CN112626121B - 三筛选标记的抗体表达载体以及应用 - Google Patents

三筛选标记的抗体表达载体以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三筛选标记的抗体表达载体，在同一载体中包括表达框一和表达框二，表达框二以顺向排列的方式紧邻表达框一，在表达框一中，嘌呤霉素抗性基因PuroR通过IRES序列偶联在抗体的轻链基因的下游，再通过E2A多肽将鼠谷氨酰胺合成酶mGS偶联在嘌呤霉素抗性基因PuroR的下游；在表达框二中，二氢叶酸还原酶基因DHFR通过IRES序列偶联在抗体的重链基因的下游。本发明的三筛选标记的抗体表达载体，在抗体的轻链上链接了PuroR基因和mGS基因，在抗体的重链上链接了DHFR基因，在筛选时，通过控制MTX和MSX的浓度，控制轻链和重链的表达平衡，既能使目标抗体的质量提高，避免产生片段化抗体或多聚体抗体，又能使目标抗体的产量提高。

Description

三筛选标记的抗体表达载体以及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种三筛选标记的抗体表达载体以及构建方法和应用。
背景技术
抗体药物是当今生物医药发展的主流，要实现抗体药物的大规模生产，第一步必须要构建高效表达目标抗体的稳定细胞株。其中，抗体表达载体是构建高效表达目标抗体稳定细胞株的关键物质。
二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）是细胞生长代谢通路中的关键物质，分别为细胞的增殖提供碳源和氮源。当细胞基因组中的二氢叶酸还原酶（DHFR）缺失或失活（也可能采用基因敲除的方法使其失活），并且培养基中缺乏碳源的补救合成途径（如次黄嘌呤H和胸腺嘧啶T）时，细胞将由于缺乏碳源而死亡。与其类似，当细胞基因组中谷氨酰胺合成酶基因缺失（也可能采用基因敲除的方法使其失活）或者谷氨酰胺合成酶表达水平较低，并且培养基中缺乏氮源供应时（如谷氨酰胺），细胞将由于缺乏氮源而死亡。因此，当前基于二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因的抗体表达载体是实现抗体高效表达的主要策略。对于二氢叶酸还原酶（DHFR）基因缺失或失活的细胞，在细胞培养过程中加入DHFR的抑制物-甲氨蝶呤（MTX），细胞将死亡，而只有从外源（如载体或质粒）整合了二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的细胞才能存活并实现增殖。同样，对于谷氨酰胺合成酶基因缺失（也可能采用基因敲除的方法使其失活）或者谷氨酰胺合成酶表达水平较低的细胞，在细胞培养过程中加入GS抑制物-蛋氨酸亚氨基代砜（MSX）时细胞将死亡，而只有从外源整合（如载体或质粒）了谷氨酰胺合成酶（GS）基因的细胞才能存活并实现增殖。
但是，当二氢叶酸还原酶（DHFR）基因或谷氨酰胺合成酶（GS）缺失或失活的细胞从外源载体或质粒获得了DHFR基因或GS基因后，当培养基中再加入MTX或MSX后，细胞由于抑制压力选择而使整合进细胞基因组的外源DHFR或GS扩增100~1000倍以上以表达足够量的二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合成酶以维持生存。与此同时，当整合进细胞基因组的二氢叶酸还原酶（DHFR）基因或谷氨酰胺合成酶（GS）扩增时，可连带其基因组两侧的数kb~10kb（碱基对）长的基因一起进行扩增，形成共扩增效应。因此，基于此特性，当前用于构建抗体高效表达稳定细胞株的抗体筛选系统为DHFR/MTX扩增系统和GS/MSX扩增系统。
传统的DHFR/MTX扩增系统如Thermo公司推出的中国仓鼠卵巢细胞DG44（二氢叶酸还原酶缺陷型）（CHO-DG44），配套的外源表达载体为pcDNA3.3-TOPO（含新霉素抗性基因）和pOptiVEC-TOPO（含二氢叶酸还原酶表达框）。中国仓鼠卵巢细胞S（二氢叶酸还原酶低表达型）（CHO-S）抗体表达系统，配套的外源表达载体为pCHO 1.0（含二氢叶酸还原酶表达框和嘌呤霉素抗性基因表达框）。两种DHFR/MTX扩增系统都可以分别表达抗体轻链和重链。
传统的GS/MSX开发和商业化的公司包括Lonza和Merk，Lonza公司分别推出一代抗体表达系统GS-CHOK1SV（谷氨酰胺合成酶低表达的CHO细胞）和二代抗体表达系统CHOK1SVGS-KO（谷氨酰胺合成酶基因缺失的CHO细胞）。Merk公司于2012年推出了CHOZN GSAntibody Expression System（谷氨酰胺合成酶基因缺失的CHO细胞），其配套的表达载体均含有谷氨酰胺合成酶基因。
抗体的高效表达与宿主细胞系、筛选系统、抗体表达载体、培养基和筛选策略有紧密关系。由于抗体是由轻链和重链装配成的四聚体，只有轻链和重链表达和组装维持在一个平衡的状态时，才能确保抗体能有效的装配和分泌，从而实现高表达，轻链和重链在细胞内表达失衡不仅影响抗体的质量，如产生片段化抗体或多聚体抗体，还会降低抗体的产量，使抗体表达水平降低。
现有技术中的抗体表达载体的设计，DHFR基因或GS基因在抗体载体中要么为独立的表达框，要么通过IRES（内部核糖体进入位点序列）将轻链或重链耦合表达，但均缺乏维持抗体轻链和重链表达平衡的策略。
公开号为CN102409060的专利文件，公开了GS-DHFR双基因筛选表达载体及其构建方法与应用，具体公开了骨架载体为p0pti VEC，依次含有CMV启动子，外源基因插入位点、CMV启动子控制的二氢叶酸还原酶基因和SV40启动子控制的谷氨酰胺合成酶基因，谷氨酰胺合成酶基因下游为SV40polyA信号序列，所述二氢叶酸还原酶基因序列与外源基因插入位点之间还有IRES序列，所述谷氨酰胺合成酶基因插入在p0pti VEC的PvuII位点，所述谷氨酰胺合成酶基因上游带有SV40启动子，下游为SV40polyA信号序列。其应用步骤为：在外源基因插入位点插入目的外源基因，然后转入宿主细胞得到转化细胞；在缺乏谷氨酰胺的培养基重添加叶酸类似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物对转化细胞进行加压筛选以获得高表达细胞系，对获得的高表达细胞系进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。
该专利公开的技术方案，虽然公开了采用MTX和MSX加压筛选高表达细胞系的方案，但是，其缺点在于通过IRES将轻链或重链耦合表达，缺乏维持抗体轻链和重链表达平衡的策略。因而，无法避免轻链和重链在细胞内表达失衡的问题，不仅影响抗体的质量，如产生片段化抗体或多聚体抗体，还会降低抗体的产量，使抗体表达水平降低。
发明内容
本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的基因筛选的抗体表达载体无法平衡抗体轻链和重链的表达平衡，影响抗体的质量，降低了抗体表达水平等问题，提供一种能够解决前述问题的三筛选标记的抗体表达载体。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：三筛选标记的抗体表达载体，在同一载体中包括表达框一和表达框二，表达框二以顺向排列的方式紧邻表达框一，在表达框一中，嘌呤霉素抗性基因PuroR通过IRES序列偶联在抗体的轻链基因的下游，再通过E2A多肽将鼠谷氨酰胺合成酶mGS偶联在嘌呤霉素抗性基因PuroR的下游；在表达框二中，二氢叶酸还原酶基因DHFR通过IRES序列偶联在抗体的重链基因的下游。
进一步的方案是，在所述的表达框一中，CMV启动子设置在抗体的轻链基因的上游，在抗体的轻链基因的5’端和3’端分别加入若干个酶切位点。
进一步的方案是，在所述的表达框一中，在鼠谷氨酰胺合成酶mGS的下游为bGHpolyA基因介导的poly A加尾信号。
进一步的方案是，在所述的表达框二中，鸡β-actin启动子设置在抗体的重链基因的上游，在抗体的重链基因的5’端和3’端分别加入若干个酶切位点。
进一步的方案是，在所述的表达框二中，在二氢叶酸还原酶基因DHFR的下游为bGHpoly A基因和SV40 polyA基因介导的poly A加尾信号。
进一步的方案是，所述的表达框一为三顺反子，表达框二为双顺反子。
进一步的方案是，所述的同一载体中还包括表达框三，表达框三由氨苄青霉素抗性基因AmpR启动子驱动AmpR的表达，以反向排列的方式紧邻表达框1，以确保质粒转化时将未转化目标质粒的感受态细胞杀死。
本发明的另一个目的在于提供一种三筛选标记的抗体表达载体的应用，三筛选标记的抗体表达载体能用于CHO野生型或DHFR、GS缺陷型细胞以及NS0、SP2/0细胞等转染、筛选和构建抗体表达稳定细胞株。
三筛选标记的抗体表达载体的应用，其筛选方法为，首先使用嘌呤霉素Puro药杀去除未转染目标质粒的细胞，然后使用MTX和MSX联合筛选加压，通过不同浓度MTX和MSX联合加压以调节抗体轻链和重链的表达平衡，并筛选出高表达的细胞，或者，同时进行Puro、MTX和MSX药杀和加压，最大程度去除未转染或低表达的细胞，以保留高表达的细胞，并调节抗体轻链和重链的表达平衡。
本发明的有益效果为：1）本发明的三筛选标记的抗体表达载体，在抗体的轻链上链接了PuroR基因和mGS基因，在抗体的重链上链接了DHFR基因，在筛选时，通过控制MTX和MSX的浓度，控制轻链和重链的表达平衡，既能使目标抗体的质量提高，避免产生片段化抗体或多聚体抗体，又能使目标抗体的产量提高；2）本发明的三筛选标记的抗体表达载体，通过在抗体的轻链上链接PuroR基因，在使用MTX和MSX筛选前，先使用嘌呤霉素Puro药杀去除未转染目标质粒的细胞，使后续的MTX和MSX筛选时，筛选的细胞量减少，筛选效率更高，且能使筛选出的细胞更符合目标要求。
附图说明
图1为本发明的三筛选标记的抗体表达载体pKHB-DG的结构示意图。
图2为将抗Her2单克隆抗体的轻链基因和重链基因分别克隆至目标表达载体pKHB-DG中产生的质粒pKHB-DG-Her2 mAb的结构示意图。
图3为加压筛选前后上清抗体高分子甘露糖含量对比图。
图4为加压筛选前后抗体表达水平的对比图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明的三筛选标记的抗体表达载体，在同一载体中包括表达框一、表达框二和表达框三。
表达框一为三顺反子，在表达框一中，人CMV启动子设置在抗体的轻链基因的上游，抗体轻链如抗Her2的抗体轻链，在抗体轻链基因的5’端和3’端分别加入NheⅠ、SrfⅠ和SgrAⅠ酶切位点，嘌呤霉素抗性基因PuroR通过IRES序列偶联在抗体的轻链基因的下游，再通过E2A多肽将鼠谷氨酰胺合成酶mGS偶联在嘌呤霉素抗性基因PuroR的下游，在鼠谷氨酰胺合成酶mGS的下游为bGH polyA基因介导的poly A加尾信号。如图1所示，在表达框1内还设有其他的酶切位点。包括XcmI、XbaI、PmeI等酶切位点。E2A多肽为马鼻病毒2A肽，IRES为脑心肌炎病毒基因中的一段300~500 bp的RNA序列。
表达框二为双顺反子，在表达框二中，鸡β-actin启动子设置在抗体的重链基因的上游，在抗体的重链基因的5’端和3’端分别加入FseⅠ、ClaⅠ以及SwaⅠ和PacⅠ酶切位点,二氢叶酸还原酶基因DHFR通过IRES序列偶联在抗体的重链基因的下游, 在二氢叶酸还原酶基因DHFR的下游为bGH poly A基因和SV40 polyA基因介导的poly A加尾信号。表达框二以顺向排列的方式紧邻表达框一。
表达框三由氨苄青霉素抗性基因AmpR启动子驱动AmpR的表达，以反向排列的方式紧邻表达框1，以确保质粒转化时将未转化目标质粒的感受态细胞杀死。紧邻表达框三为原核复制起始位点Ori，以确保目标质粒在感受态细胞中有效复制。
本发明的三筛选标记的抗体表达载体能用于CHO野生型或DHFR、GS缺陷型细胞以及NS0、SP2/0细胞等细胞的转染、筛选和构建抗体表达稳定细胞株。
三筛选标记的抗体表达载体在应用时，首先使用嘌呤霉素Puro药杀去除未转染目标质粒的细胞，然后使用MTX和MSX联合筛选加压，通过不同浓度MTX和MSX联合加压以调节抗体轻链和重链的表达平衡，并筛选出高表达的细胞，或者，同时进行Puro、MTX和MSX药杀和加压，最大程度去除未转染或低表达的细胞，以保留高表达的抗体细胞，并调节抗体轻链和重链的表达平衡。
应用例1
如图2所示，使用本发明的三筛选标记的抗体表达载体在CHO-K1细胞（野生型细胞）上进行测试，具体过程为：
1）将抗Her2单克隆抗体基因的轻链和重链先后克隆至所构建的表达载体pKHB-DG中。
2）采用PvuⅠ酶切使其线性化。
3）采用Lonza 4D核转仪将线性化的质粒进行电转(10～20μg/107个细胞)，电转48小时候使用5 μg/mL嘌呤霉素Puro进行药杀。
4）待细胞活力恢复至70%以上时，采用不同浓度的MTX和MSX进行加压筛选。
5）根据目标产量以及细胞在不同压力情况下的状态来选择一轮或二轮加压筛选。
6）ELISA进行抗体定量检测，相对于加压前，抗体的产量提高了50~100倍。
如图3所示，可以看出，在加压筛选后上清液中抗体高分子甘露糖的含量降低为加压前的30%左右。如图4所示，可以看出，在加压筛选后，抗体表达水平为加压筛选前的5.8倍左右。通过两个图标可以看出，通过加压筛选，能够获得高表达的抗体细胞。
上述应用例仅仅列举了一种细胞在抗体表达载体中的测试结果，对于本领域技术人员而言，通过该应用例，能够想到本发明的三筛选标记的抗体表达载体同样能够在其他细胞上进行应用，应用时，仅需要调节加压的MTX和MSX的浓度，即可使目标抗体的轻链和重链的表达平衡，提高获得的抗体的质量和产量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 苏州博腾生物制药有限公司
<120> 三筛选标记的抗体表达载体
<130> 20201224
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> DNA
<213> NheⅠ酶切位点序列序列(NheⅠ)
<400> 1
gctagc 6
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> SrfⅠ酶切位点序列(SrfⅠ)
<400> 2
gcccgggc 8
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> SgrAⅠ酶切位点序列(SgrAⅠ)
<400> 3
caccggtg 8
<210> 4
<211> 574
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒基因(IRES)
<400> 4
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataa 574
<210> 5
<211> 597
<212> DNA
<213> 嘌呤霉素抗性基因(PuroR)
<400> 5
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc ccgggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgacccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagt gcccgaagga ccgcgcgacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcc 597
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 马鼻病毒2A肽(E2A)
<400> 6
aggagaaaga gacaatgtac aaactacgct ttgttgaaac tcgctggcga tgttgaaagt 60
aaccccggtc ct 72
<210> 7
<211> 1125
<212> DNA
<213> 鼠谷氨酰胺合成酶(mGS)
<400> 7
atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaggcatca agcaaatgta catgtccctg 60
ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtaccgg agaaggactg 120
cgctgcaaga cccgtaccct ggactgtgag cccaagtgtg tggaagagtt acctgagtgg 180
aactttgatg gctctagtac ctttcagtct gaaggctcca acagcgacat gtacctccat 240
cctgttgcca tgtttcgaga ccccttccgc aaagacccca acaagctggt gctatgtgaa 300
gttttcaagt ataaccggaa acctgcagag accaacttga ggcacatctg taaacggata 360
atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg agcaggaata tactcttatg 420
ggaacagacg gccacccatt tggttggcct tccaatggct tccctggacc ccaaggcccg 480
tattactgcg gtgtgggagc agacaaggcc tacggcaggg acatcgtgga ggctcactac 540
cgggcctgct tgtatgctgg agtcaagatt acggggacaa atgcggaggt tatgcctgcc 600
cagtgggaat tccagatagg accctgtgag gggatccgaa tgggagatca tctttggata 660
gcccgtttta tcttgcatcg ggtgtgcgaa gactttgggg tgatagcaac ctttgacccc 720
aagcccattc cagggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaacttcag caccaaggcc 780
atgcgggagg agaatggtct gaagtgcatt gaggaggcca ttgacaaact gagcaagagg 840
caccagtacc acattcgcgc ctacgatccc aaggggggcc tggacaacgc ccggcgtctg 900
actggattcc acgaaacctc caacatcaac gacttttctg ccggtgttgc caaccgcggt 960
gccagtatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga agggctactt tgaagaccgt 1020
cggccttctg ccaattgtga cccctatgcg gtgacagaag ccatcgtccg cacgtgtctc 1080
ctcaacgaaa caggcgacga acccttccaa tacaagaact gataa 1125
<210> 8
<211> 6
<212> DNA
<213> XbaⅠ酶切位点序列( XbaⅠ)
<400> 8
tctaga 6
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> FseⅠ酶切位点序列(FseⅠ)
<400> 9
ggccggcc 8
<210> 10
<211> 6
<212> DNA
<213> Cla Ⅰ酶切位点序列(Cla Ⅰ)
<400> 10
atcgat 6
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> Swa Ⅰ酶切位点序列(Swa Ⅰ)
<400> 11
atttaaat 8
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> Pac Ⅰ酶切位点序列(Pac Ⅰ)
<400> 12
ttaattaa 8
<210> 13
<211> 564
<212> DNA
<213> 二氢叶酸还原酶基因(DHFR)
<400> 13
atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac 60
ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 120
acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180
attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240
aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300
attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360
gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420
caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480
ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540
gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564
<210> 14
<211> 8585
<212> DNA
<213> 抗体表达载体pKHB-DG质粒(pKHB-DG-Her2 mAb)
<400> 14
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gcccgggcca ccggtgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 960
tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg 1020
gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 1080
cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 1140
aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 1200
ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 1260
cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 1320
caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 1380
atctggggcc tcggtacaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 1440
gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa atgaccgagt 1500
acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc ccgggccgta cgcaccctcg 1560
ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgacccggac cgccacatcg 1620
agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg 1680
tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag 1740
cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg 1800
ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt 1860
tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg 1920
tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg 1980
cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagt 2040
gcccgaagga ccgcgcgacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgccagg agaaagagac 2100
aatgtacaaa ctacgctttg ttgaaactcg ctggcgatgt tgaaagtaac cccggtccta 2160
tggccacctc agcaagttcc cacttgaaca aaggcatcaa gcaaatgtac atgtccctgc 2220
cccagggtga gaaagtccaa gccatgtata tctgggttga tggtaccgga gaaggactgc 2280
gctgcaagac ccgtaccctg gactgtgagc ccaagtgtgt ggaagagtta cctgagtgga 2340
actttgatgg ctctagtacc tttcagtctg aaggctccaa cagcgacatg tacctccatc 2400
ctgttgccat gtttcgagac cccttccgca aagaccccaa caagctggtg ctatgtgaag 2460
ttttcaagta taaccggaaa cctgcagaga ccaacttgag gcacatctgt aaacggataa 2520
tggacatggt gagcaaccag cacccctggt ttggaatgga gcaggaatat actcttatgg 2580
gaacagacgg ccacccattt ggttggcctt ccaatggctt ccctggaccc caaggcccgt 2640
attactgcgg tgtgggagca gacaaggcct acggcaggga catcgtggag gctcactacc 2700
gggcctgctt gtatgctgga gtcaagatta cggggacaaa tgcggaggtt atgcctgccc 2760
agtgggaatt ccagatagga ccctgtgagg ggatccgaat gggagatcat ctttggatag 2820
cccgttttat cttgcatcgg gtgtgcgaag actttggggt gatagcaacc tttgacccca 2880
agcccattcc agggaactgg aatggtgcag gctgccatac caacttcagc accaaggcca 2940
tgcgggagga gaatggtctg aagtgcattg aggaggccat tgacaaactg agcaagaggc 3000
accagtacca cattcgcgcc tacgatccca aggggggcct ggacaacgcc cggcgtctga 3060
ctggattcca cgaaacctcc aacatcaacg acttttctgc cggtgttgcc aaccgcggtg 3120
ccagtatccg cattccccgg actgtcggcc aggagaagaa gggctacttt gaagaccgtc 3180
ggccttctgc caattgtgac ccctatgcgg tgacagaagc catcgtccgc acgtgtctcc 3240
tcaacgaaac aggcgacgaa cccttccaat acaagaactg ataatctaga gggcccgttt 3300
aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 3360
cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 3420
aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 3480
aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 3540
ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct 3600
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 3660
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 3720
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 3780
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 3840
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 3900
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 3960
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 4020
aattctgtgg aataggccta ggcttttgca aagacattga ttattgacta gttattaata 4080
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 4140
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 4200
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta 4260
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 4320
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 4380
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tgtcgaggtg 4440
agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat 4500
ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggcgcgcgcc 4560
aggcggggcg gggcgggggc gagggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc 4620
caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc 4680
ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg ccggccatcg atatttaaat ttaattaacc 4740
cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg 4800
cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga 4860
aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa 4920
tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa 4980
caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct 5040
gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg 5100
ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg 5160
ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtaca 5220
catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg 5280
acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aaatggttcg accattgaac tgcatcgtcg 5340
ccgtgtccca aaatatgggg attggcaaga acggagacct accctggcct ccgctcagga 5400
acgagttcaa gtacttccaa agaatgacca caacctcttc agtggaaggt aaacagaatc 5460
tggtgattat gggtaggaaa acctggttct ccattcctga gaagaatcga cctttaaagg 5520
acagaattaa tatagttctc agtagagaac tcaaagaacc accacgagga gctcattttc 5580
ttgccaaaag tttggatgat gccttaagac ttattgaaca accggaattg gcaagtaaag 5640
tagacatggt ttggatagtc ggaggcagtt ctgtttacca ggaagccatg aatcaaccag 5700
gccacctcag actctttgtg acaaggatca tgcaggaatt tgaaagtgac acgtttttcc 5760
cagaaattga tttggggaaa tataaacttc tcccagaata cccaggcgtc ctctctgagg 5820
tccaggagga aaaaggcatc aagtataagt ttgaagtcta cgagaagaaa gactaactgt 5880
gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 5940
aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 6000
taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 6060
agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gttcgaaatg accgaccaag 6120
cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg 6180
gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 6240
tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 6300
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 6360
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg 6420
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 6480
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 6540
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 6600
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 6660
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6720
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6780
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6840
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6900
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6960
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 7020
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 7080
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 7140
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 7200
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 7260
gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 7320
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt 7380
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 7440
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 7500
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 7560
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 7620
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 7680
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 7740
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 7800
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 7860
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 7920
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 7980
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 8040
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 8100
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 8160
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 8220
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 8280
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 8340
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 8400
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 8460
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 8520
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 8580
acgtc 8585

Claims (9)

1.一种三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：在同一载体中包括表达框一和表达框二，表达框二以顺向排列的方式紧邻表达框一，在表达框一中，嘌呤霉素抗性基因PuroR通过IRES序列偶联在抗体的轻链基因的下游，再通过E2A多肽将鼠谷氨酰胺合成酶mGS偶联在嘌呤霉素抗性基因PuroR的下游；在表达框二中，二氢叶酸还原酶基因DHFR通过IRES序列偶联在抗体的重链基因的下游。
2.根据权利要求1所述的三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：在所述的表达框一中，CMV启动子设置在抗体的轻链基因的上游，在抗体的轻链基因的5’端和3’端分别加入若干个酶切位点。
3.根据权利要求1所述的三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：在所述的表达框一中，在鼠谷氨酰胺合成酶mGS的下游为bGH polyA基因介导的poly A加尾信号。
4.根据权利要求1所述的三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：在所述的表达框二中，鸡β-actin启动子设置在抗体的重链基因的上游，在抗体的重链基因的5’端和3’端分别加入若干个酶切位点。
5.根据权利要求1所述的三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：在所述的表达框二中，在二氢叶酸还原酶基因DHFR的下游为bGH poly A基因和SV40 polyA基因介导的poly A加尾信号。
6.根据权利要求1所述的三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：所述的表达框一为三顺反子，表达框二为双顺反子。
7.根据权利要求1所述的三筛选标记的抗体表达载体，其特征在于：所述的同一载体中还包括表达框三，表达框三由氨苄青霉素抗性基因AmpR启动子驱动AmpR的表达，以反向排列的方式紧邻表达框1，以确保质粒转化时将未转化目标质粒的感受态细胞杀死。
8.一种权利要求1-7中任意一项所述的三筛选标记的抗体表达载体的应用，其特征在于：三筛选标记的抗体表达载体能用于CHO野生型或DHFR、GS缺陷型细胞以及NS0、SP2/0细胞的转染、筛选和构建抗体表达稳定细胞株。
9.根据权利要求8所述的三筛选标记的抗体表达载体的应用，其特征在于：其筛选方法为，首先使用嘌呤霉素Puro药杀去除未转染目标质粒的细胞，然后使用MTX和MSX联合筛选加压，通过不同浓度MTX和MSX联合加压以调节抗体轻链和重链的表达平衡，并筛选出高表达的细胞，或者，同时进行Puro、MTX和MSX药杀和加压，最大程度去除未转染或低表达的细胞，以保留高表达的细胞，并调节抗体轻链和重链的表达平衡。
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用反式互补表达载体实现全抗体在CHO-dhfr-细胞中的高效表达;安怀杰;俞炜源;孙志伟;;生物技术通讯(第05期);735-738 *

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