CN117321200A - 评估病毒载体颗粒效力的方法 - Google Patents

评估病毒载体颗粒效力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117321200A
CN117321200A CN202280031773.9A CN202280031773A CN117321200A CN 117321200 A CN117321200 A CN 117321200A CN 202280031773 A CN202280031773 A CN 202280031773A CN 117321200 A CN117321200 A CN 117321200A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
reporter
viral vector
cells
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280031773.9A
Other languages
English (en)
Inventor
E·纳尔班迪安
R·阿明
N·海格
S·莫尔科夫斯基
C·德伊穆斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Juno Therapeutics Inc
Original Assignee
Juno Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Juno Therapeutics Inc filed Critical Juno Therapeutics Inc
Publication of CN117321200A publication Critical patent/CN117321200A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供了细胞、方法、试剂盒和制品，包括与评估病毒载体的效力有关的那些。本公开文本涉及用于筛选病毒载体效力的方法，所述病毒载体包括编码重组受体的载体，所述重组受体含有细胞外抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域，如嵌合抗原受体(CAR)。所述方法包括基于一种或多种报告分子的可检测或可测量的表达或活性来评估病毒载体的效力，所述一种或多种报告分子对通过T细胞受体例如重组受体的细胞内信号传导区的信号有响应。

Description

评估病毒载体颗粒效力的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月22日提交的美国临时申请63/164,532的优先权，出于所有目的将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2022年3月21日创建的名为73504_2023240_SEQLIST.TXT的文件提供，其大小为57,897字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本涉及用于筛选病毒载体的一种或多种效力的方法，所述病毒载体包括编码重组受体的载体，所述重组受体含有细胞外靶标结合结构域和细胞内信号传导结构域，如嵌合抗原受体(CAR)。所述方法包括基于报告分子(如报告酶)的可检测或可测量的表达或活性来评估或测定病毒载体的效力，所述报告分子对通过T细胞受体(例如，重组受体)的细胞内信号传导区的信号有响应。在一些实施方案中，所述方法可用于筛选多种病毒载体，每种病毒载体含有编码候选重组受体(例如，CAR)的核酸分子，并评估这样的载体或多种载体的效力。这些方法可以是高通量的。还提供了报告细胞(如报告T细胞)、细胞组合物以及用于所述方法中的试剂盒。
背景技术
需要改进的策略来确定载体效力，其中当前的方法成本高昂，不精确且不易重现。用于测量载体效能的当前方案中的缺陷导致许多转导细胞(用于治疗癌症、传染性疾病和自身免疫性疾病)之间的不希望的显著变化，包括与过继免疫疗法有关的变化。提供了用于在满足此类需求的方法中使用的方法和细胞。
发明内容
本文提供了用于确定病毒载体的效力的方法，所述方法包括：a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；所述重组受体包含对靶标具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域，并且包含具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区或与其复合；b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及d)基于所测量的可检测信号确定产生指定(例如，半最大)可检测信号的测试病毒载体的滴定量。在一些实施方案中，所述靶标是所述重组受体的抗原。
在一些实施方案中，本文提供了用于确定病毒载体的效力的方法，所述方法包括：a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；所述重组受体包含对抗原具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域并且包含具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区或与其复合；b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及d)基于所测量的可检测信号确定产生指定(例如，半最大)可检测信号的测试病毒载体的滴定量。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述效力是相对效力，并且所述方法还包括在同一测定中，将所述测试病毒载体的指定(例如，半最大)可检测信号与参考病毒载体标准品的指定(例如，半最大)可检测信号进行比较。
本文还提供了用于确定病毒载体的效力的方法，所述方法包括：a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；所述重组受体包含对靶标具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域以及具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区；b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及d)基于所测量的可检测信号，通过在同一测定中将所述测试病毒载体的指定(例如，半最大)可检测信号与参考病毒载体标准品的指定(例如，半最大)可检测信号进行比较来确定所述测试病毒载体的相对效力。在一些实施方案中，所述靶标是所述重组受体的抗原。
本文还提供了用于确定病毒载体的效力的方法，所述方法包括：a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；所述重组受体包含对抗原具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域以及具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区；b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及d)基于所测量的可检测信号，通过在同一测定中将所述测试病毒载体的指定(例如，半最大)可检测信号与参考病毒载体标准品的指定(例如，半最大)可检测信号进行比较来确定所述测试病毒载体的相对效力。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述相对效力是测试病毒载体的可检测信号与参考病毒载体标准品的可检测信号的百分比。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述相对效力是测试病毒载体的可检测信号与参考病毒载体标准品的可检测信号的比率。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述测试病毒载体的滴定量是对所述病毒载体进行连续稀释。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述病毒载体的连续稀释是基于载体体积的连续稀释。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述连续稀释是基于载体滴度的连续稀释。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述病毒载体滴度是功能滴度，任选地其中通过体外噬斑测定法定量所述功能滴度。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述病毒载体滴度是物理滴度，任选地其中经由DNA或RNA定量、通过PCR方法定量所述物理滴度。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述病毒载体滴度被定量为感染单位(IU)/单位病毒载体体积。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述连续稀释是基于病毒载体的感染复数(MOI)的连续稀释。在任何所提供的实施方案中的一些中，在适于感染的培养条件下，经由病毒载体滴度(任选地功能滴度)对每数目的受纳细胞的MOI进行定量。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述测试病毒载体的量是病毒载体浓度与报告T细胞群体中细胞数量的比率。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述测试病毒载体的滴定量是恒定量的病毒载体浓度与报告T细胞群体中细胞数量的比率。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的体积。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的滴度。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的MOI。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述MOI在约0.001与10个颗粒/细胞之间，任选地为或为约0.01、为或为约0.1、为或为约1.0、或者为或为约10个颗粒/细胞、或任何前述值之间的任何值。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述报告T细胞是永生化细胞系。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述报告T细胞是Jurkat细胞系或其衍生物。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述Jurkat细胞系或其衍生物是Jurkat细胞克隆E6-1。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述调节元件包含由所述转录因子识别的一个或多个响应元件，所述转录因子在通过由所述重组受体刺激剂诱导的重组受体的含ITAM结构域进行信号传导后被激活。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述T细胞转录因子选自Nur77、NF-κB、NFAT或AP1。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述T细胞转录因子是Nur77。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述转录调节元件包含含有由转录因子识别的一个或多个响应元件的Nur77启动子或其部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述转录调节元件是T细胞中的内源Nur77基因座内的转录调节元件。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码所述报告分子的核酸序列整合在报告T细胞的基因组中的编码Nur77的内源基因座处或附近，其中所述报告分子与内源Nur77基因座的转录调节元件可操作地连接。在任何所提供的实施方案中的一些中，将编码所述报告分子的核酸序列通过以下方式整合：a)在编码Nur77的内源基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导遗传破坏；和b)引入包含编码所述报告分子的核酸的模板多核苷酸，以通过同源定向修复(HDR)将所述报告分子敲入内源基因座中。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述遗传破坏由特异性结合、识别或杂交至靶位点的CRISPR-Cas9组合诱导。在任何所提供的实施方案中的一些中，RNA指导的核酸酶包含具有与所述靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码所述报告物的核酸存在于基因组内的编码Nur77的内源基因座的最后一个外显子处或附近的位点处。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述一个或多个靶位点包括基因组内的如下位点和/或所述核酸存在于基因组内的如下位点，所述位点包含核酸序列TCATTGACAAGATCTTCATG(SEQ ID NO:3)和/或GCCTGGGAACACGTGTGCA(SEQ ID NO:4)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述报告分子是或包括萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其修饰形式。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述报告分子是萤光素酶，任选地是萤火虫萤光素酶。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码所述报告分子的核酸序列还编码一种或多种标记，所述一种或多种标记是或包括转导标记和/或选择标记。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述转导标记包括荧光蛋白，任选地eGFP。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述参考病毒载体标准品是代表与测试病毒载体同一生产过程的经验证的病毒载体批次。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述参考病毒载体标准品是根据良好生产规范(GMP)生产的病毒载体批次。在任何所提供的实施方案中的一些中，对所述参考病毒载体标准品的评估与测试病毒载体在所述测定中平行进行。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其信号传导部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述细胞内信号传导结构区还包含共刺激信号传导区。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述共刺激信号传导区包括CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体是工程化的T细胞受体(eTCR)。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是结合分子，所述结合分子是或包括所述重组受体的靶抗原或其细胞外结构域结合部分，任选地重组抗原。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述结合分子是或包括所述抗原的细胞外结构域结合部分，并且所述细胞外结构域结合部分包含由所述重组受体识别的表位。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是或包括对所述重组受体的细胞外靶标结合结构域具有特异性的结合分子。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是或包括对所述重组受体的细胞外靶标结合结构域具有特异性的抗体。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是或包括结合分子，所述结合分子是对所述重组受体的细胞外抗原结合结构域具有特异性的抗独特型抗体。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是或包括结合分子，所述结合分子是对所述重组受体的细胞外抗原结合结构域具有特异性的抗独特型抗体。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂被固定或附着于固体支持物上。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述固体支持物是器皿的表面，任选地是微孔板的孔，在其中进行多个孵育。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述固体支持物是珠。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述珠来自组合物，所述组合物具有如下浓度的所述结合分子：在或在约0.5μg/mL与500μg/mL之间，包含端值，任选地为或为约5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL或200μg/mL、或前述值之间的任何值。在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述珠以报告T细胞与所述珠的比率为或为约5:1至1:5(包含端值)添加。在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述珠以报告细胞与所述珠的比率为或为约3:1至1:3或2:1至1:2添加。在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述珠以报告细胞与所述珠的比率为或为约1:1添加。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是靶标表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系或是取自受试者的原代细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述靶标表达细胞是细胞系。在一些实施方案中，所述靶标是重组受体的抗原，因此在一些情况下，所述靶标表达细胞是抗原表达细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述靶标表达细胞是已任选地通过转导而经引入以表达重组受体的靶标的细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述靶标表达细胞以抗原表达细胞与报告T细胞的比率为或为约1:1至10:1添加。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述靶标表达细胞以靶标表达细胞与报告T细胞的比率为或为约1:1至6:1添加。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述重组受体刺激剂是抗原表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系或是取自受试者的原代细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述抗原表达细胞是细胞系。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述细胞系是肿瘤细胞系。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述抗原表达细胞是已任选地通过转导而经引入以表达重组受体的抗原的细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述抗原表达细胞以抗原表达细胞与报告T细胞的比率为或为约1:1至10:1添加。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述抗原表达细胞以抗原表达细胞与报告T细胞的比率为或为约1:1至6:1添加。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述多个孵育在烧瓶、管或多孔板中进行。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述多个孵育各自在多孔板的孔中单独进行。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述多孔板是96孔板、48孔板、12孔板或6孔板。
在任何所提供的实施方案中的一些中，使用读板仪测量所述可检测信号。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述可检测信号是萤光素酶发光，并且所述读板仪是发光计读板仪。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些任何所提供的实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述慢病毒载体源自HIV-1。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述可检测信号是萤光素酶发光。
附图说明
图1A显示示例性的载体效力测定，其中在添加萤光素酶底物之前，将转导的报告细胞与抗原表达靶细胞一起孵育一段时间。
图1B描绘了在激活激动剂和底物的存在下，在产生的含有Nur77-萤光素酶-EGFP敲入报告物的几个示例性Jurkat报告细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达和萤光素酶促活性的测试结果。图1C显示在PMA/离子霉素浓度渐减的情况下，在示例性Jurkat报告细胞中萤光素酶活性的剂量依赖性曲线。
图2A描绘了用于载体效力测定的示例性3板测定形式。
图2B描绘了示例性测试样品的示例性剂量响应曲线，其中载体体积(以微升计)绘制在x轴上，相对光单位(RLU)绘制在y轴上，后者与载体功能成正比。
图2C显示测试样品和参考样品的剂量响应曲线，以及与参考标准品的EC50相比的测试样品的50％有效浓度(EC50)。
图2D显示用CD19靶向性CAR转导的细胞的另一示例性剂量响应曲线。
图3描绘了用BCMA靶向性CAR转导的细胞的示例性剂量响应曲线，其中载体MOI(IU/细胞)绘制在x轴上，相对光单位绘制在y轴上。
图4A描绘了用于所述效力测定的计算的最佳拟合线，其中图4B中显示相应的残差分布。
图5描述了所提供的效力测定的特异性，如通过来自参考标准品的可检测信号而非来自非特异性载体的可检测信号所确定的，如通过测量相对光单位(RLU)所确定的。
图6显示所提供的效力测定的稳定性指示特异性，如通过在至少一种强制应激条件后评估病毒载体的载体效力所确定的。结果表明载体效力降低，这表明所述测定的特异性为稳定性指示。
图7描绘了由不同的操作员执行的4个独立测定的示例性读取结果。
具体实施方式
本文提供了用于评估或确定病毒载体(如用于转导报告细胞(例如，报告细胞组合物)的病毒载体)的相对效力的方法。所提供的实施方案涉及使用工程化报告细胞的方法，所述工程化报告细胞如那些被工程化以表达重组蛋白(如表达重组受体)的细胞。所述受体可以包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)；和其他转基因抗原受体，包括转基因T细胞受体(TCR)。
在一些情况下，所提供的实施方案(包括细胞、方法、试剂盒和制品)可以适合于评估不同类型的病毒载体的效力。在一些实施方案中，所述方法可以用于评估多种病毒载体组合物(例如，具有不同特性或效力的多种病毒载体组合物)的效力。
在一些实施方案中，所述方法使用含有报告物(如报告酶)的转导的报告细胞(例如，报告T细胞)，所述报告物对通过重组受体的细胞内信号传导区、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域的信号(如T细胞中的初级激活信号)有响应。在一些实施方案中，报告细胞(例如，报告T细胞)具有对通过受体(在一些实施方案中，为重组受体)的细胞内信号传导区的信号有响应的报告物。在一些实施方案中，所述方法涉及使用这样的细胞。在一些实施方案中，报告T细胞包含与编码Nur77的内源基因座的转录调节元件可操作地连接的编码一种或多种报告分子的核酸序列。在一些实施方案中，报告T细胞含有在内源Nur77基因座处敲入的一种或多种报告分子，使得所述一种或多种报告分子的表达受Nur77基因的内源转录调节元件控制。
基于细胞的疗法(包括过继T细胞疗法，如涉及施用表达对目的疾病或障碍具有特异性的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR)和/或其他重组抗原受体)的细胞的那些疗法，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法)可以有效地治疗癌症以及其他疾病和障碍。对于细胞疗法和基因疗法，一个生产方面是用于将目的基因引入细胞中以向患者施用或作为治疗性组合物直接给患者施用的载体。病毒载体的生产及其在下游疗法中的使用所固有的是病毒载体的复杂性，需要进行过程中表征以限制批次间的可变性。在某些情况下，评估此类载体的效力的可用方法在良好生产规范(GMP)框架内在成本、再现性、精密度或实用性的一个或多个方面可能不令人满意。
当前用于测量载体效力的技术不稳定，成本高昂且可重现性差。与常规生物制品不同，病毒载体包含蛋白质和核酸组分两者。因此，存在许多可以靶向病毒基因组或病毒蛋白的检测方法。表征病毒载体的方法包括通过本领域已知的手段确定物理病毒滴度，如DNA杂交、实时PCR(qPCR、ddPCR)、光密度(A260/280)、NanoSight和HPLC。在一些方面，定量PCR(qPCR)可以作为转基因表达的手段来用于测量载体效力。qPCR依赖质粒DNA标准曲线来计算病毒滴度，这可能导致批次之间的差异。微滴式数字PCR(ddPCR)不能从标准曲线定量，但是PCR靶序列的选择以及引物的设计可能会对任何基于PCR的策略的稳健性产生重大影响。酶联免疫吸附测定(ELISA)可以用于测量样品中存在的病毒蛋白，但其依赖于适当血清型抗体的可用性。由于分子测定受到许多实验因素的影响，这些实验因素可能直接影响滴度/和/或效力计算的准确度，因此物理滴度通常会发生很大的变化。对这些实验因素的标准和控制是至关重要的，因为通常观察到批次之间病毒载体制造的可变性。
在一些方面，还可以通过测量病毒组合物的感染滴度或功能滴度来评估病毒载体。感染滴度可以通过本领域技术人员已知的许多基于细胞的测定来测量，包括噬斑测定、荧光灶测定、终点稀释测定(TCID50)或其他基于细胞的测定。通常，这些基于细胞的测定具有高度产物特异性，因为用病毒载体转染指示细胞或报告细胞，并且测量转基因的表达(例如，RT-PCR、ELISA或FACS)。在一些方面，对于慢病毒或逆转录病毒载体，功能滴度表示为转导单位/mL(TU/mL)。类似地，载体滴度通常也可以表示为噬斑形成单位/mL(PFU/mL)或感染单位/mL(IFU/mL)。后一个术语用于不裂解细胞膜的病毒载体，因此与基于标准板的噬斑测定不相容。然而，功能滴度通常需要花费大量时间来确定，并且通常被认为在中间或开始阶段或病毒载体产生期间不适用。
在一些方面，在多种基于细胞的测定中确定了病毒载体效力，但是测定的输出可以变化。例如，在一些情况下，通过确定CAR表达的程度或百分比或者评估细胞因子产生来评估病毒载体的效力。在一些实施方案中，这样的测定可以持续很长时间，和/或可以经受高可变性(例如，预测20％-30％)。此外，许多现有的测定没有以相对的形式进行，因此不考虑日常的可变性。这意味着许多现有病毒载体效力测定的风险在于，即使相同的测试病毒载体，结果也可能根据测定而变化。
病毒载体分析的另一个重要考虑因素是相对较小的批量，这限制了材料足以用于方法开发、测定资格/验证和稳定性测试的可用性。与常规生物制品(如单克隆抗体)的制造相比，病毒载体制造过程中制造的材料要少得多(King等人“Viral VectorCharacterization:A Look at Analytical Tools”CellCultureDish.Com,2018年10月)。因此，需要提供一种评估病毒载体效力的更有效的方法。在一些方面，所提供的方法允许更容易、快速且可靠地确定效力。
因此，在一些情况下，有效且可靠地评估病毒载体效力的能力可以是产生基于细胞和基因的疗法的有用工具。还需要改进的策略来评估由不同制造批次和不同过程(包括以相对快速且可靠的方式)产生的病毒载体的效力。所提供的方法可以用于评估用于细胞疗法(包括T细胞疗法)工程化中的遗传物质的释放。
所提供的用于评估病毒载体效力的实施方案在与病毒载体相关时特别有用，所述病毒载体用于将某些转基因递送至T细胞，所述转基因编码重组受体(如CAR)，所述重组受体含有T细胞受体(TCR)组分的细胞内信号传导结构域和/或具有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。所提供的报告细胞含有与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的报告分子，所述报告分子在刺激这种信号传导结构域后对信号传导诱导的转录因子有响应。在一些实施方案中，可以在存在或不存在与T细胞受体的结合结构域结合的重组受体刺激剂和/或诱导或能够诱导通过受体的细胞内信号传导区的信号的试剂的情况下，在报告T细胞孵育之后，评估一个或多个报告细胞的表达以及其他参数。
在一些情况下，所提供的实施方案基于以下观察结果：内源Nur77基因的表达是细胞固有的和/或基本上不受其他信号传导通路(如细胞因子信号传导或toll样受体(TLR)信号传导)的影响(参见例如，Ashouri等人,(2017)J.Immunol.198:657-668)，其可以以细胞外源性方式起作用并且可以不依赖于通过重组受体进行的信号传导。在一些情况下，Nur77表达对T细胞中的初级激活信号、来自T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域的信号和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域敏感。在一些情况下，Nur77报告物的响应是对通过信号传导区的信号有剂量响应性。此外，在一些实施方案中，所提供的报告T细胞含有编码一种或多种报告分子的敲入内源Nur77基因座中的核酸序列，从而提供可以产生一致结果的稳定的报告细胞系，例如，不依赖于随机基因组整合的位置或者报告物的拷贝数和/或丢失。这样的报告细胞可以用于筛选众多病毒载体的效力，同时保持一致的读取结果。
在特定实施方案中，所述测定用报告细胞进行，其中所述报告分子是酶，如萤光素酶。使用基于酶的测定(如基于发光的测定)的优点在于，它可以输出多个记录范围的信号，而基于荧光的报告物通常不够亮不能提供这样的定量范围。此外，基于发光的检测方法还可以提供高灵敏度和低背景强度。另外，萤光素酶或其他酶在板基上更可容，并且可以在溶液中进行测量，从而提供快速读数的可能性。此外，由于T细胞转录因子(特别是由Nur77报告系统提供的)诱导信号的剂量响应性以及基于发光的报告物的高灵敏度和宽检测范围，所以所提供的方法允许较宽的线性范围，其包括病毒载体的效力的真实线性范围。所提供的测定的这些特征提供了测量病毒载体效力的现有方法所无法实现的优点。
本文提供的方法被设计为更全面地评估病毒载体的相对效力。本文提供的方法被设计为提供病毒载体效力的更生物学相关的测量。在一些实施方案中，根据本文所述的方法确定的病毒载体组合物的效力可以提供对制造控制和/或可变性的改进的测量，继而可以允许用于基因工程中的载体释放的改进的评估(包括评估载体稳定性)。
在一些实施方案中，本文提供的方法减少或消除可变性的来源。例如，本文提供的方法对于可能由于板位置偏差、操作员偏差和/或日常采样或测试而出现的可变性是稳健的。在一些情况下，消除可变性(如由于板位置偏差、操作员偏差和/或采样或测试引起的可变性)允许对病毒载体批次组合物进行比较。
本文提供的方法包括包含一系列孵育的测定形式，其中将不同滴定比例的病毒载体引入报告细胞组合物的细胞中，以评估由重组受体刺激剂(例如，结合分子)诱导的报告信号。在一些实施方案中，效力的测量包括报告分子的可检测信号的测量，所述报告分子在多个滴定比率的病毒载体下通过重组受体刺激剂(例如结合分子)与重组受体的结合而受到刺激。所述方法在不同滴定比率的病毒载体下评估报告物活性的能力允许确定、估计和/或外推病毒载体批次对重组受体(即，抗原)特异性刺激的效力。在一些实施方案中，测量的范围可以用于提取、估计和/或确定病毒载体的效力，如通过特定报告细胞组合物中的工程化细胞如何响应不同水平的重组受体刺激(即，滴定的载体)所测量的。
在一些实施方案中，病毒载体的效力表示为基于报告分子的可检测信号(例如发光)确定的病毒载体的滴定比率和/或量或浓度(例如滴度)或体积的值或测量值。在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是滴定比率的值或测量值，和/或出现可检测信号(例如发光信号)的指定值(例如，半最大值(例如，最大活性的50％))时的病毒载体的量或浓度或体积。在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现可检测信号的指定值(例如，半最大值(例如，最大活性的50％))时的滴定比率。在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现可检测信号(例如发光信号)的指定(例如，半最大)值时的病毒载体的浓度。在一些实施方案中，所述方法是基于体积的滴定，并且所述病毒载体组合物的效力是出现重组受体依赖性活性的指定(例如，半最大)值时的特定病毒载体批次的体积。在一些实施方案中，根据来自报告细胞中存在的报告分子的测量的可检测信号，所述可检测信号(例如发光)的指定(例如，半最大)值反映出现报告T细胞的指定有效刺激(例如，50％有效刺激(ES50))时的病毒载体的滴定比率、浓度(例如滴度)和/或体积。
在一些实施方案中，病毒载体的效力表示为基于报告分子的可检测信号(例如发光)确定的病毒载体的滴定比率和/或量或浓度(例如滴度)或体积的值或测量值。在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是滴定比率的值或测量值，和/或出现可检测信号(例如发光信号)的指定值(例如，半最大值(例如，最大活性的50％))时的病毒载体的量或浓度或体积。在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现可检测信号的指定值(例如，半最大值(例如，最大活性的50％))时的滴定比率。在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现可检测信号(例如发光信号)的指定(例如，半最大)值时的病毒载体的浓度。在一些实施方案中，所述方法是基于感染复数(MOI)的滴定，并且所述病毒载体组合物的效力是出现重组受体依赖性活性的指定(例如，半最大)值时的特定病毒载体批次的IU/细胞比率。在一些实施方案中，根据来自报告细胞中存在的报告分子的测量的可检测信号，所述可检测信号(例如发光)的指定(例如，半最大)值反映出现报告T细胞的指定有效刺激(例如，50％有效刺激(ES50))时的病毒载体的滴定比率、浓度(例如MOI)和/或IU/细胞比率。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是相对效力。例如，可以将测量病毒载体的半最大可检测信号时的滴定比率与测量参考标准品或对照病毒载体的半最大可检测信号时的滴定比率进行比较。应当理解，如果适用，可以使用病毒载体的浓度或量或体积或MOI来代替滴定比率。在一些实施方案中，参考标准品或对照是具有在所述测定中出现指定(例如，半最大)可检测信号时的已知和/或经验证的滴定比率的病毒载体。在一些实施方案中，参考标准品或对照是可商购的病毒载体，其已经确定了出现指定(例如，半最大)可检测信号时的滴定比率，例如使用如本文所述的方法。在一些实施方案中，参考标准品或对照是不同的病毒载体，其已经确定了出现指定(例如，半最大)可检测信号时的滴定比率，例如使用如本文所述的方法。在一些实施方案中，不同的病毒载体组合物含有编码与测试病毒载体结合相同靶标的相同重组受体的核酸。在一些实施方案中，参考病毒载体标准品是从被确定为代表测试病毒载体的制造过程的过程制造的。在一些实施方案中，参考病毒载体标准品为GMP(良好生产规范)等级。在一些实施方案中，相对效力是通过将导致测试病毒载体的指定(例如，半最大)值的滴定比率除以导致参考标准品或对照的指定(例如，半最大)值的滴定比率而确定的比率。在一些实施方案中，相对效力是通过将导致测试病毒载体组合物的指定(例如，半最大)值的滴定比率除以导致参考标准品的指定(例如，半最大)值的滴定比率并乘以100而确定的百分比。
本文提供的用于评估病毒载体组合物的效力的方法(包括测定)允许比较不同的病毒载体组合物(包括参考标准品)。比较病毒载体组合物的能力提供了如下方法，所述方法不仅用于鉴定具有改进的、最佳的和/或一致的效力的病毒载体组合物，而且还：鉴定用于进一步开发和/或分析的候选病毒载体组合物；鉴定产生具有改进的或最佳效力的病毒载体组合物的制造过程和程序；鉴定产生具有一致效力的病毒载体组合物的制造程序或过程；和/或估计制造程序固有的可变性。在特定实施方案中，所述方法可以用于释放测定中，以确认病毒载体遗传物质适合于与使用重组受体(例如CAR)的工程化细胞疗法方法结合使用。
将在本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。I.用于评估病毒载体效力的方法
本文提供了评估测试病毒载体(如编码重组受体(例如，CAR)的病毒载体)的效力的方法。本文提供了含有使用测试病毒载体转染以表达重组受体(例如，CAR)的T细胞(例如，CD3+、CD4+、CD8+T细胞)的报告T细胞组合物，其中所述测试病毒载体的效力是使用包括多个孵育的测定来测量的，其中所述多个孵育中的每一次包括培养所述报告细胞组合物的细胞，所述报告细胞组合物含有被工程化以表达重组受体与重组受体刺激剂的细胞，所述重组受体刺激剂例如抗原、抗原表达细胞、或能够与所述重组受体结合的其他结合结构域，并且其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述报告细胞中的可检测信号。在一些实施方案中，可检测信号是酶促的，如将可用底物转化为可检测产物的酶的表达，即萤光素酶反应。
本文提供的用于确定效力的方法可以重复进行。例如，可以进行2、3、4、5次或更多次测定。在一些实施方案中，重复被用于确认所述测定的准确度和/或精密度，包括可检测信号的测量的一致性和/或测试病毒载体的确定的效力和/或相对效力。在一些实施方案中，通过对一式两份或一式三份的特定测试病毒载体进行测定来实施单一测定。在一些实施方案中，测定以一式两份进行。在一些实施方案中，测定以一式三份进行。在所述测定例如以一式两份或一式三份进行的一些情况下，使用来自所述重复中的每一个的所测量的可检测信号来提供所测量的可检测信号的统计测量。例如，在一些情况下，确定可检测信号的每次测量的平均值、中位数、标准差和/或方差。在一些实施方案中，确定可检测信号的每次测量的平均值。在一些实施方案中，确定可检测信号的每次测量的标准差。在一些实施方案中，使用数学模型拟合可检测信号的平均测量值，以产生可检测信号的曲线。在一些实施方案中，将所述曲线相对于平均最大值进行归一化。在一些实施方案中，在所述测定中产生半最大可检测信号的平均滴定比率就是测试病毒载体的效力。在一些实施方案中，测试病毒载体的效力是通过以下方式确定的相对效力：获得在测定中产生半最大可检测信号的平均滴定比率，并将平均滴定比率与在参考病毒载体中产生半最大可检测信号的单一或平均滴定比率进行比较。在一些实施方案中，相对效力是测试病毒载体的平均效力除以参考病毒载体的单一或平均效力。在一些实施方案中，相对效力表示为比率。在一些实施方案中，相对效力表示为百分比。
A.将滴定的病毒载体引入报告细胞
在一些实施方案中，产生多个报告T细胞群体，其中向报告组合物的恒定数量的细胞中引入(如转导)不同或滴定量的测试病毒载体，以产生多个不同的滴定比率。在一些实施方案中，多个报告T细胞群体中的每一个含有不同滴定量的病毒载体，如不同比例、浓度或体积或MOI的测试病毒载体。在一些实施方案中，通过向报告细胞的恒定数量的细胞中引入不同量、浓度、MOI或体积的测试病毒载体以产生多个不同的滴定比率，来生成多个报告T细胞群体中的每一个。
在一些实施方案中，滴定量的测试病毒载体是病毒载体的连续稀释。例如，在多个报告细胞群体中的每一个中评估病毒载体的一系列连续稀释量(例如体积、滴度或MOI)。在一些实施方案中，病毒载体的连续稀释是基于载体体积的连续稀释。在一些实施方案中，连续稀释是基于病毒载体滴度的连续稀释。
在一些实施方案中，滴定量是恒定量的测试病毒载体与多个报告细胞群体中的每一个中细胞数量的比率。
表征病毒载体的方法包括确定物理病毒滴度，如通过多种已知方法中的任一种，如通过DNA杂交或PCR方法(如实时PCR(qPCR、ddPCR))、光密度(A260/280)、NanoSight和HPLC。在一些实施方案中，物理滴度可以通过PCR方法对病毒RNA或DNA进行定量来完成。在一些方面，定量PCR(qPCR)可以作为转基因表达的手段来用于测量载体效力。qPCR依赖质粒DNA标准曲线来计算病毒滴度，这可能导致批次之间的差异。微滴式数字PCR(ddPCR)不能从标准曲线定量，但是PCR靶序列的选择以及引物的设计可能会对任何基于PCR的策略的稳健性产生重大影响。酶联免疫吸附测定(ELISA)可以用于测量样品中存在的病毒蛋白，但其依赖于适当血清型抗体的可用性。由于分子测定受到许多实验因素的影响，这些实验因素可能直接影响滴度/和/或效力计算的准确度，因此物理滴度通常会发生很大的变化。对这些实验因素的标准和控制是至关重要的，因为通常观察到批次之间病毒载体制造的可变性。在一些实施方案中，病毒载体滴度是物理滴度。
在一些方面，还可以通过测量病毒组合物的感染滴度或功能滴度来评估病毒载体。感染滴度可以通过本领域技术人员已知的许多基于细胞的测定来测量，包括噬斑测定、荧光灶测定、终点稀释测定(TCID50)或其他基于细胞的测定。通常，这些基于细胞的测定具有高度产物特异性，因为用病毒载体转染指示细胞或报告细胞，并且测量转基因的表达(例如，RT-PCR、ELISA或FACS)。在一些方面，对于慢病毒或逆转录病毒载体，功能滴度表示为转导单位/mL(TU/mL)。类似地，载体滴度通常也可以表示为噬斑形成单位/mL(PFU/mL)或感染单位/mL(IU/mL)。后一个术语用于不裂解细胞膜的病毒载体，因此与基于标准板的噬斑测定不相容。然而，功能滴度通常需要花费大量时间来确定，并且通常被认为在中间或开始阶段或病毒载体产生期间不适用。在一些实施方案中，病毒载体滴度是功能滴度。在一些实施方案中，病毒载体滴度以IU/mL定量。
在一些实施方案中，病毒载体的连续稀释是基于病毒载体的感染复数(MOI)的连续稀释。在一些实施方案中，连续稀释是基于病毒载体滴度的连续稀释。在一些方面，病毒载体的MOI可以被确定为病毒载体颗粒与群体中存在的细胞的比率(例如，测试病毒载体颗粒与受纳细胞群体中的细胞的比率)。在一些方面，病毒载体颗粒的定量可以经由滴度进行定量。在一些实施方案中，使用功能滴度来定量MOI。在一些方面，功能滴度可以使用上述方法确定，包括噬斑测定或本领域已知的其他体外感染测定。
在一些实施方案中，进行为或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个孵育，每个孵育含有不同比例的测试病毒载体与报告细胞，即，基于体积或IU/细胞比率的滴定量。在一些实施方案中，进行为或至少3个系列的滴定，每个系列的滴定包括向报告细胞中引入测试病毒载体的不同连续稀释物。在一些实施方案中，进行为或至少6个系列的滴定，每个系列的滴定包括向报告细胞中引入测试病毒载体的不同连续稀释物。在一些实施方案中，进行为或至少10次连续稀释，每一次包括向报告细胞中引入测试病毒载体的不同连续稀释物。
在一些实施方案中，用于确定病毒载体的效力的方法包括：a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入(例如转导)多个报告T细胞的群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个被引入(例如转导)不同量的滴定的测试病毒载体，其中：每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列，并且其中所述重组受体包含对抗原具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域并且包含具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区或与其复合。在提供的实施方案中，所述方法还包括在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组生产者的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号。在所提供的方法中，所述方法包括测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号，然后基于所测量的可检测信号来确定导致半最大可检测信号的测试病毒载体的滴定量。
在一些实施方案中，将导致半最大可检测信号的滴定量与导致参考标准品(如参考病毒载体)中的半最大可检测信号的滴定比率进行比较。例如，将导致半最大可检测信号的测试病毒载体的滴定比率除以导致参考病毒载体中的半最大可检测信号的滴定比率(例如根据本文所述的方法所确定的)，以产生相对效力。在一些实施方案中，相对效力表示为比率。在一些实施方案中，相对效力表示为百分比。
在一些实施方案中，本文提供了用于确定病毒载体的效力的方法，所述方法包括将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入(例如转导)多个报告T细胞的群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个被引入(例如转导)不同量的滴定的测试病毒载体，其中每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列，并且其中所述重组受体包含对抗原具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域以及具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区。在提供的方法中，所述方法还包括在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组生产者的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号。在所提供的方法中，所述方法还包括测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及基于所测量的可检测信号，通过在同一测定中比较所述半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号来确定所述病毒测试病毒载体的相对效力。
本文提供的测定可以在适于多个孵育的任何一个或多个器皿中进行。在一些实施方案中，测定在多孔板中进行。
引入(例如转导)报告细胞组合物和病毒载体的条件可以包括特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间和/或试剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子)中的一种或多种。引入病毒载体(如转导)的持续时间被预期为至少与病毒载体引入报告细胞(例如，如第1.A.3节中所述的转导)的最小时间量相称。在一些实施方案中，引入(例如转导)进行为、为约或至少24、36、48、60或72小时。在一些实施方案中，引入(例如转导)进行为、为约或至少24或48小时。在一些实施方案中，引入(例如转导)进行为或为约24小时与为或为约72小时之间。在一些实施方案中，引入(例如转导)进行为或为约24小时与为或为约48小时之间。
在一些实施方案中，引入(例如转导)在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃，例如为或为约37℃±2℃的温度下进行。在一些实施方案中，引入(例如转导)在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或为约5％±0.5％的CO2水平下进行。在一些实施方案中，引入(例如转导)在为或为约37℃的温度下和/或在为或为约5％的CO2水平下进行。
1.报告细胞
本文提供了细胞、方法、载体、多核苷酸、多个细胞、多个多核苷酸、试剂盒和制品，包括与评估病毒载体的效力有关的那些，如评估重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的活性的方法。
在一些实施方案中，提供了用于评估病毒载体的效力的细胞，如报告T细胞。在一些实施方案中，报告T细胞包含一种或多种报告分子，其中一种或多种报告分子的表达对通过T细胞受体的细胞内信号传导区的信号有响应。在一些实施方案中，所提供的细胞包括报告T细胞。在一些实施方案中，报告T细胞含有与Nur77的转录调节元件或其变体可操作地连接的编码报告分子的核酸序列，其中所述转录调节元件任选地是T细胞中的内源Nur77基因座内的转录调节元件。在一些方面，所提供的细胞(如所提供的报告T细胞)含有与转录调节元件(如编码Nur77的内源基因座的转录调节元件)可操作地连接的编码一种或多种报告分子的核酸序列。在一些实施方案中，所提供的细胞可以用于评估一种或多种病毒载体的活性，例如，用于筛选多种载体或载体文库编码的候选受体。
所提供的实施方案还包括评估病毒载体的转导效率的方法，如使用所提供的细胞或构建体中的任一种的那些方法。在一些实施方案中，载体含有编码重组受体的核酸。在一些实施方案中，重组受体是CAR。在一些实施方案中，所述方法包括孵育一个或多个报告T细胞，如各自包含以下项的T细胞：i)重组受体，如作为包含细胞内信号传导区的CAR的重组受体，以及ii)一种或多种报告分子，其中所述一种或多种报告分子的表达对通过重组受体的细胞内信号传导区的信号有响应，其中所述孵育在存在和/或不存在与重组受体的结合结构域结合的试剂和/或诱导或能够诱导通过重组受体的细胞内信号传导区的信号的试剂的情况下进行；并且评估一个或多个报告T细胞的一种或多种报告分子的表达或活性。在一些实施方案中，所述方法可以使用本文所述的任何细胞，例如报告T细胞。
在一些实施方案中，还提供了多个报告T细胞(和/或其文库)，其包括通过本文所述的方法产生的任何报告T细胞中的一个或多个。
在一些实施方案中，还提供了报告T细胞、编码重组受体的多核苷酸、结合结构域、或由本文提供的任何方法鉴定的重组受体或存在于由本文提供的任何方法鉴定的细胞中的重组受体。
本文提供了细胞(如T细胞系)，其含有能够在通过T细胞受体(包括重组受体)的细胞内信号传导区进行信号传导后表达的一种或多种报告分子。还提供了使用此类细胞的方法，例如使用此类细胞评估病毒载体效力的方法。在一些实施方案中，本文提供的方法包括评估T细胞中编码重组受体(例如，CAR)的载体的效力，例如转导效率。在本文提供的方法的一些实施方案中，在T细胞(如T细胞系)中评估所述效力。在一些实施方案中，T细胞包含一种或多种报告分子，例如能够在通过T细胞受体的细胞内信号传导区进行信号传导后和/或重组受体与抗原或表位结合和/或识别后表达的报告分子。在一些实施方案中，提供了报告T细胞(如报告T细胞系)，其包含与编码Nur77的内源基因座的转录调节元件可操作地连接的编码一种或多种报告分子的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了T细胞，如包含一种或多种报告分子的T细胞或报告T细胞。在本文提供的方法的一些实施方案中，使用T细胞(如报告T细胞)来评估病毒载体的效力，例如转导效率。在一些实施方案中，T细胞是T细胞系，如Jurkat来源的细胞系。在一些实施方案中，提供了来源于T细胞系的报告T细胞。在一些实施方案中，提供了稳定表达荧光团(如任何荧光蛋白)的报告T细胞。荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、天蓝色/青色荧光蛋白(CYP)或增强型GFP(eGFP)。在一些实施方案中，T细胞是表达荧光蛋白并含有报告分子的T细胞系，所述报告分子例如能够产生可检测信号或在通过重组受体的细胞内信号传导区进行信号传导后催化可测量活性的报告分子。还提供了含有本文所述的任何细胞(如报告T细胞)的组合物。
在一些方面，引入病毒载体的T细胞或T细胞组合物可以称为“宿主细胞”或“宿主细胞系”。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸分子的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
在一些实施方案中，细胞或细胞系是永生化细胞系和/或克隆细胞系。在一些实施方案中，细胞或细胞系是转化细胞系。在一些实施方案中，细胞或细胞系是T细胞系。在一些实施方案中，细胞或细胞系是能够通过CD3传输、转导和/或介导信号传导的细胞系。例如，所述细胞或细胞系含有或表达含CD3的T细胞受体(TCR)信号传导通路的组分，或者可以转导含CD3的TCR复合物。在一些实施方案中，细胞含有或表达用于传输信号的信号传导通路的组分，所述信号来自初级信号传导结构域的信号的、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞或细胞系是H9人T淋巴细胞(ATCC，HTB-176)或Jurkat人T细胞白血病细胞系(ATCC，TIB-152)。
在一些实施方案中，细胞是细胞系，如可从私人和商业来源获得的细胞系，所述私人和商业来源例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；国立医学科学研究所(National Institute of Medical Sciences，NIGMS)；ASHI存储库(ASHI Repository)；欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of CellCultures，ECACC)；或国际组织相容性工作(IHW)组细胞和DNA库(InternationalHistocompatibility Working(IHW)Group Cell and DNA bank)。在一些情况下，细胞系是可商购的。在一些实施方案中，细胞是细胞系或源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞系是T淋巴细胞或T淋巴母细胞细胞系。例如，所述细胞或细胞系是Jurkat克隆E6-1(ATCC，PTS-TIB-152TM、TIB-152TM)；31E9(ATCC，HB-11052TM)；CCRF-CEM(ATCC，CCL-119TM、CRM-CCL-119DTM、CRM-CCL-119TM、PTS-CCL-119TM)；CCRF-HSB-2(ATCC，CCL-120.1TM)；CEM/C1(ATCC，CRL-2265TM)；CEM/C2(ATCC，CRL-2264TM)；CEM-CM3(ATCC，TIB-195TM)；FeT-1C(ATCC，CRL-11968TM)；FeT-J(ATCC，CRL-11967TM)；J.CaM1.6(ATCC，CRL-2063TM)；J.RT3-T3.5(ATCC，TIB-153TM)；J45.01(ATCC，CRL-1990TM)；Loucy(ATCC，CRL-2629TM)；MOLT-3(ATCC，CRL-1552TM)；MYA-1(ATCC，CRL-2417TM)；SUP-T1(ATCC，CRL-1942TM)；TALL-104(ATCC，CRL-11386TM)；I 9.2；I 2.1；D1.1；J.γ1亚系或J-Lat。在一些实施方案中，细胞或细胞系是Jurkat克隆E6-1(ATCC，PTS-TIB-152TM、TIB-152TM)。
a.将报告细胞工程化
在一些实施方案中，T细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸分子的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸分子是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸分子，例如，所述核酸分子通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所源自的生物中发现。在一些实施方案中，核酸分子不是天然存在的，如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸分子的嵌合组合的核酸。在一些实施方案中，引入、转染和/或转导多种重组受体之一的T细胞是T杂交瘤细胞。
还提供了多种T细胞或T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的多种T细胞或T细胞的组合物包含本文所述的任何T细胞，如报告T细胞。在一些实施方案中，所提供的多种T细胞或T细胞(例如，报告T细胞)的组合物已被工程化以稳定表达荧光蛋白，例如eGFP。
用于引入基因工程化组分的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移核酸并稳定表达相应蛋白的那些，包括经由病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔来进行。
在一些实施方案中，本文所提供的方法与工程化报告T细胞的一种或多种组合物结合使用。在某些实施方案中，所述工程化是或包括引入多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括经由病毒(如逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，工程化产生报告T细胞的一种或多种工程化组合物。
b.报告分子
在一些实施方案中，细胞系(例如T细胞系)含有一种或多种报告分子，所述一种或多种报告分子的表达对通过T细胞受体的细胞内信号传导区的信号有响应，即在下文中也称为“报告细胞”，如“报告T细胞”。在一些实施方案中，所提供的细胞(如报告T细胞)含有一种或多种报告分子，所述一种或多种报告分子的表达对通过T细胞受体或重组受体的细胞内信号传导区的信号有响应。在一些实施方案中，一种或多种报告分子的表达对通过以下结构域的信号有响应：初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，一种或多种报告分子的表达对通过CD3链(任选地CD3-zeta(CD3ζ)链)的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分和/或共刺激信号传导区(如T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分)的信号有响应。
在一些实施方案中，所提供的T细胞(例如，报告T细胞)和/或用于评估载体效力的任何T细胞含有编码一种或多种报告分子的核酸序列，所述一种或多种报告分子能够产生可检测信号或在通过重组受体的细胞内信号传导区进行信号传导后催化可测量活性。
在一些实施方案中，可检测信号或可测量活性包含与如下指示物相比发生改变的指示物，所述指示物在细胞中不存在载体转导的情况下、和/或在存在或不存在与受体的结合结构域结合的试剂和/或诱导或能够诱导通过受体的细胞内信号传导区的信号的试剂的情况下，由报告细胞中的一种或多种报告分子产生。在一些实施方案中，与在细胞中不存在载体转导的情况下、和/或在存在或不存在与受体的结合结构域结合的试剂和/或诱导或能够诱导通过受体的细胞内信号传导区的信号的试剂的情况下由一种或多种报告物产生的信号相比，所述可检测指示物在细胞中被诱导或表达、增加、减少、抑制、改变颜色或改变位置。在一些实施方案中，一种或多种报告分子的表达对通过细胞内信号传导区的信号的特征和/或强度和/或重组受体对靶抗原或表位的结合和/或识别有响应。因此，在一些实施方案中，能够在通过重组受体的细胞内信号传导区进行信号传导后产生指示物的一种或多种报告物可以用于低、中或高通量筛选方法中，以确定引入T细胞或多种T细胞中的载体的效力，例如转导效率。
在一些实施方案中，在细胞中在通过细胞内信号传导区进行信号传导和/或重组受体与靶抗原或表位结合和/或识别后和/或在通过含有CD3或其一部分的细胞内信号传导区转导的细胞信号传导后，所述一种或多种报告物能够被检测，如表达或诱导为催化活性。通常，信号(如T细胞受体激活信号)在与试剂(例如，特异性抗原或表位)结合后被诱导或启动，这导致含有CD3的信号传导复合物的交联和激活。在一些情况下，然后所述信号可以启动与抗原或表位结合和/或激活信号传导(例如，T细胞激活信号传导)相关的各种细胞内化合物的进一步下游信号传导和表达。在一些实施方案中，通过CD3复合物进行的T细胞激活可以诱导T细胞中的信号转导途径，从而导致该T细胞产生细胞信号传导和产物(例如，白介素-2)表达。
在一些实施方案中，“报告分子(reporter molecule)”或“报告物(reporter)”是如下任何分子，其是与如下信号相比发生改变的可检测信号或可以产生与如下信号相比发生改变的可检测信号，所述信号在存在或不存在与受体的结合结构域结合的试剂和/或诱导或能够诱导通过重组受体的细胞内信号传导区的试剂的情况下、和/或在不存在T细胞激活(例如通过受体的细胞内信号传导区进行的T细胞激活)的情况下，来自报告物或由报告物产生。在一些实施方案中，与在不存在T细胞激活和/或在细胞中不存在重组受体的情况下由报告物产生的信号相比，所述可检测信号在细胞中被诱导或表达、增加、减少、抑制、改变颜色或改变位置。在一些实施方案中，报告物是细胞中的可检测信号或可以在细胞中产生可检测信号，所述可检测信号可以包括光发射(例如荧光)、FRET、生物化学第二信使(即分子(例如钙))的浓度、在细胞中的蛋白质或基因表达或从细胞分泌的蛋白质(例如IL-2)。在一些实施方案中，报告物是酶或可以催化细胞内产生可测量的一种或多种产物的反应。T细胞功能(包括T细胞激活)的各种报告系统是已知的(参见例如，Hoekstra等人(2015)Trends in Immunol,36:392-400)。
在一些实施方案中，报告物是可检测部分，如发光蛋白或生物发光蛋白，所述发光蛋白或生物发光蛋白可以是可检测的并且可以在视觉上或通过使用分光光度计、发光计、荧光计或其他相关方法监测。在一些实施方案中，报告物是可检测部分，如产生生物发光的酶，例如可以转化发射光的底物的酶，例如萤光素酶或其变体。发光蛋白或产生生物发光的酶的非限制性例子包括例如萤光素酶、荧光蛋白(如红色、蓝色和绿色荧光蛋白，参见例如，美国专利号6,232,107，其提供来自海肾(Renilla)物种和其他物种的GFP)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、以及荧光蛋白及其变体，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体(包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、以及密码子优化的和/或增强的变体)。萤光素酶及其变体可以包括来自以下物种的萤光素酶及其变体(包括密码子优化的和/或增强的变体)：萤火虫(firefly或Photinus pyralis)、海肾(seapansy)(动物海肾(Renilla reniformis))、发光杆菌属物种(费氏弧菌(Vibriofischeri)、哈维弧菌(Vibrio haweyi)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi))、腰鞭毛虫、海洋桡足类(细长长腹水蚤(Metridia longa))、深海虾(刺虾属(Oplophorus))和鬼火蘑菇(Jack-O-Lantern mushroom)(奥尔类脐菇(Omphalotus olearius))。在一些实施方案中，报告分子是萤火虫萤光素酶，任选地是萤火虫萤光素酶2(SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，由SEQID NO:8所示的核酸序列编码)。在一些实施方案中，报告分子是绿色荧光蛋白(GFP)，任选地是增强型GFP(SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:10所示的核酸序列编码)。
在一些实施方案中，报告分子可以是激素或细胞因子或其他这样众所周知的基因，其可以在抗原或表位结合和/或受体表现出活性(例如，信号传导或激活)后在T细胞中被诱导或表达。还可以通过测量由这些基因转录的mRNA的水平来监测这些报告基因的表达。
在一些实施方案中，在抗原或表位结合之后，报告物(如可检测部分)可以与特定的重组受体(例如CAR)或由重组受体(例如CAR)的激活而诱导的下游信号直接缔合，从而提供报告物的活性(例如，信号传导或细胞激活)的直接读数。在一些实施方案中，在抗原或表位结合和/或通过重组受体的细胞内信号传导区的信号或活性后诱导的细胞中的可检测信号是在不存在抗原受体与识别的抗原或表位的结合和/或通过重组受体的细胞内信号传导区的信号或活性的情况下，与在细胞中的位置相比，可检测部分在细胞中的位置的变化。在一些方面，特定的重组受体(例如，CAR)可以被可检测部分工程化(如可操作地融合)，所述可检测部分的活性在接合或结合抗原(如表位)后被开启和/或可以以其他方式可视化。在一些情况下，重组受体(例如，CAR)的接合可以导致受体的内化，这可以被监测。在一些实施方案中，转录因子或其他信号传导分子(在对通过重组受体的细胞内信号传导区的信号或活性有响应后，其表达被诱导)可以被可检测部分工程化(如可操作地融合)，所述可检测部分的活性在接合或结合抗原或表位后被开启和/或可以以其他方式可视化。在一些情况下，通过重组受体的细胞内信号传导区的信号或活性(如T细胞激活和/或信号传导)可能导致信号特异性转录因子从胞质溶胶到细胞核的易位，这可以被监测。在一些实施方案中，可检测部分可以是所述的任何一种，如荧光蛋白、酶蛋白或发光蛋白。
在一些实施方案中，可以使用基于荧光共振能量转移(FRET)的系统来监测细胞中两个分子之间的相互作用的变化。可以监测TCR接合和/或T细胞激活的FRET系统是已知的(参见例如，Zal和Gascoigne(2004)Curr.Opin.Immunol.,16:674-83；Yudushkin和Vale(2010)PNAS,107:22128-22133；Ibraheem等人(2010)Curr.Opin.Chem.Biol.,14:30-36)。
在本文提供的方法和细胞的一些实施方案中，所述一种或多种报告分子与T细胞激活因子缔合、在T细胞激活因子的可操作控制下和/或受T细胞激活因子调节。在一些实施方案中，报告分子由在T细胞激活因子(例如调节元件)的可操作控制下的核酸序列编码，所述调节元件对通过细胞内信号传导区的信号的特征和/或强度和/或重组受体与靶抗原或表位的结合和/或识别有响应。在一些实施方案中，“T细胞激活因子”是对受体(例如在T细胞上存在或表达的T细胞受体(TCR))结合抗原或表位、或通过T细胞的TCR复合物的组分转导的信号、或包含含有TCR复合物的组分或其一部分的细胞内信号传导区的重组受体有响应的分子或因子或其部分。在一些实施方案中，T细胞激活因子可以是作为T细胞的正常下游信号传导通路的一部分的典型因子或其部分。在一些实施方案中，T细胞激活的读数是由含有T细胞激活因子的构建体编码的报告物，所述T细胞激活因子与能够进行可检测表达的报告分子可操作地连接。在一些实施方案中，抗原或表位结合和/或通过重组受体(例如，CAR)的细胞内信号传导区的信号或活性诱导信号传导，所述信号传导诱导T细胞刺激活因子表达报告物。然后可以监测报告分子的可检测表达作为T细胞激活的指示物。
在一些实施方案中，T细胞激活因子是或含有靶基因的一个或多个调节元件(如一个或多个转录控制元件)，所述转基因的表达依赖于TCR复合物的组分的激活或与其相关，凭借这种激活，调节结构域或元件由转录因子识别以驱动这种基因的表达。在一些情况下，所述T细胞激活因子(如调节结构域或元件)可以是或含有特定基因座的内源调节区的全部或部分，例如，T细胞激活因子源自靶基因座。在一些实施方案中，T细胞激活因子是或含有启动子、增强子或其他响应元件或其部分，所述启动子、增强子或其他响应元件或其部分由转录因子识别以驱动基因的表达，所述基因的活性通常通过T细胞激活而被开启。在一些实施方案中，T细胞激活因子可以是转录因子的调节结构域或区域(例如，启动子、增强子或其他响应元件)，所述调节结构域或区域的活性通过T细胞激活而被开启。在一些实施方案中，T细胞激活因子对通过细胞内信号传导区的信号的特征和/或强度和/或重组受体与靶抗原或表位的结合和/或识别中的一种或多种有响应。在一些实施方案中，调节元件对重组受体与抗原或表位结合的状态、T细胞激活、重组受体的信号强度和/或通过重组受体(例如CAR)的细胞内信号传导区的信号传导的特征中的一种或多种有响应。在一些实施方案中，T细胞激活因子是或包含基因的转录调节元件，所述基因的表达在重组受体结合抗原或表位、T细胞激活、重组受体的信号强度和/或通过重组受体(例如CAR)的细胞内信号传导区的信号传导的特征后被诱导和/或上调。
通常，T细胞激活因子可操作地与T细胞激活的可检测读取结果(如由细胞表达并可被检测到的报告物)缔合。因此，例如，可以在T细胞激活后诱导报告物的表达，而不是内源基因的表达，或除内源基因外。单独的或与可检测读取结果一起的T细胞激活因子对于细胞来说可以是内源的、外源的或异源的。
在一些实施方案中，T细胞激活因子可以是调节元件(如转录调节元件，如启动子、增强子或一个或多个响应元件)，所述调节元件含有T细胞转录因子的结合位点，因此与T细胞转录因子的下游活性有关。在一些实施方案中，转录因子是激活的T细胞的核因子(NFAT)、C/EBP、AP1、STAT1、STAT2、Nur77或NFκB。在一些实施方案中，T细胞激活因子含有由激活的T细胞的核因子(NFAT)、C/EBP、AP1、STAT1、STAT2、Nur77和NFκB识别的一个或多个响应元件。在一些实施方案中，T细胞激活因子可以含有由一种或两种以及在一些情况下三种或更多种独特的转录因子识别或对其有响应的一个或多个调节元件。
在一些情况下，所述T细胞激活因子含有仅由单个转录因子识别的结合位点(如响应元件)，所述单个转录因子通过经由TCR复合物的组分进行的信号传导而被选择性激活，所述TCR复合物在抗原或表位与受体(例如重组受体，例如CAR)结合后通过受体接合而被诱导。在一些实施方案中，T细胞激活因子包含由转录因子识别的一个或多个响应元件，所述转录因子在通过内源TCR复合物刺激T细胞后被激活。例如，基因的调节区域通常含有多个调节元件，所述多个调节元件可以对细胞中的多于一个信号传导通路有响应。相比之下，含有一个或多个调节元件的人工调节区域或人工启动子可以增加报告系统的特异性，从而使其仅对T细胞激活有响应，所述一个或多个调节元件由转录因子识别，所述转录因子通过仅经由TCR复合物的组分进行信号传导而被选择性激活。在一些实施方案中，T细胞激活因子含有一种或多种由NFAT识别的调节元件。在一些实施方案中，T细胞激活因子含有一种或多种由NFκB识别的调节元件。
在一些实施方案中，报告分子由在T细胞激活因子(如对通过抗原受体(如TCR复合物)的信号的特征和/或强度有响应的调节元件)的可操作控制下的核酸序列编码。在一些方面，T细胞激活因子对通过细胞内信号传导区的信号的特征和/或强度有响应，和/或对重组受体(如被筛选或评估的受体，如由细胞表达的重组受体)结合和/或识别靶抗原或表位有响应。在一些方面，T细胞激活因子是或含有与以下项的表达相关的一个或多个转录调节元件：孤儿核激素受体Nur77(也称为Nr4a1，神经生长因子IB(NGFIB)，GFRP1；Gfrp；HMR；Hbr-1；Hbr1；Hmr；N10；NAK-1；NGFI-B；NGFIB；NP10；Ngfi-b；孤儿核受体HMR；ST-59；TIS1；TR3；TR3孤儿受体；早期反应蛋白NAK1；生长因子诱导型核蛋白N10；激素受体；即刻早期基因转录因子NGFI-B；神经生长因子IB核受体变体1；神经生长因子诱导蛋白I-B；神经生长因子诱导蛋白I-B；神经孤儿核受体NUR77；nhr-6；nr4a1；核激素受体NUR/77；核蛋白N10；核受体亚家族4组A成员1；孤儿核受体NGFI-B；孤儿核受体NR4A1；孤儿核受体TR3；类固醇受体TR3；睾丸受体3；zgc:92434；SEQ ID NO:1所示的示例性人Nur77 DNA序列，即编码SEQ IDNO:2所示的多肽)。
Nur77通常由即刻早期响应基因编码，Nur77对通过内源T细胞受体(TCR)复合物进行的信号传导、或来自内源T细胞受体复合物的信号的激活、内源TCR的接合和/或经由参与来自TCR复合物的信号的含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的分子(例如，CD3-ζ信号传导区)有响应而被诱导。Nur77基因产物本身通常可以结合调节元件，所述调节与用于诱导基因的下游表达的若干个基因的启动子缔合。Nur77的表达水平或程度可以用作T细胞信号(例如，TCR信号)的强度的指示物(Moran等人(2011)JEM,208:1279-1289)。因此，在一些实施方案中，与Nur77基因座的一个或多个转录调节元件或其部分可操作地连接的报告分子的表达可以提供T细胞信号传导的强度的指示物。此外，Nur77的表达通常不受其他信号传导通路(如细胞因子信号传导或toll样受体(TLR)信号传导)的影响(参见例如，Ashouri等人,(2017)J.Immunol.198:657-668)，其可以以细胞外源性方式起作用并且可以不依赖于通过重组受体进行的信号传导。在一些实施方案中，T细胞激活因子是Nur77启动子或增强子或其一部分，或者是含有一个或多个Nur77响应元件的分子或基因。
在任何实施方案中的一些中，所述报告T细胞含有与Nur77的转录调节元件或其变体可操作地连接的编码报告分子的核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，所述转录调节元件的变体是与T细胞中的内源Nur77基因座内的转录调节元件展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的变体核酸序列。在任何此类实施方案中的一些中，所述转录调节元件的变体是功能变体，其具有与T细胞中的内源Nur77基因座内的转录调节元件展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的核酸序列，并且对通过内源T细胞受体(TCR)复合物进行的信号传导、或来自内源T细胞受体复合物的信号、内源TCR的接合有响应和/或经由参与来自TCR复合物的信号的含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的分子(例如，CD3-ζ信号传导区)而有响应；和/或对通过重组受体的细胞内信号传导区的信号有响应，其中所述孵育在存在或不存在与重组受体的结合结构域结合的试剂和/或诱导或能够诱导通过重组受体的细胞内信号传导区的信号的试剂的情况下进行。
在一些实施方案中，生成构建体或载体，所述构建体或载体含有在T细胞激活因子(例如，Nur77启动子)的可操作控制下的编码报告分子的核酸序列，所述T细胞激活因子能够在抗原或表位结合和/或通过受体(例如重组受体，例如CAR，用于识别抗原或其表位)的细胞内信号传导区的信号或活性后被激活或诱导。在一些实施方案中，“报告构建体”包含与一种或多种T细胞激活因子(能够诱导表达)的序列可操作地连接的编码一种或多种报告分子的核酸。
报告构建体是已知的或可以通过重组DNA技术生成。在一些实施方案中，将编码一种或多种报告分子的核酸序列克隆到表达质粒(如哺乳动物表达载体，例如pcDNA，或其他哺乳动物表达载体)中。在一些实施方案中，将编码一种或多种报告分子的核酸序列克隆到逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)中。
在一些实施方案中，将编码一种或多种报告分子的核酸序列整合到细胞中的基因组位置，例如内源基因组位置。在一些实施方案中，可以将编码报告分子的核酸序列整合到基因组位置中，以使其表达与特定基因的内源基因组位置中存在的调节元件相关、在所述调节元件的可操作控制下和/或调节下，所述特定基因的表达可以对通过细胞内信号传导区的信号的特征和/或强度、和/或受体与靶抗原或表位的结合和/或识别、和/或T细胞信号传导或T细胞激活有响应。在一些实施方案中，可以将编码一种或多种报告分子的核酸序列整合到在基因的转录调节元件的可操作控制下的内源基因组位置中，所述基因的表达在通过重组受体的细胞内信号传导区的信号和/或重组受体与靶抗原或表位的结合和/或识别后被诱导和/或上调。在一些实施方案中，可以将编码一种或多种报告分子的核酸序列整合到内源基因组位置中，以与在所述位置处编码的内源基因共表达，所述位置在T细胞激活因子(例如启动子、增强子或响应元件或其一部分)的可操作控制下，所述T细胞激活因子能够在抗原或表位结合、和/或通过重组受体(例如CAR，用于识别抗原或其表位)的细胞内信号传导区的信号或活性、和/或T细胞信号传导或T细胞激活后被激活或诱导。在一些实施方案中，内源基因是Nur77。在一些实施方案中，T细胞激活因子是Nur77启动子、增强子或响应元件或其一部分。在一些实施方案中，将编码报告分子的核酸序列与内源基因(例如内源Nur77基因)的编码序列、编码区和/或开放阅读框(ORF)(与编码自切割元件(例如T2A)的序列间隔开)进行靶向框内整合。
在一些实施方案中，本文提供的T细胞或多种T细胞或者用于本文提供的方法中的T细胞或多种T细胞可以含有多于一种报告物。在一些实施方案中，T细胞或多种T细胞可以含有两种不同的报告物。
c.示例性报告T细胞
在一些实施方案中，所提供的报告T细胞或用于本文提供的方法中的报告T细胞含有编码报告分子的核酸序列，所述报告分子存在于细胞的基因组内或靶向整合于内源基因组位置中，使得报告物的表达可以与特定基因的内源基因组位置中存在的调节元件相关、在所述调节元件的可操作控制下和/或调节下，所述特定基因的表达可以对通过细胞内信号传导区的信号的特征和/或强度、和/或受体与靶抗原或表位的结合和/或识别、和/或T细胞信号传导或T细胞激活有响应。在一些实施方案中，报告T细胞通过以下方式产生：在目的内源基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导遗传破坏；并且引入模板多核苷酸以进行同源性定向修复(HDR)。在一些实施方案中，报告T细胞具有在内源基因座处编码报告分子的核酸序列的靶向敲入，所述报告分子与T细胞激活因子连接，所述T细胞激活因子例如对通过内源T细胞受体(TCR)的信号的特征和/或强度和/或TCR与靶抗原或表位的结合和/或识别有响应的调节元件。
在一些实施方案中，报告T细胞通过以下方式产生：使用基因编辑方法诱导靶向遗传破坏(例如DNA断裂的产生)，然后进行HDR以在内源基因座处靶向敲入编码报告分子的核酸序列，所述报告分子与T细胞激活因子(如Nur77启动子、增强子或响应元件或其一部分)连接。在一些实施方案中，编码报告分子的核酸序列存在于细胞的基因组内，或与内源基因(例如内源Nur77基因)的编码序列、编码区和/或开放阅读框(ORF)进行靶向框内整合。因此，在一些示例性实施方案中，所述报告T细胞通过以下方式产生：在编码Nur77的内源基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导遗传破坏；并且引入模板多核苷酸以进行HDR。
在一些实施方案中，遗传破坏由特异性结合或杂交至靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸诱导，任选地由包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指导的核酸酶的融合蛋白诱导。在一些实施方案中，包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指导的核酸酶的融合蛋白是或包括特异性结合、识别或杂交至靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas9组合。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶包含具有与靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
在一些实施方案中，引入遗传破坏或切割涉及使用一种或多种药剂，所述一种或多种药剂能够在基因组DNA中的靶位点处引入遗传破坏、切割、双链断裂(DSB)和/或缺口，从而激活和/或募集各种细胞DNA修复机制，所述机制可以基于靶位点周围的内源基因序列与模板多核苷酸中包含的5'和/或3'同源臂之间的同源性，在通过HDR进行靶向遗传破坏的位点处或附近，利用含有同源臂序列的模板多核苷酸(DNA修复模板)有效地复制和整合编码报告分子的核酸序列。
在一些实施方案中，能够引入遗传破坏或切割的一种或多种药剂包含特异性结合或杂交至基因组中的靶位点(例如，在Nur77基因处或附近)的DNA结合蛋白或DNA结合核酸。在一些方面，使用蛋白质或核酸实现编码Nur77的内源基因处或附近的靶向切割(例如，DNA断裂)，所述蛋白质或核酸与基因编辑核酸酶偶联或复合，如以嵌合或融合蛋白的形式。在一些实施方案中，能够引入遗传破坏或切割的一种或多种药剂包含含有DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指导的核酸酶的融合蛋白。
在一些实施方案中，通过基因编辑方法引入遗传破坏或切割，如使用锌指核酸酶(ZFN)、TALEN或具有切割一个或多个靶位点(例如，Nur77基因处或附近的一个或多个靶位点)的工程化指导RNA的CRISPR/Cas系统。
在一些实施方案中，能够引入靶向切割的药剂包含各种组分，如包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指导的核酸酶的融合蛋白。在一些实施方案中，使用DNA靶向分子进行靶向切割，所述DNA靶向分子包括与核酸酶(如核酸内切酶)融合的DNA结合蛋白，如一种或多种锌指蛋白(ZFP)或转录激活因子样效应物(TALE)。在一些实施方案中，使用RNA指导的核酸酶(如成簇的规律间隔的短回文核酸(CRISPR)相关核酸酶(Cas)系统(包括Cas和/或Cfp1))进行靶向切割。在一些实施方案中，使用能够引入遗传破坏或切割的药剂进行靶向切割，所述药剂是例如专门工程化和/或设计为靶向至少一个靶位点、基因序列或其部分的序列特异性或靶向性核酸酶，包括DNA结合靶向性核酸酶和基因编辑核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以及RNA指导的核酸酶，如CRISPR相关核酸酶(Cas)系统。
在一些实施方案中，一种或多种药剂特异性靶向例如Nur77基因座处或附近的至少一个靶位点。在一些实施方案中，药剂包含特异性结合、识别或杂交至一个或多个靶位点的ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9组合。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统包括工程化crRNA/tracr RNA(“单一指导RNA”)，以指导特异性切割。在一些实施方案中，药剂包含基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为“TtAgo”(Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)。
锌指蛋白(ZFP)、转录激活因子样效应子(TALE)和CRISPR系统结合结构域可以被“工程化”以与预定的核苷酸序列结合，例如经由工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的ZFP或TALE蛋白的识别螺旋区。工程化DNA结合蛋白(ZFP或TALE)是非天然存在的蛋白质。设计的合理标准包括应用替代规则和计算机化算法，以处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496以及美国公开号20110301073。示例性ZFN、TALE和TALEN描述于例如Lloyd等人,Frontiersin Immunology,4(221):1-7(2013)中。
锌指蛋白(ZFP)或其锌指结构域是蛋白质或者较大蛋白质内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，锌指是通过锌离子配位而稳定其结构的结合结构域内氨基酸序列的区域。ZFP包括靶向通常长9-18个核苷酸的特定DNA序列的人工ZFP结构域，其是通过单独指状物的组装产生的。ZFP包括如下那些，其中单一指状物结构域具有大约30个氨基酸的长度，并且包含含有通过锌与单一β转角的两个半胱氨酸配位的两个不变组氨酸残基且具有两个、三个、四个、五个或六个指状物的α螺旋。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)进行氨基酸取代来改变。因此，例如，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如被工程化以与所选靶位点结合。
在一些情况下，DNA靶向分子是或包含锌指DNA结合结构域，其与DNA切割结构域融合以形成锌指核酸酶(ZFN)。例如，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)和可以被或可以不被工程化的一个或多个锌指结合结构域。在一些情况下，切割结构域来自IIS型限制性内切核酸酶FokI，其通常催化DNA的双链切割，在距其一条链上的识别位点9个核苷酸处和距其另一条链上的识别位点13个核苷酸处。参见例如，美国专利号5,356,802、5,436,150和5,487,994；Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。
许多基因特异性的工程化的锌指是可商购的。例如，Sangamo Biosciences(美国加利福尼亚州列治文)已经与Sigma–Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)合作开发了一个用于锌指构建的平台(CompoZr)，允许研究人员一并绕过锌指构建和验证，并为数千种靶标提供了特异性靶向锌指。参见例如，Gaj等人,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405。在一些情况下，使用或者定制设计可商购获得的锌指。
在一些实施方案中，可以使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白靶向Nur77基因进行切割。参见Sander和Joung,NatureBiotechnology,32(4):347-355。在一些实施方案中，“CRISPR系统”统指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或引导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复序列”和在内源CRISPR系统的背景下的tracrRNA加工的部分同向重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔子”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
在一些方面，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括与DNA序列特异性结合的非编码指导RNA(gRNA)和具有核酸酶功能性的Cas蛋白(例如，Cas9)。在一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶系统包含以下中的至少一种：具有与Nur77基因的靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)；或编码所述gRNA的至少一种核酸。
通常，指导序列(例如，指导RNA)是至少包含序列部分(例如，靶向结构域)的任何多核苷酸序列，所述序列部分与靶位点序列(如人中的Nur77基因中的靶位点)具有足够的互补性以与靶位点处的靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合。在一些实施方案中，在形成CRISPR复合物的背景下，“靶位点”(也称为“靶位置(targetposition)”、“靶DNA序列”或“靶位置(target location)”)通常是指指导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列与指导RNA的结构域(例如，靶向结构域)之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补性。通常，选择指导序列以减少指导序列内二级结构的程度。二级结构可以通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定。
在一些方面，将与指导序列组合(并且任选地与其复合)的CRISPR酶(例如，Cas9核酸酶)递送至细胞中。例如，CRISPR系统的一个或多个元件源自I型、II型或III型CRISPR系统。例如，CRISPR系统的一个或多个元件源自包含内源CRISPR系统的特定生物体，如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)。
在一些实施方案中，对靶位点(例如Nur77基因)具有特异性的指导RNA(gRNA)用于指导RNA指导的核酸酶(例如Cas)，以在靶位点或靶位置处引入DNA断裂。用于设计gRNA和示例性靶向结构域的方法可以包括例如国际PCT公开号WO 2015/161276中所述的那些。可以将靶向结构域掺入用于将Cas9核酸酶靶向靶位点或靶位置的gRNA中。例如在以下文献中描述了用于选择和验证靶序列以及脱靶分析的方法：Mali等人,2013Science 339(6121):823-826；Hsu等人Nat Biotechnol,31(9):827-32；Fu等人,2014Nat Biotechnol；Heigwer等人,2014Nat Methods 11(2):122-3；Bae等人,2014Bioinformatics；Xiao A等人,2014Bioinformatics.用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公众可获得的，其含有靶向人基因组或小鼠基因组中基因的组成型外显子的示例性单一指导RNA(sgRNA)序列(参见例如，genescript.com/gRNA-database.html；还参见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4)。在一些方面，gRNA序列是或包含与非靶位点或位置具有最小脱靶结合的序列。
在一些示例性实施方案中，所述靶位点位于编码Nur77的内源基因座的最后一个外显子处或附近。在一些示例性实施方案中，所述靶位点位于编码Nur77的内源基因座的最后一个外显子处或附近，但在编码Nur77的内源基因座的终止密码子之前。在一些实施方案中，一个或多个靶位点包含核酸序列TCATTGACAAGATCTTCATG(SEQ ID NO:14)和/或GCCTGGGAACACGTGTGCA(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，gRNA包含选自CAUGAAGAUCUUGUCAAUGA(SEQ ID NO:3)或UGCACACGUGUU CCCAGGC(SEQ ID NO:4)的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，对遗传破坏或切割的诱导是通过以下方式来进行：使用用于引入或转移至细胞的多种已知递送方法或媒介物中的任一种(例如，使用慢病毒递送载体)或者用于递送Cas9分子和gRNA的任何已知方法或媒介物，将能够引入遗传破坏或切割的一种或多种药剂(例如，Cas9和/或gRNA组分)递送至或引入细胞中。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。在一些实施方案中，例如通过本文所述或已知的用于将核酸引入细胞中的任何方法将编码能够引入遗传破坏或切割(例如，DNA断裂)的一种或多种药剂的一种或多种组分的核酸序列引入细胞中。在一些实施方案中，可以将编码能够引入遗传破坏或切割的一种或多种药剂(如CRISPR指导RNA和/或Cas9酶)的组分的载体递送至细胞中。
在一些实施方案中，将能够引入遗传破坏或切割的一种或多种药剂(例如，Cas9/gRNA系统)作为核糖核蛋白(RNP)复合物引入细胞中。RNP复合物包括核糖核苷酸序列(如RNA或gRNA分子)和蛋白质(如Cas9蛋白或其变体)。例如，例如使用电穿孔或其他物理递送方法，将Cas9蛋白作为RNP复合物递送，所述复合物包含Cas9蛋白和靶向靶序列的gRNA分子。在一些实施方案中，经由电穿孔或其他物理方式(例如，粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压)将RNP递送至细胞中。在一些实施方案中，RNP可以穿过细胞的质膜而无需另外的递送剂(例如，小分子药剂、脂质等)。
在一些实施方案中，将包含编码报告分子的核酸序列的模板多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，在引入能够诱导靶向遗传破坏的一种或多种药剂之前、同时或之后，将模板多核苷酸引入工程化的细胞中。在靶向遗传破坏(例如，DNA断裂)的存在下，模板多核苷酸可以用作DNA修复模板，以基于靶位点周围的内源基因序列与模板多核苷酸中所包括的5'和/或3'同源臂之间的同源性，通过HDR将转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)有效地拷贝并整合于靶向遗传破坏的位点处或附近。在一些实施方案中，基因编辑和HDR步骤是同时和/或在一个实验反应中进行的。在一些实施方案中，基因编辑和HDR步骤是在一个或连续的实验反应中连续或依序进行的。在一些实施方案中，基因编辑和HDR步骤是在单独实验反应中同时或在不同时间进行的。
在一些实施方案中，HDR可以用于在基因组中的一个或多个靶位点(例如，Nur77基因)处靶向整合一种或多种转基因。在一些实施方案中，核酸酶诱导的HDR可以用于在特定靶位置处改变靶序列、整合转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)。
靶位点处核酸序列的改变可以通过HDR用外源提供的模板多核苷酸(也称为供体多核苷酸或模板序列)来进行。例如，模板多核苷酸提供靶序列的改变，如含于模板多核苷酸内的转基因的插入。在一些实施方案中，可以使用质粒或载体作为同源重组的模板。在一些实施方案中，可以使用线性DNA片段作为同源重组的模板。在一些实施方案中，可以使用单链模板多核苷酸作为通过靶序列与模板多核苷酸之间的同源定向修复的替代方法(例如，单链退火)来改变靶序列的模板。模板多核苷酸实现的靶序列的改变依赖于通过核酸酶(例如，靶向核酸酶，如CRISPR/Cas9)进行的切割。通过核酸酶进行的切割或遗传破坏可以包括双链断裂或两个单链断裂。
在一些实施方案中，“重组”是指两个多核苷酸之间的遗传信息交换的过程。在一些实施方案中，“同源重组(HR)”是指这种交换的特化形式，其在例如经由同源定向修复机制修复细胞中的双链断裂期间进行。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用模板多核苷酸对靶DNA(即，经历双链断裂的DNA，例如内源基因中的靶位点)进行模板修复，并且因为其导致遗传信息从模板多核苷酸转移至靶标而被不同地称为“非交换型基因转化”或“短束基因转化”。在一些实施方案中，这种转移可以涉及在断裂的靶标与模板多核苷酸之间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或“合成依赖性链退火”(其中使用模板多核苷酸重新合成将成为靶标的一部分的遗传信息)，和/或相关过程。这种特化的HR通常导致靶分子序列的改变，使得模板多核苷酸的部分或全部序列掺入靶多核苷酸中。
在一些实施方案中，经由非同源性依赖性机制将模板多核苷酸(例如含有转基因的多核苷酸)整合至细胞基因组中。所述方法包括在细胞基因组中产生双链断裂(DSB)，并使用核酸酶切割模板多核苷酸分子，使得模板多核苷酸整合于DSB的位点处。在一些实施方案中，经由非同源性依赖性方法(例如，NHEJ)来整合模板多核苷酸。在体内切割后，所述模板多核苷酸可以以靶向方式整合至细胞基因组中的DSB位置处。所述模板多核苷酸可以包括用于产生DSB的一种或多种核酸酶的一个或多个相同靶位点。因此，所述模板多核苷酸可以通过用于切割期望整合至其中的内源基因的一种或多种相同核酸酶来切割。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括与用于诱导DSB的核酸酶不同的核酸酶靶位点。如上文所述，可以通过任何机制，例如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统或TtAgo核酸酶来产生靶位点或靶位置的遗传破坏。
在典型HDR中，引入双链模板多核苷酸，其包含靶位点的同源序列，所述同源序列将被直接掺入靶位点中，或者用作模板以在靶位点附近插入转基因。在遗传破坏或切割去除后，修复可以通过不同途径进行，例如通过双霍利迪连接体模型(double Hollidayjunction model)(或双链断裂修复(DSBR)途径)或合成依赖性链退火(SDSA)途径进行。在一些实施方案中，细胞可以采用其他DNA修复途径(如单链退火(SSA)、单链断裂修复(SSBR)、错配修复(MMR)、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、链内交联(ICL)、跨损伤合成(TLS)、无误性复制后修复(PRR))来修复核酸酶产生的双链或单链断裂。
靶向整合导致转基因被整合至基因组中的特定基因或基因座中。所述转基因可以被整合于基因组中至少一个靶位点或位点中的一个位点处或附近的任何位置。在一些实施方案中，转基因存在于细胞基因组内、或存在于细胞基因组内、或被整合于至少一个靶位点中的一个处或附近，例如在切割位点上游或下游300、250、200、150、100、50、10、5、4、3、2、1个或更少碱基对内，如在靶位点任一侧的100、50、10、5、4、3、2、1个碱基对内，如在靶位点任一侧的50、10、5、4、3、2、1个碱基对内。
靶位点处的遗传破坏或切割应足够接近靶向整合位点，使得在所需区域中产生改变，例如，发生转基因的插入。在一些实施方案中，所述距离不超过10、25、50、100、200、300、350、400或500个核苷酸。在一些实施方案中，认为所述遗传破坏或切割应足够接近靶向整合位点，使得所述遗传破坏或切割位于在末端切除期间经历外切核酸酶介导的去除的区域内。在一些实施方案中，靶向结构域被配置为使得切割事件位于期望改变的区域(例如，靶向插入位点)的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400或500个核苷酸内，如距离用于靶向插入的位点在约0与约200bp之间(例如，0至175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100bp)。所述遗传破坏或切割可以位于期望改变的区域(例如，靶向插入位点)的上游或下游。在一些实施方案中，断裂定位于期望改变的区域内，例如由至少两个突变体核苷酸限定的区域内。在一些实施方案中，断裂的定位紧邻期望改变的区域，例如紧接靶向整合位点的上游或下游。
可以使用与内源DNA中一个或多个靶位点处或附近的序列具有同源性的模板多核苷酸来改变靶DNA的结构，例如转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)的靶向插入。在一些实施方案中，模板多肽含有侧接转基因(例如编码报告分子(如本文所述的任何报告分子)的核酸序列)的同源序列(例如，同源臂)，用于靶向插入。在一些实施方案中，同源序列靶向Nur77基因座处或附近的转基因。在一些实施方案中，模板多核苷酸在同源臂之间包括另外的序列(编码或非编码序列)，如调节序列(如启动子和/或增强子)、剪接供体和/或受体位点、内部核糖体进入位点(IRES)、编码核糖体跳跃元件(例如2A肽)的序列、标记和/或SA位点、和/或一种或多种另外的转基因。所述模板多核苷酸中的目的序列可以包含编码功能多肽的一个或多个序列(例如，cDNA)，其具有或不具有启动子。
在一些实施方案中，核酸酶诱导的HDR导致插入转基因(也称为“外源序列”或“转基因序列”)，用于表达用于靶向插入的转基因。模板多核苷酸序列通常与其所在的基因组序列不同。模板多核苷酸序列可以含有侧接两个同源性区域的非同源序列，以允许在目的位置进行有效HDR。另外，模板多核苷酸序列可以包含载体分子，所述载体分子含有与细胞染色质中的目的区域不同源的序列。模板多核苷酸序列可以含有与细胞染色质具有同源性的几个不连续区域。例如，对于通常在目的区域中不存在的序列的靶向插入，所述序列可以存在于转基因中并且侧接与目的区域中的序列具有同源性的区域。
用于插入的多核苷酸也可以被称为“转基因”或“外源序列”或“供体”多核苷酸或分子。所述模板多核苷酸可以是单链和/或双链的DNA，并且可以以线性或环状形式引入细胞中。还参见美国专利公开号20100047805和20110207221。所述模板多核苷酸也可以以DNA形式引入，可以将其以环状或线性形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过已知的方法保护模板多核苷酸的末端(例如，防止核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'端，和/或将自身互补的寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见例如，Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science 272:886-889。用于保护异源多核苷酸免于降解的另外的方法包括但不限于一个或多个末端氨基的添加以及经修饰的核苷酸间连接(例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基)的使用。如果以双链形式引入，则模板多核苷酸可以包括一个或多个核酸酶靶位点，例如侧接要整合至细胞基因组中的转基因的核酸酶靶位点。参见例如，美国专利公开号20130326645。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是双链的。在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含单链部分和双链部分。
在一些实施方案中，模板多核苷酸含有转基因(例如编码报告分子的核酸序列)，所述转基因侧接在5'和3'端的同源序列(也称为“同源臂”)，以允许DNA修复机制(例如同源重组机制)使用模板多核苷酸作为模板用于修复，从而将转基因有效插入基因组中的靶整合位点中。同源臂应当延伸至少远至其中可以进行末端切除的区域，例如以允许切除的单链突出端找到模板多核苷酸内的互补区。总长度可以受参数限制，所述参数例如质粒大小或病毒包装限制。在一些实施方案中，同源臂不延伸至重复的元件(例如，ALU重复或LINE重复)中。
示例性同源臂长度包括至少或至少约50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂的长度是50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000个核苷酸。
在一些实施方案中，靶位点(也称为“靶位置”、“靶DNA序列”或“靶定位”)是指靶DNA(例如，染色体)上被能够诱导遗传破坏的所述一种或多种药剂(例如，Cas9分子)修饰的位点。例如，靶位点可以是修饰的Cas9分子在靶位点处对DNA的切割，以及模板多核苷酸在靶位点处引导的修饰，例如转基因的靶向插入。在一些实施方案中，靶位点可以是向其中添加一个或多个核苷酸的DNA上的两个核苷酸(例如，相邻核苷酸)之间的位点。靶位点可以包含通过模板多核苷酸改变的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，靶位点在靶序列(例如，与gRNA结合的序列)内。在一些实施方案中，靶位点位于靶序列(例如，与gRNA结合的序列)的上游或下游。
在一些实施方案中，模板多核苷酸在内源基因处的靶位点的任一侧上包含约500至1000(例如，600至900或700至800)个同源性碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸在靶位点的5'、在靶位点的3'、或同时在靶位点的5'和3'包含约500、600、700、800、900或1000个同源性碱基对。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是指可以与核酸酶(例如Cas9分子)和/或gRNA分子结合用于改变靶位点的结构的核酸序列。在一些实施方案中，靶位点被修饰以具有模板多核苷酸的一些或全部序列，通常在一个或多个切割位点处或附近。在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，模板多核苷酸是双链的。在一些实施方案中，模板多核苷酸是DNA，例如双链DNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链DNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸在与Cas9和gRNA相同的载体骨架(例如，AAV基因组、质粒DNA)上编码。在一些实施方案中，模板多核苷酸在体内被从载体骨架中切除，例如，所述模板多核苷酸侧接gRNA识别序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸在与Cas9和gRNA分开的多核苷酸分子上。在一些实施方案中，Cas9和gRNA是以核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入的，并且模板多核苷酸是作为例如载体中的多核苷酸分子来引入的。
在一些实施方案中，模板多核苷酸通过参与同源定向修复事件改变靶位点的结构，例如插入转基因。在一些实施方案中，模板多核苷酸改变靶位点的序列。
在一些实施方案中，模板多核苷酸包括对应于靶序列上的位点的序列，所述位点被Cas9介导的切割事件切割。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括对应于靶序列上的第一位点和靶序列上的第二位点二者的序列，所述第一位点在Cas9介导的第一事件中被切割，所述第二位点在Cas9介导的第二事件中被切割。
模板多核苷酸通常包含以下组分：[5'同源臂]-[转基因]-[3'同源臂]。同源臂提供重组至染色体中，从而将转基因插入DNA中的切割位点(例如，一个或多个靶位点)处或附近。在一些实施方案中，同源臂侧接最远端切割位点。
在一些实施方案中，模板多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[编码报告分子的核酸序列]-[3'同源臂]。在一些实施方案中，5'同源臂和/或3'同源臂包含与一个或多个靶位点处存在的和/或其周围的核酸序列同源的核酸序列。
在一些实施方案中，5'同源臂包含与一个或多个靶位点的5'处的核酸序列同源的核酸序列。在一些实施方案中，3'同源臂包含与一个或多个靶位点的3'处的核酸序列同源的核酸序列。在一些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂的长度独立地是约50与100、100与250、250与500、500与750、750与1000、1000与2000个碱基对之间。
在一些实施方案中，5'同源臂的3'端是与转基因的5'端相邻的位置。在一些实施方案中，5'同源臂可以从转基因的5'端向5'延伸至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，3'同源臂的5'端是与转基因的3'端相邻的位置。在一些实施方案中，3'同源臂可以从转基因的3'端向3'延伸至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个核苷酸。
类似地，在一些实施方案中，模板多核苷酸具有5'同源臂、转基因和3'同源臂，使得所述模板多核苷酸在靶位点的任一侧上延伸基本上相同的距离。例如，同源臂可以具有不同的长度，但是可以选择转基因以对此进行补偿。例如，转基因向靶位点5'的延伸可以远于其向靶位点3'的延伸，但是靶位点5'的同源臂短于靶位点3'的同源臂以进行补偿。反过来也是可能的，例如，转基因向靶位点3'的延伸可以远于其向靶位点5'的延伸，但是靶位点3'的同源臂短于靶位点5'的同源臂以进行补偿。在一些实施方案中，对于靶向插入，同源臂(例如，5'和3'同源臂)可以各自包含侧接最远端gRNA的序列的约1000个碱基对(bp)(例如，遗传破坏或靶位点任一侧上的序列的1000bp)。
在一些实施方案中，模板多核苷酸含有靶向内源Nur77基因座(SEQ ID NO:1所示的内源人Nur77的示例性核苷酸序列；NCBI参考序列：NM_001202233.1，编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)的同源臂。在一些实施方案中，将Nur77基因座的遗传破坏引入基因的编码区的3'端处或附近，例如在编码区的最后一个外显子处或附近，包括紧接在终止密码子之前的序列，例如在编码序列的最后一个外显子内，或在终止密码子的500bp内(例如，小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp)。在一些实施方案中，将Nur77基因座的遗传破坏引入基因的早期编码区，包括紧接在转录起始位点之后、在编码序列的第一外显子内、或在转录起始位点的500bp内(例如，小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp)、或在起始密码子的500bp内(例如，小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp)的序列。
在一些实施方案中，模板多核苷酸在通过靶向核酸酶和/或gRNA引入的遗传破坏的任一侧上包含约500至1000(例如，600至900或700至800)个同源性碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含：5'同源臂序列的约500、600、700、800、900或1000个碱基对，其与遗传破坏(例如，在Nur77基因座处)的5'序列的500、600、700、800、900或1000个碱基对同源；转基因；以及3'同源臂序列的约500、600、700、800、900或1000个碱基对，其与遗传破坏(例如，在Nur77基因座处)的3'序列的500、600、700、800、900或1000个碱基对同源。
在一些实施方案中，选择遗传破坏的位置(例如，靶位点)和模板多核苷酸的设计，使得在引入遗传破坏和靶向整合转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)后，与内源基因(例如内源Nur77基因)同框。在一些实施方案中，将所述转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)在内源Nur77基因框内的最后一个外显子的末端附近整合或靶向整合，使得所述转基因的表达在内源Nur77转录调节元件的可操作控制下，同时允许内源Nur77多肽表达(在一些情况下，除了C末端的最后几个氨基酸以外)。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件/自我切割元件(如2A元件)被置于转基因编码序列的上游，使得核糖体跳跃元件/自我切割元件被置于与内源基因同框。在一些实施方案中，将所述转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)整合或靶向整合，使得内源Nur77转录调节元件控制内源Nur77多肽-T2A-报告分子的表达。
在一些示例性实施方案中，所编码的报告分子是或包括荧光蛋白、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其修饰形式。在一些实施方案中，荧光蛋白是或包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、超折叠GFP、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)或其变体(包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、以及密码子优化的和/或增强的变体)。在一些实施方案中，所编码的报告分子是红色荧光蛋白(RFP)，如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2。在一些实施方案中，所编码的报告分子是EGFP。例如，在一些实施方案中，编码所述报告分子的核酸序列包含SEQ ID NO:10所示的核酸序列或与SEQ ID NO:10中任一个展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所编码的报告分子包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:11中任一个展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，核糖体跳跃元件/自我切割元件(如T2A)可以引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致在2A序列末端与相邻下游肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic5:616-626(2004))。这允许插入的转基因受到整合位点处的内源启动子(例如Nur77启动子)的转录的控制。示例性核糖体跳跃元件/自我切割元件包括来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)(T2A，例如SEQ ID NO:6)和猪捷申病毒-1，如美国专利公开号20070116690中所述。在一些实施方案中，示例性核糖体跳跃元件/自我切割元件包括与SEQ ID NO:6中任一个展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括转基因(例如，编码报告分子的核酸序列)上游的T2A核糖体跳跃元件(SEQ ID NO:6或7所示的序列)。
在一些实施方案中，模板多核苷酸包含一个或多个突变(例如，沉默突变)，所述一个或多个突变防止RNA指导的核酸酶或DNA结合核酸酶融合蛋白识别和切割所述模板多核苷酸。相对于要改变的细胞的基因组中的相应序列，所述模板多核苷酸可以包含例如至少1、2、3、4、5、10、20或30个沉默突变。在一些实施方案中，相对于要改变的细胞的基因组中的相应序列，所述模板多核苷酸包含至多2、3、4、5、10、20、30或50个沉默突变。在一些实施方案中，转基因含有一个或多个突变(例如，沉默突变)，所述一个或多个突变防止Cas9识别并切割所述模板多核苷酸。相对于要改变的细胞的基因组中的相应序列，所述模板多核苷酸可以包含例如至少1、2、3、4、5、10、20或30个沉默突变。在一些实施方案中，相对于要改变的细胞的基因组中的相应序列，所述模板多核苷酸包含至多2、3、4、5、10、20、30或50个沉默突变。在一些实施方案中，含有在模板多核苷酸中的同源臂包括沉默突变，以防止RNA指导的核酸酶或DNA结合核酸酶融合蛋白识别并切割模板多核苷酸。
在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸含有：编码T2A核糖体跳跃元件的多核苷酸(SEQ ID NO:6所示的序列，编码SEQ ID NO:7所示的多肽序列)，编码萤光素酶(FFLuc2)的多核苷酸(SEQ ID NO:8所示的系列；编码SEQ ID NO:9所示的多肽序列)以及编码eGFP荧光蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO:10所示的序列；编码SEQ ID NO:11所示的多肽序列)，在T2A、FFLuc2和eGFP编码序列的任一侧上侧接与内源Nur77基因的终止密码子周围的序列同源的5'同源臂(如SEQ ID NO:12所示，与SEQ ID NO:1所示的相应Nur77基因组序列相比，含有2个沉默突变)和3'同源臂(如SEQ ID NO:13所示)。在一些实施方案中，可以将转基因(例如，T2A-EGFP-FFLuc2编码序列)靶向插入内源Nur77基因的框内并在终止密码子之前。在一些实施方案中，用于HDR的示例性模板多核苷酸包括SEQ ID:5所示的核酸序列。在一些实施方案中，用于引入遗传破坏或切割的示例性靶位点序列包含核酸序列TCATTGACAAGATCTTCATG(SEQ ID NO:14)和/或GCCTGGGAACACGTGTGCA(SEQ ID NO:15)。
2.病毒载体
在一些实施方案中，所述方法包括使细胞组合物(如第I.A.1节中所述的报告T细胞组合物)与制备的测试或参考病毒载体(也称为“病毒载体组合物”)接触。
在一些实施方案中，病毒载体(例如逆转录病毒载体，如慢病毒载体)在病毒载体的基因组中含有编码重组受体(如嵌合抗原受体(CAR)或其他抗原受体)的核酸。除了编码重组受体的核酸以外，所述病毒载体的基因组通常还包括其他序列。此类序列可以包括允许将基因组包装到病毒颗粒中的序列和/或促进编码重组受体(如CAR)的核酸表达的序列。
病毒载体(包括逆转录病毒载体)已成为将基因引入哺乳动物(例如人类)细胞中的主要方法。病毒载体的其他来源包括DNA病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒。用于生产载体(如含有编码重组受体的核酸的载体)的方法是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,纽约。在任何此类实施方案中的一些中，所述载体是腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒(如慢病毒)。
所提供的病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(如源自基于γ逆转录病毒或慢病毒基因组的载体)的基因组。许多合适的此类载体基因组中的任何一个都是已知的(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557；Pfeifer和Verma(2001)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.,2:177-211)。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如抗原受体，如CAR)的异源核酸被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
a.逆转录病毒载体
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在一些实施方案中，病毒载体颗粒是慢病毒载体颗粒。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR))的异源核酸(例如，多核苷酸)被包含在和/或位于载体基因组的5′LTR与3′LTR序列之间。在一些实施方案中，重组蛋白是抗原受体。在一些实施方案中，重组蛋白是T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，重组蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998；美国专利号6,013,516和5,994,136。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的必要序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998；美国专利号6,013,516和5,994,136。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的必要序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可以含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72:9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可以用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将此缺失转移到原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被拷贝到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在经转导细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录之后产生的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。也可以包括增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合型载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附接位点突变或缺失来防止整合，或者通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点两者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体还可以含有这样的基因，其表达赋予可检测或可选择标记，如抗药性。
b.逆转录病毒载体的制备
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因递送系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可以包含一个或多个编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列，即编码抗原受体(如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多个载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，这提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是众所周知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体粒子，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，可以回收并滴定所述重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
c.编码异源蛋白的核酸
在一些实施方案中，病毒载体含有编码异源重组蛋白的核酸(例如，多核苷酸)。在一些实施方案中，异源重组蛋白或分子是或包括重组受体(例如，抗原受体)、SB转座子(例如，用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如，用于基因组重组)或报告基因(例如，荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶。
在一些实施方案中，病毒载体含有编码重组受体和/或嵌合受体(如异源受体蛋白)的核酸(例如，多核苷酸)。重组受体(如异源受体)可以包括抗原受体，如功能性非TCR抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)和其他抗原结合受体，如转基因T细胞受体(TCR)。受体还可以包括其他受体，如其他嵌合受体，如与特定配体结合并且具有与CAR中存在的那些类似的跨膜和/或细胞内信号传导结构域的受体。
在任何此类例子中，将核酸(例如，多核苷酸)插入或定位在病毒载体的区域中，如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸(例如，多核苷酸)插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
在一些实施方案中，所编码的重组抗原受体(例如，CAR)是能够与要靶向的细胞或疾病上的一种或多种配体特异性结合的受体，所述疾病如癌症、感染性疾病、炎性或自身免疫性疾病或其他疾病或病症，包括本文所述用于以所提供的方法和组合物靶向的那些。
在某些实施方案中，示例性抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原(oncofetal antigen)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称作5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，示例性抗原是孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))，和/或生物素化的分子，和/或由HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体表达的分子和/或具有HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体的特征的分子或对HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体具有特异性的分子，和/或其致癌形式。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗原受体(包括CAR和重组TCR)及其产生和引入包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、WO 2015/168613、WO2016/030414，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、US20190389925，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。
1)嵌合抗原受体
在一些实施方案中，病毒载体基因组中所含的核酸(例如，多核苷酸)编码嵌合抗原受体(CAR)。CAR通常是基因工程化受体，其具有细胞外配体结合结构域，如含有抗体或其片段的细胞外部分，所述细胞外配体结合结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域和/或细胞内结构域。此类分子通常模拟或接近通过天然抗原受体发出的信号和/或通过这样的受体与共刺激受体的组合发出的信号。
在一些实施方案中，CAR被构建具有对特定标记的特异性，如在过继疗法所靶向的特定细胞类型中表达的标记，例如癌症标记和/或任何所述抗原。因此，CAR通常包括抗体的一个或多个抗原结合片段、结构域或部分、或一个或多个抗体可变结构域、和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如可变重链(VH)或其抗原结合部分、或源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，提供工程化细胞(如T细胞)，其表达对特定抗原(或标记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原如在特定细胞类型的表面上表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，所述抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包括胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域或区域)，如能够在T细胞中诱导初级激活信号的胞质(细胞内)区域，例如，T细胞受体(TCR)组分的胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)；和/或所述细胞内信号传导区包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，CAR包含与靶抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。
在一些实施方案中，嵌合受体还含有与配体(例如，抗原)抗原特异性结合的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有特异性地结合至抗原的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且所述抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类抗原受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.20135(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原如在待由过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/或旨在诱导衰减反应的抗原(如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或者一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包含抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域经由接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或类似通过天然抗原受体(如TCR)的信号，并且任选地模拟或类似通过这种受体与共刺激受体的组合的信号。
在一些实施方案中，重组受体(如嵌合受体(例如，CAR))包括与抗原(或配体)结合(如特异性结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的背景下表达的那些。疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些实施方案中，抗原与疾病或病症相关，所述疾病或病症如癌症、自身免疫性疾病或障碍或者感染性疾病。在一些实施方案中，抗原受体(例如，CAR)与通用标签特异性结合。
在一些实施方案中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，靶标是重组受体的抗原，因此在一些情况下，靶标表达细胞是抗原表达细胞。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，抗原(或配体)是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原(oncofetalantigen)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，抗原是或包括BCMA、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是或包括CD19。在一些实施方案中，抗原是或包括BCMA。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含SEQ ID NO:19所示的CDRH1、SEQ IDNO:20所示的CDRH2和SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:35所述的CDRH3，以及SEQ ID NO:16所示的CDRL1和SEQ ID NO:17或36所示的CDR L2和SEQ ID NO:18或37所示的CDR L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:16的CDRL1序列、SEQ ID NO:17的CDRL2序列和SEQ ID NO:18的CDRL3序列的可变轻链以及含有SEQ ID NO:19的CDRH1序列、SEQ ID NO:20的CDRH2序列和SEQ ID NO:21的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:16的CDRL1序列、SEQ ID NO:36的CDRL2序列和SEQ ID NO:37的CDRL3序列的可变轻链以及含有SEQ ID NO:19的CDRH1序列、SEQ ID NO:20的CDRH2序列和SEQ ID NO:35的CDRH3序列的可变重链。
在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:22所示的可变重链区和SEQ ID NO:23所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:39所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:24展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含SEQ ID NO:28-30中分别所示的CDRH1、H2和H3，以及SEQ ID NO:25-27中分别所示的CDRL1、L2和L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:25的CDRL1序列、SEQ ID NO:26的CDRL2序列和SEQ ID NO:27的CDRL3序列的可变轻链以及含有SEQ ID NO:28的CDRH1序列、SEQ ID NO:29的CDRH2序列和SEQ ID NO:30的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:31所示的可变重链区和SEQ ID NO:32所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:33所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如，scFv或VH结构域)特异性识别抗原(如BCMA)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与BCMA特异性结合的抗体或抗原结合片段，或者是所述抗体或抗原结合片段的变体。
在一些实施方案中，CAR是对BCMA(例如人BCMA)具有特异性的抗BCMA CAR。先前已经描述了含有抗BCMA抗体(包括小鼠抗人BCMA抗体和人抗人抗体)的嵌合抗原受体以及表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060，WO 2016/090320，WO 2016090327，WO 2010104949A2和WO 2017173256。在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些方面，CAR含有结合或识别(例如，特异性结合)通用标签或通用表位的配体(例如，抗原)结合结构域。在一些方面，结合结构域可以结合分子、标签、多肽和/或表位，所述分子、标签、多肽和/或表位可以连接至识别与疾病或障碍相关的抗原的不同结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。示例性标签或表位包括染料(例如，异硫氰酸荧光素)或生物素。在一些方面，结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)与标签连接，所述标签识别与疾病或障碍相关的抗原(例如，肿瘤抗原)，且工程化细胞表达对所述标签具有特异性的CAR，以实现工程化细胞的细胞毒性或其他效应子功能。在一些方面，CAR对与疾病或障碍相关的抗原的特异性由带标签的结合分子(例如，抗体)提供，并且不同的带标签的结合分子可以用于靶向不同抗原。对通用标签或通用表位具有特异性的示例性CAR包括例如以下文献中所述的那些：U.S.9,233,125；WO 2016/030414；Urbanska等人,(2012)Cancer Res 72:1844-1852；和Tamada等人,(2012).Clin Cancer Res 18:6436-6445。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，如特异性识别作为MHC-肽复合物于细胞表面上呈递的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是具有跨膜α链(在一些情况下具有三个α结构域)和非共价缔合的β2微球蛋白的异二聚体。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β构成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，所述有效部分含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所必需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(如通常是CD8+T细胞，但是在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中肽通常被CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，它们在小鼠中统称为H-2，并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，如用于由抗原受体识别。通常，肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，肽通常具有约8至约24个氨基酸的长度。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，从而诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可以通过已知方法产生(参见例如，美国公开申请号US2002/0150914；US2003/0223994；US2004/0191260；US2006/0034850；US2007/00992530；US20090226474；US20090304679；和国际PCT公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主施用有效量的免疫原以用于引发免疫反应，其中免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫反应的时间。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如，美国公开申请号US20020150914、US2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合的片段(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别地选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过对天然存在的完整抗体进行酶消化产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR的细胞外部分(如其抗体部分)还包括间隔子，如抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区域。间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。在一些实施方案中，间隔子具有SEQID NO:40所示的序列，并且由SEQ ID NO:41所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:42所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:43所示的序列。
在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQID NO:44所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有与SEQ ID NO:40、42、43和44中任一个展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，间隔子具有为或为约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有以下的那些：至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括仅IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公开号WO 2014/031687。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:40所示的序列，并且由SEQ ID NO:41所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:42所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:43所示的序列。
在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQID NO:44所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有与SEQ ID NO:40、42、43和44中任一个展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
细胞外配体结合结构域(如抗原识别结构域)通常与一个或多个细胞内信号传导组分连接，所述一个或多个细胞内信号传导组分如在CAR的情况下模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或通过另一细胞表面受体传导信号的信号传导组分。在一些实施方案中，跨膜结构域连接细胞外配体结合结构域与细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜信号传导区和细胞内信号传导区连接。在一些实施方案中，CAR包含与细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然地与受体(例如，CAR)中的结构域之一缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。
在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。
重组受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种其他分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，受体的胞质结构域和/或区域或细胞内信号传导结构域和/或区域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助细胞活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区(例如，包含一种或多种细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然情境下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
T细胞激活在一些方面被描述为由至少如下两类胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括这样的信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自以下的那些：TCR或CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在某些实施方案中，含有ITAM的初级胞质信号传导序列包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、CD27、DAP10和/或ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包括激活或信号传导区和共刺激组分两者。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，CAR是刺激或激活CAR；在其他方面，它是共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，例如识别不同抗原的CAR，其中通过识别第一抗原的CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体的结合而被减少或抑制，例如，以减少脱靶效应。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括与CD3细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137共刺激结构域。
在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域与CD4+辅助T细胞的细胞内信号传导结构域相同。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域与CD4+辅助T细胞的细胞内信号传导结构域不同。
在一些实施方案中，CAR包含在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，由所提供的病毒载体内的一种或多种核酸(例如，一种或多种多核苷酸)编码的一种或多种重组受体(例如，CAR)还包括一种或多种标记，例如用于确认要表达受体的细胞的转导或工程化和/或对表达由多核苷酸编码的一种或多种分子的细胞的选择和/或靶向的目的。在一些方面，这种标记可以由不同的核酸或多核苷酸编码，所述核酸或多核苷酸也可以在基因工程化过程期间被引入，通常通过相同的方法(例如，通过本文所提供的任何方法转导，例如通过相同的载体或相同类型的载体转导)被引入。
在一些方面，标记(例如，转导标记)是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性标记是天然存在的(例如，内源性)标记(如天然存在的细胞表面分子)的截短的变体。在一些方面，与天然或内源细胞表面分子相比，变体具有降低的免疫原性、降低的运输功能和/或降低的信号传导功能。在一些实施方案中，标记是细胞表面受体的截短形式，如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如，截短形式)(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割的接头序列，例如T2A、P2A、E2A和/或F2A)的多核苷酸可操作地连接。参见例如，WO 2014/031687。
在一些实施方案中，标记是并非在T细胞上天然发现或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。
在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即不被细胞过继转移至其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标记不提供治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或原本发挥一定所需作用的分子，如在体内所遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的反应。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面包含不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括细胞外配体结合部分(如抗原结合部分，如抗体或其片段)和细胞内结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接和/或设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区或结构域之间的跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜结构域通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及细胞内信号传导结构域(含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体)。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及细胞内信号传导结构域(含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体)。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的一部分的跨膜结构域包含SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含人CD28的胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处LL被GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区和/或结构域可以包含SEQ IDNO:47或48所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:47或48展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域和/或结构域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42氨基酸胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:49展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区和/或结构域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含SEQ ID NO:50、51或52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50、51或52展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:40所示的仅铰链的间隔子。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:42所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:43中所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分(如抗原结合部分，如抗体或其片段，包括sdAb和scFv)，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28的一部分或其变体；细胞内信号传导结构域，其含有CD28的信号传导部分或其功能变体；以及CD3ζ信号传导结构域的信号传导部分或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分(如抗原结合部分，如抗体或其片段，包括sdAb和scFv)，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28的一部分或其变体；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体；以及CD3ζ信号传导结构域的信号传导部分或其功能变体。
在一些实施方案中，此类CAR构建体还包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子例如在编码CAR的序列的下游还包括编码核糖体跳跃元件(例如，T2A)的序列，然后是编码tEGFR序列的序列。在一些实施方案中，还可以产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以表达截短EGFR(EGFRt)作为非免疫原性选择表位(例如，通过引入编码由T2A核糖体开关隔开的CAR和EGFRt的构建体以从相同构建体表达两种蛋白质)，然后可以使用所述截短EGFR作为标记来检测此类细胞(参见例如，美国专利号8,802,374)。在一些情况下，肽(如T2A)可以导致核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。已知许多2A元件。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A)、马甲型鼻炎病毒(E2A)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A)和猪捷申病毒-1(P2A)，如美国专利公开号20070116690中所述。
由施用至受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性结合在所治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或为所治疗的疾病或病症或其细胞所特有的分子。在与分子(例如抗原)特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，所述细胞表达与抗原特异性结合的CAR，所述抗原由疾病或病症的细胞或组织表达或与疾病或病症相关。
3.转导
在任何所提供的实施方案中，所提供的方法包括通过转导将病毒载体引入报告细胞的方法。在一些实施方案中，转导细胞包括使病毒载体颗粒与包含多个报告细胞的细胞组合物接触(例如，孵育)。
在一些实施方案中，在通过将细胞与病毒载体颗粒一起孵育来转导它们之前，在刺激条件下孵育或已孵育细胞组合物(例如，转导组合物)。在一些方面，在孵育之前，细胞组合物的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞是经激活的细胞，例如表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包括选自IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子的细胞内表达；处于细胞周期的G1期或较后期；和/或能够增殖。在一些方面，在孵育之前，细胞组合物的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的T细胞是经激活的细胞，例如表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包括选自IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子的细胞内表达；处于细胞周期的G1期或较后期；和/或能够增殖。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，细胞组合物可以包含一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子选自IL-2、IL-7或IL-15。在一些实施方案中，细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，细胞组合物中细胞因子的浓度独立地从或从约1IU/mL至1500IU/mL，如从或从约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL、100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，细胞组合物中细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。在一些方面，也可以在孵育期间或在孵育的至少一部分期间或在孵育之后，包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(如抗CD3和/或抗CD28抗体)。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，细胞组合物可以包含血清。在一些实施方案中，血清是胎牛血清。在一些实施方案中，血清是人血清。在一些实施方案中，血清以从或从约0.5％至25％(v/v)、1.0％至10％(v/v)或2.5％至5.0％(v/v)的浓度存于细胞组合物中，每个都包含端值。在一些实施方案中，血清以至少或至少约0.5％(v/v)、1.0％(v/v)、2.5％(v/v)、5％(v/v)或10％(v/v)的浓度存于细胞组合物中。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，细胞组合物不含和/或基本上不含血清。在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，在不存在血清的情况下孵育和/或接触细胞组合物。在特定实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，在无血清培养基中孵育和/或接触细胞组合物。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在一些实施方案中，配制无血清培养基以支持某种细胞类型(如免疫细胞、T细胞和/或CD4+和CD8+T细胞)的细胞的生长、增殖、健康、稳态。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，细胞组合物包含N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，细胞组合物中N-乙酰半胱氨酸的浓度为从或从约0.4mg/mL至4mg/mL、0.8mg/mL至3.6mg/mL或1.6mg/mL至2.4mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞组合物中N-乙酰半胱氨酸的浓度为至少或至少约或约0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL或4.0mg/mL。
在一些实施方案中，进行多次转导以产生多个报告T细胞，所述报告T细胞已经引入编码重组受体的病毒载体。在一些实施方案中，将滴定量的病毒载体添加到多个报告细胞组合物中的每一个中。在一些实施方案中，每个滴定量是病毒载体批次(例如，测试病毒载体批次)的连续稀释。在一些实施方案中，将病毒载体稀释2倍至10,000倍或更多，如2倍至5,000倍、2倍至2,000倍。可以凭经验确定具体稀释范围，这取决于所使用的病毒载体和编码的重组受体。例如，特定的稀释范围是在多个滴定量中通过将参考标准品与重组受体刺激剂一起孵育后导致可检测信号的线性剂量响应增加的范围。在一些实施方案中，特定范围的连续稀释物被选择为还包括可检测信号的下渐近线和可检测信号的上渐近线，它们分别代表最小和最大响应。
在一些实施方案中，细胞组合物的细胞浓度为从或从约1.0x 105个细胞/mL至1.0x 108个细胞/mL，如至少或约至少或约1.0x 105个细胞/mL、5x 105个细胞/mL、1x 106个细胞/mL、5x 106个细胞/mL、1x 107个细胞/mL、5x 107个细胞/mL或1x 108个细胞/mL。
在一些实施方案中，细胞组合物(例如，转导组合物)包含至少为或约至少为或为约25x 106个细胞、50x 106个细胞、75x 106个细胞、100x 106个细胞、125x 106个细胞、150x106个细胞、175x 106个细胞、200x 106个细胞、225x 106个细胞、250x 106个细胞、275x 106个细胞或300x 106个细胞。例如，在一些实施方案中，细胞组合物(例如，转导组合物)包含至少为或约至少为或为约50x 106个细胞、100x 106个细胞或200x 106个细胞。
在一些实施方案中，细胞组合物(例如，转导组合物)包含至少为或约至少为或为约25x 105个细胞、50x 105个细胞、75x 105个细胞、100x 105个细胞、125x 105个细胞、150x105个细胞、175x 105个细胞、200x 105个细胞、225x 105个细胞、250x 105个细胞、275x 105个细胞或300x 105个细胞。例如，在一些实施方案中，细胞组合物(例如，转导组合物)包含至少为或约至少为或为约50x 105个细胞、100x 105个细胞或200x 105个细胞。
在一些实施方案中，以作为感染复数(MOI)的、病毒载体颗粒拷贝与细胞总数的一定比率来提供病毒载体颗粒。在一些实施方案中，MOI可以指药剂(例如病毒载体拷贝)与感染靶标(例如细胞)的比率。在一些实施方案中，在报告T细胞群体中，MOI在0.01-10个颗粒/细胞之间。在一些实施方案中，在报告T细胞群体中，MOI是0.001-10个颗粒/细胞。在一些实施方案中，在报告T细胞群体中，MOI是至少0.001、0.01、0.10、1.0或10个颗粒/细胞。在一些实施方案中，在报告T细胞群体中，MOI是0.001、0.01、0.10、1.0或10个颗粒/细胞。
在一些实施方案中，以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与报告T细胞的细胞组合物中的细胞总数或待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)(例如，作为如本文所述的MOI的某一比率)来提供病毒载体颗粒。例如，在一些实施方案中，病毒载体颗粒在接触期间以为或为约或者至少为或为约0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒/细胞存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x 106IU/mL与1x 108IU/mL之间，如在或在约5x 106IU/mL与5x 107IU/mL之间。在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度为至少6x 106IU/mL、7x 106IU/mL、8x 106IU/mL、9x 106IU/mL、1x 107IU/mL、2x 107IU/mL、3x 107IU/mL、4x 107IU/mL或5x 107IU/mL。在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度为或为约6x 106IU/mL、7x 106IU/mL、8x 106IU/mL、9x 106IU/mL、1x 107IU/mL、2x 107IU/mL、3x107IU/mL、4x 107IU/mL或5x 107IU/mL、或任何前述值之间的任何值。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒载体颗粒接触或一起孵育，如混合。在一些实施方案中，接触或孵育进行30分钟至72小时，如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时或36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触或孵育是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以如下体积接触：从或从约0.5mL至500mL，如从或从约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在一些实施方案中，接触或孵育是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以如下体积接触：从或从约1μL至1mL，如从或从约2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、40μL、50μL、100μL、200μL、400μL、500μL或1mL、或任何前述值之间的任何值。
在某些实施方案中，工程化、转导和/或转染的至少一部分以如下体积进行：从约5mL至约100mL，如从约10mL至约50mL、从约15mL至约45mL、从约20mL至约40mL、从约25mL至约35mL，或为或为约30mL。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于和/>2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统以及处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育还包括使组合物(例如，经刺激的组合物)和/或病毒载体颗粒与转导佐剂接触。在一些实施方案中，组合物(例如，经刺激的组合物)和/或病毒载体颗粒与转导佐剂的接触是在将病毒载体颗粒与组合物(例如，经刺激的组合物)一起旋转接种之前、同时或之后进行。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的孵育的至少一部分是在或在约37℃±2℃下进行。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒的孵育的至少一部分是在或在约35℃-39℃下进行。在一些实施方案中，在或在约37℃±2℃下进行的病毒载体颗粒的孵育的至少一部分进行不超过或不超过约2小时、4小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在一些实施方案中，在或在约37℃±2℃下进行的病毒载体颗粒的孵育的至少一部分进行或进行约24小时。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的孵育的至少一部分是在接种之后进行。在一些实施方案中，在接种之后进行的病毒载体颗粒的孵育的至少一部分进行不超过或不超过约2小时、4小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在一些实施方案中，在接种之后进行的病毒载体颗粒的孵育的至少一部分进行或进行约24小时。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的孵育的总持续时间不超过12小时、24小时、36小时、48小时或72小时。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育导致或产生包含被病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物，其在本文中也被称为经转导的细胞群。因此，在一些实施方案中，经转导的细胞群包含被异源多核苷酸转导的T细胞。在一些实施方案中，经转导的细胞群中至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的T细胞被异源多核苷酸转导。在一些实施方案中，经转导的细胞群中至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的T细胞被异源多核苷酸转导。在一些实施方案中，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的被异源多核苷酸转导的T细胞呈CCR7+。
在一些实施方案中，经转导的细胞群包含至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的表达重组蛋白的细胞。在一些实施方案中，经转导的细胞群包含至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的表达重组蛋白的细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括一个或多个另外的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括从经转导的细胞群中回收或分离通过所述方法产生的经转导的细胞。在一些实施方案中，回收或分离包括针对重组蛋白(例如，CAR或TCR)的表达进行选择。
可以将经转导的细胞群中被异源多核苷酸转导的T细胞的百分比与其他经转导的细胞群中经转导的T细胞的百分比进行比较，例如，可以比较多个经转导的细胞群中被异源多核苷酸转导的T细胞的百分比。在一些实施方案中，相对于多个群体之间的平均转导百分比，多个群体中经转导的T细胞的百分比之间的最大可变性小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％。例如，包括70％、80％和90％的转导百分比的多个经转导的细胞群具有12.5％的最大可变性。在一些实施方案中，多个经转导的细胞群包括至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个经转导的细胞群。
B.经由结合剂对经转导的报告细胞进行重组受体依赖性刺激
本文提供的评估效力的方法包括刺激引入了重组受体的报告T细胞的重组受体(例如，CAR、TCR)的手段。可预期的是，可以使用适于刺激重组受体也能够被定量的任何手段。在一些实施方案中，刺激重组受体的手段通过重组受体刺激剂来实现，所述重组受体刺激剂能够结合并刺激重组受体发出的细胞内信号，以产生来自报告物的可检测信号，如在第I-C节中所述。示例性重组受体刺激剂包括重组受体的抗原(例如纯化的或重组的抗原)、抗体(如抗独特型抗体)和抗原表达细胞。
1.表面固定剂
在特定实施方案中，重组受体刺激剂由结合分子组成，所述结合分子能够被固定在表面支持物上的重组受体结合。在所提供的实施方案中，结合分子可以是重组受体的抗原或抗原的一部分(例如抗原的细胞外部分)或对重组受体具有特异性的抗体(例如抗独特型抗体)。例如，结合分子(例如抗原或其结合部分，或抗体)可以固定或结合到表面支持物(如非细胞颗粒)上，其中使治疗性组合物的重组受体表达细胞(例如CAR-T细胞)(例如，滴定量的细胞)与表面支持物接触。在一些实施方案中，本文所述的颗粒(例如珠颗粒)提供了固体支持物或基质，结合分子(例如抗原或其结合部分，或抗独特型抗体)能以允许结合分子与细胞之间相互作用(特别是结合分子与细胞表面上表达的重组受体(例如CAR)之间的结合)的方式结合或附接至所述固体支持物或基质上。在特定实施方案中，缀合或附接的结合分子与细胞之间的相互作用介导对重组受体的刺激，包括一种或多种重组受体依赖性活性，如所述的激活、扩增、细胞因子产生、细胞毒性活性或其他活性，参见例如第I.C节。
在某些实施方案中，表面支持物是结合分子(例如抗原或其结合部分，或抗独特型抗体)被固定或附接的颗粒(例如，珠颗粒)。在一些实施方案中，表面支持物是固体支持物。在一些例子中，固体支持物是珠，并且抗原或其部分固定在珠上。在一些实施方案中，固体支持物是孔或板(例如细胞培养板)的表面。在一些实施方案中，表面支持物是可溶性寡聚颗粒，并且抗原被固定在可溶性寡聚颗粒的表面上。用于固定或附接用于识别或结合重组受体的试剂(例如结合分子)的表面支持物的例子可以在公开的国际申请WO 2019/027850中找到，将该申请出于所有目的通过引用并入。
在特定实施方案中，表面支持物是颗粒，其可以包括胶体颗粒、微球体、纳米颗粒、珠(如磁珠)等。在一些实施方案中，颗粒或珠是生物相容的，即无毒的。在某些实施方案中，颗粒或珠对培养的细胞(例如培养的T细胞)而言是无毒的。在特定实施方案中，颗粒是单分散的。在某些实施方案中，“单分散的”涵盖具有如下尺寸分散的颗粒(例如珠颗粒)，所述尺寸分散具有小于5％的标准差，例如直径具有小于5％的标准差。
在一些实施方案中，颗粒或珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)对培养的细胞(例如培养的T细胞)而言是无毒的。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)可以是能以允许结合分子与细胞之间相互作用的方式附接结合分子的任何颗粒。在某些实施方案中，颗粒(例如珠)可以是可以被修饰(例如表面官能化)以允许结合分子附接在颗粒表面的任何颗粒。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)由玻璃、二氧化硅、羟基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酸酐、或羟基羧酸和二羧酸的共聚物构成。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)可以由以下构成或至少部分由以下构成：直链或支链的、取代的或未取代的、饱和的或不饱和的、线性的或交联的链烷基(alkanyl)、卤代烷基、硫代烷基、氨基烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基、或烷氧基羟基酸的聚酯；或者直链或支链的、取代的或未取代的、饱和的或不饱和的、线性的或交联的链烷基、卤代烷基、硫代烷基、氨基烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基或烷氧基二羧酸的聚酸酐。另外，颗粒(例如珠)可以是量子点，或由量子点构成，例如量子点聚苯乙烯颗粒(例如珠)。也可以采用包括酯和酸酐键的混合物(例如，乙醇酸和癸二酸的共聚物)的颗粒(例如珠)。例如，颗粒(例如珠)可以包含如下材料：聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)、[rho]聚(乳酸-共-癸二酸)共聚物(PLSA)、聚(乙醇酸-共-癸二酸)共聚物(PGSA)等。可以组成颗粒(例如珠)的其他聚合物包括以下项的聚合物或共聚物：己内酯、碳酸酯、酰胺、氨基酸、原酸酯、缩醛、氰基丙烯酸酯和可降解的乌拉坦，以及它们与直链或支链的、取代或未取代的链烷基、卤代烷基、硫代烷基、氨基烷基、烯基、或芳族羟基羧酸或二羧酸的共聚物。此外，具有反应性侧链基团的在生物学上重要的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸、或它们的对映异构体可以被包括在具有任何上述材料的共聚物中，以提供用于与结合分子(如多肽抗原或抗体)缀合的反应性基团。
在一些实施方案中，颗粒是具有以下直径的珠：大于0.001μm、大于0.01μm、大于0.05μm、大于0.1μm、大于0.2μm、大于0.3μm、大于0.4μm、大于0.5μm、大于0.6μm、大于0.7μm、大于0.8μm、大于0.9μm、大于1μm、大于2μm、大于3μm、大于4μm、大于5μm、大于6μm、大于7μm、大于8μm、大于9μm、大于10μm、大于20μm、大于30μm、大于40μm、大于50μm、大于100μm、大于500μm、和/或大于1,000μm。在一些实施方案中，颗粒或珠具有在或在约0.001μm与1,000μm之间、0.01μm与100μm之间、0.1μm与10μm之间、0.1μm与100μm之间、0.1μm与10μm之间、0.001μm与0.01μm之间、0.01μm与0.1μm之间、0.1μm与1μm之间、1μm与10μm之间、1μm与2μm之间、2μm与3μm之间、3μm与4μm之间、4μm与5μm之间、1μm与5μm之间、和/或5μm与10μm之间(每个都包含端值)的直径。在某些实施方案中，颗粒或珠具有1μm和10μm(每个都包含端值)的平均直径。在某些实施方案中，颗粒(例如珠)具有为或为约1μm的直径。在特定实施方案中，颗粒(例如珠)具有为或为约2.8μm的平均直径。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)具有为或为约4.8μm的直径。
可以生产或商业地获得在本文所述的方法中使用的颗粒(例如珠颗粒)。颗粒(例如珠)，包括生产颗粒(例如珠)的方法，是本领域熟知的。参见例如，美国专利号6,074,884；5,834,121；5,395,688；5,356,713；5,318,797；5,283,079；5,232,782；5,091,206；4,774,265；4,654,267；4,554,088；4,490,436；4,452,773；美国专利申请公开号20100207051；以及Sharpe,Pau T.,Methods of Cell Separation,Elsevier,1988。可商购获得的颗粒(例如珠)(例如珠颗粒)包括但不限于ProMagTM(PolySciences,Inc.)；COMPELTM(PolySciences,Inc.)；(PolySciences,Inc.)，包括/>Plus(PolySciences,Inc.)和/>Maxi(Bang Laboratories,Inc.)；M-PVA(CehmagenBiopolymer Technologie AG)；SiMAG(Chemicell GmbH)；beadMAG(Chemicell GmbH)；(Cortex Biochem)；/>(Invitrogen)，包括/>M-280绵羊抗兔IgG(Invitrogen)、/>FlowCompTM(例如，/>FlowCompTMHumanCD3，Invitrogen)、/>M-450(例如，/>M-450Tosylactivated，Invitrogen)、/>UntouchedTM(例如，/>UntouchedTM人CD8T细胞，Invitrogen)、和结合、扩增和/或激活T细胞的/>(例如，用于T细胞扩增和激活的人T-激活因子CD3/CD28，Invitrogen)；/>M(Merk Chimie SAS)；EM(Merk Chimie SAS)；MACSiBeadsTM颗粒(例如，抗生物素MACSiBead颗粒，Miltenyi Biotec，目录号130-091-147)；/>磁珠(IBA BioTAGnology)；Strep-磁珠(IBA BioTAGnology)；/>-M(Micormod Partikeltechnologie GmbH)-M(Micromod Partikeltechnologie)；MagneSilTM(Promega GmbH)；MGP(RocheApplied Science Inc.)；PierceTM蛋白质G磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM蛋白质A磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM蛋白质A/G磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTMNHS激活的磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；PierceTM蛋白质L磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM抗HA磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM抗c-Myc磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；PierceTM谷胱甘肽磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM链霉亲和素磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；MagnaBindTM磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；Sera-MagTM磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；抗/>M2磁珠(Sigma-Aldrich)；SPHEROTM磁性颗粒(Spherotech Inc.)；和HisPurTM Ni-NTA磁珠(ThermoFisher Scientific Inc.)。
在某些实施方案中，抗原或其细胞外结构域部分经由共价化学键与颗粒(例如珠)结合。在特定实施方案中，抗原或其细胞外结构域部分的氨基酸的反应性基团或部分通过直接化学反应直接与颗粒表面上的反应性基团或部分缀合。在某些实施方案中，抗原或其细胞外结构域部分的氨基酸羧基基团(例如，C末端羧基基团)、羟基、硫醇或胺基团(如氨基酸侧链基团)通过直接化学反应直接缀合至在颗粒表面上的PLA或PGA聚合物的羟基或羧基基团，树状聚合物的末端胺或羧基基团，或者磷脂的羟基、羧基或磷酸基团。在一些实施方案中，缀合部分与结合分子和颗粒两者缀合(例如共价结合)，从而将它们连接在一起。
在某些实施方案中，颗粒的表面包含允许结合分子(例如多肽抗原或抗体)的附接(例如，共价、非共价)的化学部分和/或官能团。在特定实施方案中，颗粒表面含有暴露的官能团。合适的表面暴露的官能团包括但不限于羧基、氨基、羟基、硫酸基团、甲苯磺酰基、环氧基和氯甲基基团。在一些实施方案中，结合分子是多肽，并且与表面暴露的官能团缀合。在一些实施方案中，表面暴露的官能团必须被激活，即它必须经历化学反应以产生能够直接结合多肽的中间体产物。例如，可以用上述药剂激活多肽分子的羧基基团，以生成能够与颗粒的表面暴露的氨基基团直接结合的中间体酯。在其他例子中，可以使用磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)化学将表面支持物(例如珠)表面上的游离胺基团共价结合至抗原肽和蛋白质、或抗原肽或蛋白质融合蛋白。在又其他特定实施方案中，多肽结合分子在形成共价附接之前不需要通过药剂激活的表面暴露的官能团处共价附着于颗粒(例如珠颗粒)。此类官能团的例子包括但不限于甲苯磺酰基、环氧基和氯甲基基团。
在一些实施方案中，结合至抗原肽或蛋白质的配体与附着于表面支持物(例如珠)的抗配体之间的非共价键可以将抗原与支持物(例如珠)缀合。在一些实施方案中，可以将生物素连接酶识别序列标签与抗原肽或蛋白质的C末端连接，并且这种标签可以通过生物素连接酶生物素化。然后，生物素可以用作配体，以将抗原肽或蛋白质与抗生物素蛋白或链霉亲和素非共价地缀合，所述抗生物素蛋白或链霉亲和素作为抗配体被吸附或以其他方式结合至载体表面。可替代地，如果如本文所述将结合分子(例如抗原)与带有Fc区的免疫球蛋白结构域融合，那么Fc结构域可以充当配体，并且与表面支持物(例如珠)表面共价或非共价地结合的蛋白质A可以用作抗配体，以将抗原肽或蛋白质与载剂非共价地缀合。可以用于将结合分子(例如抗原或抗独特型抗体)与表面支持物(例如珠)非共价缀合的其他手段是本领域熟知的，包括金属离子螯合技术(例如，在结合分子(例如抗原)的C末端使用聚His标签，以及Ni包被的表面支持物)，并且这些方法可以代替这里所述的那些方法。
在一些实施方案中，结合分子(例如抗原或抗独特型抗体)通过接头与颗粒缀合。在某些实施方案中，接头可以包括但不限于多种双功能蛋白偶联剂，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基二亚胺代己二酸酯HCL)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。具体的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键。
a.靶标，例如抗原
在一些实施方案中，重组受体刺激剂是或包括靶标，例如抗原、重组抗原或其片段。在一些实施方案中，所述靶标是所述重组受体的抗原。在一些实施方案中，重组受体刺激剂是或包括抗原，例如重组抗原或其片段。
例如，重组受体刺激剂可以是被固定或结合到表面支持物(如微孔板、固体颗粒(例如珠)或寡聚颗粒(例如，如上所述))上的靶标，如抗原。在一些实施方案中，靶标(例如抗原)是在与疾病相关的细胞(例如癌细胞和/或肿瘤细胞)表面上表达的多肽或多肽的变体或片段。应理解，靶标是被重组受体的细胞外结构域识别或结合的任何分子。在一些实施方案中，靶标是被重组受体的细胞外结构域识别或结合的抗体。在一些实施方案中，靶标是抗原，并且应理解，所述抗原是被重组受体的细胞外结构域识别或结合的抗原。技术人员可以确定靶标(如抗原)，并且所述靶标或抗原的形式(例如，在固体表面上表达或固定的细胞)足以刺激重组受体。
在一些实施方案中，靶标是由重组受体的细胞外结构域识别的抗原。在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原(oncofetal antigen)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包含多肽抗原的由重组受体(例如CAR)识别或结合的部分。在特定实施方案中，抗原的部分是含有由重组受体(例如CAR)识别或结合的表位的区域。在某些实施方案中，多肽抗原的部分含有由重组受体和或CAR识别或结合的多肽的约或至少10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500个氨基酸(在一些情况下，连续氨基酸)。在某些实施方案中，多肽部分包含由重组受体和/或CAR识别的表位的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原或其部分是多肽变体，所述多肽变体与由重组受体和/或CAR结合和/或识别的多肽具有为、约或至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的氨基酸序列同一性。
在某些实施方案中，重组受体(例如CAR)的细胞外结构域对BCMA具有特异性或与BCMA结合，并且抗原是BCMA或BCMA的细胞外结构域部分。在一些实施方案中，BCMA多肽是哺乳动物BCMA多肽。在特定实施方案中，BCMA多肽是人BCMA多肽。在一些实施方案中，BCMA抗原是或包含BCMA的细胞外结构域或其部分，所述细胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。在某些实施方案中，BCMA抗原是或包含具有与SEQ ID NO:53具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:53的至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，BCMA抗原是或包括SEQ ID NO:53所示的序列或其部分，所述序列或其部分是或含有由抗原受体(例如CAR)识别的表位。
在某些实施方案中，重组受体(例如CAR)的细胞外结构域对ROR1具有特异性或与ROR1结合，并且抗原是ROR1或ROR1的细胞外结构域部分。在某些实施方案中，ROR1多肽是哺乳动物的。在特定实施方案中，ROR1多肽是人的。在一些实施方案中，抗原是ROR1的细胞外结构域或其部分，所述细胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。在一些实施方案中，抗原是具有与SEQ ID NO:49具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:49的至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，ROR1抗原包含SEQ ID NO:49所示的序列或其部分，所述序列或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。
在某些实施方案中，重组受体(例如CAR)的细胞外结构域对CD22具有特异性或与CD22结合，并且抗原是CD22或CD22的细胞外结构域部分。在某些实施方案中，CD22多肽是哺乳动物的。在特定实施方案中，CD22多肽是人的。在一些实施方案中，抗原是CD22的细胞外结构域或其部分，所述细胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。在一些实施方案中，抗原是具有与SEQ ID NO:54具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:54的至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD22抗原包含SEQ ID NO:54所示的序列或其部分，所述序列或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。
在某些实施方案中，重组受体(例如CAR)的细胞外结构域对CD19具有特异性或与CD19结合，并且抗原是CD19或CD19的细胞外结构域部分。在某些实施方案中，CD19多肽是哺乳动物的。在特定实施方案中，CD19多肽是人的。在一些实施方案中，抗原是CD19的细胞外结构域或其部分，所述细胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。在一些实施方案中，抗原是具有与SEQ ID NO:45具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:45的至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD19抗原包含SEQ ID NO:45所示的序列或其部分，所述序列或其部分包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位。
在一些实施方案中，抗原或其部分可以呈由重组受体(如抗原受体(例如CAR))识别和/或结合的多聚体(例如二聚体)形式，所述多聚体包含两个或更多个多肽抗原或其部分或变体。在一些实施方案中，多肽抗原或其部分是相同的。在某些实施方案中，多肽抗原直接或间接地连接至区域或结构域(例如多聚化结构域)，所述区域或结构域经由结构域或区域之间的互补相互作用促进或稳定两个或更多个多肽抗原之间的相互作用。在一些实施方案中，提供呈多聚体(例如二聚体)形式的多肽抗原提供了抗原或其细胞外结构域部分与抗原受体(例如CAR)的抗原结合结构域之间的多价相互作用，这在一些方面可以增加相互作用的亲合力。在一些实施方案中，通过与珠缀合的抗原或其细胞外结构域部分，增加的亲合力可能有利于抗原受体(例如CAR)的刺激或激动活性。
在一些实施方案中，将多肽直接或间接地连接至多聚化结构域。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、和相容的蛋白质间相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰的形式的Fc结构域或其部分。在特定实施方案中，将多肽抗原直接或间接地连接至Fc结构域。在一些实施方案中，多肽是包含多肽抗原或其部分和Fc结构域的融合多肽。
在特定实施方式中，抗原或其细胞外结构域部分是包含Fc结构域的融合多肽。在一些实施方案中，Fc结构域由IgG、IgA或IgD同种型的重链的第二和第三恒定结构域(即CH2和CH3结构域)(例如IgG、IgA和IgD同种型的CH2或CH3)构成。在一些实施方案中，Fc结构域由IgM或IgE同种型的三个重链恒定结构域(即，CH2、CH3和CH4结构域)构成。在一些实施方案中，Fc结构域可还包括铰链序列或其部分。在某些方面，Fc结构域含有免疫球蛋白分子的铰链结构域的部分或全部以及CH2和CH3结构域。在一些情况下，Fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，Fc结构域源自合适的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊或猴子)的免疫球蛋白(例如IgG、IgA、IgM或IgE)。在一些实施方案中，Fc结构域包含IgG的CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域与多肽抗原的C末端融合。在特定实施方案中，Fc结构域与多肽抗原的N末端融合。
在一些实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域或其部分或变体。在一些实施方案中，Fc结构域是人IgG Fc结构域或其部分或变体，其包含SEQ ID NO:46示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:46所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Fc结构域是野生型人IgG Fc结构域或其部分或变体。在特定实施方案中，Fc结构域是野生型人IgG1 Fc结构域的变体。
在一些实施方案中，融合多肽包含变体Fc结构域。在某些实施方案中，变体人IgGFc结构域含有降低、减少和/或减损Fc结构域与轻链之间配对的突变(例如取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域含有降低Fc结构域与Fc受体之间的结合亲和力的突变。在特定实施方案中，变体人IgG Fc结构域含有降低、减少和/或减损Fc结构域与Fc受体之间的相互作用或相互作用概率或可能性的突变。在一些实施方案中，变体人IgGFc结构域含有降低Fc结构域与补体系统的蛋白质之间的结合亲和力的突变。在特定实施方案中，变体人IgG Fc结构域含有降低、减少和/或减损Fc结构域与补体系统的蛋白质之间的相互作用或相互作用概率或可能性的突变。
在一些实施方案中，抗原或其部分与变体人IgG1 Fc结构域连接。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的铰链区中含有胱氨酸至丝氨酸的取代。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的铰链区中含有亮氨酸至丙氨酸的取代。在特定实施方案中，变体人IgG Fc结构域在铰链区中含有甘氨酸至丙氨酸的取代。在某些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的CH2区中含有丙氨酸至丝氨酸的取代。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的CH2区中包含脯氨酸至丝氨酸的取代。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供呈包含Fc结构域的融合多肽形式的抗原或其细胞外结构域部分，其中所述Fc结构域存在于融合多肽的C末端处。
在一些实施方案中，抗原和多聚化结构域(如Fc结构域)通过接头(如氨基酸接头)连接。在某些实施方案中，抗原与氨基酸接头的N末端融合，并且多聚化结构域(如Fc结构域)与接头的C末端融合。尽管氨基酸接头可以是任何长度并且含有氨基酸的任何组合，但是接头长度可相对较短(例如十个或更少的氨基酸)以降低所连接结构域之间的相互作用。还可以调整接头的氨基酸组成以降低具有大侧链的氨基酸或可能引入二级结构的氨基酸的数量。合适的氨基酸接头包括但不限于长度为至多3、4、5、6、7、10、15、20或25个氨基酸的那些。代表性氨基酸接头序列包括GGGGS(SEQ ID NO:52)，以及包含2、3、4或5个拷贝的GGGGS的接头(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方案中，提供呈与Fc结构域融合(BCMA-Fc)的BCMA(例如人BCMA)的细胞外结构域形式的抗原。在特定实施方案中，BCMA-Fc抗原含有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的全部或部分、或与SEQ ID NO:48展现至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性并且包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供呈与Fc结构域融合(ROR1-Fc)的ROR1(例如人ROR1)的细胞外结构域形式的抗原。在某些实施方案中，ROR-1-Fc抗原含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的全部或部分、或与SEQ ID NO:50至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性并且包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位的氨基酸序列。
在特定实施方案中，提供呈与Fc结构域融合(例如CD22-Fc)的CD22(例如人CD22)的细胞外结构域形式的抗原。在某些实施方案中，CD22-Fc抗原含有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的全部或部分、或与SEQ ID NO:51展现至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性并且包含由抗原受体(例如CAR)识别的表位的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原或其细胞外结合结构域的Fc融合物作为二聚体连接或附着于表面支持物，所述二聚体由含有多肽抗原或其部分和Fc结构域的两个Fc融合多肽形成。在一些实施方案中，所得的多肽抗原-Fc融合蛋白(例如，BCMA-Fc、ROR1-Fc、CD22-Fc或CD19-Fc)可以在例如用表达载体转化的宿主细胞中表达，从而可以通过在Fc部分之间形成的链间二硫键发生Fc结构域之间的组装，以产生二聚体(如二价)多肽抗原融合蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞系。用于重组表达蛋白质的哺乳动物细胞的例子包括HEK293细胞或CHO细胞或其衍生物。在一些方面，编码Fc融合蛋白的核酸还包括用于从细胞中分泌的信号肽。在示例性实施方案中，信号肽是CD33(例如，SEQ ID NO:44所示)。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中的细胞表达CAR，所述CAR结合或识别可以与抗体或其片段或变体融合的通用标签。在特定实施方案中，表达此类CAR的细胞能够特异性地识别和杀伤已经由与通用标签融合的抗体结合的靶细胞(例如肿瘤细胞)。一个例子包括但不限于，当抗FITC CAR表达T细胞被癌症反应性FITC标记的抗体结合时，这些细胞可以结合和/或识别各种人癌细胞。因此，在一些实施方案中，与通用标签结合的相同CAR可用于治疗不同的癌症，条件是存在识别含有通用标签的癌症相关抗原的可用抗体。在特定实施方案中，颗粒(例如，珠颗粒)包含表面暴露的结合分子，所述结合分子包含能够由重组受体(例如CAR)结合或识别的通用标签结合分子。在某些实施方案中，结合分子是由抗原受体(例如CAR)结合或识别的通用标签或其部分。特定的实施方案设想可以与抗体或其抗原结合片段或变体融合的、不阻止抗体与其各自的靶标结合的任何多肽结构域均适合用作通用标签。在一些实施方案中，颗粒与包含通用标签或其部分的结合分子结合，所述通用标签或其部分选自：FITC、链霉亲和素、生物素、组氨酸、二硝基苯酚、多甲藻素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、PE、HRP、棕榈酰化、亚硝基化、碱性磷酸酶(alkalanine phosphatase)、葡萄糖氧化酶和麦芽糖结合蛋白。
b.抗体
在一些方面，结合分子是特异性识别重组受体(例如重组受体，例如CAR)的抗体(例如，抗独特型抗体)或其抗原结合片段(“抗ID”)，如第III节所述。特别地，抗独特型抗体靶向另一种抗体的抗原结合位点，如CAR的细胞外抗原结合结构域的scFv。在一些实施方案中，抗ID能够结合重组受体以刺激重组受体依赖性活性。针对抗原特异性CAR的示例性抗独特型抗体是已知的。这些包括但不限于针对以下各项的抗独特型抗体：CD22定向CAR，参见例如PCT公开号WO 2013188864；CD19定向CAR，参见例如PCT公开号WO 2018/023100；GPRC5D定向CAR，参见例如PCT申请号PCT/US2020/063497；和BCMA定向CAR，参见例如PCT申请号PCT/US2020/063492。抗独特型抗体可以被固定或附着于如上文所述的表面支持物(例如珠)上，以用作针对表达重组受体(例如CAR)的细胞的重组受体刺激剂，所述重组受体由抗独特型抗体靶向。
本文的术语“抗体”是以最广义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合片段(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“抗独特型抗体”是指特异性地识别、特异性地靶向和/或特异性地结合抗体的独特位(如抗原结合片段)的抗体(包括其抗原结合片段)。抗体的独特位可以包括但不必限于在抗体的一个或多个互补决定区(CDR)、抗体的可变区、和/或此类可变区和/或此类CDR的局部部分或部分、和/或前述的任何组合内的残基。CDR可以是选自以下中的一个或多个：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。抗体的可变区可以是重链可变区、轻链可变区、或重链可变区和轻链可变区的组合。抗体的重链可变区和/或轻链可变区的部分片段或部分可以是如下片段，所述片段包括在所述抗体的重链可变区或轻链可变区内的2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸，例如从约2至约100、从约5至约100、从约10至约100、从约2至约50、从约5至约50、或从约10至约50个连续氨基酸；所述独特位可以包括多个不连续的氨基酸延伸段。抗体的重链可变区和轻链可变区的部分片段可以是如下片段，所述片段包括在可变区内的2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸，例如从约2至约100、从约5至约100、从约10至约100、从约2至约50、从约5至约50、或从约10至约50个连续氨基酸，并且在一些实施方案中含有一个或多个CDR或CDR片段。CDR片段可以是在CDR内的连续或非连续的2个或更多个、或5个或更多个氨基酸。因此，抗体的独特位可以是在抗体的重链可变区或轻链可变区内的、含有一个或多个CDR或一个或多个CDR片段的从约2至约100、从约5至约100、从约10至约100、从约2至约50、从约5至约50、或从约10至约50个连续氨基酸。在另一个实施方案中，独特位可以是位于抗体的可变区(例如，CDR位点)的单个氨基酸。
在一些实施方案中，独特位是抗体的可变部分内的任何单一抗原决定簇或表位。在一些情况下，它可以与抗体的实际抗原结合位点重叠，并且在一些情况下，它可以包含在抗体的抗原结合位点之外的可变区序列。在一些实施方案中，抗体的单独独特位的集合被称为此类抗体的“独特型”。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，每个全长重链可变区有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且每个全长轻链可变区有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of ProteinsofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；和Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering schemeforimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对的，而Chothia方案是基于结构信息的。Kabat和Chothia方案的编号基于最常见的抗体区序列长度，其中通过插入字母例如“30a”提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。
下表1列出了分别通过Kabat、Chothia和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如FR-L1位于CDR-L1与CDR-L2之间，依此类推。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
表1
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2)涵盖如由任何上述方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这样的CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何上述方案所定义的。在一些实施方案中，规定了指定的CDR序列。
同样，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2)涵盖如由任何已知方案所定义的一个(或特定的)框架区。在一些情况下，规定了用于鉴定特定的CDR、FR或者FR或CDR的方案，如通过Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情形中，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都源自非人CDR并且所有或基本上所有框架区(FR)氨基酸残基都源自人FR。在一些实施方案中，非人抗体(例如鼠抗体)的人源化形式是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在某些实施方案中，人源化抗体是来自非人物种的抗体，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(FR)。在一些实施方案中，人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。(参见例如，Queen,美国专利号5,585,089和Winter,美国专利号5,225,539。)此类嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。
在某些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的重链可变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所需特异性、亲和力和/或能力的小鼠、大鼠、兔、或非人灵长类动物)的重链可变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。在一些实施方案中，编码人可变重链和可变轻链的核酸序列被改变为由编码非人抗体序列(供体序列)中的相应CDR的序列替代人(受体)序列的一个或多个CDR序列。在一些实施方案中，人受体序列可以包含源自不同基因的FR。在特定实施方案中，人源化抗体将含有至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。在一些实施方案中，人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见例如，Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409，将其通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文提供人源化抗独特型抗体。
在特定实施方案中，抗体(例如，抗独特型抗体)是人源化的。在某些实施方案中，通过任何合适的已知方法对抗体进行人源化。例如，在一些实施方案中，人源化抗体可以在其中引入一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。在特定实施方案中，人源化基本上可以通过按照Winter和同事的方法来进行(Jones等人(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人(1988)Nature332:323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534-1536)，如通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著少于完整的人可变结构域用非人物种的相应序列取代。在某些实施方案中，人源化抗体是这样的人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
随后可以通过将所提供的可变重链和可变轻链序列连接至人恒定重链区和恒定轻链区来获得编码全长抗体的序列。合适的人恒定轻链序列包括κ和λ恒定轻链序列。合适的人恒定重链序列包括IgG1、IgG2和编码具有呈现的免疫刺激特性的IgG1突变体的序列。此类突变体可能具有降低的激活补体和/或抗体依赖性细胞毒性的能力，并描述于美国专利号5,624,821、WO 99/58572、美国专利号6,737,056中。合适的恒定重链还包括IgG1，其包含取代E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331S和残基236的缺失。在另一个实施方案中，全长抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM、IgY或IgW序列。
合适的人供体序列可以通过以下方法来确定：将由小鼠供体序列编码的肽序列与由一组人序列编码的肽序列，优选地与人种系免疫球蛋白基因或成熟抗体基因编码的序列进行序列比较。具有高序列同源性，优选具有确定的最高同源性的人序列可以充当用于人源化过程的受体序列。
除了将人CDR交换为小鼠CDR之外，还可以在人供体序列中进行进一步的操作以获得编码具有优化特性(如抗原的亲和力)的人源化抗体的序列。
此外，改变的人受体抗体可变结构域序列也可以被提供为编码对应于非人供体序列的轻链可变区的位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98和重链可变区的位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92的一个或多个氨基酸(根据Kabat编号系统)(Carter和Presta，美国专利号6,407,213)。
在特定实施方案中，通常希望抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。在一些实施方案中，为了达到此目的，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型通常可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。可以获得说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些展示容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到希望的抗体特征，如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。通常，高变区残基直接且最实质地参与对抗原结合的影响。
在特定实施方案中，用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变结构域的选择对于降低抗原性可能是重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，用啮齿动物抗体的可变结构域序列对已知人可变结构域序列的整个文库进行筛选。然后接受与啮齿动物最接近的人序列作为人源化抗体的人框架。参见例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体。参见例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta等人(1993)J.Immunol.,151:2623。
所提供的抗体包括人抗体。“人抗体”是具有与人或人细胞或者利用人抗体库或其他人抗体编码序列(包括人抗体文库)的非人来源产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。所述术语不包括包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，如所有或基本上所有CDR都是非人的那些。
所述人抗体可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代内源免疫球蛋白基因座或者其存在于在染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因动物中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。人抗体也可以源自含有源自人库的抗体编码序列的人抗体文库，包括噬菌体展示和无细胞文库。
所提供的抗体包括单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体(即，构成所述群体的单独抗体是相同的，但含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体除外，此类变体通常以少量存在)获得或在所述群体内的抗体。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一表位。所述术语不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。
2.靶标表达细胞
在一些实施方案中，重组受体刺激剂是表达由抗原受体识别的靶标的细胞，即，重组受体刺激剂是靶标表达细胞。在一些实施方案中，所述靶标是重组受体的抗原，因此在一些情况下，所述靶标表达细胞是抗原表达细胞。在一些实施方案中，重组受体刺激剂是抗原表达细胞，如表达如上文所述的靶标或抗原的细胞。
在某些实施方案中，细胞(例如靶标表达细胞，如抗原表达细胞)对于受试者是外源的、异源的和/或自体的。在一些实施方案中，细胞对于受试者是外源的。
在某些实施方案中，靶标表达细胞表达由重组受体结合和/或识别的靶标。在一些实施方案中，靶标是抗体，并且靶标表达细胞表达所述抗体。在一些实施方案中，靶标表达细胞是肿瘤细胞。在特定实施方案中，靶标表达细胞是原代细胞。
在一些实施方案中，靶标是由重组受体识别的抗原，并且靶标表达细胞是抗原表达细胞。在某些实施方案中，抗原表达细胞表达由重组受体结合和/或识别的抗原。在一些实施方案中，抗原表达细胞是肿瘤细胞。在特定实施方案中，抗原表达细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞系是永生细胞系。在特定实施方案中，抗原表达细胞是癌性细胞和/或肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞源自癌细胞和/或肿瘤细胞，例如人癌细胞和/或人肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞是来自癌细胞系(任选地人癌细胞系)的细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞是来自肿瘤细胞系(任选地人肿瘤细胞系)的细胞。
在特定实施方案中，抗原表达细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞是循环肿瘤细胞，例如肿瘤免疫细胞，如肿瘤B细胞(或衍生自肿瘤B细胞的细胞)。
在特定实施方案中，抗原表达细胞表达整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原IB(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AIA1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、LI细胞粘附分子(LI-CAM)、LI-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-Al、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(KG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原(oncofetal antigen)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRPl，也称为TYRPl或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)或其组合。在一些实施方案中，抗原表达细胞表达病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在特定实施方案中，抗原表达细胞表达一种或多种与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如多种已知B细胞标记中的任一种。在某些实施方案中，抗原表达细胞表达CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、CD30或其组合。在一些实施方案中，抗原表达细胞表达CD19，例如人CD19。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在某些实施方案中，抗原表达细胞是或源自肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是癌性的。在特定实施方案中，肿瘤细胞是非癌性的。在一些实施方案中，肿瘤细胞是或源自循环B细胞，如能够在体内形成肿瘤的循环B细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是或源自作为肿瘤性、致瘤性或癌性B细胞的循环B细胞。
在某些实施方案中，肿瘤细胞是或源自人癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞源自以下癌症的细胞：AIDS相关癌症、乳腺癌、消化道/胃肠道癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、肝癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌、胃(胃的)癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、Wilms肿瘤或其他儿童肾肿瘤、胚细胞癌、中枢神经系统癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、卵巢胚细胞瘤、妇科癌症、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢上皮癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头颈癌、下咽癌、喉癌、唇和口腔癌、转移性鳞颈癌(metastatic squamous neck cancer)、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、肌肉骨骼癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经系统癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、中枢神经系统胚细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤或Merkel细胞癌，或其任何等效的人类癌症。
在特定实施方案中，肿瘤细胞源自非血液学癌症，例如实体瘤。在某些实施方案中，肿瘤细胞源自血液学癌症。在某些实施方案中，肿瘤细胞源自作为B细胞恶性肿瘤或血液学恶性肿瘤的癌症。在特定实施方案中，肿瘤细胞源自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、急性髓性白血病(AML)或骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤(MM))、或其任何等效的人类癌症。在一些实施方案中，抗原表达细胞是肿瘤性、癌性和/或致瘤性B细胞。多种肿瘤细胞系是已知且可用的，并且可以根据特定重组受体(例如CAR)识别的抗原进行选择。
许多肿瘤细胞系中的任何一种都是已知且可用的。已知表达特定肿瘤抗原的肿瘤细胞系，或者肿瘤抗原的表面表达可以由本领域技术人员使用多种技术中的任一种(如通过流式细胞术)来容易地确定或测量。示例性肿瘤细胞系包括但不限于淋巴瘤细胞(Raji、Daudi、Jeko-1、BJAB、Ramos、NCI-H929、BCBL-1、DOHH-2、SC-1、WSU-NHL、JVM-2、Rec-1、SP-53、RL、Granta 519、NCEP-1、CL-01)；白血病细胞(BALL-1、RCH-ACV、SUP-B15)；宫颈癌细胞(33A、CaSki、HeLa)；肺癌细胞(NCI-H358、A549、H1355、H1975、Calu-1、H1650和H727)；乳腺癌细胞(Hs-578T、ZR-75-1、MCF-7、MCF-7/HER2、MCF10A、MDA-MB-231、SKBR-3、BT-474、MDA-MB-231)；卵巢癌细胞(ES-2、SKOV-3、OVCAR3、HEY1B)；多发性骨髓瘤细胞(U266、NCI-H929、RPMI-8226、OPM2、LP-1、L363、MM.1S、MM.1R、MC/CAR、JJN3、KMS11、AMO-1、EJM、MOLP-8)。例如，示例性CD19表达细胞系包括但不限于Raji、Daudi和BJAB；示例性CD20表达细胞系包括Daudi、Ramos和Raji；示例性CD22表达细胞系包括但不限于Ramos、Raji、A549、H727和H1650；示例性Her2表达细胞系包括SKOV3、BT-474和SKBR-3；示例性BCMA表达细胞系包括但不限于RPMI-8226、NCI-H929、MM1S、MM1R和KMS11；示例性GPRC5D表达细胞系包括但不限于AMO-1、EJM、NCI-H929、MM.1S、MM1.R、MOLP-8和OPM-2；示例性ROR1表达细胞系包括但不限于A549、MDA-MB-231、H1975、BALL-1和RCH-ACV。
在一些实施方案中，靶标表达细胞系是已被转导以表达重组受体的靶标的细胞系。在一些实施方案中，靶标是肿瘤抗原。在特定实施方案中，抗原表达细胞系是已被转导以表达肿瘤抗原的细胞系。该细胞系可以是哺乳动物细胞系，包括但不限于人细胞系。在一些实施方案中，人细胞系可以是K562、U937、721.221、T2和C1R细胞。例如，K562慢性髓系白血病细胞系可以引入编码肿瘤抗原的核酸。在一些实施方案中，细胞系可以用编码目的肿瘤抗原的质粒载体或信使RNA(mRNA)工程化。在一些实施方案中，引入可以通过基于慢病毒的转导进行。在一些实施方案中，细胞系(例如K562细胞)稳定表达编码肿瘤抗原的外源核酸。在一些实施方案中，可以将外源核酸整合到细胞系(例如K562细胞)的基因组中。在一些实施方案中，可以将外源核酸整合到细胞系(例如K562细胞)的基因组中的特定基因座处。在一些实施方案中，可以将外源核酸整合到细胞系(例如K562细胞)的基因组中的基因组安全港(GSH)处。GSH是支持外源核酸的稳定整合和表达，同时将与宿主细胞基因组的不想要的相互作用的风险降至最低的位点(参见例如，Sadelain等人,Nat Rev Cancer.(2011)12(1):51-8)。已经鉴定了几种用于在人类细胞中稳定整合外源核酸的安全GSH，包括：AAVS1，其是19号染色体上AAV病毒整合的天然存在位点；CCR5基因，一种趋化因子受体基因，也称为HIV-1共受体；以及小鼠Rosa26基因座的人类直系同源物(参见例如，Papapetrou和Schambach Mol Ther.(2016)24(4):678-684)。
在一些实施方案中，以表达重组受体的报告细胞(效应细胞)的固定细胞量提供靶标表达细胞。在一些实施方案中，所述量是从100:1至0.001比率的靶标表达靶细胞与效应T细胞的比率(T:E)，如从50:1至0.050T:E比率、从25:1至0.025T:E比率、从12:1至0.012:1T:E比率、从10:1至0.010T:E比率或从5:1至0.5T:E比率的滴定量。在一些实施方案中，所述比率为或为约从12:1至0.012:1T:E比率。在一些实施方案中，所述比率为或为约1:1至6:1。可以凭经验确定具体比率，这取决于具体靶标和所使用的靶细胞。例如，所选择的比率是产生测定中的可检测信号的比率，包括在用于转导报告T细胞的病毒载体的多个滴定量中可检测信号的线性剂量响应增加。
例如，靶标是重组受体的抗原。在一些实施方案中，以表达重组受体的报告细胞(效应细胞)固定量细胞提供抗原表达细胞。在一些实施方案中，所述量是从100:1至0.001比率的抗原表达靶细胞与效应T细胞的比率(T:E)，如从50:1至0.050T:E比率、从25:1至0.025T:E比率、从12:1至0.012:1T:E比率、从10:1至0.010T:E比率或从5:1至0.5T:E比率的滴定量。在一些实施方案中，所述比率为或为约从12:1至0.012:1T:E比率。在一些实施方案中，所述比率为或为约1:1至6:1。可以凭经验确定具体比率，这取决于具体抗原和所使用的靶细胞。例如，所选择的比率是产生测定中的可检测信号的比率，包括在用于转导报告T细胞的病毒载体的多个滴定量中可检测信号的线性剂量响应增加。
C.测量报告物活性
本文提供的用于评估效力的方法包括测量对报告细胞组合物中的细胞的重组受体的刺激有响应的报告细胞组合物的报告活性。如上所述，所提供的测定允许测量对与重组受体刺激剂(如在第I-A节中所述)一起在多个孵育条件下的孵育有响应的报告细胞中的可检测信号的活性，其中每个孵育包含不同滴定量的病毒载体。
在特定实施方案中，可检测信号是或包括酶促产物的产生和/或分泌。在一些实施方案中，可检测信号是或包括生物发光因子的产生和/或分泌。在某些实施方案中，作为萤光素酶表达的结果，光信号的强度与重组受体依赖性活性呈正相关。
用于测量因子的产生或分泌的合适技术是本领域已知的。可溶性因子的产生和/或分泌可以通过确定因子的细胞外量的浓度或量，或确定编码因子的基因的转录活性的量来测量。合适的技术包括但不限于以下测定：如免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、mRNA表达水平测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧向流动免疫测定、抑制测定或亲合力测定、蛋白质微阵列、高效液相色谱(HPLC)、中尺度发现(MesoScale Discovery，MSD)电化学发光和基于珠的多重免疫测定(MIA)。在一些实施方案中，合适的技术可以使用特异性地结合可溶性因子的可检测结合试剂。
在特定实施方案中，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)来测量可溶性因子(例如细胞因子)的测量值。ELISA是设计用于检测和定量物质如肽、细胞因子、抗体和激素的一种基于板的测定技术。在ELISA中，必须将可溶性因子固定在固体表面上，并然后与跟酶连接的抗体复合。经由与底物一起孵育以产生可检测的信号评估缀合的酶活性来完成检测。在一些实施方案中，用ELISA测定来测量重组受体依赖性活性。
在某些实施方案中，通过用于刺激重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)的能够结合重组受体的结合分子，在含有重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)的报告细胞组合物中刺激光信号的产生或分泌。在一些实施方案中，结合分子是：对重组受体具有特异性的抗原或其表位；细胞，例如表达抗原的细胞；或结合和/或识别重组受体的抗体或其部分或变体；或其组合(参见例如，上文第I-B节)。在某些实施方案中，结合分子是重组蛋白，所述重组蛋白包含由重组受体结合或识别的抗原或其表位。
预期多个孵育的持续时间至少与酶(例如萤光素酶)的表达和随后的产物检测(例如发光)的最小时间量相称。还预期在一种类型的活性(例如酶促活性)内，对于不同量的可用底物可能存在时间差。在一些实施方案中，多个孵育进行为或为约15分钟至为或为约24小时，如为或为约2小时至为或为约6小时，例如为或为约4小时。在一些实施方案中，多个孵育进行为或为约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时、或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，多个孵育进行为、为约、或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。在一些实施方案中，多个孵育进行为、为约或至少30分钟。在一些实施方案中，多个孵育进行为、为约或至少60分钟。在一些实施方案中，多个孵育进行为或为约10与60、20与60、30与60、40与60、50与60分钟之间。
在某些实施方案中，可检测信号是光信号。在一些实施方案中，将含有重组受体表达细胞的报告细胞组合物中的细胞在结合分子的存在下孵育一定的时间量，并且在孵育期间在一个或多个时间点处测量因子的产生和/或分泌。在一些实施方案中，将细胞与结合分子一起孵育长达或约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约48小时，或孵育在1小时与4小时之间、在1小时与12小时之间、在12小时与24小时之间(每个都包含端值)的持续时间，或孵育超过24小时，并且检测因子(例如光信号)的量。
在一些实施方案中，结合分子是表达由重组受体识别的抗原的细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且将报告细胞组合物中的恒定数量的细胞以报告细胞组合物中的细胞与表达抗原的细胞的多个比率孵育，所述比率包括为或为约1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1、或任何前述值之间的范围，如在1:1与1:10之间的比率或1:0.2至1:12的比率，每个都包含端值。在一些实施方案中，多个比率包括本文提供的任何或所有比率。
在一些实施方案中，结合分子是表达由重组受体识别的抗原的细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且将报告细胞组合物中的一定数量的细胞与表达抗原的恒定数量的细胞以报告细胞组合物中的细胞与表达抗原的细胞的多个比率孵育，所述比率包括为或为约1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1、或任何前述值之间的范围，如在1:1与1:10之间的比率或1:0.2至1:12的比率，每个都包含端值。在一些实施方案中，多个比率包括本文提供的任何或所有比率。
在一些实施方案，将在约1x102个与约1x104个之间、在约1x103个与约1x105个之间、在约1x104个与约1x106个之间、在约1x105个与约1x107个之间、在约1x106个与约1x108个之间、在约1x107个与约1x109个之间、以及在约1x108个与约1x1010个之间的细胞组合物中的细胞(每个都包含端值)与恒定量或浓度的结合分子一起孵育。
在一些实施方案中，将报告细胞组合物中的细胞与结合分子在一定体积的细胞培养基中一起孵育。在某些实施方案中，将细胞与结合分子在如下体积中一起孵育，所述体积为至少或约1μL、至少或约10μL、至少或约25μL、至少或约50μL、至少或约100μL、至少或约500μL、至少或约1mL、至少或约1.5mL、至少或约2mL、至少或约2.5mL、至少或约5mL、至少或约10mL、至少或约20mL、至少或约25mL、至少或约50mL、至少或约100mL、或大于100mL。在某些实施方案中，将细胞与结合分子在如下体积中一起孵育，所述体积落在约1μL与约100μL之间、在约100μL与约500μL之间、在约500μL与约1mL之间、在约500μL与约1mL之间、在约1mL与约10mL之间、在约10mL与约50mL之间、或在约10mL与约100mL之间，每个都包含端值。在某些实施方案中，将细胞与结合分子在约100μL与约1mL之间(包含端值)的体积中一起孵育。在特定实施方案中，将细胞与结合分子在约500μL的体积中一起孵育。
在某些实施方案中，可检测信号的测量值是针对测试的多个比率中的每一个，在孵育期间的时间点或孵育结束时，报告细胞组合物中的因子的量或浓度、或相对量或浓度。在特定实施方案中，将测量值减去对照测量值或相对于对照测量值进行归一化。在一些实施方案中，对照测量值是在孵育之前取得的来自相同细胞组合物的测量值。在特定实施方案中，对照测量值是从未与结合分子一起孵育的相同对照细胞组合物取得的测量值。在某些实施方案中，对照是在与结合分子一起孵育期间的相同时间点从不含有重组受体阳性细胞的细胞组合物取得的测量值。
在某些实施方案中，将报告细胞组合物中的细胞与靶细胞一起孵育长达或约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时、约48小时、或大于48小时。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物中的恒定数量的细胞与表达抗原的细胞一起孵育约18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。在一些实施方案，将在约1x102个与约1x104个之间、在约1x103个与约1x105个之间、在约1x104个与约1x106个之间、在约1x105个与约1x107个之间、在约1x106个与约1x108个之间、在约1x107个与约1x109个之间、或在约1x108个与约1x1010个之间的治疗性细胞组合物中的恒定数量的细胞(每个都包含端值)与不同数量的抗原表达细胞一起孵育，以产生多个比率。在某些实施方案，将在约1x102个与约1x104个之间、在约1x103个与约1x105个之间、在约1x104个与约1x106个之间、在约1x105个与约1x107个之间、在约1x106个与约1x108个之间、在约1x107个与约1x109个之间、或在约1x108个与约1x1010个之间的治疗性细胞组合物中的CAR+细胞的恒定数量的细胞(每个都包含端值)与不同数量的抗原表达细胞一起孵育，以产生多个比率。
在一些实施方案中，使用数学模型拟合可检测信号的测量值，以产生可检测信号的剂量响应曲线。在一些情况下，曲线拟合可以允许推断或外推行为，例如报告细胞产生可检测信号的活性，并因此外推病毒载体的效力。预期可以使用本领域已知的执行曲线拟合的任何方法。在一些实施方案中，所述曲线是S形曲线。在一些实施方案中，基于从多个孵育中的每一个测量的可检测信号，确定产生半最大可检测信号的滴定比率。在一些实施方案中，从剂量响应曲线推断、外推或估计产生半最大可检测信号的滴定比率。在一些实施方案中，将可检测信号相对于所测量的最大重组受体依赖性活性进行归一化。在一些实施方案中，将可检测信号相对于所述曲线的上渐近线(任选地是上渐近线的值的范围)进行归一化。
在一些实施方案中，包括如本文所述的测定的方法可以以一式两份或一式三份或更多份进行，以验证重组受体依赖性活性的测量值。在例如以一式两份、一式三份或更多份进行所述测定的一些情况下，使用来自每个重复测定的所测量的重组受体依赖性活性来提供重组受体依赖性活性的描述性统计量度。例如，在一些情况下，针对多个比率测试中的每一个确定重组受体依赖性活性的每次测量的平均值(例如算术平均值)、中位数、标准差和/或方差。在一些实施方案中，确定重组受体依赖性活性的每次测量的平均值。在一些实施方案中，确定重组受体依赖性活性的每次测量的标准差。在一些实施方案中，使用数学模型拟合重组受体依赖性活性的平均测量值，以产生或估计重组受体依赖性活性曲线。在一些实施方案中，将所述曲线相对于平均最大值进行归一化。在一些实施方案中，将所述曲线相对于上渐近线(任选地是上渐近线的值的范围的平均值)进行归一化。本文所述的测量值可以参照参考标准品(如本文例如第I-D-1节所述的参考标准品)使用。
D.确定病毒载体效力
本文提供的方法允许确定病毒载体组合物的效力。预期本文所述的测定可以用于评估通过如本文(例如第I节)所述的那些方法、以及允许制造的病毒载体与第IA1节所述的报告细胞在提供的包括多个孵育的方法中一起培养的任何其他制造方法制造的病毒载体组合物的效力，其中每个孵育包括将不同滴定比率(即，载体体积或MOI)的病毒载体组合物与能够刺激报告细胞组合物中的重组受体依赖性活性的结合分子一起培养。在一些实施方案中，可以根据本文提供的方法评估1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种病毒载体组合物。
通过在所测试的多个比率(即，多个载体体积或载体MOI，在结合分子存在下)中的每一个下对可检测信号进行测量，可以确定病毒载体组合物的效力。在一些实施方案中，测量值是通过在一式两份、一式三份或多个重复上取算术平均值或中位数而确定的复合值。在一些实施方案中，可以确定测量值的标准差和/或方差。在一些实施方案中，病毒载体组合物对结合分子(如第I-B节所述的结合分子)的重组受体依赖性活性(如第I-C节所述)的一个或多个测量值(包括复合测量值)可以用于确定病毒载体组合物的效力。
在一些实施方案中，以不同比率的多个孵育产生多个测量值，曲线拟合方法可以应用于这些多个测量值。在一些实施方案中，多个测量值包括复合测量值(例如，平均值或中位数)。例如，重组受体依赖性活性测量值可以与曲线(例如S形曲线)拟合，以允许对病毒载体组合物的行为(例如，灵敏度)进行推断、外推或估计。在一些实施方案中，可以使用与测量值拟合的曲线来估计在测定期间未直接检查的病毒载体组合物的行为(例如，效力)。例如，所述曲线可以用于估计：下渐近线；最小值；重组受体依赖性活性的检测损失；半最大值(例如，50％重组受体依赖性活性)；10％-90％、20％-80％、30％-70％或40％-60％的重组受体依赖性活性范围；上渐近线；以及最大值和出现每个值或范围时的比率。
预期可以使用任何量度(半最大值的比率、范围、最大值、最小值、渐近线及其复合测量值)来确定病毒载体的效力。在一些实施方案中，效力是相对效力。
1.效力
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力被定义为出现一个或多个或一系列可检测信号测量值时的比率。在一些实施方案中，一个或多个或一系列测量值是复合测量值，如从重复实验确定的平均值或中位数。在一些实施方案中，测量值和比率由所测量的可检测信号的剂量响应曲线确定。在一些实施方案中，例如通过改变病毒载体体积或病毒载体MOI，将所测量的可检测信号相对于针对病毒载体组合物测量的最大活性进行归一化。在一些实施方案中，将剂量响应曲线相对于针对病毒载体组合物测量的最大可检测信号进行归一化。在一些实施方案中，将剂量响应曲线相对于针对病毒载体组合物测量的重组受体依赖性活性的上渐近线(任选地跨渐近线的测量值的平均值)进行归一化。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现10％-90％重组受体依赖性活性时的比率范围，或反之亦然。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线估计出现10％-90％重组受体依赖性活性时的比率范围。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.1-0.9或10％-90％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现20％-80％重组受体依赖性活性时的比率范围，或反之亦然。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线估计出现20％-80％重组受体依赖性活性时的比率范围。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.2-0.8或20％-80％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现30％-70％重组受体依赖性活性时的比率范围，或反之亦然。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线估计出现30％-70％重组受体依赖性活性时的比率范围。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.3-0.7或30％-70％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现40％-60％重组受体依赖性活性时的比率范围，或反之亦然。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线估计出现40％-60％重组受体依赖性活性时的比率范围。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.4-0.6或40％-60％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的效力是出现半最大重组受体依赖性活性时的比率。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线估计半最大值和出现半最大值时的比率。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，半最大重组受体依赖性活性值是0.5或50％。
在一些实施方案中，例如当通过S形曲线对重组受体依赖性活性曲线进行拟合时，确定所述曲线的线性部分。在一些实施方案中，效力是来自所述曲线的线性部分的测量值和对应比率。在一些实施方案中，半最大值测量值和比率出现在所述曲线的线性部分中。
2.相对效力
本文提供的方法允许确定病毒载体组合物相对于不同病毒载体组合物(例如参考标准品)的效力。这种类型的效力可以称为相对效力。例如，可以将根据本文提供的方法评估的病毒载体组合物与例如根据本文提供的方法评估的不同病毒载体组合物(例如参考标准品，例如如下文所述)进行比较，以确定病毒载体组合物的效力如何相互关联(例如，根据如本文所述的病毒载体体积或MOI进行滴定)。这提供了一个优点，即，可以比较多种病毒载体组合物以确定哪种组合物具有最高的效力。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力被确定为出现病毒载体组合物的一个或多个或一系列重组受体依赖性活性测量值时的比率(例如百分比)相比于参考标准品出现一个或多个或一系列重组受体依赖性活性测量值时的比率。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品中的一者或两者的一个或多个或一系列测量值是复合测量值，如由重复实验确定的平均值或中位数。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品的测量值和比率分别从组合物的所测量的重组受体依赖性活性的重组受体依赖性活性曲线确定。在一些实施方案中，将针对病毒载体组合物和参考标准品测量的重组受体依赖性活性分别相对于针对测试病毒载体组合物和参考标准品测量的最大活性进行归一化。在一些实施方案中，将病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线分别相对于针对病毒载体组合物和参考标准品测量的最大重组受体依赖性活性进行归一化。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线分别相对于针对病毒载体组合物和参考标准品测量的重组受体依赖性活性的上渐近线(任选地跨渐近线的测量值的平均值)进行归一化。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力是出现10％-90％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)相比于参考标准品出现10％-90％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品出现10％-90％重组受体依赖性活性时的比率范围分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计。在一些实施方案中，例如当病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.1-0.9或10％-90％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力是出现20％-80％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)相比于参考标准品出现20％-80％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和参考标准品出现20％-80％重组受体依赖性活性时的比率范围分别从病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计。在一些实施方案中，例如当病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.2-0.8或20％-80％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力是出现30％-70％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)相比于参考标准品出现30％-70％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品出现30％-70％重组受体依赖性活性时的比率范围分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计。在一些实施方案中，例如当病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.3-0.7或30％-70％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力是出现40％-60％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)相比于参考标准品出现40％-60％重组受体依赖性活性时的比率范围(或反之亦然)。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品出现40％-60％重组受体依赖性活性时的比率范围分别从病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计。在一些实施方案中，例如当病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的范围是0.4-0.6或40％-60％。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力是出现指定的重组受体依赖性活性(例如，最大值的10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％)时的比率相对于参考标准品出现指定的重组受体依赖性活性时的比率。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品的指定的重组受体依赖性活性和出现指定值时的比率分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线确定。
在一些实施方案中，病毒载体组合物的相对效力是出现半最大重组受体依赖性活性时的比率相比于参考标准品出现半最大重组受体依赖性活性时的比率。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品的半最大值和出现半最大值时的比率分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计。在一些实施方案中，例如当病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性测量值或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值的半最大值是0.5或50％。
在一些实施方案中，例如当通过S形曲线对病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线进行拟合时，确定所述曲线的线性部分。在一些实施方案中，相对效力是来自病毒载体组合物的曲线的线性部分的测量值和对应比率与来自参考标准品的曲线的线性部分的测量值和对应比率的比较。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和参考标准品的半最大值测量值和比率出现在所述曲线的线性部分中。
在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考组合物的测量值(如上文所述)之间的比较是进行除法。例如，将治疗性细胞组合物出现半最大重组受体依赖性活性的比率除以参考标准品出现半最大重组受体依赖性活性的比率。在一些实施方案中，相对效力表示为比率。在一些实施方案中，相对效力表示为百分比。
在一些实施方案中，例如当通过S形曲线对病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线进行拟合并且如本文所述进行归一化时，相对效力是所述曲线之间的差异。在一些实施方案中，针对归一化曲线的线性部分测量所述曲线之间的差异。在一些实施方案中，病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线(例如S形曲线)的归一化可以用于直接比较病毒载体组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线。
a.参考标准品
特定实施方案预期，可以将病毒载体组合物的重组受体依赖性活性(例如，CAR+依赖性活性)的测量值与参考标准品的参考测量值(即，参考测量)进行比较，以例如确定相对效力。在特定实施方案中，参考测量值是参考标准品的重组受体依赖性活性的预定测量值或其值。在一些实施方案中，根据本文公开的方法评估参考标准品的重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，参考标准品是如下病毒载体组合物，对于其来说，产生重组受体依赖性活性的滴定比率已经得到验证。在一些实施方案中，参考标准品是如下病毒载体组合物，对于其来说，产生重组受体依赖性活性的滴定比率已经得到验证，并且曲线(例如S形曲线)已针对所测量的活性被拟合以产生重组受体依赖性活性曲线。在一些实施方案中，将参考标准品的重组受体依赖性活性曲线进行归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于所测量的最大重组受体依赖性活性进行归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于重组受体依赖性活性曲线的上渐近线进行归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于在重组受体依赖性活性曲线的上渐近线上计算的平均值进行归一化。在一些实施方案中，参考标准品是如下病毒载体组合物，其具有产生半最大重组受体依赖性活性的经验证的滴定比率。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线确定产生半最大重组受体依赖性活性的经验证的滴定比率。
在一些实施方案中，参考标准品是可商购的病毒载体组合物。在一些实施方案中，参考标准品是使用制造工艺制造的病毒载体组合物，所述制造工艺与用于制造与其比较的病毒载体组合物的制造工艺相同。在一些实施方案中，参考标准品是使用制造方法制造的病毒载体组合物，所述制造方法与用于制造与其比较的病毒载体组合物的制造方法不同。在一些实施方案中，参考标准品来自被确定为具有代表性的批量方法。在一些实施方案中，参考标准品为GMP级。在一些实施方案中，参考标准品是病毒载体组合物，其包含与跟其比较的治疗性细胞组合物相同的重组受体。在一些实施方案中，参考标准品是病毒载体组合物，其包含与跟其比较的治疗性细胞组合物不同的重组受体。在一些实施方案中，参考标准品是由与其比较的同一受试者制造的病毒载体组合物。在一些实施方案中，参考标准品是由制造与其比较的病毒载体组合物的不同受试者制造的病毒载体组合物。在一些实施方案中，参考标准品可以是上文所述那些中的一个或多个的组合。
II.制品和试剂盒
还提供用于进行所提供的方法的制品、系统、设备和试剂盒。还提供了含有所提供的报告T细胞的制品、系统、设备和试剂盒。在一些实施方案中，所提供的制品或试剂盒含有报告T细胞，用于在测试病毒载体上插入编码候选结合结构域的核酸序列，例如以产生重组受体。在一些实施方案中，制品或试剂盒可以用于产生多个多核苷酸和/或报告T细胞的方法中。在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有本文所述的T细胞、T细胞系和/或多种T细胞，如报告T细胞。
在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有T细胞、T细胞系和/或多个T细胞，如本文所述的任何报告T细胞、报告T细胞系和/或多种报告T细胞。在一些实施方案中，T细胞、报告T细胞系和/或多种报告T细胞或者制品和/或试剂盒中提供的任何经修饰的T细胞可以根据本文所述的筛选方法使用。在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有对照T细胞、报告T细胞系和/或多种报告T细胞。在一些实施方案中，制品或试剂盒包括一种或多种报告T细胞，例如含有报告分子的报告T细胞，其中所述报告分子的表达对通过细胞内信号传导区的信号有响应。在一些实施方案中，制品或试剂盒包括一种或多种报告T细胞，例如含有报告分子和重组受体(例如多种重组受体中的一种)的报告T细胞。
在一些实施方案中，制品或试剂盒包括用于评估与测试病毒载体一起孵育后的细胞(如表达本文所述的重组受体的细胞)的特性的一种或多种组分。例如，制品或试剂盒可以包括用于评估引入的候选重组受体的特定特性的结合试剂(例如抗体、其抗原结合片段、纯化或分离的抗原或其片段和/或探针)，所述特定特性例如候选重组受体的细胞表面表达、和/或由报告T细胞中的报告分子(例如Nur77报告物)产生的可检测信号。在一些实施方案中，制品或试剂盒可以包括用于检测特定特性的组分，如标记的组分(例如，荧光标记的组分)和/或可以产生可检测信号的组分(例如，可以产生荧光或发光的底物)。
在一些实施方案中，制品或试剂盒包括一个或多个容器(通常是多个容器)、包装材料以及一个或多个容器和/或包装上的或与一个或多个容器或包装相关联的标签或包装说明书，通常包括使用说明书，例如，用于核酸组装和/或将组装的核酸分子或核酸分子集引入细胞(如转染或转导所提供的方法中使用的细胞，例如T细胞、T细胞系和/或多种T细胞)的说明书。在一些实施方案中，制品和试剂盒包括促进高通量或大规模组装和/或筛选的组件和/或容器。在一些实施方案中，制品和试剂盒可以包括高通量或大规模形式的容器，例如多孔样品板，如96孔板或384孔板。
本文提供的制品含有包装材料。用于在包装所提供的材料中使用的包装材料是本领域技术人员所熟知的。参见例如，美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，将其各自以其整体并入本文。包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、一次性实验室用品(例如，移液管尖端和/或塑料板)或瓶子。制品或试剂盒可以包括装置，以便有助于分配材料或有助于以高通量或大规模方式使用，例如以有助于在机器人设备中使用。通常，包装不与其中所含的组合物反应。
在一些实施方案中，T细胞、T细胞系和/或多种T细胞被分开包装。在一些实施方案中，每个容器可以具有单一区室。在一些实施方案中，制品或试剂盒的其他组分是分开包装的，或者一起包装于单一区室中。
III.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的含义有实质性差异。
术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的抗体和抗体链以及其他肽(例如接头))可以包括含有天然和/或非天然氨基酸残基的氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可以含有关于自然或天然序列的修饰，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(例如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(例如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括为了在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
氨基酸取代可以包括用另一个氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已将其引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒载体(例如慢病毒或γ逆转录病毒载体)，其具有携带另一种核酸并且能够插入宿主基因组中以供其繁殖的基因组。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“至少一个/一种”或“一个/一种或多个/多种”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所陈述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，细胞或细胞群体针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的含义有实质性差异。
将在本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
IV.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种用于确定病毒载体效力的方法，所述方法包括：
a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中：
每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；
所述重组受体包含对靶标具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域，并且包含具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区或与其复合；
b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；
c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及
d)基于所测量的可检测信号确定产生半最大可检测信号的测试病毒载体的滴定量。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述效力是相对效力，并且所述方法还包括在同一测定中，将所述测试病毒载体的半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号进行比较。
3.一种用于确定病毒载体效力的方法，所述方法包括：
a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中：
每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；
所述重组受体包含对靶标具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域以及具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区；
b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；
c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及
d)基于所测量的可检测信号，通过在同一测定中，将所述半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号进行比较，确定所述病毒测试病毒载体的相对效力。
4.根据实施方案2或实施方案3所述的方法，其中所述相对效力是所述测试病毒载体的可检测信号与所述参考病毒载体标准品的可检测信号的百分比。
5.根据实施方案2或实施方案3所述的方法，其中所述相对效力是所述测试病毒载体的可检测信号与所述参考病毒载体标准品的可检测信号的比率。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中测试病毒载体的滴定量是对所述病毒载体进行连续稀释。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述病毒载体的连续稀释是基于所述载体体积的连续稀释。
8.根据实施方案6所述的方法，其中所述连续稀释是基于所述病毒载体滴度的连续稀释。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述病毒载体滴度是功能滴度，任选地其中通过体外噬斑测定法定量所述功能滴度。
10.根据实施方案8所述的方法，其中所述病毒载体滴度是物理滴度，任选地其中经由DNA或RNA定量、通过PCR方法定量所述物理滴度。
11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述病毒载体滴度被定量为感染单位(IU)/单位病毒载体体积。
12.根据实施方案6所述的方法，其中所述连续稀释是基于所述病毒载体的感染复数(MOI)的连续稀释。
13.根据实施方案12所述的方法，其中在适于感染的培养条件下，经由病毒载体滴度、任选地功能滴度对每数目的受纳细胞的MOI进行定量。
14.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中测试病毒载体的滴定量是恒定量的病毒载体与所述报告T细胞群体中的细胞数量的比率。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的体积。
16.根据实施方案14所述的方法，其中所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的滴度。
17.根据实施方案14所述的方法，其中所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的MOI。
18.根据实施方案12、13和17中任一项所述的方法，其中所述MOI在约0.001与10个颗粒/细胞之间，任选地为或为约0.01、为或为约0.1、为或为约1.0、或者为或为约10个颗粒/细胞、或任何前述值之间的任何值。
19.根据实施方案1-18所述的方法，其中所述报告T细胞是永生化细胞系。
20.根据实施方案1-5所述的方法，其中所述报告T细胞是Jurkat细胞系或其衍生物。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述Jurkat细胞系或其衍生物是Jurkat细胞克隆E6-1。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述调节元件包含由所述转录因子识别的一个或多个响应元件，所述转录因子在通过由所述重组受体刺激剂诱导的重组受体的含ITAM结构域进行信号传导后被激活。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述T细胞转录因子选自Nur77、NF-κB、NFAT或AP1。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述T细胞转录因子是Nur77。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述转录调节元件包含含有由转录因子识别的一个或多个响应元件的Nur77启动子或其部分。
26.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中所述转录调节元件是T细胞中的内源Nur77基因座内的转录调节元件。
27.根据实施方案24-26中任一项所述的方法，其中编码所述报告分子的核酸序列整合在所述报告T细胞的基因组中的编码Nur77的内源基因座处或附近，其中所述报告分子与所述内源Nur77基因座的转录调节元件可操作地连接。
28.根据实施方案24-27中任一项所述的方法，其中将编码所述报告分子的核酸序列通过以下方式整合：
a)在编码Nur77的内源基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导遗传破坏；和
b)引入包含编码所述报告分子的核酸的模板多核苷酸，以通过同源定向修复(HDR)将所述报告分子敲入所述内源基因座中。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述遗传破坏由特异性结合、识别或杂交至所述靶位点的CRISPR-Cas9组合诱导。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶包含具有与所述靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
31.根据实施方案24-30中任一项所述的方法，其中编码所述报告物的核酸存在于所述基因组内的编码Nur77的内源基因座的最后一个外显子处或附近的位点处。
32.根据实施方案28-31中任一项所述的方法，其中所述一个或多个靶位点包括所述基因组内的如下位点和/或所述核酸存在于所述基因组内的如下位点，所述位点包含核酸序列TCATTGACAAGATCTTCATG(SEQ ID NO:3)和/或GCCTGGGAACACGTGT GCA(SEQ ID NO:4)。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述报告分子是或包括萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其修饰形式。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述报告分子是萤光素酶，任选地是萤火虫萤光素酶。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中编码所述报告分子的核酸序列还编码一种或多种标记，所述一种或多种标记是或包括转导标记和/或选择标记。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述转导标记包括荧光蛋白，任选地eGFP。
37.根据实施方案2-36中任一项所述的方法，其中所述参考病毒载体标准品是代表与所述测试病毒载体同一生产过程的经验证的病毒载体批次。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述参考病毒载体标准品是根据良好生产规范(GMP)生产的病毒载体批次。
39.根据实施方案2-38中任一项所述的方法，其中对所述参考病毒载体标准品的评估与所述测试病毒载体在所述测定中平行进行。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其信号传导部分。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区还包含共刺激信号传导区。
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
44.根据实施方案42或实施方案43所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
45.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述重组受体是工程化的T细胞受体(eTCR)。
46.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是结合分子，所述结合分子是或包括所述重组受体的靶抗原或其细胞外结构域结合部分，任选地重组抗原。
48.根据实施方案47所述的方法，其中所述结合分子是或包括所述抗原的细胞外结构域结合部分，并且所述细胞外结构域结合部分包含由所述重组受体识别的表位。
49.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是或包括结合分子，所述结合分子是对所述重组受体的细胞外结构域具有特异性的抗体。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂被固定或附着于固体支持物上。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述固体支持物是器皿的表面，任选地是微孔板的孔，在其中进行多个孵育。
52.根据实施方案50所述的方法，其中所述固体支持物是珠。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述珠来自组合物，所述组合物具有如下浓度的所述结合分子：在或在约0.5μg/mL与500μg/mL之间，包含端值，任选地为或为约5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL或200μg/mL、或前述值之间的任何值。
54.根据实施方案52或实施方案53所述的方法，其中为了进行所述孵育，将所述珠以报告T细胞与所述珠的比率为或为约5:1至1:5添加，包含端值。
55.根据实施方案52-54中任一项所述的方法，其中为了进行所述孵育，将所述珠以报告细胞与所述珠的比率为或为约3:1至1:3或2:1至1:2添加。
56.根据实施方案52-55中任一项所述的方法，其中为了进行所述孵育，将所述珠以报告细胞与所述珠的比率为或为约1:1添加。
57.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是靶抗原表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系或是取自受试者的原代细胞。
58.根据实施方案57所述的方法，其中所述靶抗原表达细胞是细胞系。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述细胞系是肿瘤细胞系。
60.根据实施方案57所述的方法，其中所述靶抗原表达细胞是已任选地通过转导而经引入以表达所述重组受体的靶抗原的细胞。
61.根据实施方案57-60中任一项所述的方法，其中为了进行所述孵育，所述靶抗原表达细胞以靶抗原表达细胞与所述报告T细胞的比率为或为约1:1至10:1添加。
62.根据实施方案57-61中任一项所述的方法，其中为了进行所述孵育，所述靶抗原表达细胞以靶抗原表达细胞与所述报告T细胞的比率为或为约1:1至6:1添加。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述多个孵育在烧瓶、管或多孔板中进行。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述多个孵育各自在多孔板的孔中单独进行。
65.根据实施方案63或实施方案64所述的方法，其中所述多孔板是96孔板、48孔板、12孔板或6孔板。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中使用读板仪测量所述可检测信号。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述可检测信号是萤光素酶，并且所述读板仪是发光计读板仪。
68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述慢病毒载体源自HIV-1。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中所述可检测信号是萤光素酶发光。
V.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1Nur77-萤光素酶-EGFP报告细胞系的产生
产生了含有Nur77-萤光素酶-EGFP敲入报告物的示例性报告细胞系。孤儿核激素受体Nur77(也称为Nr4a1；SEQ ID NO:1所示的示例性人Nur77 DNA序列，编码SEQ ID NO:2所示的多肽)是即刻早期响应基因，其由来自T细胞受体和/或经由含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的分子的信号的激活所诱导。将Jurkat T细胞克隆E6-1(TIB-152TM)通过以下方式进行工程化：共转染编码Nur77靶向性指导RNA(gRNA)/CRISPR-Cas9(SEQ IDNO:3和4所示的gRNA靶向结构域序列)的载体以及用于通过同源定向修复(HDR)敲入报告物的示例性模板DNA(SEQ ID NO:5所示的模板DNA序列)。模板DNA含有编码在萤火虫萤光素酶2(FFLuc2)(SEQ ID NO:8所示的序列；编码SEQ ID NO:9所示的多肽序列)的任一侧上的两个T2A核糖体跳跃元件的多核苷酸(SEQ ID NO:6所示的序列，编码SEQ ID NO:7所示的多肽序列)，以及编码在5'端的单体增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的多核苷酸(SEQ ID NO:10所示的序列，编码SEQ ID NO:11所示的多肽序列)。这些区域在编码序列的任一侧上侧接与内源Nur77基因的终止密码子周围的序列同源的5'同源臂(如SEQ ID NO:12所示，含有2个沉默突变以减少CRISPR/Cas9对模板DNA的切割)和3'同源臂(如SEQ ID NO:13所示)。将T2A-FFLuc2-T2A-EGFP编码序列靶向插入内源Nur77基因的框内并在终止密码子之前。
将细胞转染并与佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素一起孵育18小时，并评估EGFP表达。使用流式细胞术对表达EGFP的细胞进行分选。通过DNA测序证实了Nur77基因座处的敲入。
然后，在用PMA-离子霉素刺激细胞后，将分选的EGFP+细胞与ONE-GLOW萤光素酶测定缓冲液和底物(Promega)(萤光素酶的特定底物)一起孵育。在室温与底物一起孵育至少三分钟以允许完全细胞裂解后，用平板发光计以相对光单位(RLU)测量萤光素酶活性。将先前确定的表达萤光素酶的细胞系用作阳性对照，并且将未修饰的亲本细胞用作阴性对照。示例性图形示于图1A中。
如图1B所示，许多测试的EGFP+克隆在激活激动剂和底物的存在下显示出萤光素酶活性。在这些克隆中，定量评估了对PMA/离子霉素刺激有响应的三种示例性EGFP+/Luc+细胞系。在添加如先前所述的ONE-GLOW萤光素酶测定底物之前，将细胞与PMA/离子霉素的连续稀释物一起孵育。选择具有组成型活性萤光素酶的一种伯基特淋巴瘤(Raji)和一种多发性骨髓瘤(RPMI 8226)细胞系作为对照。如图1C所示，随着PMA/离子霉素浓度的渐减，观察到萤光素酶活性的剂量依赖性降低。结果与Nur77-FFLuc2-EGFP报告构建体在使用PMA/离子霉素评估对报告细胞的剂量依赖性刺激方面的效用一致。
实施例2使用Nur77-萤光素酶-EGFP报告细胞系、经由载体体积评估病毒载体的效 力
产品(如慢病毒载体)达到确定的生物学作用的特定能力是其生物学活性，而效力是该生物学活性的定量量度。因此，效力基于载体的与相关生物学特性有关的属性，包括靶细胞的转导效率。为了评估病毒载体效力，使用如实施例1中所述产生的稳定转染的Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat细胞报告细胞系测量编码嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体的转导效率。
载体效力测定使用3板测定形式，其中每个样品的位置在板之间轮换，以减少由于样品放置而引起的偏差源。从左到右滴定载体以生成10点剂量响应曲线。示例性板测定装置示于图2A中。
用含有编码示例性CAR的核酸的连续稀释的慢病毒载体转导Jurkat报告细胞系。将滴定量的连续稀释的逆转录病毒载体以一式两份地分别添加到已接种Jurkat报告细胞的多孔板的孔中。示例性CAR包括针对靶抗原(例如CD19)的抗原结合结构域、跨膜结构域、以及含有CD3-ζ来源的细胞内信号传导区和共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导区。将细胞在足以将CAR构建体整合到细胞基因组的条件下孵育。还包括参考标准品，其是含有与测试慢病毒载体相同的编码CAR的核酸并且由确定具有代表性的批量方法产生的慢病毒载体。在一些情况下，参考标准品可以是先前已经过良好生产规范(GMP)验证的批次，如实施例4中所述。在这样的实施例中，还可以包括用于比较的另外的对照慢病毒载体，其中所述对照是由代表性批量方法产生的慢病毒载体，但尚未经过GMP验证。
在转导后，然后将CAR转导的Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat细胞报告细胞与表达由CAR识别的抗原的靶细胞共培养，在该实施例中，与Raji细胞共培养，其是内源表达表面CD19的永生化伯基特淋巴瘤细胞系。将表达抗原的靶细胞以靶细胞与效应细胞比率(T:E)为1:1-6:1之间添加到微孔板的孔中。在有利于细胞维持的培养基中在一定温度下共培养后，添加萤光素酶特定底物，并且如先前所述在读板仪上测量相对发光。
通过使用受约束的5参数逻辑曲线确定病毒载体的相对效力百分比(％)。图2B描绘了示例性测试样品的示例性剂量响应曲线，其中载体体积(以微升计)绘制在x轴上，相对光单位(RLU)绘制在y轴上，后者与载体功能成正比。示例性测试样品的剂量响应曲线表明参考标准品和测试样品在测定中具有合适的生物等效性，并通过其他系统适用性标准。这包括变异系数(CV)、R2以及上渐近线、斜率因子和下渐近线的等效性的标准，如图2B所示。上渐近线(参数D)被确定为在最大剂量下一式两份响应的平均值，其中在测试条件下在上渐近线之间存在最大效果差异。类似地，下渐近线(参数A)被确定为在最小剂量下一式两份响应的平均值，其中在测试条件下在下渐近线之间存在最小效果差异。
建立生物等效性之后，参考标准品和测试样品的剂量响应曲线都受到约束。计算测试样品的50％有效浓度(EC50)与参考标准品的EC50的比率。对结果取平均值并报告为与参考标准品相比的平均相对效力％；参见图2C。曲线向左移动表示与参考标准品相比，测试样品的效力增加(而曲线向右移动将表示与参考标准品相比效力降低)。
编码抗CD19 CAR的慢病毒载体的另一示例性测试批次的类似的剂量响应曲线描绘于图2D中。剂量响应曲线可以用于测量产生半最大可检测信号的滴定量，作为病毒载体效力的量度。在一些方面，病毒测试病毒载体的相对效力可以通过使用如上文所述的方法，在同一测定中将所述半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号进行比较来确定。
这些结果表明，Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat T细胞报告细胞系可以用于评估和比较病毒载体的效力。
实施例3使用Nur77-萤光素酶-EGFP报告细胞系、经由感染复数(MOI)评估病毒载 体的效力
为了评估病毒载体效力，使用如实施例1中所述产生的稳定转染的Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat细胞报告细胞系测量编码嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体的转导效率。
该病毒载体效力测定使用如下测定形式，其中对载体进行滴定以产生一定范围的MOI(IU/细胞)。
用滴定量的编码CAR的慢病毒载体转导Jurkat报告细胞系。将滴定量的慢病毒载体以一式两份地分别添加到已接种Jurkat报告细胞的多孔板的孔中。示例性CAR包括针对靶抗原(例如BCMA)的抗原结合结构域、跨膜结构域、以及含有CD3-ζ来源的细胞内信号传导区和共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导区。将细胞在足以将CAR构建体整合到细胞基因组的条件下孵育。
在转导后，然后将CAR转导的Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat细胞报告细胞与表达BCMA的靶细胞共培养。在有利于细胞维持的培养基中在一定温度下共培养后，添加萤光素酶特定底物，并且如先前所述在读板仪上测量相对发光。
图3描绘了示例性测试样品的示例性剂量响应曲线，其中载体MOI(以IU/细胞计)绘制在x轴上，相对光单位(RLU)绘制在y轴上。剂量响应曲线可以用于测量产生半最大可检测信号的滴定量，作为病毒载体效力的量度。在一些方面，病毒测试病毒载体的相对效力可以通过使用如实施例2所述的方法，在同一测定中将所述半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号进行比较来确定。
这些数据支持Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat T细胞报告细胞系可以用于评估和比较病毒载体的效力。
实施例4示例性载体效力测定的资格评定方法
为了根据标准良好生产规范(GMP)原则评估载体效力测定的资格，进行实验以确定如实施例2中所述使用载体体积进行的测定的准确度、精密度、可重复性、线性和特异性。
简而言之，将Nur77-FFLuc2-EGFP Jurkat T细胞报告细胞用编码同一示例性CAR的测试载体批次、对照载体批次和参考载体批次转染，基本上如实施例2中所述。然后，评价以下资格参数：准确度、精密度(包括可重复性和中间精密度)、线性、范围和特异性(包括抗原特异性、稳定性指示特异性和代表性材料)。
A)准确度和精密度
为了评估来自确定为具有代表性的表征方法的参考载体批次的准确度、精密度和可重复性，由多个操作员测定几个水平的相对效力百分比。例如，为了评估200％相对效力，使用2倍体积的100％参考标准品对照来转导Jurkat报告细胞系；并且为了评估50％相对效力，使用一半体积的参考标准品对照。测试了50％-200％的相对效力范围(例如50％、71％、100％、141％和200％)。
对于测量相对准确度和中间精密度中任一个的测定，至少3名操作员在多个测试日内进行了单独的实验，以评估恢复百分比。对于测量可重复性的测定，单个操作员在相同的测试条件下进行了3次实验。使用实施例2中所述的载体效力测定，满足80％-120％的相对准确度目标，并且满足≤20％ CV的中间精密度和可重复性目标，如下表E1和表E2中所示。
B)线性
为了确保所述方法显示的线性，使用如上所述的准确度和中间精密度来计算最佳拟合线，并将其描绘在图4A中。简而言之，在GMP方法资格评定中使用线性测定是一个重大挑战，因为现有方法通常受限于由于上渐近线处的计算不准确所致的平行度(即，与真实剂量响应曲线相反)。拟合的汇总可以在下表E3中看到。如所示的，符合了至少五个连续水平的准确度和中间精密度的接受标准，所述方法证明了线性。观察到斜率约为1的线性分布。另外，残差分布不偏向一侧或另一侧，如图4B所示。这些数据表明残差(因此是误差)也是正态分布的。
总之，这些数据支持所述测定符合线性的所有接受标准。此外，这些数据支持该测定具有至少50％至200％的线性范围。
C)特异性
抗原特异性被证明为非特异性载体未能满足测定接受标准。简而言之，使用非特异性载体评估报告细胞测定的抗原特异性(即，特异性T细胞转导)。选择不会与靶细胞相互作用的非特异性载体，特别是不应该被靶细胞上的特异性抗原的存在刺激的载体。如图5所示，非特异性载体未能以任何体积(X轴)产生任何测量的输出(Y轴)，这证明了所述测定的抗原特异性。
所述测定的特异性也被评估为稳定性指示。简而言之，解冻了具有相同载体的3个独立的小瓶，以进行第一次强制降解事件(即，强制应激)。立即将一个小瓶重新冷冻作为对照，而另外两个小瓶则经受两个单独的温度应激方案。如图6所示，一个方案产生与单一强制降解对照相对可比的稳定载体，而另一种强制应激条件导致载体的相对效力降低。这些数据支持所述测定是稳定性指示，并且存在所述测定可以检测到的降解条件。
D)结论
这些数据支持示例性测定作为确定载体效力的合格方法的用途。具体地，数据显示所述方法在宽范围内(至少50％-200％)是高度准确、精确、线性的，并且是抗原特异性的和稳定性指示的。由不同的操作员执行的4个独立测定的示例性读取结果示于图7中。
此外，所述测定形式减少了通常观察到的生物测定偏差，并解决了细胞和基因疗法效力测定在开发过程中面临的许多挑战(包括生物等效性)。这种测定格式可能会减少的这些常见偏差中的一些包括：板位置偏差、操作员和日常可变性、细胞传代老化等。这允许获得在操作员之间、测定之间、研究日之间以及载体批次之间可比较的结果。最后，系统适用性和测定接受标准对于方法趋向是理想的，这是确保所述测定通过方法趋向保持其验证状态所必需的。这允许随着时间推移在测试场地对所述测定表现进行一致的监控，以确保达到标准并确保方法保持控制状态。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 评估病毒载体颗粒效力的方法
<130> 73504-20232.40
<140> 尚未分配
<141> 2022-03-21
<150> 63/164,532
<151> 2021-03-22
<160> 54
<170> 用于Windows的FastSEQ版本4.0
<210> 1
<211> 2597
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Nur77 DNA
<400> 1
ttcctggtgt aagctttggt atggatggtg gccgtctccc tacagactgg gagctgttag 60
agggcaggga tcctagctga cacatctatg tcctcgcctt ggttggaggc ctccaccatg 120
gacagaggcc aggccctgcc cctcccaggc agcctggctc cttctgctgg gccctgaagg 180
cagacgggat aatgtggttg gccaaggcct gttggtccat ccagagtgag atgccctgta 240
tccaagccca atatgggaca ccagcaccga gtccgggacc ccgtgaccac tggcaagcga 300
ccccctgacc cctgagttca tcaagcccac catggacctg gccagccccg aggcagcccc 360
cgctgccccc actgccctgc ccagcttcag caccttcatg gacggctaca caggagagtt 420
tgacaccttc ctctaccagc tgccaggaac agtccagcca tgctcctcag cctcctcctc 480
ggcctcctcc acatcctcgt cctcagccac ctcccctgcc tctgcctcct tcaagttcga 540
ggacttccag gtgtacggct gctaccccgg ccccctgagc ggcccagtgg atgaggccct 600
gtcctccagt ggctctgact actatggcag cccctgctcg gccccgtcgc cctccacgcc 660
cagcttccag ccgccccagc tctctccctg ggatggctcc ttcggccact tctcgcccag 720
ccagacttac gaaggcctgc gggcatggac agagcagctg cccaaagcct ctgggccccc 780
acagcctcca gccttctttt ccttcagtcc tcccaccggc cccagcccca gcctggccca 840
gagccccctg aagttgttcc cctcacaggc cacccaccag ctgggggagg gagagagcta 900
ttccatgcct acggccttcc caggtttggc acccacttct ccacaccttg agggctcggg 960
gatactggat acacccgtga cctcaaccaa ggcccggagc ggggccccag gtggaagtga 1020
aggccgctgg ctgtgtgtgg ggacaacgct tcatgccagc attatggtgt ccgcacatgt 1080
gagggctgca agggcttctt caagcgcaca gtgcagaaaa acgccaagta catctgcctg 1140
gctaacaagg actgccctgt ggacaagagg cggcgaaacc gctgccagtt ctgccgcttc 1200
cagaagtgcc tggcggtggg catggtgaag gaagttgtcc gaacagacag cctgaagggg 1260
cggcggggcg gctaccttca aaacccaagc agcccccaga tgcctcccct gccaatctcc 1320
tcacttccct ggtccgtgca cacctggact cagggcccag cactgccaaa ctggactact 1380
ccaagttcca ggagctggtg ctgccccact ttgggaagga agatgctggg gatgtacagc 1440
agttctacga cctgctctcc ggttctctgg aggtcatccg caagtgggcg gagaagatcc 1500
ctggctttgc tgagctgtca ccggctgacc aggacctgtt gctggagtcg gccttcctgg 1560
agctcttcat cctccgcctg gcgtacaggt ctaagccagg cgagggcaag ctcatcttct 1620
gctcaggcct ggtgctacac cggctgcagt gtgcccgtgg cttcggggac tggattgaca 1680
gtatcctggc cttctcaagg tccctgcaca gcttgcttgt cgatgtccct gccttcgcct 1740
gcctctctgc ccttgtcctc atcaccgacc ggcatgggct gcaggagccg cggcgggtgg 1800
aggagctgca gaaccgctcg ccagctgcct gaaggagcac gtggcagctg tggcgggcga 1860
gccccacagc cagctgcctg tcacgtctgt tgggcaaact gcccgagctg cggaccctgt 1920
gcacccaggg cctgcagcgc atcttctacc tcaagctgga ggacttggtg ccccctccac 1980
ccatcattga caagatcttc atggacacgc tgcccttctg acccctgcct gggaacacgt 2040
gtgcacatgc gcactctcat atgccacccc atgtgccttt agtccacgga cccccagagc 2100
acccccaagc ctgggcttga gctgcagaat gactccacct tctcacctgc tccaggaggt 2160
ttgcagggag ctcaagccct tggggagggg gatgccttca tgggggtgac cccacgattt 2220
gtcttatccc ccccagcctg gccccggcct ttatgttttt tgtaagataa accgttttta 2280
acacatagcg ccgtgctgta aataagccca gtgctgctgt aaatacagga agaaagagct 2340
tgaggtggga gcggggctgg gaggaaggga tgggccccgc cttcctgggc agcctttcca 2400
gcctcctgct ggctctctct tcctaccctc cttccacatg tacataaact gtcactctag 2460
gaagaagaca aatgacagat tctgacattt atatttgtgt attttcctgg atttatagta 2520
tgtgactttt ctgattaata tatttaatat attgaataaa aaatagacat gtagttggaa 2580
ctgaaaaaaa aaaaaaa 2597
<210> 2
<211> 609
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Nur77
<400> 2
Met Trp Leu Ala Lys Ala Cys Trp Ser Ile Gln Ser Glu Met Pro Cys
1 5 10 15
Ile Gln Ala Gln Tyr Gly Thr Pro Ala Pro Ser Pro Gly Pro Arg Asp
20 25 30
His Leu Ala Ser Asp Pro Leu Thr Pro Glu Phe Ile Lys Pro Thr Met
35 40 45
Asp Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ala Leu Pro
50 55 60
Ser Phe Ser Thr Phe Met Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Phe Asp Thr Phe
65 70 75 80
Leu Tyr Gln Leu Pro Gly Thr Val Gln Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ser
85 90 95
Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Pro Ala Ser Ala
100 105 110
Ser Phe Lys Phe Glu Asp Phe Gln Val Tyr Gly Cys Tyr Pro Gly Pro
115 120 125
Leu Ser Gly Pro Val Asp Glu Ala Leu Ser Ser Ser Gly Ser Asp Tyr
130 135 140
Tyr Gly Ser Pro Cys Ser Ala Pro Ser Pro Ser Thr Pro Ser Phe Gln
145 150 155 160
Pro Pro Gln Leu Ser Pro Trp Asp Gly Ser Phe Gly His Phe Ser Pro
165 170 175
Ser Gln Thr Tyr Glu Gly Leu Arg Ala Trp Thr Glu Gln Leu Pro Lys
180 185 190
Ala Ser Gly Pro Pro Gln Pro Pro Ala Phe Phe Ser Phe Ser Pro Pro
195 200 205
Thr Gly Pro Ser Pro Ser Leu Ala Gln Ser Pro Leu Lys Leu Phe Pro
210 215 220
Ser Gln Ala Thr His Gln Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr Ser Met Pro
225 230 235 240
Thr Ala Phe Pro Gly Leu Ala Pro Thr Ser Pro His Leu Glu Gly Ser
245 250 255
Gly Ile Leu Asp Thr Pro Val Thr Ser Thr Lys Ala Arg Ser Gly Ala
260 265 270
Pro Gly Gly Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ser
275 280 285
Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe
290 295 300
Lys Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu Ala Asn Lys
305 310 315 320
Asp Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg
325 330 335
Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr
340 345 350
Asp Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Gln
355 360 365
Pro Pro Asp Ala Ser Pro Ala Asn Leu Leu Thr Ser Val Arg Ala His
370 375 380
Leu Asp Ser Gly Pro Ser Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Ser Lys Phe Gln
385 390 395 400
Glu Leu Val Leu Pro His Phe Gly Lys Glu Asp Ala Gly Asp Val Gln
405 410 415
Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Ser Gly Ser Leu Glu Val Ile Arg Lys Trp
420 425 430
Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Glu Leu Ser Pro Ala Asp Gln Asp
435 440 445
Leu Leu Leu Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Ile Leu Arg Leu Ala
450 455 460
Tyr Arg Ser Lys Pro Gly Glu Gly Lys Leu Ile Phe Cys Ser Gly Leu
465 470 475 480
Val Leu His Arg Leu Gln Cys Ala Arg Gly Phe Gly Asp Trp Ile Asp
485 490 495
Ser Ile Leu Ala Phe Ser Arg Ser Leu His Ser Leu Leu Val Asp Val
500 505 510
Pro Ala Phe Ala Cys Leu Ser Ala Leu Val Leu Ile Thr Asp Arg His
515 520 525
Gly Leu Gln Glu Pro Arg Arg Val Glu Glu Leu Gln Asn Arg Ile Ala
530 535 540
Ser Cys Leu Lys Glu His Val Ala Ala Val Ala Gly Glu Pro Gln Pro
545 550 555 560
Ala Ser Cys Leu Ser Arg Leu Leu Gly Lys Leu Pro Glu Leu Arg Thr
565 570 575
Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu Lys Leu Glu Asp
580 585 590
Leu Val Pro Pro Pro Pro Ile Ile Asp Lys Ile Phe Met Asp Thr Leu
595 600 605
Pro
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Nur77 gRNA 1
<400> 3
caugaagauc uugucaauga 20
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Nur77 gRNA 2
<400> 4
ugcacacgug uucccaggc 19
<210> 5
<211> 7286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nur77敲入构建体
<400> 5
cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60
ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180
ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240
accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300
gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360
gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420
caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600
ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac 660
caatctcact atgttgcccg agctggtctc gaactcctgg gctcaaatga tcctcctgtc 720
tcagcctcct aaagtgctgg gattacaggt gtgagccacc acgcctagcc cttcactgtg 780
acttctgaca gtgcagatca gattggttgt gcctgttttg gactttatgt aaatgtagtt 840
ctgcaggatg gaatctggtg ttgaatgcag aggttttcag atttctctgt tttttaaagg 900
aaagaatcca ccctcgttca ttttttcact taaattgcac aggggaccca acgatataga 960
acacaatcag aggtactctg ggctgaggga gtgctgagtt ctgaggctgg gtttctcaga 1020
acagtctaga ttttaaaaac ccaatgatct agccagaaaa cgtaggttag gattttattt 1080
cccgtttgtg accctgggca agtcattagc ctcctgggcc tcgggttctc acttggagta 1140
tgaggataat gagggttact gcttctcaga cttgtgacga tgcttactaa tggccaacat 1200
gtgaatgcgc ttttgtgaag tgccagcaga gcatgagggg tggtcagggg cagcagtttt 1260
aggggcctgg gggaggctgg ggctttgggg gcctggttct cagatgtaca gctaatcctg 1320
tacccttccc gcagaccggc atgggctgca ggagccgcgg cgggtggagg agctgcagaa 1380
ccgcatcgcc agctgcctga aggagcacgt ggcagctgtg gcgggcgagc cccagccagc 1440
cagctgcctg tcacgtctgt tgggcaaact gcccgagctg cggaccctgt gcacccaggg 1500
cctgcagcgc atcttctacc tcaagctgga ggacttggtg ccccctccac ctatcatcga 1560
caagatcttc atggacacgc tgcccttcgg atccggagaa ggacggggct ctctgcttac 1620
atgtggcgac gttgaggaaa accccggacc tatggaagat gccaaaaaca ttaagaaggg 1680
cccagcgcca ttctacccac tcgaagacgg gaccgccggc gagcagctgc acaaagccat 1740
gaagcgctac gccctggtgc ccggcaccat cgcctttacc gacgcacata tcgaggtgga 1800
cattacctac gccgagtact tcgagatgag cgttcggctg gcagaagcta tgaagcgcta 1860
tgggctgaat acaaaccatc ggatcgtggt gtgcagcgag aatagcttgc agttcttcat 1920
gcccgtgttg ggtgccctgt tcatcggtgt ggctgtggcc ccagctaacg acatctacaa 1980
cgagcgcgag ctgctgaaca gcatgggcat cagccagccc accgtcgtat tcgtgagcaa 2040
gaaagggctg caaaagatcc tcaacgtgca aaagaagcta ccgatcatac aaaagatcat 2100
catcatggat agcaagaccg actaccaggg cttccaaagc atgtacacct tcgtgacttc 2160
ccatttgcca cccggcttca acgagtacga cttcgtgccc gagagcttcg accgggacaa 2220
aaccatcgcc ctgatcatga acagtagtgg cagtaccgga ttgcccaagg gcgtagccct 2280
accgcaccgc accgcttgtg tccgattcag tcatgcccgc gaccccatct tcggcaacca 2340
gatcatcccc gacaccgcta tcctcagcgt ggtgccattt caccacggct tcggcatgtt 2400
caccacgctg ggctacttga tctgcggctt tcgggtcgtg ctcatgtacc gcttcgagga 2460
ggagctattc ttgcgcagct tgcaagacta taagattcaa tctgccctgc tggtgcccac 2520
actatttagc ttcttcgcta agagcactct catcgacaaa tacgacctaa gcaacttgca 2580
cgagatcgcc agcggcgggg cgccgctcag caaggaagtc ggcgaggccg tggccaaacg 2640
cttccaccta cccggcatcc gccagggcta cggcctgaca gaaacaacca gcgccattct 2700
gatcaccccc gaaggggacg acaagcctgg cgcagtaggc aaggtggtgc ccttcttcga 2760
ggctaaggtg gtggacttgg acaccggcaa gacactgggt gtgaaccagc gcggcgagct 2820
gtgcgtccgt ggccccatga tcatgagcgg ctacgttaac aaccccgagg ctacaaacgc 2880
tctcatcgac aaggacggct ggctgcacag cggcgacatc gcctactggg acgaggacga 2940
gcacttcttc atcgtggacc ggctgaagag cctgatcaaa tacaagggct accaggtggc 3000
cccagccgaa ctggagagca tcctgctgca acaccccaac atcttcgacg ccggggtcgc 3060
cggcctgccc gacgacgatg ccggcgagct gcccgccgca gtcgtcgtgc tggaacacgg 3120
caaaaccatg accgagaagg agatcgtgga ctatgtggcc agccaggtca caaccgccaa 3180
gaagctgcgc ggtggtgttg tgttcgtgga cgaggtgcct aaaggactga ccggcaagtt 3240
ggacgcccgc aagatccgcg agattctcat taaggccaag aagggcggca agatcgccgt 3300
gggcagcgga gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg 3360
ccctatggtg tccaagggcg aagaactgtt taccggcgtg gtgcccatcc tggtggaact 3420
ggatggggat gtgaacggcc acaagttcag cgttagcgga gaaggcgaag gcgacgccac 3480
atacggaaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcctg tgccttggcc 3540
tacactggtc accacactga catacggcgt gcagtgcttc agcagatacc ccgaccatat 3600
gaagcagcac gacttcttca agagcgccat gcctgagggc tacgtgcaag agcggaccat 3660
cttctttaaa gacgacggca actacaagac cagggccgaa gtgaagttcg agggcgacac 3720
cctggtcaac cggatcgagc tgaagggcat cgacttcaaa gaggacggca acatcctggg 3780
ccacaagctt gagtacaact acaacagcca caacgtgtac atcatggccg acaagcagaa 3840
aaacggcatc aaagtgaact tcaagatccg gcacaacatc gaggacggct ctgtgcagct 3900
ggccgatcac taccagcaga acacacccat cggagatggc cctgtgctgc tgcccgataa 3960
ccactacctg agcacccaga gcaagctgag caaggacccc aacgagaagc gggaccacat 4020
ggtgctgctg gaatttgtga cagccgccgg aatcaccctc ggcatggatg agctgtacaa 4080
gtgactcgag cctgggaaca cgtgtgcaca tgcgcactct catatgccac cccatgtgcc 4140
tttagtccac ggacccccag agcaccccca agcctgggct tgagctgcag aatgactcca 4200
ccttctcacc tgctccagga ggtttgcagg gagctcaagc ccttggggag ggggatgcct 4260
tcatgggggt gaccccacga tttgtcttat cccccccagc ctggccccgg cctttatgtt 4320
ttttgtaaga taaaccgttt ttaacacata gcgccgtgct gtaaataagc ccagtgctgc 4380
tgtaaataca ggaagaaaga gcttgaggtg ggagcggggc tgggaggaag ggatgggccc 4440
cgccttcctg ggcagccttt ccagcctcct gctggctctc tcttcctacc ctccttccac 4500
atgtacataa actgtcactc taggaagaag acaaatgaca gattctgaca tttatatttg 4560
tgtattttcc tggatttata gtatgtgact tttctgatta atatatttaa tatattgaat 4620
aaaaaataga catgtagttg gaactgagat tcagtctgtc tctgatgccc cctccccact 4680
cccccaccag acacacccca tcattacata agagatgggc tgctcaagat gaaacttgga 4740
tgttaccagc ctgagctgtc aggcctcagt gtactcattt gtaaaaggcg gataataatg 4800
acacctgctt cacgaggttg ttatgcaaag cacttagact aatttctaac acgtgggaag 4860
cctgcattag ctgtgcctgg ctagctgtgc ctggctcatt gctggggtct gcagtggctg 4920
actagcccag gggtcactgc agggccctag caatagactt agccgcagat ctcagggttg 4980
tcatgtttcc taaactggac atatattctc tgattcttga tttccacatc cataaaacaa 5040
gaatagaccc agcctcacag agctgcggcc gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc 5100
cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 5160
aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 5220
ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 5280
ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 5340
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 5400
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 5460
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 5520
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 5580
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 5640
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 5700
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 5760
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 5820
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 5880
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 5940
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 6000
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 6060
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 6120
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 6180
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 6240
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 6300
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 6360
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 6420
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 6480
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 6540
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 6600
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 6660
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 6720
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 6780
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 6840
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 6900
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 6960
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 7020
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 7080
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 7140
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 7200
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 7260
tccgcgcaca tttccccgaa aagtgc 7286
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A DNA
<400> 6
gaaggcagag gctctctcct cacatgtggg gatgttgaag aaaatccagg tccc 54
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A蛋白
<400> 7
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 8
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FFLuc2 DNA
<400> 8
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaaat acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaagtcg gcgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac ccggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggcaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtggcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggc aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggtcac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg 1650
<210> 9
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FFLuc2
<400> 9
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ile Ala Val
545 550
<210> 10
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP
<400> 10
atggtgtcca agggcgaaga actgtttacc ggcgtggtgc ccatcctggt ggaactggat 60
ggggatgtga acggccacaa gttcagcgtt agcggagaag gcgaaggcga cgccacatac 120
ggaaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcctgtgcc ttggcctaca 180
ctggtcacca cactgacata cggcgtgcag tgcttcagca gataccccga ccatatgaag 240
cagcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggctacg tgcaagagcg gaccatcttc 300
tttaaagacg acggcaacta caagaccagg gccgaagtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtcaaccgga tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaagagg acggcaacat cctgggccac 420
aagcttgagt acaactacaa cagccacaac gtgtacatca tggccgacaa gcagaaaaac 480
ggcatcaaag tgaacttcaa gatccggcac aacatcgagg acggctctgt gcagctggcc 540
gatcactacc agcagaacac acccatcgga gatggccctg tgctgctgcc cgataaccac 600
tacctgagca cccagagcaa gctgagcaag gaccccaacg agaagcggga ccacatggtg 660
ctgctggaat ttgtgacagc cgccggaatc accctcggca tggatgagct gtacaag 717
<210> 11
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP
<400> 11
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 12
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nur77左同源臂
<400> 12
aatctcacta tgttgcccga gctggtctcg aactcctggg ctcaaatgat cctcctgtct 60
cagcctccta aagtgctggg attacaggtg tgagccacca cgcctagccc ttcactgtga 120
cttctgacag tgcagatcag attggttgtg cctgttttgg actttatgta aatgtagttc 180
tgcaggatgg aatctggtgt tgaatgcaga ggttttcaga tttctctgtt ttttaaagga 240
aagaatccac cctcgttcat tttttcactt aaattgcaca ggggacccaa cgatatagaa 300
cacaatcaga ggtactctgg gctgagggag tgctgagttc tgaggctggg tttctcagaa 360
cagtctagat tttaaaaacc caatgatcta gccagaaaac gtaggttagg attttatttc 420
ccgtttgtga ccctgggcaa gtcattagcc tcctgggcct cgggttctca cttggagtat 480
gaggataatg agggttactg cttctcagac ttgtgacgat gcttactaat ggccaacatg 540
tgaatgcgct tttgtgaagt gccagcagag catgaggggt ggtcaggggc agcagtttta 600
ggggcctggg ggaggctggg gctttggggg cctggttctc agatgtacag ctaatcctgt 660
acccttcccg cagaccggca tgggctgcag gagccgcggc gggtggagga gctgcagaac 720
cgcatcgcca gctgcctgaa ggagcacgtg gcagctgtgg cgggcgagcc ccagccagcc 780
agctgcctgt cacgtctgtt gggcaaactg cccgagctgc ggaccctgtg cacccagggc 840
ctgcagcgta tcttctacct caagctggag gacttggtgc cccctccacc tatcatcgac 900
aagatcttca tggacacgct gcccttc 927
<210> 13
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nur77右同源臂
<400> 13
gcctgggaac acgtgtgcac atgcgcactc tcatatgcca ccccatgtgc ctttagtcca 60
cggaccccca gagcaccccc aagcctgggc ttgagctgca gaatgactcc accttctcac 120
ctgctccagg aggtttgcag ggagctcaag cccttgggga gggggatgcc ttcatggggg 180
tgaccccacg atttgtctta tcccccccag cctggccccg gcctttatgt tttttgtaag 240
ataaaccgtt tttaacacat agcgccgtgc tgtaaataag cccagtgctg ctgtaaatac 300
aggaagaaag agcttgaggt gggagcgggg ctgggaggaa gggatgggcc ccgccttcct 360
gggcagcctt tccagcctcc tgctggctct ctcttcctac cctccttcca catgtacata 420
aactgtcact ctaggaagaa gacaaatgac agattctgac atttatattt gtgtattttc 480
ctggatttat agtatgtgac ttttctgatt aatatattta atatattgaa taaaaaatag 540
acatgtagtt ggaactgaga ttcagtctgt ctctgatgcc ccctccccac tcccccacca 600
gacacacccc atcattacat aagagatggg ctgctcaaga tgaaacttgg atgttaccag 660
cctgagctgt caggcctcag tgtactcatt tgtaaaaggc ggataataat gacacctgct 720
tcacgaggtt gttatgcaaa gcacttagac taatttctaa cacgtgggaa gcctgcatta 780
gctgtgcctg gctagctgtg cctggctcat tgctggggtc tgcagtggct gactagccca 840
ggggtcactg cagggcccta gcaatagact tagccgcaga tctcagggtt gtcatgtttc 900
ctaaactgga catatattct ctgattcttg atttccacat ccataaaaca agaatagacc 960
cagcctcaca gagct 975
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nur77靶位点1
<400> 14
tcattgacaa gatcttcatg 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nur77靶位点2
<400> 15
gcctgggaac acgtgtgca 19
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 17
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 18
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 19
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 20
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 21
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 22
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 24
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 25
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 26
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 27
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 28
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 29
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 30
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 31
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 32
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 34
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 35
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 36
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 37
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 38
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 38
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 39
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<400> 40
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<400> 41
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 42
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 43
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 43
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 44
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 44
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28
<400> 45
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 46
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28
<400> 46
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 47
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28
<400> 47
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 48
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28
<400> 48
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 49
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
<400> 49
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 50
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 50
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 51
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 52
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 53
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 53
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 54
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 54
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355

Claims (72)

1.一种用于确定病毒载体效力的方法，所述方法包括：
a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中：
每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；
所述重组受体包含对靶标具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域，并且包含具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区或与其复合；
b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；
c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及
d)基于所测量的可检测信号确定产生半最大可检测信号的测试病毒载体的滴定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述效力是相对效力，并且所述方法还包括在同一测定中，将所述测试病毒载体的半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号进行比较。
3.一种用于确定病毒载体效力的方法，所述方法包括：
a)将滴定量的编码重组受体的测试病毒载体引入多个报告T细胞群体中，其中每个报告T细胞群体是相同的并且每个群体被引入不同量的滴定的测试病毒载体，其中：
每个报告T细胞群体包含报告T细胞，所述报告T细胞包含与T细胞转录因子的转录调节元件可操作地连接的编码报告分子的核酸序列；
所述重组受体包含对靶标具有特异性的细胞外结合结构域、跨膜结构域以及具有含ITAM结构域的细胞内信号传导区；
b)在重组受体刺激剂的存在下孵育所述多个报告T细胞群体中的每一个，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合诱导通过所述重组受体的细胞内信号传导区的信号传导，以由所述报告分子产生可检测信号；
c)测量所述多个报告T细胞群体中的每一个的来自所述报告分子的可检测信号；以及
d)基于所测量的可检测信号，通过在同一测定中，将所述半最大可检测信号与参考病毒载体标准品的半最大可检测信号进行比较，确定所述病毒测试病毒载体的相对效力。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述相对效力是所述测试病毒载体的可检测信号与所述参考病毒载体标准品的可检测信号的百分比。
5.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述相对效力是所述测试病毒载体的可检测信号与所述参考病毒载体标准品的可检测信号的比率。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中测试病毒载体的滴定量是对所述病毒载体进行连续稀释。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述病毒载体的连续稀释是基于所述载体体积的连续稀释。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述连续稀释是基于所述病毒载体滴度的连续稀释。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒载体滴度是功能滴度，任选地其中通过体外噬斑测定法定量所述功能滴度。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒载体滴度是物理滴度，任选地其中经由DNA或RNA定量、通过PCR方法定量所述物理滴度。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述病毒载体滴度被定量为感染单位(IU)/单位病毒载体体积。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述连续稀释是基于所述病毒载体的感染复数(MOI)的连续稀释。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在适于感染的培养条件下，经由病毒载体滴度、任选地功能滴度对每数目的受纳细胞的MOI进行定量。
14.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中测试病毒载体的滴定量是恒定量的病毒载体与所述报告T细胞群体中的细胞数量的比率。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的体积。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的滴度。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述测试病毒载体的量是所述测试病毒载体的MOI。
18.根据权利要求12、13和17中任一项所述的方法，其中所述MOI在约0.001与10个颗粒/细胞之间，任选地为或为约0.01、为或为约0.1、为或为约1.0、或者为或为约10个颗粒/细胞、或任何前述值之间的任何值。
19.根据权利要求1-18所述的方法，其中所述报告T细胞是永生化细胞系。
20.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述报告T细胞是Jurkat细胞系或其衍生物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述Jurkat细胞系或其衍生物是Jurkat细胞克隆E6-1。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述调节元件包含由所述转录因子识别的一个或多个响应元件，所述转录因子在通过由所述重组受体刺激剂诱导的重组受体的含ITAM结构域进行信号传导后被激活。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述T细胞转录因子选自Nur77、NF-κB、NFAT或AP1。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述T细胞转录因子是Nur77。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述转录调节元件包含含有由转录因子识别的一个或多个响应元件的Nur77启动子或其部分。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述转录调节元件是T细胞中的内源Nur77基因座内的转录调节元件。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中编码所述报告分子的核酸序列整合在所述报告T细胞的基因组中的编码Nur77的内源基因座处或附近，其中所述报告分子与所述内源Nur77基因座的转录调节元件可操作地连接。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中将编码所述报告分子的核酸序列通过以下方式整合：
a)在编码Nur77的内源基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导遗传破坏；和
b)引入包含编码所述报告分子的核酸的模板多核苷酸，以通过同源定向修复(HDR)将所述报告分子敲入所述内源基因座中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传破坏由特异性结合、识别或杂交至所述靶位点的CRISPR-Cas9组合诱导。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶包含具有与所述靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法，其中编码所述报告物的核酸存在于所述基因组内的编码Nur77的内源基因座的最后一个外显子处或附近的位点处。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述一个或多个靶位点包括所述基因组内的如下位点和/或所述核酸存在于所述基因组内的如下位点，所述位点包含核酸序列TCATTGACAAGATCTTCATG(SEQ ID NO:3)和/或GCCTGGGAACACGTGTGCA(SEQ ID NO:4)。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述报告分子是或包括萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其修饰形式。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述报告分子是萤光素酶，任选地是萤火虫萤光素酶。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中编码所述报告分子的核酸序列还编码一种或多种标记，所述一种或多种标记是或包括转导标记和/或选择标记。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述转导标记包括荧光蛋白，任选地eGFP。
37.根据权利要求2-36中任一项所述的方法，其中所述参考病毒载体标准品是代表与所述测试病毒载体同一生产过程的经验证的病毒载体批次。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述参考病毒载体标准品是根据良好生产规范(GMP)生产的病毒载体批次。
39.根据权利要求2-38中任一项所述的方法，其中对所述参考病毒载体标准品的评估与所述测试病毒载体在所述测定中平行进行。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其信号传导部分。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区还包含共刺激信号传导区。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
45.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述重组受体是工程化的T细胞受体(eTCR)。
46.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是结合分子，所述结合分子是或包括所述重组受体的靶抗原或其细胞外结构域结合部分，任选地重组抗原。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述结合分子是或包括所述抗原的细胞外结构域结合部分，并且所述细胞外结构域结合部分包含由所述重组受体识别的表位。
49.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是或包括结合分子，所述结合分子是对所述重组受体的细胞外结构域具有特异性的抗体。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂被固定或附着于固体支持物上。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述固体支持物是器皿的表面，任选地是微孔板的孔，在其中进行多个孵育。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述固体支持物是珠。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述珠来自组合物，所述组合物具有如下浓度的所述结合分子：在或在约0.5μg/mL与500μg/mL之间，包含端值，任选地为或为约5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL或200μg/mL、或前述值之间的任何值。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中，为了进行所述孵育，将所述珠以报告T细胞与所述珠的比率为或为约5:1至1:5添加，包含端值。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中，为了进行所述孵育，将所述珠以报告细胞与所述珠的比率为或为约3:1至1:3或2:1至1:2添加。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中，为了进行所述孵育，将所述珠以报告细胞与所述珠的比率为或为约1:1添加。
57.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是靶标表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系或是取自受试者的原代细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述靶标表达细胞是细胞系。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞系是肿瘤细胞系。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述靶标表达细胞是已任选地通过转导而经引入以表达所述重组受体的靶标的细胞。
61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，其中，为了进行所述孵育，将所述靶标表达细胞以靶标表达细胞与所述报告T细胞的比率为或为约1:1至10:1添加。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法，其中，为了进行所述孵育，将所述靶标表达细胞以靶标表达细胞与所述报告T细胞的比率为或为约1:1至6:1添加。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述多个孵育在烧瓶、管或多孔板中进行。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述多个孵育各自在多孔板的孔中单独进行。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述多孔板是96孔板、48孔板、12孔板或6孔板。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中使用读板仪测量所述可检测信号。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述可检测信号是萤光素酶，并且所述读板仪是发光计读板仪。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述慢病毒载体源自HIV-1。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述可检测信号是萤光素酶发光。
CN202280031773.9A 2021-03-22 2022-03-21 评估病毒载体颗粒效力的方法 Pending CN117321200A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163164532P 2021-03-22 2021-03-22
US63/164,532 2021-03-22
PCT/US2022/021226 WO2022204071A1 (en) 2021-03-22 2022-03-21 Method to assess potency of viral vector particles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117321200A true CN117321200A (zh) 2023-12-29

Family

ID=81392934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280031773.9A Pending CN117321200A (zh) 2021-03-22 2022-03-21 评估病毒载体颗粒效力的方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4314280A1 (zh)
JP (1) JP2024511420A (zh)
KR (1) KR20230158573A (zh)
CN (1) CN117321200A (zh)
AU (1) AU2022244229A1 (zh)
CA (1) CA3208944A1 (zh)
WO (1) WO2022204071A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240067958A1 (en) * 2022-08-31 2024-02-29 Gigamune, Inc. Engineered enveloped vectors and methods of use thereof
CN116218918A (zh) * 2022-11-08 2023-06-06 上海药明生物技术有限公司 一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5876435A (ja) 1981-10-30 1983-05-09 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 重合体粒子
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
NO155316C (no) 1982-04-23 1987-03-11 Sintef Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4554088A (en) 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5395688A (en) 1987-10-26 1995-03-07 Baxter Diagnostics Inc. Magnetically responsive fluorescent polymer particles
US5091206A (en) 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2645160B1 (zh) 1989-03-31 1992-10-02 Rhone Poulenc Chimie
FR2656318B1 (fr) 1989-12-27 1994-02-04 Rhone Poulenc Chimie Microspheres "core-shell" magnetisables a base d'organopolysiloxane reticule, leur procede de preparation et leur application en biologie.
US5318797A (en) 1990-06-20 1994-06-07 Clarkson University Coated particles, hollow particles, and process for manufacturing the same
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US20020150914A1 (en) 1995-06-30 2002-10-17 Kobenhavns Universitet Recombinant antibodies from a phage display library, directed against a peptide-MHC complex
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5834121A (en) 1996-01-16 1998-11-10 Solid Phase Sciences Corp. Composite magnetic beads
WO1997034634A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain fv constructs of anti-ganglioside gd2 antibodies
AU6467796A (en) 1996-04-24 1997-05-15 Claude Fell Cell separation system for biological fluids like blood
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6074884A (en) 1997-10-09 2000-06-13 Coulter International Corp. Stable protein-nickel particles and methods of production and use thereof
IL136544A0 (en) 1997-12-05 2001-06-14 Scripps Research Inst Humanization of murine antibody
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
DE69938293T2 (de) 1998-03-27 2009-03-12 Bruce J. Beverly Hills Bryan Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
JP2002524081A (ja) 1998-09-04 2002-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
ES2224726T3 (es) 1998-12-24 2005-03-01 Biosafe S.A. Sistema de separacion sanguinea indicado en particular para la concentracion de celulas madre hematopoyeticas.
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
CA2410510A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
AU2001297703B2 (en) 2000-11-07 2006-10-19 City Of Hope CD19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
CA2476625A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
EP1773383B1 (en) 2004-05-27 2012-09-12 Jon A. Weidanz Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20090226474A1 (en) 2004-05-27 2009-09-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
KR101319135B1 (ko) 2005-03-23 2013-10-17 바이오세이프 쏘시에떼아노님 재생 의약에서 성체 줄기 세포를 비롯한 세포 부분집합의 수집, 처리, 이식을 위한 통합된 기계 장치
ATE553144T1 (de) 2006-12-21 2012-04-15 Invitrogen Dynal As Partikel und ihre verwendung in einem verfahren zur nukleinsäureisolierung oder einem verfahren zur phosphorproteinisolierung
WO2008121420A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
EP2313515B1 (en) 2008-08-22 2015-03-04 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
PT2406284T (pt) 2009-03-10 2016-09-29 Biogen Ma Inc Anticorpos anti-bcma
JP5956342B2 (ja) 2009-11-03 2016-07-27 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 形質導入Ｔ細胞選択のためのトランケート上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
BR122021026169B1 (pt) 2010-12-09 2023-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Uso de uma célula
ES2791716T3 (es) 2010-12-14 2020-11-05 Univ Maryland Células T que expresan al receptor de antígeno quimérico antietiqueta universal y métodos para el tratamiento del cáncer
ES2841983T3 (es) 2011-03-23 2021-07-12 Hutchinson Fred Cancer Res Método y composiciones para inmunoterapia celular
KR20140033029A (ko) 2011-04-01 2014-03-17 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 에이치엘에이 에이2에 의해 제공된 더블유티1 펩타이드에 특이적인 티 세포 수용체 유사 항체
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
BR112014011417B1 (pt) 2011-11-11 2021-10-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Polipeptídeo isolado capaz de elicitar uma resposta de célula t antígeno-específica para ciclina a1 humana, composição imunogênica compreendendo o referido polipeptídeo, bem como método para preparar células apresentadoras de antígeno, antígeno-pulsadas,e uso destas para superexpressão de ccna1
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
KR20150009556A (ko) 2012-05-03 2015-01-26 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 증강된 친화성 t　세포 수용체 및 이의 제조 방법
WO2013169802A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
US9371396B2 (en) 2012-06-15 2016-06-21 Sinomab Bioscience Limited Anti-CD22 anti-idiotypic antibodies and uses thereof
WO2014031687A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
CN112430580A (zh) 2012-10-02 2021-03-02 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
EP3132030B1 (en) 2014-04-18 2020-08-26 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
US10301370B2 (en) 2014-05-02 2019-05-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor T cells
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
EP2990416B1 (en) 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
AU2015343121B2 (en) 2014-11-05 2020-06-18 Juno Therapeutics, Inc. Methods for transduction and cell processing
AU2015357535B2 (en) 2014-12-05 2020-05-14 Eureka Therapeutics, Inc. Antibodies targeting G-protein coupled receptor and methods of use
RS61781B1 (sr) 2014-12-05 2021-06-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitela koja ciljaju antigen za sazrevanje b-ćelija i postupci upotrebe
SG11201704549UA (en) 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
SI3227339T1 (sl) 2014-12-05 2022-02-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Himerni antigenski receptorji, ki ciljajo na receptor, povezan z G-proteinom, in njihova uporaba
US11377481B2 (en) 2015-12-22 2022-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SpyCatcher and SpyTag: universal immune receptors for T cells
KR102584280B1 (ko) 2016-04-01 2023-10-04 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 및 t 세포 수용체 및 사용 방법
JP7062640B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 抗ｃｄ１９抗体に対する抗イディオタイプ抗体
US20200181678A1 (en) * 2016-12-15 2020-06-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Cell-Based Reporter Assay for Live Virus Vaccines
JP7337773B2 (ja) 2017-07-29 2023-09-04 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組換え受容体を発現している細胞を増大させるための試薬
US11851679B2 (en) * 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
CN112313331A (zh) * 2018-04-27 2021-02-02 沃雅戈治疗公司 用于测量aadc病毒载体效力的方法
US20210348242A1 (en) * 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2021026461A2 (en) * 2019-08-08 2021-02-11 Biogen Ma Inc. Potency assays for viral vector production

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024511420A (ja) 2024-03-13
EP4314280A1 (en) 2024-02-07
AU2022244229A1 (en) 2023-09-14
KR20230158573A (ko) 2023-11-20
CA3208944A1 (en) 2022-09-29
WO2022204071A1 (en) 2022-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101471445B1 (ko) 조류에서 이식유전자 발현
KR101320489B1 (ko) 인간 세포주에서 재조합 인간 단백질의 무혈청의 안정한형질감염 및 생산
CN117321200A (zh) 评估病毒载体颗粒效力的方法
KR102626748B1 (ko) 임상용 변형된 NK-92 haNK003 세포
AU740768B2 (en) Rapid generation of stable mammalian cell lines producing high levels of recombinant proteins
KR102096592B1 (ko) 신규한 crispr 연관 단백질 및 이의 용도
KR20220047623A (ko) 세포 유형 운명 특정화의 조절인자를 확인하기 위한 조성물 및 방법
US6544779B1 (en) Pseudo-type retroviral vectors with modifiable surface capsid proteins
JP2024037917A (ja) 組換えｔ細胞受容体遺伝子を用いて細胞ベースの治療薬を製造するための技法
CN101652475A (zh) 在禽类中进行转基因表达
CN113061626B (zh) 一种组织特异性敲除斑马鱼基因的方法及应用
CN110050065B (zh) 用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离(epic)
CN114874332B (zh) 经修饰的rnf112作为治疗als药物的应用
CN107058390A (zh) 一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用
CN113355288B (zh) 一种治疗covid-19的通用型嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用
CN114630909B (zh) 环状rna、包含环状rna的疫苗及用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒
CN106520837A (zh) 一种重组载体及其应用
CN114222763A (zh) 在嵌合抗原受体设计中实现的超模块化IgG3间隔区结构域和多功能位点
CA2510184A1 (en) In vivo affinity maturation scheme
CN114644581A (zh) 含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用
CN116322793A (zh) 改进的使用科卡尔包膜的t细胞转导用慢病毒载体的生成
KR20190136018A (ko) Pvr 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
MXPA00004017A (es) Generacion rapida de lineas celulares de estables de mamifero que producen altos niveles de proteinas recombinantes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination