CN1686564A - 可卡因－苯丙胺调节转录肽基因疫苗及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种能对抗吗啡等精神活性物质引起精神依赖的基因疫苗，及其制备与应用。本发明将可卡因—苯丙胺调节转录肽(CART)基因，克隆到真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使可卡因—苯丙胺调节转录肽在活体中表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应，刺激机体产生了对抗可卡因—苯丙胺调节转录肽的抗体，从而减少了机体对吗啡、可卡因和苯丙胺等精神药物长期使用而引起的精神依赖。

Description

可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗及其制备与应用

技术领域：

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种能对抗吗啡等精神活性物质引起精神依赖的基因疫苗，及其制备与应用。

背景技术：

精神活性物质依赖(吸毒)和复吸是当今社会严重的问题，目前，尚无较理想的方法来防治吸毒与复吸。本发明是基于近年来科学界对可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)研究的深入而发明的一种可以刺激机体产生对抗可卡因-苯丙胺调节转录肽的抗体的基因疫苗。可卡因-苯丙胺调节转录肽是一类与药物的受酬和依赖效应相关的肽类物质，在可卡因和苯丙胺等精神药物的诱导下，可卡因-苯丙胺调节转录肽有明显的表达。减少可卡因-苯丙胺调节转录肽的表达就可减少了机体对可卡因和苯丙胺等精神药物长期使用而引起的机体躯体依赖和精神依赖。

基因疫苗技术作为一种新的免疫接种手段有巨大的潜力，它通过把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体中表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。大量的实验结果表明，基因疫苗可以用于人类，它不仅具有预防疾病的作用，还有治疗疾病的作用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能对抗吗啡等精神活性物质(包括阿片类、可卡因、苯丙胺和氯胺酮等)引起精神依赖(导致的成瘾行为)的基因疫苗。本发明的另一目的是提供上述基因疫苗的制备方法与用途。

本发明将可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)基因，克隆到真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使可卡因-苯丙胺调节转录肽在活体中表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应，刺激机体产生了对抗可卡因-苯丙胺调节转录肽的抗体，从而减少了机体对吗啡、可卡因和苯丙胺等精神药物长期使用而引起的精神依赖。

本发明提供一种可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗，命名为pcDNA31CART，它是真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)与可卡因-苯丙胺调节转录肽编码全基因序列重组的核苷酸序列。可卡因-苯丙胺调节转录肽编码全基因序列的gene bank号为NM_017110。

一种可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗是具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。SEQ ID NO：1中第926位至第1276位核苷酸序列为可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)基因序列。

一种可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗在活体中表达的抗原是具有SEQ ID NO：2的蛋白质。SEQ ID NO：2中前27个氨基酸为信号肽序列，第28个至116个氨基酸为CART的活性片段，包括3对二硫键。

本发明还提供一种制备可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗的方法，该方法包括：

I、逆转录合成cDNA，用PCR扩增大鼠的CART编码区；

II、BamHI酶和XhoI酶双酶切PCR产物，胶回收片段；

III、BamHI酶和XhoI酶双酶切PcDNA3.1(+)载体，胶回收载体；

IV、将胶回收后的CART片段和pcDNA3.1(+)载体进行粘端连接，转化入大肠杆菌TG1型菌株，抽提质粒，测序；

V、用Qiagen质粒大抽试剂盒制备疫苗；

VI、分离纯化疫苗，将疫苗溶于无菌无热源的PBS缓冲液中，-20℃贮存。

本发明还提供上述可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗在制备对抗吗啡等精神活性物质引起精神依赖的药物中的用途。小鼠肌肉注射pcDNA31CART后，pcDNA31CART被肌细胞吸收，在CMV启动子作用下，使CART在细胞中表达并分泌，产生的抗原(CART)激活机体的免疫系统，引发免疫反应，刺激机体产生了CART的抗体，该抗体与循环中的CART结合，导致循环中CART水平降低。由于精神活性物质可导致中枢CART水平的增加可能是导致依赖的原因，因此增加的CART将顺浓度梯度进入循环被抗体中和，使中枢CART水平降低到正常水平，从而发挥其预防和治疗效应。本发明用吗啡诱导的条件性位置偏爱和自身给药模型已经证实，pcDNA31CART基因疫苗(即图中所示pcDNA3.1(+)-CART)不仅对抗吗啡诱导的条件性位置偏爱，而且抑制大鼠的自身给药行为，血清中CART抗体的效价在免疫后2个月内可维持在1∶2500-1∶8000之间。因此我们认为pcDNA31CART基因疫苗具有对抗精神活性物质引起的依赖，特别是精神依赖的作用。

附图说明

图1是可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗制备流程图。

图2是细胞免疫荧光检测可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)的表达。

图3是pcDNA3.1(+)和CART基因疫苗本身对位置偏爱的影响。

图4是预防性给药pcDNA3.1(+)-CART对吗啡诱导的动物条件性位置偏爱的影响。

图5是治疗性给药pcDNA3.1(+)-CART对吗啡诱导的动物条件性位置偏爱的影响。

图6是pcDNA31CART基因疫苗对吗啡复吸的影响。

图7是行为学评分表。

图8是pcDNA31CART基因疫苗对行为学总评分的抑制作用。

图9是pcDNA31CART基因疫苗对吗啡部分戒断症状的影响。

图10是pcDNA31CART基因疫苗以大鼠自身给药行为的影响。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：

如图1所示制备可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗：逆转录合成cDNA，用PCR扩增大鼠的CART编码区；BamHI酶和XhoI酶双酶切PCR产物，胶回收片段，BamHI酶和XhoI酶双酶切PcDNA3.1(+)载体，胶回收载体。将胶回收后的CART片段和pcDNA3.1(+)载体进行粘端连接，转化入大肠杆菌TG1型菌株，抽提质粒，经测序证实CART序列完全正确，见SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。用Qiagen质粒大抽试剂盒(上海基因公司提供的德国Qiagen公司产品)制备疫苗；分离纯化疫苗，将疫苗溶于无菌无热源的PBS缓冲液中，-20℃贮存。

转染到CHO细胞检测表达的抗原，见SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。如图2所示，基因疫苗能在真核细胞中表达出可卡因-苯丙胺调节转录肽。表达出的蛋白呈荧光反应。pcDNA3.1(+)组为对照组，取转染有pcDNA3.1(+)的CHO细胞作对照，没有产生特异性黄绿色荧光；pcDNA3.1(+)-CART组，细胞形态清楚，有强烈的绿色荧光产生，说明CHO细胞内已经有CART蛋白形成。

实施例2

将含可卡因-苯丙胺调节转录肽基因质粒用于动物实验，证实可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗减少了机体对吗啡等精神药物长期使用而引起的机体躯体依赖和精神依赖。结果如下：

一、测定接种可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗(pcDNA3.1(+)-CART)后血清抗体效价。

ELISA检测肌肉注射CART基因疫苗一周后昆明小鼠血清中的CART抗体效价。将CART_55-102蛋白抗原以10mg/L浓度包被96孔板，检测经倍比稀释的小鼠抗血清，终止反应后，用酶联免疫检测仪测定450nm波长处OD值。将所测的原始OD值减去对照管的OD值所得的值为实际测定值。阳性对照实际测定值/阴性对照实际测定值＞2.0者，方可认为测试效果有效。用稀释倍数进行相关性分析，并计算当实际测定OD值为最大的可识别值3.5的50％的抗体稀释度作为抗体效价。结果显示，给小鼠肌肉注射CART基因疫苗一周后，在血清中可检测到抗体，CART基因疫苗的抗体效价在1∶2500～1∶10000之间，一次免疫2个月后的抗体效价仍可保持在1∶2000～1∶8000之间。

二、CART基因疫苗对吗啡精神依赖的影响

(一)条件性位置偏爱模型

1.条件性位置偏爱箱

本实验采用的条件位置偏爱穿梭箱采用“直线”型两箱设计，材料为黑色有机玻璃，壁厚1cm。左右两箱一黑一白，黑白两个箱子的内径为15×15×35cm，穿梭门大小为5×5cm，箱底上方5cm处分别安置有光滑、粗糙的铁丝网各一块；黑灰、白灰两箱中间有穿梭门各一个，为可抽动的挡板。观察箱具有隔光、隔音的效果，声强衰减为20-25dB。在每个箱子的顶部，安装有白光照明灯和红外LED，并有通风通道和小风扇；黑、白箱均装有1个微摄像头，并有DC 12V电源线和A/V视频线的接头；箱底部垫有一块垫板，可有效防止光线的反射，使成像清晰。

2.动物模型构建

选择实验小鼠  选用雄性小鼠。打开两室闸门，将小鼠放于中间闸门下，同时采集视频，采样速度：用15帧/秒。并允许探索黑白箱2min，然后记录小鼠15min内在黑箱中的停留时间。连续试验3d，选择明显偏爱黑箱的小鼠为实验用小鼠。

训练小鼠  将实验用小鼠按体重以随机数字表随机分组。上午sc Mor 4mg·kg^-1后放入白箱(伴药箱)，下午sc saline后放入黑箱(非伴药箱)。每次在箱内停留50min，连续7d。小鼠经Mor训练将会改变其天然的偏爱，由偏爱黑箱转为偏爱白箱。

观察小鼠  完成训练后，停止给药。训练后d1，将其单只放于穿梭箱内，打开两室门，允许探索黑白箱2min，之后观察小鼠15min内在最初偏爱侧(黑箱)的停留时间。之后每隔1天观察一次，直至观察到恢复其天然的位置偏爱行为。

3.实验结果

(1)pcDNA3.1(+)-CART本身对正常动物位置偏爱无影响。

在训练前的15min内，小鼠停留在黑箱(非伴药箱)的时间比白箱(伴药箱)的长，表明小鼠天性喜欢呆在黑暗的场所。用生理盐水作为药物训练小鼠条件性位置偏爱，在训练前一周分别给巴比氏小鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)-CART、pcDNA3.1(+)和生理盐水，质粒浓度为1μg/μl，小鼠平均体重为30g，按50μg/只给予。小鼠完成训练后，停止给药，第二天观察小鼠15min内在白箱(伴药箱)的停留时间。生理盐水组、pcDNA3.1(+)组和pcDNA3.1(+)-CART组分别为251±62s、276±85s和311±34s，与训练前的218±37s、282±105s和330±24s相比无明显差异(P＞0.05)。用pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART预处理的小鼠，经过生理盐水条件性训练以后，其喜欢停留的场所并没有改变，表明pcDNA3.1(+)和CART基因疫苗本身没有影响位置偏爱的作用。

如图3所示，横坐标分别是空白对照组，pcDNA3.1(+)组和pcDNA3.1(+)-CART组。纵坐标为伴药箱时间(秒)，白柱为训练前，灰柱为训练后。

(2)预防性给药pcDNA3.1(+)-CART对吗啡诱导的动物条件性位置偏爱的影响

在训练前一周分别给小鼠肌肉注射生理盐水，pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，pcDNA3.1(+)-CART以0.1mg/kg和1mg/kg给予。结果表明两个剂量的CART均能抑制吗啡引起的CPP形成。

如图4所示，纵坐标为伴药箱时间(秒)，横坐标分别是空白对照组，吗啡组，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg组和pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg组。空白对照组为给小鼠安慰剂但不用吗啡训练，吗啡组为给小鼠安慰剂且用吗啡训练，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg组和pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg组为训练前一周给小鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，其中pcDNA3.1(+)-CART的剂量分别为0.1mg/kg体重和1.0mg/kg体重。白柱为训练前，灰柱为训练后。训练完成后统计小鼠在伴药箱时间。**P＜0.01与训练前比较有显著性差异，##P＜0.01与吗啡组训练后比较有显著性差异。

(3)治疗性给药pcDNA3.1(+)-CART对吗啡诱导的动物条件性位置偏爱的影响

训练后分别给小鼠肌肉注射生理盐水，pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART以0.1mg/kg，1.0mg/kg和10mg/kg给予。2小时后吗啡诱导，结果表明三个剂量的CART均能抑制吗啡引起的CPP形成。

如图5所示，纵坐标为伴药箱时间(秒)，横坐标分别是空白对照组，吗啡组，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg组，pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg组，pcDNA3.1(+)-CART10.0mg/kg组。空白对照组为给小鼠安慰剂但不用吗啡训练，吗啡组为给小鼠安慰剂且用吗啡训练，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg组，pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg组和pcDNA3.1(+)-CART10.0mg/kg组为训练后给小鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，其中pcDNA3.1(+)-CART的剂量分别为0.1mg/kg体重，1.0mg/kg体重和10mg/kg体重。给药后2小时吗啡诱导条件性位置依赖，统计小鼠在伴药箱时间。白柱为训练前，灰柱为训练后。**P＜0.01与吗啡诱导前比较有显著性差异，##P＜0.01与吗啡组吗啡诱导后比较有显著性差异。

(4)pcDNA3.1(+)-CART对复吸的影响

吗啡诱导动物产生位置偏爱后，停止吗啡给药，在无药条件下，每3d观察动物的行为。停药约十天后，位置偏爱效应消失，腹腔注射吗啡(1mg/kg)点燃位置偏爱，1h之后观察小鼠15min内在白箱(伴药箱)的停留时间。生理盐水组在点燃前后的时间分别为280±276s和391±221s，无明显差别。吗啡组、吗啡+pcDNA3.1(+)组分别为605±223s、574±257s均比点燃前的379±30s、401±188s明显增加(P＜0.01)吗啡+pcDNA3.1(+)-CART组为412±108s，与点燃前的313±86s无明显差异(P＞0.05)，但明显低于吗啡组被点燃后的时间(P＜0.05)，表明CART基因疫苗对复吸有明显抑制作用。

如图6所示，纵坐标为伴药箱时间(秒)，横坐标为实验组，分别是空白对照组，吗啡组，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART组。空白对照组为给小鼠安慰剂，在不用吗啡训练的情况下给吗啡点燃，吗啡组为给小鼠安慰剂，用吗啡训练，吗啡点燃。pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART组分别为给老鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，吗啡训练后用吗啡点燃。**P＜0.01，*P＜0.05与吗啡点燃前比较有显著性差异，#P＜0.05与吗啡组吗啡点燃后比较有显著性差异。

(二)、自身给药模型

1.模型的构建

如图10所示，动物先进行10天的海洛因自身给药训练，停药以后肌肉注射疫苗。经过2星期戒断，测定条件性线索诱导的海洛因觅药行为。有效觅药数指动物在训练时触鼻以后给予海洛因，在测定时每次触鼻后给予条件性线索；而无效觅药数在训练过程中与有效触鼻器左右侧分布，动物触鼻后没有海洛因，在测定时触鼻反应不给予条件性线索。

2.实验结果

组别	1小时测定		2小时测定
					有效觅药	无效觅药	有效觅药	无效觅药
	Vaccine	32.3±2.7***	6±2.5	43.6±6**					10.3±4.3
Vaccine1					40±2.6***+	2.0±1.1**+	64±6.3*++	5.6±2.8
	Plasmid	61±3.0	7..5±1.5	85±8					13.5±4.5

^***P＜0.001，^**P＜0.01，^*P＜0.05，与质粒对照组相比；++P＜0.01，+P＜0.05，与Vaccine组相比。Vaccine为不含类毒素的超纯疫苗，Vaccine1为含有类毒素的一般疫苗。

三、CART基因疫苗对吗啡躯体依赖的影响

慢性吗啡处理7天后，第二天腹腔注射纳络酮(10mg/kg)，在观察的10min内，吗啡组、pcDNA3.1(+)组和pcDNA3.1(+)-CART基因疫苗组均出现明显的戒断症状，行为学总评分分别为23.71±3.64、21.67±1.63和17.5±2.95，明显高于生理盐水对照组9.67±3.01(P＜0.01)。评分标准见图7，动物最后一次给予吗啡后24h，称量动物体重后，皮下注射纳络酮(10mg/kg)，观察并记录动物的戒断症状。根据Rasmussen的方法进行改进后评分，即将15min的评分改为10min评分。10min评分不包括体重的丢失。

但是CART基因疫苗组动物的行为学总评分明显低于吗啡组，说明CART基因疫苗具有对行为学总评分具有一定的抑制作用(P＜0.05)，如图8所示，横坐标为实验组别，分别是空白对照组，吗啡组，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)-CART组。空白对照组为给小鼠安慰剂，不用吗啡训练，用纳络酮戒断。吗啡组用吗啡训练，用纳络酮戒断。pcDNA3.1(+)组为给小鼠pcDNA3.1(+)，用吗啡训练，用纳络酮戒断。pcDNA3.1(+)-CART组为给小鼠pcDNA3.1(+)-CART，用吗啡训练，用纳络酮戒断。(**P＜0.01与空白对照组比较有显著性差异，+P＜0.05与吗啡组比较有显著性差异)。

同时，CART基因疫苗组对吗啡依赖小鼠纳络酮引起的部分戒断症状，如跳跃、站立、湿狗样颤抖、特殊体位等，具有抑制作用(*P＜0.05与吗啡组有显著性差异)。

以上动物行为结果显示可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗减少了机体对可卡因和苯丙胺等精神药物长期使用而引起的机体躯体依赖和精神依赖。

                     SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗及其制备与应用

<130>说明书，权利要求书

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5795

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(926)..(1276)

<223>可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)基因序列

<400>1

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ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc    3780

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg    3840

gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc    3900

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag    3960

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa    4020

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc    4080

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc    4140

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg    4200

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt    4260

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc    4320

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc    4380

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag    4440

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg    4500

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa    4560

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag    4620

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact    4680

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa    4740

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt    4800

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag    4860

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca    4920

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc    4980

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt    5040

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg    5100

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca    5160

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg    5220

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca    5280

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg    5340

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct    5400

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca    5460

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca    5520

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg    5580

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac    5640

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt    5700

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc    5760

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc                               5795

<210>2

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Glu Ser Ser Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Leu Gly Ala Ala Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ala Gly Ala Gln Glu Asp Ala Glu

            20                  25                  30

Leu Gln Pro Arg Ala Leu Asp Ile Tyr Ser Ala Val Asp Asp Ala Ser

        35                  40                  45

His Glu Lys Glu Leu Ile Glu Ala Leu Gln Glu Val Leu Lys Lys Leu

    50                  55                  60

Lys Ser Lys Arg Ile Pro Ile Tyr Glu Lys Lys Tyr Gly Gln Val Pro

65                  70                  75                  80

Met Cys Asp Ala Gly Glu Gln Cys Ala Val Arg Lys Gly Ala Arg Ile

                85                  90                  95

Gly Lys Leu Cys Asp Cys Pro Arg Gly Thr Ser Cys Asn Ser Phe Leu

            100                 105                 110

Leu Lys Cys Leu

        115

Claims (5)

1、一种可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗，其特征在于它是真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)与可卡因-苯丙胺调节转录肽编码全基因序列重组的核苷酸序列。

2、根据权利要求书1所述的基因疫苗，其特征在于它是具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

3、根据权利要求书1所述的基因疫苗，其特征在于它在活体中表达的抗原是具有SEQ ID NO：2的蛋白质。

4、一种制备权利要求书1、2或3所述的可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗的方法，其特征在于，该方法包括：

VII、逆转录合成cDNA，用PCR扩增大鼠的CART编码区；

VIII、BamHI酶和XhoI酶双酶切PCR产物，胶回收片段；

IX、BamHI酶和XhoI酶双酶切PcDNA3.1(+)载体，胶回收载体；

X、将胶回收后的CART片段和pcDNA3.1(+)载体进行粘端连接，转化入大肠杆菌TG1型菌株，抽提质粒，测序；

XI、用Qiagen质粒大抽试剂盒制备疫苗；

XII、分离纯化疫苗，将疫苗溶于无菌无热源的PBS缓冲液中，-20℃贮存。

5、权利要求1所述的可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗在制备对抗精神活性物质引起精神依赖的药物中的应用。

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