RU2752858C1 - Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD - Google Patents
Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD Download PDFInfo
- Publication number
- RU2752858C1 RU2752858C1 RU2021102630A RU2021102630A RU2752858C1 RU 2752858 C1 RU2752858 C1 RU 2752858C1 RU 2021102630 A RU2021102630 A RU 2021102630A RU 2021102630 A RU2021102630 A RU 2021102630A RU 2752858 C1 RU2752858 C1 RU 2752858C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rbd
- recombinant
- cov
- sars
- protein
- Prior art date
Links
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 37
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 title description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 title description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 3
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 5
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229910052593 corundum Inorganic materials 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910001845 yogo sapphire Inorganic materials 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960001235 gentian violet Drugs 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 208000034712 Rickettsia Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000048657 human ACE2 Human genes 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и медицине. Описан интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию белка RBD коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, имеющий размер 9910 п.н., нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержащий элементы в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1. Также создан рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-RBD - продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащего интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD по п. 1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, обеспечивающий экспрессию и секрецию белка RBD коронавируса SARS-CoV-2 и депонированный под номером 322 в коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (справка о депонировании прилагается). Также получен рекомбинантный белок RBD коронавируса SARS-CoV-2, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеток яичника китайского хомячка СНО-K1-RBD по п. 2 и имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Техническим результатом является повышение выхода целевого рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2. Изобретение может быть использовано для создания вакцин. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к интегративному плазмидному вектору pVEAL2-S-RBD, обеспечивающему экспрессию и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, штамму рекомбинантной клеточной линии СНО-K1-RBD и рекомбинантному белку RBD SARS-CoV-2, продуцируемому указанной клеточной линией СНО-K1-RBD и может быть использовано в области генной инженерии и биотехнологии. Рекомбинантный белок RBD может служить, в первую очередь, для создания вакцины против новой коронавирусной инфекции COVID-19, а также для создания диагностикумов.
Уровень техники
Пандемия COVID-19 вызвана новым высокопатогенным вирусом SARS-CoV-2, последствия заражения которым варьируют от бессимптомного течения и легких респираторных симптомов до летального исхода.
Вакцинопрофилактика считается наиболее эффективной мерой для предотвращения распространения вируса. На сегодняшний день во всем мире в разработке находятся более 190 вакцин-кандидатов против SARS-CoV-2 (https://www.who.int/who-documents-detail/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines). Привлекательной мишенью для создания вакцины является поверхностный гликопротеин S SARS-CoV-2. Гликопротеин S связывается с поверхностным белком ACE2 (ангиотензинпревращающий фермент 2) клеток-мишеней, опосредуя проникновение вируса в клетки (Gralinski & Menachery, 2020; Shang et al., 2020).
Эктодомен S белка включает два основных домена: рецептор-связывающий домен (RBD) и N-концевой домен (NTD) (Pallesen et al., 2017; Song et al., 2018; Zhou et al., 2019; Wrapp et al., 2020). Исследования показывают, что антитела нейтрализующие вирус в основном нацелены на домен RBD, к тому же он является одним из консервативных регионов (Ul Qamar et al., 2019; Gralinski & Menachery, 2020; Shang et al., 2020; Wrapp et al., 2020). Именно поэтому RBD рассматривается как одна из основных В-клеточных мишеней при создании вакцины против SARS-CoV-2 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32203189/). На данный момент 5 субъединичных вакцин на основе RBD находятся на этапе клинических испытаний и 8 на доклинических (https://www.who.int/who-documents-detail/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).
Критическим фактором для разработки вакцины на основе RBD является выбор системы экспрессии. Наиболее перспективными являются клетки млекопитающих, поскольку позволяют получать целевой белок в наиболее близкой к нативной форме, т.е. прошедший необходимые пострансляционные модификации, что весьма важно для иммуногенности рекомбинантного белка. Так было показано, что на поверхности гликопротеина S SARS-CoV-2 имеется до двадцати мест гликозилирования, два из которых приходятся на регион RBD (Zeyu Sun, et al. // Mass spectrometry analysis of newly emerging coronavirus HCoV-19 spike S protein and human ACE2 reveals camouflaging glycans and unique post-translational modifications. // bioRxiv, 2020. DOI: 10.1101/2020.04.29.068098).
Известна заявка на изобретение Китая (CN 111217917, МПК А61K 39/215, опубл. 02.06.2020 г.), в которой описан способ получения слитых белков RBD-CTB и RBD-CRM197(A) для создания рекомбинантных субъединичных вакцин для лечения и профилактики COVID-19. Для этого в экспрессионный вектор pET9a встраивали нуклеотидные последовательности, кодирующие RBD соединенные линкером с адъювантами CTB или CRM197(A), и проводили трансформацию клеток Escherichia coli BL21 полученными конструкциями.
Недостатком данного изобретения является выбор системы экспрессии в клетах Escherichia coli BL21, поскольку известно, что у прокариот отсутствуют некоторые системы посттрансляционной модификации белков, например, гликозилирование, необходимое для получения корректной формы RBD, так же существует риск некорректного фолдинга молекул. Такие особенности могут критически снижать уровень иммуногенности итоговой вакцины.
Также известна заявка на изобретение Китая (CN 111254155, МПК А61K 39/215, опубл. 09.06.2020 г.), в которой варианты RBD для субъединичных вакцин против вируса SARS-CoV-2 получали с использованием растений-хозяев. Авторы с помощью транзиентной экспресии в Lactuca sativa (салат-латук) получали слитые белки CTB-RBD и RBD-Fc, используемые в вакцине для профилактики COVID-19.
Недостатком изобретения является способ выделения целевых белков, включающий многоступенчатую систему очистки, а так же особенности экспрессии связанные с некорректным гликозилированием и фолдингом белков в растительных системах экспрессии.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является (патент РФ № 2723008, МПК C07K 14/165, C12N 15/50, опубл. 08.06.2020 г.)
- генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающая SEQ ID NO: 1;
- штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO: 1;
- способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, включающий: получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO: 1; введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B;
- рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO: 2, являющийся продуктом штамма CHO-S-RBD;
- способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающий: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO: 2.
Недостатком изобретения является использование относительно слабого лидерного пептида тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, что может снизить выход целевого белка. Кроме того, негативное влияние на выход продукта может оказать тот факт, что авторы не проводили оптимизацию кодонного состава нуклеотидной последовательности, кодирующей RBD, для продуцента, а так же использовали вектор для эписомальной (внехромомсомной) экспрессии. Авторами показан довольно низкий уровень продукции 5-10 мг/л суспензионной культуры.
Таким образом, существует потребность в разработке стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантного RBD SARS-CoV-2.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение выхода целевого рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2 за счет создания кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок RBD SARS-CoV-2 для экспрессии в клетках СНО, конструирования интегративного плазмидного вектора pVEAL2-RBD4, содержащего кодон-оптимизированный ген RBD и обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих, и разработки с помощью указанного вектора штамма-продуцента рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного штамма клеточной линии яичников китайского хомячка СНО-К1.
Технический результат достигается созданием интегративного плазмидного вектора pVEAL2-S-RBD, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка RBD коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, имеющего размер 9910 п.н., нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержащего в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1, следующие элементы:
- участок начала репликации ori (7612-8200);
- последовательности прямых и инвертированных повторов IR/DR, содержащие сайты связывания с транспозазой SB100 (139-403, 6828-7123);
- последовательности UCOE, предотвращающие хромосомное «замалчивание» рекомбинантной экспрессионной кассеты (416 - 1964, 5268-6816);
- CMV энхансер (2115-2494), CMV промотора (2495-2706) - наиболее часто используемый промотор в генно-терапевтических конструкциях;
- Chimeric intron (2867-2999), химерный интрон, для усиления экспрессии целевого гена;
- лидерный пептид S-SP (3090-3134), обеспечивающий экспорт белка из клеток СНО-К1-RBD;
- кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность гена RBD (SEQ ID NO: 1) (3135-3836);
- последовательность 10хHis - полигистидиновый тэг для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии (3837-3866);
- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES (3916-4490);
- последовательность PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину (4503-5102);
- последовательность SV40 poly(A) signal для стабилизации мРНК-транскриптов за счет полиаденилирования (5137-5258);
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR (8371-9231) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (9232-9336), позволяющие проводить амплификацию плазмиды в E.coli.
Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантного штамма клеток яичника китайского хомячка СНО-K1-RBD - продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащего интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD по п. 1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, обеспечивающий экспрессию и секрецию белка RBD коронавируса SARS-CoV-2 и депонированный под номером 322 в коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (справка о депонировании прилагается).
Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного белка RBD коронавируса SARS-CoV-2, продуцируемого рекомбинантным штаммом клеток яичника китайского хомячка СНО-K1-RBD по п. 2 и имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
Заявляемая группа изобретений имеет существенные преимущества перед известными аналогами и прототипом. Оптимизацию кодонного состава нуклеотидной последовательности, имеющей улучшенный индекс адаптации кодонов CAI (англ. Codon Adaptation Index), обеспечивает повышение экспрессии рекомбинантного белка в клетках СНО путем увеличения эффективности трансляции. Интегративный вектор pVEAL2-RBD4 содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую RBD, которая обеспечивает больший выход продукта в клетках линии СНО. UCOE-элементы, фланкирующие экспрессионную кассету указанного вектора, способствуют декомпактизации хроматина и, как следствие, усилению транскрипции гена RBD. Сигнальная последовательность играет решающую роль в секреции белка во внеклеточное пространство, поэтому в данном изобретении использована последовательность, обеспечивающая эффективный экспорт целевого белка из клеток, предотвращая токсическое воздействие рекомбинантного белка RBD на клетки продуцента.
Последовательность полигистидинового тэга 10×His введена для последующей очистки рекомбинантного белка RBD с помощью аффинной хроматографии. Добавление полигистидинового «хвоста» 10×His к одному из концов рекомбинантного белка представляет собой одну из известных генетических модификаций рекомбинантных белков, но свойства целевого белка могут значительно измениться в худшую сторону вплоть до потери его какого-либо свойства (например, потеря термостабильности белка, его агрегация и т.п.). При модификации заявляемого белка для исследователя неочевидно, что модифицированный белок будет сохранять свои специфические свойства: http://pushchinocity.ru/article/uchyonye-iz-g.puschino-vyyasnili-kak-vliyaet-poligistidinovyj-hvost-na-aktivnost-i-svojstva-endolizina-bakteriofaga-t5-81696.
Авторами установлено, что последовательность 10×His значительно повышает эффективность очистки рекомбинантного RBD в отличие от последовательности 6×His в прототипе. К тому же наличие 10×His на С-конце белка RBD не приводит к снижению иммуногенности, агрегации или иным изменениям белка в ходе хранения при +4°С в течение полугода.
Для разработки продуцента была выбрана клеточная линия СНО-К1, поскольку экспресcионная система клеток СНО позволяет получать наиболее корректную форму белка, обеспечивая все необходимые процессы посттрансляционной модификации. Для получения эффективной культуры-продуцента в заявленном изобретении проведен отбор наиболее продуктивных клонов культуры-продуцента CHO-K1-RBD. Это дополнительно увеличивает выход целевого продукта, поскольку поликлональная клеточная культура содержит клоны с разной способностью к продукции рекомбинантного белка.
Таким образом, заявляемая группа изобретений обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2 в иммунологически корректной форме, что является хорошей платформой для создания иммунобиологических препаратов и вакцин. Кроме того, технические решения соотвествуют критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Осуществление изобретения
Описание фигур
Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами.
На фиг. 1 изображена физическая и генетическая карта интегративного плазмидного pVEAL2-S-RBD.
На фиг. 2 представлены результаты иммуноблоттинга белков при окрашивании моноклональными антителами к полигистидиновому тэгу.
На фиг. 3 представлен электрофорез белков в ДСН-ПААГ.
На фиг. 4 представлен анализ специфичности сывороток мышей, иммунизированных RBD, с помощью иммуноферментного анализа.
На фиг. 5 представлены результаты исследования нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных RBD, в реакции нейтрализации цитопатического действия (ЦПД) вируса на культуре клеток VERO E6.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Ниже приведены примеры 1-5 конкретного осуществления изобретения.
Пример 1. Оптимизация кодонного состава нуклеотидной последовательности, кодирующей RBD SARS-CoV-2
Последовательность гена, кодирующего домен RBD (308V - 542N) белка S коронавируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) извлекали из базы данных GenBank и проводили оптимизацию кодонного состава для клеток CHO при помощи инструмента GeneOptimizer (https://www.thermofisher.com/ru/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html). Индекс адаптации кодонов CAI (англ. Codon Adaptation Index) был улучшен с 0,63 до 0,73.
Итоговую нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1) синтезировали на заказ в ООО «ДНК-синтез» в составе вектора pGH-RBD.
Пример 2. Конструирование интегративного плазмидного вектора pVEAL2-S-RBD для синтеза и секреции RBD SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих
На основе вектора pVEAL2 получали конструкцию pVEAL2-S-RBD (фиг. 1), содержащую нуклеотидную последовательность RBD (SEQ ID NO: 1), последовательность 10хHis и лидерный пептид S-SP белка S SARS-CoV-2 (MFVFLVLLPLVSSQC).
Нуклеотидную последовательность сигнального пептида S-SP, 10хHis и сайтов рестрикции Sfr274I и SalI вводили в последовательность RBD одновременно с помощью ПЦР и последующего отжига продуктов амплификации. С использованием праймеров pVL-F и S-SP-R получали ПЦР-продукты на матрице вектора pVEAL2, а с использованием праймеров S-SPRBD-F и RBDH-R на матрице pGH-RBD (таблица 1).
Амплификацию фрагментов проводили по стандартному протоколу. Реакционные смеси, объемом 50 мкл, содержали 5-10 нг ДНК-матрицы; 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов; 0,2 мкМ каждого прaймеров; 5 мкл SE-буфера для PfuSE ДНК полимеразы («СибЭнзим», г. Новосибирск); 1 мг/мл BSA; 50 ед/мл PfuSE ДНК полимеразы («СибЭнзим», г. Новосибирск).
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов
| Название праймера | Нуклеотидная последовательность 5'-3' | Продукт ПЦР |
| pVL-F | GACCGCCATGTTGGCATTG | 3'-часть S-RBD |
| S-SP-R | TAGTGGCAATAAAACAAGAAAAACAAACATGGCTAGCCAGCGAATTCTCGAGGC | |
| S-SPRBD-F | TTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCA | 5'-часть S-RBD |
| RBDH-R | AAAAAGTCGACGAGGCTGATCAGCGGTTTAAACTTAAGCTTAGTGGTGGTGATGGTGATGATGGTGGTGATGGAAGTTCACGCATTTGTTCTTCACG |
Температурный профиль реакции состоял из начальной денатурации при 95°С в течение 3 мин и 30 циклов (30 сек денатурации при 95°С, 20 сек отжига при 60°С и 1-2 мин элонгации при 72°С) с финальной элонгацией в течение 2 мин при 72°С.
Далее проводили отжиг соответствующих ПЦР-фрагментов и амплификацию полученных фрагментов с использованием праймеров pVL-F и RBDH-R согласно протоколу описаному выше. Затем проводили встройку в вектор pVEAL2 рестриктазно-лигазным методом по сайтам рестрикции Sfr274I и SalI. Подтверждение структуры полученного вектора проводили с помощью секвенирования.
Пример 3. Получение штамма рекомбинантной клеточной линии CHO-K1-RBD, продуцента рекомбинантного домена RBD SARS-CoV-2
Штамм рекомбинантной клеточной линии CHO-K1-RBD продуцент рекомбинантного домена RBD SARS-CoV-2 получен в 2020 г. на основе клеточной линии яичников китайского хомячка СНО-K1 с использованием разработанной конструкции pVEAL2-S-RBD. Клетки растили в инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности. При достижении 80% плотности монослоя проводили трансфекцию клеток плазмидой pVEAL2-S-RBD с помощью Lipofectamine 3000 (ThermoFisher, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для интеграции экспрессионной кассеты вектора pVEAL2-S-RBD в геном клеток совместно с плазмидой pVEAL2-S-RBD добавляли плазмиду pCMV(CAT)T7-SB100, кодирующую транспозазу SB100, в отношении 10:1. Через 3 дня в культуральную среду добавляли селективный антибиотик пуромицин (InvivoGen, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл, ген устойчивости к которому входит в состав вектора.
Селекцию устойчивых клонов проводили в течение трех суток, затем поликлональную клеточную культуру рассевали в 96 луночном планшете в концентрации 1 клетка на лунку. Спустя две недели, анализировали наличие единичных колоний в лунках, отбирали культуральную жидкость и оценивали продуктивность клонов с помощью ИФА, из которых и получен заявляемый рекомбинантный штамм CHO-K1-RBD.
Штамм депонирован 19.01.2021 г. в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером 322.
Характеристика рекомбинантного штамма CHO-K1-RBD.
Морфология: веретеновидные и эпителиоподобные клетки с круглыми ядрами, содержащими от 1 до 2 ядрышек.
Способ культивирования: монослойный. Среда для культивирования: питательная среда DМЕМ/F-12 (1:1) - 90 %, сыворотка крови плодов коровы - 10 %.
Температура культивирования: 37°С. Посевная концентрация: 100 тыс. клеток в 1 мл. Метод снятия: 0,25 % трипсин (1/3) и 0,02 % версен (2/3).
Кратность рассева: 1:3. Частота пассирования: 3-4 суток.
Условия криоконсервации: питательная среда DМЕМ/F-12 (1:1) - 50 %, сыворотка крови плодов коровы - 40 %, ДМСО - 10 %.
Режим замораживания: при температуре 4°С - 1 ч, минус 80°С - 12 ч, минус 196°С.
Условия хранения: в криопробирках в количестве 5 шт. хранится в жидком азоте при температуре минус 196°С.
Номер пассажа в жидком азоте: 10. Жизнеспособность после криоконсервации: 85-90 %.
Маркерый признак: наличие в культуральной среде рекомбинантного белка RBD размером ~35 кДа, подтверждается с помощью белкового электрофореза и иммуноблотинга. Область применения: биотехнология, генетическая инженерия.
Пример 4. Получение рекомбинантного белка RBD с использованием штамма рекомбинантной клеточной линии CHO-K1-RBD.
Штамм культуры-продуцента CHO-K1-RBD, показавший наибольшую продуктивность, культивировали на роллерных установках и собирали культуральную среду. Наличие целевого белка определяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с использованием антител против гистидинового тэга (фиг. 2). На фиг. 2 представлены результаты иммуноблоттинга белков при окрашивании моноклональными антителами к полигистидиновому тэгу, где:
1 - образец клеток CHO-K1-RBD, продуцента RBD SARS-CoV-2;
2 - образец клеток CHO-К1;
3 - образец культуральной жидкости клеток CHO-K1-RBD;
4 - образец культуральной жидкости клеток CHO-К1;
5 - образец RBD, очищенного с помощью аффинной и ионообменной хроматографии.
Культуральную жидкость, содержащую RBD, центрифугировали и фильтровали через фильтровальные системы с размером пор 0,22 мкМ для удаления клеточного дебриса и очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя.
Затем проводили дополнительную очистку ионообменной хроматографией на соединенных последовательно колонках с катионообменным (SP-сефароза) и анионообменным (Q-сефароза) сорбентами, уравновешенными 20мМ Трис-HCl, рН 8,2. После нанесения белка колонки промывали 20мМ Трис-HCl, рН 8,2. Затем колонку с сорбентом SP-сефароза, на которую RBD не сорбируется в этих условиях (рН 8,2), отсоединяли, а белки, связавшиеся с сорбентом Q-сефароза, элюировали в линейном градиенте концентрации NaCI от 0 до 1 М в 20мМ Трис-HCl, рН 8,2.
Фракции элюатов анализировали при помощи электрофореза в денатурирующих условиях в 15% ДСН-ПААГ (фиг. 3). На фиг. 3 представлен электрофорез белков в ДСН-ПААГ, где:
М - маркер молекулярного веса;
1 - рекомбинантный RBD, полученный в клетках E.coli (~27 кДа);
2 - рекомбинантный RBD, полученный в клетках CНО-К1-RBD (~35 кДа).
Фракции, содержащие целевой белок размером ~35 кДа, диализовали против фосфатно-солевого буфера и подвергали стерилизующей фильтрации через фильтры с размером пор 0,22 мкМ. Для препаратов белка, полученных в трех независимых экспериментах, определяли концентрацию RBD на спектрофотометре Nanodrop 2000c. Выход рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2 после хроматографической очистки составил 50-100 мг с литра культуральной среды, что десятикратно превосходит выход белка RBD, представленный в прототипе, и является показателем эффективности группы заявленных изобретений.
Пример 5. Оценка иммуногенности рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2
Оценку иммуногенности полученного рекомбинантного RBD проводили в экспериментах по иммунизации мышей линии BALB/c (самки весом 16-18 г). Группы животных содержали в отдельных клетках (виварий ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в одинаковых условиях, на стандартном рационе со свободным доступом к пище и воде. Эксперименты были одобрены на заседании Биоэтической комиссии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (ГНЦ ВБ «Вектор»/10-09.2020, утвержден протоколом Биоэтической комиссии № 5 от 01.10.2020) и выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации.
Животные случайным образом были разделены на шесть групп (n=6). Препараты белков вводили внутрибрюшинно на 1-й и 14-й дни. Иммунизацию 1 группы проводили введением 80 мкг RBD, 2 группы - 80 мкг RBD в комбинации с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma, США), 3 группы - 80 мкг RBD в комбинации с Al2O3 (Brenntag Biosector A/S, Denmark). Для сравнения иммуногенности 4 и 5 группам вводили RBD, полученный в прокариотической системе экспресии E.coli BL21 (proRBD) в количестве 80 мкг proRBD в комбинации с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma, США) и Al2O3 (Brenntag Biosector A/S, Denmark) соответственно. Контрольной группе мышей вводили физиологический раствор. Через две недели после последней иммунизации, у животных проводили забор крови и получали сыворотки.
Специфическую активность полученных сывороток оценивали с помощью ИФА по стандартному протоколу. В качестве антигенов использовали препараты RBD, полученные в эу- и прокариотической системах экспрессии, а так же рекомбинантные тримеры белка S SARS-CoV-2, где домен RBD формируется в корректной форме. Антиегены в концентрации 1 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночного планшета в фосфатно-солевом буфере (PBS) (Greiner bio one, Германия) при 4°С в течение ночи. Затем отмывали буфером PBST (0.1% р-р Tween-20 в PBS) и блокировали 1 % раствором казеина в буфере PBST в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого образцы сывороток вносили в трёхкратном последовательном разведении, начиная с 1:50, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем добавляли антитела кролика против IgG мыши (разбавленные в 1% блокирующем растворе казеина 1:6000), конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). После каждого этапа проводили отмывку несвязавшихся белков буфером PBST. Затем вносили раствор субстрата TMB (Amresco, США) и инкубировали в течение 10 минут, реакцию терминировали раствором 1H HCl и сразу измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на ИФА-ридере (ChroMate Awareness technology inc., США). Графики были построены с помощью программы GraphPad Prism 6.0.
По результатам ИФА с использованием 3 указанных антигенов (фиг. 4) специфичность сывороток мышей, иммунизированных RBD, наработанным клетками CHO-K1-RBD, была выше, чем сывороток мышей, иммунизированных RBD, полученным в прокариотической системе экспрессии. На фиг. 4 представлен анализ специфичности сывороток мышей, иммунизированных RBD, с помощью иммуноферментного анализа, где:
- euRBD - RBD, полученный с помощью продуцента CHO-K1-RBD;
- proRBD - RBD, полученный с помощью продуцента E.coli BL21;
- Al2O3 - адъювант окись аллюминия;
- IFA - неполный адъювант Фрейнда.
Графики и статистическая обработка сделаны в программе GraphPad Prism. Изображены геометрические средние значения данных с 95% доверительным интервалом, статистический анализ проведён непараметрическим методом Манна-Уитни.
Анализ нейтрализующей активности сывороток мышей определяли в реакции нейтрализации цитопатического действия (ЦПД) вируса на культуре клеток. В работе использовали коронавирус SARS-Cov-2 штамм nCoV/Victoria/1/2020 (Государственная коллекция возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора, РФ), доза вируса составляла 100 ЦПД50. Культуру клеток Vero E6 растили в 96 луночных культуральных планшетах в ростовой питательной среде MEM с 10% фетальной бычьей сыворотки и добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин- 100 мкг/мл) до образования 100% монослоя.
Сыворотки мышей инактивировали при +56°С в течение 30 минут и готовили последовательные двукратные разведения на среде MEM начиная с разведения 1:10 (с 1:10 до 1:5120). Готовили смесь разведений сывороток и рабочего разведения вируса в равных объемах. Смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем наносили на монослой культуры клеток. Планшеты инкубировали в течение 4 сут при +37°С, 5%СО2. Затем проводили окрашивание клеток. Для этого в каждую лунку планшета вносили по 150 мкл 0,2% раствора генциан-виолета (1 г генциан виолета, 20 мл 96% этилового спирта, 120 мл 40% формалина и 350 мл раствора Хенкса). Через 30 мин удаляли жидкость из лунок и промывали водой. Оценку результатов проводили визуально, учитывая любое специфическое поражение культуры клеток в лунке как ЦПД. Титром сыворотки считали ее разведение, при котором регистрировали защиту в 50% лунок с культурой клеток от ЦПД вируса. Расчет титра нейтрализующих антител проводили по формуле Рида-Менча [23].
Результаты эксперимента (фиг. 5) подтверждают, что заявленный рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 обеспечивает более эффективный гуморальный ответ, чем RBD, полученный в прокариотической системе экспресии. На фиг. 5 представлены результаты исследования нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных RBD, в реакции нейтрализации цитопатического действия (ЦПД) вируса на культуре клеток VERO E6, где:
- euRBD - RBD, полученный с помощью продуцента CHO-K1-RBD;
- proRBD - RBD, полученный с помощью продуцента E.coli BL21;
- Al2O3 - адъювант окись аллюминия;
- IFA - неполный адъювант Фрейнда.
Графики и статистическая обработка сделаны в программе GraphPad Prism. Изображены геометрические средние значения данных с 95% доверительным интервалом, статистический анализ проведён непараметрическим методом Манна-Уитни.
Таким образом, группа заявленных изобретений обеспечивает получение иммунологически корректной формы RBD SARS-CoV-2, который может быть использован как платформа для создания вакцины против COVID-19.
Технический результат заявляемого изобретения достигается за счет того, что выход рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2 после хроматографической очистки составляет 50-100 мг с литра культуральной среды, что десятикратно превосходит выход белка RBD, представленный в прототипе (продукция белка RBD SARS-CoV-2 в прототипе составляет от 5 мг/л до 10 мг/л).
--->
ПРИЛОЖЕНИЕ
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр
вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)
<120> Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и
секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2
в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии СНО-K1-RBD
и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной
линии СНО-K1-RBD.
<160> 3
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 702 п.н.
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность гена RBD.
<400> 1
1 gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga atccatcgtg
6 1 cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc caccagattc
121 gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga ctactccgtg
181 ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc taccaagctg
241 aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg agatgaagtg
301 cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa gctgcccgac
361 gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa agtcggcggc
421 aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt cgagcgggac
481 atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga aggcttcaac
541 tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg ctatcagccc
601 tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt gtgcggccct
661 aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tc
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 9910 п.н.
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Нуклеотидная последовательность вектора pVEAL2-S-RBD.
<400> 2
1 caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg
61 ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcggt tccctataca
121 gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta
181 ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt
241 gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat
301 tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt
361 aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagcttca ttggcgccct
421 ccgcgcctac agctcaagcc acatccgaag ggggagggag ccgggagctg cgcgcggggc
481 cgccgggggg aggggtggca ccgcccacgc cgggcggcca cgaagggcgg ggcagcgggc
541 gcgcgcgcgg cggggggagg ggccggcgcc gcgcccgctg ggaattgggg ccctaggggg
601 agggcggagg cgccgacgac cgcggcactt accgttcgcg gcgtggcgcc cggtggtccc
661 caaggggagg gaagggggag gcggggcgag gacagtgacc ggagtctcct cagcggtggc
721 ttttctgctt ggcagcctca gcggctggcg ccaaaaccgg actccgccca cttcctcgcc
781 cgccggtgcg agggtgtgga atcctccaga cgctggggga gggggagttg ggagcttaaa
841 aactagtacc cctttgggac cactttcagc agcgaactct cctgtacacc aggggtcagt
901 tccacagacg cgggccaggg gtgggtcatt gcggcgtgaa caataatttg actagaagtt
961 gattcgggtg tttccggaag gggccgagtc aatccgccga gttggggcac ggaaaacaaa
1021 aagggaaggc tactaagatt tttctggcgg gggttatcat tggcgtaact gcagggacca
1081 cctcccgggt tgagggggct ggatctccag gctgcggatt aagcccctcc cgtcggcgtt
1141 aatttcaaac tgcgcgacgt ttctcacctg ccttcgccaa ggcaggggcc gggaccctat
1201 tccaagaggt agtaactagc aggactctag ccttccgcaa ttcattgagc gcatttacgg
1261 aagtaacgtc gggtactgtc tctggccgca agggtgggag gagtacgcat ttggcgtaag
1321 gtggggcgta gagccttccc gccattggcg gcggataggg cgtttacgcg acggcctgac
1381 gtagcggaag acgccttagt gggggggaag gttctagaaa agcggcggca gcggctctag
1441 cggcagtagc agcagcgccg ggtcccgtgc ggaggtgctc ctcgcagagt tgtttctcca
1501 gcagcggcag ttctcactac agcgccagga cgagtccggt tcgtgttcgt ccgcggagat
1561 ctctctcatc tcgctcggct gcgggaaatc gggctgaagc gactgagtcc gcgatggagg
1621 taacgggttt gaaatcaatg agttattgaa aagggcatgg cgaggccgtt ggcgcctcag
1681 tggaagtcgg ccagccgcct ccgtgggaga gaggcaggaa atcggaccaa ttcagtagca
1741 gtggggctta aggtttatga acggggtctt gagcggaggc ctgagcgtac aaacagcttc
1801 cccaccctca gcctcccggc gccatttccc ttcactgggg gtgggggatg gggagctttc
1861 acatggcgga cgctgccccg ctggggtgaa agtggggcgc ggaggcggga cttcttattc
1921 cctttctaaa gcacgctgct tcgggggcca cggcgtctcc tcggggatcc cagatcttca
1981 atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata ttggctattg
2041 gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaat
2101 atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc
2161 attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc
2221 tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt
2281 aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca
2341 cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg
2401 taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca
2461 gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacaccaa
2521 tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa
2581 tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactgcga
2641 tcgcccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc
2701 agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcact agaagcttta ttgcggtagt ttatcacagt
2761 taaattgcta acgcagtcag tgcttctgac acaacagtct cgaacttaag ctgcagtgac
2821 tctcttaagg tagccttgca gaagttggtc gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt
2881 tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcttg tcgagacaga gaagactctt
2941 gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc tctccacagg
3001 tgtccactcc cagttcaatt acagctctta aggctagagt acttaatacg actcactata
3061 ggctagcctc gagaattcgc tggctagcca tgtttgtttt tcttgtttta ttgccactag
3121 tctctagtca gtgtgtggaa aagggcatct accagaccag caacttccgg gtgcagccca
3181 ccgaatccat cgtgcggttc cccaatatca ccaatctgtg ccccttcggc gaggtgttca
3241 atgccaccag attcgcctct gtgtacgcct ggaaccggaa gcggatcagc aattgcgtgg
3301 ccgactactc cgtgctgtac aactccgcca gcttcagcac cttcaagtgc tacggcgtgt
3361 cccctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca caaacgtgta cgccgacagc ttcgtgatcc
3421 ggggagatga agtgcggcag attgcccctg gacagacagg caagatcgcc gactacaact
3481 acaagctgcc cgacgacttc accggctgtg tgattgcctg gaacagcaac aacctggact
3541 ccaaagtcgg cggcaactac aattacctgt accggctgtt ccggaagtcc aatctgaagc
3601 ccttcgagcg ggacatctcc accgagatct atcaggccgg cagcacccct tgtaacggcg
3661 tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agtcctacgg ctttcagccc acaaatggcg
3721 tgggctatca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga actgctgcat gcccctgcca
3781 cagtgtgcgg ccctaagaaa agcaccaatc tcgtgaagaa caaatgcgtg aacttccatc
3841 accaccatca tcaccatcac caccactaag cttaagttta aaccgctgat cagcctcgtc
3901 gaccgagcgg ttcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct
3961 tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg
4021 gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt
4081 cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg
4141 aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac
4201 ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg
4261 cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctcacct
4321 caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg
4381 atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg
4441 ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggccacaa
4501 ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg
4561 tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc gtcgatccgg
4621 accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg
4681 acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg
4741 agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg
4801 gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg
4861 agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc aagggtctgg
4921 gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc
4981 tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg
5041 ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct
5101 gattcgcata tgggttaatg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac
5161 aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg
5221 ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttcc acggccggcc ctccgcgcct
5281 acagctcaag ccacatccga agggggaggg agccgggagc tgcgcgcggg gccgccgggg
5341 ggaggggtgg caccgcccac gccgggcggc cacgaagggc ggggcagcgg gcgcgcgcgc
5401 ggcgggggga ggggccggcg ccgcgcccgc tgggaattgg ggccctaggg ggagggcgga
5461 ggcgccgacg accgcggcac ttaccgttcg cggcgtggcg cccggtggtc cccaagggga
5521 gggaaggggg aggcggggcg aggacagtga ccggagtctc ctcagcggtg gcttttctgc
5581 ttggcagcct cagcggctgg cgccaaaacc ggactccgcc cacttcctcg cccgccggtg
5641 cgagggtgtg gaatcctcca gacgctgggg gagggggagt tgggagctta aaaactagta
5701 cccctttggg accactttca gcagcgaact ctcctgtaca ccaggggtca gttccacaga
5761 cgcgggccag gggtgggtca ttgcggcgtg aacaataatt tgactagaag ttgattcggg
5821 tgtttccgga aggggccgag tcaatccgcc gagttggggc acggaaaaca aaaagggaag
5881 gctactaaga tttttctggc gggggttatc attggcgtaa ctgcagggac cacctcccgg
5941 gttgaggggg ctggatctcc aggctgcgga ttaagcccct cccgtcggcg ttaatttcaa
6001 actgcgcgac gtttctcacc tgccttcgcc aaggcagggg ccgggaccct attccaagag
6061 gtagtaacta gcaggactct agccttccgc aattcattga gcgcatttac ggaagtaacg
6121 tcgggtactg tctctggccg caagggtggg aggagtacgc atttggcgta aggtggggcg
6181 tagagccttc ccgccattgg cggcggatag ggcgtttacg cgacggcctg acgtagcgga
6241 agacgcctta gtggggggga aggttctaga aaagcggcgg cagcggctct agcggcagta
6301 gcagcagcgc cgggtcccgt gcggaggtgc tcctcgcaga gttgtttctc cagcagcggc
6361 agttctcact acagcgccag gacgagtccg gttcgtgttc gtccgcggag atctctctca
6421 tctcgctcgg ctgcgggaaa tcgggctgaa gcgactgagt ccgcgatgga ggtaacgggt
6481 ttgaaatcaa tgagttattg aaaagggcat ggcgaggccg ttggcgcctc agtggaagtc
6541 ggccagccgc ctccgtggga gagaggcagg aaatcggacc aattcagtag cagtggggct
6601 taaggtttat gaacggggtc ttgagcggag gcctgagcgt acaaacagct tccccaccct
6661 cagcctcccg gcgccatttc ccttcactgg gggtggggga tggggagctt tcacatggcg
6721 gacgctgccc cgctggggtg aaagtggggc gcggaggcgg gacttcttat tccctttcta
6781 aagcacgctg cttcgggggc cacggcgtct cctcggggat ctagcttgtg gaaggctact
6841 cgaaatgttt gacccaagtt aaacaattta aaggcaatgc taccaaatac taattgagtg
6901 tatgtaaact tctgacccac tgggaatgtg atgaaagaaa taaaagctga aatgaatcat
6961 tctctctact attattctga tatttcacat tcttaaaata aagtggtgat cctaactgac
7021 ctaagacagg gaatttttac taggattaaa tgtcaggaat tgtgaaaaag tgagtttaaa
7081 tgtatttggc taaggtgtat gtaaacttcc gacttcaact gtatagggtt cctctagcta
7141 gagacgacct cgggtaccca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc
7201 gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa
7261 catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac
7321 attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca
7381 ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc
7441 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc
7501 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc
7561 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag
7621 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc
7681 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt
7741 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct
7801 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg
7861 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct
7921 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat
7981 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg
8041 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa
8101 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt
8161 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc
8221 tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt
8281 atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta
8341 aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat
8401 ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac
8461 tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg
8521 ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag
8581 tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt
8641 aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt
8701 gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt
8761 tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt
8821 cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct
8881 tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt
8941 ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac
9001 cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa
9061 actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa
9121 ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca
9181 aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct
9241 ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga
9301 atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc
9361 tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac
9421 cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc
9481 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt
9541 tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg
9601 gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag
9661 tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt
9721 ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt
9781 taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc
9841 aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg
9901 ggatgtgctg
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 244 а.о.
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Аминокислотная последовательность белка RBD.
<400> 3
1 VEKGIYQTSN FRVQPTESIV RFPNITNLCP FGEVFNATRF ASVYAWNRKR ISNCVADYSV
61 LYNSASFSTF KCYGVSPTKL NDLCFTNVYA DSFVIRGDEV RQIAPGQTGK IADYNYKLPD
121 DFTGCVIAWN SNNLDSKVGG NYNYLYRLFR KSNLKPFERD ISTEIYQAGS TPCNGVEGFN
181 CYFPLQSYGF QPTNGVGYQP YRVVVLSFEL LHAPATVCGP KKSTNLVKNK CVNFHHHHHH
241 HHHH
<---
Claims (16)
1. Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию белка RBD коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, имеющий размер 9910 п.н., нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и содержащий в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1, следующие элементы:
- участок начала репликации ori (7612-8200);
- последовательности прямых и инвертированных повторов IR/DR, содержащие сайты связывания с транспозазой SB100 (139-403, 6828-7123);
- последовательности UCOE, предотвращающие хромосомное «замалчивание» рекомбинантной экспрессионной кассеты (416-1964, 5268-6816);
- CMV энхансер (2115-2494), CMV промотора (2495-2706);
- наиболее часто используемый промотор в генно-терапевтических конструкциях;
- Chimeric intron (2867-2999), химерный интрон, для усиления экспрессии целевого гена;
- лидерный пептид S-SP (3090-3134), обеспечивающий экспорт белка из клеток СНО-К1-RBD;
- кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность гена RBD (SEQ ID NO: 1) (3135-3836);
- последовательность 10хHis - полигистидиновый тэг для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии (3837-3866);
- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES (3916-4490);
- последовательность PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину (4503-5102);
- последовательность SV40 poly(A) signal для стабилизации мРНК-транскриптов за счет полиаденилирования (5137-5258);
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR (8371-9231) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (9232-9336), позволяющие проводить амплификацию плазмиды в E.coli.
2. Рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-RBD продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD по п. 1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, обеспечивающий экспрессию и секрецию белка RBD коронавируса SARS-CoV-2 и депонированный под номером 322 в коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
3. Рекомбинантный белок RBD коронавируса SARS-CoV-2, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-RBD по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021102630A RU2752858C1 (ru) | 2021-02-04 | 2021-02-04 | Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021102630A RU2752858C1 (ru) | 2021-02-04 | 2021-02-04 | Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2752858C1 true RU2752858C1 (ru) | 2021-08-11 |
Family
ID=77348983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021102630A RU2752858C1 (ru) | 2021-02-04 | 2021-02-04 | Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2752858C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114262694A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-01 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用 |
| RU2772905C1 (ru) * | 2021-12-13 | 2022-05-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") | Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDomik, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.1.529 в клетках млекопитающих. |
| CN114957410A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 华兰基因工程有限公司 | 一种κ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2378015C2 (ru) * | 2008-04-02 | 2010-01-10 | Равшан Иноятович Атауллаханов | Конъюгат для иммунизации и вакцинации и способ повышения иммуногенности |
| RU2689671C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2019-05-28 | Хипра Сьентифик, С.Л.У. | Мутантные штаммы mycoplasma hyopneumoniae |
| CN111458504A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-07-28 | 中科欧蒙未一(北京)医学技术有限公司 | 用于检测样品中抗新型冠状病毒SARS-COV-2的IgG抗体的试剂盒 |
| CN111533790A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-14 | 中山大学 | 基于马赛克策略的冠状病毒抗原的构建方法及其应用 |
| CN111647053A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-09-11 | 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 | 多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用 |
| CN111848753A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 新型冠状病毒抗原表位及其应用 |
| RU2738081C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов |
-
2021
- 2021-02-04 RU RU2021102630A patent/RU2752858C1/ru active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2378015C2 (ru) * | 2008-04-02 | 2010-01-10 | Равшан Иноятович Атауллаханов | Конъюгат для иммунизации и вакцинации и способ повышения иммуногенности |
| RU2689671C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2019-05-28 | Хипра Сьентифик, С.Л.У. | Мутантные штаммы mycoplasma hyopneumoniae |
| CN111458504A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-07-28 | 中科欧蒙未一(北京)医学技术有限公司 | 用于检测样品中抗新型冠状病毒SARS-COV-2的IgG抗体的试剂盒 |
| CN111647053A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-09-11 | 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 | 多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用 |
| CN111533790A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-14 | 中山大学 | 基于马赛克策略的冠状病毒抗原的构建方法及其应用 |
| CN111848753A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 新型冠状病毒抗原表位及其应用 |
| RU2738081C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114262694A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-01 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用 |
| CN114262694B (zh) * | 2021-12-06 | 2023-11-03 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 以B型流感病毒为载体的SARS-CoV-2疫苗候选株及其构建方法和应用 |
| RU2772905C1 (ru) * | 2021-12-13 | 2022-05-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") | Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDomik, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.1.529 в клетках млекопитающих. |
| RU2772904C1 (ru) * | 2021-12-13 | 2022-05-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") | Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDdelta, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 в клетках млекопитающих |
| RU2784655C1 (ru) * | 2021-12-31 | 2022-11-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ К SARS-CoV-2 В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ ЛЮДЕЙ, ПЕРЕНЕСШИХ COVID-19 ИЛИ ПРИВИТЫХ ВАКЦИНАМИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ COVID-19, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА, СОДЕРЖАЩЕГО РЕКОМБИНАНТНЫЙ РЕЦЕПТОР-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН (RBD) ПОВЕРХНОСТНОГО ГЛИКОПРОТЕИНА S КОРОНАВИРУСА SARS-COV-2 И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ РЕЦЕПТОР АСЕ2 |
| CN114957410A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 华兰基因工程有限公司 | 一种κ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 |
| RU2801532C1 (ru) * | 2022-10-11 | 2023-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Плазмидная генетическая конструкция pVEAL2-9E2ch-scFv, штамм рекомбинантной клеточной линии CHO-K1-9E2ch и химерное одноцепочечное антитело 9E2ch против вируса Западного Нила, продуцируемое указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-9E2ch, обладающее высоким сродством к неонатальному рецептору FcRn |
| RU2816175C1 (ru) * | 2023-07-28 | 2024-03-26 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Интегративный плазмидный вектор pVEAL3-RBDdel, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного белка рецепторсвязывающего домена RBDdelta коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1- RBDdelta и рекомбинантный белок RBDdelta SARS-CoV-2, продуцируемый штаммом клеточной линии |
| RU2817380C1 (ru) * | 2023-10-30 | 2024-04-15 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Интегральный плазмидный вектор pVEAL2-B7, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы (ВНО) в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии СНО-К1-В7 и рекомбинантный белок В7 ВНО, продуцируемый штаммом клеточной линии СНО-К1-В7 и используемый для получения иммунобиологических препаратов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2752858C1 (ru) | Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD | |
| CN111171132B (zh) | 乌鳢抗菌肽 | |
| KR20230028482A (ko) | SARS-CoV-2에 대한 항체, 그 항체를 사용하여 SARS-CoV-2를 검출하는 방법 및 그 항체를 포함하는 키트 | |
| CN113355296A (zh) | 一种表达人ccl19的重组溶瘤新城疫病毒及其应用 | |
| CN105176936B (zh) | 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用 | |
| KR102584136B1 (ko) | 조직 재생용 조성물 | |
| CN110734480B (zh) | 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用 | |
| CN114874332B (zh) | 经修饰的rnf112作为治疗als药物的应用 | |
| CN110050065B (zh) | 用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离(epic) | |
| KR101578444B1 (ko) | 구제역 a형 한국분리주를 이용한 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 | |
| CN113355288B (zh) | 一种治疗covid-19的通用型嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用 | |
| KR20200132958A (ko) | 불활성화된 ul18 및/또는 ul8을 갖는 신규한 ehv | |
| CN106520837A (zh) | 一种重组载体及其应用 | |
| AU609183B2 (en) | Antimalaria vaccines | |
| CN107058390A (zh) | 一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用 | |
| CN111826397A (zh) | 生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液 | |
| CN104673832B (zh) | 一种组装tale/talen模块的方法 | |
| CN101745107A (zh) | 一种重组复制缺陷型腺病毒载体h5n1亚型流感基因工程疫苗 | |
| CN114773448B (zh) | 重组κ-酪蛋白及其制备方法和人造乳 | |
| CN114773449B (zh) | 一种β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用 | |
| CN114317605B (zh) | 一种小胶质细胞钾离子探针转基因小鼠模型的构建方法 | |
| CN113373163B (zh) | 一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用 | |
| CN101717787A (zh) | 肝组织特异性表达rtTA的载体及其应用 | |
| US20240042009A1 (en) | Yeast-based expression of therapeutic proteins in vivo | |
| CN111518833B (zh) | 一种携带aim2基因的溶瘤腺病毒的构建方法及应用 |