TWI795373B - 用於生物製劑生產之細胞早期轉染後分離（ｅｐｉｃ） - Google Patents
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Abstract
本文提供了用於選擇表現靶多肽的細胞群體的方法。在一些方面，本公開提供了基於轉染的宿主細胞的群體的可選擇多肽的早期表現來分選和選擇的方法。在某些實施方式中，所述分選基於所述可選擇多肽使用螢光激活細胞分選或磁激活細胞分選進行。這樣的選擇方法可進一步用來產生生產者細胞的選殖群體，例如，用於大規模製造感興趣的靶多肽。
Description
本申請案係請求於2016年10月7日申請的美國臨時專利申請No.62/405,392的權益，其全部內容以參考方式併入本文。
本申請含有序列表，其已經以ASCII形式電子提交，並且在此以參考方式將其全部併入。將創建於2017年10月5日的這種ASCII複本命名為593805_SA9_179CTW_ST25.txt，大小為15,363位元組。
用於選擇生產者細胞群體和細胞選殖體的方法對製造生物製劑如抗體和融合蛋白是必要的。這樣的方法一般依賴於選擇劑如甲氨蝶呤(MTX)或甲硫胺酸碸亞胺(MSX)的使用，以傾向和擴增生物製劑的產生。基於選擇劑的方法可能影響選擇的群體的生存能力和生長速率，或可能對選殖穩定性具有負面影響。這樣的基於藥物的選擇也可能是耗費時間的，經常需要多輪選擇，以獲得含有適合於生物製劑製造的選殖體的群體。仍然需要快速且可靠的產生產生高效價的生物製劑而對宿主細胞的負面影響較小的大細胞群體和選殖體的方法。
在一些方面，本公開提供了選擇表現靶多肽的細胞群體的方法。如 本文所述，依賴於在群體轉染後不久對其進行分選，開發了用於選擇的方法。因此，該方法的特徵在於針對轉染載體的早期可檢測表現分離轉染的細胞的亞群的步驟。在某些實施方式中，選擇是基於可選擇多肽的早期表現，所述可選擇多肽不同於靶多肽，而且是在細胞表面上可檢測的。
意想不到地，發現本文所述的方法比使用兩輪MTX選擇來產生一池(pool)的傳統方法更快，並且比包括單輪MTX選擇的傳統MTX擴增生產力更高。
本文所述的方法對例如產生用於篩選感興趣的多肽的細胞池(如在早期臨床開發中)和產生高效價選殖體是有用的，其可用來產生用於小規模和大規模製造的感興趣的多肽。
因此，在一些方面，本公開提供了產生表現靶多肽的生產者細胞的群體的方法，所述方法包括：(a)使用編碼一個或多個mRNA的一個或多個載體轉染宿主細胞，其中，所述一個或多個mRNA編碼可選擇多肽和所述靶多肽；(b)在轉染後的2-15天內，從轉染的宿主細胞中分離表現所述可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞的亞群；和(c)擴大早期表現轉染的宿主細胞的亞群，由此產生生產者細胞的群體。
在一些實施方式中，所述步驟(b)在無藥物選擇培養基中進行。
在一些實施方式中，所述步驟(c)在無藥物選擇培養基中進行。
在一些實施方式中，所述步驟(b)和(c)各自在無藥物選擇培養基中進行。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述方法進一步包括從擴大的亞群中分離靶多肽。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述方法進一步包括從擴大的亞群中分離一個或多個單一轉染的宿主細胞，和培養所述一個或多個單 一轉染的宿主細胞以產生一個或多個單一轉染的宿主細胞的選殖群體。
在提供的任一方法的一些實施方式中，與在步驟(c)中獲得的轉染但未選殖的宿主細胞的穩定池相比，所述一個或多個單一轉染的宿主細胞的選殖群體的至少一個在產生靶多肽方面產生2-30倍改善。
在提供的任一方法的一些實施方式中，在步驟(b)中經過選擇的轉染的宿主細胞含有至少80-120 x 106個細胞。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述步驟(b)中的分離在轉染後少於6天進行。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述步驟(b)中的分離在轉染後2-4天進行。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述步驟(b)中的分離在轉染後2天進行。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述步驟(b)中的分離在轉染後3天進行。
在提供的任一方法的一些實施方式中，在步驟(c)中的擴大之前，所述轉染的宿主細胞的亞群含有0.5-6.0 x 106個細胞。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述步驟(c)的擴大持續4-31天。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述一個或多個載體的第一個係編碼編碼所述靶多肽的mRNA，所述一個或多個載體的第二個係編碼編碼所述可選擇多肽的mRNA。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述編碼所述靶多肽的mRNA和所述編碼所述可選擇多肽的mRNA兩者均在一個載體上編碼。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述一個或多個載體的第一個編碼編碼所述靶多肽的mRNA，所述一個或多個載體的第二個編碼編碼所述可選擇多肽的mRNA。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述編碼所述靶多肽的mRNA 和所述編碼所述可選擇多肽的mRNA兩者均在一個載體上編碼。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述步驟(b)中的分離採用磁激活細胞分選(MACS)、螢光激活細胞分選(FACS)或ClonePix。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述可選擇多肽是FACS可選擇多肽，而且所述步驟(b)中的分離採用FACS。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述靶多肽和所述可選擇多肽形成融合多肽。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述mRNA是多順反子(multicistronic)mRNA。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述多順反子mRNA包含編碼所述可選擇多肽的第一開放讀碼框(ORF)，和編碼所述靶多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位於第二ORF的5’。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述第一ORF具有非AUG起始密碼子。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述第二ORF具有AUG起始密碼子。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述非AUG起始密碼子是Kozak共有序列(Kozak consensus sequence)中的UUG、GUG或CUG。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述編碼可選擇多肽的ORF沒有任何AUG序列。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述可選擇多肽是CD52或CD59。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述靶多肽是治療劑。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述靶多肽是分泌蛋白。在提供的任一方法的一些實施方式中，所述靶多肽是抗體或Fc融合蛋白。
在提供的任一方法的一些實施方式中，所述宿主細胞是CHO細胞、HEK293細胞或HeLa細胞。
本公開的其他方面涉及可以藉由上述或本文另外描述的任一方法獲 得的轉染的宿主細胞的選殖群體，其表現可選擇多肽和靶多肽。
第1A圖是傳統轉染和選擇與基於EPIC的轉染和選擇之間的示意性描繪。早期表現指在重要的基因組整合之前，轉染後早期的表現。
第1B圖是顯示在核苷酸缺乏選擇過程中細胞從第3天至第21天的轉染的群體的報告基因表現的示意圖(與模擬轉染群體相比)。轉染的細胞在轉染後不久表現出明顯的早期表現(例如，第3-4天)，然後在完成選擇時轉變到穩定的表現(第18-21天)。
第2圖是一系列的FACS直方圖偏移，其描繪來自相同載體(pGZ729-RFP)的紅色螢光蛋白(RFP)和細胞表面報告基因CD52表現的早期表現。沒有選擇壓力被施加到轉染的細胞。RFP和CD52的峰值早期表現出現在第2天和第3天之間。
第3圖是一系列的FACS直方圖偏移，其描繪在轉染有pGZ729-RFP(編碼可選擇多肽CD52和靶多肽RFP)或pGZ700-RFP(僅編碼靶多肽RFP)的細胞中RFP和CD52的第3天早期表現。
第4圖是顯示EPIC在轉染後不久產生用於選擇的細胞亞群的方法的示意圖，和分離/擴大分選富集群體時的報告基因表現和單株抗體(mAb)效價的有益影響。模擬係指模擬轉染。
第5圖是描繪與傳統MTX方法相比用於產生EPIC的池的第14天未補料分批效價的圖。還顯示了藉由快速批量過程產生的池(RB#1和RB#2)。
第6圖是描繪來自產生EPIC的選殖體的第14天未分批補料效價的圖，所述選殖體實現了範圍1.5-2.0g/L的最高表現。最左邊的條(0.5g/L)表示選殖體之前EPIC分選的池的效價。所有其他垂直條表示單個選殖體的效價。
第7圖是一系列的直方圖偏移，其描繪了EPIC靶向產生轉染有 pGZ729-RFP的穩定池的比較益處。EPIC用於靶向第2天的早期RFP表現，這與傳統轉染/選擇方法(0nM MTX)相比，產生具有改善的RFP(和CD52報告基因表現)的穩定池。
第8圖是顯示用於產生池以支持選殖體有限稀釋(CLD)過程的3種不同方法的示意圖。所有方法使用相似的“彙集(pooled)”回收轉染細胞以開始過程。與傳統MTX選擇過程相比，均為MTX非依賴性過程的EPIC和快速批量還具有減少的時間表。對於三種重組蛋白(mAb #1、mAb #2、FcFusion #1)的每一種完成整個方案。
第9圖是使用從第8圖所示的各過程(EPIC、快速批量和MTX)產生的池顯示來自三種不同分子的選殖體生產力的圖。該圖示例了MTX非依賴性過程(EPIC和快速批量)獲得了與從MTX選擇過程產生的選殖體相似高生產力的選殖體。
第10圖是顯示表示各過程(EPIC、快速批量和MTX)的三種不同分子的DNA到池和池到選殖體的每個過程的時間表的圖。EPIC池產生可比產生MTX的池更快(1個月)獲得，這意味著產生選殖體的整個時間表顯著縮短。
第11A圖是FACS直方圖疊加，其顯示分離瞬時陽性群體的可變分選目標以產生EPIC池(與未分選的對照相比較)。第11B圖是顯示與每個EPIC分選目標相關的生產力的圖，並且清楚地表明越高的瞬時靶向產生越大的生產力。數據支持EPIC池富集僅僅是分離瞬時陽性群體的結果的主張。PoP=原理的證據。
在描述本發明前，被理解的是本發明不局限於本文所公開的特定方法和實驗條件；因為這樣的方法和條件可能變化。還被理解的是本文所使用的術語僅用於描述具體的實施方式的目的，並不意圖是限制性的，因為 本發明的範圍將僅由所附請求項來限制。
此外，除非另有說明，否則本發明的實踐採用本領域技術中的常規分子和細胞生物學以及免疫學技術。這樣的技術是技術人員公知，並且在文獻中充分地解釋。見，例如，Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008),including all supplements；M.R.Green and J.Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2012)；和Harlow et al.,Antibodies：A Laboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(2013,2nd edition)。
I.定義
除非本文另有定義，否則本文所使用的科學和技術術語具有由本領域普通技術人員通常理解的含義。在任何潛在歧義的情況下，本文所提供的定義優先於任何字典或外在定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數形式，並且複數術語應包括單數形式。除非另有說明，否則“或”的使用意指“和/或”。術語“包括”以及其他形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用沒有限制。
通常，與本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質和核酸化學和雜交相關使用的命名是本領域中公知的和通常使用的那些。除非另有說明，否則本文所提供的方法和技術一般根據本領域公知的常規方法進行，並如貫穿本說明書引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中所述。酶促反應和純化技術根據製造商的說明書進行，如本領域中通常完成的或如本文所述的。與本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和製藥化學相關使用的術語以及試驗程序和技 術是本領域中公知的和通常使用的那些。標準技術用於化學合成，化學分析，藥物製備、配製和遞送，以及患者的治療。
公開內容可以更容易地理解，選擇術語在下面定義。
如本文所使用的，術語“多核苷酸”意圖指任何長度的核苷酸的多聚形式，其實例包括，但不限於，基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、互補DNA(cDNA)、重組多核苷酸、分枝多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。
如本文所使用的，術語“多肽”指任何長度的核酸的多聚形式，其實例包括，但不限於，蛋白質、蛋白質片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗體(包括其片段)和肽。
如本文所使用的，“可選擇多肽”是可藉由任何適合的方法直接或間接檢測的多肽，所述方法包括例如而不限於，螢光激活細胞分選(FACS)、磁激活細胞分選(MACS)、ClonePix和親和色譜法。在某些實施方式中，可選擇多肽在細胞表面表現，即，是細胞表面多肽。可選擇多肽的實例包括包含胞外結構域(例如CD52或CD59)的多肽，所述胞外結構域能夠與或被可檢測的結合配偶體(binding partner)(例如，螢光標記的抗體)結合。可選擇多肽的其他實例包括螢光蛋白，如綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、藍色螢光蛋白(BFP)及它們的變體，所述變體包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等。在某些實施方式中，可選擇多肽可以藉由流式細胞術直接或間接地方便地檢測。
如本文所使用的，“螢光激活細胞分選”或“FACS”指基於由細胞表現的一個或多個FACS可選擇多肽(FACS-selectable polypeptides)的存在、不存 在或水平，將細胞的群體分離成一個或多個亞群的方法。FACS依賴於單個細胞的光學特性，其包括螢光性，以將細胞分選為亞群。適合於進行本文所述的方法的FACS細胞分選儀是本領域公知的和可商購的。示例性的FACS細胞分選儀包括BD InfluxTM(BD Biosciences)和由其他商業供應商如Sony、Bio-Rad和Beckman Coulter生產的其他等同的細胞分選儀。
如本文所使用的，“FACS可選擇多肽”是可以藉由流式細胞術直接或間接檢測的多肽。FACS可選擇多肽的實例包括包含胞外結構域(例如，CD52或CD59)的多肽，所述胞外結構域能夠與可檢測的結合配偶體(例如螢光標記的抗體)結合以藉由流式細胞術間接檢測多肽。FACS可選擇多肽的其他實例包括螢光蛋白，如綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、藍色螢光蛋白(BFP)及它們的變體，所述變體包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等，其可以藉由流式細胞術直接檢測。
如本文所使用的，磁激活細胞分選或“MACS”指基於由細胞表現的一個或多個MACS可選擇多肽(MACS-selectable polypeptides)的存在、不存在或水平，將細胞的群體分離成一個或多個亞群的方法。MACS依賴於標簽的單個細胞的磁化率特性，以將細胞分離成亞群。適合於進行本文所述的方法的MACS細胞分選是本領域中公知的和可商購的。示例性的MACS細胞分選包括MACSQuant®流式細胞儀(Miltenyi Biotec)。
如本文所使用的，“MACS可選擇多肽”是可以藉由磁激活細胞分選直接或間接檢測的多肽。MACS可選擇多肽的實例包括包含能夠與磁敏感結合配偶體(例如，與抗體偶聯的鐵、鎳或鈷標記的珠子)結合以直接或間接檢測多肽的胞外結構域(例如，CD52或CD59)的多肽。在某些實施方式中，可選擇多肽可以藉由流式細胞術直接或間接地方便地檢測。
如本文所使用的，“ClonePix”指基於由細胞表現的一個或多個可選擇 多肽的存在、不存在或水平，將細胞的群體分離成一個或多個亞群的方法和裝置。ClonePix依賴於單個細胞或細胞選殖體的光學特性，其包括白光和螢光檢測，以將細胞分選成亞群。ClonePix在Richmond等人的每個美國專利號7,776,584；8,034,612；8,034,625；8,293,520；8,293,525；8,293,526和8,293,527中描述，並且可從Molecular Devices(Sunnyvale,CA)商購。
如本文所使用的，“靶多肽”指可在宿主細胞中產生的蛋白質、蛋白質片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗體(包括其片段)或肽，而且在本文示例的方面，靶多肽由於其作為治療劑例如抗體(包括其片段)、Fc融合蛋白、激素或酶的潛力而被選擇。在一些實施方式中，靶多肽是分泌蛋白。然而，本文所述的方法不限於治療性多肽的選擇和放大(scale up)。例如，還考慮診斷多肽或用於環境的多肽以在本文所公開的方法中用作治療多肽。
在某些實施方式中，可選擇多肽是細胞表面多肽，並且靶多肽是分泌多肽。
如本文所使用的，術語“抗體”指對感興趣的抗原具有顯著已知特異性免疫反應活性的這樣的裝配(例如，完整抗體分子、抗體片段或它們的變體)。抗體和免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈，在它們之間具有或沒有鏈間共價鍵。脊椎動物系統的基礎免疫球蛋白結構相對而言得到了充分的理解。
如本文所使用的，術語“抗體”包括全長抗體和抗原結合片段以及這樣的抗體的變體。抗體可以是任何類型，如IgG、IgA或IgM；和任何亞類，如IgG1或IgG4。抗體可以是多株抗體或單株抗體，或其可以是多株抗體或單株抗體的片段。抗體可以是嵌合的、人源化的、全長人的、雙特異性的或雙功能的。還考慮是抗體的任何抗原結合片段或變體，如Fab、Fab'、F(ab')2、它們的單鏈可變區(scFv)和它們的變體。
如本文所使用的，“Fc融合蛋白”指包含與多肽如蛋白質或肽直接或間 接連接的免疫球蛋白Fc結構域的蛋白。連接的多肽可以是任何感興趣的蛋白質分子，如配體、受體或抗原性肽。
如本文所使用的，術語“生產者細胞”指表現感興趣的多肽的細胞。在某些實施方式中，生產者細胞是表現如本文所公開的靶多肽的細胞。在某些實施方式中，生產者細胞是表現如本文所公開的可選擇多肽和靶多肽的細胞。
在某些實施方式中，術語“生產者細胞”指適合於在用於產生生物製劑的小規模或大規模製造方法中產生蛋白質的細胞。在一些實施方式中，生產者細胞是哺乳動物或昆蟲細胞。本文進一步討論生產者細胞。
如本文所使用的，“生產者細胞的群體”是表現增強的一個或多個多肽，(例如由相同多順反子mRNA編碼的FACS可選擇多肽和靶多肽)的水平的細胞的群體。在某些實施方式中，“生產者細胞的群體”是表現增強的靶多肽水平的細胞群體。在一些實施方式中，增強的水平是未選擇的群體中的一個或多個多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。在一些實施方式中，增強的水平在如藉由流式細胞術(例如在BD InfluxTM細胞分選儀上)檢測的未選擇的群體中的FACS可選擇多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。在一些實施方式中，增強的水平是如藉由流式細胞術(例如在MACSQuant®流式細胞儀(Miltenyi Biotec)上)檢測的未選擇的群體中的MACS可選擇多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。本文中描述用於產生生產者細胞的群體的方法。
如本文所使用的，“生產者細胞的群體”是表現可檢測的一個或多個多肽(例如由相同多順反子mRNA編碼的FACS可選擇多肽和靶多肽)的水平的細胞的群體。本文描述用於產生生產者細胞群體的方法。
如本文所使用的，“多順反子mRNA”是含有至少兩個能夠編碼兩個或多個多肽的開放讀碼框(ORF)的mRNA。
如本文所使用的，“無藥物選擇培養基”是沒有藥物(例如甲氨蝶呤(MTX))的培養基，其用來選擇表現賦予群體或亞群抗藥性(例如二氫葉酸還原酶)的蛋白質的細胞的群體或亞群。
如本文所使用的，“基於培養基的選擇”是由此將培養基改為包括選擇劑(例如MTX)或不包括培養基的成分的培養基的選擇過程，這引起對亞群的選擇，所述亞群對選擇劑有抗性或在不存在排除的培養基成分的情況下能夠存活。
如本文所使用的，“核苷酸缺陷型/缺乏培養基”是沒有或含有低水平(例如小於10mg/mL)的具有一個或多個核苷鹼基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、次黃嘌呤或胸苷)的核苷酸。在一些實施方式中，核苷酸缺陷型培養基是沒有次黃嘌呤或胸苷的培養基。示例性的核苷酸缺陷型培養基包括CD CHO培養基(Gibco,Life Technologies，目錄編號10743(液體)和12490(顆粒)).
如本文所使用的，“生存能力標記”是表示細胞生存能力的細胞特徵，並且可藉由FACS檢測。示例性的生存能力標記包括前向散射、側向散射、碘化丙錠染色或它們的組合。
如本文所使用的，術語“非AUG起始密碼子”意圖包括任何非AUG多核苷酸(一般是三聯體)，其作為轉譯起始的起始位點起作用，相對於AUG起始密碼子的效率降低。天然存在的可替換的起始密碼子用法是本領域已知的，並且例如在Kozak(1991)J.Cell Biol.115(4)：887-903；Mehdi et al.(1990)Gene 91：173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11)：5073-5080中描述。一般地，與AUG的轉譯效率相比，非AUG起始密碼子的轉譯效率降 低；例如，與AUG的轉譯效率(100%)相比，可替換的起始密碼子GUG可具有3-5%轉譯效率。非AUG起始密碼子的轉譯效率還可以被其序列背景影響；例如，報告最佳的Kozak共有序列以對在非AUG起始密碼子處的轉譯起始有積極的作用(Mehdi et al.(1990)Gene 91：173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11)：5073-5080)。完整的Kozak DNA共有序列是GCCRCCATGG(SEQ ID NO：1)，其中起始密碼子ATG(在RNA中是AUG)是粗體字，命名ATG起始密碼子的A為+1位，並且在-3位的“R”是嘌呤(A或G)。兩個最高保守位是嘌呤，優選地，A在-3，並且G在+4(Kozak(1991)J Cell Biol 115(4)：887-903)。在美國專利公開案2006/0172382和美國專利公開案2006/0141577中描述用於可選標記的減弱表現的可替換的起始密碼子用法，其全部內容以參考方式併入本文。本領域技術人員會認識到本文所述的序列作為DNA會具有作為RNA分子的相關序列，例如，DNA序列ATG會對應於RNA序列AUG，反之亦然。
如本文所使用的，術語“快速批量分選(rapid bulk sorting)”和“快速批量”是指螢光激活細胞分選(FACS)成批選擇表現靶多肽的生產者細胞的方法。方法包括以下步驟：(a)提供生產者細胞的異質群體，其中群體中的生產者細胞表現由相同多順反子mRNA編碼的FACS可選擇多肽和靶多肽的不同水平；(b)使用FACS從生產者細胞的異質群體中選擇生產者細胞的第一異質亞群，其中第一異質亞群中的生產者細胞以高於(a)中異質群體中的至少80%的生產者細胞的水平表現FACS可選擇多肽；和(c)在無藥物選擇培養基中擴大生產者細胞的第一異質亞群，由此產生生產者細胞的擴大的第一異質亞群。
快速批量法可進一步包括以下步驟：(d)使用FACS從步驟(c)中的生產者細胞的擴大的第一異質亞群選擇生產者細胞的第二異質亞群，其中第二 亞群中的生產者細胞以高於步驟(c)中生產者細胞的擴大的第一異質亞群中的至少80%的生產者細胞的水平表現FACS可選擇多肽；和(e)在無藥物選擇培養基中擴大生產者細胞的第二異質亞群，由此產生生產者細胞的擴大的第二異質亞群。
如本文所使用的，術語“EPIC”指如在本文中更詳細描述的細胞的早期轉染後分離。
如本文所使用的，術語“FLARE”指“流式細胞術減弱的報告基因表現(Flow cytometry Attenuated Reporter Expression)”。FLARE是利用多順反子mRNA的表現系統，其含有至少兩個開放讀碼框(ORF)，含有非AUG起始密碼子並編碼FACS可選擇多肽的上游ORF，和含有AUG起始密碼子並編碼靶多肽的下游ORF。見美國專利申請公開案No.2009/0239235，其以參考方式整體併入。
如本文所使用的，術語“大約”應指在規定值附近的10%的容差範圍。因此，當術語“大約”用來修飾規定值時，表示的範圍會涵蓋±0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的規定值中的任何數字。
II.用於生產者細胞的早期選擇的方法
在一些方面，本公開涉及產生表現靶多肽的生產者細胞的群體，在一些實施方式中，所述方法包括：(a)使用編碼一個或多個mRNA的一個或多個載體轉染宿主細胞，其中，所述一個或多個mRNA編碼可選擇多肽和所述靶多肽；(b)在轉染的2-15天內，從轉染的宿主細胞中分離表現所述可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞的亞群；和(c)擴大轉染的宿主細胞的亞群，由此產生表現所述靶多肽的生產者 細胞的群體。
早期表現轉染的細胞可包含不同類型的外源DNA，其一部分尚未整合到細胞的基因組DNA中，並且其一部分已經整合到細胞的基因組DNA中。這兩種類型的DNA均具有導致多肽或它們編碼的多肽的表現的潛力。
宿主細胞使用編碼一個或多個mRNA的一個或多個載體轉染，其中，一個或多個mRNA編碼可選多肽和靶多肽。可以使用適合於從多順反子mRNA產生靶多肽的任何細胞類型產生生產者細胞。在一些實施方式中，宿主細胞是真核細胞。適合的真核細胞產生靶多肽的實例包括，但不限於，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其包括命名為CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1的那些，和倉鼠細胞系BHK-21；命名為NIH3T3的鼠細胞系、NS0、C127、類人猿細胞系COS、Vero；和人細胞系HeLa、HEK293(也稱為293)、NIH-3T3、U-937和Hep G2。適合的宿主細胞的另外的實例包括酵母細胞、昆蟲細胞(例如，施耐德果蠅(Drosophila Schneider)S2細胞、Sf9昆蟲細胞(WO 94/26087)、BTI-TN-5B1-4(High FiveTM)昆蟲細胞(Invitrogen))、植物細胞、鳥細胞和牛細胞。用於表現酵母的實例包括，但不限於釀酒酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、擬酵母屬(Torulopsis)、耶氏酵母屬(Yarrowia)和畢赤酵母屬(Pichia)。見例如，美國專利Nos.4,812,405；4,818,700；4,929,555；5,736,383；5,955,349；5,888,768和6,258,559。生產者細胞的其他實例可以是原核的，其包括細菌細胞，如大腸桿菌(E.coli)(例如菌株DH566TM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、PerC6(Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和/或其他適合的細菌。細胞可以從商業供應商如美國典型培養物保藏中心(ATCC,Rockville,MD)購買，或使用本領域已知的方法從分離株培養。
為製造生產者細胞，可以使用任何適合的轉移技術(例如，藉由轉染、轉化、電穿孔或轉導)將重組或外源多核苷酸插入到宿主細胞中。編碼一個或多個mRNA的載體包括DNA載體。可以使用的載體包括質粒、病毒、噬菌體、轉位子和微型染色體，其中質粒是一般的實施方式。一般地，這樣的載體進一步包括可操作地連接到編碼多順反子mRNA的基因的信號序列、複製起點、一個或多個標記基因、啟動子和轉錄終止序列，以促進表現。適合的DNA病毒載體的實例包括腺病毒(Ad)和腺相關病毒(AAV)。用於遞送多核苷酸的基於腺病毒的載體是本領域已知的，並且可商業獲得或藉由標準分子生物學方法構建。腺病毒(Ad)是一組病毒，其包括超過50個血清型。見，例如，國際專利申請案No.WO 95/27071。用於本公開的其他病毒載體包括源於牛痘、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒(HSV))和逆轉錄病毒的載體。基因遞送載體還包括一些非病毒載體，其包括DNA/脂質體複合物，和靶向的病毒蛋白-DNA複合物。
為了用於轉染，在某些實施方式中，環狀載體可例如藉由在一個或多個限制性核酸內切酶位點處的限制酶切預線性化，即在引入到宿主細胞前線性化。認為線性化對整合到基因組中是必要的，並且可藉由預線性化或藉由天然存在於宿主細胞內的核酸內切酶以隨機方式使其發生。預線性化具有將一定程度的控制引入到限制酶切的位點的潛在優勢。因此，在某些實施方式中，可以將環狀載體(其包括超螺旋的環狀載體)引入到宿主細胞中。在根據本發明的某些實施方式中，一個或多個載體在轉染時是線性的。
含有啟動子和可操作地連接多核苷酸到選殖位點中的載體是本領域中已知的，並且可從商業供應商獲得。這樣的載體能夠體外或體內轉錄RNA，並且可從如安捷倫科技(Agilent Technologies)和普洛麥格公司 (Promega Corporation)的來源商購。為了最佳化表現和/或體外轉錄，可能需要在轉錄或轉譯水平去除、添加或改變5'和/或3'非轉譯的部分以去除額外的、可能不適合的可替換的轉譯起始密碼子或可干擾或減少表現的其他序列。或者，可以在起始密碼子的5'緊接著插入共有核糖體結合位點以增強表現。
可提供啟動子用於在生產者細胞中表現。啟動子可是組成性的或可誘導的。例如，啟動子可可操作地連接到編碼多順反子mRNA的核苷酸，以便其指導編碼的多肽的表現。原核和真核宿主的多種適合的啟動子是可獲得的。原核啟動子包括大腸桿菌的lac、tac、T3、T7啟動子；3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡糖激酶。真核啟動子包括可誘導的酵母啟動子，如醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和負責氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用的酶；RNA聚合酶II啟動子，其包括病毒啟動子，如多瘤病毒啟動子、雞痘病毒和腺病毒(例如，腺病毒2)啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子、禽肉瘤病毒啟動子、巨細胞病毒啟動子(CMV，特別地，即早基因啟動子)、反轉錄病毒啟動子、乙型肝炎病毒啟動子、肌動蛋白啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，以及早期或晚期猿猴病毒40(SV40)啟動子和非病毒啟動子，如EF-1α(Mizushima and Nagata(1990)Nucleic Acids Res.18(17)：5322)。本領域的技術人員能夠選擇適當的啟動子用於在給定的宿主中表現任何給定的多肽。
在適當的情況下，例如為了在高等真核生物的細胞中表現，可包括另外的增強子元件來代替被發現位於上述啟動子中的那些增強子元件，或可包括額外的增強子元件以及被發現位於上述啟動子中的那些增強子元 件。適合的哺乳動物增強子序列包括來自球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金屬硫蛋白和胰島素的增強子元件。或者，可使用來自真核細胞病毒如SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子、杆狀病毒增強子或鼠IgG2a座位的增強子元件(見，WO 2004/009823)。雖然這樣的增強子經常在載體上位於在啟動子上游的位點，它們還可以位於別處，例如，在多腺苷酸化信號的非轉譯區或下游中。增強子的選擇和位置可基於與用於表現的宿主細胞的相容性。
另外，載體(例如表現載體)可包含用於選擇攜帶載體的宿主細胞的可選標記，並在可複製的載體的情況下，可包含複製的起始點。編碼賦予抗生素抗性或藥物抗性的產物的基因是一般可選標記，而且可用於原核細胞(例如f3-內醯胺酶基因(氨苄西林抗性)、tet基因(四環素抗藥性))和真核細胞(例如新黴素(G418或遺傳黴素)、gpt(黴酚酸)、氨苄西林或潮黴素B抗性基因)。二氫葉酸還原酶(DHFR)基因允許在多種宿主中選擇氨甲蝶呤或核苷酸缺乏的培養基。相似地，穀氨醯胺合成酶(GS)基因允許選擇甲硫胺酸碸亞胺。編碼宿主(例如，LEU2、URA3、HIS3)的營養缺陷型標記的基因產物的基因經常在酵母中用作可選標記。還考慮病毒(例如杆狀病毒)或噬菌體載體和能夠整合到宿主細胞的基因組中的載體(如逆轉錄病毒載體)的使用。
在真核系統中，多腺苷酸化和終止信號可可操作地連接到編碼本文所述的多順反子mRNA的多核苷酸。這樣的信號一般置於一個開放讀碼框的3'。在哺乳動物系統中，多腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括源自生長激素類、延長因子-1α和病毒(例如SV40)基因或逆轉錄病毒長末端重複序列的那些。在酵母系統中，多腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括源自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)基因和醇脫氫酶1(ADH)基因的那些。在原核系 統中，一般不需要多腺苷酸化信號，而是通常採用更短和更多定義的終止子序列。多腺苷酸化/終止序列的選擇可基於與用於表現的宿主細胞的相容性。除上述以外，可用於增強產率的其他特徵包括染色質重塑元件、內含子和宿主細胞特異性密碼子修飾。
本公開的生產者細胞含有重組多核苷酸(例如重組cDNA)，其編碼多順反子mRNA分子，其中靶多肽和可選擇多肽分別從不同ORF轉譯。在一些實施方式中，可選擇多肽是細胞表面多肽。在某些實施方式中，本公開的生產者細胞含有多種重組多核苷酸，其各自編碼多順反子mRNA分子，其中靶多肽和可選擇多肽分別從不同ORF轉譯。因此每個靶多肽可與特定的可選擇多肽有關。在一些實施方式中，可選擇多肽是細胞表面多肽。
細胞表面多肽的實例包括，但不限於CD2、CD20、CD52和CD59。CD52和CD59。細胞表面多肽的示例性、非限制性胺基酸序列在下面提供。
示例性的人CD52多肽的胺基酸序列： 
(SEQ ID NO：2)
示例性的人CD59多肽的胺基酸序列(剪接受體突變體)： 
(SEQ ID NO：3)
示例性的小鼠CD52多肽的胺基酸序列： 
(SEQ ID NO：4)
在一些實施方式中，提供第一ORF，其編碼可選擇多肽，如CD52或 CD59。CD52和CD59的示例性、非限制性ORF序列在下面提供。
示例性的人CD52 ORF的核苷酸序列： 
(SEQ ID NO：5)
示例性的人CD59 ORF的核苷酸序列： 
(SEQ ID NO：6)
示例性的小鼠CD52 ORF的核苷酸序列： 
(SEQ ID NO：7)
如下所述，已經修飾每個在前示例性的ORF以去除所有內部ATG三聯體。
在一些實施方式中，提供第二ORF，其編碼靶多肽，如抗體、酶或Fc融合蛋白。在一些實施方式中，藉由使用用於可選擇多肽的轉譯起始的非AUG起始密碼子和用於靶多肽的轉譯起始的AUG起始密碼子來完成單獨的轉譯。在此實施方式中，一般地，編碼靶多肽的多核苷酸位於編碼可選擇多肽的多核苷酸的下游。單獨的轉譯還可以使用內部核糖體進入位點 (IRES)實現。在一些實施方式中，IRES元件位於編碼靶多肽的多核苷酸的上游和編碼可選擇多肽的多核苷酸的下游。在一些實施方式中，IRES元件位於編碼可選擇多肽的多核苷酸的上游和編碼靶多肽的多核苷酸的下游。
在一些實施方式中，非AUG起始密碼子位於編碼可選擇多肽的DNA中，如此一來轉譯可選擇多肽比轉譯靶多肽效率更低。為了實現降低的轉譯效率，可選擇多肽的AUG起始密碼子可以改為可替換的非AUG起始密碼子，其實例包括但不限於：CUG、GUG、UUG、AUU、AUA和ACG。
因此，當使用可替換的非AUG起始密碼子時，可選擇多肽的表現相對於共表現的靶多肽的表現可減弱。除了起始密碼子的替換之外，編碼可選擇多肽的DNA可在所有內部ATG三聯體處修飾以防止轉譯的內部起始。在一些實施方式中，可選擇多肽具有短的胺基酸序列(<200個胺基酸)而且藉由幾乎沒有(<10)ATG三聯體的多核苷酸編碼。
在不希望受理論束縛的情況下，為了開始編碼可選擇多肽和靶多肽兩者的mRNA的轉譯，核糖體在mRNA的5'帽子結構處開始掃描，大多數掃描經過可替換的起始密碼子(例如，UUG)，而不是在下游AUG起始密碼子處開始轉譯。然而，轉譯起始可在可替換的起始密碼子處發生，儘管以非常低的頻率，從而還表現低水平的可選擇多肽。
從轉染的宿主細胞中選擇早期表現轉染的宿主細胞的亞群，其表現可檢測水平的可選擇多肽。在轉染期間，單個宿主細胞以基本隨機方式吸收不同量的外源多核苷酸，例如DNA。一些細胞會吸收外源多核苷酸的複本，另一些細胞會幾乎不吸收複本，且一些細胞會不吸收複本。吸收到給定細胞中的DNA的量影響DNA的命運，包括其早期表現和其整合到基因組中。
使用DNA轉染後，已經被引入到細胞中的至少一些多核苷酸被易位 到其轉錄為mRNA的核中。在最初幾天，引入的DNA的表現可被一類或多類DNA驅除(drive off)，一些尚未整合到宿主細胞的基因組中，而一些已經被整合到宿主細胞的基因組中。在這點上，認為表現的程度主要與引入到宿主細胞和其核中的DNA的“量”成比例。被宿主細胞吸收的外源DNA的量越大，早期表現的程度越大。然而，被引入到宿主細胞中的少量DNA，特別是一旦它是線性的，可整合到宿主細胞的基因組中。因此，在轉染後的最初幾天，一方面在外源DNA的降解和丟失之間有競爭，另一方面，將外源DNA隨機整合到基因組中。整合可包括引入的DNA的單複本或多複本。藉由宿主細胞吸收的外源DNA的量越大，其整合的機會(和程度)越大。最終，其是負責長期生產性表現(即，在所有非整合的DNA(例如質粒或附加體DNA)降解到不能有意義的表現的點之後的表現)的整合的DNA。
因此在轉染後的最初2至約15天(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天)，有表現可檢測量的可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞。具體地，在最初2-6天，更具體地，在最初2-4天，而且甚至更具體地在最初2-3天，認為此早期表現主要地，但非必須排他地驅除尚未被整合到宿主細胞的基因組中的外源DNA。在轉染之後的這個早期期間，可能在某種程度上將外源DNA整合到宿主細胞基因組中。因為，此早期表現取決於由宿主細胞和其核吸收的DNA的“量”，而且量在轉染的細胞中基本是隨機的，在此早期期間，轉染的宿主細胞包括表現不同量的由外源DNA編碼的多肽的細胞的亞群。而且，在此早期期間，表現越大量的編碼外源DNA的多肽的細胞的亞群可能吸收越大量的外源DNA，並且因此具有更大機會將DNA併入它們的基因組。
另外，如本文所使用的術語“早期表現(early-expressing)”或“早期的表現(early expression)”指在轉染後的最初2至約15天(e.g.,2-15天、2-14天、2- 13天、2-12天、2-11天、2-10天、2-9天、2-8天、2-7天、2-6天、2-5天、2-4天、2-3天、3-15天、3-14天、3-13天、3-12天、3-11天、3-10天、3-9天、3-8天、3-7天、3-6天、3-5天、3-4天、4-15天、4-14天、4-13天、4-12天、4-11天、4-10天、4-9天、4-8天、4-7天、4-6天、4-5天、5-15天、5-14天、5-13天、5-12天、5-11天、5-10天、5-9天、5-8天、5-7天、5-6天、6-15天、6-14天、6-13天、6-12天、6-11天、6-10天、6-9天、6-8天、6-7天、7-15天、7-14天、7-13天、7-12天、7-11天、7-10天、7-9天、7-8天、8-15天、8-14天、8-13天、8-12天、8-11天、8-10天、8-9天、9-15天、9-14天、9-13天、9-12天、9-11天、9-10天)中可檢測的表現。在某些實施方式中，術語“早期表現(early-expressing)”或“早期的表現(early expression)”指在轉染後的最初2至約10天中的可檢測的表現。在某些實施方式中，術語“早期表現(early-expressing)”或“早期的表現(early expression)”指在轉染後的最初2至約6天中的可檢測的表現。在某些實施方式中，術語“早期表現(early-expressing)”或“早期的表現(early expression)”指在轉染後的最初2至約5天中的可檢測的表現。術語“早期表現(early-expressing)”或“早期的表現(early expression)”指在轉染後的最初2至約4天中的可檢測的表現。術語“早期表現(early-expressing)”或“早期的表現(early expression)”指在轉染後的最初2至約3天中的可檢測的表現。
用於檢測細胞表面標記的本領域中已知的任何方法可以與本公開的方法相關使用。例如，抗體或其他細胞表面標記特異性結合劑在允許或有利於抗體與可選擇多肽結合的條件下直接或間接與轉染的宿主細胞接觸，由此選擇早期表現轉染的宿主細胞的亞群。抗體或其他結合劑的選擇藉由以下確定：1)其選擇性結合在宿主細胞上表現的可選擇多肽的能力；和2)其使用可檢測的標記標記或結合用於例如流式細胞術或FACS的可檢測的 標記的能力。
在可替換的實施方式中，第一試劑可為結合可選擇多肽的蛋白質或多肽，其中第一試劑繼而又結合能夠被可檢測地標記(例如，併入螢光標記、酶標記、比色標記、磁化標記或其他可檢測標記)的第二試劑。儘管並不總是明確說明，意圖是“間接”結合可選擇多肽包括使用任何數量的中間配偶體。在某些實施方式中，“間接”結合可選擇多肽，包括使用一個中間配偶體，例如一個未標記的抗體或其他結合劑。
在一些實施方式中，抗體或其他結合劑直接結合細胞表面標記，而且包含螢光標記。適合的螢光標記包括，但不限於，異硫氰酸螢光素(FITC)、若丹明類、四甲基羅丹明、曙紅、藻紅蛋白(PE)、赤鮮紅、別藻藍蛋白(APE)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、均二苯代乙烯、螢光黃、級聯藍和德克薩斯紅。其他適合的光染料在Molecular Probes® Handbook,11th Edition,2010中描述。
在一些實施方式中，將螢光標記功能化以促進與抗體或其他試劑的共價結合。適合的官能團，包括，但不限於異硫氰酸鹽/酯基、胺基、鹵代乙醯基、馬來醯亞胺、琥珀醯亞胺酯和磺醯鹵，其全部可用來使螢光標記與第二分子結合。螢光標記的官能團的選擇會取決於與抗體或其他結合劑、可選擇多肽或第二標記劑的結合的位點。
螢光標記的結合可以是直接或經由接頭結合到抗體或其他結合劑。一方面，接頭是相對短的偶聯部分，其一般用來結合分子。在此實施方式中，第一標記部分與候選試劑的結合將如本領域技術人員通常所理解的那樣進行，而且可包括以上概述用於併入螢光標記的技術。
用於設計和構建用於細胞計數的標記抗體和其他試劑是本領域中已知的，並例如在Bailey et al.(2002)Biotechnol.Bioeng.80(6)；670-676；Carroll and A1-Rubeai(2004)Expt.Opin.Biol.Therapy 4：1821-1829；Yoshikawa et al.(2001)Biotechnol.Bioeng.74：435-442；Meng et al.(2000)Gene 242：201-207；Borth et al.(2001)Biotechnol.Bioeng.71(4)：266-273；Zeyda et al.(1999)Biotechnol.Prog.15：953-957；Klucher et al.(1997)Nucleic Acids Res.25(23)：4853-4860；和Brezinsky et al.(2003)J.Imumunol.Methods 277：141-155中描述。
用於間接連接標記與試劑(其繼而結合可選擇多肽)的適合的結合對包括，但不限於，抗原/抗體，其包括地高辛配基/抗體、二硝基酚(DNP)/抗DNP、丹醯X/抗丹醯、螢光素/抗螢光素、螢光黃/抗螢光黃、若丹明類/抗若丹明類和生物素/抗生物素蛋白(或生物素/抗生蛋白鏈菌素)。結合對應該彼此具有高親和力，在細胞分選或與本公開相關使用的其他檢測系統期間足夠經受剪切力。
因此，在一些方面，第一標記部分(當使用第二標記部分時)包括，但不限於，半抗原，如生物素。靶分子的生物素化是公知的，例如，已知大量生物素化試劑，其包括用於蛋白質、核酸、碳水化合物和羧酸的生物素化的胺反應劑和硫醇反應劑。相似地，還已知大量其他半抗原化試劑。
用於本文所述的方法的抗體可在細胞培養中、在噬菌體中或在各種動物(其包括但不限於小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔子、綿羊、山羊、馬、牛、駱駝、猴子、黑猩猩等)中產生，只要抗體保留對可選擇多肽的結合特異性。可以藉由在一組給定的條件下比較結合適當的抗原與結合無關的抗原或抗原混合物來測試抗體的結合特異性。
在沒有直接標記用於可選擇多肽的抗體或其他結合劑的實施方式中，抗體或結合劑還優選含有並保留結合經由可選擇多肽結合細胞後可檢測的第二試劑的能力。
在一些實施方式中，當可選擇多肽是CD52時，可選擇多肽可使用抗CD52抗體檢測。“抗CD52抗體”指特異性識別並結合CD52的抗體。可藉由本領域公知的方法產生抗CD52抗體。見例如，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,1987 to present versions)和Antibodies：A Laboratory Manual,Second edition(Greenfield,ed.2013)。另外，幾個抗CD52抗體是可商購的(例如，與螢光標記接合的抗體，如由商業供應商AbCam、SeroTec和BioLegend售賣的那些)。
在一些實施方式中，當可選擇多肽是CD59時，可選擇多肽可使用抗CD59抗體檢測。“抗CD59抗體”指特異性識別並結合CD59的抗體。可藉由本領域公知的方法產生抗CD59抗體。另外，幾個抗CD59抗體是可商購的(例如，與螢光標記接合的抗體，如由商業供應商AbCam、SeroTec和BioLegend售賣的那些)。
在具體的實施方式中，當可選擇多肽是CD20時，可選擇多肽可使用抗CD20抗體檢測。“抗CD20抗體”指特異性識別並結合CD20的抗體。可以藉由本領域公知的方法產生抗CD20抗體。另外，幾個抗CD20抗體是可從供應商如BD Pharmingen；Beckman Coulter,Inc.(Fullerton,Calif.,numerous clones including Catalog No.6604106 Clone H299(B1)；Isotype IgG2a and Catalog No.IM1565 Clone L26,Isotype IgG2a)；Invitrogen(Carlsbad,Calif.,Clone：BH-20,Isotype：IgG2a and Clone：B-H20,Isotype：IgG2a)；BioLegend(San Diego,Calif.,Catalog.No.302301,Clone：21-7,Isotype：IgG2b,76)；EMD Biosciences,Inc.,CALBIOCHEM® Brand(San Diego,Calif.,Catalog No.217670 Clone 2H7,Isotype：IgG2b)和Anaspec(San Jose,Calif.,Catalog No.29587)商購的。
為了在MACS中使用，其中有更有限數量的抗原特異性磁珠，標記或 未標記的初級抗體或其他結合劑(例如Fc融合蛋白)可以用來結合可選擇多肽，然後藉由例如同型特異性磁珠結合。例如，Miltenyi Biotec sells CD20微珠和抗小鼠IgG微珠，但不是CD52或CD59微珠；抗小鼠IgG微珠可用來標記初級小鼠IgG抗人CD52或小鼠IgG抗人CD59。
在示例性的、非限制性的方法中，如果存在，如本文所述的轉染的宿主細胞群體與識別並直接或間接結合細胞表面上的可選擇多肽的試劑接觸。接觸在有利於或適合於試劑或抗體與可選擇多肽的特異性結合(直接或間接)的條件下進行。然後使用合適的方法如FACS(例如，藉由門控以高水平如群體水平的至少80%的水平表現FACS可選擇多肽的細胞)選擇結合試劑或抗體的細胞並用來選擇早期表現轉染的宿主細胞的亞群。或者，然後使用合適的方法如MACS(例如，藉由門控以高水平如群體水平的至少80%的水平表現FACS可選擇多肽的細胞)選擇結合試劑或抗體的細胞並用來選擇早期表現轉染的宿主細胞的亞群。
然後選擇的早期表現轉染的宿主細胞的亞群在引起亞群擴大的條件下生長以產生表現靶多肽的生產者細胞的群體。
在某些實施方式中，在轉染的2至15天內，從轉染的宿主細胞分離表現可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞的亞群)的步驟在無藥物選擇培養基中進行。例如，在某些實施方式中，在轉染的2至15天內，從轉染宿主細胞分離表現可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞的亞群的步驟在0nM MTX(即無MTX)培養基中進行。
在某些實施方式中，擴增選擇的轉染的宿主細胞的亞群的步驟在無藥物選擇培養基中進行。例如，在某些實施方式中，擴大選擇的轉染的宿主細胞的亞群的步驟在0nM MTX(即無MTX)培養基中進行。
在某些實施方式中，步驟(b)在轉染的2-15天內從轉染的宿主細胞分 離表現可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞的亞群和步驟(c)擴大分離的轉染的宿主細胞的亞群均在無藥物選擇培養基中進行。例如，在某些實施方式中，(b)在轉染的2-15天內從轉染的宿主細胞分離表現可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞的亞群和步驟(c)擴大分離的轉染的宿主細胞的亞群均在0nM MTX(即無MTX)培養基中進行。
包括生產者細胞的細胞可以在旋轉瓶、搖瓶、滾瓶、波反應器(例如來自wavebiotech.com的System 1000)或中空纖維系統中培養，或用於大規模生產的攪拌槽型反應器或袋式反應器(例如，Wave Biotech，Somerset，New Jersey USA)特別用於懸浮培養。攪拌槽型反應器可適合使用例如噴灑器、擋板或低剪切葉輪來通氣。對於鼓泡塔和氣升式反應器，可以使用使用空氣或氧氣泡直接充氣。當宿主細胞在無血清培養基中培養時，培養基可以補充有細胞保護劑如泊洛沙姆188(Pluronic® F-68)以幫助防止曝氣過程造成的細胞損傷。根據宿主細胞特徵，微載體可以用作貼壁依賴性細胞系的生長基質，或者細胞可以適應懸浮培養。宿主細胞特別是脊椎動物宿主細胞的培養可利用多種操作模式，如分批式過程、補料分批過程、重複分批過程(見，Drapeau et al.(1994)Cytotechnology 15：103-109)、擴大的分批過程或灌注培養。儘管重組轉化的生產者細胞可以在包含胎牛血清(FCS)的含血清培養基中培養，但是在一些實施方式中，將這樣的宿主細胞培養在無血清培養基(如在Keen et al.(1995)Cytotechnology 17：153-163中所公開的)，或可商購的培養基(如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex,NJ,USA))中培養，必要的情況下補充能量來源(如葡萄糖)和合成生長因子(如重組胰島素)。宿主細胞的無血清培養可能需要這些細胞適合在無血清條件下生長。一種適應方法是在含有血清的培養基中培養這樣的宿主細胞，並重複交換80%培養基用於無血清培養基，以便宿主細胞適應無血清 條件(見，例如，Scharfenberg,Scharfenberg,K.et al.(1995)In：Animal Cell Technology：Developments Towards the 21st Century(Beuvery,E.C.et al.,eds),pp.619-623,Kluwer Academic publishers)。
在某些實施方式中，方法進一步包括從生產者細胞的群體分離靶多肽。可以使用本領域已知的任何方法分離靶多肽，而且可以例如根據用於重組蛋白質和抗體的現行良好生產規範(Current Good Manufacturing Practice)(CGMP)進一步純化到至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或更高的純度水平。根據所述實施方式的靶多肽可以分泌到培養基中並使用各種技術中的任何技術從其中回收和純化，以提供適合於意圖使用的純化的程度。例如，當與包含靶多肽的培養基相比時，用於治療人類受試者的靶多肽(例如抗體或Fc融合蛋白)的使用一般要求藉由還原SDS-PAGE確定至少95%的純度，更一般為98%或99%的純度。首先，來自培養基的細胞碎片可以使用離心去除，然後是使用例如微量過濾、超濾和/或深度過濾的上清液的澄清步驟。或者，可藉由微量過濾、超濾或深度過濾來收穫靶多肽，而無需事先離心。如透析和凝膠電泳以及如羥基磷灰石(HA)、親和色譜(任選地涉及親和標簽系統如聚組胺酸)和/或疏水相互作用層析(HIC)(見US 5,429,746)的多種其他技術是可用的。在一個實施方式中，在各種澄清步驟之後，使用蛋白A或G親和色譜，然後藉由進一步的色譜步驟如離子交換層析和/或HA層析、陰離子或陽離子交換色譜、尺寸排阻色譜法和硫酸銨沉澱法來捕獲靶多肽如抗體或Fc融合蛋白。也可以使用多種病毒去除步驟(例如，使用例如DV-20過濾器的納米過濾)。在這些多種步驟之後，提供了包含至少10mg/mL或更多，例如100mg/mL或更多的本文所述的靶多肽的純化製劑。
在某些實施方式中，本發明的方法進一步包括以下步驟：從擴大的 亞群中分離一個或多個單一轉染的宿主細胞和培養一個或多個單一轉染的宿主細胞以產生一個或多個單一轉染的宿主細胞的選殖群體。在某些實施方式中，本發明的方法進一步包括以下步驟：從擴大的亞群分離一個或多個單一轉染的宿主細胞和培養一個或多個單一轉染的宿主細胞以產生一個或多個表現靶多肽的生產者細胞的選殖群體。可以藉由本領域已知的任何方法進行選殖群體的製備。例如，在一個實施方式中，可以將選擇的細胞以每孔一個細胞的密度鋪板到96孔(或其他尺寸)板中，並允許生長一段時間(例如，一般7-28天)，其中允許單個細胞生長成多細胞集落的子細胞(即選殖群體)。接下來該方法可以包括藉由檢測所述選殖群體上的可選擇多肽和/或靶多肽表現的水平並選擇具有可選擇多肽和/或靶多肽的高表現水平的一個或多個選殖群體來分析一個或多個選殖群體，由此選擇一個或多個穩定表現靶多肽的選殖群體。在某些實施方式中，在分析選殖群體之前，以單個細胞密度鋪板後將選殖群體培養7-28天。方法可以進一步包括使選殖群體與可檢測的抗體或其他結合劑接觸，所述可檢測的抗體或其他結合劑在允許或有利於抗體或其他結合劑與可選擇多肽結合的條件下識別並直接或間接結合在選殖細胞的表面上的可選擇多肽(如果存在)；和選擇或檢測直接或間接結合抗體或其他結合劑的一個或多個細胞。也可分離和培養如此選擇的這些細胞。方法可以進一步包括例如使用蛋白A篩選(例如當靶多肽是抗體或Fc融合蛋白時)、蛋白質印跡、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)與考馬斯藍(Coomassie Blue)或銀色染色，或酶活性測定分析一個或多個選殖體的靶多肽表現。
在某些實施方式中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含至少80-120 x 106個細胞。例如，在某些實施方式中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含至少約80 x 106個細胞；在某些實施方式 中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含至少約90 x 106個細胞；在某些實施方式中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含至少約100 x 106個細胞；在某些實施方式中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含至少約110 x 106個細胞；並且在某些實施方式中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含至少約120 x 106個細胞。例如，在某些實施方式中，在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞的亞群包含約80 x 106至約800 x 106個細胞、約100 x 106至約800 x 106個細胞、約200 x 106至約800 x 106個細胞、約300 x 106至約800 x 106個細胞、約400 x 106至約800 x 106個細胞、約500 x 106至約800 x 106個細胞、約80 x 106至約600 x 106個細胞、約100 x 106至約600 x 106個細胞、約200 x 106至約600 x 106個細胞、約300 x 106至約600 x 106個細胞、約400 x 106至約600 x 106個細胞、約500 x 106至約600 x 106個細胞、約80 x 106至約500 x 106個細胞、約100 x 106至約500 x 106個細胞、約200 x 106至約500 x 106個細胞、約300 x 106至約500 x 106個細胞、約400 x 106至約500 x 106個細胞、約80 x 106至約400 x 106個細胞、約100 x 106至約400 x 106個細胞、約200 x 106至約400 x 106個細胞、約300 x 106至約400 x 106個細胞、約80 x 106至約300 x 106個細胞、約100 x 106至約300 x 106個細胞、約200 x 106至約300 x 106個細胞、約80 x 106至約250 x 106個細胞、約100 x 106至約250 x 106個細胞、約200 x 106至約250 x 106個細胞、約80 x 106至約200 x 106個細胞或約100 x 106至約200 x 106個細胞。
在某些實施方式中，步驟(b)中的分離在轉染後小於6天進行。例如，在某些實施方式中，步驟(b)中的分離在轉染後兩到四天之間進行。在某些實施方式中，步驟(b)中的分離在轉染後兩天進行。在某些實施方式中，步驟(b)中的分離在轉染後三天進行。
在某些實施方式中，在步驟(c)中的擴大之前，轉染的宿主細胞的亞群包含約0.5-6.0 x 106個細胞。例如，在某些實施方式中，在步驟(c)中的擴大之前，轉染的宿主細胞的亞群包含約0.5 x 106個細胞、約1.0 x 106個細胞、約2.0 x 106個細胞、約3.0 x 106個細胞、約4.0 x 106個細胞、約5.0 x 106個細胞或約6.0 x 106個細胞。例如，在某些實施方式中，在步驟(c)中的擴大之前，轉染的宿主細胞的亞群包含約0.5 x 106至約1.0 x 106個細胞、約0.5 x 106至約2.0 x 106個細胞、約0.5 x 106至約3.0 x 106個細胞、約0.5 x 106至約4.0 x 106個細胞、約0.5 x 106至約5.0 x 106個細胞、約0.5 x 106至約6.0 x 106個細胞、約1.0 x 106至約2.0 x 106個細胞、約1.0 x 106至約3.0 x 106個細胞、約1.0 x 106至約4.0 x 106個細胞、約1.0 x 106至約5.0 x 106個細胞、約1.0 x 106至約6.0 x 106個細胞、約2.0 x 106至約3.0 x 106個細胞、約2.0 x 106至約4.0 x 106個細胞、約2.0 x 106至約5.0 x 106個細胞、約2.0 x 106至約6.0 x 106個細胞、約3.0 x 106至約4.0 x 106個細胞、約3.0 x 106至約5.0 x 106個細胞、約3.0 x 106至約6.0 x 106個細胞、約4.0 x 106至約5.0 x 106個細胞、約4.0 x 106至約6.0 x 106個細胞或約5.0 x 106至約6.0 x 106個細胞。在某些實施方式中，在步驟(c)中的擴大之前，轉染的宿主細胞的亞群含有大於6.0 x 106個細胞。例如，在某些實施方式中，在步驟(c)中的擴大之前，轉染的宿主細胞的亞群包含約7.0 x 106個細胞，約8.0 x 106個細胞、約9.0 x 106個細胞或約10.0 x 106個細胞。
在某些實施方式中，步驟(c)中的擴大持續4-31天。例如，在多種實施方式中，所述擴大持續4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。
在某些實施方式中，一個或多個載體的第一個載體係編碼編碼靶多 肽的mRNA，並且一個或多個載體的第二個係編碼編碼可選擇多肽的mRNA。在編碼編碼靶多肽的mRNA和編碼可選擇多肽的mRNA的一個或多個載體是單獨的載體的情況下，在某些實施方式中，載體獨立地選自質粒、病毒、噬菌體、轉位子和微型染色體。
在某些實施方式中，編碼靶多肽的mRNA和編碼可選擇多肽的mRNA都在一個載體上編碼。根據這些實施方式，單一載體編碼編碼靶多肽和可選擇多肽的多順反子mRNA。同樣根據這些實施方式，在某些實施方式中，編碼可選擇多肽的mRNA可以是編碼靶多肽的mRNA的上游(即5’)。或者，在某些實施方式中，編碼靶多肽的mRNA可以是編碼可選擇多肽的mRNA的上游(即5’)。
因此，在某些實施方式中，靶多肽和可選擇多肽由單一多順反子mRNA編碼。在某些實施方式中，多順反子mRNA包含編碼可選擇多肽的第一開放讀碼框(ORF)和編碼靶多肽的第二ORF，其中第一ORF位於第二ORF的5’。
在某些實施方式中，第一ORF具有非AUG起始密碼子。在某些實施方式中，非AUG起始密碼子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。可以使用標準分子生物學技術來安裝非AUG起始密碼子，如本領域公知的。
在某些實施方式中，第二ORF具有AUG起始密碼子。
在某些實施方式中，第一ORF具有非AUG起始密碼子，第二ORF具有AUG起始密碼子。
在某些實施方式中，編碼可選擇多肽的ORF不含任何AUG序列。除了終止密碼子之外，可以使用標準分子生物學技術將AUG序列轉化成其他三聯體序列，如本領域公知的；例如，而且不限於，AUG序列可獨立轉化成CUG(L)、GUG(V)、UUG(L)、AAG(K)、ACG(T)、AGG(R)、AUA (I)、AUC(I)、AUU(I)、GCA(A)、GCC(A)、GCG(A)或GCU(A)。
在某些實施方式中，靶多肽和可選擇多肽形成融合蛋白。在某些實施方式中，融合蛋白是膜結合的。當融合蛋白是膜結合的，在某些實施方式中，可選擇多肽以可檢測的形式存在，即融合蛋白的靶多肽部分不阻止檢測融合蛋白的可選擇多肽部分。而且，當融合蛋白質是膜結合的，在某些實施方式中，靶多肽以功能形式存在，即融合蛋白質的可選擇多肽部分不阻止融合蛋白質的靶多肽部分的功能。在某些實施方式中，融合蛋白從宿主細胞釋放作為可溶性蛋白。在某些實施方式中，將融合蛋白表現為表面蛋白，但可將其切割以釋放可溶、功能形式的靶多肽。
在某些實施方式中，靶多肽是治療劑，例如抗體、抗體的抗原結合片段、Fc融合蛋白、激素或酶。多肽激素包括，但不限於，促腎上腺皮質激素(ACTH)、抗利尿激素(加壓素)、心房鈉尿肽(ANP)、膽囊收縮素、促卵泡激素(FSH)、胃泌素、胰高血糖素、生長激素、胰島素、瘦素、促黃體激素(LH)、催產素、催乳素、生長抑素和促甲狀腺激素(TSH)。酶包括，但不限於，酸性α-葡糖苷酶、腺苷脫氨酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶B、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、葡糖腦苷脂酶、乙醯肝素磺醯胺酶、乙醯肝素-α-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶、透明質酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙醯半乳糖胺-4-硫酸酯酶、N-乙醯葡糖胺6-硫酸酯酶和N-乙醯胺基葡糖苷酶。
在一些實施方式中，靶多肽是分泌蛋白。
在某些實施方式中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方式中，宿主細胞選自下組：CHO細胞、BHK-21細胞、NIH/3T3細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、SP2/0細胞、NS0細胞、C127細胞、COS細胞、Vero細胞和U937細胞。所有這些細胞(細胞系)都可以從如美國典型培養物 保藏中心(ATCC,Manassas,VA)的來源商購。在某些實施方式中，宿主細胞選自下組：CHO細胞、HEK293細胞和HeLa細胞。
本發明的一方面是表現可藉由本發明方法獲得的可選擇多肽和靶多肽的轉染宿主細胞的選殖群體。在某些實施方式中，轉染的宿主細胞的選殖群體表現可藉由本發明的方法獲得的FACS可選擇多肽和靶多肽。
在某些實施方式中，與在步驟(c)中獲得的轉染的但未選殖的宿主細胞的穩定池相比，選殖群體在產生靶多肽方面產生2至30倍的改善。
例如，在一些實施方式中，與在步驟(c)中獲得的轉染的但未選殖的宿主細胞的穩定池相比，選殖群體在產生靶多肽方面產生2至30倍、3至30倍、5至30倍、10至30倍、15至30倍、20至30倍、25至30倍、2至25倍、3至25倍、5至25倍、10至25倍、15至25倍、20至25倍、2至20倍、3至20倍、5至20倍、10至20倍、15至20倍、2至15倍、3至15倍、5至15倍、10至15倍、2至10倍、3至10倍、5至10倍、2至5倍、3至5倍或2至3倍的改善。在某些實施方式中，與在步驟(c)中獲得的轉染的但未選殖的宿主細胞的穩定池相比，選殖群體在產生靶多肽方面產生大於30倍的改善。例如，在某些實施方式中，與在步驟(c)中獲得的轉染的但未選殖的宿主細胞的穩定的彙集物相比，選殖群體在產生靶多肽方面產生高達40倍、高達50倍、高達60倍、高達70倍、高達80倍、高達90倍或高達100倍的改善。
III．生產者細胞及其產生的方法
在一些實施方式中，提供了生產者細胞的異質群體。可以使用本領域已知或本文描述的任何方法產生生產者細胞的異質群體。在提供的任一種方法的一些實施方式中，藉由使用編碼多順反子mRNA的載體轉染細胞並使轉染的細胞經過少於或等於一輪基於培養基的選擇來選擇表現不同水平(例如，至少10倍、100倍、1,000倍或10,000倍的變異)多順反子mRNA的 細胞而產生生產者細胞的異質群體。在一些實施方式中，載體進一步含有藥物選擇標記，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，而且基於培養基的選擇是甲氨蝶呤(MTX，例如1nM-100nM MTX)、核苷酸缺陷型培養基或它們的組合。在一些實施方式中，載體進一步含有穀氨醯胺合成酶(GS)基因，而且基於培養基的選擇是甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX，25-100μM MSX)。在一些實施方式中，載體缺乏藥物選擇標記，例如缺乏DHFR基因或GS基因。
在一些實施方式中，使用FACS來選擇表現不同水平的多順反子mRNA的細胞，例如藉由使用FACS可選擇多肽水平來選擇細胞。
對於本領域技術人員來說會顯而易見的是，在不背離本文所公開的實施方式的範圍的情況下，可以使用合適的等同物對本文所描述的方法進行其他適當的修改和改變。現在已經詳細描述了某些實施方式，藉由參考以下實施例將更清楚地理解這些實施方式，所述實施例僅用於說明的目的而不意圖是是限制性的。
實施例
藉由以下實施例進一步說明本發明，所述實施例不應該被解釋為進一步限制性的。
實施例1：針對細胞的早期轉染後分離(EPIC)的分選-觀點的證據
此實施例表明在選擇之前分選以靶向未經選擇的轉染的早期表現群體以批量富集的方法的可行性。此分選的方法被稱為“短分選”或“EPIC”(細胞的早期轉染後分離)，並企圖在轉染後不久進行分選分離或批量富集早期報告基因表現。EPIC可顯著縮短選擇時間表和/或改善得到的異質群體的生產力。已經進行實驗來研究核苷酸缺乏選擇過程的整個過程中轉染的群體的報告基因表現概況。第1A圖描繪EPIC的一般方案。第1B圖顯示在核 苷酸缺乏選擇過程期間報告基因的早期表現。這些偏移直方圖表明早期表現(例如第3-4天)是陽性的和可分選的；使分離轉染細胞的亞群用於EPIC過程可行。
如第1A圖所示，執行EPIC可藉由轉染群體並允許早期表現形成來進行，這可以使用流式細胞術或其他細胞分選的方法來進行靶向以供分離。 然後，可將這些分選分離早期表現亞群置於選擇培養基中以建立穩定的表現池。在選擇前，這些轉染後早期表現亞群的分離產生超過單獨的標準轉染/選擇方法的改善的生產力(例如，如第1A圖所示)。
為了證明檢測到的CD52信號實際上是早期CD52報告基因表現的觀點的證據，構建了指導表現紅色螢光蛋白(RFP)和CD52(pGZ729-RFP)二者或單獨的RFP(pGZ700-RFP)的載體並將其轉染用於早期表現評價。在此系統中，CD52對應於可檢測的多肽，而RFP對應於靶多肽。
pGZ729載體骨架序列(其包括編碼CD52但不是RFP的序列)在下面顯示，然後是序列的注釋。
pGZ729表現載體的序列(SEQ ID NO：8)：
pGZ729表現載體的元件(和核苷酸位置)： 核苷酸1-325-SV40早期啟動子(用於DHFR轉錄)
核苷酸347-1089-二氫葉酸還原酶(DHFR)開放讀碼框
核苷酸1090-1934-SV40早期內含子和polyA
核苷酸2684-3366-大腸桿菌(E.coli)ColE1起點
核苷酸3464-4123-氨苄西林抗性基因
核苷酸4528-7539-倉鼠β-肌動蛋白啟動子(用於感興趣的基因的轉錄)
核苷酸7568-7753-CD52開放讀碼框(含有TTG起始密碼子)
核苷酸7781-7791-在3個讀碼框的每個中的終止密碼子
核苷酸7813-7872-多選殖位點(用於插入具有ATG起始密碼子的靶多肽)
核苷酸7882-8123-SV40早期polyA
如第2圖所示，轉染有pGZ729-RFP的CHO細胞產生在約第2和第3天達到高峰的CD52和RFP的早期表現，信號變差直到轉染後第7天。因此，在或接近第2-3天的EPIC靶向適合於分離轉染的宿主細胞的早期表現亞群。為了表明這些相對低螢光強度的信號實際上是CD52表現，分析轉染有pGZ729-RFP或pGZ700-RFP的CHO細胞的RFP和CD52表現。如第3圖所示，轉染有pGZ729-RFP的CHO細胞和轉染有pGZ700-RFP的CHO細胞均強烈地表現RFP(分別是左上和左下)，而儘管轉染有pGZ729-RFP的CHO細胞適度表現CD52(右上)，轉染有pGZ700-RFP的CHO細胞基本不表現可檢測的CD52(右下)。這些發現支持的觀念是這些相對低螢光強度的信號實際上是從可替換的起始表現盒的CD52表現，而且適用於分選分離(EPIC)的適合 靶標。
作為原理的進一步證據，使用pGZ729-RFP從轉染的群體中針對EPIC靶向早期RFP表現，然後產生穩定池。轉染兩天後(峰值瞬間)，靶向早期RFP表現，用於分選分離和收集。然後在0nM MTX核苷酸缺乏培養基中使用產生EPIC的RFP陽性亞群經由選擇建立穩定池。還產生標準轉染/選擇池以用作比較性對照。如第7圖所示，產生EPIC的池(其靶向早期RFP表現)產生了比單獨使用傳統轉染/選擇方法(0nM池)更多RFP和CD52報告基因表現的穩定池(EPIC池)。結果表明原理的FLARE獨立證據支持產生EPIC的池比傳統的轉染/選擇方法更有生產力的說法。
實施例2：針對細胞的早期轉染後分離(EPIC)的分選-生產者細胞池產生
最初使用mAb # 1嘗試EPIC，其中轉染CHO細胞並給予2天恢復，之後開始0nM MTX選擇以建立早期表現。轉染四天后，以CD52細胞表面報告基因的早期表現為靶進行分選分離(EPIC)。分選僅靶向陽性表現，收集所述陽性表現作為約1百萬個細胞的批量富集的群體，然後允許其在核苷酸缺乏培養基(0nM MTX)中繼續選擇。作為對照，允許未分選的轉染經由標準選擇程序繼續選擇。如第4圖所示，到第8天，與標準選擇相比，針對EPIC的分選產生了藉由CD52報告基因表現所見的輕度富集的群體。然而，隨著兩個群體的選擇仍在繼續，這個小的EPIC亞群隨著時間變得更加突出。實際上，在選擇完成後幾乎將CD52陰性亞群排除。比較而言，標準選擇方法表明了歷史上一般的CD52報道基因表現的輕微改善。針對EPIC的分選或分離早期表現產生了陽性表現的亞群(其具有超過不善於表現的細胞的優先的生存能力)，這繼而產生了一個更有生產力的穩定池。
EPIC和標準選擇的池均用來建立未補料分批培養物以確定mAb # 1效 價。如第4圖和第5圖所示，產生EPIC的池產生了502mg/L的效價，遠遠超過由MTX擴增產生的任何池，在整個過程中又一次不使用MTX。比較而言，藉由標準選擇產生的池產生了150mg/L的效價，其比產生EPIC的池的效價低3倍。
雖然這些靶向EPIC的初始分選花費了35天(轉染/分選/分離)以實現完成穩定的池，但這與收集的分選的細胞量少(100萬)直接相關，然後所述分選細胞不得不持續擴大和選擇成為一個穩定的群體。這樣的時間表可以藉由簡單地收集更多的細胞和/或靶向更純的分選而大大減少。許多分選的細胞具有高水平的雜質(幾乎不表現或不表現的細胞)並且不得不被選出來(殺死)，延長了選擇/擴大時間。
實施例3：針對細胞的早期轉染後分離(EPIC)的分選-選殖體生成
接下來使用實施例2的產生EPIC的池如前所述使用FLARE產生選殖體(見，例如，Cairns,V.et al.(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a Flow Cytometric Method for Efficient Selection of Recombinant Cell Lines,Biotechnol Bioeng 108(11)：2611-2622)。簡言之，FLARE用來分離並且單細胞鋪板使用FACS來自每個池的前3-5%的報告基因表現細胞。然後再次使用FLARE篩選擴大的選殖體(取前30%陽性表現者)，以僅鑑定一流選殖體(top tier clones)用於靶多肽效價評價的擴大。如第6圖所示，例如使用MTX擴增池(接近2.0g/L)，使表現名列前茅的產生EPIC的選殖體實現了與傳統方法的最佳選殖體相似的效價。結果表明在選擇之前使用EPIC分離早期表現群體是傳統轉染和選擇方法的可行替換方案。EPIC提供不依賴MTX的方法來實現類似於傳統MTX方法的選殖體效價，得到潛在更強健和更穩定的選殖體。或者，在選擇/擴大EPIC產生的亞群期間，EPIC也能夠引入MTX，具有驅動在這些富集的群體中甚至更高的表現的潛力。
實施例4：用於選殖體生成的細胞的早期轉染後分離(EPIC)-與其他方法的頭對頭比較
進行了綜合研究，以直接比較用於選殖體產生的EPIC過程(不依賴MTX)、快速批量過程(不依賴MTX)和標準MTX選擇過程(直接選擇過程)。每個過程進行三個獨立的實驗，每個實驗使用不同的重組蛋白(兩個單株抗體和一個Fc融合蛋白)。第8圖描繪了比較研究的一般方案，三個過程中的每一個從轉染細胞的單一來源池開始。
在“EPIC過程”中，在分選分離細胞表面報告基因陽性表現群體之前，允許一部分彙集的轉染細胞繼續再恢復兩天。將分選分離的細胞置於核苷酸缺乏培養基(無MTX)中擴大以產生穩定的EPIC池。在“快速批量過程”中，將一部分彙集的轉染的細胞置於核苷酸缺乏培養基(無MTX)中以產生群體，然後將該群體批量富集兩次(靶向前10%)，其藉由基於細胞表面報告基因表現水平的分選分離來進行，以快速批次#2池結束。在“直接選擇過程”中，將一部分彙集的轉染的細胞置於具有MTX的培養基中進行標準選擇程序。在選殖體生成之前，將得到的池在核苷酸缺乏培養基中傳代。每個小組(arm)表示一個獨立的製備適合於選殖體產生的細胞的穩定轉染的群體(池)的方法。
對於三個獨立過程中的每一個，在過程結束時產生的池用來使用如先前所述的FLARE產生選殖體(見，例如，Cairns,V.et al.(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a Flow Cytometric Method for Efficient Selection of Recombinant Cell Lines,Biotechnol Bioeng 108(11)：2611-2622)。簡而之，FLARE用來分離，並且單細胞鋪板使用FACS來自每個池的前3-5%的報告基因表現細胞。然後再次使用FLARE篩選擴大的選殖體(取前30%陽性表現者)，以僅鑑定一流選殖體用於擴大以供進行靶多肽效價的評 價。
第9圖顯示了使用三個獨立過程產生的選殖體的靶多肽(mAb # 1、mAb # 2或FcFusion # 1)效價的分佈。
mAb # 1和mAb # 2的結果清楚地表明，由EPIC和快速批量過程(兩者都不使用MTX)產生的選殖體具有與從標準MTX選擇過程產生的選殖體相似的生產力。對於Fc融合蛋白，來自EPIC過程的選殖體效價的範圍與來自快速批量(無MTX)和標準MTX選擇過程的範圍相似，除了在範圍的頂端，最好EPIC選殖體效價低於來自另外兩個過程的最好選殖體效價。儘管如此，EPIC過程仍產生效價高達1.8g/L的選殖體(在不受控制的(uncontrolled)分批培養中)。並且，來自快速批量過程(無MTX)的Fc融合蛋白選殖體實現了與來自MTX選擇過程的效價一樣高的效價。雖然用MTX選擇的過程時更高生產者的頻率更高，這可能表示MTX過程產生不太多樣化的選殖體組，可能具有類似轉基因整合的類似遺傳起源。或者，EPIC和快速批量方法(其是分選富集過程而不是藥物選擇/細胞死亡過程)可以產生具有不同轉基因整合位點的更多樣化的選殖體組，並因此具有更大範圍的生產力。當鑑定適於製造過程的細胞系時，選殖體多樣性的程度更高通常更優選。
此實施例也表明了藉由EPIC過程實現了顯著的時間節省。第10圖顯示從轉染到用於選殖體的池(黑色)和從池到最終選殖體(灰色)的天數。
關於從轉染到最終池的時間，EPIC過程產生池比標準MTX選擇過程快一個月。在該池生成步驟中，實現了最顯著的時間節省，使用此不依賴MTX的方法更快產生池，意味著整個CLD過程時間表減少1個月。
此實施例表明，與標準MTX選擇過程相比，不依賴MTX的EPIC方法可以產生具有相當生產力的選殖體，而且顯著減少了時間表。除了是一個更快的過程，與來自MTX過程的類似生產力的選殖體相比，MTX的缺乏 可得到更強健和穩定的選殖體。
實施例5：靶向細胞的早期轉染後分離(EPIC)的可變分選-EPIC瞬時分離陽性亞群
實驗企圖更好地理解EPIC如何工作。假設以在轉染後早期分選細胞為目標並分離高度陽性瞬時表現的亞群。然而，不能排除在這個時間框內靶向報告基因的表現也可以分離具有早期穩定整合的細胞(在細胞基因組中)，這將有助於產生顯著富集的EPIC池。進行兩個實驗來證明EPIC是來自分離瞬時表現亞群的結果。首先，在一段時間內對EPIC進行分選，以顯示在峰值瞬時表現(2至4天；見第2圖)期間的分離產生了最佳的EPIC池富集。
其次，在轉染後2天進行靶向EPIC的可變分選，目的是分離越來越多的陽性瞬時表現群體，繼而產生進一步富集的EPIC池。
使用第2天(峰值)瞬時表現群體，獨立分選靶向全部陽性瞬時表現群體(+)和更高度陽性的瞬時表現亞群(++)。這些數據確鑿地表明，分離更具陽性的瞬時亞群致使在產生的最終EPIC池中更大的富集。在轉染後的第2天，不會存在穩定整合表現的細胞，因為這是在瞬時表現的丟失和穩定表現的出現之前(第2圖)。因此，在該特定早期時間點的相關關係(第11A和11B圖)提供了EPIC池富集是直接由轉染後不久從峰值(或接近峰值)瞬時表現的瞬時亞群分離引起的證據。
<110> 健臻公司(Genzyme Corporation)
<120> 用於生物製劑生產之細胞早期轉染後分離(EPIC)
<130> 593805：SA9-197CTW
<150> US 62/405,392
<151> 2016-10-07
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核？酸
<400> 1
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核？酸
<400> 8
Claims (29)
- 一種產生表現靶多肽的生產者細胞的群體的方法，該方法包括：(a)以編碼一個或多個mRNA的載體轉染宿主細胞，其中該一個或多個mRNA係編碼可選擇多肽和該靶多肽；(b)在轉染後的2-4天之間，從轉染的宿主細胞中分離表現該可選擇多肽的早期表現轉染的宿主細胞之高度陽性瞬時表現亞群，其中該早期表現轉染的宿主細胞之高度陽性瞬時表現亞群包含就其等可選擇多肽的表現而言約前10%的轉染宿主細胞，且其中步驟(b)中的分離採用磁激活細胞分選(MACS)或螢光激活細胞分選(FACS)；和(c)擴大該分離之早期表現轉染的宿主細胞之高度陽性瞬時表現亞群，由此產生表現該靶多肽的生產者細胞的群體，其中步驟(b)和(c)各自在無藥物選擇培養基中進行。
- 如請求項1的方法，其進一步包括從該生產者細胞的群體中分離該靶多肽。
- 如請求項1的方法，其進一步包括從擴大的亞群中分離一個或多個單一轉染的宿主細胞，和培養該一個或多個單一轉染的宿主細胞以產生一個或多個單一轉染的宿主細胞的選殖群體。
- 如請求項3的方法，其中，與在步驟(c)中獲得之源自表現該靶多肽的生產者細胞的群體之轉染但未選殖的宿主細胞的穩定池(pool)相比，該一個或多個單一轉染的宿主細胞的選殖群體的至少一個在產生靶多肽上產生2-30倍的改善。
- 如請求項1的方法，其中在步驟(b)中經過分離的轉染的宿主細胞含有至少80-120 x 106個細胞。
- 如請求項1的方法，其中步驟(b)中的分離在轉染後4天進行。
- 如請求項1的方法，其中該步驟(b)中的分離在轉染後2-3天之間進行。
- 如請求項1的方法，其中該步驟(b)中的分離在轉染後2天進行。
- 如請求項1的方法，其中該步驟(b)中的分離在轉染後3天進行。
- 如請求項1的方法，其中在步驟(c)中的擴大之前，該轉染的宿主細胞的亞群含有0.5-6.0 x 106個細胞。
- 如請求項1的方法，其中該步驟(c)中的擴大持續4-31天之間。
- 如請求項1的方法，其中該一個或多個載體的第一個係編碼mRNA，該mRNA編碼該靶多肽，並且該一個或多個載體的第二個係編碼mRNA，該mRNA編碼該可選擇多肽。
- 如請求項1的方法，其中該編碼靶多肽的mRNA和該編碼可選擇多肽的mRNA兩者均在一個載體上編碼。
- 如請求項1的方法，其中步驟(b)中的分離採用磁激活細胞分選(MACS)、螢光激活細胞分選(FACS)或ClonePix。
- 如請求項1的方法，其中該可選擇多肽是FACS可選擇多肽，並且步驟(b)中的分離採用FACS。
- 如請求項1的方法，其中該靶多肽和該可選擇多肽形成融合多肽。
- 如請求項1的方法，其中該靶多肽和該可選擇多肽由單一多順反子mRNA編碼。
- 如請求項17的方法，其中該多順反子mRNA包含編碼該可選擇多肽的第一開放讀碼框(ORF)，和編碼該靶多肽的第二ORF，其中該第一ORF位於第二ORF的5’。
- 如請求項18的方法，其中該第一ORF具有非AUG起始密碼子。
- 如請求項19的方法，其中該非AUG起始密碼子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。
- 如請求項18的方法，其中該第二ORF具有AUG起始密碼子。
- 如請求項18的方法，其中該編碼可選擇多肽的ORF沒有任何AUG序列。
- 如請求項1的方法，其中該可選擇多肽是CD52或CD59。
- 如請求項1的方法，其中該靶多肽是治療劑。
- 如請求項1的方法，其中該靶多肽是分泌蛋白。
- 如請求項1的方法，其中該靶多肽是抗體或Fc融合蛋白。
- 如請求項1的方法，其中該宿主細胞是CHO細胞、HEK293細胞或HeLa細胞。
- 一種表現可選擇多肽和靶多肽之轉染的宿主細胞之選殖群體，其可藉由請求項1至27中任一項的方法獲得。
- 如請求項28的選殖群體，其中與(b)中的轉染的宿主細胞亞群相比，該選殖群體在產生靶多肽上產生2-30倍的改善。
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