CN103468742A - GS-DHFRmut双基因筛选表达载体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种GS-DHFRmut双标记基因的真核表达载体、制备方法及应用，属于生物技术领域，所述的表达载体含有控制谷氨酰胺合成酶基因表达的启动子及谷氨酰胺合成酶基因，以及控制突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子及突变的二氢叶酸还原酶基因，两个筛选基因下游均带有PolyA信号序列，本发明还公开了上述表达载体的制备方法及应用，通过用GS-DHFRmut双标记筛选系统表达载体来提高外源蛋白的表达水平，同时扩大了在基因工程中的宿主细胞株的使用来源，在以后基因工程产业化发展中有着重要应用价值。

Description

GS-DHFRmut双基因筛选表达载体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种真核表达载体、制备方法及应用，具体是GS-DHFRmut双基因筛选表达载体及其制备与应用，属于生物技术领域。 
背景技术
目前以哺乳动物细胞株为代表的真核表达系统的研发是生物制药发展的趋势。哺乳动物细胞表达系统由于具有精确的转录后加工，翻译及修饰(糖基化、酰胺化、磷酸化及二硫键的形成等)，同时外源蛋白的表达水平是细胞工程发展的重要因素。外源基因的扩增是提高外源蛋白表达水平的重要策略之一。目前为止，广泛应用于工业的基因扩增系统有GS(谷氨酰胺合成酶)基因扩增系统和DHFR(二氢叶酸还原酶)基因扩增系统。 
GS基因扩增系统是利用谷氨酰胺合成酶抑制物(Methioninesulphoximine，MSX)在没有谷氨酰胺的培养条件下使GS基因及与之相连的外源基因扩增，达到提高外源蛋白表达水平的目的。(Bebbiington CR，RennerG，Thomson S et al.Biotechnology，1992；10(2)；169-175.)。DHFR基因扩增系统通过选择DHFR缺陷型的CHO细胞株作为宿主细胞，转染DHFR标记的表达载体到DHFR-细胞株中，通过不断提高MTX的浓度来筛选高表达克隆细胞株。已有文章指出，用不同MTX加压筛选，表达载体内的DHRF标记基因4下游定位的基因同时扩增(Kaufman et al.Mol Cell Biol.1985；5(7)；1750-1759)。此外也有报道，分离到突变的高表达DHFR基因可以在非DHFR缺陷型的宿主细胞中作标记筛选基因，用DHFRmut基因在CHOK1细胞株中表达，通过不同浓度的MTX加压筛选来提高外源蛋白的表达水平(Christian C，Renner G，Arthur D et al.Biochemistry，1983；80(12)；2495-2499.)。 
然而这种筛选系统要求使用特殊的基因缺陷型细胞，具有一定的局限性。Levinson小组的科学家(Christlan C，Renner G，Arthur D et al.Biochemistry，1983；80(12)；2495-2499.)自小鼠细胞库中分离筛选到了一种突变的DHFR蛋白，DHFRmut。该蛋白位于其活性抑制位点处的第22位氨基酸由野生型的亮氨酸突变为精氨酸，从而大大降低了其与抑制毒素MTX的结合力。这一突变一方面保留了DHFRmut正常的酶活，另一方面则将DHFRmut对MTX的抗性提高了约两个数量级。Levinson小组还进一步考察了DHFRmut重组基因转染DHFR缺失型细胞后的表现，并就其对MTX的耐受浓度与DHFR+细胞株(如CHO-K1细胞株)进行比较，发现DHFRmut不但可以挽救DHFR缺失型细胞的MTX敏感现象，更能将其对MTX的耐受浓度进一步提高，甚至比带有野生型DHFR基因的细胞还要高出2个数量级。这一结果为随后利用该突变的DHFR在非DHFR缺陷型的宿主细胞中使用DHFR外源基因扩增系统提供了思路。在如CHO-K1等非DHFR缺陷型的宿主细胞中，以DHFRmut基因作为标记筛选基因，，通过不同浓度的MTX加压筛选来提高外源蛋白的表达水平。这一应用将大大扩大DHFR筛选系统使用宿主细胞株的范围。 
发明内容
本发明公开了一种GS-DHFRmut双标记基因表达载体的表达系统，这个基因扩增表达系统集合了GS系统和DHFRmut系统两个筛选系统的优点，也克服了DHFR系统要求DHFR缺陷型细胞做转染的缺点。同时应用GS-DHFRmut双标记基因表达载体的表达系统比单独用GS表达系统的外源蛋白表达水平提高了50～100倍。 
一种GS-DHFRmut双标记基因的真核表达载体，其特征在于，含有外源基因启动子，5’-UTR序列，外源基因插入位点，PolyA外源基因表达终止信号，控制的谷氨酰胺合成酶基因表达的启动子及谷氨酰胺合成酶基因本身，以及控制的突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子及突变的二氢叶酸还原酶基因本身。两个筛选基因下游均带有PolyA信号序列。所述的GS-DHFRmut双标记基因的真核表达载体，具体的突变的二氢叶酸还原酶基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。 
所述的GS-DHFRmut双标记基因的真核表达载体，在具体实施过程中，控制的谷氨酰胺合成酶基因表达的启动子可以是SV40启动子，控制的突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子可以为SV40启动子。 
所述的GS-DHFRmut双标记筛选表达载体，所述的紧邻外源基因插入位点的SV40-PolyA终止信号与谷氨酰胺合成酶表达元件之间还有多克隆位点序列用于插入第二以及第三个外源基因表达元件。 
在具体的实施例中，所述的GS-DHFRmut双标记筛选表达载体的构建方法，骨架载体为pEE12.4；所述突变的二氢叶酸还原酶基因插入在pEE12.4的MluI位点；所述突变的二氢叶酸还原酶基因上游有启动子，下游有PolyA信号序列。 
上述GS-DHFRmut双标记基因真核表达载体的制备方法，步骤如下：将突变的二氢叶酸还原酶基因插入在pEE12.4的MluI位点，或是其他位于GS基因下游序列中的限制性内切酶位点，其中突变的二氢叶酸还原酶基因上游有SV40启动子，下游有SV40-PolyA信号序列。将构建好的GS-DHFRmut双标记基因真核表达载体命名为pEE12.4dual。 
所述的GS-DHFRmut双标记筛选表达载体的用于单个外源基因的表达，其步骤为：在所述外源基因插入位点插入目的外源基因，然后转入宿主细胞得到转化细胞；在基础培养基中添加叶酸类似物甲喋呤和谷氨酰胺合成 酶抑制物对转化细胞进行加压筛选已获得高表达细胞株；对获得的高表达细胞株进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。 
所述的GS-DHFRmut双标记筛选表达载体的用于多个外源基因的表达，其步骤为：在所述外源基因插入位点插入目的外源基因一，然后在所述多克隆位点插入目的外源基因二，或是目的外源基因二和三的表达元件，构建双标记筛选多基因表达载体；所述的外源基因二或三的表达元件包括控制目的基因转录的启动子、目的基因序列、以及PolyA终止信号；所述双标记筛选多基因表达载体转入宿主细胞得到转化细胞；在基础培养基中添加叶酸类似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物对转化细胞进行加压筛选已获得高表达细胞株；对获得的高表达细胞株进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。 
所述宿主细胞为哺乳动物细胞。 
所述哺乳动物细胞为CHO K1细胞。 
将本发明的特征及优点总结如下： 
A通过分子克隆手段将突变的DHFR基因构建到GS表达载体中运用双标记基因筛选系统筛选稳定细胞株克隆； 
B突变的DHFR筛选基因不需要二氢叶酸还原酶基因缺陷型的宿主细胞进行转染； 
C GS-DHFRmut表达载体双筛选系统重组蛋白表达量是GS单筛选系统的50～100倍； 
本次申请参考了多篇论文及专利，根据GS基因扩增系统和突变的DHFR基因扩增系统的各自特点设计了以非DHFR缺陷的野生型CHOK1细胞为宿主细胞，用GS-DHFRmut双标记筛选系统表达载体来提高外源蛋白的表达水平，同时扩大了在基因工程中的宿主细胞株的使用来源。在以后基因工程产业化发展中有着重要应用价值。 
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 
图1为pEE12.4dual的Mlu I酶切验证图谱，其中1～3为pEE12.4dualMluI酶切产物，4为pEE12.4MluI酶切产物(阴性对照)。 
图2为pEE12.4dual的载体结构示意图。 
图3为pEE6.4-mAb-1H、pEE12.4-mAb-1L、pEE12.4Dual-mAb-1L用HindIII和EcoRI双酶切鉴定后的DNA电泳图，其中1为 
pEE6.4-mAb-1H HindIII与EcoRI双酶切产物，3为pEE12.4-mAb-1LHindIII与EcoRI双酶切产物，4为pEE12.4dual-mAb-1L HindIII与EcoRI双酶切产物。 
图4为pEE6.4-mAb-2H、pEE12.4-mAb-2L、pEE12.4Dual-mAb-2L用HindIII和EcoRI双酶切鉴定后的DNA电泳图，其中1为pEE6.4-mAb-2H HindIII与EcoRI双酶切产物，2为pEE12.4-mAb-2LHindIII与EcoRI双酶切产物，4为pEE12.4dual-mAb-2L HindIII与EcoRI双酶切产物。 
图5为pEE12.4-6.4-mAb-1、pEE12.4Dual-6.4-mAb-1用SalI和NotI双酶切鉴定后的DNA电泳图，1为pEE12.4-6.4-mAb-1NotI与SalI双酶切产物，2为pEE12.4dual-6.4-mAb-1NotI与SalI双酶切产物。 
图6为pEE12.4-6.4-mAb-2、pEE12.4Dual-6.4-mAb-2用SalI和NotI双酶切鉴定后的DNA电泳图，其中1为pEE12.4-6.4-mAb-2NotI与SalI双酶切产物，2为pEE12.4dual-6.4-mAb-2NotI与SalI双酶切产物。 
图7为PEE12.4-6.4-mAb-1(85个克隆)和PEE12.4DUAL-6.4-mAb-1(90个克隆)两个表达载体筛选克隆的ELISA检测结果比较。 
图8为部分PEE12.4-6.4-mAb-1表达载体筛选的克隆，SDS-PAGE结 果。 
图9为部分PEE12.4DUAL-6.4-mAb-1表达载体筛选的克隆，SDS-PAGE结果。 
图10为PEE12.4-6.4-mAb-2(80个克隆)和PEE12.4DUAL-6.4-mAb-2(83个克隆)两个表达载体筛选克隆的ELISA检测结果比较。 
图11为部分PEE12.4-6.4-mAb-2表达载体筛选的克隆，SDS-PAGE结果。 
图12为部分PEE12.4DUAL-6.4-mAb-2表达载体筛选的克隆，SDS-PAGE结果。 
具体实施方式
下面给出一种根据本发明制备的表达载体的非限定性的实施例。 
实施例1： 
GS-DHFRmut双标记筛选表达载体(pEE12.4dual)的构建：将DHFRmut基因序列插入Lonza的商业化GS筛选表达空白载体，pEE12.4。 
DHFRmut基因的获得：根据Christlan C等人1983年于Biochemistry科学期刊上发表的文献，确认了DHFRmut的开放式阅读框(ORF)DNA序列，具体序列信息见SEQ No1。之后再参照商业化载体pEE12.4的框架序列，在DHFRmut的ORF上下游加入启动子、PolyA信号序列，以及MluI酶切位点，构成完整的DHFRmut基因序列，并交由基因合成公司合成。 
单酶切：取委托基因公司合成的DHFRmut基因以及购买自Lonza公司的商业化GS筛选表达空白载体pEE12.4，分别用Mlu I进行单酶切。酶切体系：10×H buffer 10μL，载体和合成的DHFRmut基因分别为20μL，Mlu I限制性内切酶2μL，MilliQ灭菌水补足至100μL，37℃反应3-5小时。0.8％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。(限制性内切酶Mlu I和胶回收试剂盒均购 于TakaRa公司) 
去磷酸化：将Mlu I酶切后回收到的pEE12.4载体进行去磷酸化处理。反应体系为：酶切产物88μL，10×Alkaline Phosphatase Buffer 10μL，CIAP(10～30U/μl)2μL，37℃反应30分钟。PCR产物纯化试剂盒纯化上述去磷酸化产物。 
连接：取1.5mL无菌Eppendorf管加入上述DNA分子，反应体系如下：DHFRmut插入片段6μL，载体2μL，10×T4DNA ligase buffer 1μL，T4 DNAligase buffer 1μL；同时做阴性对照，即将上述连接体系中的DHFRmut插入片段用MilliQ灭菌水代替。4℃，过夜连接。 
转化：-80℃取出100μL Top10感受态细胞，迅速置于冰上，待感受态细胞溶解后分为50μL/管，并分别加入5μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热击45秒(注意此时不要晃动离心管)，立即放入冰上静置2-5分钟，之后每管加入400μL室温放置的LB培养基，37℃，250rpm摇晃培养1小时。取100μL转化产物，均匀涂布于含有100mg/mL氨苄的LB固体培养基上，放于37℃培养箱中倒置培养过夜。 
挑菌：在平板中挑取菌落3个，分别接种于含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中(3ml/管)，37℃摇床培养过夜。 
载体鉴定：将提取的质粒，通过Mlu I酶切验证(如图1)，并且对验证得到的阳性克隆2进行序列测定。序列结果证明DHFRmm已准确地插入到载体pEE12.4中。 
获得的GS-DHFRmut双标记筛选表达载体命名为pEE12.4dual，质粒图谱见图2。 
实施例2： 
GS-DHFRmut双标记筛选重组抗体表达载体以及GS单标记筛选重组抗体表达载体的构建。 
重组单克隆抗体mAb-1基因的获得：重组单克隆抗体mAb-1重链与轻链的可变区(VH，VL)氨基酸序列来源于Genentech公司1995年的专利WO-09630046，见SEQ No2和No3；重链恒定区(CH)的氨基酸序列来源于蛋白数据库UniProt上公布人类IgG1重链恒定区的序列(查询号P01857)，见SEQ No4；轻链恒定区(CL)的氨基酸序列来源于蛋白数据库UniProt上公布人类Ig kappa链恒定区的序列(查询号P01834)，见SEQ No5。所得到的全长重组单克隆抗体mAb-1的氨基酸序列，通过JCat网站的密码子优化程序(http://www.jcat.de/)得到对应的DNA编码序列，见SEQ No6～7。之后再在其上下游加入HindIII和EcoRI的酶切位点、起始密码子(ATG)、老鼠KappaIII信号肽基因(见SEQ No8)，以及终止密码子(TAG)，构成完整的重组单克隆抗体重链(mAb-1H)及轻链(mAb-1L)基因序列，并交由基因合成公司合成。 
重组单克隆抗体mAb-2基因的获得：重组单克隆抗体mAb-2重链与轻链的全长氨基酸序列来源于DrugBank上关于抗CD20杂合单克隆抗体的序列信息(查询号DB00073)，见SEQ No.9和No.10。该氨基酸序列通过JCat网站的密码子优化程序(http://www.icat.de/)得到对应的编码序列，见SEQ No11～12。之后再在其上下游加入HindIII和的EcoRI酶切位点、起始密码子(ATG)、老鼠KappaIII信号肽基因(见SEQ No8)，以及终止密码子(TAG)，构成完整的重组单克隆抗体重链(mAb-2H)及轻链(mAb-2L)基因序列，并交由基因合成公司合成。 
单基因表达载体的构建：取委托基因公司合成的mAb-1H、mAb-2H、mAb-1L以及mAb-2L基因、购买自Lonza公司的商业化GS筛选表达空白载体pEE12.4及不含有任何筛选标签的空白载体pEE6.4，分别用Takara公司的HindIII与EcoRI双酶切，并回收纯化酶切片段。随后将酶切处理过的外源基因及线性化的空白载体进行连接。根据所需连接的DNA片段及空白 载体的不同，共分为三个平行的反应：一为mAb-1H/mAb-2H基因连入pEE6.4载体、二为mAb-1L/mAb-2L基因连入pEE12.4载体、三为mAb-1L/mAb-2L基因连入pEE12.4dual载体。之后每一种连接产物分别通过热激转化至50μL Top10感受态细胞中，均匀涂布于含有100mg/mL氨苄的LB固体培养基上，放于37℃培养箱中倒置培养过夜。最后通过HindIII和EcoRI双酶切筛选验证插入目的外源片段的阳性克隆(如图3、图4)。对验证得到的阳性克隆进行序列测定，序列结果证明六个单基因表达载体pEE6.4-mAb-1H、pEE6.4-mAb-2H、pEE12.4-mAb-1L、pEE12.4-mAb-2L、pEE12.4dual-mAb-1L以及pEE12.4dual-mAb-1L的正确构建。 
重组单克隆抗体表达载体的构建：取上述构建成功的单基因表达载体pEE6.4-mAb-1H、pEE6.4-mAb-2H、pEE12.4-mAb-1L、pEE12.4-mAb-2L、pEE12.4dual-mAb-1L以及pEE12.4dual-mAb-1L，分别用Takara公司的SalI与NotI双酶切。酶切产物通过0.8％的琼脂糖电泳分离纯化，并回收pEE6.4-mAb-1H及pEE6.4-mAb-2H中约4kb大小的DNA片段；pEE12.4-mAb-1L、pEE12.4-mAb-2L、pEE12.4dual-mAb-1L及pEE12.4dual-mAb-1L约7-8kb大小的DNA片段。随后将酶切处理过的DNA片段进行连接，整合同一单抗的重链和轻链两个外源基因表达原件于一个表达载体上。根据所需整合的载体不同，共分为四个平行的反应：pEE6.4-mAb-1H的表达原件整合进pEE12.4-mAb-1L中、pEE6.4-mAb-1H整合入pEE12.4dual-mAb-1L载体中、pEE6.4-mAb-2H的表达原件整合进pEE12.4-mAb-2L中，以及pEE6.4-mAb-2H整合入pEE12.4dual-mAb-2L载体中。之后每一种连接产物分别通过热激转化至50μL Top10感受态细胞中，均匀涂布于含有100mg/mL氨苄的LB固体培养基上，放于37℃培养箱中倒置培养过夜。最后通过SalI与NotI双酶切筛选验证插入目的外源片段的阳性克隆(如图5、图6)。 
构建获得的4个重组单克隆抗体表达载体，两个为GS单筛选标记的表达载体，命名为pEE12.4-6.4-mAb-1和pEE12.4-6.4-mAb-2；另两个为GS-DHFRmut双标记的表达载体，命名为pEE12.4dual-6.4-mAb-1及pEE12.4dual-6.4-mAb-2。 
实施例3： 
电转染mAb1基因表达载体并比较不同筛选方式的克隆的表达量， 
在实验过程中，GS单标记筛选的表达载体使用上述构建的pEE12.4-6.4-mAb-1载体；GS-DHFRmut双筛选表达载体使用上述构建的pEE12.4dual-6.4-mAb-1。 
1、细胞培养和转染 
电转染前一天，传代悬浮培养CHO K1细胞，传代培养的细胞密度是0.5E6cell/ml，培养体积为20ml CD CHO media(GIBCO)。第二天，取15E6细胞进行电转染，按照操作说明书进行操作电转仪(Biorad)，将质粒A和B转染到CHOK1细胞；然后用CD CHO培养基稀释电转染后的CHOK1细胞，20000cell/孔；将稀释的细胞悬浮液加到96孔板150ul/孔。在37度，5％的CO2条件下培养，用25uM MSX-100nM TX筛选克隆细胞株。 
1、单克隆筛选 
电转染后，96孔板培养三至四周左右，用ELISA检测96孔板培养的克隆；同时挑取高表达克隆进行12％的SDS-PAGE电泳检测。根据结果检测结果显示，不同的筛选系统条件下，克隆的表达量提高了50～100倍， 
竞争ELISA检测结果的比较见图7及表1，其中pEE12.4-6.4-mAb-1筛选了85个克隆；pEE12.4dual-6.4-mAb-1筛选了90个克隆。部分克隆的SDS-PAGE结果见图8及图9。 
电转染mAb2基因表达载体并比较不同筛选方式的克隆的表达量，在实验过程中，GS单标记筛选的表达载体使用上述构建的pEE12.4-6.4-mAb-2 载体；GS-DHFRmut双筛选表达载体使用上述构建的pEE12.4dual-6.4-mAb-2。 
2、细胞培养和转染 
电转染前一天，传代悬浮培养CHO K1细胞，传代培养的细胞密度是0.5E6cell/ml，培养体积为20ml CD CHO media(GIBCO)。第二天，取15E6细胞进行电转染，按照操作说明书进行操作电转仪(Biorad)，将质粒A和B转染到CHOK1细胞；然后用CD CHO培养基稀释电转染后的CHOK1细胞，20000cell/孔；将稀释的细胞悬浮液加到96孔板150ul/孔。在37度，5％的CO2条件下培养，用25uM MSX-100nM TX筛选克隆细胞株。 
3、单克隆筛选 
电转染后，96孔板培养三至四周左右，用ELISA检测96孔板培养的克隆；同时挑取高表达克隆进行12％的SDS-PAGE电泳检测。根据结果检测结果显示，不同的筛选系统条件下，克隆的表达量提高了50～100倍 
竞争ELISA检测结果的比较见图10，其中pEE12.4-6.4-mAb-2筛选了80个克隆；pEE12.4dual-6.4-mAb-2筛选了83个克隆。部分克隆的SDS-PAGE结果见图11及图12。 
表1：PEE12.4-6.4(85个克隆)和PEE12.4DUAL-6.4(90个克隆)两个表达载体筛选克隆，ELISA检测表达量前30位克隆结果比较； 
PEE12.4-6.4-mAb-1 ug/mL   PEE12.4DUAL-6.4-mAb-1 ug/mL
C36 5.51   D3 281.13
c61 1.22   A57 92.87
C35 0.51   A18 35.86
A20 0.41   A51 51.33
C9 0.29   A41 47.39
C9 0.28   A49 25.68
[0068] 
C46 0.26   A37 22.40
A14 0.25   D4 22.33
C8 0.24   A44 19.00
C37 0.23   A58 17.04
C16 0.22   A31 16.86
C50 0.21   A45 12.57
C40 0.21   A1 11.53
C51 0.20   A48 11.10
C17 0.19   A25 9.70
C3 0.19   A56 9.29
C8 0.19   A19 8.37
C27 0.19   A32 7.58
C54 0.19   A59 7.31
A8 0.18   A39 6.97
C13 0.18   A35 5.98
C55 0.18   A16 5.68
C31 0.18   A52 4.41
C41 0.18   A38 4.38
A1 0.18   A15 4.08
C10 0.17   A50 4.04
C1 0.16   D2 3.25
B11 0.16   A46 3.24
C6 0.16   A8 2.98
C2 0.15   A21 2.17
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不 局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。 
Figure ISA00000808563900011
Figure ISA00000808563900021
Figure ISA00000808563900031
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Figure ISA00000808563900051
Figure ISA00000808563900061

Claims (11)

1.一种GS-DHFRmut双标记基因的真核表达载体，其特征在于含有控制谷氨酰胺合成酶基因表达的启动子及谷氨酰胺合成酶基因，以及控制突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子及突变的二氢叶酸还原酶基因，两个筛选基因下游均带有PolyA信号序列。
2.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于其所述的突变的二氢叶酸还原酶基因具有序列1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于用于构建所述表达载体的载体骨架为pEE12.4。
4.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于所述的控制谷氨酰胺合成酶基因表达和控制突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子为SV40启动子。
5.权利要求1到4任一所述的表达载体的制备方法，包含以下步骤：将突变的二氢叶酸还原酶基因插入在pEE12.4的MluI位点，或是其他位于GS基因下游序列中的限制性内切酶位点，其中二氢叶酸还原酶基因上游有SV40启动子，下游有SV40-PolyA信号序列。
6.权利要求1到5任一所述的真核表达载体的应用，所述的表达载体用于单个外源基因或多个外源基因的表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的用于单个外源基因表达的步骤为：在外源基因插入位点插入目的外源基因，然后转入宿主细胞得到转化细胞；在基础培养基中添加叶酸类似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物对转化细胞进行加压筛选已获得高表达细胞株；对获得的高表达细胞株进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的用于多个外源基因表达的步骤为：在外源基因插入位点插入目的外源基因一，然后在所述多克隆位点插入目的外源基因二，或是目的外源基因二和三的表达元件，构建双标记筛选多基因表达载体；所述的外源基因二或三的表达元件包括控制目的基因转录的启动子、目的基因序列、以及PolyA终止信号；所述表达载体转入宿主细胞得到转化细胞；在基础培养基中添加叶酸类似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物对转化细胞进行加压筛选已获得高表达细胞株；对获得的高表达细胞株进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。
9.根据权利要求7或8所述的应用，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，所述哺乳动物细胞为非DHFR缺陷型的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的应用，所述哺乳动物细胞为CHO K1细胞。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946687A (zh) * 2015-06-09 2015-09-30 北京东方百泰生物科技有限公司 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法
CN107964535A (zh) * 2016-12-23 2018-04-27 浙江海隆生物科技有限公司 一种cho单克隆细胞株的筛选方法和应用
CN109988777A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 南京金斯瑞生物科技有限公司 谷氨酰胺合成酶基因以及应用
CN112626121A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 苏州博腾生物制药有限公司 三筛选标记的抗体表达载体以及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102365364A (zh) * 2009-03-31 2012-02-29 株式会社斯特利恩 用于选择高效表达重组细胞系的方法
CN102409060A (zh) * 2010-09-26 2012-04-11 北京华安科创生物技术有限公司 Gs-dhfr双基因筛选表达载体及其构建方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102365364A (zh) * 2009-03-31 2012-02-29 株式会社斯特利恩 用于选择高效表达重组细胞系的方法
CN102409060A (zh) * 2010-09-26 2012-04-11 北京华安科创生物技术有限公司 Gs-dhfr双基因筛选表达载体及其构建方法与应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946687A (zh) * 2015-06-09 2015-09-30 北京东方百泰生物科技有限公司 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法
CN104946687B (zh) * 2015-06-09 2018-09-14 北京东方百泰生物科技有限公司 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法
CN107964535A (zh) * 2016-12-23 2018-04-27 浙江海隆生物科技有限公司 一种cho单克隆细胞株的筛选方法和应用
CN109988777A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 南京金斯瑞生物科技有限公司 谷氨酰胺合成酶基因以及应用
CN112626121A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 苏州博腾生物制药有限公司 三筛选标记的抗体表达载体以及应用
CN112626121B (zh) * 2020-12-29 2024-04-09 苏州博腾生物制药有限公司 三筛选标记的抗体表达载体以及应用

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