CN104946687B - 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体公开了哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法；本发明涉及哺乳动物双基因高效筛选表达载体pGD、pGN，载体pGD携带GS和DHFR筛选基因，载体pGN携带GS和NEO筛选基因，同时在筛选基因前的SV40启动子中引入了缺失突变，实现筛选基因的转录弱化，而且所述载体与带有强启动子pEF‑1α的目的基因表达元件相连接，可快速筛选出高效表达目的蛋白的细胞株，为哺乳动物细胞中制备重组蛋白提供了新的工具。所述载体筛选高表达单克隆细胞,具有速度快、阳性克隆率高、目的蛋白表达量高等特点。

Description

哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及到哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法。

背景技术

基因工程药物因具有其他药物无法比拟的优点，迅速成为制药产业中引人注目的焦点,近年来，各国政府将其视为新的经济增长热点并大力支持。CHO细胞(Chinesehamster ovary,中国仓鼠卵巢细胞)表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，被广泛应用于抗体类蛋白质药物的生产。影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。CHO细胞表达体系和外源基因影响mRNA(Messenger RNA)的翻译；表达细胞株的加压扩增,目的在于增加外源基因的拷贝数,从而提高表达量；筛选基因的应用使获得稳定的、高表达的单克隆细胞株成为可能[吴海涛，胡云龙，陈松，等，中国生物工程杂志，2004；24(8)：1-5]。构建哺乳动物高效筛选表达载体，是哺乳动物细胞株生产制药的重要研究内容。

为了获得高效表达的细胞株，需要用携带筛选基因和目的基因的载体，转染哺乳动物细胞，并使载体随机整合到细胞基因组中，通过加压筛选，获得稳定表达的细胞株。真核细胞的筛选基因主要包括两类：一类是新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,NEO)等非扩增基因，它不影响目的基因的拷贝数；另一类是共扩增基因，如二氢叶酸还原酶(Dihydrcofolate reductase，DHFR)基因、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)基因等。G418是一种氨基糖苷类抗生素，通过影响核糖体的功能阻断蛋白质的合成，当NEO基因整合到基因组后，NEO基因编码的抗性产物新霉素磷酸转移酶，可以将G418转变成无毒形式，从而使细胞在含G418的培养基中生长。叶酸类似物氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)能抑制二氢叶酸还原酶DHFR活性，导致无法合成四氢叶酸，将携带目的基因和DHFR基因的质粒转染DHFR缺乏的细胞，在MTX选择压力下，幸存下来的细胞的DHFR基因得以扩增，带动目的基因的扩增[Looney JE，Hamlin JL.Mol cell Biol，1987；7(2)：569-577]。然而，在选择压力下，DHFR临近基因的扩增大小和范围是处于变化中的，扩增不稳定。谷氨酰胺合成酶扩增系统是新近发展起来的，当细胞在缺乏谷氨酰胺、加入谷氨酰胺合成酶抑制物(Methionine sulphoximine，MSX)的条件下培养，GS基因不仅自身进行自我复制，还能够带动外源基因随着GS基因的复制而复制，达到目的基因的高水平表达[Bebbington CR，Renner G，Thomson S，et al，Biotechnology，1992；10(2)：169-175]，谷氨酰胺合成酶扩增系统具有更高的扩增效率，但是筛选到的细胞生长状态不佳。

对筛选标记进行弱化后，若筛选标记整合到细胞低表达整合位点，则标记基因自我扩增(复制)拷贝数较低，而细胞株由于低表达量不足以应付较高的压力，从而在筛选过程中死亡。只有少量筛选标记整合到转录活跃区的细胞，因筛选标记的高倍数扩增而在较高的压力下存活下来。由于双表达载体的目的基因紧邻筛选标记，筛选标记与目的基因会整合到染色体同一位点，如果他们同在转录活跃区，从而增加了目的基因的拷贝数，提高了表达水平。常用的弱化筛选基因的方法包括：对筛选基因进行突变，削弱其表达功能；改造起始密码子临近序列，弱化基因表达以及弱化启动子的转录。据报道，删除SV40启动子中的一个72bp重复序列，或删除一个72bp重复序列，并在剩余的72bp重复序列的第5-7位引入TGG-GTT突变，使得SV40启动子的转录活性降低为野生型的1/1000或1/36[Zenke M,T,Matthes H,et al.EMBO,1986,5:387-397]。

构建一个或多个基因的高表达载体，通常是将较强的顺式作用元件集中到一个载体中启动外源基因表达，以提高重组蛋白的产量。真核细胞的启动子，主要有猴空泡病毒SV40(Simian vacuolating virus 40，SV40)、人巨细胞病毒CMV(cytomegalovirus，CMV)、人延伸因子EF-1α(elongation factors 1α，EF-1α，1α是延生因子的亚基编号)启动子，前者主要用于选择基因的表达，后面两个可以高效的表达重组蛋白。EF-1α启动子是目前最强的启动子之一，在细胞的不同时期表达都很高[Sunghoi Hong,Dong-Youn Hwang1,Soonsang Yoon，et al,Molecular Therapy,2007；15(9),1630–1639]。巨细胞病毒CMV(cytomegalovirus，CMV)启动子(pCMV)即早期启动子，仅在S期(细胞周期中的DNA合成期)激活,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖,这不利于连续持久大规模培养宿主细胞。而人延伸因子lα亚基启动子(pEF-1α)不受细胞周期限制,且启动子强度高于pCMV,有利于大规模外源蛋白的生产[来大志，翁少洁，于长明，等，生物化学与生物物理进展，2004；31(2)：118-126]。因此本发明表达载体中目的基因采用了EF-1α强启动子，以期得到较高外源蛋白的表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中阳性克隆率低、筛选周期长、目的蛋白表达量低等不足之处，提供了哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法。由于许多哺乳动物细胞有内源的DHFR和GS基因，如果只用单一的DHFR或GS系统来筛选，筛选过程中高表达细胞的阳性率较低，筛选基因的联合使用，可以使筛选时细胞的阳性率增高。由于GS和DHFR都是共扩增基因，如果利用GS-DHFR共同或者分别加压筛选，可以结合DHFR和GS系统的优点并克服二者的缺点，双筛选标记的同时应用使目的基因扩增的拷贝数更高，大大提高目的基因的表达量，可以构建更高效的表达载体。同时，由于哺乳动物细胞不含内源的NEO抗性基因，如果联合GS、NEO基因构建双表达系统的载体共同作用细胞，可以有效利用GS的扩增功能和NEO的筛选系统的特点，快速获得高效表达的细胞株。本发明构建了两种携带不同筛选基因的哺乳动物细胞表达载体pGD和pGN。这两种载体的所有筛选基因都采用了弱化的SV40的启动子，所有外源基因都用了强的外源基因启动子pEF1α，两种载体都采用了两种筛选标记(pGD使用了GS和DHFR双筛选标记，而pGN则使用了GS和NEO双筛选标记)，这两种高表达质粒可以针对不同要求而使用。上述两种载体的使用可以使得外源基因的表达量更高，也易于筛选到高表达的细胞克隆并缩短了筛选时间。因此使用所述载体筛选高表达单克隆细胞，具有速度快、阳性克隆率高、目的蛋白表达量高等特点。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

哺乳动物双基因高效筛选表达载体包含载体pGD和载体pGN；所述载体pGD和所述载体pGN均包含双筛选基因，所述载体pGD的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS基因和二氢叶酸还原酶DHFR基因；所述载体pGN的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS筛选基因和新霉素磷酸转移酶NEO基因；所述双筛选基因的启动子均进行了弱化；所述双筛选基因的目的基因表达框均含有强启动子。

优选地，所述双筛选基因启动子的弱化采用缺失突变SV40启动子的方法。

更加优选地，所述筛选标记包含弱化的SV40启动子控制的GS基因、DHFR基因或NEO基因。

更加优选地，所述强启动子用于启动外源基因的表达，所述强启动子采用pEF-1α强启动子。

更加优选地，所述目的基因表达框依次含有EF-1α强启动子、目的基因以及polyA多聚腺苷酸尾巴序列。

更加优选地，所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其构建方法包括：

①以含有谷氨酰胺合成酶GS基因的哺乳动物表达载体pBHHU、含有二氢叶酸还原酶DHFR基因的哺乳动物表达载体pSV2-DHFR和含有新霉素磷酸转移酶NEO基因的哺乳动物表达载体pEF1/myc-hisB为基础载体，以即用型阳性选择克隆载体pZeroback为辅助载体，构建独立的筛选基因载体；

②将DHFR筛选基因或NEO筛选基因的表达框分别与含有弱化了SV40启动子的GS筛选基因连接，构建含有双筛选基因的表达载体pGD或载体pGN。

更加优选地，所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体pGD或载体pGN的应用：

(1)将目的基因插入到带有pEF1α强启动子的载体pEF1/myc-hisB的多克隆位点；

(2)将目的基因的高表达载体与筛选载体pGD或载体pGN连接。

更加优选地，所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体用于单基因或双基因的表达载体的构建。

更加优选地，所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体用于包含CHO和NSO(小鼠胸腺瘤细胞)的哺乳动物细胞筛选稳定高表达细胞株。

本发明一种哺乳动物双基因高效筛选表达载体的设计要点在于：

哺乳动物双基因高效筛选表达载体包含载体pGD和载体pGN，载体pGD包括谷氨酰胺合成酶GS基因、二氢叶酸还原酶DHFR基因，载体pGN包括谷氨酰胺合成酶GS基因、新霉素磷酸转移酶NEO基因，载体pGD和载体pGN的所有筛选标记均使用弱化的SV40的启动子。所有筛选基因(谷氨酰胺合成酶GS，二氢叶酸还原酶DHFR和新霉素磷酸转移酶NEO)前的SV40启动子均进行了弱化，在选择压力下，只有载体整合到细胞染色体活跃区的细胞，因选择基因产物的大量表达而存活下来；另外在提高筛选压力的时候，只有筛选基因的复制拷贝数较高的细胞株能够适应高压力而存活下来，高拷贝的筛选基因带动了目的基因高拷贝扩增，从而使外源基因表达量增高。

本发明弱化了筛选基因GS的SV40启动子，去掉了sph Ⅰ间的72bp重复序列，去掉的重复序列如SEQ ID No 1。强启动子pEF1α的应用使得目的基因在同一拷贝数情况下目的基因的mRNA转录水平较高，从而使目的蛋白的表达量更高，而且不受细胞周期等影响和限制，这种启动子适合大规模的外源蛋白表达。本发明的真核表达载体，是以pBHHU、pSV2-DHFR、pEF1/myc-hisB为基础载体，筛选基因是以pBHHU内GS筛选基因的表达框、pSV2-DHFR内的DHFR筛选基因表达框、pEF1/myc-hisB内的NEO筛选基因表达框为基础，目的基因表达是来源于带有启动子pEF-1α的载体pEF1/myc-hisB。所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体pGD、pGN，其与带有强启动子pEF-1α的目的基因连接，可快速且高效地筛选出目的蛋白高表达细胞株。

其中，所述poly A多聚腺苷酸是指位于mRNA 3’-末端一段含150-200个腺苷酸残基的序列(又称为尾巴结构)。在真核生物中，多聚腺苷酸化是指多聚腺苷酸与mRNA分子的共价链结。polyA多聚腺苷酸可以保护mRNA免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译都十分重要。

其中，pBHHU这个质粒前的p是plasmid即质粒的首字母，pBHHU是含GS筛选基因的表达框的哺乳动物表达载体。pSV2-DHFR是含有DHFR筛选基因表达框的哺乳动物表达载体；pEF1/myc-hisB是含有NEO筛选基因表达框的哺乳动物表达载体，pEF1是强启动子，myc和hisb是纯化时用到的标签；pZeroback是零背景即用型阳性选择克隆载体。

本发明进行生物材料样品保藏，保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所；保藏日期是：2015年6月3日；保藏编号是：CGMCC No.10947；分类命名是：哺乳动物 双基因高效筛选表达载体。

本发明进行生物材料样品保藏，保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所；保藏日期是：2015年6月3日；保藏编号是：CGMCC No.10948；分类命名是：哺乳动物 双基因高效筛选表达载体。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明联合GS-DHFR、GS-NEO双基因筛选系统、转录弱化的筛选基因表达框和带有强启动子的目的基因表达框等方法构建载体，利用该载体可以方便快速的获得目的基因高效表达的稳定细胞株，且细胞克隆阳性率较高。

说明书附图

图1示出了pBHHU质粒图谱；

图2示出了pSV2-DHFR质粒图谱；

图3示出了pEF1/myc-hisB质粒图谱；

图4示出了pBH-pZeroback质粒图谱；

图5示出了pBHHU-1质粒图谱；

图6示出了pGD质粒图谱；

图7示出了pGN质粒图谱；

图8示出了pEF1-pZeroback-11质粒图谱；

图9示出了pGD-EF1-031、pGN-EF1-031质粒电泳验证图；注：泳道1为对照PGD，泳道2-7为pGD-EF1-031的6个单克隆，泳道8、9为pGN-EF1-031的两个单克隆。

图10示出了pGD-EF1-031酶切验证图；注：各泳道酶切验证1.MluI；2.SalI；3.NotI；4.MluI&SalI；5.SalI&NotI；6.MluI&NotI；7.MluI&SalI&NotI。

图11示出了pGN-EF1-031酶切验证图；注：各泳道酶切验证1.MluI；2.SalI；3.NotI；4..MluI&SalI；5.SalI&NotI；6.MluI&NotI；7.MluI&SalI&NotI。

图12示出了ELISA定量检测重组蛋白031表达的标准曲线示意图。

具体实施方式

本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。尤其下述实施例6、7和8中的基因并不仅限于实施例中表述的抗体031，也可以是其他基因片段。

以下结合附图和实施例详述本发明。

实施例1：GS筛选基因构建pBHHU-1的具体步骤：

pBHHU(质粒图谱如图1所示)的两个单一酶切位点Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ间的序列含有筛选基因GS的表达元件。

首先用Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切pBHHU和pZeroback-ASDHⅢ(对购于天根生化科技有限公司的pZeroback零背景快速克隆试剂盒中的pzeroback Vector做加Sal Ⅰ位点、去HindⅢ位点突变)，将从pBHHU载体酶切下的谷氨酰胺合成酶GS基因的表达元件与酶切后的pZeroback-ASDHⅢ连接，测序正确的连接载体再用sphI酶切，去掉SV40启动子sph Ⅰ间的72bp重复序列(如SEQ ID NO.1)，将sphI酶切后的大片段进行载体自连，筛选到的载体即为含有弱化SV40启动子的GS表达元件，将此质粒命名为pBH-pZeroback(质粒图谱如图4所示)。用SalI和BglII双酶切pBH-pZeroback，切下有弱化SV40启动子的GS表达元件，插回到pBHHU的SalI和BglI位点间，构建成pBHHU-1(质粒图谱如图5所示)，pBHHU-1含有弱化的SV40启动子、GS基因和SV40polyA。

实施例2：DHFR筛选基因构建pZeroback-DHFR5C的具体步骤：

利用第一对引物P-DHFR-B2-D-F、DHFR-SalI-R(序列如SEQ ID NO.2所示)，为pSV2-DHFR(质粒图谱如图2所示)突变BglII位点，同时在DHFR表达框的一端添加SalI位点；PCR反应的关键条件:Tm＝60℃20cycles。

利用第二对引物DHFR-XhoI-F、P-DHFR-D-R(序列如SEQ ID NO.2所示)，为pSV2-DHFR(质粒图谱如图2所示)突变BglII位点，同时在DHFR表达框的另一端添加XhoI位点；PCR反应关键条件:退火温度Tm＝60℃，循环数20cycles。

用上述引物做第一轮PCR后，进行PCR产物纯化，纯化的PCR产物按照1:1混匀作模板，用引物DHFR-XhoI-F、DHFR-SalI-R，进行第二轮overlap PCR(重叠PCR)，退火温度Tm＝56℃，循环数20cycles，PCR产物进行粘性末端补平，连接载体pZeroback，得到新的质粒pZeroback-DHFR5C。

其中，引物DHFR-XhoI-F设计在重复序列内部，在PCR时有效的去除了重复序列，故中间载体pZeroback-DHFR5C含有弱化的SV40启动子、DHFR基因和SV40polyA。

实施例3：NEO筛选基因构建pZeroback-NEO的具体实验步骤：

以pEF1/myc-hisB(质粒图谱如图3所示)为模版,Neo-Xho-F和Neo-Sal-R(序列如SEQ ID NO.3)为引物，扩增出Neo基因表达框，并将片段连接到pZeroback中并测序，测序正确的质粒命名为pZeroback-NEO。

其中，引物Neo-Xho-F在设计时除去了SV40启动子的72bp的重复序列，故NEO的启动子是弱化的SV40启动子。

实施例4：双基因筛选基因载体pGD(质粒图谱如图6所示)的构建：

将pBHHU-1中的谷氨酰胺合成酶GS基因表达框与pZeroback-DHFR5C中的DHFR基因表达框连接到一起，此载体命名为pGD。pGD的具体构建步骤如下：

pBHHU-1用Sal Ⅰ单酶切，切胶回收所需的产物用CIAP去磷酸化，同时pZeroback-DHFR5C用XhoI和SalI双酶切，酶切回收所需的片段。将两个回收片段连接起来，筛选正确的质粒并测序验证，将得到的质粒命名pGD，这个质粒含有DHFR和GS双筛选标记，其中两个筛选基因均由弱化的SV40启动子来控制。

实施例5：双基因筛选基因载体pGN(质粒图谱如图7所示)的构建：

将pBHHU-1中的谷氨酰胺合成酶GS基因表达框与pZeroback1-NEO中的Neo基因表达框连接到一起，此中间载体命名为pGN。pGN的具体构建步骤如下：

pBHHU-1用Sal Ⅰ单酶切，切胶回收产物用碱性去磷酸化酶CIAP去磷酸化，同时将pZeroback-NEO用XhoI和SalI双酶切后回收所需的片段。连接两个回收产物，鉴定后测序验证，将得到的质粒命名pGD，这个质粒含有NEO和GS双筛选标记，其中筛选基因的启动子均是弱化了的SV40启动子。

实施例6：强启动子表达载体的构建：

本发明用MluI、SmaI双酶切pEF1/myc-HisB(质粒图谱如图3所示)质粒，将质粒pEF1/myc-HisB的强启动子pEF-1α、多克隆位点MCS、牛生长激素多腺苷酸化信号BGH polyA连接到pZeroback中，此载体命名为pEF1-pZeroback-11(质粒图谱如图8所示)，并用引物(引物序列如SEQ ID NO.4)环式突变掉了HindIII、NotI位点，并在pZeroback的HindIII突变引入了MluI和SalI，新载体分别命名为pEF1-MHNM、pEF1-MHNS。突变后的载体便于在多克隆位点插入目的基因。环式突变的高保真酶Pfu-Ultra Ⅱfusion HS DNA polymerase购于Agilent公司，环式突变PCR体系:模板(20ng/μL)1μL，引物primer-F(10mΜ)1μL，引物primer-R(10mΜ)1μL，缓冲液buffer(10X)5μL，DNTP(2.5mM)5μL，高保真酶Pfu-Ultra Ⅱfusion HS DNA polymerase 1μL，H₂O 36μL。PCR扩增程序：95℃2mim；95℃20s,55℃30s,72℃1.5min,14cycles；72℃3min。最后，取2μL Dpn1，37℃酶切2h，消化掉原始未突变的质粒，转化涂板，挑单克隆测序。

实施例7：将高表达目的基因的表达框与筛选载体pGD连接，构建pGD-EF1-031：

将抗体031的轻重链分别插入到PEF1-MHNM、PEF1-MHNS的多克隆位点，命名为PEF1-MHNM-031L、PEF1-MHNS-031H，然后用NotI和MluI双酶切轻链所在载体PEF1-MHNM-031L，用NotI和SalI双酶切重链所在载体PEF1-MHNS-031H，回收目的片段；载体pGD为了便于将目的片段从凝胶上区分出来，需要先用EcoRI单酶切，回收约9500bp片段，然后用SalI和MluI双酶切，回收同时含有GS表达框和DHFR表达框的目的大片段；最后将含有两个筛选基因表达框的大片段与带有强启动子pEF-1α的抗体031的轻重链做连接，新质粒命名为pGD-EF1-031(质粒酶切验证结果如图9所示)。质粒pGD-EF1-031含有弱化了启动子的GS、DHFR双筛选基因，而且031的启动子采用了强启动子pEF-1α。

实施例8：将高表达目的基因的表达框与筛选载体pGN连接，构建pGN-EF1-031：

用NotI和MluI双酶切轻链所在载体PEF1-MHNM-031L，用NotI和SalI双酶切重链所在载体PEF1-MHNS-031H，回收目的片段；载体pGN为了便于将目的片段从凝胶上区分出来，需要先用EcoRI单酶切，回收约9200bp的片段，然后用SalI和MluI双酶切，回收同时含有GS表达框和NEO表达框的目的大片段；最后将含有两个筛选基因表达框的大片段与带有强启动子pEF-1α的抗体031的轻重链做三连，新质粒命名为pGN-EF1-031(质粒酶切验证结果如图10所示)。质粒pGN-EF1-031含有弱化了启动子的GS、NEO双筛选基因，而且031的启动子采用了强启动子pEF-1α。

实施例9：重组质粒转染CHO细胞

CHO DG44细胞(pGD-EF1-031转染时用)和CHO-K1细胞(pGN-EF1-031转染时用)与培养基(购于Invitrogen公司)用于悬浮培养条件下重组蛋白表达和高表达细胞株的筛选。将冻存的细胞置于37℃水浴锅，尽量在2分钟内使其复苏，把解冻的全部1ml细胞(≥1×10⁷个细胞)转接到含有29ml预热培养基的125ml摇瓶中，在135rpm，37℃，5％CO2条件下培养。传代时密度保持在3×10⁵个/ml左右。当细胞密度达到5×10⁵个/ml，细胞活率>95％时，进行转染(混合质粒和FreeStyle^TM MAX试剂，室温孵育10到20分钟，将混合物转接到125ml摇瓶中培养)。待细胞恢复活力后，进行加压筛选。

实施例10：快速获得稳转细胞株

为了获得稳转细胞株，将转染细胞在转染24h后，按照1:10的比例将细胞传代至150mm细胞培养皿中，传代24h后换成筛选培养基进行筛选，重组质粒pGD-EF1-031转染的CHO-DG44细胞，在CD OptiCHO+50μM MSX+10nM MTX的选择压力条件下，重组质粒pGD-EF1-031转染的CHO-K1在CD OptiCHO+50μM MSX+800μg/ml G418的选择压力条件下，对照组pBHHU-031质粒转染的CHO-K1在CD OptiCHO+50μM MSX的选择压力条件下筛选表达，加压筛选一周后，采用有限稀释法筛选单克隆细胞。每组分10块96孔板，每空一个细胞，进行稳定细胞株筛选。

实施例11：重组CHO DG44细胞上清中抗体定量检测

A.上清的获得

重组质粒pGD-EF1-031/pGN-EF1-031分别转染CHO-DG44/CHO-K1细胞后，将加压筛选后的CHO细胞按照2×10⁵个/ml的密度接种于含有30ml CD OptiCHO^TM培养基的125ml的摇瓶中培养，6天后，离心收集上清。对照组用pBHHU-031质粒转染CHO–K1细胞。

B.定量ELISA检测重组蛋白的表达

重组质粒pGD-EF1-031转染的CHO-DG44在CD OptiCHO+50μM MSX+10nM MTX的选择压力条件下，收集细胞培养上清，检测抗体031的蛋白表达；

重组质粒pGN-EF1-031转染的CHO-K1在CD OptiCHO+50μM MSX+800μg/ml G418的选择压力条件下，收集细胞培养上清，检测抗体031的蛋白表达；

对照组pBHHU-031质粒转染的CHO-K1在CD OptiCHO+50μM MSX的选择压力条件下，收集细胞培养上清，检测抗体的蛋白表达。

3.ELISA定量测定上清抗体含量具体步骤：

(1)首先配置标准品，用CD OptiCHO^TM培养基稀释纯化的031抗体(已测浓度)，作为标准品。

(2)用包被液包被抗原，100ul/孔，4℃过夜，PBST洗板三次；200ul/孔封闭液(PBS+1％BSA)37℃封闭2h，PBST洗板三次；加入标准品和待测样品100ul/孔，37℃孵育1h，PBST洗板三次；加入羊抗人-HRP过氧化物酶100ul/孔，37℃孵育1h，PBST洗板三次；TMB底物显色试剂盒显色；用酶标仪检测波长562nm(630nm作参比波长)处的吸光值，取其增量做标准曲线，计算重组蛋白浓度。

表1、ELISA定量检测重组蛋白031的表达

(3)结果分析：根据所述表1的测定结果，以标准品的浓度值为横坐标，以浓度值对应的OD562和OD630处的吸光值的增量为纵坐标，做标准曲线(如图12所示)，标准曲线的相关系数R²＝0.9943，通过公式y＝1.6434x-0.018，计算稀释后样品的浓度，所得值乘以样品的稀释倍数，得出细胞上清中031的浓度：即在50μM MSX+10nM MTX的选择压力条件下，pGD-EF1-031转染的细胞上清中031蛋白浓度为750mg/L；在50μM MSX+800μg/ml G418的选择压力条件下，pGN-EF1-031转染的细胞上清中031蛋白浓度为660mg/L；对照组pBHHU-031在MSX浓度为50μM MSX时，细胞上清的031蛋白浓度为220mg/L。经过优化的双基因筛选系统质粒转染CHO后，蛋白质的表达水平明显高于优化前的表达系统中的蛋白质表达水平。另外，经过优化的双基因筛选系统得到的阳性克隆率更高，如表2所示：

表2、高表达细胞克隆的阳性率

样品	pGD-EF1-031	pGN-EF1-031	pBHHU-031
				阳性克隆率(％)	33.2	56.0	7.6

在逐步增加筛选压力时，所述的表达质粒结果应该比未经改造的质粒更具有优势。因此，这种筛选基因启动子弱化、目的基因有强启动子的且带有双筛选基因标记的质粒可以应用于哺乳动物细胞高表达细胞株的筛选，具有很强的实用价值。

对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：包含载体pGD和载体pGN，所述载体pGD和所述载体pGN均包含双筛选基因，所述载体pGD的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS基因和二氢叶酸还原酶DHFR基因；所述载体pGN的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS筛选基因和新霉素磷酸转移酶NEO基因；所述双筛选基因的启动子均采用缺失突变SV40启动子的方法进行了弱化，所述SV40启动子去掉了sphⅠ间的72bp重复序列，去掉的重复序列如SEQID No.1；所述双筛选基因的目的基因表达框均含有强启动子；所述强启动子采用pEF-1α强启动子启动外源基因的表达。

2.根据权利要求1所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述筛选标记包含弱化的SV40启动子控制的GS基因、DHFR基因或NEO基因。

3.根据权利要求1所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述目的基因表达框依次含有EF-1α强启动子、目的基因以及polyA多聚腺苷酸尾巴序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其构建方法包括：

(1)以含有谷氨酰胺合成酶GS基因的哺乳动物表达载体pBHHU、含有二氢叶酸还原酶DHFR基因的哺乳动物表达载体pSV2-DHFR和含有新霉素磷酸转移酶NEO基因的哺乳动物表达载体pEF1/myc-hisB为基础载体，以即用型阳性选择克隆载体pZeroback为辅助载体，构建独立的筛选基因载体；

(2)将DHFR筛选基因或NEO筛选基因的表达框分别与含有弱化了SV40启动子的GS筛选基因连接，构建含有双筛选基因的表达载体pGD或载体pGN。

5.根据权利要求4所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体pGD或载体pGN的应用，将双基因高效筛选表达载体pGD或载体pGN，与带有强启动子的外源目的基因连接，其过程包括：

(1)将目的基因插入到带有pEF1α强启动子的载体pEF1/myc-hisB的多克隆位点；

(2)将目的基因的高表达载体与筛选载体pGD或载体pGN连接。

6.根据权利要求4所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体用于单基因或双基因的表达载体的构建。

7.根据权利要求4所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体用于包含CHO和NSO的哺乳动物细胞筛选稳定高表达细胞株。