CN114887067B - 脑靶向石墨烯量子点及其基因复合物、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑靶向石墨烯量子点，由石墨烯量子点和脑靶向肽通过酰胺化反应得到；与lncRNA‑Hh复合形成脑靶向石墨烯量子点基因复合物。脑靶向石墨烯量子点的制备方法包括以下步骤：配制石墨烯量子点溶液，加入EDC和NHS进行活化，然后加入脑靶向肽，搅拌反应后透析、冻干得到脑靶向石墨烯量子点。本发明的脑靶向石墨烯量子点作为脑靶向纳米基因载体，可用于高效负载、靶向递送lncRNA‑Hh进行帕金森病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及脑靶向石墨烯量子点及其基因复合物、制备方法和应用。
背景技术
帕金森病是最常见的神经系统退行性疾病，我国65岁以上人群总体患病率高达1700/10万，且随年龄增长而升高，给家庭和社会带来沉重的负担。临床上帕金森病治疗是以药物治疗为主，辅以手术治疗、运动疗法、心理疏导及护理的综合治疗方式。药物治疗可有效改善症状，但长期口服药物易产生耐药性和副作用，诱使疾病进展和症状加重。
细胞替代治疗(Cell Replacement Therapy,CRT)作为神经退行性病变干细胞治疗的新探索，利用功能性多巴胺能神经元(Dopaminergic Neurons，DANs)移植替代黑质-纹状体通路缺失或改善DANs功能障碍，促进多巴胺分泌，极具应用价值和前景。相对于外源性CRT治疗直接注射干细胞，存在干细胞来源受限、安全性不明确、移植存活率较低等问题，拓展内源性CRT治疗，即通过外源性刺激诱导宿主内源性神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)增殖、迁移至损伤部位并原位分化为局部细胞，继而结构性和功能性修复受损组织，对黑质-纹状体通路缺失或功能障碍的DANs进行内源性补充与保护，以有效逆转帕金森病进程，有望从根本上提高帕金森病治疗效果。由于内源性神经再生率易受自体神经损伤或退化而波动，如何有效促进内源性NSCs募集分化以稳定提高内源性神经再生率成为该领域的关键问题。
最新研究表明，长链非编码RNA(Long Non-coding RNA，lncRNA)与PD关系密切，在神经干细胞的自我更新、增殖和分化中发挥十分重要的作用，同时还参与许多经典信号通路交互作用，实现对神经干细胞的调控，与帕金森病关系密切。lncRNA大量分布于中枢神经系统，在脑发育、神经元功能稳定、神经干细胞分化、神经退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化等多种神经系统疾病发生发展过程中起重要调控作用。其中lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
然而，现有技术中还不能实现靶向递送长链非编码RNA穿透血脑屏障，用于内源性CRT治疗，进而从根本上提高帕金森病治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脑靶向石墨烯量子点，作为脑靶向纳米基因载体，可用于高效负载、靶向递送lncRNA-Hh进行帕金森病的治疗。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脑靶向石墨烯量子点，由石墨烯量子点和脑靶向肽通过酰胺化反应得到。
石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots，GQDs)是一种准零维的纳米材料，具有独特的物理、化学性质，在生物载药和生物成像等医用领域也极具应用价值。GQDs为碳原子组成的单层或多层片状结构，可以作为优良的药物和基因载体，具有高负载性以及良好的生物相容性，结合其本身的纳米级尺寸特性，有助于穿越血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)递送药物和基因，从而优化给药途径、提高给药效率。另一方面，GQDs还具有稳定的荧光特性，可以避免常规荧光标记的光漂白缺点，不易出现光衰减失去荧光性，在作为载体递送药物和基因的同时，还可以进行无创的可视化示踪，有望为诊断和治疗提供准确可靠的实时信息。近几年来，利用GQDs丰富的结构可修饰性，通过连接具有不同功能的结构，大大拓展了其在神经疾病领域包括帕金森病治疗的应用前景。有关研究发现石墨烯量子点能够穿透BBB并有效抑制帕金森病中的α-共核蛋白形成纤维化聚集体。此外，石墨烯量子点不仅在体外和体内均没有明显的体内毒性，还能够挽救神经元死亡和突触丢失，减少路易小体形成等，通过对其进行适当的修饰，有望开发治疗蛋白异常聚集导致的神经疾病的新型药物。
在构建脑靶向给药载体时，随着噬菌体展示技术的发展，筛选出了一些低毒、与血脑屏障特异性受体选择性结合的脑靶向肽，能够高效结合、穿透BBB提高载体递送效率，如RGD、B6和RVG29等，可以特异性结合神经元细胞表达的乙酰胆碱受体，为通过BBB递送siRNA提供了很好的潜力。
本发明的脑靶向石墨烯量子点是一种安全高效的脑靶向递送载体，由于脑靶向肽为内源性神经保护肽，将脑靶向肽连接到石墨烯量子点上得到脑靶向石墨烯量子点，可以促进神经前体细胞和神经元的新生，可作为脑靶向纳米基因载体用于高效负载、靶向递送lncRNA-Hh进行帕金森病的治疗；该纳米基因载体不仅具有良好的高负载性和BBB穿透性可以提高转染效率，而且具有稳定的荧光成像特性，无需绿色荧光蛋白标记，为可视化示踪诊断和治疗提供实时信息。
优选地，所述脑靶向肽是RVG29，脑靶向石墨烯量子点记为GQD@RVG29。其中，RVG29是一段含有29个氨基酸序列的多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)，申请人发现，在脑靶向肽中，RVG29可以特异性结合神经元细胞表达的乙酰胆碱受体，靶向效率最高。
本发明还提供一种脑靶向石墨烯量子点基因复合物，由所述的脑靶向石墨烯量子点与lncRNA-Hh复合而成，其中lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。脑靶向石墨烯量子点基因复合物通过以脑靶向石墨烯量子点作为载体，靶向递送lncRNA-Hh穿越血脑屏障靶，可用于对帕金森病的治疗。
本发明还提供一种脑靶向石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：
配制石墨烯量子点溶液，加入EDC和NHS进行活化，然后加入脑靶向肽，搅拌反应后透析、冻干得到脑靶向石墨烯量子点。
进一步地，所述石墨烯量子点和所述脑靶向肽的重量比是(1：14)～(6：1)，EDC和NHS的重量之比是(0.5:1)～(1:1)，EDC的加入量至少是石墨烯量子点重量的1.2倍。在此优选条件下，石墨烯量子点与脑靶向肽完全反应。
具体地，石墨烯量子点的制备方法是：先制备氧化石墨烯，然后制备石墨烯量子点：将氧化石墨烯溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，超声处理，然后将混合溶液在100～300℃下加热，再冷却至25℃，收集黑色沉淀物，即为石墨烯量子点。
优选地，氧化石墨烯制备方法是：用含有K2S2O8和P2O5的H2SO4对石墨粉进行预氧化，然后将预氧化的石墨粉采用Hummers方法制备得到氧化石墨烯。通过该优选方式制备的氧化石墨烯再制备石墨烯量子点，量子点的粒径更小，穿透BBB更容易，使脑靶向纳米基因载体的穿透性更稳定。
本发明还提供一种脑靶向石墨烯量子点基因复合物的制备方法，包括以下步骤：按照所述制备方法制备脑靶向石墨烯量子点；然后将所述脑靶向石墨烯量子点与含有lncRNA-Hh的质粒进行混合，其中lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述脑靶向石墨烯量子点与含有lncRNA-Hh的质粒的N/P比不小于5，GQD@RVG29对lncRNA-Hh有较强的复合能力。
本发明还提供一种脑靶向石墨烯量子点基因复合物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。脑靶向石墨烯量子点基因复合物可以应用于治疗帕金森病的药物中，可以有效地促进诱导人体内源性神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)增殖、迁移至损伤部位并原位分化为局部细胞，继而结构性和功能性修复受损组织，对黑质-纹状体通路缺失或功能障碍的DANs进行内源性补充与保护，以有效逆转帕金森病进程，有望从根本上提高帕金森病治疗效果。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
附图说明
图1A为实施例5的脑靶向石墨烯量子点制备过程制得的氧化石墨烯的透射电镜图，图1B为实施例5制备的脑靶向石墨烯量子点的透射电镜图。
图2A为实施例5的脑靶向石墨烯量子点制备过程制得的氧化石墨烯的红外光谱图，图2B为实施例5制备的脑靶向石墨烯量子点的红外光谱图。
图3是实施例5的脑靶向石墨烯量子点制备过程制得的氧化石墨烯、RVG29以及实施例5制备的脑靶向石墨烯量子点的紫外谱图。
图4是不同GQD@RVG29与lncRNA质量比下GQD@RVG29/IncRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是实施例7的细胞毒性实验结果图。
图6是不同GQD@RVG29与lncRNA质量比下GQD@RVG29/IncRNA复合物基因转染的流式分布图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行说明，可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明实施例，而非对本发明实施例的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明实施例相关的部分而非全部。本发明的多个实施例用于使本发明所属技术领域的普通技术人员更完整地理解本发明，以下实施例可以以多种不同的方式变形，这些变形也包括在本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例的脑靶向石墨烯量子点，由石墨烯量子点和脑靶向肽通过酰胺化反应得到。脑靶向肽可以能特异性结合神经元细胞表达的乙酰胆碱受体的是RGD、B6和RVG29等。
本发明的脑靶向石墨烯量子点是一种安全高效的脑靶向递送载体，由于脑靶向肽为内源性神经保护肽，将脑靶向肽连接到石墨烯量子点上得到脑靶向石墨烯量子点，可以促进神经前体细胞和神经元的新生，可作为脑靶向纳米基因载体用于高效负载、靶向递送lncRNA-Hh进行帕金森病的治疗；该纳米基因载体不仅具有良好的高负载性和BBB穿透性可以提高转染效率，而且具有稳定的荧光成像特性，无需绿色荧光蛋白标记，为可视化示踪诊断和治疗提供实时信息。
在一个优选实施方式中，脑靶向肽是RVG29。RVG29是一段含有29个氨基酸序列的多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)，申请人发现，RVG29的靶向效率最高。
实施例2
本实施例的脑靶向石墨烯量子点基因复合物，由实施例1的脑靶向石墨烯量子点与lncRNA-Hh复合而成，其中lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
实施例3
本实施例的脑靶向石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化石墨烯GO的制备
通过改良的Hummers方法，使用天然石墨粉合成氧化石墨烯(GO)。在GO制备之前进行了另外的预氧化程序。在60℃的温度下，将石墨粉(6g)溶于含有K2S2O8(1g)和P2O5(10g)的H2SO4(20mL)溶液中。分离深色混合物，在室温下冷却过夜，并用超纯水稀释至中性。随后，将石墨预氧化并溶解在含有NaNO3(1g)的冷H2SO4(90mL)溶液中。将KMnO4(10g)缓慢加入到混合物中，并将反应在50℃下搅拌10小时。反应后，向系统中添加200mL水，并在90℃加热15分钟，然后添加大量水和30％H2O2溶液以终止反应。将混合物过滤并用稀HCl溶液洗涤。最后，将超纯水洗涤3次后，收集GO产物。
(2)石墨烯量子点GQD的制备
将10mL的1mg/mL的氧化石墨烯溶液溶解于30mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将混合物超声处理10min，然后将混合溶液加入衬有特氟隆的高压釜中，并在高温300℃条件下加热1小时。然后将容器用水冷却至25℃，收集黑色沉淀物，用水洗涤，得到石墨烯量子点GQD，然后重悬于PBS中以备后用。
(3)脑靶向石墨烯量子点GQD@RVG29的制备
GQD与RVG29的偶连是通过酰胺反应来实现的。具体来说，取1mL的GQD溶液，加入20mg EDC和30mg NHS，活化1小时，然后加入14mg RVG29，室温搅拌反应过夜，透析、冻干得到GQD@RVG29。
实施例4
本实施例的脑靶向石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化石墨烯GO的制备
通过改良的Hummers方法，使用天然石墨粉合成氧化石墨烯(GO)。在GO制备之前进行了另外的预氧化程序。在100℃的温度下，将石墨粉(6g)溶于含有K2S2O8(10g)和P2O5(1g)的H2SO4(10mL)溶液中。分离深色混合物，在室温下冷却过夜，并用超纯水稀释至中性。随后，将石墨预氧化并溶解在含有NaNO3(4g)的冷H2SO4(90mL)溶液中。将KMnO4(16g)缓慢加入到混合物中，并将反应在30℃下搅拌6小时。反应后，向系统中添加200mL水，并在90℃加热15分钟，然后添加大量水和30％H2O2溶液以终止反应。将混合物过滤并用稀HCl溶液洗涤。最后，将超纯水洗涤3次后，收集GO产物。
(2)石墨烯量子点GQD的制备
将40mL的1mg/mL的氧化石墨烯溶液溶解于50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将混合物超声处理60min，然后将混合溶液加入衬有特氟隆的高压釜中，并在高温100℃条件下加热8小时。然后将容器用水冷却至25℃，收集黑色沉淀物，用水洗涤，得到石墨烯量子点GQD，然后重悬于PBS中以备后用。
(3)脑靶向石墨烯量子点GQD@RVG29的制备
GQD与RVG29的偶连是通过酰胺反应来实现的。具体来说，取6mL的GQD溶液，加入12mg EDC和24mg NHS，活化1小时，然后加入1mg RVG29，室温搅拌反应过夜，透析、冻干得到GQD@RVG29。
实施例5
本实施例的脑靶向石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化石墨烯GO的制备与表征
通过改良的Hummers方法，使用天然石墨粉合成氧化石墨烯(GO)。在GO制备之前进行了另外的预氧化程序。在80℃的温度下，将石墨粉(4g)溶于含有K2S2O8(5g)和P2O5(5g)的H2SO4(15mL)溶液中。分离深色混合物，在室温下冷却过夜，并用超纯水稀释至中性。随后，将石墨预氧化并溶解在含有NaNO3(2g)的冷H2SO4(90mL)溶液中。将KMnO4(12g)缓慢加入到混合物中，并将反应在40℃下搅拌8小时。反应后，向系统中添加200mL水，并在90℃加热15分钟，然后添加大量水和30％H2O2溶液以终止反应。将混合物过滤并用稀HCl溶液洗涤。最后，将超纯水洗涤3次后，收集GO产物。
图1A为本步骤制备得到的氧化石墨烯的透射电镜图，从图上可以看出，所制备的氧化石墨烯为片状结构分布在铜网上，平均直径为400nm左右。图2A为本步骤制备得到的氧化石墨烯的红外光谱图，可以看到我们所制备的氧化石墨烯有几个明显的吸收峰。在3407cm-1附近有一个较宽也比较强的吸收峰，这归属于羧基中-OH的伸缩振动峰，在1730cm-1处的吸收是氧化石墨烯上C＝O的伸缩振动峰，在1628cm-1处的吸收峰属于C-OH的弯曲振动吸收峰，在1074cm-1处吸收峰为C-O-O的振动吸收峰。说明所制备的产物至少存在OH、COOH、C-O-C和C＝O等官能团，氧化石墨烯成功合成。
(2)石墨烯量子点GQD的制备与表征
将20mL的1mg/mL的氧化石墨烯溶液溶解于40mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将混合物超声处理30min，然后将混合溶液加入衬有特氟隆的高压釜中，并在高温200℃条件下加热4小时。然后将容器用水冷却至25℃，收集黑色沉淀物，用水洗涤，得到石墨烯量子点GQD，然后重悬于PBS中以备后用。
图1B为本步骤制备得到的石墨稀量子点的透射电镜图，由于石墨烯量子点为碳结构材料，而透射电镜测试中使用的铜网是碳膜的，元素组成接近，因而对比度较低，从图上可以看出，所制备的石墨烯量子点均匀分布在碳膜上，平均直径为10nm左右。对GQD进行红外谱图分析后，从图2B可以看到我们所制备的石墨烯量子点有几个明显的吸收峰，1374cm-1处出现峰值，这是由于-COOH基团的C-OH拉伸振动所致。由于C＝C和C-OH拉伸振动，在1640cm-1和1064cm-1处观察到其他峰值。证明GQD的成功合成。
(3)脑靶向石墨烯量子点GQD@RVG29的制备与表征
GQD与RVG29的偶连是通过酰胺反应来实现的。具体来说，取3mL的GQD溶液，加入24mg EDC和24mg NHS，活化4小时，然后加入7mg RVG29，室温搅拌反应过夜，透析、冻干得到GQD@RVG29。为验证靶向多肽RVG29与量子点的结合，我们进行了紫外可见光谱分析，图3示出GQDs在小于300nm的波长处强烈吸收紫外光。它们在231处表现出特征性的宽吸收峰，归因于芳香C＝C键的跃迁。RVG29多肽在280nm处表现出典型的生物大分子紫外吸收峰，来源于色氨酸和酪氨酸-芳香族氨基酸的吸收。在GQD-RVG29中有多肽的特征峰，证明RVG29的成功负载。
实施例6
本实施例的脑靶向石墨烯量子点基因复合物GQD@RVG29/IncRNA的制备方法，在实施例5制得的GQD@RVG29的基础上，具体地，将GQD@RVG29水溶液与含有lncRNA-Hh的质粒按不同的N/P比(0:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1和40:1)在不同的Eppendorf管中均匀混合，使混合物在室温条件下复合半个小时，其中lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示，质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
然后进行凝胶电泳试验来表征GQD@RVG29对lncRNA-Hh的结合能力。如图4所示，是不同GQD@RVG29与lncRNA质量比下GQD@RVG29/IncRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳图。可以看出，当GQD@RVG29与lncRNA-Hh质量比小于2时，可以明显观察到lncRNA-Hh条带从凹槽中迁出，当质量比大于等于5，lncRNA-Hh已难以在电场条件下从复合物中迁出，说明在该质量比以上，GQD@RVG29对lncRNA-Hh有较强的复合能力。
实施例7
细胞毒性实验：
通过CCK-8法定量检测实施例5制得的GQD和GQD@RVG29的细胞相容性。实验步骤简述如下，将L929细胞接种于96孔板中，接种密度5000个/孔，置于二氧化碳培养箱中培养贴壁过夜。随后，吸出培养基，换上新鲜的含有不同浓度的GQD和GQD@RVG29的完全培养基，每组均设置5个平行孔，PBS(磷酸盐缓冲液)作为对照组，继续培养24h后，培养后用PBS将细胞洗涤一次后并向各孔中加入100μL的新鲜培养基(含有10％CCK-8)。置于培养箱中孵育一段时间，最后使用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度。如图5所示，不同浓度的纳米材料(石墨烯量子点GQD和脑靶向石墨烯量子点GQD@RVG29)对L929均无毒性作用，当纳米材料浓度达到100μg/mL时，细胞存活率依然具有90％左右，表明石墨烯量子点GQD和脑靶向石墨烯量子点GQD@RVG29均具有良好的生物相容性。
实施例8
基因转染实验：
首先将HT22细胞接种于24孔板中，接种密度为5×104个/孔。然后将其置于二氧化碳培养箱中贴壁过夜。待细胞密度达70％时，吸出原来培养基，更换新鲜的含有不同GQD@RVG29与lncRNA质量比的GQD@RVG29/lncRNA复合物(lncRNA：1μg/孔)的完全培养基，PEI25k/lncRNA(w/w＝1.3)作为对照组，其中，lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示。然后将培养板置于培养箱中继续培养一天。转染完成后，首先，利用倒置荧光显微镜观察是否有绿色荧光蛋白的表达，然后，利用胰蛋白酶消化细胞，离心吸出上清，并加入PBS重悬细胞，最后，用流式细胞仪来定量分析基因转染效果。如图6所示，我们观察到N/P比对GQD@PEG-RVG29/lncRNA复合物的转染效率具有重要的影响。当N/P比为20:1时，GQD@PEG-RVG29/lncRNA复合物具有最高的基因转染效率，29.9％的HT22细胞被转染。相反，PEI25k/lncRNA复合物在有血清的条件下转染率仅为13.7％。N/P比高于或低于20:1时，GQD@PEG-RVG29/lncRNA复合物的基因转染效率均有不同程度降低。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
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SEQUENCE LISTING
<110> 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司
<120> 脑靶向石墨烯量子点及其基因复合物、制备方法和应用
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<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4394
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
cuaucaacuc caucugucac aaaaauuaag gcuaaaucuc cucuccagaa gcagagggag 60
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agaccccaag aauuuaagua auuuguucaa ggcaacacac ugcuaugugg uagaacuaca 1020
aauugagccc aaauaaucca gcuucagaua cuaugcaaag guauccuagg ugugggggug 1080
auaaccuggu gacaaucccu ucucagaagg aaaacagguc ccaucuacag aggugaagca 1140
gaguguggaa cugaaaaacu caauggaaga auggcuauua agauuuagga cggcugggaa 1200
auaauaaagu aauaauaaua auacuaggua uugacgugug cuacaugcca ggccuugggu 1260
gacauuugga uugauuccca uuuucuuuac uuuucagcag uggggucuuu caccuuucaa 1320
gcucugccug agaagucaac augguggcau uuggcuaggu ucuuuuaggc aaccaauugu 1380
uuuaacauga uuuguugaaa agccuauucu cucuuucauu gaacuauaau gcuagcucug 1440
ucauaaauca aauuuucauu ugauuuauga uaugaaaauu auaugcauuu gauugauaug 1500
cauuuuuucu ccaaugauac ucaacugucu uaauuauaua auuuuguagu aauucuuggu 1560
aucuaauuag gcaaauaccc acucccaacc cuguuucuuu uguuuuuaaa uccaggggug 1620
uuuuggauau ucucguucau uugugcuucc accuacauuu uucaguuaac uugucaggua 1680
cgaaaaaaua aaaggcaaaa uuuuuuaucc uuaaaucaau uugggcaagu uugcaguuuu 1740
uucuuguauu guaacuucca aucuaugaau augaucuauu uuuucaccaa uuuauggcuu 1800
cuuccaauaa cauuuuauaa uugucuuuuu agaggccuua ucuuuuguuu agauucauau 1860
cuagguauuu aauauuuuug augcuguuau aaaugguauu uuuaaaaaua uauacauuuu 1920
uaacuauuuc acauagaaaa cuuuaaugga uuuuuaaaau guagauuugu auucaguaaa 1980
ccuguuaaaa ucucuuagaa ugucuaagag uuuauuuauu caauuugauu uucuuuuuuu 2040
uuuuuucucc uggagacgga guuucgcucu uguugcccag gcuggagugc aguggcauga 2100
ucucagcuca cugcaaccuc cggcucccgg guucaagcaa uucuccuguc ucagccuccu 2160
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gagacagagu uucaccaugu uggccaggcu ggucucaaac uccugaccuc aggugauccg 2280
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uccacaaucu uuacagguuu aauuuuuuuc uaugccuugc ugcacucucu augauuucca 2460
guauuggcac uacucuggcc uuuggucuuu gcucuugcau cagccuuuca uaauugggua 2520
uguuuguugu aaguuuucug uagagagucu uuaugagguu aagagauuug uuucauuucu 2580
aguuuauuaa gagauuuuau uauagaucaa uguuaaauuu uaucaaaauu ucuccauugc 2640
auuucuauug agaugaucac augauuauua aaaauuagua uaaagauuua uuauuuugau 2700
auuuuaaaau cagguuuauu gaggcauaau uuauauauaa uaaaauuuac ccuauuagag 2760
uauccagucc aguaaguuuu gguaaaugua ugcgaauaac acaauaaaca gguuuagaac 2820
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uuugaguguu aagccagccu uacauuucug aguuaacuug gucaugauau cuucuacaaa 3000
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agcuggaaua auuuauguau uauugaaauu aauugcuccu uaaauacuug gcagaauuca 3180
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auuauuuuau uuuuguaaua cagcuuauuu uuccagaaac uucuacuuuu cguuuacauc 3300
uucaagucag auuaaaguug uauuaauaac cccuuauuau uuaaaucuca gcagaaugug 3360
aaguuauguu cccccuuugu auccauuuuu uucucuagau auuuuucugu uaccuguuuu 3420
aaauuuaauu ccauuguggu cagagauaau acuuuguaug acuugcauuc uuuuauguau 3480
auugagacuu guuauaaggc acagaguaug guuuaucuug guaaucauuc guggcacacu 3540
uaaaaaucau guguuuucug cuauuguuga gugggauguu cuguaacugu gaauuagguc 3600
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cccauuuguu cuuuguuuca aaaaaacucu uuuuuugccu uuuuuuauau caaguauuuu 4080
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uguaauauuu uuguuuaaac aauauuuauu uagacuuaau aauaaauaau aaaaauauau 4380
gcuaaccagg aucc 4394
<210> 2
<211> 10495
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
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gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
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gtttaaactt aagcttctat caactccatc tgtcacaaaa attaaggcta aatctcctct 960
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gatttattat tttgatattt taaaatcagg tttattgagg cataatttat atataataaa 3660
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acttttcgtt tacatcttca agtcagatta aagttgtatt aataacccct tattatttaa 4260
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gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 9360
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 9420
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 9480
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tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 9600
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 9660
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 9720
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 9780
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gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 9900
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 9960
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 10020
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 10080
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 10140
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 10200
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 10260
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 10320
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<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
20 25
Claims (4)
1.一种脑靶向石墨烯量子点基因复合物，其特征在于：由脑靶向石墨烯量子点与lncRNA-Hh复合而成，其中lncRNA-Hh的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示；所述脑靶向石墨烯量子点由石墨烯量子点和脑靶向肽通过酰胺化反应得到；
所述脑靶向石墨烯量子点基因复合物的制备方法，包括以下步骤：制备脑靶向石墨烯量子点；然后将所述脑靶向石墨烯量子点与含有lncRNA-Hh的质粒进行混合；所述脑靶向石墨烯量子点与含有lncRNA-Hh的质粒的N/P为20；
所述脑靶向石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：配制石墨烯量子点溶液，加入EDC和NHS进行活化，然后加入脑靶向肽，搅拌反应后透析、冻干得到脑靶向石墨烯量子点；
所述脑靶向肽是RVG29。
2.根据权利要求1所述的脑靶向石墨烯量子点基因复合物，其特征在于：所述石墨烯量子点和所述脑靶向肽的重量比是1：14～6：1，EDC和NHS的重量之比是0.5:1～1:1，EDC的加入量至少是石墨烯量子点重量的1.2倍。
3.根据权利要求1所述的脑靶向石墨烯量子点基因复合物，其特征在于：所述石墨烯量子点的制备方法是：先制备氧化石墨烯，然后制备石墨烯量子点：将氧化石墨烯溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，超声处理，然后将混合溶液在100～300℃下加热，再冷却至25°C，收集黑色沉淀物，即为石墨烯量子点。
4.根据权利要求3所述的脑靶向石墨烯量子点基因复合物，其特征在于：所述氧化石墨烯制备方法是：用含有K2S2O8和P2O5的H2SO4对石墨粉进行预氧化，然后将预氧化的石墨粉采用Hummers方法制备得到氧化石墨烯。
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