CN108368504A - 细胞的早期转染后分离(epic)用于生物制品产生 - Google Patents
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Abstract
本文提供的是用于选择表达靶多肽的细胞的群体的方法。在一些方面，本公开提供了基于转染的宿主细胞的群体的可选多肽的早期表达，用于分选和选择方法。在某些实施方案中，基于所述可选多肽，分选使用荧光激活的细胞分选或磁性激活的细胞分选进行。这样的选择方法可进一步用来生成生产者细胞的克隆群体，例如用于感兴趣的靶多肽的大规模制造。
Description
相关申请
本申请要求于2015年10月9日提交的美国临时专利申请号62/239,515的优先权的权益。在先申请的内容通过提及以其整体由此并入。
背景技术
用于选择生产者细胞群体和细胞克隆的方法对制造生物制品如抗体和融合蛋白是必要的。这样的方法通常依赖于选择剂如甲氨喋呤(MTX)或甲硫氨酸砜亚胺(methioninesulphoximine,MSX)的使用，以偏好和放大生物制品的产生。基于选择剂的方法可影响选择的群体的存活力和生长速率，或可对克隆稳定性具有负面影响。这样的基于药物的选择也可为耗费时间的，经常需要多轮选择，以获得含有适合于生物制剂制造的克隆的群体。这仍然需要快速且可靠的生成产生高效价和对宿主细胞的负面影响较小的生物制剂的克隆和大细胞群体两者的方法。
发明内容
在一些方面，本公开提供了选择表达靶多肽的细胞的群体的方法。如本文所述，依赖于群体转染后不久的分选，开发了用于选择的方法。因此，该方法的特征在于分离转染的细胞的亚群用于转染的载体的早期可检测表达的步骤。在某些实施方案中，选择是基于可选多肽的早期表达，所述可选多肽不同于靶多肽，而且是在细胞的表面上可检测的。
意想不到地，发现本文所述的方法比使用两轮MTX选择来产生汇集物的传统方法更快，并且比包括单轮MTX选择的传统MTX扩增更高效。
本文所述的方法例如对生成用于筛选感兴趣的多肽的细胞的汇集物(如在早期临床发展中)和对生成高效价克隆是有用的，其可用来产生用于小规模和大规模制造的感兴趣的多肽。
因此，在一些方面，本公开提供了产生表达靶多肽的生产者细胞的群体的方法，所述方法包括：(a)用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中所述一个或多个mRNA编码可选多肽和所述靶多肽；(b)在转染后的2至15天内，从所述转染的宿主细胞分离表达所述可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群；和(c)扩大所述早期表达的转染的宿主细胞的亚群，由此产生生产者细胞的群体。
在一些实施方案中，所述步骤(b)在无药物选择培养基中进行。
在一些实施方案中，所述步骤(c)在无药物选择培养基中进行。
在一些实施方案中，所述步骤(b)和(c)各自在无药物选择培养基中进行。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括从扩大的亚群中分离所述靶多肽。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述扩大的亚群中分离一个或多个单一转染的宿主细胞，和培养所述一个或多个单一转染的宿主细胞以产生一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体。
在提供的任一方法的一些实施方案中，与在步骤(c)中获得的转染但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，所述一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体的至少一个在靶多肽产生中得到2至30倍改善。
在提供的任一方法的一些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞含有至少80-120x 106个细胞。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后少于6天进行。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后2-4天进行。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后2天进行。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后3天进行。
在提供的任一方法的一些实施方案中，在步骤(c)中的扩大之前，所述转染的宿主细胞的亚群含有0.5-6.0x 106个细胞。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(c)的扩大进行4-31天。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述一个或多个载体的第一个编码mRNA，所述mRNA编码所述靶多肽，所述一个或多个载体的第二个编码mRNA，所述mRNA编码所述可选多肽。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述编码所述靶多肽的mRNA和所述编码所述可选多肽的mRNA两者均在一个载体上编码。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述一个或多个载体的第一个编码mRNA，所述mRNA编码所述靶多肽，并且所述一个或多个载体的第二个编码mRNA，所述mRNA编码所述可选多肽。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述编码多个靶多肽的mRNA和所述编码多个可选多肽的mRNA两者均在一个载体上编码。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离采用磁性激活的细胞分选(MACS)、荧光激活的细胞分选(FACS)或ClonePix。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述可选多肽是FACS可选多肽，而且所述步骤(b)中的分离采用FACS。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述靶多肽和所述可选多肽形成融合多肽。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述mRNA是多顺反子mRNA。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述多顺反子mRNA包含编码所述可选多肽的第一开放读码框(ORF)，和编码所述靶多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述第一ORF具有非AUG起始密码子。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述第二ORF具有AUG起始密码子。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述编码所述可选多肽的ORF没有任何AUG序列。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述可选多肽是CD52或CD59。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述靶多肽是治疗剂。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述靶多肽是分泌蛋白。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述靶多肽是抗体或Fc融合蛋白。
在提供的任一方法的一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。
本公开的其他方面涉及表达通过上述或本文另外描述的任一方法可获得的可选多肽和靶多肽的转染的宿主细胞的克隆群体。
附图说明
图1A是描绘传统转染和选择与基于EPIC的转染和选择之间的比较的示意图。早期表达指在重要的基因组整合之前、在转染后早期的表达。
图1B是显示在核苷酸缺乏选择过程中细胞从第3天至第21天的转染的群体的报道蛋白表达的图解(与模拟转染的群体比较)。转染的细胞在转染后不久(例如，第3-4天)表现出明显的早期表达，然后在完成选择时(第18-21天)转变到稳定的表达。
图2是一系列的FACS直方图偏移(histogram offsets)，其描绘来自相同载体(pGZ729-RFP)的红色荧光蛋白(RFP)和细胞表面报道蛋白CD52表达两者的早期表达。没有选择压力被施加到转染的细胞。RFP和CD52的峰值早期表达出现在第2天和第3天之间。
图3是一系列的FACS直方图偏移，其描绘在转染有pGZ729-RFP(编码可选多肽CD52和靶多肽RFP两者)或pGZ700-RFP(仅编码靶多肽RFP)的细胞中RFP和CD52的第3天早期表达。
图4是显示在转染后不久EPIC生成用于选择的细胞的亚群的方法学，和在分离/扩大分选富集的群体时对报道蛋白表达和单克隆抗体(mAb)效价两者的有益影响的示意图。模拟指模拟转染。
图5是描绘与传统MTX方法学相比EPIC生成的汇集物的第14天未补料分批效价的图。
图6是描绘来自实现了范围1.5-2.0g/L的最高表达的EPIC生成的克隆的第14天未补料分批效价的图。最左边的条(0.5g/L)表示克隆之前EPIC分选的汇集物的效价。所有其他垂直条表示单个克隆的效价。
图7是一系列的直方图偏移，其描绘了EPIC靶向以生成转染有pGZ729-RFP的稳定的汇集物的相对益处。EPIC用来靶向第2天的早期RFP表达，这与传统转染/选择方法(0nMMTX)相比，产生具有改善的RFP(和CD52报道蛋白表达)的稳定的汇集物。
具体实施方案
在描述本发明前，应该理解的是本发明不局限于本文所公开的具体方法和实验条件；因为这样的方法和条件可能改变。还应该理解的是本文所使用的术语仅用于描述具体的实施方案的目的，并不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。
此外，除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域技术中的常规分子和细胞生物学以及免疫学技术。这样的技术是技术人员已知的，并且在文献中充分地解释的。见，例如，Ausubel等编,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008),包括所有增补；M.R.Green和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第四版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2012)；和Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2013,第2版)。
I.定义
除非本文另有定义，否则本文所使用的科学和技术术语具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何字典或外在定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”以及其他形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。
通常，连同本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名是本领域中已知的和通常使用的那些。除非另有说明，否则本文所提供的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法进行，并如贯穿本说明书引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域中通常完成的或如本文所述的。连同本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及试验程序和技术是本领域中已知的和通常使用的那些。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备、配制和递送，以及患者的治疗。
公开内容可更容易地理解，选择术语在下面定义。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”意图指任何长度的核苷酸的多聚形式，其实例包括，但不限于，基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。
如本文所使用的，术语“多肽”意图指任何长度的核酸的多聚形式，其实例包括，但不限于，蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体(包括其片段)和肽。
如本文所使用的，“可选多肽”是可通过任何合适的方法直接或间接检测的多肽，所述方法包括例如而不限于，荧光激活的细胞分选(FACS)、磁性激活的细胞分选(MACS)、ClonePix和亲和色谱法。在某些实施方案中，可选多肽在细胞表面表达，即为细胞表面多肽。可选多肽的实例包括包含胞外结构域的多肽(例如CD52或CD59)，其能够与或通过可检测的结合配偶体(binding partner)(例如，荧光标记的抗体)结合。可选多肽的其他实例包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)及它们的变体，所述变体包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等。在某些实施方案中，可选多肽可以通过流式细胞术直接或间接地方便地检测。
如本文所使用的，“荧光激活的细胞分选”或“FACS”指基于由细胞表达的一个或多个FACS可选多肽的存在、不存在或水平，将细胞的群体分离成一个或多个亚群的方法。FACS依赖于单个细胞的光学特性(包括荧光性)以将细胞分选为亚群。适合于进行本文所述的方法的FACS细胞分选仪是本领域已知的和可商购的。示例性的FACS细胞分选仪包括BDInfluxTM(BD Biosciences)和由其他商业供应商如Sony、Bio-Rad和Beckman Coulter生产的其他等同的细胞分选仪。
如本文所使用的，“FACS可选多肽”是可以通过流式细胞术直接或间接检测的多肽。FACS可选多肽的实例包括包含胞外结构域的多肽(例如，CD52或CD59)，其能够与可检测的结合配偶体(例如荧光标记的抗体)结合以通过流式细胞术间接检测多肽。FACS可选多肽的其他实例包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)及它们的变体，所述变体包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等，其可以通过流式细胞术直接检测。
如本文所使用的，磁性激活的细胞分选或“MACS”指基于由细胞表达的一个或多个MACS可选多肽的存在、不存在或水平，将细胞的群体分离成一个或多个亚群的方法。MACS依赖于标签的单个细胞的磁化率特性以将细胞分离成亚群。适合于进行本文所述的方法的MACS细胞分选仪是本领域中已知的和可商购的。示例性的MACS细胞分选仪包括流式细胞仪(Miltenyi Biotec)。
如本文所使用的，“MACS可选多肽”是可通过磁性激活的细胞分选直接或间接检测的多肽。MACS可选多肽的实例包括包含胞外结构域的多肽(例如，CD52或CD59)，其能够与磁敏感结合配偶体(例如，与抗体偶联的铁、镍或钴标记的珠子)结合用于直接或间接检测多肽。在某些实施方案中，可选多肽可以通过流式细胞术直接或间接地方便地检测。
如本文所使用的，“ClonePix”指基于由细胞表达的一个或多个可选多肽的存在、不存在或水平，将细胞的群体分离成一个或多个亚群的方法和装置。ClonePix依赖于单个细胞或细胞克隆的光学特性(包括白光和荧光检测)以将细胞分选成亚群。ClonePix在Richmond等的各美国专利号7,776,584；8,034,612；8,034,625；8,293,520；8,293,525；8,293,526和8,293,527中描述，并且可从Molecular Devices(Sunnyvale,CA)商购。
如本文所使用的，“靶多肽”指可在宿主细胞中产生的蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体(包括其片段)或肽，而且在本文示例的方面，靶多肽由于其作为治疗剂例如抗体(包括其片段)、Fc融合蛋白、激素或酶的潜力而被选择。在一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。然而，本文所述的方法不限于治疗性多肽的选择和放大。例如，还涵盖诊断多肽或用于环境的多肽以在本文所公开的方法中用作靶多肽。
在某些实施方案中，可选多肽是细胞表面多肽，并且靶多肽是分泌多肽。
如本文所使用的，术语“抗体”指这样的装配体(例如，完整抗体分子、抗体片段或它们的变体)，其对感兴趣的抗原具有重要已知特异性免疫反应活性。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，在它们之间具有或没有链间共价键。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构相对充分理解。
如本文所使用的，术语“抗体”包括全长抗体以及这样的抗体的抗原结合片段和变体。抗体可以是任何类型，如IgG、IgA或IgM；和任何亚类，如IgG1或IgG4。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，或其可以是多克隆抗体或单克隆抗体的片段。抗体可以是嵌合的、人源化的、全人的、双特异性的或双功能的。还涵盖抗体的任何抗原结合片段或变体，如Fab、Fab′、F(ab′)2、它们的单链可变区(scFv)和变体。
如本文所使用的，“Fc融合蛋白”指包含与多肽如蛋白质或肽直接或间接连接的免疫球蛋白Fc结构域的蛋白。连接的多肽可以是感兴趣的任何蛋白质分子，如配体、受体或抗原性肽。
如本文所使用的，术语“生产者细胞”指表达感兴趣的多肽的细胞。在某些实施方案中，生产者细胞是表达如本文所公开的靶多肽的细胞。在某些实施方案中，生产者细胞是表达如本文所公开的可选多肽和靶多肽两者的细胞。
在某些实施方案中，术语“生产者细胞”指适合于在用于产生生物制剂的小规模或大规模制造方法中产生蛋白质的细胞。在一些实施方案中，生产者细胞是哺乳动物或昆虫细胞。本文进一步讨论生产者细胞。
如本文所使用的，“生产者细胞的群体”是表达增强水平的一个或多个多肽(例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽)的细胞的群体。在某些实施方案中，“生产者细胞的群体”是表达增强水平的靶多肽的细胞的群体。在一些实施方案中，增强水平是未选择的群体中的一个或多个多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。在一些实施方案中，增强水平在如通过流式细胞术(例如在BD InfluxTM细胞分选仪上)检测的未选择的群体中的FACS可选多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。在一些实施方案中，增强水平是如通过流式细胞术(例如在流式细胞仪(Miltenyi Biotec)上)检测的未选择的群体中的MACS可选多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。用于生成生产者细胞的群体的方法在本文中描述。
如本文所使用的，“生产者细胞的群体”是表达可检测水平的一个或多个多肽(例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽)的细胞的群体。用于生成生产者细胞的群体的方法在本文中描述。
如本文所使用的，“多顺反子mRNA”是含有至少两个能够编码两个或多个多肽的开放读码框(ORF)的mRNA。
如本文所使用的，“无药物选择培养基”是没有药物(例如甲氨喋呤(MTX))的培养基，其用来选择表达赋予群体或亚群药物抗性的蛋白质(例如二氢叶酸还原酶)的细胞的群体或亚群。
如本文所使用的，“基于培养基的选择”是由此将培养基改为包括选择剂(例如MTX)或排除培养基的组分的选择过程，这引起亚群的选择，所述亚群对选择剂有抗性或在不存在排除的培养基组分的情况下能够存活。
如本文所使用的，“核苷酸缺陷型培养基”是没有或含有低水平(例如小于10微克/mL)的核苷酸的培养基，所述核苷酸具有核苷碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、次黄嘌呤或胸苷)的一个或多个。在一些实施方案中，核苷酸缺陷型培养基是没有次黄嘌呤或胸苷的培养基。示例性的核苷酸缺陷型培养基包括CD CHO培养基(Gibco,LifeTechnologies,目录编号10743(液体)和12490(颗粒))。
如本文所使用的，“存活力标记”是表示细胞存活力的细胞特征，并且可通过FACS检测。示例性的存活力标记包括前向散射、侧向散射、碘化丙锭染色或它们的组合。
如本文所使用的，术语“非AUG起始密码子”意图包括任何非AUG多核苷酸(一般是三联体)，其作为翻译起始的起始位点起作用，相对于AUG起始密码子的效率降低。天然存在的可替换的起始密码子用法是本领域已知的，并且例如在Kozak(1991)J.Cell Biol.115(4):887-903；Mehdi等(1990)Gene91:173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11):5073-5080中描述。一般地，与AUG的翻译效率相比，非AUG起始密码子具有降低的翻译效率；例如，与AUG的翻译效率(100％)相比，可替换的起始密码子GUG可具有3-5％翻译效率。非AUG起始密码子的翻译效率还可以被其序列上下文影响；例如，报道最佳Kozak共有序列对非AUG起始密码子处的翻译起始有积极的作用(Mehdi等(1990)Gene 91:173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11):5073-5080)。完整Kozak DNA共有序列是GCCRCCATGG(SEQ ID NO:1)，其中起始密码子ATG(在RNA中是AUG)是下划线的，称ATG起始密码子的A为+1位，并且在-3位的“R”是嘌呤(A或G)。两个最高保守位是嘌呤，优选地，A在-3，并且G在+4(Kozak(1991)JCell Biol 115(4):887-903)。在美国专利公开2006/0172382和美国专利公开2006/0141577中描述了用于可选标记的减弱表达的可替换的起始密码子用法，其全部内容通过提及并入本文。本领域技术人员会认识到，本文描述为DNA的序列会具有与RNA分子相关的序列，例如，DNA序列ATG会对应于RNA序列AUG，而且反之亦然。
如本文所使用的，术语“EPIC”指细胞的早期转染后分离，如在本文中更详细描述的。
如本文所使用的，术语“FLARE”指“流式细胞术减弱的报道蛋白表达”。FLARE是利用多顺反子mRNA的表达系统，其含有至少两个开放读码框(ORF)，含有非AUG起始密码子并编码FACS可选多肽的上游ORF，和含有AUG起始密码子并编码靶多肽的下游ORF。见美国专利申请公开号12/441,806，其通过提及以其整体并入。
如本文所使用的，术语“约”应指在规定值附近的10％的容许范围。因此，当术语“约”用来修饰规定值时，表示的范围会涵盖规定值的±0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％内的任何数字。
II.用于生产者细胞的早期选择的方法
在一些方面，本公开涉及产生表达靶多肽的生产者细胞的群体，在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中所述一个或多个mRNA编码可选多肽和所述靶多肽；
(b)在转染的2至15天内，从所述转染的宿主细胞分离表达所述可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群；和
(c)扩大所述转染的宿主细胞的亚群，由此产生表达所述靶细胞的生产者细胞的群体。
早期表达转染的细胞可包含不同类型的外源DNA，其一部分尚未整合到细胞的基因组DNA中，并且其一部分已经整合到细胞的基因组DNA中。这两种类型的DNA均具有导致多肽或它们编码的多肽的表达的潜力。
宿主细胞用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染，其中，一个或多个mRNA编码可选多核和靶多肽。可使用适合于从多顺反子mRNA产生靶多肽的任何细胞类型生成生产者细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。合适的真核细胞产生靶多肽的实例包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包括称为CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1的那些，和仓鼠细胞系BHK-21；称为NIH3T3、NS0、C127的鼠细胞系，类人猿细胞系COS、Vero；和人细胞系HeLa、HEK293(也称为293)、NIH-3T3、U-937和Hep G2。合适的宿主细胞的另外的实例包括酵母细胞、昆虫细胞(例如，施耐德果蝇(Drosophila Schneider)S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087)、BTI-TN-5B1-4(High FiveTM)昆虫细胞(Invitrogen))、植物细胞、禽类细胞和牛细胞。用于表达的酵母的实例包括，但不限于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。参见例如，美国专利号4,812,405；4,818,700；4,929,555；5,736,383；5,955,349；5,888,768和6,258,559。生产者细胞的其他实例可为原核的，其包括细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)(例如菌株DH5αTM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、PerC6(Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其他合适的细菌。细胞可以从商业供应商如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,MD)购买，或使用本领域已知的方法从分离物培养。
为制造生产者细胞，可使用任何合适的转移技术(例如，通过转染、转化、电穿孔或转导)将重组或外源多核苷酸插入到宿主细胞中。编码一个或多个mRNA的载体包括DNA载体。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子和微型染色体，其中质粒是一般的实施方案。一般地，这样的载体进一步包括可操作地连接到编码多顺反子mRNA以促进表达的基因的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、启动子和转录终止序列。合适的DNA病毒载体的实例包括腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)。用于递送多核苷酸的基于腺病毒的载体是本领域已知的，并且可商业获得或通过标准分子生物学方法构建。腺病毒(Ad)是一组病毒，其包括超过50个血清型。参见例如，国际专利申请号WO 95/27071。用于本公开的其他病毒载体包括源自牛痘、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(HSV))和逆转录病毒的载体。基因递送运载体还包括一些非病毒载体，其包括DNA/脂质体复合物，和靶向的病毒蛋白-DNA复合物。
为了用于转染，在某些实施方案中，环形载体可例如通过在一个或多个限制性核酸内切酶位点处的限制酶切预线性化，即在引入到宿主细胞中之前线性化。认为线性化对整合到基因组中是必要的，并且这可以通过预线性化或通过天然存在于宿主细胞内的核酸内切酶以随机方式影响。预线性化具有将一定程度的控制引入到限制酶切的位点的潜在优势。因此，在某些实施方案中，可以将环形载体(其包括超螺旋的环形载体)引入到宿主细胞中。在根据本发明的某些实施方案中，一个或多个载体在转染时是线性的。
含有启动子和将多核苷酸可操作地连接到克隆位点中的载体是本领域中已知的，并且可从商业供应商获得。这样的载体能够在体外或在体内转录RNA，并且可从如安捷伦科技(Agilent Technologies)和普洛麦格公司(Promega Corporation)的来源商购。为了最佳化表达和/或在体外转录，可需要在转录或翻译水平去除、添加或改变5′和/或3′非翻译的部分以消除额外的、可能不适合的可替换的翻译起始密码子或可干扰或减少表达的其他序列。或者，可以在起始密码子的5'即刻插入共有核糖体结合位点以增强表达。
可提供启动子用于在生产者细胞中表达。启动子可是组成性的或可诱导的。例如，启动子可可操作地连接到编码多顺反子mRNA的核苷酸，以便其指导编码的多肽的表达。原核和真核宿主的多个合适的启动子是可获得的。原核启动子包括大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子；3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶。真核启动子包括可诱导的酵母启动子，如醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶；RNA聚合酶II启动子，其包括病毒启动子，如多瘤病毒启动子、鸡痘病毒和腺病毒(例如，腺病毒2)启动子、牛乳头瘤病毒启动子、禽肉瘤病毒启动子、巨细胞病毒启动子(CMV，特别地，即时早期基因启动子)、反转录病毒启动子、乙型肝炎病毒启动子、肌动蛋白启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子，以及早期或晚期猿猴病毒40(SV40)启动子和非病毒启动子，如EF-1α(Mizushima和Nagata(1990)Nucleic AcidsRes.18(17):5322)。本领域的技术人员能够选择适当的启动子用于表达给定的宿主细胞中的任何给定的多肽。
在适当的情况下，例如为了在高等真核生物的细胞中表达，可包括另外的增强子元件来代替发现位于上述启动子中的那些增强子元件，或可包括额外的增强子元件以及发现位于上述启动子中的那些增强子元件。适合的哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠IgG2a基因座的增强子元件(参见,WO 2004/009823)。虽然这样的增强子经常位于处于启动子的上游的位点处的载体，它们还可位于别处，例如，在多腺苷酸化信号的非翻译区中或下游。增强子的选择和位置可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。
另外，载体(例如表达载体)可包含用于选择携带载体的宿主细胞的可选标记，并在可复制的载体的情况下，可包含复制的起始点。编码赋予抗生素抗性或抗药性的产物的基因是一般可选标记，而且可用于原核细胞(例如f3-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、tet基因(四环素抗性))和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素B抗性基因)。二氢叶酸还原酶(DHFR)基因允许在多个宿主中选择甲氨喋呤或核苷酸缺乏培养基。相似地，谷氨酰胺合成酶(GS)基因允许选择甲硫氨酸砜亚胺。编码宿主的营养缺陷型标记的基因产物(例如，LEU2、URA3、HIS3)的基因经常在酵母中用作可选标记。还涵盖病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体和能够整合到宿主细胞的基因组中的载体(如逆转录病毒载体)的使用。
在真核系统中，多腺苷酸化和终止信号可以可操作地连接到编码多顺反子mRNA的多核苷酸，如本文所述。这样的信号一般置于开放读码框的3'。在哺乳动物系统中，多腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括源自生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复序列的那些。在酵母系统中，多腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括源自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)基因和醇脱氢酶1(ADH)基因的那些。在原核系统中，一般不需要多腺苷酸化信号，而是通常采用更短和更多定义的终止子序列代替。多腺苷酸化/终止序列的选择可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。除上述以外，可用于增强产率的其他特征包括染色质重塑元件、内含子和宿主细胞特异性密码子修饰。
本公开的生产者细胞含有重组多核苷酸(例如重组cDNA)，其编码多顺反子mRNA分子，其中靶多肽和可选多肽分别从不同ORF翻译。在一些实施方案中，可选多肽是细胞表面多肽。在某些实施方案中，本公开的生产者细胞含有多个重组多核苷酸，其各自编码多顺反子mRNA分子，其中靶多肽和可选多肽分别从不同ORF翻译。因此每个靶多肽可与特定的可选多肽有关。在一些实施方案中，可选多肽是细胞表面多肽。
细胞表面多肽的实例包括，但不限于CD2、CD20、CD52和CD59。CD52和CD59细胞表面多肽的示例性、非限制性氨基酸序列在下面提供。
示例性人CD52多肽的氨基酸序列：
LERFLFLLLTISLLVLVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS(SEQ IDNO:2)
示例性人CD59多肽的氨基酸序列(剪接受体突变体)：
LGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNNCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP(SEQ ID NO:3)
示例性小鼠CD52多肽的氨基酸序列：
LKSFLLFLTIILLVVIQIQTGSLGQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKSGASSIIDAGACSFLFFANTLICLFYLS(SEQ ID NO:4)
在一些实施方案中，提供第一ORF，其编码可选多肽，如CD52或CD59。CD52和CD59的示例性、非限制性ORF序列在下面提供。
示例性人CD52ORF的核苷酸序列：
ttggagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctcgttttggtacaaatacaaaccggactctccggacaaaacgacaccagccaaaccagcagcccctcagcatccagcaacataagcggaggcattttccttttcttcgtcgccaacgccataatccacctcttctgcttcagttga(SEQ ID NO:6)
示例性人CD59ORF的核苷酸序列：
ttgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctcgctgtcttctgccattccggtcatagcctgcagtgctacaactgtcctaacccaactgctgactgcaaaacagccgtcaattgttcatctgattttgacgcgtgtctcattaccaaagctgggttacaagtgtataacaactgttggaagtttgagcattgcaatttcaacgacgtcacaacccgcttgagggaaaacgagctaacgtactactgctgcaagaaggacctgtgtaactttaacgaacagcttgaaaacggagggacatccttatcagagaaaacagttcttctgctggtgactccatttctggcagctgcttggagccttcatccctaa
(SEQ ID NO:7)
示例性小鼠CD52ORF的核苷酸序列：
TTGAAGAGCTTCCTCCTCTTCCTCACTATCATTCTTCTCGTAGTCATTCAGATACAAACAGGATCCTTAGGACAAGCCACTACGGCCGCTTCAGGTACTAACAAAAACAGCACCTCCACCAAAAAAACCCCCTTAAAGAGCGGGGCCTCATCCATCATCGACGCGGGCGCTTGCAGTTTCCTCTTCTTCGCCAATACCCTTATTTGCCTCTTCTACCTCAGCTAACTGAGTAA(SEQ ID NO:8)
如下所述，已经修饰每个在前示例性ORF以消除所有内部ATG三联体。
在一些实施方案中，提供第二ORF，其编码靶多肽，如抗体、酶或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，通过使用用于可选多肽的翻译起始的非AUG起始密码子和用于靶多肽的翻译起始的AUG起始密码子来完成单独的翻译。在该实施方案中，一般地，编码靶多肽的多核苷酸位于编码可选多肽的多核苷酸的下游。单独的翻译还可以使用内部核糖体进入位点(IRES)实现。在一些实施方案中，IRES元件位于编码靶多肽的多核苷酸的上游和编码可选多肽的多核苷酸的下游。在一些实施方案中，IRES元件位于编码可选多肽的多核苷酸的上游和编码靶多肽的多核苷酸的下游。
在一些实施方案中，非AUG起始密码子以翻译可选多肽比翻译靶多肽效率更低的这样的方式位于编码可选多肽的DNA中。为了实现降低的翻译效率，可选多肽的AUG起始密码可改为可替换的非AUG起始密码子，其实例包括但不限于：CUG、GUG、UUG、AUU、AUA和ACG。
因此，当使用可替换的非AUG起始密码子时，可选多肽的表达相对于共表达的靶多肽的表达可以是减弱的。除了起始密码子的替换之外，编码可选多肽的DNA可在所有内部ATG三联体处修饰以防止翻译的内部起始。在一些实施方案中，可选多肽具有短的氨基酸序列(<200个氨基酸)而且通过几乎没有(<10)ATG三联体的多核苷酸编码。
在不希望受理论束缚的情况下，为了开始翻译编码可选多肽和靶多肽两者的mRNA，在mRNA的5′帽结构处开始扫描核糖体，大多数扫描经过可替换的起始密码子(例如，UUG)，而不是在下游AUG起始密码子处开始翻译。然而，翻译起始可在可替换的起始密码子处发生，尽管以非常低的频率，从而还表达低水平的可选多肽。
从转染的宿主细胞中选择早期表达转染的宿主细胞的亚群，其表达可检测水平的可选多肽。在转染期间，单个宿主细胞以基本随机方式吸收不同量的外源多核苷酸，例如DNA。一些细胞会吸收外源多核苷酸的许多拷贝，另一些细胞会几乎不吸收拷贝，并且一些细胞会不吸收拷贝。吸收到给定的细胞中的DNA的量影响DNA的命运，包括其早期表达和其整合到基因组中。
使用DNA转染后，已经被引入到细胞中的至少一些多核苷酸被易位到其转录到mRNA中的核中。在最初几天，引入的DNA的表达可被一类或多类DNA驱除，一些尚未整合到宿主细胞的基因组中，而一些已经被整合到宿主细胞的基因组中。在这点上，认为表达的程度主要与引入到宿主细胞和其核中的DNA的“剂量”成比例。被宿主细胞吸收的外源DNA的量越大，早期表达的程度越大。然而，被引入到宿主细胞中的少量DNA，特别是一旦它是线性的，可整合到宿主细胞的基因组中。因此，在转染后的最初几天，一方面在外源DNA的降解和损失之间有竞争，另一方面将外源DNA随机整合到基因组中。整合可包括引入的DNA的单拷贝或多拷贝。通过宿主细胞吸收的外源DNA的量越大，其整合的机会(和程度)越大。最终，它是整合的DNA，其负责长期生产性表达，即在所有非整合的DNA(例如质粒或附加体DNA)降解到不能有意义的表达的点之后的表达。
因此在转染后的最初2至约15天(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天)，有表达可检测量的可选多肽的早期表达转染的宿主细胞。具体地，在最初2-6天，更具体地，在最初2-4天，而且甚至更具体地在最初2-3天，认为此早期表达是主要地，但非必须排他地，驱除尚未被整合到宿主细胞的基因组中的外源DNA。在转染后的这个早期期间，可能有一定程度的外源DNA到宿主细胞基因组中的整合。因为，该早期表达取决于由宿主细胞和其核吸收的DNA的“剂量”，而且剂量在转染的细胞中基本是随机的，在该早期期间，转染的宿主细胞包括表达不同量的由外源DNA编码的多肽的细胞的亚群。并且，在该早期期间，表达越大量的编码外源DNA的多肽的细胞的亚群，推测吸收越大量的外源DNA，并且因此具有更大机会将DNA并入它们的基因组。
另外，如本文所使用的，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(earlyexpression)”指在转染后的最初2至约15天(例如,2-15天、2-14天、2-13天、2-12天、2-11天、2-10天、2-9天、2-8天、2-7天、2-6天、2-5天、2-4天、2-3天、3-15天、3-14天、3-13天、3-12天、3-11天、3-10天、3-9天、3-8天、3-7天、3-6天、3-5天、3-4天、4-15天、4-14天、4-13天、4-12天、4-11天、4-10天、4-9天、4-8天、4-7天、4-6天、4-5天、5-15天、5-14天、5-13天、5-12天、5-11天、5-10天、5-9天、5-8天、5-7天、5-6天、6-15天、6-14天、6-13天、6-12天、6-11天、6-10天、6-9天、6-8天、6-7天、7-15天、7-14天、7-13天、7-12天、7-11天、7-10天、7-9天、7-8天、8-15天、8-14天、8-13天、8-12天、8-11天、8-10天、8-9天、9-15天、9-14天、9-13天、9-12天、9-11天、9-10天)中的可检测的表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”指在转染后的最初2至约10天中的可检测的表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(earlyexpression)”指在转染后的最初2至约6天中的可检测的表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”指在转染后的最初2至约5天中的可检测的表达。术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(earlyexpression)”指在转染后的最初2至约4天中的可检测的表达。术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”指在转染后的最初2至约3天中的可检测的表达。
用于检测细胞表面标记的本领域中已知的任何方法可以连同本公开的方法使用。例如，抗体或其他细胞表面标记特异性结合剂在允许或有利于抗体与可选多肽结合的条件下直接或间接与转染的宿主细胞接触，并且由此选择早期表达转染的宿主细胞的亚群。抗体或其他结合剂的选择通过以下确定：1)其选择性结合在宿主细胞上表达的可选多肽的能力；和2)其用可检测的标记标记或结合用于例如流式细胞术或FACS的可检测的标记的能力。
在可替换的实施方案中，第一试剂可为结合可选多肽的蛋白质或肽，其中第一试剂继而又结合能够被可检测地标记(例如，并入荧光标记、酶标记、比色标记、磁化标记或其他可检测标记)的第二试剂。尽管并不总是明确说明，意图是“间接”结合可选多肽包括使用任何数量的中间配偶体。在某些实施方案中，“间接”结合可选多肽包括使用一个中间配偶体，例如一个未标记的抗体或其他结合剂。
在一些实施方案中，抗体或其他结合剂直接结合细胞表面标记，而且包含荧光标记。适合的荧光标记包括，但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、藻红蛋白(PE)、赤藓红、别藻蓝蛋白(APE)、香豆素、甲基香豆素、芘(pyrene)、孔雀石绿(Malachite green)、芪(stilbene)、萤光黄、级联蓝和德克萨斯红。其他适合的光染料在Molecular Handbook,第11版,2010中描述。
在一些实施方案中，将荧光标记功能化以促进与抗体或其他试剂的共价附接。适合的官能团包括，但不限于异硫氰酸盐/酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤，其全部可用来使荧光标记与第二分子附接。荧光标记的官能团的选择会取决于与抗体或其他结合剂、可选多肽或第二标记剂的附接的位点。
荧光标记的附接可直接或经由接头到抗体或其他结合剂。一方面，接头是相对短的偶联部分，其通常用来附接分子。在此实施方案中，第一标记部分与候选试剂的附接会如本领域技术人员通常所理解的那样进行，而且可包括以上概述用于并入荧光标记的技术。
用于设计和构建用于流式细胞术的标记的抗体和其他试剂的材料和技术是本领域中已知的，并例如在Bailey等(2002)Biotechnol.Bioeng.80(6)；670-676；Carroll和Al-Rubeai(2004)Expt.Opin.Biol.Therapy4:1821-1829；Yoshikawa等(2001)Biotechnol.Bioeng.74:435-442；Meng等(2000)Gene 242:201-207；Borth等(2001)Biotechnol.Bioeng.71(4):266-273；Zeyda等(1999)Biotechnol.Prog.15:953-957；Klucher等(1997)Nucleic Acids Res.25(23):4853-4860；和Brezinsky等(2003)J.Imumunol.Methods277:141-155中描述。
用于间接连接标记与试剂(其继而结合可选多肽)的合适的结合对包括，但不限于，抗原/抗体，其包括地高辛/抗体、二硝基酚(DNP)/抗DNP、丹酰-X/抗丹酰、荧光素/抗荧光素、萤光黄/抗萤光黄、罗丹明/抗罗丹明和生物素/抗生物素蛋白(或生物素/抗生蛋白链菌素)。结合对应该彼此具有高亲和力，在细胞分选或连同本公开使用的其他检测系统期间足以经受剪切力。
因此，在一些方面，第一标记部分(当使用第二标记部分时)包括，但不限于，半抗原，如生物素。靶分子的生物素化是已知的，例如，已知大量生物素化试剂，其包括用于蛋白质、核酸、碳水化合物和羧酸的生物素化的胺反应剂和硫醇反应剂。相似地，还已知大量其他半抗原化试剂。
用于本文所述的方法的抗体可在细胞培养中、在噬菌体中或在多种动物(其包括但不限于牛、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、绵羊、山羊、马、牛、骆驼、猴子、黑猩猩等)中产生，只要抗体保留对可选多肽的结合的特异性。可通过在一组给定的条件下比较结合适当的抗原与结合无关的抗原或抗原混合物来测试抗体的结合特异性。
在没有直接标记用于可选多肽的抗体或其他结合剂的实施方案中，抗体或结合剂还优选含有并保留结合经由可选多肽结合细胞后可检测的第二试剂的能力。
在一些实施方案中，当可选多肽是CD52时，可选多肽可使用抗CD52抗体检测。“抗CD52抗体”指特异性识别并结合CD52的抗体。可通过本领域已知的方法产生抗CD52抗体。见例如，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987至目前版本)和Antibodies:A Laboratory Manual,第二版(Greenfield编2013)。另外，几个抗CD52抗体是可商购的(例如，与荧光标记缀合的抗体，如由商业供应商AbCam、SeroTec和BioLegend售卖的那些)。
在一些实施方案中，当可选多肽是CD59时，可选多肽可使用抗CD59抗体检测。“抗CD59抗体”指特异性识别并结合CD59的抗体。可通过本领域已知的方法产生抗CD59抗体。另外，几个抗CD59抗体是可商购的(例如，与荧光标记缀合的抗体，如由商业供应商AbCam、SeroTec和BioLegend售卖的那些)。
在具体的实施方案中，当可选多肽是CD20时，可选多肽可使用抗CD20抗体检测。“抗CD20抗体”指特异性识别并结合CD20的抗体。可通过本领域已知的方法产生抗CD20抗体。另外，几个抗CD20抗体是可从供应商，如BD Pharmingen；Beckman Coulter,Inc.(Fullerton,Calif.,多个克隆，包括目录号6604106克隆H299(B1)；同种型IgG2a和目录号IM1565克隆L26,同种型IgG2a)；Invitrogen(Carlsbad,Calif.,克隆:BH-20,同种型:IgG2a和克隆:B-H20,同种型:IgG2a)；BioLegend(San Diego,Calif.,目录号302301,克隆:21-7,同种型:IgG2b,κ)；EMD Biosciences,Inc.,Brand(San Diego,Calif.,目录号217670克隆2H7,同种型:IgG2b)和Anaspec(San Jose,Calif.,目录号29587)商购的。
为了在MACS中使用，其中有更有限数量的抗原特异性磁珠，标记或未标记的初级抗体或其他结合剂(例如Fc融合蛋白)可用来结合可选多肽，然后通过例如同型特异性磁珠结合。例如，Miltenyi Biotec sells CD20微珠和抗小鼠IgG微珠，但不是CD52或CD59微珠；抗小鼠IgG微珠可用来标记初级小鼠IgG抗人CD52或小鼠IgG抗人CD59。
在示例性的、非限制性的方法中，如果存在，如本文所述的转染的宿主细胞群体与识别并直接或间接结合细胞表面上的可选多肽的试剂接触。接触在有利于或适合于试剂或抗体与可选多肽的特异性结合(直接或间接)的条件下进行。然后使用合适的方法如FACS(例如，通过门限(gating)以高水平如群体水平的至少80％的水平表达FACS可选多肽的细胞)选择结合试剂或抗体的细胞并用来选择早期表达转染的宿主细胞的亚群。或者，然后使用合适的方法如MACS(例如，通过门限以高水平如群体水平的至少80％的水平表达MACS可选多肽的细胞)选择结合试剂或抗体的细胞并用来选择早期表达转染的宿主细胞的亚群。
然后选择的早期表达转染的宿主细胞的亚群在引起亚群扩大的条件下生长以产生表达靶多肽的生产者细胞的群体。
在某些实施方案中，在转染的2至15天内，从转染的宿主细胞分离表达可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群的步骤在无药物选择培养基中进行。例如，在某些实施方案中，在转染的2至15天内，从转染的宿主细胞分离表达可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群的步骤在0nM MTX(即无MTX)培养基中进行。
在某些实施方案中，扩大选择的转染的宿主细胞的亚群的步骤在无药物选择培养基中进行。例如，在某些实施方案中，扩大选择的转染的宿主细胞的亚群的步骤在0nM MTX(即无MTX)培养基中进行。
在某些实施方案中，在转染的2-15天内，(b)从转染的宿主细胞分离表达可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群的步骤和(c)扩大分离的转染的宿主细胞的亚群的步骤均在无药物选择培养基中进行。例如，在某些实施方案中，在转染的2-15天内，(b)从转染的宿主细胞分离表达可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群的步骤和(c)扩大分离的转染的宿主细胞的亚群的步骤两者均在0nM MTX(即无MTX)培养基中进行。
包括生产者细胞的细胞可在旋转瓶、摇瓶、滚瓶、波反应器(例如来自wavebiotech.com的System 1000)或中空纤维系统中培养，或用于大规模生产的搅拌釜式反应器或袋式反应器(例如，Wave Biotech，Somerset，New Jersey USA)特别用于悬浮培养。使用例如喷洒器、挡板或低剪切叶轮，使搅拌釜式反应器可适应通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可使用用空气或氧气泡直接充气的。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，培养基可补充有细胞保护剂如泊洛沙姆188(poloxamer 188，F-68)以帮助防止曝气过程造成的细胞损坏。根据宿主细胞特征，微载体可用作依赖贴壁细胞的生长基质，或者细胞可适应悬浮培养。宿主细胞特别是脊椎动物宿主细胞的培养可利用多种操作模式，如分批式过程、补料分批过程、重复分批过程(见，Drapeau等(1994)Cytotechnology 15:103-109)、扩大分批过程或灌注培养。尽管重组转化的生产者细胞可在包含胎牛血清(FCS)的含血清培养基中培养，但是在一些实施方案中，将这样的宿主细胞培养在无血清培养基(如在Keen等(1995)Cytotechnology 17:153-163中所公开的)，或可商购的培养基(如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex,NJ,USA))中培养，必要的情况下补充能量源(如葡萄糖)和合成生长因子(如重组胰岛素)。宿主细胞的无血清培养可需要这些细胞适应在无血清条件下生长。一个适应手段是在含血清培养基中培养这样的宿主细胞，并将80％的培养基重复交换为无血清培养基，使得宿主细胞适应无血清条件(见，例如，Scharfenberg,Scharfenberg,K.等(1995)于:Animal Cell Technology:Developments Towards the 21st Century(Beuvery,E.C.等编),第619-623页,Kluwer Academic publishers)。
在某些实施方案中，方法进一步包括从生产者细胞的群体分离靶多肽。可以使用本领域已知的任何方法分离靶多肽，而且可以例如根据用于重组蛋白质和抗体的现行良好生产规范(Current Good Manufacturing Practice)(CGMP)进一步纯化到至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或更高的纯度水平。根据所述实施方案的靶多肽可分泌到培养基中并使用多种技术中的任何技术从其中回收和纯化，以提供适合于意图使用的纯化的程度。例如，当与包含靶多肽的培养基比较时，用于治疗人类受试者的靶多肽(例如抗体或Fc融合蛋白)的使用通常要求如通过还原SDS-PAGE确定的至少95％纯度，更通常为98％或99％纯度。首先，来自培养基的细胞碎片可使用离心去除，然后是使用例如微量过滤、超滤和/或深度过滤的上清液的澄清步骤。或者，可通过微量过滤、超滤或深度过滤来收获靶多肽，而无需事先离心。多种其他技术如透析和凝胶电泳以及如羟基磷灰石(HA)、亲和色谱(任选地涉及亲和标签系统如聚组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC)(参见US 5,429,746)的是可用的。在一个实施方案中，在多种澄清步骤之后，使用蛋白A或G亲和色谱，然后通过进一步的色谱步骤如离子交换色谱和/或HA色谱、阴离子或阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱法和硫酸铵沉淀法来捕获靶多肽如抗体或Fc融合蛋白。也可使用多种病毒去除步骤(例如，使用例如DV-20过滤器的纳米过滤)。在这些多种步骤之后，提供了包含至少10mg/mL或更多，例如100mg/mL或更多的本文所述的靶多肽的纯化制剂。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：从扩大的亚群中分离一个或多个单一转染的宿主细胞和培养一个或多个单一转染的宿主细胞以产生一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：从扩大的亚群分离一个或多个单一转染的宿主细胞和培养一个或多个单一转染的宿主细胞以产生表达靶多肽的生产者细胞的一个或多个克隆群体。可以通过本领域已知的任何方法进行克隆群体的制备。例如，在一个实施方案中，可以将选择的细胞以每孔一个细胞的密度铺板到96孔(或其他尺寸)板中，并允许生长一段时间(例如，通常为7-28天)，其中允许单个细胞生长成子细胞的多细胞集落(即克隆群体)。接下来该方法可包括通过检测所述克隆群体上的可选择多肽和/或靶多肽表达的水平并选择具有可选择多肽和/或靶多肽的高表达水平的一个或多个克隆群体来分析一个或多个克隆群体，由此选择一个或多个稳定表达靶多肽的克隆群体。在某些实施方案中，在分析克隆群体之前，以单个细胞密度铺板后将克隆群体培养7-28天。该方法可进一步包括使克隆群体与可检测的抗体或其他结合剂接触，所述可检测的抗体或其他结合剂在允许或有利于抗体或其他结合剂与可选多肽结合的条件下识别并直接或间接结合在克隆细胞的表面上的可选多肽(如果存在的化)；和选择或检测直接或间接结合抗体或其他结合剂的一个或多个细胞。也可分离和培养如此选择的这些细胞。该方法可以进一步包括例如使用蛋白A筛选(如当靶多肽是抗体或Fc融合蛋白时)、Western印迹、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与考马斯蓝(Coomassie Blue)或银色染色，或酶活性测定分析一个或多个克隆的靶多肽表达。
在某些实施方案中，在步骤(b)中经受分离的转染的宿主细胞的亚群包含至少80-120x 106个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞的亚群包含至少约80x 106个细胞；在某些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞的亚群包含至少约90x 106个细胞；在某些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞的亚群包含至少约100x 106个细胞；在某些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞的亚群包含至少约110x 106个细胞；并且在某些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞的亚群包含至少约120x 106个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞的亚群包含约80x106至约800x 106个细胞、约100x106至约800x 106个细胞、约200x 106至约800x 106个细胞、约300x 106至约800x 106个细胞、约400x 106至约800x 106个细胞、约500x 106至约800x 106个细胞、约80x 106至约600x106个细胞、约100x 106至约600x 106个细胞、约200x 106至约600x 106个细胞、约300x106至约600x 106个细胞、约400x 106至约600x 106个细胞、约500x 106至约600x 106个细胞、约80x 106至约500x 106个细胞、约100x 106至约500x 106个细胞、约200x 106至约500x 106个细胞、约300x 106至约500x 106个细胞、约400x 106至约500x 106个细胞、约80x 106至约400x 106个细胞、约100x 106至约400x 106个细胞、约200x 106至约400x 106个细胞、约300x106至约400x106个细胞、约80x 106至约300x 106个细胞、约100x 106至约300x 106个细胞、约200x 106至约300x 106个细胞、约80x 106至约250x 106个细胞、约100x 106至约250x 106个细胞、约200x 106至约250x 106个细胞、约80x 106至约200x106个细胞或约100x 106至约200x 106个细胞。
在某些实施方案中，步骤(b)中的分离在转染后小于6天进行。例如，在某些实施方案中，步骤(b)中的分离在转染后2-4天进行。在某些实施方案中，步骤(b)中的分离在转染后2天进行。在某些实施方案中，步骤(b)中的分离在转染后3天进行。
在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩大之前，转染的宿主细胞的亚群包含约0.5-6.0x 106个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩大之前，转染的宿主细胞的亚群包含约0.5x 106个细胞、约1.0x 106个细胞、约2.0x 106个细胞、约3.0x 106个细胞、约4.0x 106个细胞、约5.0x 106个细胞或约6.0x 106个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩大之前，转染的宿主细胞的亚群包含约0.5x 106至约1.0x 106个细胞、约0.5x106至约2.0x 106个细胞、约0.5x 106至约3.0x 106个细胞、约0.5x 106至约4.0x 106个细胞、约0.5x106至约5.0x 106个细胞、约0.5x 106至约6.0x 106个细胞、约1.0x 106至约2.0x106个细胞、约1.0x 106至约3.0x 106个细胞、约1.0x 106至约4.0x 106个细胞、约1.0x 106至约5.0x 106个细胞、约1.0x 106至约6.0x 106个细胞、约2.0x106至约3.0x 106个细胞、约2.0x 106至约4.0x 106个细胞、约2.0x 106至约5.0x 106个细胞、约2.0x 106至约6.0x 106个细胞、约3.0x 106至约4.0x 106个细胞、约3.0x 106至约5.0x 106个细胞、约3.0x 106至约6.0x 106个细胞、约4.0x106至约5.0x 106个细胞、约4.0x 106至约6.0x 106个细胞或约5.0x106至约6.0x 106个细胞。在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩大之前，转染的宿主细胞的亚群含有大于6.0x 106个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩大之前，转染的宿主细胞的亚群包含约7.0x 106个细胞，约8.0x 106个细胞、约9.0x 106个细胞或约10.0x106个细胞。
在某些实施方案中，步骤(c)中的扩大是4-31天。例如，在多种实施方案中，所述扩大是针对4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。
在某些实施方案中，一个或多个载体的第一个编码mRNA，所述mRNA编码靶多肽，并且一个或多个载体的第二个编码mRNA，所述mRNA编码可选择多肽。在编码mRNA(其编码靶多肽)和编码mRNA(其可选多肽)的一个或多个载体是单独的载体的情况下，在某些实施方案中，载体独立地选自质粒、病毒、噬菌体、转座子和微型染色体。
在某些实施方案中，编码靶多肽的mRNA和编码可选择多肽的mRNA都在一个载体上编码。根据这些实施方案，单一载体编码多顺反子mRNA，该多顺反子mRNA编码靶多肽和可选择多肽。同样根据这些实施方案，在某些实施方案中，编码可选择多肽的mRNA可以是编码靶多肽的mRNA的上游(即5’)。或者，在某些实施方案中，编码靶多肽的mRNA可为编码可选多肽的mRNA的上游(即5’)。
因此，在某些实施方案中，靶多肽和可选多肽由单一多顺反子mRNA编码。在某些实施方案中，多顺反子mRNA包含编码可选择多肽的第一开放读码框(ORF)和编码靶多肽的第二ORF，其中第一ORF位于第二ORF的5’。
在某些实施方案中，第一ORF具有非AUG起始密码子。在某些实施方案中，非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。可使用标准分子生物学技术来安装非AUG起始密码子，如本领域已知的。
在某些实施方案中，第二ORF具有AUG起始密码子。
在某些实施方案中，第一ORF具有非AUG起始密码子，第二ORF具有AUG起始密码子。
在某些实施方案中，编码可选多肽的ORF没有任何AUG序列。除了终止密码子之外，可以使用如本领域已知的标准分子生物学技术将AUG序列转化成其他三联体序列；例如，而且不限于，AUG序列可独立转化成CUG(L)、GUG(V)、UUG(L)、AAG(K)、ACG(T)、AGG(R)、AUA(I)、AUC(I)、AUU(I)、GCA(A)、GCC(A)、GCG(A)或GCU(A)。
在某些实施方案中，靶多肽和可选多肽形成融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白是膜结合的。当融合蛋白是膜结合的时，在某些实施方案中，可选多肽以可检测的形式存在，即融合蛋白的靶多肽部分不阻止检测融合蛋白的可选多肽部分。而且，当融合蛋白质是膜结合的时，在某些实施方案中，靶多肽以功能形式存在，即融合蛋白的可选择多肽部分不阻止融合蛋白的靶多肽部分的功能。在某些实施方案中，融合蛋白从宿主细胞释放作为可溶性蛋白。在某些实施方案中，将融合蛋白表达为表面蛋白，但可将其切割以释放可溶、功能形式的靶多肽。
在某些实施方案中，靶多肽是治疗剂，例如抗体、抗体的抗原结合片段、Fc融合蛋白、激素或酶。多肽激素包括，但不限于，促肾上腺皮质激素(ACTH)、抗利尿激素(加压素)、心房钠尿肽(ANP)、胆囊收缩素、促卵泡激素(FSH)、胃泌素、胰高血糖素、生长激素、胰岛素、瘦素、促黄体激素(LH)、催产素、催乳素、生长抑素和促甲状腺激素(TSH)。酶包括，但不限于，酸性α-葡糖苷酶、腺苷脱氨酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶B、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、透明质酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶和N-乙酰氨基葡糖苷酶。
在一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。
在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞选自下组：CHO细胞、BHK-21细胞、NIH/3T3细胞、HEK293细胞、HeLa细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、C127细胞、COS细胞、Vero细胞和U937细胞。所有这些细胞(细胞系)都可从如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)的来源商购。在某些实施方案中，宿主细胞选自下组：CHO细胞、HEK293细胞和HeLa细胞。
本发明的一方面是表达可通过本发明方法获得的可选择多肽和靶多肽的转染宿主细胞的克隆群体。在某些实施方案中，转染的宿主细胞的克隆群体表达可通过本发明的方法获得的FACS可选多肽和靶多肽。
在某些实施方案中，与在步骤(c)中获得的转染但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，克隆群体在靶多肽产生中得到2至30倍的改善。
例如，在一些实施方案中，与在步骤(c)中获得的转染但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，克隆群体在靶多肽产生中得到2至30倍、3至30倍、5至30倍、10至30倍、15至30倍、20至30倍、25至30倍、2至25倍、3至25倍、5至25倍、10至25倍、15至25倍、20至25倍、2至20倍、3至20倍、5至20倍、10至20倍、15至20倍、2至15倍、3至15倍、5至15倍、10至15倍、2至10倍、3至10倍、5至10倍、2至5倍、3至5倍、或2至3倍的改善。在某些实施方案中，与在步骤(c)中获得的转染但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，克隆群体在靶多肽产生中得到大于30倍的改善。例如，在某些实施方案中，与在步骤(c)中获得的转染的但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，克隆群体在靶多肽产生中得到高达40倍、高达50倍、高达60倍、高达70倍、高达80倍、高达90倍或高达100倍的改善。
III.生产者细胞及其产生的方法
在一些实施方案中，提供了生产者细胞的异质群体。可以使用本领域已知或本文描述的任何方法产生生产者细胞的异质群体。在提供的任一方法的一些实施方案中，通过使用编码多顺反子mRNA的载体转染细胞并使转染的细胞经过少于或等于一轮基于培养基的选择来选择表达不同水平(例如，至少10倍、100倍、1,000倍或10,000倍的变异)多顺反子mRNA的细胞而产生生产者细胞的异质群体。在一些实施方案中，载体进一步含有药物选择标记，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，而且基于培养基的选择是甲氨喋呤(MTX，例如1nM-100nM MTX)、核苷酸缺陷型培养基或它们的组合。在一些实施方案中，载体进一步含有谷氨酰胺合成酶(GS)基因，而且基于培养基的选择是甲硫氨酸磺酰亚胺(MSX，25-100μM MSX)。在一些实施方案中，载体缺乏药物选择标记，例如缺乏DHFR基因或GS基因。
在一些实施方案中，使用FACS来选择表达不同水平的多顺反子mRNA的细胞，例如通过使用FACS可选多肽水平来选择细胞。
对于本领域技术人员来说会容易地显而易见的是，在不背离本文所公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等同物对本文所描述的方法做出其他合适的修改和改变。现在已经详细描述了某些实施方案，通过提及以下实施例会更清楚地理解这些实施方案，所述实施例仅用于示例说明的目的并不意图是是限制性的。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应该被解释为进一步限制性的。
实施例1：用于细胞的早期转染后分离(EPIC)的分选-概念的证据
该实施例证明在选择之前分选以靶向未经选择转染的早期表达群体以批量富集的方法的可行性。该分选的方法被称为“短分选”或“EPIC”(细胞的早期转染后分离)，并且经设计以在转染后不久进行分选分离或批量富集早期报道蛋白表达。EPIC可显著减少所得异质群体的选择时间表和/或改善其生产力。已经进行实验来研究核苷酸缺乏选择过程的整个过程中转染的群体的报道蛋白表达概况。图1A描绘了EPIC的一般方案。图1B显示出在核苷酸缺乏选择过程期间报道基因的早期表达。这些偏移直方图证明早期表达(例如第3-4天)是阳性的和可分选的；使分离转染细胞的亚群用于EPIC过程可行。
如图1A所示，可通过转染群体和允许早期表达发生来执行EPIC，可使用流式细胞术或其他细胞分选的方法将其靶向用于分离。然后，可将这些分选分离的早期表达亚群置于选择培养基中以建立稳定的表达汇集物。在选择前，这些转染后早期表达亚群的分离得到相对于单独的标准转染/选择方法改善的生产力(例如，如图1A所示)。
为了证明检测到的CD52信号实际上是早期CD52报道蛋白表达的概念的证据，构建了指导表达红色荧光蛋白(RFP)和CD52两者的载体(pGZ729-RFP)或单独的RFP的载体(pGZ700-RFP)，并将其转染用于早期表达评价。在此系统中，CD52对应于可检测的多肽，而RFP对应于靶多肽。
下面显示pGZ729载体主链序列(backbone sequence)，其包括编码CD52但不是RFP的序列，然后是序列的注释。
pGZ729表达载体的序列(SEQ ID NO:6):
ggatccgctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttggggggggggacagctcagggctgcgatttcgcgccaaacttgacggcaatcctagcgtgaaggctggtaggattttatccccgctgccatcatggttcgaccattgaactgcatcgtcgccgtgtcccaaaatatggggattggcaagaacggagacctaccctggcctccgctcaggaacgagttcaagtacttccaaagaatgaccacaacctcttcagtggaaggtaaacagaatctggtgattatgggtaggaaaacctggttctccattcctgagaagaatcgacctttaaaggacagaattaatatagttctcagtagagaactcaaagaaccaccacgaggagctcattttcttgccaaaagtttggatgatgccttaagacttattgaacaaccggaattggcaagtaaagtagacatggtttggatagtcggaggcagttctgtttaccaggaagccatgaatcaaccaggccacctcagactctttgtgacaaggatcatgcaggaatttgaaagtgacacgtttttcccagaaattgatttggggaaatataaacttctcccagaatacccaggcgtcctctctgaggtccaggaggaaaaaggcatcaagtataagtttgaagtctacgagaagaaagactaacaggaagatgctttcaagttctctgctcccctcctaaagctatgcatttttataagaccatgggacttttgctggctttagatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattggggaccaagacagaaccataagccagtgggatagatcagaaatgttccagaggtgggatggggccagagtgcctgccccttgaaccgtcccagggaccagaggtgacaaagtggcaacacaggtcctgcctgggaatctggtctgctcctacttagtaaagctgcctggtgtcacacaagaggcccccacttattcctgcacccctggtggtaggtggcgtcttctcccctgcagccaccaggctcccctgagaacactgccggcagtcctcattgacaggcagtattcgctctgccccacccccacctgtgaattgcagggctggcaggtcctcaggcagctggcaaaccgcctgaacaactgagagatacagggccagggccagggcagtcccgtcccccggaggcagggaggggacgtgctgggaaagttctctctctcaggcccaggttggtgactgcagaagg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pGZ729表达载体的元件(和核苷酸位置):
核苷酸1-325–SV40早期启动子(用于DHFR转录)
核苷酸347-1089–二氢叶酸还原酶(DHFR)开放读码框
核苷酸1090-1934–SV40早期内含子和polyA
核苷酸2684-3366–大肠杆菌(E.coli)ColE1起点
核苷酸3464-4123–氨苄青霉素抗性基因
核苷酸4528-7539–仓鼠β-肌动蛋白启动子(用于感兴趣的基因的转录)
核苷酸7568-7753–CD52开放读码框(含有TTG起始密码子)
核苷酸7781-7791–在3个读码框的每个中的终止密码子
核苷酸7813-7872–多克隆位点(用于插入具有ATG起始密码子的靶多肽)
核苷酸7882-8123–SV40早期polyA
如图2所示，转染有pGZ729-RFP的CHO细胞产生在约第2和第3天达到峰值的CD52和RFP两者的早期表达，信号劣化到转染后第7天。因此，在或接近第2-3天靶向的EPIC适合于分离转染的宿主细胞的早期表达亚群。为了证明这些相对低程度的荧光强度信号实际上是CD52表达，分析转染有pGZ729-RFP或pGZ700-RFP的CHO细胞的RFP和CD52表达。如图3所示，转染有pGZ729-RFP的CHO细胞和转染有pGZ700-RFP的CHO细胞均稳固地表达RFP(分别是左上和左下)，而当转染有pGZ729-RFP的CHO细胞具有中度表达CD52(右上)时，转染有pGZ700-RFP的CHO细胞基本不表达可检测的CD52(右下)。这些发现支持的概念是这些相对低程度的荧光强度信号实际上是来自可替换的起始表达盒的CD52表达，其适合作为用于分选分离(EPIC)的靶标。
实施例2：用于细胞的早期转染后分离的分选(EPIC)-生产者细胞汇集物生成
最初使用mAb#1尝试EPIC，其中转染CHO细胞并给予2天恢复，之后，开始0nM MTX选择以建立早期表达。转染四天后，靶向CD52细胞表面报道蛋白的早期表达用于分选分离(EPIC)。分选仅靶向阳性表达，收集所述阳性表达作为约1百万个细胞的批量富集的群体，然后允许其在核苷酸缺乏培养基(0nM MTX)中继续选择。作为对照，允许未分选的转染以经由标准选择程序继续选择。如图4所示，到第8天，与标准选择相比，EPIC的分选得到了如通过CD52报道蛋白表达所见的轻度富集的群体。然而，随着两个群体的选择仍在继续，这个小的EPIC亚群随着时间变得更加突出。实际上，在选择完成时CD52阴性亚群几乎都被消除了。比较而言，标准选择方法证明了历史上通常的CD52报道蛋白表达的轻微改善。EPIC的分选或分离早期表达得到了阳性表达的亚群(其具有超过较小表达性细胞的优先的存活力)，其继而得到了一种更有生产力的稳定的汇集物。
EPIC和标准选择的汇集物两者均用来建立未补料分批培养以确定mAb#1效价。如图4和图5所示，生成EPIC的汇集物得到了502mg/L的效价，远远超过由MTX扩增生成的任何汇集物，再一次在整个过程中不使用MTX。比较而言，通过标准选择生成的汇集物得到了150mg/L的效价，其为EPIC生成的汇集物的效价的1/3。
虽然这些靶向EPIC的初始分选花费了35天(转染/分选/分离)以实现完成稳定的汇集物，但这与收集的少量的分选细胞(100万)直接相关，然后所述分选细胞不得不经受扩大和选择到一个稳定的群体。这样的时间表可通过简单地收集更多的细胞和/或靶向更纯的分选而大大减少。许多分选的细胞具有高水平的杂质(几乎不表达至不表达的细胞)并且不得不被选出来(杀死)，延长了选择/扩大时间。
实施例3：细胞的早期转染后分离的分选(EPIC)-克隆生成
接下来将实施例2的EPIC生成的汇集物用于使用FLARE产生克隆，如前所述(见，例如，Cairns,V.等(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a FlowCytometric Method for Efficient Selection of Recombinant Cell Lines,Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622)。简言之，将FLARE用于分离，并且将单个细胞使用FACS铺板来自每个汇集物的前3-5％的报道蛋白表达细胞。然后再次使用FLARE筛选扩大的克隆(取前30％阳性表达者)，以仅鉴定顶级(top tier)克隆来扩大用于靶多肽效价评价。如图6中所示，例如使用MTX扩增汇集物(接近2.0g/L)，使最高表达EPIC生成的克隆实现与来自传统方法的最佳克隆的效价相似的效价。结果证明在选择之前使用EPIC分离早期表达群体是传统转染和选择方法的可行替换方案。EPIC提供了不依赖MTX的方法以实现类似于传统MTX方法的克隆效价的克隆效价，得到潜在更稳固和更稳定的克隆。或者，在选择/扩大EPIC生成的亚群期间，EPIC也可顺从于MTX引入，具有在这些富集的群体中驱动甚至更高表达的潜力。
Claims (30)
1.一种产生表达靶多肽的生产者细胞的群体的方法，所述方法包括：
(a)用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中所述一个或多个mRNA编码可选多肽和所述靶多肽；
(b)在转染的2至15天内，从所述转染的宿主细胞分离表达所述可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群；和
(c)扩大所述转染的宿主细胞的亚群，由此产生表达所述靶多肽的生产者细胞的群体。
2.权利要求1的方法，其中，步骤(b)和(c)各自在无药物选择培养基中进行。
3.权利要求1或2的方法，其进一步包括从所述生产者细胞的群体中分离所述靶多肽。
4.权利要求1或2的方法，其进一步包括从扩大的亚群中分离一个或多个单一转染的宿主细胞，和培养所述一个或多个单一转染的宿主细胞以产生一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体。
5.权利要求4的方法，其中，与在步骤(c)中获得的转染但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，所述一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体的至少一个在靶多肽产生中得到2-30倍的改善。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中，在步骤(b)中经过选择的转染的宿主细胞含有至少80-120x106个细胞。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中，所述步骤(b)中的分离在转染后少于6天进行。
8.权利要求7的方法，其中，所述步骤(b)中的分离在转染后2-4天进行。
9.权利要求7的方法，其中，所述步骤(b)中的分离在转染后2天进行。
10.权利要求7的方法，其中，所述步骤(b)中的分离在转染后3天进行。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中，在步骤(c)中的扩大之前，所述转染的宿主细胞的亚群含有0.5-6.0x106个细胞。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中，所述步骤(c)中的扩大进行4-31天。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中，所述一个或多个载体的第一个编码mRNA，所述mRNA编码所述靶多肽，并且所述一个或多个载体的第二个编码mRNA，所述mRNA编码所述可选多肽。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中，所述编码所述靶多肽的mRNA和所述编码所述可选多肽的mRNA两者均在一个载体上编码。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述步骤(b)中的分离采用磁性激活的细胞分选(MACS)、荧光激活的细胞分选(FACS)或ClonePix。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述可选多肽是FACS可选多肽，并且所述步骤(b)中的分离采用FACS。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述靶多肽和所述可选多肽形成融合多肽。
18.权利要求1至16中任一项的方法，其中，所述靶多肽和所述可选多肽由单一多顺反子mRNA编码。
19.权利要求18的方法，其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述可选多肽的第一开放读码框(ORF)，和编码所述靶多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’。
20.权利要求19的方法，其中，所述第一ORF具有非AUG起始密码子。
21.权利要求20的方法，其中，所述非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。
22.权利要求19-21中任一项的方法，其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子。
23.权利要求19-22中任一项的方法，其中，所述编码所述可选多肽的ORF没有任何AUG序列。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中，所述可选多肽是CD52或CD59。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中，所述靶多肽是治疗剂。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中，所述靶多肽是分泌蛋白。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中，所述靶多肽是抗体或Fc融合蛋白。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中，所述宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。
29.一种转染的宿主细胞的克隆群体，其表达可通过前述权利要求中任一项的方法获得的可选多肽和靶多肽。
30.权利要求29的克隆群体，其中，与(b)中的转染的宿主细胞的亚群相比，所述克隆群体在靶多肽产生中得到2至30倍的改善。
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