CN110050065B

CN110050065B - 用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离(epic)

Info

Publication number: CN110050065B
Application number: CN201780075590.6A
Authority: CN
Inventors: V·R·凯恩斯; C·德马里亚; J·维特科
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2017-10-06
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2037-10-06
Also published as: US20240026410A1; SG10202103545PA; MX2019004013A; WO2018067964A1; AU2017341028A1; TW202346598A; CN110050065A; AU2017341028B2; US11685943B2; EP3523440A1; CA3039598A1; TW201827598A; US20200299743A1; SG11201903018WA; US20180119192A1; TWI795373B; AU2024201853A1

Abstract

本文提供选择表达靶多肽的细胞的群体的方法。在一些方面中，本公开文本提供基于经转染的宿主细胞中可选择多肽的早期表达来分选并选择所述宿主细胞的群体的方法。在某些实施方案中，该分选是使用基于该可选择多肽的荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选进行。所述选择方法可进一步用于生成生产细胞的克隆群体，例如用于目标靶多肽的大规模制造。

Description

用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离(EPIC)

相关申请的交叉引用

本申请主张2016年10月7日申请的美国临时专利申请案第62/405,392号的权益，其全部内容是通过引用并入本文中。

序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交并且全文通过引用并入本文中的序列表。在2017年10月5日创建的所述ASCII副本命名为593804_SA9_179CPC_ST25.txt并且大小为15,363字节。

背景技术

选择生产细胞群体和细胞克隆的方法对于生物制品(例如抗体和融合蛋白)的制造是必不可少的。所述方法通常依赖于使用选择剂，例如甲氨蝶呤(MTX)或甲硫氨酸砜亚胺(MSX)，以偏向并扩大生物制品的生产。给予选择剂的方法可影响所选群体的生存力或生长速率，或可对克隆稳定性具有负面影响。所述基于药物的选择也可较费时，通常需要多轮选择以获得含有适于生物制品制造的克隆的群体。仍需要生成大细胞群体和克隆二者的快速可靠的方法，所述群体和克隆产生对宿主细胞的负面影响较小的高效价生物制品。

发明内容

在一些方面中，本公开文本提供选择表达靶多肽的细胞群体的方法。如本文所述，研发依赖于在群体转染后不久对群体进行分选的选择方法。因此，该方法的特征为针对经转染载体的早期可检测表达分离经转染细胞子群体的步骤。在某些实施方案中，该选择是基于可选择多肽的早期表达，所述可选择多肽与靶多肽不同并且在细胞表面上可检测。

意外的是，发现本文所述方法比使用两轮MTX选择生成池的传统方法更快，并且比包括单轮MTX选择在内的传统MTX扩增生产力更高。

本文所述方法可用于例如生成筛选目标多肽的细胞池(例如在早期临床研发中和用于生成高效价克隆，其可用于产生小规模和大规模制造的目标多肽)。

因此，在一些方面中，本公开文本提供产生表达靶多肽的生产细胞群体的方法，该方法包含：(a)用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽；(b)在转染后2到15天内，从经转染的宿主细胞分离表达可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体；和(c)扩增经转染的早期表达宿主细胞的子群体，由此产生生产细胞群体。

在一些实施方案中，步骤(b)是在无药物选择培养基中进行。

在一些实施方案中，步骤(c)是在无药物选择培养基中进行。

在一些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)各自在无药物选择培养基中进行。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包含从经扩增子群体分离靶多肽。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包含从经扩增子群体分离一个或多个经转染的单宿主细胞和培养该一个或多个经转染的单宿主细胞以产生该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，与在步骤(c)获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体中的至少一个产生靶多肽产量的2倍到30倍提高。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞含有80-120x 10⁶个细胞。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后不到6天进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后2天与4天之间进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后2天进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后3天进行。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体含有0.5-6.0x 10⁶个细胞。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤(c)中的扩增进行4到31天。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，一个或多个载体中的第一载体对编码靶多肽的mRNA进行编码，并且一个或多个载体中的第二载体编码可选择多肽。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，编码靶多肽的mRNA和编码可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，编码多个靶多肽的mRNA和编码多个可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤(b)中的分离采用磁激活细胞分选(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)或ClonePix。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，可选择多肽是FACS可选择多肽并且步骤(b)中的分离采用FACS。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽和可选择多肽形成融合多肽。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，mRNA是多顺反子mRNA。在所提供任一种方法的一些实施方案中，多顺反子mRNA包含编码可选择多肽的第一开放阅读框(ORF)和编码靶多肽的第二ORF，其中第一ORF位于第二ORF的5'。在所提供任一种方法的一些实施方案中，第一ORF具有非AUG起始密码子。在所提供任一种方法的一些实施方案中，第二ORF具有AUG起始密码子。在所提供任一种方法的一些实施方案中，非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。在所提供任一种方法的一些实施方案中，编码可选择多肽的ORF缺乏任何AUG序列。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，可选择多肽是CD52或CD59。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽是治疗剂。在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽是抗体或Fc融合蛋白。

在所提供任一种方法的一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。

本公开文本的其他方面涉及表达可选择多肽和靶多肽(其可通过上文所述或本文中其他地方描述的任一种方法来获得)的经转染的宿主细胞的克隆群体。

附图说明

图1A是描绘传统转染和选择与基于EPIC的转染和选择之间的比较的示意图。早期表达是指在转染后，在显著基因组整合之前的早期表达。

图1B是显示核苷酸缺乏选择过程中第3天到第21天的经转染的细胞群体的报道基因表达的图式(与模拟转染的群体相比)。经转染的细胞在转染后不久展现明显早期表达(例如，第3-4天)，并且随后在选择完成后过渡到稳定表达(第18-21天)。

图2是一系列FACS直方图偏移，描绘来自相同载体(pGZ729-RFP)的红色荧光蛋白(RFP)和细胞表面报道基因CD52表达二者的早期表达。未对经转染的细胞施加选择压力。RFP和CD52的峰值早期表达出现在第2天与第3天之间。

图3是一系列FACS直方图偏移，描绘在经pGZ729-RFP(编码可选择多肽CD52和靶多肽RFP二者)或pGZ700-RFP(仅编码靶多肽RFP)转染的细胞中RFP和CD52的第3天早期表达。

图4是示意图，同时显示在转染后不久生成细胞子群体以供进行选择的EPIC方法，以及在分选富集的群体的分离/扩增后对报道基因表达和单克隆抗体(mAb)效价二者的有益效应。模拟是指模拟转染。

图5是描绘与传统MTX方法相比，EPIC生成的池的第14天未给料分批效价的图表。还显示通过快速增量工序生成的池(RB#1和RB#2)。

图6是描绘来自EPIC生成的克隆的第14天未给料分批效价的图表，其实现1.5-2.0g/L的最高表达。最左侧条形(0.5g/L)代表在克隆前EPIC分选的池的效价。所有其他垂直条形代表各个克隆的效价。

图7是一系列直方图偏移，描绘EPIC靶向以生成经pGZ729-RFP转染的稳定池的比较益处。使用EPIC靶向第2天的早期RFP表达，其产生与传统转染/选择方法(0nM MTX)相比具有改良RFP(和CD52报道基因表达)的稳定池。

图8是示意图，显示生成池以支持克隆有限稀释(CLD)工序的3种不同方法。所有方法都使用相似的“池化的”回收经转染细胞以开始该工序。EPIC和快速增量都是非MTX依赖性工序，也具有与传统MTX选择工序相比缩短的时间线。对三种重组蛋白(mAb#1、mAb#2、FcFusion#1)中的每一种完成此完整方案。

图9是图表，其显示使用图8中显示的每一工序(EPIC、快速增量和MTX)生成的池的三种不同分子的克隆生产力。该图表图解说明，两种非MTX依赖性工序(EPIC和快速增量)都实现具有与从MTX选择工序产生的克隆类似的高生产力的克隆。

图10是图解说明对于代表每种工序(EPIC、快速增量和MTX)的三种不同分子，每种工序从DNA到池和从池到克隆的时间线的图表。EPIC池生成可比MTX生成的池更快(1个月)地实现，此转换为对于克隆产生显著较短的总时间线。

图11A是FACS直方图叠加，显示经分离以生成EPIC池的短暂阳性群体的可变分选靶(与未分选对照相比)。图11B是显示与每一EPIC分选靶相关的生产力，并明确显示，较高短暂靶向产生较高生产力。数据支持以下论断：EPIC池富集只是分离短暂阳性群体的结果。PoP＝原理验证

具体实施方式

在描述本发明之前，应理解，本发明并不限于本文所公开的特定方法和实验条件；因为所述方法和条件可变。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，不打算具有限制性，因为本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。

此外，除非另有指示，否则本发明的实践采用本领域技术内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。所述技术为熟练工作者所熟知，并且在文献中已充分解释。参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增刊；M.R.Green和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2012)；和Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual，第14章，Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2013，第2版)。

I.定义

除非本文中另有定义，否则本文中所用的科学和技术术语具有本领域一般技术人员一般理解的含义。在任何潜在歧义的事件中，本文所提供的定义优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式例如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。

通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语是本领域中熟知并且一般使用的术语。除非另有指示，否则本文提供的方法和技术通常是根据本领域中熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行。酶反应和纯化方法是根据制造商说明书来进行，如本领域中一般所完成的或如本文所述。与在此所描述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中众所周知并且常用的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗，使用标准技术。

由此可更容易地理解本公开文本，所选术语定义于下文中。

如本文所用，术语“多核苷酸”意指任何长度的核苷酸聚合形式，其例子包括但不限于基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。

如本文所用，术语“多肽”意指任何长度的氨基酸的聚合形式，其例子包括但不限于蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体(包括其片段)和肽。

如本文所用，“可选择多肽”是可通过任何适宜方法直接或间接检测的多肽，所述方法包括例如且不限于荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、ClonePix和亲和色谱。在某些实施方案中，可选择多肽在细胞表面上表达，也就是细胞表面多肽。可选择多肽的例子包括包含细胞外结构域的多肽(例如，CD52或CD59)，其能结合到可检测结合配偶体(例如，荧光标记抗体)或由该配偶体结合。可选择多肽的其他例子包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和其变体，包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等。在某些实施方案中，可选择多肽可通过流式细胞术直接或间接地便捷地检测。

如本文所用，“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指基于细胞表达的一种或多种FACS可选择多肽的存在、不存在或水平将该细胞的群体分离为一个或多个子群体的方法。FACS依赖于各个细胞的光学性质(包括荧光)以将细胞分选为子群体。适于实施本文所述方法的FACS细胞分选器为本领域所熟知并且可在市场上购得。示例性FACS细胞分选器包括BDInflux^TM(BD Biosciences)和其他商业供货商生产的其他等效细胞分选器，其他商业供货商例如Sony、Bio-Rad和Beckman Coulter。

如本文所用，“FACS可选择多肽”是可通过流式细胞术直接或间接检测的多肽。FACS可选择多肽的例子包括包含细胞外结构域的多肽(例如，CD52或CD59)，其能结合到可检测结合配偶体(例如，荧光标记抗体)用于通过流式细胞术间接检测多肽。FACS可选择多肽的其他例子包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和其变体，包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等，其可通过流式细胞术直接检测。

如本文所用，磁激活细胞分选或“MACS”是指基于细胞表达的一种或多种MACS可选择多肽的存在、不存在或水平将该细胞的群体分离为一个或多个子群体的方法。MACS依赖于加标签的各个细胞的磁敏感性性质，以将细胞分选为子群体。适于实施本文所述方法的MACS细胞分选器为本领域所熟知并且可在市场上购得。示例性MACS细胞分选器包括流式细胞仪(Miltenyi Biotec)。

如本文所用，“MACS可选择多肽”是可通过磁激活细胞分选直接或间接检测的多肽。MACS可选择多肽的例子包括包含细胞外结构域的多肽(例如，CD52或CD59)，其能结合到磁敏感性结合配偶体(例如，偶联到抗体的铁、镍或钴标记的珠粒)用于直接或间接检测多肽。在某些实施方案中，可选择多肽可通过流式细胞术直接或间接地便捷地检测。

如本文所用，“ClonePix”是指基于细胞表达的一种或多种可选择多肽的存在、不存在或水平将该细胞的群体分离为一个或多个子群体的方法和装置。ClonePix依赖于光学性质，包括各个细胞或细胞集落的白光和荧光检测，以将细胞分选为子群体。ClonePix描述于各自颁予Richmond等人的美国专利第7,776,584号；第8,034,612号；第8,034,625号；第8,293,520号；第8,293,525号；第8,293,526号；和第8,293,527号中，并且可从MolecularDevices(Sunnyvale,CA)购得。

如本文所用，“靶多肽”是指可在宿主细胞中产生的蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体(包括其片段)或肽，并且在本文所例示的方面中，靶多肽是由于其作为治疗剂的潜力而被选择，所述治疗剂例如抗体(包括其片段)、Fc融合蛋白、激素或酶。在一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。然而，对于治疗性多肽的选择和放大试验，本文所述方法不受限制。例如，还预期诊断性多肽或用于环境中的多肽用作本文所公开方法中的靶多肽。

在某些实施方案中，可选择多肽是细胞表面多肽，并且靶多肽是分泌多肽。

如本文所用，术语“抗体”是指所述组合体(例如，完整抗体分子、抗体片段或其变体)其与目标抗原具有显著的已知特异性免疫反应活性。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，其间具有或不具有链间共价连接。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构已被相对充分地理解。

如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体以及抗原结合片段和所述抗体的变体。抗体可为任何类别，例如IgG、IgA或IgM；并且为任何子类，例如IgG1或IgG4。抗体可为多克隆或单克隆抗体，或其可为多克隆或单克隆抗体的片段。抗体可为嵌合、人源化、完全人类、双特异性或双功能的。还预期抗体的任何抗原结合片段或变体，例如Fab、Fab'、F(ab')₂、单链可变区(scFv)和其变化形式。

如本文所用，“Fc融合蛋白”是指包含直接或间接连接到多肽(例如蛋白质或肽)的免疫球蛋白Fc结构域的蛋白质。所连接多肽可为任何目标蛋白质性分子，例如配体、受体或抗原性肽。

如本文所用，术语“生产细胞”是指表达目标多肽的细胞。在某些实施方案中，生产细胞是表达如本文所公开的靶多肽的细胞。在某些实施方案中，生产细胞是表达如本文所公开的可选择多肽和靶多肽二者的细胞。

在某些实施方案中，术语“生产细胞”是指适于在例如生产生物制品的小规模或大规模制造方法中生产蛋白质的细胞。在一些实施方案中，生产细胞是哺乳动物或昆虫细胞。生产细胞进一步论述于本文中。

如本文所用，“生产细胞的群体”是表达升高水平的一种或多种多肽的细胞的群体，所述多肽例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选择多肽和靶多肽。在某些实施方案中，“生产细胞的群体”是表达升高水平的靶多肽的细胞的群体。在一些实施方案中，该升高水平为未经选择的群体中一种或多种多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。在一些实施方案中，该升高水平为未经选择的群体中FACS可选择多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍，如通过流式细胞术(例如，在BD Influx^TM细胞分选器上)所检测。在一些实施方案中，该升高水平为未经选择的群体中MACS可选择多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍，如通过流式细胞术(例如，在流式细胞仪(Miltenyi Biotec)上)所检测。生成生产细胞群体的方法描述于本文中。

如本文所用，“生产细胞的群体”是表达可检测水平的一种或多种多肽的细胞的群体，所述多肽例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选择多肽和靶多肽。生成生产细胞群体的方法描述于本文中。

如本文所用，“多顺反子mRNA”是含有能编码两个或更多个多肽的至少两个开放阅读框(ORF)的mRNA。

如本文所用，“无药物选择培养基”是缺乏药物(例如，甲氨蝶呤(MTX))的培养基，所述药物用于选择表达赋予该群体或子群体抗药性的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的细胞的群体或子群体。

如本文所用，“基于培养基的选择”是改变培养基以包括选择剂(例如，MTX)或排除培养基组分的选择工序，所述选择工序导致选择抵抗选择剂的或可在所排除的培养基组分不存在下存活的子群体。

如本文所用，“核苷酸缺乏培养基”是缺乏或含有低水平(例如，小于10微克/mL)核苷酸的培养基，具有核碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、次黄嘌呤或胸苷中的一种或多种的。在一些实施方案中，核苷酸缺乏培养基是缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基。示例性核苷酸缺乏培养基包括CD CHO培养基(Gibco,Life Technologies，目录号10743(液体)和12490(颗粒状))。

如本文所用，“生存力标志物”是指示细胞生存力的细胞特征并且可通过FACS来检测。示例性生存力标志物包括前向散射、侧向散射、碘化丙啶染色或其组合。

如本文所用，术语“非AUG起始密码子”意欲包括任何非AUG多核苷酸(通常三联体)，其用作翻译起始的起始位点，并且效率相对于AUG起始密码子有所降低。天然存在的备选起始密码子使用为本领域中已知并且描述于例如以下文献中：Kozak(1991)J.CellBiol.115(4):887-903；Mehdi等人(1990)Gene 91:173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11):5073-5080。通常，非AUG起始密码子具有与AUG相比降低的翻译效率；例如，备选起始密码子GUG可具有与AUG(100％)相比3-5％的翻译效率。非AUG起始密码子的翻译效率还可受其序列上下文影响；例如，据报道最佳Kozak共有序列对在非AUG起始密码子的翻译起始具有正面效应(Mehdi等人(1990)Gene91:173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11):5073-5080)。完整Kozak DNA共有序列是GCCRCCATGG(SEQ ID NO:1)，其中起始密码子ATG(RNA中为AUG)为粗体，ATG起始密码子中的A指定为+1位置，并且位置-3的“R”是嘌呤(A或G)。两个最保守位置是嘌呤，优选地-3位置的A和+4位置的G(Kozak(1991)J Cell Biol 115(4):887-903)。针对可选择标志物的减弱表达的备选起始密码子使用描述于美国专利公开案2006/0172382和美国专利公开案2006/0141577中，其全部内容是通过引用并入本文中。本领域技术人员将认识到，本文描述为DNA的序列将具有作为RNA分子的相关序列，例如DNA序列ATG将对应于RNA序列AUG，并且反之亦然。

如本文所用，术语“快速增量分选”和“快速增量”是指荧光激活细胞分选(FACS)分批选择表达靶多肽的生产细胞的方法。该方法包含以下步骤：(a)提供生产细胞的异质性群体，其中该群体中的生产细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选择多肽和靶多肽；(b)使用FACS从生产细胞的异质性群体选择生产细胞的第一异质性子群体，其中第一异质性子群体中的生产细胞以高于(a)中异质性群体的至少80％生产细胞的水平的水平表达FACS可选择多肽；和(c)在无药物选择培养基中扩增生产细胞的第一异质性子群体，由此产生生产细胞的经扩增第一异质性子群体。

快速增量方法可进一步包含以下步骤：(d)使用FACS从步骤(c)中生产细胞的经扩增第一异质性子群体选择生产细胞的第二异质性子群体，其中第二子群体中的生产细胞以高于步骤(c)中生产细胞的经扩增第一异质性子群体中至少80％生产细胞的水平的水平表达FACS可选择多肽；和(e)在无药物选择培养基中扩增生产细胞的第二异质性子群体，由此产生生产细胞的经扩增第二异质性子群体。

如本文所用，术语“EPIC”是指细胞的早期转染后分离，如本文中更详细地描述。

如本文所用，术语“FLARE”是指“流式细胞术减弱的报道基因表达”。FLARE是利用含有至少两个开放阅读框(ORF)的多顺反子mRNA的表达系统，上游ORF含有非AUG起始密码子并编码FACS可选择多肽，并且下游ORF含有AUG起始密码子并编码靶多肽。参见美国专利申请公开案第2009/0239235号，其是全文通过引用并入本文中。

如本文所用，术语“约”应该是指所述值上下10％的公差范围。因此，在术语“约”用于修饰所述值时，所指示范围将涵盖在所述值的±0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％内的任何数字。

II.生产细胞的早期选择方法

在一些方面中，本公开文本涉及产生表达靶多肽的生产细胞的群体的方法。在一些实施例中，该方法包括：

(a)用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽；

(b)在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达该可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体；和

(c)扩增经转染的宿主细胞的该子群体，由此产生表达该靶多肽的生产细胞的群体。

经转染的早期表达细胞可包含不同类别的外源DNA，所述外源DNA的一部分尚未整合到细胞的基因组DNA中，并且一部分已整合到细胞的基因组DNA中。这些类型的DNA具有引起其所编码的一个或多个多肽表达的潜力。

用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽。生产细胞可使用适合于从多顺反子mRNA产生靶多肽的任何细胞类型来生成。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。适合于产生靶多肽的真核细胞的例子包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，包括名为CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1和仓鼠细胞系BHK-21的细胞系；名为NIH3T3、NS0、C127的鼠类细胞系；猿猴细胞系COS、Vero；以及人类细胞系HeLa、HEK293(也称为293)、NIH-3T3、U-937和Hep G2。适宜宿主细胞的其他例子包括酵母细胞、昆虫细胞(例如，施耐德果蝇(Drosophila Schneider)S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087)、BTI-TN-5B1-4(High Five^TM)昆虫细胞(Invitrogen))、植物细胞、鸟类细胞和牛细胞。可用于表达的酵母的例子包括但不限于酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、子囊菌酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。参见例如美国专利第4,812,405号、第4,818,700号、第4,929,555号、第5,736,383号、第5,955,349号、第5,888,768号和第6,258,559号。生产细胞的其他例子可为原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)(例如，菌株DH5α^TM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、PerC6(Crucell,Leiden,NL)、枯草杆菌(B.subtilis)和/或其他适宜细菌。细胞可从商业供货商购得，例如美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC，Rockville,MD)，或使用本领域已知的方法从分离物培养。

为了制造生产细胞，可使用任何适宜的转移技术(例如，通过转染、转化、电穿孔或转导)将一个或多个重组或外源多核苷酸插入宿主细胞中。编码一个或多个mRNA的载体包括DNA载体。可用载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子和微型染色体，其中质粒是典型实施方案。通常，所述载体进一步包括信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、启动子和转录终止序列(其与编码多顺反子mRNA的基因可操作连接以帮助表达)。适宜DNA病毒载体的例子包括腺病毒(Ad)和腺伴随病毒(AAV)。用于递送多核苷酸的基于腺病毒的载体为本领域中已知并且可以商业方式获得，或者通过标准分子生物学方法来构建。腺病毒(Ad)是一组病毒，包括超过50种血清型。参见例如国际专利申请案第WO 95/27071号。用于本公开文本中的其他病毒载体包括源自牛痘、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV))和反转录病毒的载体。基因递送媒剂还包括若干种非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物，以及靶向病毒蛋白-DNA复合物。

对于在转染中的使用，在某些实施方案中，环状载体可例如通过在一个或多个限制性内切核酸酶位点进行限制性酶切来预线性化，即在引入宿主细胞中之前线性化。线性化被认为是整合到基因组中所需的，并且这可通过预线性化或以随机方式通过在宿主细胞内天然存在的内切核酸酶来实现。预线性化具有将一定程度的控制引入限制位点中的潜在优点。因此，在某些实施方案中，可将包括超螺旋结构环状载体的环状载体引入宿主细胞中。在根据本发明的某些实施方案中，一个或多个载体在转染时为线性。

既含有启动子又含有多核苷酸可以操作性连接的克隆位点的载体为本领域中已知并且可从商业供货商获得。所述载体能在体外或在体内转录RNA，并且可从诸如AgilentTechnologies和Promega Corporation等来源购得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要移除、添加或改变5'和/或3'非翻译部分以消除额外的可能不合适的备选翻译起始密码子或可在转录或翻译水平上干扰或减少表达的其他序列。或者，可紧靠起始密码子的5'插入共有核糖体结合位点以增强表达。

可提供启动子用于在生产细胞中表达。启动子可为组成型或诱导型。例如，启动子可以可操作连接至编码多顺反子mRNA的核酸，使得其引导所编码多肽的表达。可获得原核和真核宿主的多种适宜启动子。原核启动子包括用于大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子；3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶和葡糖激酶。真核启动子包括诱导型酵母启动子，例如醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶；RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子，例如多瘤病毒、鸡痘病毒和腺病毒(例如，腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV，特定地，立即早期基因启动子)、反转录病毒、B型肝炎病毒、肌动蛋白、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猿猴病毒40(SV40)，以及非病毒启动子，例如EF-1α(Mizushima和Nagata(1990)Nucleic Acids Res.18(17):5322)。本领域技术人员将能够选择适当启动子在给定宿主细胞中表达任何给定多肽。

如果适合于例如在高等真核生物细胞中表达，可包括其他增强子元件来代替被发现位于上述启动子中的增强子，或与所述增强子共存。适宜哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠类IgG2a基因座(参见WO 2004/009823)。所述增强子通常位于载体上的启动子上游位点，同时其还可位于其他位置，例如在非翻译区内或在多腺苷酸化信号下游。增强子的选择和定位可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。

另外，载体(例如，表达载体)可包含用于选择携带载体的宿主细胞的可选择标志物，以及在可复制载体的情形中的复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常用可选择标志物，并且可用于原核细胞(例如，f3-内酰胺酶基因(氨苄西林抗性)、tet基因(四环素抗性)和真核细胞(例如，新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄西林或潮霉素B抗性基因)。二氢叶酸还原酶(DHFR)基因允许在多种宿主中用甲氨蝶呤或核苷酸缺乏培养基进行选择。类似地，谷氨酰胺合成酶(GS)基因允许用甲硫氨酸砜亚胺进行选择。编码宿主的营养缺陷型标志物的基因产物的基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)通常在酵母中用作可选择标志物。病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体载体以及能整合到宿主细胞基因组中的载体(例如逆转录病毒载体)的使用也有所预期。

在真核系统中，多聚腺苷酸化和终止信号可以可操作连接到编码如本文所述多顺反子mRNA的多核苷酸。所述信号通常位于开放阅读框的3'。在哺乳动物系统中，多聚腺苷酸化/终止信号的非限制性例子包括源自以下各项的信号：生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如，SV40)基因或逆转录病毒长末端重复序列。在酵母系统中，多聚腺苷酸化/终止信号的非限制性例子包括源自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)和醇脱氢酶1(ADH)基因的信号。在原核系统中，通常不需要多腺苷酸化信号，并且通常代之以采用较短并且更确定的终止子序列。多聚腺苷酸化/终止序列的选择可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。除了上文以外，可用于提高产率的其他特征包括染色体重建元件、内含子和宿主细胞特异性密码子修饰。

本公开文本的生产细胞含有编码多顺反子mRNA分子的重组多核苷酸(例如，重组cDNA)，靶多肽和可选择多肽是从来自所述多顺反子mRNA分子的不同ORF单独翻译。在一些实施方案中，可选择多肽是细胞表面多肽。在某些实施方案中，本公开文本的生产细胞含有多个重组多核苷酸，其各自编码多顺反子mRNA分子，靶多肽和可选择多肽是从来自所述多顺反子mRNA分子的不同ORF单独翻译。每一靶多肽可由此与特定可选择多肽相关。在一些实施方案中，可选择多肽是细胞表面多肽。

细胞表面多肽的例子包括但不限于CD2、CD20、CD52和CD59。CD52和CD59细胞表面多肽的示例性非限制性氨基酸序列提供于下文中。

示例性人类CD52多肽的氨基酸序列：

LERFLFLLLTISLLVLVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS(SEQ IDNO:2)

示例性人类CD59多肽(剪接受体突变体)的氨基酸序列：

LGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNNCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP(SEQ ID NO:3)

示例性小鼠CD52多肽的氨基酸序列：

LKSFLLFLTIILLVVIQIQTGSLGQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKSGASSIIDAGACSFLFFANTLICLFYLS(SEQ ID NO:4)

在一些实施方案中，提供第一ORF，其编码可选择多肽，例如CD52或CD59。CD52和CD59的示例性非限制性ORF序列提供于下文中。

示例性人类CD52ORF的核苷酸序列：

ttggagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctcgttttggtacaaatacaaaccggactctccggacaaaacgacaccagccaaaccagcagcccctcagcatccagcaacataagcggaggcattttccttttcttcgtcgccaacgccataatccacctcttctgcttcagttga(SEQ ID NO:5)

示例性人类CD59ORF的核苷酸序列：

ttgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctcgctgtcttctgccattccggtcatagcctgcagtgctacaactgtcctaacccaactgctgactgcaaaacagccgtcaattgttcatctgattttgacgcgtgtctcattaccaaagctgggttacaagtgtataacaactgttggaagtttgagcattgcaatttcaacgacgtcacaacccgcttgagggaaaacgagctaacgtactactgctgcaagaaggacctgtgtaactttaacgaacagcttgaaaacggagggacatccttatcagagaaaacagttcttctgctggtgactccatttctggcagctgcttggagccttcatccctaa(SEQ ID NO:6)

示例性小鼠CD52ORF的核苷酸序列：

ttgaagagcttcctcctcttcctcactatcattcttctcgtagtcattcagatacaaacaggatccttaggacaagccactacggccgcttcaggtactaacaaaaacagcacctccaccaaaaaaacccccttaaagagcggggcctcatccatcatcgacgcgggcgcttgcagtttcctcttcttcgccaatacccttatttgcctcttctacctcagctaactgagtaa(SEQ ID NO:7)

如下文所讨论，前述示例性ORF已各自经修饰以消除所有内部ATG三联体。

在一些实施方案中，提供第二ORF，其编码靶多肽，例如抗体、酶或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，单独翻译是通过使用用于可选择多肽的翻译起始的非AUG起始密码子和使用用于靶多肽的翻译起始的AUG起始密码子来完成。在这个实施方案中，通常编码靶多肽的多核苷酸位于编码可选择多肽的多核苷酸的下游。单独翻译还可使用内部核糖体进入位点(IRES)来实现。在一些实施方案中，IRES元件位于编码靶多肽的多核苷酸的上游和编码可选择多肽的多核苷酸的下游。在一些实施方案中，IRES元件位于编码可选择多肽的多核苷酸的上游和编码靶多肽的多核苷酸的下游。

在一些实施方案中，非AUG起始密码子以使可选择多肽的翻译效率低于靶多肽翻译的方式位于编码可选择多肽的DNA内。为了实现降低的翻译效率，可将可选择多肽的AUG起始密码子变为备选非AUG起始密码子，其例子包括但不限于：CUG、GUG、UUG、AUU、AUA和ACG。

因此，在使用备选非AUG起始密码子时，可选择多肽的表达可相对于共表达的靶多肽的表达有所减弱。除了改变起始密码子以外，编码可选择多肽的DNA可在所有内部ATG三联体处经修饰，以防止翻译的内部起始。在一些实施方案中，可选择多肽具有短氨基酸序列(<200个氨基酸)，并且由具有极少(<10个)ATG三联体的多核苷酸编码。

不希望受限于理论，为了起始编码可选择多肽和靶多肽二者的mRNA的翻译，核糖体在mRNA的5'帽结构处开始扫描，大部分扫描越过备选起始密码子(例如，UUG)并代之以在下游AUG起始密码子处起始翻译。然而，翻译起始可发生在备选起始密码子处，但频率极低，使得也表达低水平的可选择多肽。

从经转染的宿主细胞选择表达可检测水平的可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体。在转染期间，各个宿主细胞以基本上随机的方式吸收不同量的外源多核苷酸，例如DNA。一些细胞将吸收外源多核苷酸的多个拷贝，其他细胞将吸收较少拷贝，并且一些细胞将不进行吸收。吸收到给定细胞中的DNA的量影响该DNA的命运，包括其早期表达和其在基因组中的整合。

在经DNA转染后，至少一些已引入细胞中的多核苷酸易位到细胞核中，其中所述多核苷酸转录为mRNA。在最初几天中，所引入DNA的表达可驱除一个或多个类别的DNA，其中一些所述DNA尚未整合到宿主细胞的基因组中，并且其中一些所述DNA已整合到宿主细胞的基因组中。此时，人们认为表达程度主要与引入宿主细胞和其细胞核中的DNA的“剂量”成比例。宿主细胞吸收的外源DNA的量越大，早期表达程度越高。然而，少量已引入宿主细胞中的DNA，特别在其为线性之后，可立即被整合到宿主细胞的基因组中。因此，在转染后的最初几天中，在一方面外源DNA的降解和损失与另一方面外源DNA随机整合到基因组中之间存在竞争。整合可包括所引入DNA的单一拷贝或多个拷贝。宿主细胞吸收的外源DNA的量越大，其整合的机率(和程度)越大。最后，所整合的DNA负责长期高效表达，也就是在所有未整合DNA(例如，质粒或附加体DNA)降解到不能有效表达的程度之后的表达。

因此，在转染后最初2至约15天(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天)中，存在表达可检测量的可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞。特定地在最初2-6天中，更特定地在最初2-4天中，并且甚至更特定地在最初2-3天中，认为这种早期表达显著地，但不一定唯一地驱除尚未整合到宿主细胞基因组中的外源DNA。在转染后的这个早期阶段期间，外源DNA可在一定程度上整合到宿主细胞基因组中。由于这种早期表达依赖于宿主细胞和其细胞核吸收的DNA的“剂量”，并且该剂量在经转染细胞之间基本上是随机的，因此在这个早期阶段期间，经转染的宿主细胞包括表达不同量的外源DNA所编码多肽的细胞的子群体。同样是在这个早期阶段期间，表达较大量的外源DNA所编码多肽的细胞的子群体可能吸收较大量的外源DNA，并且因此具有较大机率将该DNA并入其基因组中。

因此，如本文所用，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(earlyexpression)”是指在转染后最初2至约15天(例如，2-15天、2-14天、2-13天、2-12天、2-11天、2-10天、2-9天、2-8天、2-7天、2-6天、2-5天、2-4天、2-3天、3-15天、3-14天、3-13天、3-12天、3-11天、3-10天、3-9天、3-8天、3-7天、3-6天、3-5天、3-4天、4-15天、4-14天、4-13天、4-12天、4-11天、4-10天、4-9天、4-8天、4-7天、4-6天、4-5天、5-15天、5-14天、5-13天、5-12天、5-11天、5-10天、5-9天、5-8天、5-7天、5-6天、6-15天、6-14天、6-13天、6-12天、6-11天、6-10天、6-9天、6-8天、6-7天、7-15天、7-14天、7-13天、7-12天、7-11天、7-10天、7-9天、7-8天、8-15天、8-14天、8-13天、8-12天、8-11天、8-10天、8-9天、9-15天、9-14天、9-13天、9-12天、9-11天、9-10天)中的可检测表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”是指在转染后最初2至约10天中的可检测表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”是指在转染后最初2至约6天中的可检测表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”是指在转染后最初2至约5天中的可检测表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(earlyexpression)”是指在转染后最初2至约4天中的可检测表达。在某些实施方案中，术语“早期表达(early-expressing)”或“早期表达(early expression)”是指在转染后最初2至约3天中的可检测表达。

本领域中已知可用于检测细胞表面标志物的任何方法可结合本公开文本的方法来使用。例如，在允许或有利于抗体结合到可选择多肽的条件下使抗体或其他细胞表面标志物特异性结合剂与经转染的宿主细胞直接或间接接触，并由此选择经转染的早期表达宿主细胞的子群体。抗体或其他结合剂的选择是通过以下各项来确定：1)其选择性结合在宿主细胞上表达的可选择多肽的能力；和2)其经可检测标记来标记或结合到可检测标记的能力，例如用于流式细胞术或FACS中。

在备选实施方案中，第一试剂可为结合到可选择多肽的蛋白质或肽，该第一试剂继而还结合到能被可检测地标记(例如，并入荧光、酶、比色、磁敏感性或其他可检测标记)的第二试剂。虽然并未始终明确陈述，但“间接”结合到可选择多肽打算包括使用任何数目的中间配偶体。在某些实施方案中，“间接”结合到可选择多肽包括使用一个中间配偶体，例如一个未经标记的抗体或其他结合剂。

在一些实施方案中，抗体或其他结合剂直接结合到细胞表面标志物并且包含荧光标记。适宜荧光标记包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、藻红蛋白(PE)、赤藓红、别藻蓝蛋白(APE)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、均二苯乙烯、萤光黄、瀑布蓝和德克萨斯红。其他适宜光学染料描述于MolecularHandbook，第11版，2010。

在一些实施方案中，荧光标记经官能化以促进共价附接到抗体或其他试剂。适宜官能团包括但不限于异硫氰酸酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基酯和磺酰卤，其都可用于将荧光标记附接到第二分子。荧光标记的官能团的选择将取决于附接到抗体或其他结合剂的位点、可选择多肽或第二标记剂。

荧光标记的附接可为直接地或通过接头附接到抗体或其他结合剂。在一个方面中，接头是通常用于附接分子的相对短的偶联部分。在这个实施方案中，第一标记部分附接到候选试剂将如本领域技术人员通常所了解的一般来进行，并且可包括上文针对荧光标记的并入所概述的技术。

用于设计和构建用于细胞计量术中的经标记抗体和其他试剂的材料和技术为本领域已知并且描述于例如以下文献中：Bailey等人(2002)Biotechnol.Bioeng.80(6)；670-676；Carroll和Al-Rubeai(2004)Expt.Opin.Biol.Therapy4:1821-1829；Yoshikawa等人(2001)Biotechnol.Bioeng.74:435-442；Meng等人(2000)Gene 242:201-207；Borth等人(2001)Biotechnol.Bioeng.71(4):266-273；Zeyda等人(1999)Biotechnol.Prog.15:953-957；Klucher等人(1997)Nucleic Acids Res.25(23):4853-4860；和Brezinsky等人(2003)J.Imumunol.Methods 277:141-155。

用于将标记间接连接到该试剂(其继而结合可选择多肽)的适宜结合对包括但不限于抗原/抗体，包括地高辛配基/抗体、二硝基苯酚(DNP)/抗DNP、丹磺酰基-X/抗丹磺酰基、荧光素/抗荧光素、萤光黄/抗萤光黄、罗丹明/抗罗丹明；以及生物素/抗生物素蛋白(或生物素/抗生蛋白链菌素)。结合对应对彼此具有高亲和性，足以经受细胞分选期间的剪切力或结合本公开文本使用的其他检测系统。

因此，在一些方面中，第一标记部分(在使用第二标记部分时)包括但不限于半抗原，例如生物素。靶分子的生物素化是众所周知的，例如，已知大量生物素化试剂，包括胺反应试剂和硫醇反应试剂，用于蛋白质、核酸、碳水化合物和羧酸的生物素化。类似地，也已知大量其他半抗原化试剂。

本文所述方法中使用的抗体可在细胞培养中、在噬菌体中或在各种动物中产生，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、荷兰猪、兔子、绵羊、山羊、马、牛、骆驼、猴子、黑猩猩等，只要该抗体保留对可选择多肽的结合特异性即可。可通过在给定条件集下比较与适当抗原的结合以及与无关抗原或抗原混合物的结合来测试抗体的结合特异性。

在可选择多肽的抗体或其他结合剂未经直接标记的实施方案中，抗体或结合剂优选地还含有并保留结合第二试剂的能力，所述第二试剂在通过可选择多肽结合到细胞后是可检测的。

在一些实施方案中，在可选择多肽是CD52时，可选择多肽可使用抗CD52抗体来检测。“抗CD52抗体”是指特异性识别并结合CD52的抗体。抗CD52抗体可通过本领域中所熟知的方法来生成。参见例如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987年至目前版本)和Antibodies:A Laboratory Manual，第二版(Greenfield编辑，2013)。另外，若干种抗CD52抗体可从市场购得(例如，偶联到荧光标记的抗体，例如由商业供货商AbCam、SeroTec和BioLegend销售的那些)。

在一些实施方案中，在可选择多肽是CD59时，可选择多肽可使用抗CD59抗体来检测。“抗CD59抗体”是指特异性识别并结合CD59的抗体。抗CD59抗体可通过本领域中所熟知的方法来生成。另外，若干种抗CD59抗体可从市场购得(例如，偶联到荧光标记的抗体，例如由商业供货商AbCam、SeroTec和BioLegend销售的那些)。

在特定实施方案中，在可选择多肽是CD20时，可选择多肽可使用抗CD20抗体来检测。“抗CD20抗体”是指特异性识别并结合CD20的抗体。抗CD20抗体可通过本领域中所熟知的方法来生成。另外，若干种抗CD20抗体可从供货商购得，例如BD Pharmingen；BeckmanCoulter,Inc.(Fullerton,Calif.，多种克隆，包括目录号6604106克隆H299(B1)；同种型IgG2a和目录号IM1565克隆L26，同种型IgG2a)；Invitrogen(Carlsbad,Calif.,克隆：BH-20，同种型：IgG2a和克隆：B-H20，同种型：IgG2a)；BioLegend(San Diego,Calif.，目录号302301，克隆：21-7，同种型：IgG2b，κ)；EMD Biosciences,Inc.,牌(San Diego,Calif.，目录号217670克隆2H7，同种型：IgG2b)；以及Anaspec(San Jose,Calif.，目录号29587)。

对于在MACS中的使用，其中存在更有限数目的抗原特异性磁珠，经标记或未经标记的一级抗体或其他结合剂(例如，Fc融合蛋白)可用于结合到可选择多肽，之后与例如同种型特异性磁珠结合。例如，Miltenyi Biotec销售CD20微珠和抗小鼠IgG微珠，但不销售CD52和CD59微珠；抗小鼠IgG微珠可用于标记一级小鼠IgG抗人类CD52或小鼠IgG抗人类CD59。

在实例性非限制性方法中，使如本文所述的经转染的宿主细胞的群体与识别并直接或间接结合细胞表面上的可选择多肽(如果存在)的试剂接触。该接触是在有利于或适于试剂或抗体与可选择多肽的特异性结合(直接或间接)的条件下进行的。随后使用适宜方法(例如FACS)来选择结合到试剂或抗体的细胞(例如，通过针对以高水平(例如该群体的水平的至少80％的水平)表达FACS可选择多肽的细胞进行门控)，并将其用于选择经转染的早期表达宿主细胞的子群体。或者，随后使用适宜方法(例如MACS)来选择结合到试剂或抗体的细胞(例如，通过针对以高水平(例如该群体的水平的至少80％的水平)表达MACS可选择多肽的细胞进行门控)，并将其用于选择经转染的早期表达宿主细胞的子群体。

随后使经转染的早期表达宿主细胞的所选择子群体在导致该子群体扩增的条件下生长，以产生表达靶多肽的生产细胞的群体。

在某些实施方案中，在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体的步骤是在无药物选择培养基中进行。例如，在某些实施方案中，在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体的步骤是在0nM MTX(即，无MTX)培养基中进行。

在某些实施方案中，扩增经转染的宿主细胞的所选择子群体的步骤是在无药物选择培养基中进行。例如，在某些实施方案中，扩增经转染的宿主细胞的所选择子群体的步骤是在0nM MTX(即，无MTX)培养基中进行。

在某些实施方案中，(b)在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体的步骤，和(c)扩增经转染的宿主细胞的经分离子群体的步骤都是在无药物选择培养基中进行。例如，在某些实施方案中，(b)在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体的步骤，和(c)扩增经转染的宿主细胞的经分离子群体的步骤都是在0nM MTX(即，无MTX)培养基中进行。

包括生产细胞在内的细胞可在以下装置中培养：旋转烧瓶、振荡烧瓶、滚瓶、波式反应器(例如，来自wavebiotech.com的System 1000)或中空纤维系统，或者对于大规模生产，搅拌罐反应器或袋式反应器(例如，Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)特别用于悬浮培养。搅拌罐反应器可适合于使用例如喷洒器、挡板或低剪切叶轮进行通风。对于鼓泡塔和气升式反应器，可使用用空气或氧气泡直接通风。如果在无血清培养基中培养宿主细胞，培养基中可补充有细胞保护剂，例如泊洛沙姆188(F-68)以帮助防止细胞因通风过程而损伤。根据宿主细胞的特征，可使用微载体作为锚定依赖性细胞系的生长基底，或该细胞可适合于悬浮培养。宿主细胞、特别是脊椎动物宿主细胞的培养可利用多种操作模式，例如分批、补料分批、重复分批加工(参见，Drapeau等人(1994)Cytotechnology15:103-109)、延长分批工序或灌注培养。虽然重组转化的生产细胞可在含血清培养基(例如包含胎牛血清(FCS)的培养基)中培养，但是在一些实施方案中，所述宿主细胞是在无血清培养基中培养，例如Keen等人(1995)Cytotechnology 17:153-163中所披露，或市售培养基，例如ProCHO-CDM或UltraCHO^TM(Cambrex,NJ,USA)，所述培养基在需要时补充有诸如葡萄糖等能源和诸如重组胰岛素等合成生长因子。宿主细胞的无血清培养可能需要那些细胞适合于在无血清条件下生长。一种适应方法是在含血清培养基中培养所述宿主细胞并将80％的培养基反复更换为无血清培养基，使得宿主细胞适应无血清条件(参见，例如，Scharfenberg,K.等人(1995)，Animal Cell Technology:Developments Towards the21st Century(Beuvery,E.C.等人编辑)，第619-623页，Kluwer Academic publishers)。

在某些实施方案中，该方法进一步包含从生产细胞的群体分离靶多肽。靶多肽可使用本领域已知的任何方法来分离，并且可例如根据用于重组蛋白和抗体的现行药品生产管理规范(Current Good Manufacturing Practice，CGMP)进一步纯化至至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或更高的纯度水平。根据所述实施方案的靶多肽可被分泌到培养基中并使用多种技术中的任一种从中回收和纯化，以提供适于既定用途的纯化程度。例如，与包含靶多肽的培养基相比，靶多肽(例如，抗体或Fc融合蛋白)用于治疗人类受试者的用途通常要求如通过还原SDS-PAGE所测定的至少95％纯度，更通常地98％或99％纯度。在第一种情况下，可使用以下步骤从培养基移除细胞碎片：离心，之后使用例如微孔过滤、超滤和/或深层过滤对上清液进行澄清步骤。或者，可在没有事先离心的情况下，通过微孔过滤、超滤或深层过滤收获靶多肽。可使用多种其他技术，例如透析和凝胶电泳和色谱技术，例如羟磷灰石(HA)、亲和色谱(任选地涉及亲和标签系统，例如多组氨酸)和/或疏水相互作用色谱(HIC)(参见US5,429,746)。在一个实施方案中，在各种澄清步骤后，使用以下步骤捕获诸如抗体或Fc融合蛋白等靶多肽：蛋白A或G亲和色谱，之后进行进一步色谱步骤，例如离子交换和/或HA色谱、阴离子或阳离子交换、尺寸排阻色谱和硫酸铵沉淀。还可采用各种病毒移除步骤(例如，纳米过滤，使用例如DV-20过滤器)。在这些不同步骤后，提供包含至少10mg/mL或更多，例如100mg/mL或更多本文所述靶多肽的经纯化制剂。

在某些实施方案中，本发明方法进一步包括以下步骤：从经扩增子群体分离一个或多个经转染的单宿主细胞，并培养该一个或多个经转染的单宿主细胞以产生该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体。在某些实施方案中，本发明方法进一步包括以下步骤：从经扩增子群体分离一个或多个经转染的单宿主细胞，并培养该一个或多个经转染的单宿主细胞以产生表达靶多肽的生产细胞的一个或多个克隆群体。克隆群体的制备可通过本领域中已知的任何方法来进行。例如，在一个实施方案中，可将所选择细胞以1个细胞/孔的密度平铺到96孔(或其他大小)板中并允许其生长一段时间(例如，通常7-28天)，其允许单细胞生长为子细胞的多细胞集落(即，克隆群体)。该方法可随后包含通过检测所述克隆群体上可选择多肽和/或靶多肽表达的水平来分析一个或多个克隆群体，以及选择一个或多个具有可选择多肽和/或靶多肽的高表达水平的克隆群体，由此选择一个或多个稳定表达靶多肽的克隆群体。在某些实施方案中，在以单细胞密度平铺后，在分析克隆群体前，将克隆群体培养7-28天。该方法可进一步包括在允许或有利于抗体或其他结合剂与可选择多肽结合的条件下，使克隆群体与可检测的识别并直接或间接结合克隆细胞表面上的可选择多肽(如果存在)的抗体或其他结合剂接触；以及选择或检测一个或多个直接或间接结合到抗体或其他结合剂的细胞。还可分离并培养如此选择的这些细胞。该方法可进一步包括例如使用蛋白A筛选(例如在靶多肽是抗体或Fc融合蛋白时)、蛋白质印迹、使用考马斯蓝或银染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或酶活性分析来分析一个或多个克隆的靶多肽表达。

在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含至少80-120x 10⁶个细胞。例如，在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含至少约80x 10⁶个细胞；在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含至少约90x 10⁶个细胞；在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含至少约100x 10⁶个细胞；在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含至少约110x 10⁶个细胞；并且在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含至少约120x10⁶个细胞。例如，在某些实施方案中，经历步骤(b)中的分离的经转染的宿主细胞的子群体包含约80x 10⁶至约800x 10⁶个细胞、约100x 10⁶至约800x 10⁶个细胞、约200x 10⁶至约800x 10⁶个细胞、约300x 10⁶至约800x 10⁶个细胞、约400x 10⁶至约800x 10⁶个细胞、约500x 10⁶至约800x 10⁶个细胞、约80x 10⁶至约600x 10⁶个细胞、约100x 10⁶至约600x 10⁶个细胞、约200x10⁶至约600x10⁶个细胞、约300x 10⁶至约600x 10⁶个细胞、约400x 10⁶至约600x 10⁶个细胞、约500x 10⁶至约600x 10⁶个细胞、约80x 10⁶至约500x 10⁶个细胞、约100x 10⁶至约500x 10⁶个细胞、约200x 10⁶至约500x 10⁶个细胞、约300x 10⁶至约500x10⁶个细胞、约400x 10⁶至约500x 10⁶个细胞、约80x 10⁶至约400x 10⁶个细胞、约100x 10⁶至约400x 10⁶个细胞、约200x10⁶至约400x 10⁶个细胞、约300x 10⁶至约400x 10⁶个细胞、约80x 10⁶至约300x 10⁶个细胞、约100x 10⁶至约300x10⁶个细胞、约200x 10⁶至约300x 10⁶个细胞、约80x 10⁶至约250x 10⁶个细胞、约100x 10⁶至约250x 10⁶个细胞、约200x 10⁶至约250x 10⁶个细胞、约80x 10⁶至约200x 10⁶个细胞或约100x 10⁶至约200x 10⁶个细胞。

在某些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后不到6天进行。例如，在某些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后2天与4天之间进行。在某些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后2天进行。在某些实施方案中，步骤(b)中的分离是在转染后3天进行。

在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体包含约0.5-6.0x 10⁶个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体包含约0.5x 10⁶个细胞、约1.0x 10⁶个细胞、约2.0x 10⁶个细胞、约3.0x 10⁶个细胞、约4.0x 10⁶个细胞、约5.0x 10⁶个细胞或约6.0x 10⁶个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体包含约0.5x 10⁶至约1.0x 10⁶个细胞、约0.5x 10⁶至约2.0x 10⁶个细胞、约0.5x 10⁶至约3.0x 10⁶个细胞、约0.5x 10⁶至约4.0x10⁶个细胞、约0.5x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞、约0.5x 10⁶至约6.0x 10⁶个细胞、约1.0x10⁶至约2.0x 10⁶个细胞、约1.0x 10⁶至约3.0x 10⁶个细胞、约1.0x 10⁶至约4.0x 10⁶个细胞、约1.0x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞、约1.0x 10⁶至约6.0x10⁶个细胞、约2.0x 10⁶至约3.0x10⁶个细胞、约2.0x 10⁶至约4.0x 10⁶个细胞、约2.0x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞、约2.0x 10⁶至约6.0x 10⁶个细胞、约3.0x 10⁶至约4.0x 10⁶个细胞、约3.0x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞、约3.0x 10⁶至约6.0x10⁶个细胞、约4.0x 10⁶至约5.0x 10⁶个细胞、约4.0x 10⁶至约6.0x 10⁶个细胞或约5.0x 10⁶至约6.0x 10⁶个细胞。在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体含有大于6.0x 10⁶个细胞。例如，在某些实施方案中，在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体包含约7.0x10⁶个细胞、约8.0x 10⁶个细胞、约9.0x10⁶个细胞或约10.0x 10⁶个细胞。

在某些实施方案中，步骤(c)中的扩增进行4-31天。例如，在多个实施方案中，扩增进行4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。

在某些实施方案中，一个或多个载体中的第一载体对编码靶多肽的mRNA进行编码，并且该一个或多个载体中的第二载体对编码可选择多肽的mRNA进行编码。如果一个或多个对编码靶多肽的mRNA进行编码和对编码可选择多肽的mRNA进行编码的载体是单独载体，那么在某些实施方案中，该载体独立地选自质粒、病毒、噬菌体、转座子和微型染色体。

在某些实施方案中，编码靶多肽的mRNA和编码可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。根据这些实施方案，单一载体编码同时编码靶多肽和可选择多肽的多顺反子mRNA。同样根据这些实施方案，在某些实施方案中，编码可选择多肽的mRNA可位于编码靶多肽的mRNA的上游(即，5')。或者，在某些实施方案中，编码靶多肽的mRNA可位于编码可选择多肽的mRNA的上游(即，5')。

因此，在某些实施方案中，靶多肽和可选择多肽是由单一多顺反子mRNA编码。在某些实施方案中，多顺反子mRNA包含编码可选择多肽的第一开放阅读框(ORF)和编码靶多肽的第二ORF，其中第一ORF位于第二ORF的5'。

在某些实施方案中，第一ORF具有非AUG起始密码子。在某些实施方案中，非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。非AUG起始密码子可使用标准分子生物学技术来安置，例如本领域中熟知的技术。

在某些实施方案中，第二ORF具有AUG起始密码子。

在某些实施方案中，第一ORF具有非AUG起始密码子，并且第二ORF具有AUG起始密码子。

在某些实施方案中，编码可选择多肽的ORF缺乏任何AUG序列。AUG序列可使用标准分子生物学技术转化为除了终止密码子以外的其他三联体序列，例如本领域中熟知的技术；例如并不限于，AUG序列可独立转化为CUG(L)、GUG(V)、UUG(L)、AAG(K)、ACG(T)、AGG(R)、AUA(I)、AUC(I)、AUU(I)、GCA(A)、GCC(A)、GCG(A)或GCU(A)。

在某些实施方案中，靶多肽和可选择多肽形成融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白是膜结合的。在融合蛋白是膜结合蛋白时，在某些实施方案中，可选择多肽是以可检测形式存在，即，融合蛋白的靶多肽部分不妨碍对融合蛋白的可选择多肽部分的检测。同样在融合蛋白是膜结合蛋白时，在某些实施方案中，靶多肽是以功能性形式存在，即，融合蛋白的可选择多肽部分不妨碍融合蛋白的靶多肽部分的功能。在某些实施方案中，融合蛋白是作为可溶蛋白从宿主细胞释放。在某些实施方案中，融合蛋白是作为表面蛋白来表达，但可裂解以释放呈可溶功能性形式的靶多肽。

在某些实施方案中，靶多肽是治疗剂，例如抗体、抗体的抗原结合片段、Fc融合蛋白、激素或酶。多肽激素包括但不限于促肾上腺皮质激素(ACTH)、抗利尿激素(加压素)、心房利钠肽(ANP)、胆囊收缩素、滤泡刺激激素(FSH)、胃泌素、高血糖素、生长激素、胰岛素、瘦素、促黄体生成激素(LH)、催产素、催乳素、促生长素抑制素和促甲状腺激素(TSH)。酶包括但不限于酸性α葡萄糖苷酶、腺苷脱氨酶、α半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶B、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、透明质酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶和N-乙酰氨基葡糖苷酶。

在一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。

在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞选自CHO细胞、BHK-21细胞、NIH/3T3细胞、HEK293细胞、HeLa细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、C127细胞、COS细胞、Vero细胞和U937细胞。所有这些细胞(细胞系)都可从诸如美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)等来源购得。在某些实施方案中，宿主细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和HeLa细胞。

本发明的一方面是表达可通过本发明方法获得的可选择多肽和靶多肽的经转染的宿主细胞的克隆群体。在某些实施方案中，经转染的宿主细胞的克隆群体表达可通过本发明方法获得的FACS可选择多肽和靶多肽。

在某些实施方案中，与在步骤(c)获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，克隆群体产生靶多肽产量的2至30倍提高。

例如，在一些实施方案中，与在步骤(c)获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，克隆群体产生靶多肽产量的2至30倍、3至30倍、5至30倍、10至30倍、15至30倍、20至30倍、25至30倍、2至25倍、3至25倍、5至25倍、10至25倍、15至25倍、20至25倍、2至20倍、3至20倍、5至20倍、10至20倍、15至20倍、2至15倍、3至15倍、5至15倍、10至15倍、2至10倍、3至10倍、5至10倍、2至5倍、3至5倍或2至3倍提高。在某些实施方案中，与在步骤(c)获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，克隆群体产生靶多肽产量的大于30倍提高。例如，在某些实施方案中，与在步骤(c)获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，克隆群体产生靶多肽产量的高达40倍、高达50倍、高达60倍、高达70倍、高达80倍、高达90倍或高达100倍提高。

III.生产细胞和其产生方法

在一些实施方案中，提供生产细胞的异质性群体。生产细胞的异质性群体可使用本领域中已知或本文中描述的任何方法。在所提供任一种方法的一些实施方案中，生产细胞的异质性群体是通过以下方式来产生：用编码多顺反子mRNA的载体转染细胞，并使经转染细胞经历少于或等于一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平(例如，相差至少10倍、100倍、1,000倍或10,000倍)的多顺反子mRNA的细胞。在一些实施方案中，载体进一步含有药物可选择标志物，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，并且基于培养基的选择是甲氨蝶呤(MTX，例如，1nM-100nM MTX)、核苷酸缺乏培养基或其组合。在一些实施方案中，载体进一步含有谷氨酰胺合成酶(GS)基因，并且基于培养基的选择是甲硫氨酸砜亚胺(MSX，例如，25-100μM MSX)。在一些实施方案中，载体缺少药物可选择标志物，例如缺少DHFR基因或GS基因。

在一些实施方案中，使用FACS选择表达不同水平的多顺反子mRNA的细胞，例如通过使用FACS可选择多肽水平以选择细胞。

本领域技术人员将易于明了，本文所述方法的其他适宜修饰和适应可在不背离本文所公开实施方案的范围的情况下使用适宜等效方式来进行。虽然现已详细描述某些实施方案，但参照以下实施例将更清楚地理解所述实施方案，所述实施例仅出于说明目的而被包括，并且不打算具有限制性。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明，不应将所述实施例视为进一步限制。

实施例1：用于细胞的早期转染后分离(EPIC)的分选-概念验证

这个实施例证实在选择前靶向未选择的经转染的早期表达群体以供增量富集(bulk enrichment)的分选方法的可行性。这种分选方法称为“短分选(short sorting)”或“EPIC”(细胞的早期转染后分离)并且经设计用于分选分离(sort-isolate)或增量富集转染后不久的早期报道基因表达。EPIC可显著缩短选择时间线和/或提高所得异质性群体的生产力。已进行实验来研究经转染群体在整个核苷酸缺乏选择过程期间的报道基因表达谱。图1A描绘EPIC的一般方案。图1B显示报道基因在核苷酸缺乏选择过程期间的早期表达。这些偏移直方图证实，早期表达(例如第3-4天)是阳性的并且可分选的；使得分离经转染细胞的子群体用于EPIC工序可行。

如图1A中所示，EPIC可通过转染群体并容许早期表达发展来执行，可靶向所述群体用于使用流式细胞术或其他细胞分选方式来分离。随后可将这些经分选分离的早期表达子群体置于选择培养基中以建立稳定表达池。相对于单独的标准转染/选择方法，在选择前分离这些转染后早期表达子群体产生提高的生产力(例如，如图1A中所示)。

为了证实所检测到的CD52信号实际上是早期CD52报道基因表达的概念验证，构建引导红色荧光蛋白(RFP)和CD52(pGZ729-RFP)二者或单独的RFP(pGZ700-RFP)表达的载体并转染以供早期表达评估。在这个系统中，CD52对应于可检测多肽，并且RFP对应于靶多肽。

pGZ729载体主链序列(包括编码CD52而非RFP的序列)显示于下文中，后随序列注释。

pGZ729表达载体的序列(SEQ ID NO:8)：

ggatccgctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttggggggggggacagctcagggctgcgatttcgcgccaaacttgacggcaatcctagcgtgaaggctggtaggattttatccccgctgccatcatggttcgaccattgaactgcatcgtcgccgtgtcccaaaatatggggattggcaagaacggagacctaccctggcctccgctcaggaacgagttcaagtacttccaaagaatgaccacaacctcttcagtggaaggtaaacagaatctggtgattatgggtaggaaaacctggttctccattcctgagaagaatcgacctttaaaggacagaattaatatagttctcagtagagaactcaaagaaccaccacgaggagctcattttcttgccaaaagtttggatgatgccttaagacttattgaacaaccggaattggcaagtaaagtagacatggtttggatagtcggaggcagttctgtttaccaggaagccatgaatcaaccaggccacctcagactctttgtgacaaggatcatgcaggaatttgaaagtgacacgtttttcccagaaattgatttggggaaatataaacttctcccagaatacccaggcgtcctctctgaggtccaggaggaaaaaggcatcaagtataagtttgaagtctacgagaagaaagactaacaggaagatgctttcaagttctctgctcccctcctaaagctatgcatttttataagaccatgggacttttgctggctttagatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattggggaccaagacagaaccataagccagtgggatagatcagaaatgttccagaggtgggatggggccagagtgcctgccccttgaaccgtcccagggaccagaggtgacaaagtggcaacacaggtcctgcctgggaatctggtctgctcctacttagtaaagctgcctggtgtcacacaagaggcccccacttattcctgcacccctggtggtaggtggcgtcttctcccctgcagccaccaggctcccctgagaacactgccggcagtcctcattgacaggcagtattcgctctgccccacccccacctgtgaattgcagggctggcaggtcctcaggcagctggcaaaccgcctgaacaactgagagatacagggccagggccagggcagtcccgtcccccggaggcagggaggggacgtgctgggaaagttctctctctcaggcccaggttggtgactgcagaaggcttctgtcaaatctcttttgtgggaaccacagagtagccctgaacgtgggggtgtgcttccagtatactctggggtcaccctttccatactggaggcctctgcaacttcaaaatgctctgctaccaacctagcacaaggaagttggtccagcctccccacgcagggccactgctgcagtccatatatggactaagccttccttggtttcaacacctacactcactgagcccctactatgtgtatgcagagccgagacaggccctgagcatctcatctgaagcacccttcttgcctaaattcagttttctgtcactttctcccaggaggtgtgtgtccctctaagctaagccaggggtccctcacccctgccccactcccatccctagtgtaggtatcagctgaagagcttcctgagcagaacactcttgggtgctgacattttgataaataggcccatgtttaggagagcaggggtccgggggcgggagatcttctctggtggattgagggctccaagaactactctttgagcacgctgcccctcccagagtccccacagcctccagatggactagaacacagttcggctgtggctgcacataactaacagaggatagatggtgggtcccagcccaacagtgcctggcaatcacccagagccaccagctaacggccttggcttagttttttgcctgggtgtgatcaggcagccctccaaaactgcccggactccatgacaagttttgcttgttctatagagcacagttcctttctaggtctggggcaagggacatcgggagacatcttcctgcaacagctccagtcactggaccaccaggctcgccctgtctttggtgtgtggccctgagtctcctaagtggcccaaacctgtgaagacccctccaaccacagttttgcttctaaattgtaccccaacacacctagcaaattgaaaccccaccagaagtcccccagatctggctttccggctattgctggcaagggggagtgactcccggcccattcaatccaggccccgcgtgttcctcaaacaagaagccacgtaaacataaaccgagcctccatgctgacccttgcccatcgaggtactcaatgttcacgtgatatccacacccagagggtcctggggtgggtgcatgagccccagaatgcaggcttgataaccgagaccctgaatcgggcagtgtccacaagggcggaggccagtcatgcatgttcgggcctatggggccagcacccaacgccaaaactctccatcctcttcctcaatctcgctttctctctctctctctttttttttttttattttttttttttgcaaaaggaggggagagggggtaaaaaaatgctgcactgtgcggctaggccggtgagtgagcggcgcggagccaatcagcgctcgccgttccgaaagttgccttttatggctcgagtggccgctgtggcgtcctataaaacccggcggcgcaacgcgcagccactgtcgagtccgcgtccacccgcgagcacaggcctttcgcagctctttcttcgccgctccacacccgccaccaggtaagcagggacaacaggcccagccggccacagccctcccgtgggcagtgaccgcgctgcagggtcgcgggggacactcggcgcggacaccggggaaggctggagggtggtgccgggccgcggagcggacactttcagatccaactttcagtccagggtgtagaccctttacagccgcattgccacggtgtagacaccggtggacccgctctggctcagagcacgcggcttgggggaacccattagggtcgcagtgtgggcgctatgagagccgatgcagctttcgggtgttgaaccgtatctgcccaccttggggggaggacacaaggtcgggagccaaacgccacgatcatgccttggtggcccatgggtctttgtctaaaccggtttgcccatttggcttgccgggcgggcgggcgcggcgggcccggctcggccgggtgggggctgggttgccactgcgcttgcgcgctctatggctgggtattggggcgcgtgcacgctggggagggagcccttcctcttccccctctcccaagttaaacttgcgcgtgcgtattgagacttggagcgcggccaccggggttgggcgagggcggggccgttgtccggaaggggcggggtcgcagcggcttcggggcgcctgctcgcgcttcctgctgggtgtggtcgcctcccgcgcgcgcactagccgcccgccggcggggcgaaggcggggcttgcgcccgtttggggagggggcggaggcctggcttcctgccgtggggccgcctccggaccagcgtttgcctcttatggtaataacgcggccggcctgggcttcctttgtcccctgagtttgggcgcgcgccccctggcggcccgaggccgcggcttgccggaagtgggcagggcggcagcggctgcgcctagtggcccgctagtgaccgcgaccctcttttgtgccctgatatagttcgccggatcctaccgcggtagcggccgcgccaccttggagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctcgttttggtacaaatacaaaccggactctccggacaaaacgacaccagccaaaccagcagcccctcagcatccagcaacataagcggaggcattttccttttcttcgtcgccaacgccataatccacctcttctgcttcagttgaaggccggccaatacgtaggcgcgccattgagtgagtgatttggcgcgccaagatatcacacccgggattaattaaaggtacctacgcgtagaattccacgtagtggtttaaactctagatactcgagggatctggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtct

pGZ729表达载体的元件(和核苷酸位置)：

核苷酸1-325–SV40早期启动子(用于DHFR转录)

核苷酸347-1089–二氢叶酸还原酶(DHFR)开放阅读框

核苷酸1090-1934–SV40早期内含子和多聚A

核苷酸2684-3366–大肠杆菌ColE1起点

核苷酸3464-4123–氨苄西林抗性基因

核苷酸4528-7539–仓鼠β-肌动蛋白启动子(用于目标基因的转录)

核苷酸7568-7753–CD52开放阅读框(含有TTG起始密码子)

核苷酸7781-7791–3个阅读框各自的终止密码子

核苷酸7813-7872–多个克隆位点(用于插入具有ATG起始密码子的靶多肽)

核苷酸7882-8123–SV40早期多聚A

如图2中所示，经pGZ729-RFP转染的CHO细胞产生CD52和RFP二者的早期表达，大约在第2天和第3天达到峰值，且信号变差至转染后第7天。因此，在第2-3天或接近第2-3天的EPIC靶向适于分离经转染的宿主细胞的早期表达子群体。为了证实这些相对低的荧光强度信号实际上是CD52表达，分析经pGZ729-RFP或pGZ700-RFP转染的CHO细胞的RFP和CD52表达。如图3中所示，经pGZ729-RFP转染的CHO细胞和经pGZ700-RFP转染的CHO细胞稳健地表达RFP(分别是左上图和左下图)，而虽然经pGZ729-RFP转染的CHO细胞具有CD52的适度表达(右上图)，但经pGZ700-RFP转染的CHO细胞表达基本上无法检测的CD52(右下图)。这些发现支持以下看法：这些相对低的荧光强度信号实际上是来自备选起始表达盒的CD52表达，并且是分选分离(EPIC)的适宜靶。

作为另一原理验证，靶向早期RFP表达用于使用pGZ729-RFP从经转染群体进行EPIC，以随后生成稳定池。靶向早期RFP表达用于转染后两天的分选分离和收集(峰值瞬态)。随后通过在0nM MTX核苷酸缺乏培养基中选择，使用EPIC生成的RFP阳性子群体建立稳定池。还生成标准转染/选择池以用作比较对照。如图7中所示，EPIC生成的池(其靶向早期RFP表达)产生稳定池(EPIC池)，其中RFP和CD52报道基因表达大于单独的传统转染/选择方法(0nM池)。结果证实非FLARE依赖性原理验证，支持以下主张：EPIC生成的池的生产力高于传统转染/选择方法。

实施例2：用于细胞的早期转染后分离(EPIC)的分选–生产细胞池生成

首先使用mAb#1尝试EPIC，其中转染CHO细胞并给予其2天以恢复，之后起始0nMMTX选择以建立早期表达。在转染后4天，靶向CD52细胞表面报道基因的早期表达用于分选分离(EPIC)。分选仅靶向阳性表达，收集其作为约1百万个细胞的增量富集的群体，随后容许其在核苷酸缺乏培养基(0nM MTX)中继续进行选择。作为对照，容许未分选的转染通过标准选择程序继续进行选择。如图4中所示，截至第8天，与标准选择相比，用于EPIC的分选产生略微富集的群体，如通过CD52报道基因表达可见。然而，随着两个群体的选择继续进行，这个小型EPIC子群体随时间变得更显著。实际上，CD52阴性子群体在选择完成时几乎被消除。相比之下，标准选择方法显示CD52报道基因表达略有改善，这根据经验是典型的。用于EPIC的分选或分离早期表达产生阳性表达的子群体，其生存性优于表达较弱的细胞，继而产生生产力更高的稳定池。

使用EPIC和标准选择的池二者建立未给料分批培养以测定mAb#1效价。如图4和图5中所示，EPIC生成的池产生502mg/L的效价，远远超过通过MTX扩增生成的任何池，在整个过程期间仍不使用MTX。相比之下，通过标准选择生成的池产生150mg/L的效价，比EPIC生成的池的效价低3倍。

虽然这些初始分选靶向EPIC耗时35天(转染/分选/分离)以实现稳定池的完成，但这与所收集的经分选的细胞的小数目(1百万个)直接相关，所述细胞随后必须忍受扩增和针对稳定群体的选择。所述时间线可通过简单地收集更多细胞和/或靶向更纯净的种类显著缩短。所分选的细胞中很多具有大量杂质(表达极少或无表达的细胞)并且必须将其选择除去(消除)，从而延长选择/扩增时间。

实施例3：用于细胞的早期转染后分离(EPIC)的分选-克隆生成

实施例2中的EPIC生成的池随后用于使用FLARE生成克隆，如先前所述(参见，例如，Cairns,V.等人(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a FlowCytometric Method for Efficient Selection of Recombinant Cell Lines,Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622)。简单来说，将FLARE用于分离并使用FACS，单细胞平铺每一池中报道基因表达细胞的最高的3-5％。然后仍使用FLARE筛选经扩增克隆(取阳性表达细胞的最高的30％)，以仅鉴别最高效价克隆，以扩增用于靶多肽效价评估。如图6中所示，最高表达的EPIC生成的克隆实现与来自传统方法(例如使用MTX扩增的池)的最佳克隆的效价(接近2.0g/L)类似的效价。结果证实，在选择前使用EPIC分离早期表达群体是传统转染和选择方法的可行的备选方案。EPIC提供非MTX依赖性方法来实现与来自传统MTX方法的克隆效价相似的克隆效价，获得可能更稳健且更稳定的克隆。或者，EPIC也适于在EPIC生成的子群体的选择/扩增期间进行MTX引入，具有在这些经富集群体中驱动甚至更高表达的潜力。

实施例4：用于克隆生成的细胞早期转染后分离(EPIC)–与其他方法的直接比较

进行综合性研究以直接比较用于克隆生成的EPIC工序(非MTX依赖性)、快速增量工序(非MTX依赖性)与标准MTX选择工序(直接选择工序)。对于每种工序进行三个独立实验，每个实验使用不同的重组蛋白(两种单克隆抗体和一种Fc融合蛋白)。图8描绘比较性研究的一般方案，其中三种工序各自从经转染细胞的单一来源池起始。

在“EPIC工序”中，在细胞表面报道基因阳性表达群体的分选分离之前，容许池化的经转染细胞的一部分继续再恢复2天。将经分选分离的细胞置于用于扩增的核苷酸缺乏培养基(无MTX)中以生成稳定EPIC池。在“快速增量工序”中，将池化的经转染细胞的一部分置于核苷酸缺乏培养基(无MTX)中以生成群体，随后通过基于细胞表面报道基因表达水平的分选分离将所述群体增量富集两倍(靶向最高的10％)，最后#2号池进行快速增量。在“直接选择工序”中，将池化的经转染细胞的一部分置于含有MTX的培养基中用于标准选择程序。在克隆生成前，使所得池在核苷酸缺乏培养基中传代。每一组代表制备适于克隆生成的细胞稳定转染群体(池)的独立方法。

对于三种独立工序中的每一种，使用在工序最后生成的池使用FLARE生成克隆，如先前所述(参见，例如，Cairns,V.等人(2011)Utilization of Non-AUG InitiationCodons in a Flow Cytometric Method for Efficient Selection of RecombinantCell Lines,Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622).简单来说，将FLARE用于分离并使用FACS，单细胞平铺每一池中报道基因表达细胞的最高的3-5％。然后仍使用FLARE筛选经扩增克隆(取阳性表达细胞的最高的30％)，以仅鉴别最高效价克隆，以扩增用于靶多肽效价评估。

图9显示使用三种独立工序生成的克隆的靶多肽(mAb#1、mAb#2或Fc融合#1)效价的分布。

mAb1#和mAb#2的结果明确证实，从EPIC和快速增量工序(二者都不使用MTX)生成的克隆具有与从标准MTX选择工序生成的克隆相似的生产力。对于Fc融合蛋白，来自EPIC工序的克隆效价的范围与来自快速增量(无MTX)和标准MTX选择工序的克隆效价相似，但范围的最高值除外，最佳EPIC克隆效价低于来自其他两种工序的最佳克隆效价。尽管如此，EPIC工序仍生成效价高达1.8g/L的克隆(在不受控分批培养中)。同样，来自快速增量工序(无MTX)的Fc融合蛋白克隆实现与来自MTX选择工序的克隆一样高的效价。虽然存在与MTX选择工序相关的较高生产细胞的较大频率，但这可能指示MTX工序得到多样性较低的克隆组，可能具有类似的转基因整合情况下的与具有类似遗传起源。或者，EPIC和快速增量方法是分选富集工序而不是药物选择/细胞死亡工序，可产生具有不同转基因整合位点的多样性更高的克隆组，并因此产生更大范围的生产力。在鉴别适合于制造工序的细胞系时，较高克隆多样性程度通常是优选的。

这个实施例还证实EPIC工序实现的显著的时间节省。图10显示从转染到用于克隆的池(黑色)和从池到最终克隆(灰色)的天数。

关于从转染到最终池的时间，EPIC工序生成池比标准MTX选择工序快一个月。在这个池生成步骤时实现最显著的时间节省，并且用这种非MTX依赖性方法较快地生成池转变为总体CLD工序时间线缩短1个月。

这个实施例证实，与标准MTX选择工序相比，非MTX依赖性EPIC方法可以相当的生产力和显著缩短的时间线生成克隆。除了是一种更快速的工序以外，与来自MTX工序的类似生产性克隆相比，MTX的不存在可导致更稳健和稳定的克隆。

实施例5：用于细胞的早期转染后分离(EPIC)的可变分选靶向–EPIC是分离短暂阳性子群体

设计实验以得到对EPIC如何工作的更好的理解。假设靶向转染后早期的分选细胞并分离高阳性短暂表达的一种或多种子群体。然而，可能无法排除，在这个时间范围中的靶向报道基因表达也可为具有早期稳定整合(在细胞基因组中)的分离细胞，其可有助于产生显著富集的EPIC池。进行两个实验以证实，EPIC得自短暂表达子群体的分离。首先，在一时程期间进行用于EPIC的分选以显示在峰值短暂表达阶段(第2天至第4天；见图2)期间的分离产生最佳EPIC池富集。

第二，在转染后2天进行用于EPIC的可变分选靶向，旨在分离递增的阳性短暂表达群体，继而产生经进一步富集的EPIC池。

使用第2天(峰值)短暂表达群体，独立分选靶向全阳性短暂表达群体(+)和更高阳性短暂表达子群体(++)。数据最终证实，更高阳性短暂子群体的分离导致所生成的最终EPIC池中的更强富集。在转染后第2天，不会再有细胞具有稳定整合的表达，因为之后短暂表达丧失并且出现稳定表达(图2)。因此，在这个特殊早期时间点的相关关系(图11A和11B)证实，EPIC池富集直接得自来自转染后不久的峰值(或接近峰值)短暂表达的短暂子群体分离。

序列表

<110> 建新公司(Genzyme Corporation)

<120> 用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离（EPIC）

<130> 593804: SA9-179CPC

<150> US 62/405,392

<151> 2016-10-07

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 1

gccrccatgg 10

<210> 2

<211> 61

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Leu Glu Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr

20 25 30

Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ile Ser Gly Gly Ile Phe Leu Phe

35 40 45

Phe Val Ala Asn Ala Ile Ile His Leu Phe Cys Phe Ser

50 55 60

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Leu Gly Ile Gln Gly Gly Ser Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Ala Val Phe Cys His Ser Gly His Ser Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro

20 25 30

Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe

35 40 45

Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln Val Tyr Asn Asn Cys

50 55 60

Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg

65 70 75 80

Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe

85 90 95

Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val

100 105 110

Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro

115 120 125

<210> 4

<211> 74

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Leu Lys Ser Phe Leu Leu Phe Leu Thr Ile Ile Leu Leu Val Val Ile

1 5 10 15

Gln Ile Gln Thr Gly Ser Leu Gly Gln Ala Thr Thr Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Thr Asn Lys Asn Ser Thr Ser Thr Lys Lys Thr Pro Leu Lys Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ser Ile Ile Asp Ala Gly Ala Cys Ser Phe Leu Phe Phe Ala

50 55 60

Asn Thr Leu Ile Cys Leu Phe Tyr Leu Ser

65 70

<210> 5

<211> 74

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

Leu Lys Ser Phe Leu Leu Phe Leu Thr Ile Ile Leu Leu Val Val Ile

1 5 10 15

Gln Ile Gln Thr Gly Ser Leu Gly Gln Ala Thr Thr Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Thr Asn Lys Asn Ser Thr Ser Thr Lys Lys Thr Pro Leu Lys Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ser Ile Ile Asp Ala Gly Ala Cys Ser Phe Leu Phe Phe Ala

50 55 60

Asn Thr Leu Ile Cys Leu Phe Tyr Leu Ser

65 70

<210> 6

<211> 387

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

ttgggaatcc aaggagggtc tgtcctgttc gggctgctgc tcgtcctcgc tgtcttctgc 60

cattccggtc atagcctgca gtgctacaac tgtcctaacc caactgctga ctgcaaaaca 120

gccgtcaatt gttcatctga ttttgacgcg tgtctcatta ccaaagctgg gttacaagtg 180

tataacaact gttggaagtt tgagcattgc aatttcaacg acgtcacaac ccgcttgagg 240

gaaaacgagc taacgtacta ctgctgcaag aaggacctgt gtaactttaa cgaacagctt 300

gaaaacggag ggacatcctt atcagagaaa acagttcttc tgctggtgac tccatttctg 360

gcagctgctt ggagccttca tccctaa 387

<210> 7

<211> 233

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

ttgaagagct tcctcctctt cctcactatc attcttctcg tagtcattca gatacaaaca 60

ggatccttag gacaagccac tacggccgct tcaggtacta acaaaaacag cacctccacc 120

aaaaaaaccc ccttaaagag cggggcctca tccatcatcg acgcgggcgc ttgcagtttc 180

ctcttcttcg ccaataccct tatttgcctc ttctacctca gctaactgag taa 233

<210> 8

<211> 8123

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 8

ggatccgctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 60

cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg 120

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 180

gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 240

tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt 300

ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc ttgggggggg 360

ggacagctca gggctgcgat ttcgcgccaa acttgacggc aatcctagcg tgaaggctgg 420

taggatttta tccccgctgc catcatggtt cgaccattga actgcatcgt cgccgtgtcc 480

caaaatatgg ggattggcaa gaacggagac ctaccctggc ctccgctcag gaacgagttc 540

aagtacttcc aaagaatgac cacaacctct tcagtggaag gtaaacagaa tctggtgatt 600

atgggtagga aaacctggtt ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa ggacagaatt 660

aatatagttc tcagtagaga actcaaagaa ccaccacgag gagctcattt tcttgccaaa 720

agtttggatg atgccttaag acttattgaa caaccggaat tggcaagtaa agtagacatg 780

gtttggatag tcggaggcag ttctgtttac caggaagcca tgaatcaacc aggccacctc 840

agactctttg tgacaaggat catgcaggaa tttgaaagtg acacgttttt cccagaaatt 900

gatttgggga aatataaact tctcccagaa tacccaggcg tcctctctga ggtccaggag 960

gaaaaaggca tcaagtataa gtttgaagtc tacgagaaga aagactaaca ggaagatgct 1020

ttcaagttct ctgctcccct cctaaagcta tgcattttta taagaccatg ggacttttgc 1080

tggctttaga tctttgtgaa ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta 1140

cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa 1200

ctactgattc taattgtttg tgtattttag attccaacct atggaactga tgaatgggag 1260

cagtggtgga atgcctttaa tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat gccatctagt 1320

gatgatgagg ctactgctga ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa gagaaaggta 1380

gaagacccca aggactttcc ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt 1440

aatagaactc ttgcttgctt tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac 1500

aagaaaatta tggaaaaata ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat 1560

aacatactgt tttttcttac tccacacagg catagagtgt ctgctattaa taactatgct 1620

caaaaattgt gtacctttag ctttttaatt tgtaaagggg ttaataagga atatttgatg 1680

tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc 1740

tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 1800

tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 1860

cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 1920

atcttatcat gtctggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 1980

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 2040

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccgtg gccgggggac 2100

tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca 2160

acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgaccgatgc 2220

ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg 2280

ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct 2340

gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg 2400

cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac 2460

gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct 2520

tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg ccttccccat tatgattctt ctcgcttccg 2580

gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc 2640

agggacagct tcaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 2700

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 2760

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 2820

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 2880

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2940

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 3000

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 3060

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 3120

ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 3180

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 3240

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 3300

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 3360

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 3420

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 3480

aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 3540

tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 3600

gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 3660

agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 3720

aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag 3780

gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 3840

caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 3900

cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 3960

ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 4020

ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac 4080

gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 4140

cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 4200

gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 4260

caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 4320

tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 4380

acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 4440

aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 4500

gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaat tggggaccaa gacagaacca taagccagtg 4560

ggatagatca gaaatgttcc agaggtggga tggggccaga gtgcctgccc cttgaaccgt 4620

cccagggacc agaggtgaca aagtggcaac acaggtcctg cctgggaatc tggtctgctc 4680

ctacttagta aagctgcctg gtgtcacaca agaggccccc acttattcct gcacccctgg 4740

tggtaggtgg cgtcttctcc cctgcagcca ccaggctccc ctgagaacac tgccggcagt 4800

cctcattgac aggcagtatt cgctctgccc cacccccacc tgtgaattgc agggctggca 4860

ggtcctcagg cagctggcaa accgcctgaa caactgagag atacagggcc agggccaggg 4920

cagtcccgtc ccccggaggc agggagggga cgtgctggga aagttctctc tctcaggccc 4980

aggttggtga ctgcagaagg cttctgtcaa atctcttttg tgggaaccac agagtagccc 5040

tgaacgtggg ggtgtgcttc cagtatactc tggggtcacc ctttccatac tggaggcctc 5100

tgcaacttca aaatgctctg ctaccaacct agcacaagga agttggtcca gcctccccac 5160

gcagggccac tgctgcagtc catatatgga ctaagccttc cttggtttca acacctacac 5220

tcactgagcc cctactatgt gtatgcagag ccgagacagg ccctgagcat ctcatctgaa 5280

gcacccttct tgcctaaatt cagttttctg tcactttctc ccaggaggtg tgtgtccctc 5340

taagctaagc caggggtccc tcacccctgc cccactccca tccctagtgt aggtatcagc 5400

tgaagagctt cctgagcaga acactcttgg gtgctgacat tttgataaat aggcccatgt 5460

ttaggagagc aggggtccgg gggcgggaga tcttctctgg tggattgagg gctccaagaa 5520

ctactctttg agcacgctgc ccctcccaga gtccccacag cctccagatg gactagaaca 5580

cagttcggct gtggctgcac ataactaaca gaggatagat ggtgggtccc agcccaacag 5640

tgcctggcaa tcacccagag ccaccagcta acggccttgg cttagttttt tgcctgggtg 5700

tgatcaggca gccctccaaa actgcccgga ctccatgaca agttttgctt gttctataga 5760

gcacagttcc tttctaggtc tggggcaagg gacatcggga gacatcttcc tgcaacagct 5820

ccagtcactg gaccaccagg ctcgccctgt ctttggtgtg tggccctgag tctcctaagt 5880

ggcccaaacc tgtgaagacc cctccaacca cagttttgct tctaaattgt accccaacac 5940

acctagcaaa ttgaaacccc accagaagtc ccccagatct ggctttccgg ctattgctgg 6000

caagggggag tgactcccgg cccattcaat ccaggccccg cgtgttcctc aaacaagaag 6060

ccacgtaaac ataaaccgag cctccatgct gacccttgcc catcgaggta ctcaatgttc 6120

acgtgatatc cacacccaga gggtcctggg gtgggtgcat gagccccaga atgcaggctt 6180

gataaccgag accctgaatc gggcagtgtc cacaagggcg gaggccagtc atgcatgttc 6240

gggcctatgg ggccagcacc caacgccaaa actctccatc ctcttcctca atctcgcttt 6300

ctctctctct ctcttttttt ttttttattt tttttttttg caaaaggagg ggagaggggg 6360

taaaaaaatg ctgcactgtg cggctaggcc ggtgagtgag cggcgcggag ccaatcagcg 6420

ctcgccgttc cgaaagttgc cttttatggc tcgagtggcc gctgtggcgt cctataaaac 6480

ccggcggcgc aacgcgcagc cactgtcgag tccgcgtcca cccgcgagca caggcctttc 6540

gcagctcttt cttcgccgct ccacacccgc caccaggtaa gcagggacaa caggcccagc 6600

cggccacagc cctcccgtgg gcagtgaccg cgctgcaggg tcgcggggga cactcggcgc 6660

ggacaccggg gaaggctgga gggtggtgcc gggccgcgga gcggacactt tcagatccaa 6720

ctttcagtcc agggtgtaga ccctttacag ccgcattgcc acggtgtaga caccggtgga 6780

cccgctctgg ctcagagcac gcggcttggg ggaacccatt agggtcgcag tgtgggcgct 6840

atgagagccg atgcagcttt cgggtgttga accgtatctg cccaccttgg ggggaggaca 6900

caaggtcggg agccaaacgc cacgatcatg ccttggtggc ccatgggtct ttgtctaaac 6960

cggtttgccc atttggcttg ccgggcgggc gggcgcggcg ggcccggctc ggccgggtgg 7020

gggctgggtt gccactgcgc ttgcgcgctc tatggctggg tattggggcg cgtgcacgct 7080

ggggagggag cccttcctct tccccctctc ccaagttaaa cttgcgcgtg cgtattgaga 7140

cttggagcgc ggccaccggg gttgggcgag ggcggggccg ttgtccggaa ggggcggggt 7200

cgcagcggct tcggggcgcc tgctcgcgct tcctgctggg tgtggtcgcc tcccgcgcgc 7260

gcactagccg cccgccggcg gggcgaaggc ggggcttgcg cccgtttggg gagggggcgg 7320

aggcctggct tcctgccgtg gggccgcctc cggaccagcg tttgcctctt atggtaataa 7380

cgcggccggc ctgggcttcc tttgtcccct gagtttgggc gcgcgccccc tggcggcccg 7440

aggccgcggc ttgccggaag tgggcagggc ggcagcggct gcgcctagtg gcccgctagt 7500

gaccgcgacc ctcttttgtg ccctgatata gttcgccgga tcctaccgcg gtagcggccg 7560

cgccaccttg gagcgcttcc tcttcctcct actcaccatc agcctcctcg ttttggtaca 7620

aatacaaacc ggactctccg gacaaaacga caccagccaa accagcagcc cctcagcatc 7680

cagcaacata agcggaggca ttttcctttt cttcgtcgcc aacgccataa tccacctctt 7740

ctgcttcagt tgaaggccgg ccaatacgta ggcgcgccat tgagtgagtg atttggcgcg 7800

ccaagatatc acacccggga ttaattaaag gtacctacgc gtagaattcc acgtagtggt 7860

ttaaactcta gatactcgag ggatctggat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt 7920

tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc 7980

aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 8040

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 8100

catcaatgta tcttatcatg tct 8123

Claims

1.一种产生表达靶多肽的生产细胞的群体的方法，该方法包括：

(a)用编码多顺反子mRNA的载体转染宿主细胞，其中该多顺反子mRNA编码可选择多肽CD52和靶多肽；

(b)在转染2至4天内通过FACS、MACS、ClonePix或亲和色谱直接或间接从经转染的宿主细胞分离表达该可选择多肽的经转染的宿主细胞的短暂表达的子群体，其中该可选择多肽是能够通过FACS、MACS、ClonePix和亲和色谱直接或间接检测的多肽；和

(c)扩增经转染的宿主细胞的该高阳性短暂表达的子群体，由此产生表达该靶多肽的生产细胞的群体，其中步骤(b)和(c)各自在无药物选择培养基中进行，所述无药物选择培养基是缺乏药物的培养基，所述药物用于选择细胞的群体或子群体，所述群体或子群体表达赋予该群体或子群体抗药性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含从生产细胞的该群体分离该靶多肽。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括从该经扩增的子群体分离一个或多个单转染的宿主细胞，并培养该一个或多个单转染的宿主细胞以产生该一个或多个单转染的宿主细胞的克隆群体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中与在步骤(c)获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，该一个或多个单转染的宿主细胞的克隆群体中的至少一个产生该靶多肽产量的2倍到30倍提高。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中要经历(b)中的选择的经转染的宿主细胞含有至少80x 10⁶至120x 10⁶个细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的分离是在转染后2天进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的分离是在转染后3天进行。

8.根据权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中的扩增之前，经转染的宿主细胞的该子群体含有0.5x 10⁶至6.0x 10⁶个细胞。

9.根据权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的扩增进行4至31天。

10.根据权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法，其中编码该靶多肽的mRNA和编码该可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。

11.根据权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的分离采用磁激活细胞分选(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)或ClonePix。

12.根据权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法，其中该可选择多肽是FACS可选择多肽并且步骤(b)中的分离采用FACS。

13.根据权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法，其中该靶多肽和该可选择多肽是由单一多顺反子mRNA编码。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该多顺反子mRNA包含编码该可选择多肽的第一开放阅读框(ORF)和编码该靶多肽的第二ORF，其中该第一ORF位于该第二ORF的5'。

15.根据权利要求14所述的方法，其中该第一ORF具有非AUG起始密码子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中该非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中该第二ORF具有AUG起始密码子。

18.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中编码该可选择多肽的ORF缺乏任何AUG序列。

19.根据权利要求1、2、6、7和14-16中任一项所述的方法，其中该靶多肽是治疗剂。

20.根据权利要求1、2、6、7和14-16中任一项所述的方法，其中该靶多肽是分泌蛋白。

21.根据权利要求1、2、6、7和14-16中任一项所述的方法，其中该靶多肽是抗体或Fc融合蛋白。

22.根据权利要求1、2、6、7和14-16中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。