KR101471445B1 - 조류에서 이식유전자 발현 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로모터 성분 및 프로모터 간섭이 감소된 벡터를 포함하는 외인성 누클레오티드 서열을 그 게놈에 함유하는 유전자이식 조류에 관한 것이고, 여기서 외인성 누클레오티드 서열은 게놈 및 조류에 통합된다.
Description
관련 출원 정보
본 출원은 2007년 5월 16일 출원된 미국 가출원 60/930,491호 및 2007년 9월 18일 출원된 60/994,203호의 이익을 주장하며 2007년 1월 26일 출원된 미국 특허 출원 11/699,257호의 일부 계속 출원이다. 상기 두 가출원 및 한 특허 출원 각각의 기술이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 일반적으로 유전자이식 닭과 같은 유전자이식 조류의 세포 (예컨대, 자궁관 세포)에서 기능하는 프로모터 및 이러한 프로모터를 함유하는 벡터의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 핵산 및 발현 벡터, 트랜스펙션된 세포 및 코딩 서열에 작동가능하게 결합된 유전자 발현 조절 영역을 지닌 벡터를 함유하는 유전자이식 동물, 예를 들어 유전자이식 닭과 같은 유전자이식 조류에 관한 것이다.
유전자이식 분야는 초기에 모든 동물과 관련된 단일 유전자의 작용 및 유전자 활성화, 발현 및 상호작용의 현상을 이해하기 위해 개발되었다. 유전자이식 기술은 인간 및 다른 동물의 다양한 질병 모델을 제공하기 위해서도 이용되었고, 이는 유전학의 연구 및 유전 메카니즘 및 기능을 이해하기 위해 이용가능한 가장 강력한 도구 중 하나이다. 경제적 관점에서, 특정 단백질 또는 약학적으로 흥미로운 다른 물질을 생성하기 위해 동물을 "단백질 공장"으로 전환시키는 유전자이식 기술의 이용은 (Gordon et al., 1987, Biotechnology 5: 1183-1187; Wilmut et al., 1990, Theriogenology 33: 113-123) 유전자 발현에 의해 단백질을 생성하는 보다 통상적인 방법에 비해 현저한 이점을 제공한다.
외래 단백질을 발현시키는데 유용한 한 시스템은 조류 생식 시스템이다. 조류 알의 생성은 암탉의 난소에서 큰 난황의 형성으로 시작된다. 수정되지 않은 난모세포 또는 난자는 난황낭의 상부에 배치된다. 배란 후, 난자는 자궁관의 깔때기를 통과하며, 정충이 존재하는 경우 여기서 수정된 다음, 자궁관의 매그넘(magnum)으로 이동하고, 대롱샘 세포로 라이닝된다. 이러한 세포들은 오브알부민, 리소자임, 오보뮤코이드, 콘알부민 및 오보뮤신을 포함하는 난백 단백질을 매그넘의 관내강으로 분비하고, 여기서 이들은 조류 배아 및 난황 위로 침착된다. 과거에는 외인성 단백질 생성이 특히 조류 자궁관을 표적으로 하는 조류 생식 시스템에서 수행되어 왔다.
외인성 단백질 발현을 위해 조류 자궁관을 표적으로 하는 이점으로는 표적 단백질의 적절한 폴딩 및 번역후 개질, 생성물 회수의 용이함, 및 다른 동물 종에 비해 닭과 같은 조류의 짧은 발육 기간을 들 수 있다.
유전자이식 조류의 자궁관에서 이종성 유전자 생성물의 직접 발현은 새에서의 편재성(ubiquitous) 발현에 비해 현저하게 이로울 수 있다. 즉, 숙주 동물에서의 생체활성 유전자 생성물의 편재성 발현의 결과는 바람직하지 않을 수 있다. 예 를 들어, 특정 예에서, 재조합 단백질의 편재성 존재는 조류의 발육에 유해할 수 있고 새를 치사시킬 수 있다. 또한, 새의 건강에 좋지 않은 영향을 미쳐서 감소된 수준의 단백질 생성을 초래할 수 있다.
조류 알의 대략 60 중량%는 네 개의 주요 단백질 성분: 오브알부민, 오보뮤코이드, 리소자임 및 오보트랜스페린으로 구성된 알부민으로 이루어지며 오브알부민과 오보뮤코이드가 가장 많은 양으로 존재한다.
오브알부민 프로모터, 오보뮤코이드 프로모터 및 리소자임 프로모터는 과거에 유전자이식 조류의 자궁관에서 이종성 (외인성) 단백질을 생성하기 위해 성공적으로 적용되어 왔다. 참조, 예를 들어 미국특허 6,875,588 (2005년 4월 5일 등록됨); 7,176,300 (2007년 2월 13일 등록됨); 7,199,279 (2007년 4월 3일 등록됨); 및 2006년 6월 15일 공개된 미국 특허 공보 2006/0130170 (세 개의 등록된 특허 및 한 개의 공개된 특허 출원 각각의 기술은 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다)는 자궁관에서 최초로 또는 배타적으로 발현된 다양한 조류 프로모터에 의해 촉진된 조류 자궁관에서의 외인성 단백질의 생성을 기술한다. 상기 등록된 특허 및 공개된 출원에 기술된 프로모터 및 프로모터의 단편을 이용하여 조류에서의 발현 수준이 유용한 수준이 되었으나, 그 수율은 통상적으로 0.1 mg/ml의 난백 보다 훨씬 낮았다.
유전자이식 조류의 세포, 특히 유전자이식 조류의 자궁관 세포 (예컨대, 대롱샘 세포)에서 외인성 코딩 서열의 높은 수준의 발현을 제공할 시스템이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 이러한 요구 등을 충족한다. 유전자이식 조류 자궁관 조직에서 적당한 수율로 외인성 단백질을 생성한 지 수 년 후, 본 발명의 발명자들은 이러한 생성 수준이 본원에 개시된 신규한 조성물 및 방법을 적용시킴에 의해 약 10배 내지 약 100배 이상만큼 부스팅(boosted)될 수 있다는 것을 발견하였다.
일 양태에서, 본 발명은 프로모터 성분 및 SIN 벡터를 포함하는 외인성 누클레오티드 서열을 게놈에 함유하는 유전자이식 조류 (예컨대, 닭, 칠면조, 메추라기)에 관한 것이다. 통상적으로, 프로모터 성분은 조류에 외인성인 코딩 서열에 결합되고, 즉 그 코딩 서열은 조류에 보통은 또는 자연적으로 존재하지 않는다. 통상적으로, 외인성 누클레오티드 서열은 조류의 게놈으로 통합된다. 특히 유용한 일 구체예에서, 프로모터 성분은 조류의 자궁관 (예컨대, 대롱샘 세포)에서 주로 기능하거나 발현된다. 예를 들어, 프로모터 성분은 자궁관 특이적 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터 성분은 조류 오보뮤코이드 프로모터 성분, 조류 오브알부민 프로모터 성분, 조류 리소자임 프로모터 성분 및 조류 오보억제제 프로모터 성분 (즉, 콘알부민 프로모터 성분) 중 하나일 수 있다.
SIN 벡터는 조류 자궁관에서 생성되는 외인성 단백질의 품질을 증가시키는데 특히 유용한 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 이러한 효과는 SIN 벡터가 SC 네거티브 벡터 (즉, 기능성 프로모터를 지닌 선택할 수 있는 마커 카세트를 함유하지 않는 벡터)이기도 할 때 추가로 개선될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 유전자이식 조류를 제조하는 방법 및 본 발명의 유전자이식 조류를 이용하여 외인성 단백질을 생성하는 방법도 포함한다. 일 구체예에서, 유전자이식 조류는 SIN 벡터 또는 SC 네거티브 벡터 중 하나 이상의 벡터를 포함하는 누클레오티드 서열을 그 게놈에 지닌다. 통상적으로, 누클레오티드 서열은 외인성 코딩 서열에 결합된 프로모터 성분을 포함한다.
유용한 일 구체예에서, 외인성 코딩 서열은 조류의 자궁관 세포에서 발현되고 자궁관 세포로부터 분비된다. 예를 들어, 외인성 코딩 서열은 대롱샘 세포에서 발현될 수 있다. 일 구체예에서, 외인성 단백질은 유전자이식 조류가 낳은 단단한 껍질의 알에 침착된다. 일 구체예에서, 외인성 단백질은 인간 단백질이다. 일 구체예에서, 외인성 단백질은 치료용 단백질, 예컨대 시토킨이다.
일 구체예에서, 유전자이식 조류는 SC 네거티브 벡터 및 외인성 단백질을 엔코딩하는 외인성 코딩 서열에 결합된 프로모터 성분을 지니는 외인성 누클레오티드 서열을 그 게놈에 함유한다. 일 구체예에서, SC 네거티브 벡터는 또한 SIN 벡터이다.
일 양태에서, 조류 백혈증 바이러스 벡터 (ALV), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV) 및 렌티바이러스 벡터가 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
본 발명은 키메라 유전자이식 조류 및 가금류 번식 분야의 전문가가 이해하는 대로 생식세포 키메라에서 수득될 수 있는 완전한 유전자이식 생식세포 조류를 포함한다.
본 발명은 하기 서열번호 1 내지 8과 유사하거나 동일한 누클레오티드 서열 (즉, DNA 서열)을 지니는 유전자 발현 조절 영역 또는 프로모터를 포함한다. 본 발명의 특히 유용한 구체예에서, 단편은 단일 DNA 분자 상에 존재하는 5' 내지 3'의 선형 순서에서 상부에서 바닥으로 나열된다. 예를 들어, 서열 1의 3.5 kb OV 단편의 3' 말단은 5' UTR-5' 부분의 5' 말단에 공유적으로 결합되고 5' UTR-5' 부분의 3' 말단은 5' UTR-3' 부분의 5' 말단에 공유적으로 결합될 것이다. 그러나, 본 발명은 단편의 임의의 특정 순서로 제한되지 않으며 개재(intervening) 누클레오티드 서열이 단편 사이에 존재할 수 있다.
1. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터);
2. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR;
3. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터);
4. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR;
5. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR / DHS A (서열번호 22의 bp 13576 내지 15163);
6. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR / DHS A (서열번호 22의 bp 13576 내지 15163);
7. 3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
부분 3' UTR
RRE (Rev 반응 엘리먼트) 도 9a;
8. 3.5 kb OV 단편의 5'측에 삽입된 ALV CTE (도 9b)
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
부분 3' UTR.
본원에 개시된 특정 오브알부민 구성물 (예컨대, 상기 기술된 구성물 1 내지 8) 일부의 좌표(coordinate)가 하기 서열번호 22의 16051 bp 오브알부민 DNA 세그먼트에 도시된다:
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함): 시작: 도 8 (서열번호 22)의 3199 끝: 6659 ;
1.4 kb OV 단편 (DHS I & II 포함): 시작: 도 8 (서열번호 22)의 5209 끝: 6659;
3.8 kb OV 단편: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 2863 끝: 6659;
5.2 kb OV 단편: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 1463 끝: 6659;
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터): 시작: 도 8 (서열번호 22)의 6659 끝: 6705;
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터): 시작: 도 8 (서열번호 22)의 8295 끝: 8311;
3' UTR: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 13576 끝: 14209;
부분 3' UTR: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 13576 끝: 13996;
인트론 A: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 6706 끝: 8294;
인트론 E: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 10010 끝: 10968;
엑손 L: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 6659 끝: 6705;
엑손 1: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 8295 끝: 8478;
엑손 2: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 8731 끝: 8781;
엑손 3: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 9363 끝: 9491;
엑손 4: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 9892 끝: 10009;
엑손 5: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 10968 끝: 11110;
엑손 6: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 11442 끝: 11597;
엑손 7: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 13180 끝: 13575;
+1 SITE: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 6659 끝: 6659;
ATG: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 8312 끝: 8312;
폴리 A: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 14204 끝: 14209;
TATA: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 6627 끝: 6632;
DHS A: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 13858 끝: 15163;
DHS IV: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 459 끝: 859;
DHS III: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 3253 끝: 3559;
DHS II: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 5629 끝: 6009; 및
DHS I: 시작: 도 8 (서열번호 22)의 6359 끝: 6659.
프로모터 구성물은 상기 개시된 것들 (즉, 상기 1 내지 8)과 같은 본원에 개시된 프로모터 구성물 각각에 80% 동일하고, 85% 동일하고, 90% 동일하고, 91% 동일하고, 92% 동일하고, 93% 동일하고, 94% 동일하고, 95% 동일하고, 96% 동일하고, 97% 동일하고, 98% 동일하고, 99% 동일한 누클레오티드 서열을 지니는 것으로 고려된다.
본 발명은 3.5 kb OV 단편이 3.8 kb OV 단편으로 교체된 상기 프로모터 구성물 1 내지 8에 상응하는 프로모터 구성물도 고려한다. 본 발명은 3.5 kb OV 단편이 5.2 kb OV 단편으로 교체된 프로모터 구성물 1 내지 8에 상응하는 프로모터 구성물도 고려한다.
프로모터 구성물은 DHS III이 구성물로부터 생략된 상기 명시된 재조합 프로모터 (즉, 1 내지 8)의 각각에 대해 고려된다.
프로모터 구성물은 인트론 A가 인트론 E로 교체된 상기 구성물 2, 3, 5, 7 및 8의 각각에 상응하는 것으로 고려되며, 이는 외인성 단백질 생성의 증가된 수준을 초래할 수 있다. 인트론 A 및 E는 주위 DNA 영역에서 히스톤의 정렬을 유도하는 DNA 서열을 지닌다. 이러한 정렬은 OV 유전자의 전사 조절을 제공할 수 있다. 어떠한 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 매이길 원치 않으며, 인트론 E를 인트론 A로 치환시켜 인트론 E의 사용으로부터 초래된 히스톤의 우선적인 간격(spacing)을 제공할 수 있다 (즉, 인트론 A에 대한 주기성은 202 bp +/- 5 bp이고, 인트론 E는 196 bp +/- 5 bp이다). 예를 들어, 히스톤에 의한 DNA의 패키징은 DNA의 위상 변화를 초래하는데 이의 조작은 전사 조절능이 있는 단백질 (예컨대, 전사 인자)에 대해 결합 부위의 우선적인 정렬을 초래하여 개선된 수준의 전사를 이끌 수 있는 것으로 여겨진다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 벡터 구성물 및 다른 구성물 및 누클레오티드 서열 각각에 80% 동일하고, 85% 동일하고, 90% 동일하고, 91% 동일하고, 92% 동일하고, 93% 동일하고, 94% 동일하고, 95% 동일하고, 96% 동일하고, 97% 동일하고, 98% 동일하고, 99% 동일한 누클레오티드 서열을 지니는 본원에 개시된 벡터 구성물 및 다른 구성물 및 누클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 개시된 특징들의 임의의 유용한 조합은 임의의 그러한 조합에 포함된 특징들이 문맥, 본 명세서 및 당업자의 지식으로부터 자명할 상호간에 모순됨이 없다면 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 추가의 목적 및 양태가 하기 간단하게 설명되는 첨부된 도면과 함께 하기 개시된 상세한 설명의 검토시에 더욱 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B 벡터의 원형 맵을 도시한다. pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B의 서열은 서열번호 1에 도시된다.
도 2는 유전자이식 메추라기의 난백에서 IFNa의 발현 수준을 도시하는 막대 그래프이다. GO 메추라기는 pALV-SIN-4.0-Lys-IFNa-2B 레트로바이러스 벡터 형질도입 입자를 일본 메추라기 배아에 주사함에 의해 생성되었다.
도 3은 pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv 벡터의 원형 맵을 도시한다. pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv의 누클레오티드 서열은 서열번호 19에 도시된다.
도 4는 pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc 벡터의 원형 맵을 도시한다. pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc의 누클레오티드 서열은 서열번호 20에 도시된다.
도 5는 pBS-OM-4.4 벡터의 원형 맵을 도시한다. pBS-OM-4.4의 누클레오티드 서열은 서열번호 23에 도시된다.
도 6은 pAVIJCR-A137.91.1.2 벡터의 원형 맵을 도시한다. pAVIJCR-A137.91.1.2의 누클레오티드 서열은 서열번호 24에 도시된다.
도 7은 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B 플라스미드 벡터의 원형 맵을 도시한다. pSIN-1.8-OM-IFNa-2B의 누클레오티드 서열은 서열번호 21에 도시된다.
도 8a-e (서열번호 22)는 닭 오브알부민 유전자의 세그먼트를 도시한다.
도 9a (서열번호 25)는 렌티 바이러스의 RRE (rev 반응성 엘리먼트) 서열을 도시한다. 도 9b (서열번호 26)는 ALV CTE (항시적 운반 엘리먼트) 서열을 도시한다.
도 10a는 SIN 벡터를 제조하기 위해 예시적인 레트로바이러스 LTR (ALV)로부터 결실된 세그먼트의 다이아그램을 도시한다. 도 10b (서열번호 29)는 10a에 도시된 LTR의 서열을 도시한다. 밑줄로 표시된 서열이 결실된 서열이다.
상세한 설명
정의
"동물"이라는 용어는 조류를 포함하는 모든 척추동물을 포함하기 위해 본원에서 사용되며 인간을 포함할 수 있다. 이는 배아 및 태아 단계를 포함하는 모든 발육 단계의 개개 동물도 포함한다.
본원에서 사용된 "항체"라는 용어는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 이의 기능성 단편을 언급한다. 항체는 에피토프에 특이적으로 결합되는 능력을 보유하는 개질되거나 유도체화된 항체 변이체를 포함한다. 항체는 표적 항원 또는 에피토프에 선택적으로 결합될 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAbs), 인간화된 및 다른 키메라 항체, 단쇄 항체 (scFvs), Fab 단편, F(ab')2 단편 및 이황화-결합된 Fvs (sdFv) 단편을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 "조류"라는 용어는 분류학적 클래스 아바(ava)의 유기체의 임의의 종, 아종 또는 계통을 언급하며, 예컨대 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 피리새, 매, 까마귀, 및 타조, 에뮤 및 화식조를 포함하는 주금류와 같은 유기체이나 이로 제한되지 않는다. 이 용어는 다양한 공지된 계통의 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 또는 닭 (예를 들어, 화이트 레그혼, 브라운 레그혼, 바드-락, 서섹스, 뉴 햄프셔, 로드 아일랜드, 어스트랄로프, 미노르카, 암록스, 캘리포니아 그레이, 이탈리안 파트리지-컬러드) 뿐만 아니라 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 시판용 양으로 보통 번식되는 기타 가금류의 계통을 포함한다.
레트로바이러스 벡터는 특정 레트로바이러스에 기초하거나 이로부터 유래되거나 특정 레트로바이러스의 누클레오티드 서열에 기초한다에서 "기초한다" 또는 "유래된다"라는 표현은 레트로바이러스 벡터의 게놈이 특정 레트로바이러스 게놈의 누클레오티드 서열의 실질적인 부분을 함유함을 의미한다. 실질적인 부분은 gag, pol 및/또는 env 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열과 같은 특정 유전자 또는 누클레오티드 서열 또는 LTR을 엔코딩하는 서열과 같은 바이러스 게놈의 다른 구조적 또는 기능적 누클레오티드 서열일 수 있거나 실질적으로 완전한 레트로바이러스 게놈, 예를 들어 레트로바이러스 게놈의 대부분 (예컨대, 60% 초과 또는 70% 초과 또는 80% 초과 또는 90% 초과) 또는 전부일 수 있고, 이는 당업자의 지식에 따라 본 명세서의 문맥으로부터 자명할 것이다. 레트로바이러스에 기초하거나 이로부터 유래된 레트로바이러스 벡터의 예는 문헌[Cosset et al, Journal of Virology (1991) vol 65, p 3388-3394]에 개시된 ALV 레트로바이러스에 기초한 NL 레트로바이러스 벡터 (예컨대, NLB)이다.
본원에서 사용된 "코딩 서열" 및 "코딩 영역"이라는 용어는 RNA, 단백질, 또는 RNA 또는 단백질의 임의의 부분을 합성하기 위한 유전자 정보를 엔코딩하는, RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 누클레오티드 서열 및 핵산 서열을 언급한다. 특정 유기체 게놈의 천연 부분이 아닌 누클레오티드 서열을 "외래 누클레오티드 서열", "이종성 누클레오티드 서열" 또는 "외인성 누클레오티드 서열"이라고 언급한다. "이종성 단백질"은 외래, 이종성 또는 외인성 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 단백질이므로, 종종 세포에서 자연적으로 발현되지 않는다. 단리된 다음 동일한 유형의 (예컨대, 동일한 종) 유기체로 재도입된 누클레오티드 서열은 특정 유기체 게놈의 천연 발생 부분으로서 고려되지 않으므로 외인성 또는 이종성으로 간주된다.
본원에서 사용된 "구성물"이라는 용어는 천연 공급원으로부터 단리된 누클레오티드 서열의 하나를 초과하는 세그먼트로부터 어셈블링되었거나 화학적으로 합성된 DNA와 같은 선형 또는 원형 누클레오티드 서열 또는 이의 조합물을 언급한다.
본원에서 사용된 "상보적"이라는 용어는 서로 특수한 상호작용을 형성할 수 있는 두 핵산 분자를 언급한다. 특정 상호작용에서, 두 개의 핵산 가닥이 반대되는 극성에 있을 때 한 가닥의 핵산 내에 있는 아데닌 염기는 두 번째 핵산 가닥 내에 있는 티민과 2개의 수소 결합을 형성할 수 있다. 또한 특정 상호작용에서, 두 개의 핵산 가닥이 반대되는 극성에 있을 때 한 가닥의 핵산 내에 있는 구아닌 염기는 두 번째 핵산 가닥 내에 있는 시토신과 세 개의 수소 결합을 형성할 수 있다. 본원에 언급된 상보적인 핵산은 개질된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 개질된 아데닌은 티민 또는 개질된 티민과 수소 결합을 형성할 수 있고, 개질된 시토신은 구아닌 또는 개질된 구아닌과 수소 결합을 형성할 수 있다.
본원에서 사용된 "시토킨"이라는 용어는 세포의 기능에 영향을 미치는 분비된 임의의 아미노산 서열을 언급하며, 이는 면역, 염증 또는 조혈 반응에서 세포간에 상호작용을 조정하는 분자이다. 시토킨은 세포가 이들을 생성하는지와 무관하게 모노킨 및 림포킨을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노킨은 일반적으로 매크로파지 및/또는 단핵구와 같은 단핵 세포에 의해 생성되고 분비되는 것으로 언급된다. 그러나, 많은 다른 세포도 천연 킬러 세포, 섬유모세포, 호염기구, 호중구, 내피 세포, 뇌 별아교세포, 골수 기질 세포, 표피 각질세포 및 B-림프구와 같은 모노킨을 생성한다. 림포킨은 일반적으로 림프구 세포에 의해 생성되는 것으로 언급된다. 시토킨의 예로는 인터류킨-1 (IL-I), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-8 (IL-8), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파) 및 종양 괴사 인자 베타 (TNF-베타)가 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 "발현된" 또는 "발현"이라는 용어는 유전자로부터의 전사가 유전자의 두 핵산 가닥 중 하나의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 RNA 핵산 분자를 제공하는 것을 언급한다. 본원에서 사용된 "발현된" 또는 "발현"이라는 용어는 RNA를 번역시켜 단백질 또는 펩티드를 제공하는 것도 언급할 수 있다.
본원에서 사용된 "발현 벡터"라는 용어는 유전자 발현 조절 영역, 예컨대 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 또는 프로모터 성분을 포함하는 핵산 벡터를 언급한다.
본원에서 사용된 "단편"이라는 용어는 인위적으로 (예컨대, 화학적 합성에 의해) 또는 천연 생성물을 제한 엔도누클레아제 또는 기계적 전단변형(shearing)을 이용하여 다수의 조각들로 절단함에 의해 또는, 예를 들어 PCR 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 중합화 기술에 의해 효소적으로 구성되거나 당업자에게 공지된 재조합 핵산 기술에 의해 숙주 세포에서 발현된 핵산의, 예를 들어 적어도 약 10, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000, 2000, 5000, 6,000, 8,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000 또는 60,000개 길이의 누클레오티드 부분을 언급할 수 있다. 본원에서 사용된 "단편"이라는 용어는 아미노산 서열의, 예를 들어 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 1000, 2000, 5000, 6,000, 8,000 또는 10,000개 아미노산 부분을 언급할 수 있고, 이 부분은 하나 이상의 프로테아제에 의해 단백분해 절단에 의해 천연 발생 아미노산 서열로부터 절단되거나 화학적 방법 또는 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술 (예컨대, 천연 발생 아미노산 서열을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 부분으로부터 발현됨)을 이용하여 합성된 천연 발생 아미노산 서열의 부분이다. "단편"은 특정 누클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의, 예를 들어 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%의 부분도 언급할 수 있다.
"기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 상호교환적으로 사용되며 본원에서 사용된 대로 전체의 기능을 전부 또는 부분적으로 수행할 수 있는 전체의 일부 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 분자의 생물학적으로 기능성인 부분은 전체 또는 완전한 분자의 생물학적 기능을 수행하는 분자의 부분을 의미한다. 예를 들어, 유전자 발현 조절 영역의 기능성 부분은 생물학적 시스템 (예컨대, 프로모터)에서 유전자 발현을 전부 또는 부분적으로 조절하거나 제어하는 (예컨대, 전부 또는 부분적으로 촉진시킨다) 특정 유전자 발현 조절 영역의 단편 또는 부분이다. 기능성 부분은 임의의 유용한 크기일 수 있다. 예를 들어, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 20개 염기부터 특정 서열의 전체 길이로부터 하나의 누클레오티드를 뺀 것과 같은 길이의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 50개 염기부터 특정 서열의 전체 길이로부터 하나의 누클레오티드를 뺀 것과 같은 길이의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 50개 염기부터 약 20 kb의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 500개 염기부터 약 20 kb의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 1 kb부터 약 20 kb의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 0.1 kb부터 약 10 kb의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 단편의 크기는 그 길이가 약 20 kb부터 약 10 kb의 범위일 수 있다.
본원에서 사용된 "유전자 발현 조절 영역"이라는 용어는 코딩 서열에 결합되어 코딩 서열의 발현을 전부 또는 부분적으로 조절하는, 예를 들어 코딩 서열의 전사를 전부 또는 부분적으로 조절하는 누클레오티드 서열을 언급한다. 유전자 발현 조절 영역은 천연 발생 공급원으로부터 단리될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있고 핵산 벡터에 도입되어 적합한 세포에서 조절된 전사를 가능하게 할 수 있다. "유전자 발현 조절 영역"은 mRNA로 전사될 수 있는 코딩 서열 말단의 5'측 영역에 있는 핵산 서열의 영역에 선행될 수 있으나 선행으로 제한되는 것은 아니다.
"이종성", "외인성" 및 "외래"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 특정 유기체 또는 특정 세포, 조직 또는 유기체에 함유되거나 유기체에 의해 생성된 다른 성분에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 또는 단백질과 같은 생체분자를 언급한다. 예를 들어, 알에 이종성 또는 외인성인 단백질은 알에서 천연적으로 발견되지 않는 단백질이다. DNA 및 RNA와 같은 핵산과 관련하여 본원에서 사용된 "이종성", "외인성" 및 "외래"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 이것이 자연에서 발생하는 위치(들) 및/또는 양과 상이한 위치(들) 및/또는 양으로 발견되거나 이것이 존재하는 염색체, 게놈 또는 세포의 일부로서 천연적으로 발생하지 않는 핵산을 언급한다. 이것은 게놈, 염색체 또는 세포에 내인성이 아닌 핵산일 수 있고 게놈, 염색체 또는 세포로 외생적으로 도입되었다. 이종성 DNA의 예로는 유전자 발현 조절 영역을 포함하는 DNA 및 생성물 또는 생성물들, 예를 들어 RNA 또는 단백질 생성물을 엔코딩하는 핵산이 있으나 이로 제한되지 않는다. 이종성 DNA의 예로는 조류로부터 일단 단리된 이후, 예컨대 조류 게놈으로의 재-도입 후 사용되는 본원에 개시된 프로모터 또는 유전자 발현 조절 영역이 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 "단리된 핵산"이라는 용어는, 예를 들어 (a) 천연 발생 게놈 분자 일부의 서열을 지니나 천연 발생된 종의 게놈에서 분자의 그 일부를 플랭킹하는 서열 중 적어도 하나에 의해 플랭킹되지 않는 DNA; (b) 생성된 벡터 또는 게놈 DNA가 핵산이 수득된 천연 발생 DNA와 동일하지 않도록 하는 방식으로 벡터나 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 포함된 핵산; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR) 또는 화학적 합성에 의해 생성된 단편, 또는 제한 단편과 같은 분리된 분자; (d) 하이브리드 유전자, 즉 융합 단백질을 엔코딩하는 유전자의 일부인 재조합 누클레오티드 서열, 및 (e) 천연 발생되지 않은 하이브리드 서열의 일부인 재조합 누클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 단리된 핵산 분자는, 예를 들어 천연 대립유전자 변이체 뿐만 아니라 누클레오티드 결실, 삽입, 자리바꿈 또는 치환에 의해 개질된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는 누클레오티드 및 누클레오시드, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, mRNA, tRNA, 올리고누클레오티드, 올리고누클레오시드 및 이들의 유도체의 임의의 선형 또는 일련의 어레이를 언급한다. 논의를 용이하게 하기 위해, 비천연 발생 핵산은 본원에서 구성물로서 언급될 수 있다. 핵산은 발현, 클로닝, 코스미드 및 형질전환 벡터, 예컨대 동물 바이러스 벡터, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니나 개질된 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 폴리오 바이러스, 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 예컨대 조류 백혈증 바이러스 (ALV) 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터 등 및 이들의 단편을 포함하는 세균 플라스미드 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 핵산은 조류 백혈증 바이러스 (ALV) 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터 및 이들의 단편의 LTR일 수 있다. 핵산은 NLB, NLD 및 NLA 및 이들의 단편과 같은 NL 벡터 및 화학적으로 합성된 DNA 또는 RNA와 같은 합성 올리고누클레오티드도 포함할 수 있다. 핵산은 개질되거니 유도체화된 누클레오티드 및 누클레오시드, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니라 할로겐화된 누클레오티드, 예컨대 유일하지 않으나 5-브로모우라실, 및 유도체화된 누클레오티드, 예컨대 비오틴-표지된 누클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "벡터" 및 "핵산 벡터"라는 용어는 세포로 트랜스펙션되거나 형질전환되고 숙주 세포 게놈과 별개로 또는 숙주 세포 게놈 내에서 복제될 수 있는 천연 또는 합성의 단일 또는 이중 가닥 플라스미드 또는 바이러스 핵산 분자를 언급한다. 원형 이중 가닥 벡터는 벡터의 누클레오티드 서열에 기초한 적합한 제한 효소로의 처리에 의해 선형화될 수 있다. 핵산은 벡터를 제한 효소로 절단하고 요망되는 조각들을 함께 라이게이션시킴에 의해 벡터로 삽입될 수 있다.
"작동가능하게 결합된"이라는 용어는 이렇게 개시된 성분들이 이들의 유용한 기능을 수행할 수 있도록 배열되는 엘리먼트의 정렬을 언급한다. 코딩 서열에 작동가능하게 결합된 유전자 발현 조절 영역 또는 프로모터 (예컨대, 프로모터 성분)는 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 조절 서열은 이들이 발현을 명령하도록 기능하는 한 코딩 서열에 연속될 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 아직 번역되지 않은 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 결합된" 것으로 고려될 수 있다.
본원에서 사용된 "자궁관 특이적 프로모터"라는 용어는 기능성인, 즉 코딩 서열의 전사를 큰 한도로, 예를 들어 새의 자궁관 세포에서 주로 (즉, 특정 프로모터 유형에 의해 동물에서 생성된 전사 생성물의 50% 초과가 자궁관 세포에서 생성됨) 또는 배타적으로 제공하는 프로모터 및 프로모터 성분을 언급한다. 자궁관 특이적 프로모터의 예로는 오브알부민 프로모터, 오보뮤코이드 프로모터, 오보억제제 프로모터, 리소자임 프로모터 및 오보트랜스페린 프로모터 및 이들 프로모터의 기능성 부분들, 예컨대 프로모터 성분이 있다.
사용된 "서열 동일성 퍼센트", "동일성 퍼센트", 예를 들어 "% 동일한" 및 "서열 상동성 퍼센트", "상동성 퍼센트", 예를 들어 "상동성 %" 및 "서열 유사성 퍼센트"라는 용어 각각은 문헌[Karlin & Attschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264-2268, modified as in Karlin & Attschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-5877]의 알고리듬을 이용하여 결정된 두 핵산 서열 또는 두 아미노산 서열간 서열 매칭 정도를 언급한다. 이러한 알고리듬은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (Attschul et al. (1990) T. Mol. Biol. Q15: 403-410)에 포함된다. BLAST 누클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드길이 = 12로 수행하여 본 발명의 핵산 분자와 상동인 누클레오티드 서열을 수득하였다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 수행하여 기준 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열을 수득하였다. 비교 목적으로 이격된(gapped) 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST를 문헌[Attschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402]에 개시된 대로 이용하였다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 개개 프로그램의 디폴트 파라미터 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)를 이용한다. 다른 알고리듬, 프로그램 및 디폴트 세팅도 적합하며, 예컨대 누클레오티드 또는 아미노산 서열 비교를 위한 프로그램을 포함하는 유.케이. 휴먼 게놈 맵핑 프로젝트 리소스 센터 (U.K. Human Genome Mapping Project Resource Centre)의 GCG-서열 분석 패키지가 있으나, 이것이 유일한 것은 아니다.
"폴리누클레오티드", "올리고누클레오티드", "누클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 코딩 서열, 즉 적합한 조절 또는 제어 서열의 조절하에 놓일 때 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사 및 번역되는 폴리누클레오티드(들) 또는 핵산 서열(들); 조절 서열, 예컨대 번역 개시 및 스톱 코돈, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 시그널, 전사 인자 결합 부위, 전사 종료 서열, 업스트림 및 다운스트림 조절 도메인, 인핸서, 사일런서(silencer), 전사 인자(들)이 결합되어 유전자 프로모터의 활성을 포지티브 (유도) 또는 네거티브 (억제)하게 변경시키는 DNA 서열 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 길이나 합성 기원에 대한 어떠한 제한도 본원에 개시된 용어에 의해 제안되지 않는다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 펩티드 결합을 통해 결합된 연속의 어레이에서 세 개 이상의 아미노산의 아미노산 중합체를 언급한다. "폴리펩티드"라는 용어는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩티드 등을 포함한다. "폴리펩티드"라는 용어는 재조합 기술을 통해 생성되거나 (예컨대, 유전자이식 새로부터 단리됨) 합성된, 핵산에 의해 엔코딩되는 상기 정의된 폴리펩티드를 포함한다. "폴리펩티드"라는 용어는 화학적으로 개질된 아미노산 또는 표지화 리간드에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 아미노산을 포함하는 상기 정의된 폴리펩티드를 추가로 고려한다.
본원에서 사용된 "프로모터"라는 용어는 조류 세포에서 RNA 중합효소에 의한 전사 개시를 시작하는데 유용한 DNA 서열을 언급한다. "프로모터 성분"은 스스로 또는 다른 DNA 서열과 조합하여 전사를 일으키거나 촉진시킬 수 있는 DNA 서열이다. 오브알부민 프로모터 성분, 오보뮤코이드 프로모터 성분 및 리소자임 프로모터 성분 및 본원에 개시되고 청구된 기타 프로모터 및 프로모터 성분들과 같은 특정 프로모터 서열이 특수한 프로모터 서열을 나타내는 것은 아니다. 오히려, 이들은 코딩 서열의 전사를 수행하고 촉진시키기에 유용한 개개 프로모터의 임의의 서열 또는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, 오보뮤코이드 프로모터 성분은 제한 없이 2007년 5월 17일 공개된 미국 공보 11/649,543호 (그 전체가 본원에 참조로서 포함된다)에 개시된 약 1.8 kb, 약 3.9 kb 및 약 10 kb의 오보뮤코이드 프로모터를 포함한다. "프로모터 성분"은 RNA 전사를 개시하도록 하는 재정렬된 유전자 발현 조절 영역 및 RNA 전사를 개시하도록 하는 천연 발생 DNA 서열 및/또는 합성 DNA 서열로 구성된 하이브리드 DNA 분자도 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "재조합 핵산" 및 "재조합 DNA"라는 용어는 진핵세포 또는 원핵세포에서 천연으로 발견되지 않는 2개 이상의 핵산 서열의 조합을 언급한다. 핵산 서열은 핵산 벡터, 유전자 발현 조절 엘리먼트, 복제 기점, 발현시 항생제 내성을 제공하는 적합한 유전자 서열, 단백질-엔코딩 서열 등을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함하며 이것이 이들의 위치, 순도 또는 구조에 있어서 천연 발생 폴리펩티드와 별개가 되도록 한다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리펩티드는 자연에서 정상적으로 관찰되는 것과 상이한 양으로 세포에 존재할 것이다.
본원에서 사용된 "조절 서열"이라는 용어는 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터, 인핸서 및 다른 엘리먼트를 포함한다.
"SC 네거티브 벡터"는 기능성 프로모터를 지니는 선택가능하거나 스크리닝될 수 있는 카세트 마커를 함유하지 않는 벡터이다. 프로모터는 전부 또는 부분적으로 결실될 수 있거나 누클레오티드 서열 삽입에 의해 불활성화될 수 있다. 스크리닝될 수 있는 카세트로는 네오마이신 내성과 같은 항생제 내성 마커에 대한 DNA 서열 및 GFP 또는 lacZ와 같은 다른 선택가능한 마커에 대한 DNA 서열이 있으나 이로 제한되지 않는다.
"SIN 벡터"는 자가-불활성화 벡터이다. 구체적으로, SIN 벡터는 표적 세포 (예컨대, 조류 배아 세포)의 게놈 DNA로의 통합시에 통합된 레트로바이러스 벡터의 5' LTR이 프로모터로서 기능하지 않도록 하는 변경된 게놈을 지니는 레트로바이러스 벡터이다. 예를 들어, 일단 통합되면 레트로바이러스 벡터의 5' LTR의 U3 영역을 초래하는 레트로바이러스 벡터의 누클레오티드 서열의 일부 또는 전부를 결실시키거나 변경시켜 5' LTR의 프로모터 활성을 감소시키거나 제거시킬 수 있다. 특정 예에서, 5' LTR의 U3으로부터의 CAAT box 및/또는 TAATA box의 결실은 당 분야에서 이해되는 대로 SIN 벡터를 초래할 수 있다.
"SIN/SC 네거티브 벡터"는 SIN 벡터이고 SC 네거티브 벡터이기도 한 벡터, 즉 레트로바이러스 벡터이다.
본원에서 사용된 "센스 가닥"이라는 용어는 RNA로 전사되고 유전자의 천연 폴리펩티드 생성물로 번역될 수 있는 게놈 DNA로부터의 단일 가닥 DNA 분자를 언급한다. 본원에서 사용된 "안티센스 가닥"이라는 용어는 유전자의 센스 가닥과 상보적인 게놈 DNA의 단일 가닥 DNA 분자를 언급한다.
"치료용 단백질" 또는 "약학적 단백질"은 약물의 전부 또는 일부를 구성하는 물질이다. 특히, "치료용 단백질" 및 "약학적 단백질"은 약물의 전부 또는 일부를 구성하는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 "전사 조절 서열" 및 "유전자 발현 조절 영역" 및 "프로모터 성분"이라는 용어는 핵산 서열과 결합되어 코딩 서열의 전사 발현을 조절하는 누클레오티드 서열을 언급한다. 예시적인 전사 조절 서열로는 인핸서 엘리먼트, 호르몬 반응 엘리먼트, 스테로이드 반응 엘리먼트, 네거티브 조절 엘리먼트 등이 있다. "전사 조절 서열"은 단리되고 벡터 핵산으로 혼입되어 벡터 DNA 일부의 적합한 세포에서 조절된 전사를 가능하게 할 수 있다. "전사 조절 서열"은 mRNA로 전사될 수 있는 단백질 코딩 서열 말단의 5'측 영역에 있는 핵산 서열 영역에 선행될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 전사 조절 서열은 유전자의 영역에서 "인트론" 영역으로서 동정되는 단백질 코딩 서열 내에도 위치할 수 있거나 핵산 영역에 있는 핵산 서열의 영역에 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 "형질전환" 및 "트랜스펙션"이라는 용어는 핵산을 숙주로 삽입하는 과정을 언급한다. 원핵생물 또는 진핵생물 유기체로의 핵산의 형질전환 또는 트랜스펙션을 촉진시키는 다수의 기술이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 세포를 고 농도의 염, 예컨대 유일한 것은 아니나 칼슘 또는 마그네슘 염, 전기장, 세척제, 또는 리포솜 매개된 트랜스펙션으로 처리하여 숙주 세포가 핵산 분자의 흡수에 대해 반응력이 있도록 하는 다양한 기술을 포함한다.
본원에서 사용된 "유전자이식 동물"은 인간이 아닌 임의의 동물, 예컨대 닭을 포함하는 조류 종이고, 여기서 조류 세포의 하나 이상은 인간 개재 방식, 예컨대 본원에 개시된 것들을 포함하는 당 분야에 공지된 유전자이식 기술에 의해 도입된 이종성 핵산을 함유할 수 있다 (참조, 예를 들어 2007년 10월 18일 공개된 미국 특허 공보 2007/0243165호, 이의 전체가 본원에 참조로서 포함된다). 핵산은 계획적인 유전자 조작의 방식으로, 예컨대 미세주사 또는 재조합 바이러스로의 감염에 의해 세포의 전구체로 도입됨으로써 직접 또는 간접적으로 동물에게 도입된다. 유전자 조작이라는 용어는 전통적인 교차-번식 또는 시험관내 수정을 포함하지 않으며, 오히려 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체 내에 통합될 수 있거나, 염색체외 복제용 DNA일 수 있다. 통상적인 유전자이식 동물에서, 이식유전자는 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 재조합 형태를 발현시키는 세포를 야기할 수 있다. "키메라 동물" 또는 "모자이크 동물"이라는 용어는 본원에서 이식유전자가 발견되거나 재조합 누클레오티드 서열이 동물의 모든 세포가 아닌 일부에서 발현되는 동물을 언급한다. 생식세포-라인 키메라 동물은 그 생식세포에 이식유전자를 함유하여 자손 동물의 대부분 또는 모든 세포가 이식유전자를 함유할 유전자이식 동물을 발생시킬 수 있다.
본원에서 사용된 "이식유전자"라는 용어는 유전자이식 동물 또는 이것이 도입된 세포에 대해 부분적으로 또는 완전히 이종성, 즉 외래이거나, 유전자이식 동물의 내인성 유전자 또는 이것이 도입된 세포에 동종이나 이것이 삽입된 (예컨대, 이것은 천연 유전자와 상이한 위치에 삽입되거나 이의 삽입이 녹아웃을 초래한다) 세포의 게놈을 변경시키는 방식으로 동물의 게놈에 삽입되도록 고안되거나 삽입된 핵산 서열 (엔코딩, 예를 들어 인간 단백질)을 의미한다. 본 발명에 따른 이식유전자는 조류에서 (예컨대, 조류 자궁관에서) 외인성 단백질 생성에 유용한 서열을 함유하는 본 발명의 벡터 (예컨대, SIN 벡터)를 함유할 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질을 단리시키고 특성규명하는데 유용한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고 표준 분자 생물학 및 생화학 매뉴얼이 과도한 실험 없이 사용할 적합한 프로토콜을 선택하는데 참고가 될 수 있다. 참조, 예를 들어 문헌[Sambrook et al, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor, 이의 내용이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다].
약어:
본원에 사용된 약어는 하기를 포함할 수 있다: aa, 아미노산(들); bp, 염기쌍(들); cDNA, RNA에 상보적인 DNA; nt, 누클레오티드(들); kb, 1000개 염기쌍; ㎍, 마이크로그램; ml, 밀리리터; ng, 나노그램.
설명:
본 발명에서 고안되고 사용된 SIN 벡터는 유전자이식 조류에 적용된 관심있는 프로모터의 프로모터 간섭을 감소시키거나 제거할 수 있다. 특히 유용한 구체예에서, 관심있는 프로모터 (즉, 프로모터 성분)는 우선적으로 자궁관 세포 또는 자궁관 조직에서 이들의 유전자 생성물을 우선적으로 발현시키며, 예컨대 자궁관 특이적 프로모터이다. 이러한 프로모터 (예컨대, 프로모터 성분)의 예로는 오브알부민, 리소자임, 콘알부민 (즉, 오보트랜스페린), 오보뮤코이드, 오보뮤신 및/또는 오보억제제 유전자 발현 조절 영역 또는 프로모터 영역의 기능성 부분이 있으나 이로 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 관심있는 프로모터는 하나 이상의 프로모터의 조합물 또는 융합체 또는 오브알부민, 리소자임, 콘알부민 (즉, 오보트랜스페린), 오보뮤코이드, 오보뮤신 및/또는 오보억제제 유전자 발현 조절 영역 또는 프로모터 단편, 예컨대 바이러스 프로모터 (예컨대, LTR 프로모터)와 같은 하나 이상의 프로모터의 단편의 융합체이다.
SIN 벡터는 자궁관 특이적 프로모터에 특히 유용한 것으로 나타났다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 제한되길 원치 않으며, 자궁관 특이적 프로모터는 레트로바이러스 LTR 프로모터의 영향을 특히 받기 쉬울 수 있다고 여겨진다. 결과적으로, SIN 벡터는 조류 자궁관 특이적 프로모터와 함께 이용시에 특히 유용하다.
특히 유용한 일 구체예에서, 본 발명의 자궁관 특이적 프로모터에 작동가능하게 결합된 코딩 서열의 전사를 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 방해 프로모터 (예컨대, LTR 프로모터)가, 예를 들어 방해 프로모터 서열 전부 또는 일부의 결실, 삽입 또는 자리바꿈에 의해 불활성화된 SIN 벡터가 생성된다. 예를 들어, 도 1에 도시된 벡터 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B, 3' RAV2 LTR은 인핸서에 결실을 지녀서 당 분야에서 이해되는 대로 레트로바이러스 영역이 통합될 때 5' LTR이 불활성화되도록 한다. LTR 결실의 상세한 도식에 대해서는 도 10을 참조한다.
본 발명의 유용한 일 구체예에서, SIN/SC 네거티브 벡터를 생성하는 SC 네거티브 벡터이기도 한 SIN 벡터가 적용된다. SC 네거티브 벡터 및 SIN 벡터의 조합은 SIN 벡터이거나 SC 네거티브 벡터이기만 한 벡터에 비해 프로모터 방해의 정도가 실질적으로 감소된 벡터를 초래할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B 및 다른 SIN 벡터도 SC 네거티브 벡터 및 SIN 벡터 둘 모두가 되도록 항생제 내성 마커가 결여되어 있다.
SIN 벡터, SC 네거티브 벡터 및 SIN/SC 네거티브 벡터는 생식세포 키메라를 포함하는 키메라를 생성하기 위한 닭, 메추라기 및 칠면조와 같은 임의의 유용한 조류 및 당업자에게 공지된 것들과 같은 번식 기술을 이용하여 생성된 자손 새에서 본 발명에 따라 사용이 고려된다. 또한, SC 네거티브 레트로바이러스 벡터 (비-SIN 벡터임)도 SC 네거티브 벡터가 아닌 본질적으로 동일한 레트로바이러스 벡터로 생성된 유전자이식 조류에 비해 유전자이식 조류에서 생성된 외인성 단백질의 양을 향상시키거나 증가시킬 것으로 고려된다.
본 발명을 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘으로 제한시키길 원하지 않으며, 선택가능한 마커 카세트의 결핍은 인핸서와 같은 프로모터 엘리먼트의 존재를 감소시키는 것으로 여겨지며, 만약 그렇지 않으면 인핸서는 조류 자궁관 세포 (예컨대, 자궁관 특이적 프로모터)에서 외인성 단백질 생성을 위해 적용된 프로모터에 시스(in cis)이며 이에 근접할 것이다. 이러한 근접성은 관심있는 프로모터, 즉 외인성 단백질 생성을 위해 적용된 프로모터를 지니는 마커 유전자의 전사조절 엘리먼트에 의해 방해될 수 있다. 그러나, 본 발명은 마커 유전자 코딩 서열, 예를 들어, 제한 없이 네오마이신 내성 코딩 서열 및 베타 락타마아제 코딩 서열이 조류 자궁관 세포에서 외인성 단백질 생성을 위해 적용된 프로모터 (즉, 첫 번째 프로모터)를 방해하지 않는 프로모터 (즉, 두 번째 프로모터)에 작동가능하게 결합될 수 있다고 고려한다. 예를 들어, 마커 프로모터 및 관심있는 프로모터가 동일하거나 유사한 프로모터인 경우, 선택가능한 카세트에 의한 방해는 최소화되거나 제거될 것으로 고려된다. 예를 들어, 마커 유전자 코딩 서열에 작동가능하게 결합된 두 번째 오브알부민 프로모터는 조류 자궁관 세포에서 외인성 단백질 생성을 위해 적용된 첫 번째 오브알부민 프로모터를 방해하지 않을 수 있다.
본 발명은 조류에서 외인성 단백질 발현을 위한 본 발명의 벡터에서, 임의의 유용한 자궁관 특이적 프로모터, 및 자궁관 특이적 프로모터 단편의 적용을 고려한다. 예를 들어, 2005년 1월 31일 출원된 미국 특허 공보 2005/0176047호 (이의 기술이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다) 및 2007년 1월 26일 출원된 미국 특허 공부 2007/0124829호 (이의 기술이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다) 및 2003년 12월 11일 출원된 미국 특허 공보 2006/0130170호 (이의 기술이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다)에 개시된 프로모터 및 프로모터의 유용한 (예컨대, 기능성인) 단편 (예컨대, 프로모터 성분)이 본 발명에 따라 SIN 벡터 및 SC 네거티브 벡터 및 SIN/SC 네거티브 벡터와 함께 사용되도록 고려된다.
본 발명은 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스-육종 바이러스 (RSV) 프로모터, β-액틴 프로모터 (예컨대, 닭 β-액틴 프로모터), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터와 같은 본 발명에 따라 관심있는 프로모터로서 사용되는 기타 프로모터 및 전사적으로 기능성인 이의 부분 (예컨대, 프로모터 성분)도 고려한다.
본 발명은 또한 유전자이식 조류에서 외인성 단백질을 생성하는데 사용이 고려되는 다양한 오브알부민 프로모터 성분을 포함한다. 본원에 개시된 각각의 프로모터는 본 발명에 따라 벡터에 사용되도록 고려된다.
재조합 오브알부민 DNA를 함유하는 본 발명의 벡터의 예가 하기에 제시된다. 단편은 5'에서 3'의 선형 순서로 상부에서 바닥으로 나열되며, 여기서 이들은 단일 DNA 분자 상에 존재한다. 예를 들어, 서열 1의 3.5 kb OV 단편의 3' 말단은 5' UTR-5' 부분의 5' 말단에 공유적으로 결합되고 5' UTR-5' 부분의 3' 말단은 5' UTR-3' 부분의 5' 말단에 공유적으로 결합될 것이다.
1. pSIN - OV -3.5- CSI
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
2. pSIN - OV -3.5- Int - CSI - inv
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR
3. pSIN - OV -3.5- Int - CSI
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
4. pSIN - OV -3.5- CSI - UTR - inv
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR
5. pSIN - OV -3.5- Int - CSI - LUTR - inv
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR / DHS A (도 8의 13576 내지 15163);
6. pSIN - OV -3.5- CSI - LUTR - inv
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
3' UTR / DHS A (도 8의 bp 13576 내지 15163);
7. pSIN - OV -3.5- Int - CSI - RRE
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
부분 3' UTR
RRE (Rev 반응 엘리먼트) 도 9a
구성물 7은 RRE가 스플라이싱되지 않은 RNA 게놈을 세포질로 운반할 수 있게 하여 완전한 레트로바이러스 RNA의 패키징을 개선시킬 수 있다. RRE는 Rev 단백질의 존재하에서만 활성이다. Rev 활성은 레트로바이러스 성분의 일시적인 트랜스펙션 동안에 당 분야에 널리 공지되어 있고 시판되는 (예컨대, Invitrogen, Inc.), Rev를 엔코딩하는 DNA, Rev를 엔코딩하는 RNA, 및/또는 Rev 단백질의 형태로 제공된다. 따라서, 인트론은 바이러스 입자에 의해 생성된 유전자이식 새의 게놈에 함유된 이식유전자로 존재할 것이다 (rev 단백질은 유전자이식 새의 세포에 존재하지 않는다). 결과적으로 RNA는 산란 암탉의 자궁관 세포에서 스플라이싱되어 인트론이 없는 동일한 이식유전자를 갖는 동일한 유전자이식 새에 비해 개선된 수준의 단백질 발현을 초래하여야 한다.
8. pSIN - CTE - OV -3.5- Int - CSI
3.5 kb OV 단편의 5'측에 삽입된 ALV CTE (도 9b)
3.5 kb OV 단편 (DHS I, II & III 포함)
5' UTR-5' 부분 (엑손 L로부터)
인트론 A
5' UTR-3' 부분 (엑손 1로부터)
부분 3' UTR
상기 8개의 벡터에 대한 엘리먼트 중 일부에 대한 좌표가 본 출원의 다른 곳에 개시되어 있다. 예를 들어, 오브알부민 누클레오티드 서열로부터의 서열들의 좌표는 상기 개요 부분에 개시되어 있다. CSI는 관심있는 코딩 서열, 즉 유전자이식 조류 자궁관에서 발현되는 것이 요망되는 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명에 따라 이용되는 SIN 벡터, SIN/SC 네거티브 벡터 및 SC 네거티브 벡터는 조류 백혈병/백혈증 바이러스 (ALV), 예를 들어 비제한적으로 RAV-0, RAV-1, RAV-2; 조류 육종 바이러스 (ASV); 조류 육종/급성 백혈병 바이러스 (ASLV), 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV); 후지나미 육종 바이러스 (FSV); 조류 골수모구증 바이러스 (AMV); 조류 적혈모구증 바이러스 (AEV); 조류 골수구종증 바이러스 (MCV), 예를 들어 비제한적으로 MC29; 세망내피증 바이러스 (REV), 예를 들어 비제한적으로 비장 괴사 바이러스 (SNV)와 같은 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 이해되는 대로 비제한적으로 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV); 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (MMSV); 몰로니 육종 백혈병 바이러스 (MMLV); 및 렌티바이러스 (예컨대, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV) 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV) (SIN 벡터이도록 개질됨))에 기초한 레트로바이러스 벡터, SIN/SC 네거티브 벡터 또는 SC 네거티브 벡터를 포함하는 다른 유용한 레트로바이러스 벡터를 고려한다.
매우 특수한 일 구체예에서, 문헌[Cosset et al, J of Virology (1991) vol 65, no. 6, p 3388-3394, 이의 기술이 전체로서 본원에 참조로서 포함된다]에 개시된 개질된 ALV 벡터의 5' LTR의 부분을 결실시켜 SIN 벡터를 생성한다. 특히, 누클레오티드 1 내지 173이 서열번호 29에 도시된 ALV 기재 벡터 LTR 서열로부터 결실되었다. 조류 유전자이식에 사용될 수 있는 다른 벡터로부터 SIN 벡터를 생성하기에 유용한 5' LTR 서열로부터의 특수한 결실이 당업자에 의해 결정될 수 있다.
특히 유용한 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따라 닭과 같은 유전자이식 조류의 자궁관에서 생성될 수 있는 치료용 단백질의 생성에 관한 것이다. 본 발명에 따라 생성되기 위한 예시적인 단백질로서는 비제한적으로 에리트로포이에틴, GM-CSF, 인터페론 β, 융합 단백질, CTLA4-Fc 융합 단백질, 성장 호르몬, 시토킨, 구조 단백질, 인터페론, 리소자임, β-카제인, 알부민, α-1 항트립신, 항트롬빈 III, 콜라겐, 인자 VIII, IX, X (기타), 섬유소원, 락토페린, 단백질 C, 조직-형 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 소마토트로핀 및 키모트립신, 면역글로불린, 항체. 면역독소, 인자 VIII, b-도메인 결실된 인자 VIII, 인자 VIIa, 인자 IX, 항응고제; 히루딘, 알테플라제, tpa, 레테플라제, tpa, tpa - 5개 도메인 중 3개가 결실됨, 인슐린, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글라르긴, 지속 인슐린 유사체, 글루카곤, tsh, 폴리트로핀-베타, fsh, pdgh, inf-베타, inf-알파 1, ifn-알파 2, inf-베타, inf-베타 1b, ifn-베타 1a, ifn-감마, ifn-감마 1b, il-2, il-11, hbsag, ospa, dornase-알파 dnase, 베타 글루코세레브로시다제, tnf-알파, il-2-디프테리아 독소 융합 단백질, tnfr-lgg 단편 융합 단백질 라로니다제, dnaases, 알레파셉트, 토시투모맵, 뮤린 mab, 알렘투주맵, 라스부리카제, 아갈시다제 베타, 테리파라티드, 부갑상선 호르몬 유도체, 아달리무맵 (lggl), 아나킨라, 네시리티드, 인간 b-형 나트륨이뇨 펩티드 (hbnp), 집락 자극 인자, 페그비소만트, 인간 성장 호르몬 수용체 길항제, 재조합 활성화된 단백질 c, 오말리주맵, 면역글로불린 e(lge) 차단제, 이브리투모맵 티욱세탄, ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 색소 호르몬, 소마토메딘, 황체형성 호르몬, 융모 생식샘자극호르몬, 시상하부 방출 인자, 에타너셉트(etanercept), 항이뇨 호르몬, 프로락틴 및 갑상샘 자극 호르몬, 면역글로불린 폴리펩티드, 면역글로불린 폴리펩티드 D 영역, 면역글로불린 폴리펩티드 J 영역, 면역글로불린 폴리펩티드 C 영역, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 링커 펩티드가 있다. 상기 및 기타 단백질 각각의 생성은 본 발명의 방법, 벡터 및 프로모터를 이용하여 고려된다.
본 발명은 예로서 제공된 하기 실시예에 의해 추가로 기술되며 이것이 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허 공보 및 특허의 내용이 그 전체로서 본원에 참고로서 포함된다.
실시예
1
pALV
-
SIN
-4.2-
Lvs
-
IFNa
-2B의 생성
벡터 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B (도 1에 도시됨)를 구성하고 도 1에 도시한다. pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B의 서열은 서열번호 1로 제시된다. 4.2 Kb 리소자임 프로모터가 서열번호 1의 누클레오티드 4810 내지 9008에 걸쳐있다. 리소자임 시그널 펩티드 코딩 서열이 서열번호 1의 누클레오티드 9037 내지 9090에 걸쳐있다. 인터페론 알파 2b 코딩 서열이 서열번호 1의 누클레오티드 9091 내지 9585에 걸쳐있다. 서열의 다른 성분으로는 서열번호 1의 누클레오티드 4000 내지 4345 및 누클레오티드 725 내지 897에 걸쳐있는 LTR이 있다.
pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B를 당업자에게 자명한 다양한 방법에 의해 구성할 수 있다. 그러나, 벡터를 제조하는데 가장 유용한 것으로 여겨지는 방법은 다음과 같다: pNLB-CMV-IFN-알파2B (2005년 6월 24일 출원된 미국 특허 출원 11/167,052에 개시됨, 이의 기술이 전체로서 본원에 참조로서 포함됨)의 3427 bp 영역을 프라이머 ATGCGCGCATTGGTAATTGATCGGCTGG (프라이머 ALV-SIN-1, 서열번호 2) 및 ATATGCGGCCGCGGTACCGCCCGGGCATCGATATCAAGCTTACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCA (프라이머 ALV-SIN-2, 서열번호 3)를 이용하여 PCR 증폭한다. 생성물을 BssHII 및 Not I으로 소화시켜 겔 정제에 의해 단리될 수 있는 3428 bp 단편을 생성한다. pNLB-CMV-IFN-알파2B의 1436 bp 영역을 프라이머 ATATGCGGCCGCGTCGACGGCCGGCCAGATCTGCTGAGCCGGTCGCTACCATTACCAGT (프라이머 ALV-SIN-3, 서열번호 4) 및 ATACGCGTATTCCCTAACGATCACGTCG (프라이머 ALV-SIN-4, 서열번호 5)를 이용하여 PCR 증폭한다. 생성된 생성물을 Not I 및 Mlu I로 소화시켜 겔 정제에 의해 단리된 1438 bp 단편을 수득한다. BssHII 스터퍼(stuffer) 단편을 함유하는 Bluescript II SK 벡터를 BssHII로 소화시켜 2788 bp의 선형화된 Bluescript 벡터를 수득하고 이것을 겔 정제시킨 후 3428 bp 및 1438 bp PCR 생성물에 라이게이션시켜 JCR.A108.49.5.24를 수득한다.
JCR.A108.49.5.24를 Hind III으로 소화시키고 생성된 6823 bp 단편을 라이게이션에 의해 원형으로 만들어 JCR.A108.76.1.1을 수득한다.
JCR.A108.76.1.1의 1175 bp 영역을 프라이머 CTGAAGTGTAAGGAATGTAAG (프라이머 ALV-SIN-5, 서열번호 6) 및 GCGCGTCTCATCCCCCTCCCTATGCAAAAG (프라이머 ALV-SIN-6, 서열번호 7)를 이용하여 PCR 증폭시키고 생성된 단편을 Blp I and Esp3I로 소화시켜 1030 bp 단편을 생성하고 이것을 겔 정제에 의해 단리시킨다. JCR.A108.76.1.1의 660 bp 영역을 프라이머 GGGCGTCTCAGGGACGGATTGGACGAACCACTGAATT (프라이머 ALV-SIN-7, 서열번호 8) 및 TTAGTGCTTTACGGCACCTC (프라이머 ALV-SIN-8, 서열번호 9)를 이용하여 PCR 증폭시키고 Esp3I and DraIII로 소화시켜 겔 정제에 의해 단리된 596 bp 단편을 수득한다. JCR.A108.76.1.1을 DraIII and Blp 1으로 소화시키고 5024 bp 선형 벡터를 1030 및 596 bp PCR 단편에 라이게이션시켜 pALV-SIN을 생성한다.
pALV-SIN을 BamHI로 소화시키고 4795 bp 선형 벡터를 겔 정제에 의해 단리시킨다. JCR.115.93.1.2의 4815 bp 영역 (2007년 1월 26일 출원된 미국 특허 출원 2007/0124829호에 개시됨)을 프라이머 GACGGATCCGATACCGTCCCTATTTTTGTGTTTGCTTC (프라이머 ALV-SIN-9, 서열번호 10) 및 TAACGGATCCTAGACTTTTTACTCCTTAGA (프라이머 ALV-SIN-10, 서열번호 11)를 이용하여 PCR 증폭시키고 BamHI 소화시킨다. 생성된 4802 단편을 4795 bp 선형 pALV-SIN에 라이게이션시켜 pALV-SIN-4.0-Lys-IFNa-2B를 생성한다.
실시예
2
pALV
-
SIN
-4.2-
Lvs
-
IFNa
-2B를 이용한 유전자이식 메추라기의 생성
벡터 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B의 형질도입 입자를 미국 특허 공보 2007/0077650호 (published April 5, 2007, entitled: Rapid Production of High Titer Virus, 이의 기술이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함됨)에 개시된 섬유모세포에서 생성시켰다.
일본 메추라기 수정란을 본질적으로 문헌[미국 특허 5,897,998호, 이의 기술이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함됨]에 개시된 스펙스니이더(Speksnijder) 절 차에 따라 윈도잉(windowed)하였다. 80개 알의 배하강에 알 당 약 7 마이크로리터 (대략 총 7 x 104개의 바이러스 입자)의 pALV-SrN-4.2-Lys-IFNa-2B 형질도입 입자를 주사하였다. 선택가능한 마커가 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B에 사용되지 않았기 때문에, 바이러스 입자의 농도는 선택가능한 카세트 또는 마커가 입자 정량을 허용하는 벡터에 사용된 경우의 바이러스 입자 생성에 대한 과거의 결과에 기초하여 산정되었다. 주사한 지 약 18일 후 16마리의 병아리가 부화되었고 부화 후 12주령 병아리로부터 수집된 혈청 샘플로부터 IFN ELISA에 의해 IFN 수준을 측정하였다. 혈청 중 IFN 단백질은 실재하지 않는다.
이식유전자를 함유하는 인터페론 알파 2 코딩 서열이 그 게놈에 함유된 G0 메추라기를 동정하기 위해, DNA를 새의 피로부터 추출하고 DNA 샘플을 7700 서열 검출기 (Perkin Elmer) 상에서 Taqman® 분석하였다.
8마리의 G0 메추라기로부터의 알을 ELISA에 의해 난백 중 IFN 단백질의 존재에 대해 시험하였다. 4번 메추라기가 현저한 수준의 IFN을 그 알로부터의 난백에 지니는 것이 발견되었다. 도 2는 4번 메추라기의 난백 중 IFN의 발현 수준을 예시하는 막대 그래프이다. 4번 메추라기는 1 ml의 난백에서 0.45 ㎍의 IFN-알파-2를 발현시켰고, 이것은 G0 조류에 대해 높은 수준의 발현이다. 4번 메추라기의 혈액에서 인터페론 알파 2는 검출되지 않았고 이것은 특히 의의 깊은 것이다. 예를 들어, 특정 예에서 재조합 단백질은 혈액에 존재하는 경우 조류의 발육 또는 건강에 유해할 수 있어서 새를 죽이거나 감소된 수준의 단백질 생성을 초래할 수 있다.
실시예
3
pALV
-
SIN
-6.5-
Lvs
-
IFNa
-2B를 이용한 유전자이식 메추라기의 생성
벡터 pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B의 4.2 kb 리소자임 프로모터를 제거하고 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 서열번호 12의 누클레오티드 대략 5363 내지 11863에 상응하는 6.5 kb 리소자임 프로모터로 교체하여 pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B를 수득하였다. 신규한 벡터 pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B의 형질도입 입자를 2007년 4월 5일 공개된 미국 특허 공보 2007/0077650호에 개시된 대로 생성하였다.
닭 수정란 또는 일본 메추라기 알을 윈도잉하고 약 7x104개의 pALV-SIN-6.5-Lys-IFNa-2B 형질도입 입자를 각 알의 배하강에 주사하였다. 주사한 지 21일 또는 18일 후에 알이 부화되었고 실시예 2에 개시된 대로, 그 게놈에 활성 이식유전자를 함유하는 키메라 새를 동정하였다. 이식유전자를 그 게놈에 함유하는 완전한 유전자이식 G1 새를 당 분야에 공지된 방법을 이용하여, 즉 수컷 키메라를 비-유전자이식 암컷과 교배시켜 키메라로부터 생성하였다.
실시예
4
벡터
pSIN
-
OV
-3.5-I-
CTLA4
-
Fc
-
Inv
의 생성
이 벡터는 오브알부민 Dnase 과민감성 부위 (DHS) I, II 및 III, 첫 번째 엑손 (엑손 L), 첫 번째 인트론 및 두 번째 엑손 (엑손 1)의 ATG 및 3' 비번역 영역 (UTR)을 지니는 프레임에 삽입된 CTLA4-Fc 융합 단백질 코딩 서열을 포함한다. 발현 카세트를 조류 백혈증 바이러스 (ALV) 벡터에 역 배향으로 삽입시키고, 이것을 서열번호 29에 도시된 ALV LTR 서열의 누클레오티드 1 내지 173의 결실에 의해 자가-불활성화시켰다 (SIN).
벡터를 다음과 같이 구성하였다: pNLB-3.9-OM-CTLA4-Fc (2007년 5월 17일 공개된 미국 특허 공보 2007/0113299호의 실시예 20에 개시됨, 이의 기술이 전체로서 본원에 참조로서 포함됨)를 Nae I 및 Not I으로 절단하였다. Not I 부위를 클레노우(Klenow) 반응에 의해 채웠다. 생성된 8125 bp 단편을 겔 정제시키고, 재라이게이션시켜 pOM-3.9-CTLA4-dSacI를 생성하였다.
pOM-3.9-CTLA4-dSacI을 EcoRI 및 Kpn I으로 절단하고 8115 bp 단편을 겔 정제시켰다. 닭 오브알부민 유전자의 3' UTR을 프라이머 5'-GCGGAATTCAAAGAAGAAAGCTGAAAAAC-3' (서열번호 13) 및 5'-GCGGGTACCTTCAAATACTACAAGTGAAA-3' (서열번호 14)를 이용하여 2006년 6월 15일 공개된 미국 특허 공보 2006/0130170호에 개시된 대로 BAC 26으로부터 PCR시켰다. 3' UTR PCR을 Eco RI 및 Kpn I로 절단하고 684 bp 단편을 겔 정제시켰다. pOM-3.9-CTLA4-dSacI의 8115 kb 단편을 3' UTR PCR의 684 bp 단편에 라이게이션시켜 pOM-3.9-CTLA4-OV3'UTR을 생성하였다.
3.5 kb OV 프로모터 영역, 엑손 L, 첫 번째 인트론 및 엑손 1의 UTR을 주형으로서 BAC26을 이용하고 프라이머 5'-GGCCTCGAGTCAAGTTCTGAGTAGGTTTTAGTG-3' (서열번호 15) 및 5'- GCGCGTCTCTGTCTAGAGCAAACAGCAGAACAGTGAAAATG-3' (서열번호 16)을 이용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 Xho I 및 Esp3I로 절단하고 5094 bp 생성물을 겔 정제시켰다.
CTLA4-Fc 유전자의 5' 부분을 pOM-3.9-CTLA4를 주형으로서 이용하고 프라이머 5'-GCGCGTCTCAAGACAACTCAGAGTTCACCATGGGTGTACTGCTCACACAG-3' (서열번호 17) 및 5'-GGCCCGGGAGTTTTGTCAGAAGATTTGGG-3' (서열번호 18)을 이용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 Esp3I 및 SacI로 절단하고 384 bp 생성물을 겔 정제시켰다.
pOM-3.9-CTLA4-OV3'UTR을 Sac I 및 Xho I로 절단하고, 4473 bp 생성물을 겔 정제시키고, 5094 bp OV PCR 단편 및 384 bp CTLA4-Fc 단편에 라이게이션시켜 pOV-3.5-I-CTLA4를 생성하였다.
예를 들어, 2007년 5월 31일 공개된 모출원 미국 특허 공보 2007/0124829호의 실시예 10에 개시된 pALV-SIN을 Mfe I 및 Xho I로 절단하고, 클레노우로 채우고, 4911 bp 단편을 겔 정제시켰다.
pOV-3.5-I-CTLA4를 Xhol 및 BamHI로 절단하고, 클레노우로 채우고, 6957 bp 단편을 겔 정제시켰다. 이 단편을 pAVI-SIN의 4911 bp 단편으로 라이게이션시켜 CTLA4-Fc 유전자 및 플랭킹 발현 엘리먼트가 ALV 긴 말단 반복부위의 반대 배향에 있게 하여 pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv를 생성하였다. 도 3 및 서열번호 19를 참조한다. 이러한 반대 배향은 이식유전자의 관심있는 코딩 서열 (즉, CSI)이 하나 이상의 인트론 또는 스플라이스 부위를 함유하는 경우에 바람직할 수 있다.
실시예
5
SIN
-
OV
-3.5-I-
CTLA4
-
inv
를 이용한 유전자이식 메추라기의 생성
pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv 벡터 (도 3)를 함유하고 VSV 외피 단백질로 의사형(pseudotyped)이 된 레트로바이러스 입자를 2007년 4월 5일 공개된 미국 특허 공 보 2007/0077650호에 개시된 대로 생성하였다. 바이러스 입자를 트랜스펙션 48시간 후에 회수하고, 농축시키고, 동일자로 약 1 x 105개의 입자를 함유하는 약 4 마이크로리터의 바이러스 현탁액을 단계 X 메추라기 알의 배아강에 주사하였다. 알을 재밀봉하여 부화시켰다.
ALV는 스플라이싱되지 않은 레트로바이러스 RNA가 세포질로 운반되도록 하는 CTE 엘리먼트를 그 게놈의 3' 말단에 지닌다. pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv에서, LTR에 대한 OV 프로모터의 역 배향으로 인해, CTE는 CTE 엘리먼트가 OV 프로모터에 의해 전사된 RNA가 아닌 5' LTR 프로모터로부터 유래된 RNA에만 있도록 하는 OV 프로모터의 업스트림이다. 따라서, OV 프로모터에 의해 전사된 임의의 RNA가 세포질로 운반되기 전에 스플라이싱되어야 한다.
키메라 메추라기로부터의 난백을 CTLA4-Fc에 대해 ELISA를 이용하여 검정하였다. 한 메추라기가 그 난백에 약 16 ㎍/ml의 CTLA4-Fc를 지니는 것으로 밝혀졌다. 이러한 메추라기의 유전자이식 수준은 약 5% 이하로 추정된다. 따라서, G1의 수준은 실질적으로 더 커야 한다. 메추라기 및 닭 오브알부민 유전자 및 다른 조류의 오브알부민 유전자가 매우 유사하므로 유사한 수준이 닭 및 다른 조류에서 발견될 것으로 예상된다.
실시예
6
pSIN
-3.9-
OM
-
CTLA4
-
Fc
의 구성
pALV-SIN의 4907 bp Mfe I/Xho I 단편 (예를 들어, 2007년 5월 31일 공개된 미국 특허 공보 2007/0124829호에 개시됨)을 pOM-3.9-CTLA4의 5115 XhoI/EcoRI 단편 (2007년 5월 17일 공개된 미국 특허 공보 2007/0113299호의 도 15에 도시됨)에 라이게이션시켜 도 4 및 서열번호 20에 도시된 pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc를 생성하였다.
실시예
7
pSIN
-3.9-
OM
-
CTLA4
-
Fc
를 이용한 유전자이식 닭의 생성
VSV 외피 단백질로 의사형이 되고 pSIN-3.9-OM-CTLA4-Fc (도 4) 벡터를 함유하는 레트로바이러스 입자를 2007년 4월 5일 공개된 미국 특허 공보 2007/0077650호에 개시된 대로 생성하였다. 바이러스를 트랜스펙션 48시간 후에 회수하고, 농축시키고, 동일자로 약 7 마이크로리터를 단계 X 알의 배아강에 주사하였다. 알을 재밀봉하여 부화시까지 인큐베이션하였다.
암탉으로부터의 난백을 CTLA4-Fc에 대해 ELISA를 이용하여 검정하였다. 한 암탉이 그 난백에 약 0.37 ㎍/ml의 CTLA4-Fc를 지니는 것으로 밝혀졌다. 이러한 암탉의 유전자이식 수준은 약 5% 이하로 추정된다. 따라서, G1의 수준은 실질적으로 더 커야 한다.
임의의 유용한 코딩 서열을 상응하는 생성물의 제공을 위해 CTLA4-Fc 코딩 서열 대신 삽입할 수 있다.
실시예
8
pSIN
-1.8-
OM
-
IFNa
-2B의 구성
pBS-OM-4.4로부터의 1051 bp Nco I-Nco I 단편 (도 5 서열번호 23)을 pAVIJCR-Al37.91.1.2의 Nco I 부위 (도 6 서열번호 24)에 삽입시켜, IFN 코딩 서열 및 SV40 폴리아데닐화 시그널 앞에 1 kb 오보뮤코이드 프로모터를 삽입하고 plkb-OM-IFNMM을 생성하였다. plkb-OM-IFNMM의 1816 bp Cla I-Sac I 단편을 pBS-OM-4.4의 6245 bp Cla I-Sac I 단편에 삽입시켜 4.4 kb 오보뮤코이드 단편을 IFN 코딩 서열과 융합시키고 p4.4OM-IFNMM을 생성하였다. pBS-OMUP-10의 8511 bp BamH I-Sal I 단편을 p4.4OM-IFN의 5148 bp BamH l-Sal I 단편에 라이게이션시켜 IFN 코딩 서열의 앞에 10 kb 오보뮤코이드 프로모터를 정위시킴으로써 p10-OM-IFN을 생성하였다.
pl0.0-OM-IFN의 영역 2487-4889를 프라이머 5'- GGCGTCGACGGATCCGTTAACCCTAGAACTAGTGGATCTCTGCCCTTGTGCTGAC-3' (서열번호 27) 및 5'-GGCCTCGAGCCTAGACTTTTTACTCCTTAGA-3' (서열번호 28)를 이용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 Sal I 및 Xho I로 소화시키고 2435 bp를 단리시켰다. pALV-SIN (예를 들어, 2007년 5월 31일 공개된 미국 특허 공보 2007/0124829호에 개시됨)을 Xho I로 소화시키고 4915 bp 단편을 단리시키고 2435 bp 단편에 라이게이션시켜 도 7 및 서열번호 21에 도시된 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B를 생성하였다.
실시예
9
pSIN
-1.8-
OM
-
IFNa
-2B를 이용한 유전자이식 닭의 생성
VSV 외피 단백질로 의사형이 되고 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B 이식유전자를 함유하는 레트로바이러스 입자를 2007년 4월 5일 공개된 미국 특허 공보 2007/0077650호에 개시된 대로 생성하였다. 바이러스를 트랜스펙션 48시간 후에 회수하고, 농축시키고, 동일자로 약 7 마이크로리터를 단계 X 계란의 배아강에 주사하였다. 알을 재밀봉하여 부화시까지 인큐베이션하였다.
암탉으로부터의 난백을 IFNa-2B에 대해 ELISA를 이용하여 검정하였다. 암탉은 난백에 1.5 내지 865.0 ng/ml의 IFNa-2B를 지니는 것으로 밝혀졌는데, 이러한 IFNa-2B 수준은 혈청에서 보다 적어도 약 600배 낮은 것이다. 이러한 암탉의 유전자이식 수준은 약 5% 이하로 추정된다.
5 마리의 GO 정자 포지티브 수탉을 비-유전자이식 암탉에게 번식시켰다. 1251 마리의 자손 중, 30 마리가 pSIN-1.8-OM-IFNa-2B 이식유전자를 지녔다. 30 마리의 암탉 중 6 마리가 1 ml의 난백에 대하여 34.1 내지 165.6 ㎍의 인간 IFN-α-2B를 발현시켰다. 6마리의 암탉 각각이 이식유전자의 단일 복사체를 지녔다. 인간 IFN-α-2B의 혈청 수준은 0.3 내지 9.2 ng/ml이었고, 이것은 난백 수준에 비해 평균 30,000배 낮은 것이었다.
실시예
10
렌티바이러스
벡터 및 몰로니
뮤린
백혈병 바이러스를 이용한 유전자이식 닭의 생성
본 발명은 본 발명에 따라 이용되는 조류 유전자이식에 유용한 다른 레트로바이러스 벡터의 적용을 특히 고려한다. 이러한 벡터는, 예를 들어 ALV-SIN 벡터가 상기 실시예 1 내지 9에서 이용된 것과 동일한 방식으로 유전자이식 조류를 생성하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV) 및 렌티바이러스 벡터를 본 발명에 따라 이용할 수 있는데, 각각에서, 예를 들어 SIN 벡터를 생성하기 위해 CAAT box; TAATA box; 및 각 바이러스의 업스트림 LTR의 U3 영역에 함유된 인핸서 중 하나 이상이 결실된다. 대안적으로 또는 추가로 (즉, SIN 벡터와 함께), 어떠한 전사적으로 활성인 마커 또는 선택가능한 카세트가 레트로바이러스 벡터 각각에 포함되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예를 특정 용어, 장치 및 방법을 이용하여 설명하였으나, 그러한 설명은 단지 예시를 목적으로 하는 것이다. 사용된 용어는 제한이라기보다는 설명을 위한 용어이다. 변형 및 개질이 하기 청구범위에 개시된 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으며 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 다양한 구체예의 양태가 전부 또는 부분적으로 교체될 수 있음을 이해하여야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> AviGenics, Inc.
<120> Transgene Expression in Avians
<130> AVI-065
<160> 29
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 9597
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pALV-SIN-4.2-Lys-IFNa-2B Vector
<400> 1
gatcccccgt gctgcagaac cgagcggcta ttgacttctt gctcctagct cacggccatg 60
gctgtgagga cattgcggga atgtgttgtt tcaatctgag tgatcacagt gagtctatac 120
agaagaagtt ccagctaatg aaggaacatg tcaataagat cggcgtgaac aacgacccaa 180
tcggaagttg gctgcgagga ttattcggag gaataggaga atgggccgta cacttgctga 240
aaggactgct tttggggctt gtagttatct tgttgctagt agtatgcttg ccttgccttt 300
tgcaatgtgt atctagtagt attcgaaaga tgattgataa ttcactcggc tatcgcgagg 360
aatataaaaa aattacagga ggcttataag cagcccgaaa gaagagcgta ggcgagttct 420
tgtattccgt gtgatagctg gttggattgg taattgatcg gctggcacgc ggaatatagg 480
aggtcgctga atagtaaact tgtagacttg gctacagcat agagtatctt ctgtagctct 540
gatgactgct aggaaataat gctacggata atgtggggag ggcaaggctt gcgaatcggg 600
ttgtaacggg caaggcttga ctgaggggac aatagcatgt ttaggcgaaa agcggggctt 660
cggttgtacg cggttaggag tcccctcagg atatagtagt ttcgcttttg catagggagg 720
gggacggatt ggacgaacca ctgaattccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta 780
gctcgataca ataaacgcca tttgaccatt caccacattg gtgtgcacct gggttgatgg 840
ccggaccgtt gattccctgr cgactacgag cacatgcatg aagcagaagg cttcatttgg 900
tgaccccgac gtgatcgtta gggaatacgc gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 960
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 1020
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 1080
atggcgaatg gaaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta 1140
aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga 1200
atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa 1260
cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga 1320
accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc 1380
taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga 1440
agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg 1500
cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt 1560
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 1620
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 1680
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 1740
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 1800
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 1860
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 1920
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 1980
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 2040
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 2100
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 2160
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 2220
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 2280
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 2340
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 2400
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 2460
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 2520
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 2580
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 2640
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 2700
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 2760
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 2820
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 2880
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 2940
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 3000
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 3060
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 3120
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 3180
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 3240
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 3300
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 3360
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 3420
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 3480
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 3540
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 3600
cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 3660
tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc 3720
attggtaatt gatcggctgg cacgcggaat ataggaggtc gctgaatagt aaacttgtag 3780
acttggctac agcatagagt atcttctgta gctctgatga ctgctaggaa ataatgctac 3840
ggataatgtg gggagggcaa ggcttgcgaa tcgggttgta acgggcaagg cttgactgag 3900
gggacaatag catgtttagg cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagtcccc 3960
tcaggatata gtagtttcgc ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaatact 4020
cttgtagtct tgcaacatgc ttatgtaacg atgagttagc aacatgcctt ataaggagag 4080
aaaaagcacc gtgcatgccg attggtggga gtaaggtggt atgatcgtgg tatgatcgtg 4140
ccttgttagg aaggcaacag acgggtctaa cacggattgg acgaaccact gaattccgca 4200
ttgcagagat attgtattta agtgcctagc tcgatacaat aaacgccatt tgaccattca 4260
ccacattggt gtgcacctgg gttgatggcc ggaccgttga ttccctgrcg actacgagca 4320
catgcatgaa gcagaaggct tcatttggtg accccgacgt gatcgttagg gaatagtggt 4380
cggccacagg cggcgtggcg atcctgtcct catccgtctc gcttattcgg ggagcggacg 4440
atgaccctag tagagggggc tgcggcttag gagggcagaa gctgagtggc gtcggaggga 4500
gccctactgc agggggccaa cataccctac cgagaactca gagagtcgtt ggaagacggg 4560
aaggaagccc gacgactgag cggtccaccc caggcgtgat tccggttgct ctgcgtgatt 4620
ccggtcgccc ggtggatcaa gcatggaagc cgtcataaag gtgatttcgt ccgcgtgtaa 4680
gacctattgc gggaaaacct ctccttctaa gaaggaaata ggggctatgt tgtccctgtt 4740
acaaaaggaa gggttgctta cgtccccctc agacttatat tccccggggt cctgggatcc 4800
gataccgtcc ctatttttgt gtttgcttca gcagccattt aattcttcag tgtcatcttg 4860
ttctgttgat gccactggaa caggattttc agcagtcttg caaagaacat ctagctgaaa 4920
actttctgcc attcaatatt cttaccagtt cttcttgttt gaggtgagcc ataaattact 4980
agaacttcgt cactgacaag tttatgcatt ttattacttc tattatgtac ttactttgac 5040
ataacacaga cacgcacata ttttgctggg atttccacag tgtctctgtg tccttcacat 5100
ggttttactg tcatacttcc gttataacct tggcaatctg cccagctgcc catcacaaga 5160
aaagagattc cttttttatt acttctcttc agccaataaa caaaatgtga gaagcccaaa 5220
caagaacttg tggggcaggc tgccatcaag ggagagacag ctgaagggtt gtgtagctca 5280
atagaattaa gaaataataa agctgtgtca gacagttttg cctgatttat acaggcacgc 5340
cccaagccag agaggctgtc tgccaaggcc accttgcagt ccttggtttg taagataagt 5400
cataggtaac ttttctggtg aattgcgtgg agaatcatga tggcagttct tgctgtttac 5460
tatggtaaga tgctaaaata ggagacagca aagtaacact tgctgctgta ggtgctctgc 5520
tatccagaca gcgatggcac tcgcacacca agatgaggga tgctcccagc tgacggatgc 5580
tggggcagta acagtgggtc ccatgctgcc tgctcattag catcacctca gccctcacca 5640
gcccatcaga aggatcatcc caagctgagg aaagttgctc atcttcttca catcatcaaa 5700
cctttggcct gactgatgcc tcccggatgc ttaaatgtgg tcactgacat ctttattttt 5760
ctatgatttc aagtcagaac ctccggatca ggagggaaca catagtggga atgtaccctc 5820
agctccaagg ccagatcttc cttcaatgat catgcatgct acttaggaag gtgtgtgtgt 5880
gtgaatgtag aattgccttt gttatttttt cttcctgctg tcaggaacat tttgaatacc 5940
agagaaaaag aaaagtgctc ttcttggcat gggaggagtt gtcacacttg caaaataaag 6000
gatgcagtcc caaatgttca taatctcagg gtctgaagga ggatcagaaa ctgtgtatac 6060
aatttcaggc ttctctgaat gcagcttttg aaagctgttc ctggccgagg cagtactagt 6120
cagaaccctc ggaaacagga acaaatgtct tcaaggtgca gcaggaggaa acaccttgcc 6180
catcatgaaa gtgaataacc actgccgctg aaggaatcca gctcctgttt gagcaggtgc 6240
tgcacactcc cacactgaaa caacagttca tttttatagg acttccagga aggatcttct 6300
tcttaagctt cttaattatg gtacatctcc agttggcaga tgactatgac tactgacagg 6360
agaatgagga actagctggg aatatttctg tttgaccacc atggagtcac ccatttcttt 6420
actggtattt ggaaataata attctgaatt gcaaagcagg agttagcgaa gatcttcatt 6480
tcttccatgt tggtgacagc acagttctgg ctatgaaagt ctgcttacaa ggaagaggat 6540
aaaaatcata gggataataa atctaagttt gaagacaatg aggttttagc tgcatttgac 6600
atgaagaaat tgagacctct actggatagc tatggtattt acgtgtcttt ttgcttagtt 6660
acttattgac cccagctgag gtcaagtatg aactcaggtc tctcgggcta ctggcatgga 6720
ttgattacat acaactgtaa ttttagcagt gatttagggt ttatgagtac ttttgcagta 6780
aatcataggg ttagtaatgt taatctcagg gaaaaaaaaa aaaagccaac cctgacagac 6840
atcccagctc aggtggaaat caaggatcac agctcagtgc ggtcccagag aacacaggga 6900
ctcttctctt aggaccttta tgtacagggc ctcaagataa ctgatgttag tcagaagact 6960
ttccattctg gccacagttc agctgaggca atcctggaat tttctctccg ctgcacagtt 7020
ccagtcatcc cagtttgtac agttctggca ctttttgggt caggccgtga tccaaggagc 7080
agaagttcca gctatggtca gggagtgcct gaccgtccca actcactgca ctcaaacaaa 7140
ggcgaaacca caagagtggc ttttgttgaa attgcagtgt ggcccagagg ggctgcacca 7200
gtactggatt gaccacgagg caacattaat cctcagcaag tgcaatttgc agccattaaa 7260
ttgaactaac tgatactaca atgcaatcag tatcaacaag tggtttggct tggaagatgg 7320
agtctagggg ctctacagga gtagctactc tctaatggag ttgcattttg aagcaggaca 7380
ctgtgaaaag ctggcctcct aaagaggctg ctaaacatta gggtcaattt tccagtgcac 7440
tttctgaagt gtctgcagtt ccccatgcaa agctgcccaa acatagcact tccaattgaa 7500
tacaattata tgcaggcgta ctgcttcttg ccagcactgt ccttctcaaa tgaactcaac 7560
aaacaatttc aaagtctagt agaaagtaac aagctttgaa tgtcattaaa aagtatatct 7620
gctttcagta gttcagctta tttatgccca ctagaaacat cttgtacaag ctgaacactg 7680
gggctccaga ttagtggtaa aacctacttt atacaatcat agaatcatag aatggcctgg 7740
gttggaaggg accccaagga tcatgaagat ccaacacccc cgccacaggc agggccacca 7800
acctccagat ctggtactag accaggcagc ccagggctcc atccaacctg gccatgaaca 7860
cctccaggga tggagcatcc acaacctctc tgggcagcct gtgccagcac ctcaccaccc 7920
tctctgtgaa gaacttttcc ctgacatcca atctaagcct tccctccttg aggttagatc 7980
cactccccct tgtgctatca ctgtctactc ttgtaaaaag ttgattctcc tcctttttgg 8040
aaggttgcaa tgaggtctcc ttgcagcctt cttctcttct gcaggatgaa caagcccagc 8100
tccctcagcc tgtctttata ggagaggtgc tccagccctc tgatcatctt tgtggccctc 8160
ctctggaccc gctccaagag ctccacatct ttcctgtact gggggcccca ggcctgaatg 8220
cagtactcca gatggggcct caaaagagca gagtaaagag ggacaatcac cttcctcacc 8280
ctgctggcca gccctcttct gatggagccc tggatacaac tggctttctg agctgcaact 8340
tctccttatc agttccacta ttaaaacagg aacaatacaa caggtgctga tggccagtgc 8400
agagtttttc acacttcttc atttcggtag atcttagatg aggaacgttg aagttgtgct 8460
tctgcgtgtg cttcttcctc ctcaaatact cctgcctgat acctcacccc acctgccact 8520
gaatggctcc atggccccct gcagccaggg ccctgatgaa cccggcactg cttcagatgc 8580
tgtttaatag cacagtatga ccaagttgca cctatgaata cacaaacaat gtgttgcatc 8640
cttcagcact tgagaagaag agccaaattt gcattgtcag gaaatggttt agtaattctg 8700
ccaattaaaa cttgtttatc taccatggct gtttttatgg ctgttagtag tggtacactg 8760
atgatgaaca atggctatgc agtaaaatca agactgtaga tattgcaaca gactataaaa 8820
ttcctctgtg gcttagccaa tgtggtactt cccacattgt ataagaaatt tggcaagttt 8880
agagcaatgt ttgaagtgtt gggaaatttc tgtatactca agagggcgtt tttgacaact 8940
gtagaacaga ggaatcaaaa gggggtggga ggaagttaaa agaagaggca ggtgcaagag 9000
agcttgcagt cccgctgtgt gtacgacact ggcaacatga ggtctttgct aatcttggtg 9060
ctttgcttcc tgcccctggc tgccttaggg tgcgatctgc ctcagaccca cagcctgggc 9120
agcaggagga ccctgatgct gctggctcag atgaggagaa tcagcctgtt tagctgcctg 9180
aaggataggc acgattttgg ctttcctcaa gaggagtttg gcaaccagtt tcagaaggct 9240
gagaccatcc ctgtgctgca cgagatgatc cagcagatct ttaacctgtt tagcaccaag 9300
gatagcagcg ctgcttggga tgagaccctg ctggataagt tttacaccga gctgtaccag 9360
cagctgaacg atctggaggc ttgcgtgatc cagggcgtgg gcgtgaccga gacccctctg 9420
atgaaggagg atagcatcct ggctgtgagg aagtactttc agaggatcac cctgtacctg 9480
aaggagaaga agtacagccc ctgcgcttgg gaagtcgtga gggctgagat catgaggagc 9540
tttagcctga gcaccaacct gcaagagagc ttgaggtcta aggagtaaaa agtctag 9597
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-1
<400> 2
atgcgcgcat tggtaattga tcggctgg 28
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-2
<400> 3
atatgcggcc gcggtaccgc ccgggcatcg atatcaagct tacggttcac taaacgagct 60
ctgcttatat agacctccca 80
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-3
<400> 4
atatgcggcc gcgtcgacgg ccggccagat ctgctgagcc ggtcgctacc attaccagt 59
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-4
<400> 5
atacgcgtat tccctaacga tcacgtcg 28
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-5
<400> 6
ctgaagtgta aggaatgtaa g 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-6
<400> 7
gcgcgtctca tccccctccc tatgcaaaag 30
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-7
<400> 8
gggcgtctca gggacggatt ggacgaacca ctgaatt 37
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-8
<400> 9
ttagtgcttt acggcacctc 20
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-9
<400> 10
gacggatccg ataccgtccc tatttttgtg tttgcttc 38
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ALV-SIN-10
<400> 11
taacggatcc tagacttttt actccttaga 30
<210> 12
<211> 11945
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Proximal promoter and lysozyme signal peptide
<400> 12
tgccgccttc tttgatattc actctgttgt atttcatctc ttcttgccga tgaaaggata 60
taacagtctg tataacagtc tgtgaggaaa tacttggtat ttcttctgat cagtgttttt 120
ataagtaatg ttgaatattg gataaggctg tgtgtccttt gtcttgggag acaaagccca 180
cagcaggtgg tggttggggt ggtggcagct cagtgacagg agaggttttt ttgcctgttt 240
tttttttttt tttttttttt aagtaaggtg ttcttttttc ttagtaaatt ttctactgga 300
ctgtatgttt tgacaggtca gaaacatttc ttcaaaagaa gaaccttttg gaaactgtac 360
agcccttttc tttcattccc tttttgcttt ctgtgccaat gcctttggtt ctgattgcat 420
tatggaaaac gttgatcgga acttgaggtt tttatttata gtgtggcttg aaagcttgga 480
tagctgttgt tacacgagat accttattaa gtttaggcca gcttgatgct ttattttttc 540
cctttgaagt agtgagcgtt ctctggtttt tttcctttga aactggtgag gcttagattt 600
ttctaatggg attttttacc tgatgatcta gttgcatacc caaatgcttg taaatgtttt 660
cctagttaac atgttgataa cttcggattt acatgttgta tatacttgtc atctgtgttt 720
ctagtaaaaa tatatggcat ttatagaaat acgtaattcc tgatttcctt tttttttatc 780
tctatgctct gtgtgtacag gtcaaacaga cttcactcct atttttattt atagaatttt 840
atatgcagtc tgtcgttggt tcttgtgttg taaggataca gccttaaatt tcctagagcg 900
atgctcagta aggcgggttg tcacatgggt tcaaatgtaa aacgggcacg tttggctgct 960
gccttcccga gatccaggac actaaactgc ttctgcactg aggtataaat cgcttcagat 1020
cccagggaag tgcagatcca cgtgcatatt cttaaagaag aatgaatact ttctaaaata 1080
ttttggcata ggaagcaagc tgcatggatt tgtttgggac ttaaattatt ttggtaacgg 1140
agtgcatagg ttttaaacac agttgcagca tgctaacgag tcacagcgtt tatgcagaag 1200
tgatgcctgg atgcctgttg cagctgttta cggcactgcc ttgcagtgag cattgcagat 1260
aggggtgggg tgctttgtgt cgtgttccca cacgctgcca cacagccacc tcccggaaca 1320
catctcacct gctgggtact tttcaaacca tcttagcagt agtagatgag ttactatgaa 1380
acagagaagt tcctcagttg gatattctca tgggatgtct tttttcccat gttgggcaaa 1440
gtatgataaa gcatctctat ttgtaaatta tgcacttgtt agttcctgaa tcctttctat 1500
agcaccactt attgcagcag gtgtaggctc tggtgtggcc tgtgtctgtg cttcaatctt 1560
ttaaagcttc tttggaaata cactgacttg attgaagtct cttgaagata gtaaacagta 1620
cttacctttg atcccaatga aatcgagcat ttcagttgta aaagaattcc gcctattcat 1680
accatgtaat gtaattttac acccccagtg ctgacacttt ggaatatatt caagtaatag 1740
actttggcct caccctcttg tgtactgtat tttgtaatag aaaatatttt aaactgtgca 1800
tatgattatt acattatgaa agagacattc tgctgatctt caaatgtaag aaaatgagga 1860
gtgcgtgtgc ttttataaat acaagtgatt gcaaattagt gcaggtgtcc ttaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaag taatataaaa aggaccaggt gttttacaag tgaaatacat tcctatttgg 1980
taaacagtta catttttatg aagattacca gcgctgctga ctttctaaac ataaggctgt 2040
attgtcttcc tgtaccattg catttcctca ttcccaattt gcacaaggat gtctgggtaa 2100
actattcaag aaatggcttt gaaatacagc atgggagctt gtctgagttg gaatgcagag 2160
ttgcactgca aaatgtcagg aaatggatgt ctctcagaat gcccaactcc aaaggatttt 2220
atatgtgtat atagtaagca gtttcctgat tccagcaggc caaagagtct gctgaatgtt 2280
gtgttgccgg agacctgtat ttctcaacaa ggtaagatgg tatcctagca actgcggatt 2340
ttaatacatt ttcagcagaa gtacttagtt aatctctacc tttagggatc gtttcatcat 2400
ttttagatgt tatacttgaa atactgcata acttttagct ttcatgggtt cctttttttc 2460
agcctttagg agactgttaa gcaatttgct gtccaacttt tgtgttggtc ttaaactgca 2520
atagtagttt accttgtatt gaagaaataa agaccatttt tatattaaaa aatacttttg 2580
tctgtcttca ttttgacttg tctgatatcc ttgcagtgcc cattatgtca gttctgtcag 2640
atattcagac atcaaaactt aacgtgagct cagtggagtt acagctgcgg ttttgatgct 2700
gttattattt ctgaaactag aaatgatgtt gtcttcatct gctcatcaaa cacttcatgc 2760
agagtgtaag gctagtgaga aatgcataca tttattgata cttttttaaa gtcaactttt 2820
tatcagattt ttttttcatt tggaaatata ttgttttcta gactgcatag cttctgaatc 2880
tgaaatgcag tctgattggc atgaagaagc acagcactct tcatcttact taaacttcat 2940
tttggaatga aggaagttaa gcaagggcac aggtccatga aatagagaca gtgcgctcag 3000
gagaaagtga acctggattt ctttggctag tgttctaaat ctgtagtgag gaaagtaaca 3060
cccgattcct tgaaagggct ccagctttaa tgcttccaaa ttgaaggtgg caggcaactt 3120
ggccactggt tatttactgc attatgtctc agtttcgcag ctaacctggc ttctccacta 3180
ttgagcatgg actatagcct ggcttcagag gccaggtgaa ggttgggatg ggtggaagga 3240
gtgctgggct gtggctgggg ggactgtggg gactccaagc tgagcttggg gtgggcagca 3300
cagggaaaag tgtgggtaac tatttttaag tactgtgttg caaacgtctc atctgcaaat 3360
acgtagggtg tgtactctcg aagattaaca gtgtgggttc agtaatatat ggatgaattc 3420
acagtggaag cattcaaggg tagatcatct aacgacacca gatcatcaag ctatgattgg 3480
aagcggtatc agaagagcga ggaaggtaag cagtcttcat atgttttccc tccacgtaaa 3540
gcagtctggg aaagtagcac cccttgagca gagacaagga aataattcag gagcatgtgc 3600
taggagaact ttcttgctga attctacttg caagagcttt gatgcctggc ttctggtgcc 3660
ttctgcagca cctgcaaggc ccagagcctg tggtgagctg gagggaaaga ttctgctcaa 3720
gtccaagctt cagcaggtca ttgtctttgc ttcttccccc agcactgtgc agcagagtgg 3780
aactgatgtc gaagcctcct gtccactacc tgttgctgca ggcagactgc tctcagaaaa 3840
agagagctaa ctctatgcca tagtctgaag gtaaaatggg ttttaaaaaa gaaaacacaa 3900
aggcaaaacc ggctgcccca tgagaagaaa gcagtggtaa acatggtaga aaaggtgcag 3960
aagcccccag gcagtgtgac aggcccctcc tgccacctag aggcgggaac aagcttccct 4020
gcctagggct ctgcccgcga agtgcgtgtt tctttggtgg gttttgtttg gcgtttggtt 4080
ttgagattta gacacaaggg aagcctgaaa ggaggtgttg ggcactattt tggtttgtaa 4140
agcctgtact tcaaatatat attttgtgag ggagtgtagc gaattggcca atttaaaata 4200
aagttgcaag agattgaagg ctgagtagtt gagagggtaa cacgtttaat gagatcttct 4260
gaaactactg cttctaaaca cttgtttgag tggtgagacc ttggataggt gagtgctctt 4320
gttacatgtc tgatgcactt gcttgtcctt ttccatccac atccatgcat tccacatcca 4380
cgcatttgtc acttatccca tatctgtcat atctgacata cctgtctctt cgtcacttgg 4440
tcagaagaaa cagatgtgat aatccccagc cgccccaagt ttgagaagat ggcagttgct 4500
tctttccctt tttcctgcta agtaaggatt ttctcctggc tttgacacct cacgaaatag 4560
tcttcctgcc ttacattctg ggcattattt caaatatctt tggagtgcgc tgctctcaag 4620
tttgtgtctt cctactctta gagtgaatgc tcttagagtg aaagagaagg aagagaagat 4680
gttggccgca gttctctgat gaacacacct ctgaataatg gccaaaggtg ggtgggtttc 4740
tctgaggaac gggcagcgtt tgcctctgaa agcaaggagc tctgcggagt tgcagttatt 4800
ttgcaactga tggtggaact ggtgcttaaa gcagattccc taggttccct gctacttctt 4860
ttccttcttg gcagtcagtt tatttctgac agacaaacag ccacccccac tgcaggctta 4920
gaaagtatgt ggctctgcct gggtgtgtta cagctctgcc ctggtgaaag gggattaaaa 4980
cgggcaccat tcatcccaaa caggatcctc attcatggat caagctgtaa ggaacttggg 5040
ctccaacctc aaaacattaa ttggagtacg aatgtaatta aaactgcatt ctcgcattcc 5100
taagtcattt agtctggact ctgcagcatg taggtcggca gctcccactt tctcaaagac 5160
cactgatgga ggagtagtaa aaatggagac cgattcagaa caaccaacgg agtgttgccg 5220
aagaaactga tggaaataat gcatgaattg tgtggtggac atttttttta aatacataaa 5280
ctacttcaaa tgaggtcgga gaaggtcagt gttttattag cagccataaa accaggtgag 5340
cgagtaccat ttttctctac aagaaaaacg attctgagct ctgcgtaagt ataagttctc 5400
catagcggct gaagctcccc cctggctgcc tgccatctca gctggagtgc agtgccattt 5460
ccttggggtt tctctcacag cagtaatggg acaatacttc acaaaaattc tttcttttcc 5520
tgtcatgtgg gatccctact gtgccctcct ggttttacgt taccccctga ctgttccatt 5580
cagcggtttg gaaagagaaa aagaatttgg aaataaaaca tgtctacgtt atcacctcct 5640
ccagcatttt ggtttttaat tatgtcaata actggcttag atttggaaat gagagggggt 5700
tgggtgtatt accgaggaac aaaggaaggc ttatataaac tcaagtcttt tatttagaga 5760
actggcaagc tgtcaaaaac aaaaaggcct taccaccaaa ttaagtgaat agccgctata 5820
gccagcaggg ccagcacgag ggatggtgca ctgctggcac tatgccacgg cctgcttgtg 5880
actctgagag caactgcttt ggaaatgaca gcacttggtg caatttcctt tgtttcagaa 5940
tgcgtagagc gtgtgcttgg cgacagtttt tctagttagg ccacttcttt tttccttctc 6000
tcctcattct cctaagcatg tctccatgct ggtaatccca gtcaagtgaa cgttcaaaca 6060
atgaatccat cactgtagga ttctcgtggt gatcaaatct ttgtgtgagg tctataaaat 6120
atggaagctt atttattttt cgttcttcca tatcagtctt ctctatgaca attcacatcc 6180
accacagcaa attaaaggtg aaggaggctg gtgggatgaa gagggtcttc tagctttacg 6240
ttcttccttg caaggccaca ggaaaatgct gagagctgta gaatacagcc tggggtaaga 6300
agttcagtct cctgctggga cagctaaccg catcttataa ccccttctga gactcatctt 6360
aggaccaaat agggtctatc tggggttttt gttcctgctg ttcctcctgg aaggctatct 6420
cactatttca ctgctcccac ggttacaaac caaagataca gcctgaattt tttctaggcc 6480
acattacata aatttgacct ggtaccaata ttgttctcta tatagttatt tccttcccca 6540
ctgtgtttaa ccccttaagg cattcagaac aactagaatc atagaatggt ttggattgga 6600
aggggcctta aacatcatcc atttccaacc ctctgccatg ggctgcttgc cacccactgg 6660
ctcaggctgc ccagggcccc atccagcctg gccttgagca cctccaggga tggggcaccc 6720
acagcttctc tgggcagcct gtgccaacac ctcaccactc tctgggtaaa gaattctctt 6780
ttaacatcta atctaaatct cttctctttt agtttaaagc cattcctctt tttcccgttg 6840
ctatctgtcc aagaaatgtg tattggtctc cctcctgctt ataagcagga agtactggaa 6900
ggctgcagtg aggtctcccc acagccttct cttctccagg ctgaacaagc ccagctcctt 6960
cagcctgtct tcgtaggaga tcatcttagt ggccctcctc tggacccatt ccaacagttc 7020
cacggctttc ttgtggagcc ccaggtctgg atgcagtact tcagatgggg ccttacaaag 7080
gcagagcaga tggggacaat cgcttacccc tccctgctgg ctgcccctgt tttgatgcag 7140
cccagggtac tgttggcctt tcaggctccc agaccccttg ctgatttgtg tcaagctttt 7200
catccaccag aacccacgct tcctggttaa tacttctgcc ctcacttctg taagcttgtt 7260
tcaggagact tccattcttt aggacagact gtgttacacc tacctgccct attcttgcat 7320
atatacattt cagttcatgt ttcctgtaac aggacagaat atgtattcct ctaacaaaaa 7380
tacatgcaga attcctagtg ccatctcagt agggttttca tggcagtatt agcacatagt 7440
caatttgctg caagtacctt ccaagctgcg gcctcccata aatcctgtat ttgggatcag 7500
ttaccttttg gggtaagctt ttgtatctgc agagaccctg ggggttctga tgtgcttcag 7560
ctctgctctg ttctgactgc accattttct agatcaccca gttgttcctg tacaacttcc 7620
ttgtcctcca tcctttccca gcttgtatct ttgacaaata caggcctatt tttgtgtttg 7680
cttcagcagc catttaattc ttcagtgtca tcttgttctg ttgatgccac tggaacagga 7740
ttttcagcag tcttgcaaag aacatctagc tgaaaacttt ctgccattca atattcttac 7800
cagttcttct tgtttgaggt gagccataaa ttactagaac ttcgtcactg acaagtttat 7860
gcattttatt acttctatta tgtacttact ttgacataac acagacacgc acatattttg 7920
ctgggatttc cacagtgtct ctgtgtcctt cacatggttt tactgtcata cttccgttat 7980
aaccttggca atctgcccag ctgcccatca caagaaaaga gattcctttt ttattacttc 8040
tcttcagcca ataaacaaaa tgtgagaagc ccaaacaaga acttgtgggg caggctgcca 8100
tcaagggaga gacagctgaa gggttgtgta gctcaataga attaagaaat aataaagctg 8160
tgtcagacag ttttgcctga tttatacagg cacgccccaa gccagagagg ctgtctgcca 8220
aggccacctt gcagtccttg gtttgtaaga taagtcatag gtaacttttc tggtgaattg 8280
cgtggagaat catgatggca gttcttgctg tttactatgg taagatgcta aaataggaga 8340
cagcaaagta acacttgctg ctgtaggtgc tctgctatcc agacagcgat ggcactcgca 8400
caccaagatg agggatgctc ccagctgacg gatgctgggg cagtaacagt gggtcccatg 8460
ctgcctgctc attagcatca cctcagccct caccagccca tcagaaggat catcccaagc 8520
tgaggaaagt tgctcatctt cttcacatca tcaaaccttt ggcctgactg atgcctcccg 8580
gatgcttaaa tgtggtcact gacatcttta tttttctatg atttcaagtc agaacctccg 8640
gatcaggagg gaacacatag tgggaatgta ccctcagctc caaggccaga tcttccttca 8700
atgatcatgc atgctactta ggaaggtgtg tgtgtgtgaa tgtagaattg cctttgttat 8760
tttttcttcc tgctgtcagg aacattttga ataccagaga aaaagaaaag tgctcttctt 8820
ggcatgggag gagttgtcac acttgcaaaa taaaggatgc agtcccaaat gttcataatc 8880
tcagggtctg aaggaggatc agaaactgtg tatacaattt caggcttctc tgaatgcagc 8940
ttttgaaagc tgttcctggc cgaggcagta ctagtcagaa ccctcggaaa caggaacaaa 9000
tgtcttcaag gtgcagcagg aggaaacacc ttgcccatca tgaaagtgaa taaccactgc 9060
cgctgaagga atccagctcc tgtttgagca ggtgctgcac actcccacac tgaaacaaca 9120
gttcattttt ataggacttc caggaaggat cttcttctta agcttcttaa ttatggtaca 9180
tctccagttg gcagatgact atgactactg acaggagaat gaggaactag ctgggaatat 9240
ttctgtttga ccaccatgga gtcacccatt tctttactgg tatttggaaa taataattct 9300
gaattgcaaa gcaggagtta gcgaagatct tcatttcttc catgttggtg acagcacagt 9360
tctggctatg aaagtctgct tacaaggaag aggataaaaa tcatagggat aataaatcta 9420
agtttgaaga caatgaggtt ttagctgcat ttgacatgaa gaaattgaga cctctactgg 9480
atagctatgg tatttacgtg tctttttgct tagttactta ttgaccccag ctgaggtcaa 9540
gtatgaactc aggtctctcg ggctactggc atggattgat tacatacaac tgtaatttta 9600
gcagtgattt agggtttatg agtacttttg cagtaaatca tagggttagt aatgttaatc 9660
tcagggaaaa aaaaaaaaag ccaaccctga cagacatccc agctcaggtg gaaatcaagg 9720
atcacagctc agtgcggtcc cagagaacac agggactctt ctcttaggac ctttatgtac 9780
agggcctcaa gataactgat gttagtcaga agactttcca ttctggccac agttcagctg 9840
aggcaatcct ggaattttct ctccgctgca cagttccagt catcccagtt tgtacagttc 9900
tggcactttt tgggtcaggc cgtgatccaa ggagcagaag ttccagctat ggtcagggag 9960
tgcctgaccg tcccaactca ctgcactcaa acaaaggcga aaccacaaga gtggcttttg 10020
ttgaaattgc agtgtggccc agaggggctg caccagtact ggattgacca cgaggcaaca 10080
ttaatcctca gcaagtgcaa tttgcagcca ttaaattgaa ctaactgata ctacaatgca 10140
atcagtatca acaagtggtt tggcttggaa gatggagtct aggggctcta caggagtagc 10200
tactctctaa tggagttgca ttttgaagca ggacactgtg aaaagctggc ctcctaaaga 10260
ggctgctaaa cattagggtc aattttccag tgcactttct gaagtgtctg cagttcccca 10320
tgcaaagctg cccaaacata gcacttccaa ttgaatacaa ttatatgcag gcgtactgct 10380
tcttgccagc actgtccttc tcaaatgaac tcaacaaaca atttcaaagt ctagtagaaa 10440
gtaacaagct ttgaatgtca ttaaaaagta tatctgcttt cagtagttca gcttatttat 10500
gcccactaga aacatcttgt acaagctgaa cactggggct ccagattagt ggtaaaacct 10560
actttataca atcatagaat catagaatgg cctgggttgg aagggacccc aaggatcatg 10620
aagatccaac acccccgcca caggcagggc caccaacctc cagatctggt actagaccag 10680
gcagcccagg gctccatcca acctggccat gaacacctcc agggatggag catccacaac 10740
ctctctgggc agcctgtgcc agcacctcac caccctctct gtgaagaact tttccctgac 10800
atccaatcta agccttccct ccttgaggtt agatccactc ccccttgtgc tatcactgtc 10860
tactcttgta aaaagttgat tctcctcctt tttggaaggt tgcaatgagg tctccttgca 10920
gccttcttct cttctgcagg atgaacaagc ccagctccct cagcctgtct ttataggaga 10980
ggtgctccag ccctctgatc atctttgtgg ccctcctctg gacccgctcc aagagctcca 11040
catctttcct gtactggggg ccccaggcct gaatgcagta ctccagatgg ggcctcaaaa 11100
gagcagagta aagagggaca atcaccttcc tcaccctgct ggccagccct cttctgatgg 11160
agccctggat acaactggct ttctgagctg caacttctcc ttatcagttc cactattaaa 11220
acaggaacaa tacaacaggt gctgatggcc agtgcagagt ttttcacact tcttcatttc 11280
ggtagatctt agatgaggaa cgttgaagtt gtgcttctgc gtgtgcttct tcctcctcaa 11340
atactcctgc ctgatacctc accccacctg ccactgaatg gctccatggc cccctgcagc 11400
cagggccctg atgaacccgg cactgcttca gatgctgttt aatagcacag tatgaccaag 11460
ttgcacctat gaatacacaa acaatgtgtt gcatccttca gcacttgaga agaagagcca 11520
aatttgcatt gtcaggaaat ggtttagtaa ttctgccaat taaaacttgt ttatctacca 11580
tggctgtttt tatggctgtt agtagtggta cactgatgat gaacaatggc tatgcagtaa 11640
aatcaagact gtagatattg caacagacta taaaattcct ctgtggctta gccaatgtgg 11700
tacttcccac attgtataag aaatttggca agtttagagc aatgtttgaa gtgttgggaa 11760
atttctgtat actcaagagg gcgtttttga caactgtaga acagaggaat caaaaggggg 11820
tgggaggaag ttaaaagaag aggcaggtgc aagagagctt gcagtcccgc tgtgtgtacg 11880
acactggcaa catgaggtct ttgctaatct tggtgctttg cttcctgccc ctggctgcct 11940
taggg 11945
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAC 26 Primer-1
<400> 13
gcggaattca aagaagaaag ctgaaaaac 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAC 26 Primer-2
<400> 14
gcgggtacct tcaaatacta caagtgaaa 29
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAC 26-OV Primer 1
<400> 15
ggcctcgagt caagttctga gtaggtttta gtg 33
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAC 26-OV Primer 2
<400> 16
gcgcgtctct gtctagagca aacagcagaa cagtgaaaat g 41
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA-4-Fc Primer 1
<400> 17
gcgcgtctca agacaactca gagttcacca tgggtgtact gctcacacag 50
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA-4-Fc Primer 2
<400> 18
ggcccgggag ttttgtcaga agatttggg 29
<210> 19
<211> 11868
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSIN-OV-3.5-I-CTLA4-inv Vector
<400> 19
aattgctaga ctaggatccc ccgtgctgca gaaccgagcg gctattgact tcttgctcct 60
agctcacggc catggctgtg aggacattgc gggaatgtgt tgtttcaatc tgagtgatca 120
cagtgagtct atacagaaga agttccagct aatgaaggaa catgtcaata agatcggcgt 180
gaacaacgac ccaatcggaa gttggctgcg aggattattc ggaggaatag gagaatgggc 240
cgtacacttg ctgaaaggac tgcttttggg gcttgtagtt atcttgttgc tagtagtatg 300
cttgccttgc cttttgcaat gtgtatctag tagtattcga aagatgattg ataattcact 360
cggctatcgc gaggaatata aaaaaattac aggaggctta taagcagccc gaaagaagag 420
cgtaggcgag ttcttgtatt ccgtgtgata gctggttgga ttggtaattg atcggctggc 480
acgcggaata taggaggtcg ctgaatagta aacttgtaga cttggctaca gcatagagta 540
tcttctgtag ctctgatgac tgctaggaaa taatgctacg gataatgtgg ggagggcaag 600
gcttgcgaat cgggttgtaa cgggcaaggc ttgactgagg ggacaatagc atgtttaggc 660
gaaaagcggg gcttcggttg tacgcggtta ggagtcccct caggatatag tagtttcgct 720
tttgcatagg gagggggacg gattggacga accactgaat tccgcattgc agagatattg 780
tatttaagtg cctagctcga tacaataaac gccatttgac cattcaccac attggtgtgc 840
acctgggttg atggccggac cgttgattcc ctgrcgacta cgagcacatg catgaagcag 900
aaggcttcat ttggtgaccc cgacgtgatc gttagggaat acgcgctcac tggccgtcgt 960
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 1020
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 1080
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg 1140
ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct 1200
tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt 1260
ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat 1320
ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca 1380
ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac 1440
gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 1500
gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg 1560
tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 1620
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 1680
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 1740
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 1800
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 1860
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 1920
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 1980
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 2040
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 2100
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 2160
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 2220
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 2280
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2340
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2400
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2460
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 2520
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 2580
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 2640
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 2700
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 2760
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 2820
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 2880
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 2940
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3000
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3060
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3120
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3180
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3240
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3300
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3360
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 3420
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 3480
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 3540
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 3600
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 3660
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 3720
tacgccaagc gcgcattggt aattgatcgg ctggcacgcg gaatatagga ggtcgctgaa 3780
tagtaaactt gtagacttgg ctacagcata gagtatcttc tgtagctctg atgactgcta 3840
ggaaataatg ctacggataa tgtggggagg gcaaggcttg cgaatcgggt tgtaacgggc 3900
aaggcttgac tgaggggaca atagcatgtt taggcgaaaa gcggggcttc ggttgtacgc 3960
ggttaggagt cccctcagga tatagtagtt tcgcttttgc atagggaggg ggaaatgtag 4020
tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atgcttatgt aacgatgagt tagcaacatg 4080
ccttataagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt gggagtaagg tggtatgatc 4140
gtggtatgat cgtgccttgt taggaaggca acagacgggt ctaacacgga ttggacgaac 4200
cactgaattc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgc 4260
catttgacca ttcaccacat tggtgtgcac ctgggttgat ggccggaccg ttgattccct 4320
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cgttggaaga cgggaaggaa gcccgacgac tgagcggtcc accccaggcg tgattccggt 4620
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<211> 10021
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ctctccatga atggttgctt ctttccctca tgaaaaggca atttccacac tcacaatatg 3120
caacaaagac aaacagagaa caattaatgt gctccttcct aatgtcaaaa ttgtagtggc 3180
aaagaggaga acaaaatctc aagttctgag taggttttag tgattggata agaggctttg 3240
acctgtgagc tcacctggac ttcatatcct tttggataaa aagtgctttt ataactttca 3300
ggtctccgag tctttattca tgagactgtt ggtttaggga cagacccaca atgaaatgcc 3360
tggcatagga aagggcagca gagccttagc tgaccttttc ttgggacaag cattgtcaaa 3420
caatgtgtga caaaactatt tgtactgctt tgcacagctg tgctgggcag ggcaatccat 3480
tgccacctat cccaggtaac cttccaactg caagaagatt gttgcttact ctctctagac 3540
ccccaagtca aaccaactat gcaggtatgc tgacaacgct atgatgacag cctgttctga 3600
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atctacattg ttttaaacca ccagctactt cttggagagg aaaaatggct tttataagac 3780
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ggacactatg tggaagtcaa atagagaagc tttaaaaaaa cctttgggat cattctcatc 3900
ttatatttgc agcacgatac tatgacagtg ataactgaca taactgcatc aatttccttg 3960
atattttatt tgtcttaaag tacaagacat agagatggac gtaaagatgg acatatgact 4020
caggtctgga caggtccgtg gtccatgtat gataaaagag atgaagggaa ggagaatgga 4080
gactgtctaa gaagggcttc agggacgttc tgaaggcaga tttgactgaa tcagatgtac 4140
tgtccaagtc tcatatgtag caatggaaga ctgatattgg agaaatataa agaaatggct 4200
gtgaactcaa agtgaccctg aacagaaaag ggatatggag ttaaaataat ggcacagaac 4260
tgaggtttat atgatatacc atgggctgca gagggtcaga gtgctccacc atgggcctct 4320
cttgggctgc agggaacttc tgttctacac ctggaacacc tcctgccctc ctccgcactg 4380
acctcagtgt catcagggct gtttctctca cattttctca ctcacctctc ccaactacca 4440
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cgtggcgttt agtgctctgg ctcactggta cacccaacca cagggtgaga agcagcctgt 4740
tgttattcac tactcttagg acagattatg gtgaattgtt aataaaagca tttcttcata 4800
acatccaaag gaggaaatac actaaattat attttttatt tattaattac acatgcttaa 4860
ttatatatgg catggttgct ttgaaagaac cttgtcctta ctgaccagat ctgctgtttg 4920
ctgagacaaa atggctgaca attttggcca tggtggatac cttccccctt ttctgtagca 4980
ttaggacaga agttattctg gagcctgtct gacaagtcag acttgataac tttaagtatt 5040
tggaagtgtg cttttcatgc tggatgtcat ctccagaacc tccctgtctg gtaagcagtt 5100
ccctgcctta gtaagagccg aaacggtctc tcttttcctt gttatctcac caggatatta 5160
caatgtgaca ggactatctg aactacgcca acctgcaaat tccaaatata tatatatata 5220
tgtaagatat ctatacacaa attattagtg tttgattgac accagatgac agagaagtgc 5280
atctgagaaa acctattccc aatctccttt ctctttctgc agactgacat gcatttcata 5340
ggtagagata acatttactg ggaagcacat ctatcatcat aaaaagcagg caagattttc 5400
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aaaaatcagt tgatacctgt ggtgtagaca tccagcaaaa aaatattatt tgcactacca 5520
tcttgtctta agtcctcaga cttggcaagg agaatgtaga tttctacagt atatatgttt 5580
tcacaaaagg aaggagagaa acaaaagaaa atggcactga ctaaacttca gctagtggta 5640
taggaaagta attctgctta acagagattg cagtgatctc tatgtatgtc ctgaagaatt 5700
atgttgtact tttttccccc atttttaaat caaacagtgc tttacagagg tcagaatggt 5760
ttctttactg tttgtcaatt ctattatttc aatacagaac aatagcttct ataactgaaa 5820
tatatttgct attgtatatt atgattgtcc ctcgaaccat gaacactcct ccagctgaat 5880
ttcacaattc ctctgtcatc tgccaggcca ttaagttatt catggaagat ctttgaggaa 5940
cactgcaagt tcatatcata aacacatttg aaattgagta ttgttttgca ttgtatggag 6000
ctatgttttg ctgtatcctc agaaaaaaag tttgttataa agcattcaca cccataaaaa 6060
gatagattta aatattccag ctataggaaa gaaagtgcgt ctgctcttca ctctagtctc 6120
agttggctcc ttcacatgca tgcttcttta tttctcctat tttgtcaaga aaataatagg 6180
tcacgtcttg ttctcactta tgtcctgcct agcatggctc agatgcacgt tgtagataca 6240
agaaggatca aatgaaacag acttctggtc tgttactaca accatagtaa taagcacact 6300
aactaataat tgctaattat gttttccatc tctaaggttc ccacattttt ctgttttctt 6360
aaagatccca ttatctggtt gtaactgaag ctcaatggaa catgagcaat atttcccagt 6420
cttctctccc atccaacagt cctgatggat tagcagaaca ggcagaaaac acattgttac 6480
ccagaattaa aaactaatat ttgctctcca ttcaatccaa aatggaccta ttgaaactaa 6540
aatctaaccc aatcccatta aatgatttct atggcgtcaa aggtcaaact tctgaaggga 6600
acctgtgggt gggtcacaat tcaggctata tattccccag ggctcagcca gtgtctgtac 6660
atacagctag aaagctgtat tgcctttagc agtcaagctc gaaaggtaag caactctctg 6720
gaattacctt ctctctatat tagctcttac ttgcacctaa actttaaaaa attaacaatt 6780
attgtgctat gtgttgtatc tttaagggtg aagtacctgc gtgatacccc ctataaaaac 6840
ttctcacctg tgtatgcatt ctgcactatt ttattatgtg taaaagcttt gtgtttgttt 6900
tcaggaggct tattctttgt gcttaaaata tgtttttaat ttcagaacat cttatcctgt 6960
cgttcactat ctgatatgct ttgcagtttg cttgattaac ttctagccct acagagtgca 7020
cagagagcaa aatcatggtg ttcagtgaat tctggggagt tattttaatg tgaaaattct 7080
ctagaagttt aattcctgca aagtgcagct gctgatcact acacaagata aaaatgtggg 7140
gggtgcataa acgtatattc ttacaataat agatacatgt gaacttatat acagaaaaga 7200
aaatgagaaa aatgtgtgtg tgtatactca cacacgtggt cagtaaaaac ttttgagggg 7260
tttaatacag aaaatccaat cctgaggccc cagcactcag tacgcatata aagggctggg 7320
ctctgaagga cttctgactt tcacagatta tataaatctc aggaaagcaa ctagattcat 7380
gctggctcca aaagctgtgc tttatataag cacactggct atacaatagt tgtacagttc 7440
agctctttat aatagaaaca gacagaacaa gtataaatct tctattggtc tatgtcatga 7500
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tttctcttct gtctgaatgt caccactaaa atttaactcc acagaaagtt tatactacag 7620
tacacatgca tatctttgag caaagcaaac catacctgaa agtgcaatag agcagaatat 7680
gaattacatg cgtgtctttc tcctagacta catgacccca tataaattac attacttatc 7740
tattctgcca tcaccaaaac aaaggtaaaa atacttttga agatctactc atagcaagta 7800
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gctctttgaa tttccagttt tgcaagccta tcagattgtg ttttaatcag aggtactgaa 7980
aagtatcaat gaattctagc tttcactgaa caaaaatatg tagaggcaac tggcttctgg 8040
gacagtttgc tacccaaaag acaactgaat gcaaatacat aaatagattt atgaatatgg 8100
ttttgaacat gcacatgaga ggtggatata gcaacagaca cattaccaca gaattacttt 8160
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ccatagagta ccctgcatgg tactatgtac agcattccat ccttacattt tcactgttct 8280
gctgtttgct ctagacaact cagagttcac catgggctcc atcggtgcag caagcatgga 8340
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tatttcagct actattattt tcaattacag gttgttcgct ttgataaact tccaggattc 8760
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gagcagctag tgctctgcat ccagcagttg ggagaacact gttcataaga acagagaaaa 8940
agaaggaagt aacaggggat tcagaacaaa cagaagataa aactcaggac aaaaataccg 9000
tgtgaatgag gaaacttgtg gatatttgta cgcttaagca agacagctag atgattctgg 9060
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gcagcaggta ggcaggagtt ccctagagaa aagtatgagg gaattacaga agaaaaacag 9180
cacaaaattg taaatattgg aaaaggacca catcagtgta gttactagca gtaagacaga 9240
caggatgaaa aatagttttg taaacagaag tatctaacta ctttactctg ttcatacact 9300
acgtaaaact tactaagtaa taaaactaga ataacaacat ctttctttct ctttgtattc 9360
agtgtggcac atctgtaaac gttcactctt cacttagaga catcctcaac caaatcacca 9420
aaccaaatga tgtttattcg ttcagccttg ccagtagact ttatgctgaa gagagatacc 9480
caatcctgcc agtaagttgc tctaaaatct gatctgagtg tattccatgc caaagctcta 9540
ccattctgta atgcaaaaac agtcagagtt ccacatgttt cactaagaaa atttcttttt 9600
ctcttgtttt tacaaatgaa agagaggaca aataacattt ctctatcacc gacctgaaac 9660
tctacagtct tcagagaatg aatggcttgc taaaagaatg tcaaatctta ctatacagct 9720
atttcatatt acactactaa atacactata aggcatagca tgtagtaata cagtgtaaaa 9780
tagcttttta cactactata ttattaatat ctgttaattc cagtcttgca tttcacattt 9840
gcaaaacgtt ttgaaattcg tatctgaaag ctgaatactc ttgctttaca ggaatacttg 9900
cagtgtgtga aggaactgta tagaggaggc ttggaaccta tcaactttca aacagctgca 9960
gatcaagcca gagagctcat caattcctgg gtagaaagtc agacaaatgg taaggtagaa 10020
catgctttgt acatagtgag agttggttca ccctaatact gagaacttgg atatagctca 10080
gccagcgtgc tttgcgttca agcttaccag agctgttgta tgcctgttaa gcagggcata 10140
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ctctctgcgt ggttcctcaa tttttctact tcattcctca tctcctcaga gcattccttt 10320
ccctcatgct tgaaacacag atgaaagact gtgaattcta actgagatga aaacatccac 10380
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tttactagtt ctaactatta tctcatttgg tggcactcaa tgtgctttgt tcacgtcttc 12000
ataaattaat ctatctaaaa attggatgtg gttaaagcaa tttcagaaat aacatgtaca 12060
taatgtacaa ttattgatat gaacagaaca caggcatagc atattgtaat taggaggact 12120
gtagttattt tgaataggaa acacaatgta ataaatgaga attcattgaa atgttagtat 12180
gctaactcaa tctaaattat aaagataaag aggcatttaa tcacagctag atttccatca 12240
cttgtgacag acaggcatat gaatgattat gtacagctct aggaaaaaaa gtatgtagga 12300
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gtagggtcag cagaggctgg agtggatgct gcaagcgtct ctgaagaatt tagggctgac 13500
catccattcc tcttctgtat caagcacatc gcaaccaacg ccgttctctt ctttggcaga 13560
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attgctctgt caccacaccc catatagatc t 16051
<210> 23
<211> 7334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBS-OM-4.4 Vector
<400> 23
atcaagctta tcgataccgt cgacctcgag ggggggcccg gtacccagct tttgttccct 60
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ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 480
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caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 1080
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 1140
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 1200
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 1260
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 1320
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 1380
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 1440
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 1500
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 1560
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 1620
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 1680
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 1740
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 1800
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 1860
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 1920
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 1980
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 2040
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 2100
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 2160
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 2220
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 2280
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2340
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2400
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2460
gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2520
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2580
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2640
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2700
gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 2760
tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 2820
ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta atacgactca 2880
ctatagggcg aattggagct ccaccgcggt ggcggccgct ctagaactag tggatccttc 2940
ttaaaaagca gaccatcatt cactgcaaac ccagagcttc atgcctctcc ttccacaacc 3000
gaaaacagcc ggcttcattt gtctttttta aatgctgttt tccaggtgaa ttttggccag 3060
cgtgttggct gagatccagg agcacgtgtc agctttctgc tctcattgct cctgttctgc 3120
attgcctctt tctggggttt ccaagagggg gggagacttt gcgcggggat gagataatgc 3180
cccttttctt agggtggctg ctgggcagca gagtggctct gggtcactgt ggcaccaatg 3240
ggaggcacca gtgggggtgt gttttgtgca ggggggaagc attcacagaa tggggctgat 3300
cctgaagctt gcagtccaag gctttgtctg tgtacccagt gaaatccttc ctctgttaca 3360
taaagcccag ataggactca gaaatgtagt cattccagcc cccctcttcc tcagatctgg 3420
agcagcactt gtttgcagcc agtcctcccc aaaatgcaca gacctcgccg agtggaggga 3480
gatgtaaaca gcgaaggtta attacctcct tgtcaaaaac actttgtggt ccatagatgt 3540
ttctgtcaat cttacaaaac agaaccgaga ggcagcgagc actgaagagc gtgttcccat 3600
gctgagttaa tgagacttgg cagctcgctg tgcagagatg atccctgtgc ttcatgggag 3660
gctgtaacct gtctccccat cgccttcaca ccgcagtgct gtcctggaca cctcaccctc 3720
cataagctgt aggatgcagc tgcccaggga tcaagagact tttcctaagg ctcttaggac 3780
tcatctttgc cgctcagtag cgtgcagcaa ttactcatcc caactatact gaatgggttt 3840
ctgccagctc tgcttgtttg tcaataagca tttcttcatt ttgcctctaa gtttctctca 3900
gcagcaccgc tctgggtgac ctgagtggcc acctggaacc cgaggggcac agccaccacc 3960
tccctgttgc tgctgctcca gggactcatg tgctgctgga tggggggaag catgaagttc 4020
ctcacccaga cacctgggtt gcaatggctg cagcgtgctc ttcttggtat gcagattgtt 4080
tccagccatt acttgtagaa atgtgctgtg gaagcccttt gtatctcttt ctgtggccct 4140
tcagcaaaag ctgtgggaaa gctctgaggc tgctttcttg ggtcgtggag gaattgtatg 4200
ttccttcttt aacaaaaatt atccttagga gagagcactg tgcaagcatt gtgcacataa 4260
aacaattcag gttgaaaggg ctctctggag gtttccagcc tgactactgc tcgaagcaag 4320
gccaggttca aagatggctc aggatgctgt gtgccttcct gattatctgt gccaccaatg 4380
gaggagattc acagccactc tgcttcccgt gccactcatg gagaggaata ttcccttata 4440
ttcagataga atgttatcct ttagctcagc cttccctata accccatgag ggagctgcag 4500
atccccatac tctccccttc tctggggtga aggccgtgtc ccccagcccc ccttcccacc 4560
ctgtgcccta agcagcccgc tggcctctgc tggatgtgtg cctatatgtc aatgcctgtc 4620
cttgcagtcc agcctgggac atttaattca tcaccagggt aatgtggaac tgtgtcatct 4680
tcccctgcag ggtacaaagt tctgcacggg gtcctttcgg ttcaggaaaa ccttcactgg 4740
tgctacctga atcaagctct atttaataag ttcataagca catggatgtg ttttcctaga 4800
gatacgtttt aatggtatca gtgattttta tttgctttgt tgcttacttc aaacagtgcc 4860
tttgggcagg aggtgaggga cgggtctgcc gttggctctg cagtgatttc tccaggcgtg 4920
tggctcaggt cagatagtgg tcactctgtg gccagaagaa ggacaaagat ggaaattgca 4980
gattgagtca cgttaagcag gcatcttgga gtgatttgag gcagtttcat gaaagagcta 5040
cgaccactta ttgttgtttt ccccttttac aacagaagtt ttcatcaaaa taacgtggca 5100
aagcccagga atgtttggga aaagtgtagt taaatgtttt gtaattcatt tgtcggagtg 5160
ctaccagcta agaaaaaagt cctacctttg gtatggtagt cctgcagaga atacaacatc 5220
aatattagtt tggaaaaaaa caccaccacc accagaaact gtaatggaaa atgtaaacca 5280
agaaattcct tgggtaagag agaaaggatg tcgtatactg gccaagtcct gcccagctgt 5340
cagcctgctg accctctgca gttcaggacc atgaaacgtg gcactgtaag acgtgtcccc 5400
tgcctttgct tgcccacaga tctctgccct tgtgctgact cctgcacaca agagcatttc 5460
cctgtagcca aacagcgatt agccataagc tgcacctgac tttgaggatt aagagtttgc 5520
aattaagtgg attgcagcag gagatcagtg gcagggttgc agatgaaatc cttttctagg 5580
ggtagctaag ggctgagcaa cctgtcctac agcacaagcc aaaccagcca agggttttcc 5640
tgtgctgttc acagaggcag ggccagctgg agctggagga ggttgtgctg ggacccttct 5700
ccctgtgctg agaatggagt gatttctggg tgctgttcct gtggcttgca ctgagcagct 5760
caagggagat cggtgctcct catgcagtgc caaaactcgt gtttgatgca gaaagatgga 5820
tgtgcacctc cctcctgcta atgcagccgt gagcttatga aggcaatgag ccctcagtgc 5880
agcaggagct gtagtgcact cctgtaggtg ctagggaaaa tctctggttc ccagggatgc 5940
attcataagg gcaatatatc ttgaggctgc gccaaatctt tctgaaatat tcatgcgtgt 6000
tcccttaatt tatagaaaca aacacagcag aataattatt ccaatgcctc ccctcgaagg 6060
aaacccatat ttccatgtag aaatgtaacc tatatacaca cagccatgct gcatccttca 6120
gaacgtgcca gtgctcatct cccatggcaa aatactacag gtattctcac tatgttggac 6180
ctgtgaaagg aaccatggta agaaacttcg gttaaaggta tggctgcaaa actactcata 6240
ccaaaacagc agagctccag acctcctctt aggaaagagc cacttggaga gggatggtgt 6300
gaaggctgga ggtgagagac agagcctgtc ccagttttcc tgtctctatt ttctgaaacg 6360
tttgcaggag gaaaggacaa ctgtactttc aggcatagct ggtgccctca cgtaaataag 6420
ttccccgaac ttctgtgtca tttgttctta agatgctttg gcagaacact ttgagtcaat 6480
tcgcttaact gtgactaggt ctgtaaataa gtgctccctg ctgataaggt tcaagtgaca 6540
tttttagtgg tatttgacag catttacctt gctttcaagt cttctaccaa gctcttctat 6600
acttaagcag tgaaaccgcc aagaaaccct tccttttatc aagctagtgc taaataccat 6660
taacttcata ggttagatac ggtgctgcca gcttcacctg gcagtggttg gtcagttctg 6720
ctggtgacaa agcctccctg gcctgtgctt ttacctagag gtgaatatcc aagaatgcag 6780
aactgcatgg aaagcagagc tgcaggcacg atggtgctga gccttagctg cttcctgctg 6840
ggagatgtgg atgcagagac gaatgaagga cctgtccctt actcccctca gcattctgtg 6900
ctatttaggg ttctaccaga gtccttaaga ggtttttttt ttttttggtc caaaagtctg 6960
tttgtttggt tttgaccact gagagcatgt gacacttgtc tcaagctatt aaccaagtgt 7020
ccagccaaaa tcaattgcct gggagacgca gaccattacc tggaggtcag gacctcaata 7080
aatattacca gcctcattgt gccgctgaca gattcagctg gctgctccgt gttccagtcc 7140
aacagttcgg acgccacgtt tgtatatatt tgcaggcagc ctcgggggga ccatctcagg 7200
agcagagcac cggcagccgc ctgcagagcc gggcagtacc tcaccatggc catggcaggt 7260
gtcttcgtgc tgttctcttt cgtgctttgt ggcttcctcc caggtgagta actcccagag 7320
tgctgcagaa gctt 7334
<210> 24
<211> 4327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAVIJCR-A137.91.1.2 Vector
<400> 24
gccaatgtgg tacttcccac attgtataag aaatttggca agtttagagc aatgtttgaa 60
gtgttgggaa atttctgtat actcaagagg gcgtttttga caactgtaga acagaggaat 120
caaaaggggg tgggaggaag ttaaaagaag aggcaggtgc aagagagctt gcagtcccgc 180
tgtgtgtacg acactggcac catggctttg acctttgcct tactggtggc tctcctggtg 240
ctgagctgca agagcagctg ctctgtgggc tgcgatctgc ctcagaccca cagcctgggc 300
agcaggagga ccctgatgct gctggctcag atgaggagaa tcagcctgtt tagctgcctg 360
aaggataggc acgattttgg ctttcctcaa gaggagtttg gcaaccagtt tcagaaggct 420
gagaccatcc ctgtgctgca cgagatgatc cagcagatct ttaacctgtt tagcaccaag 480
gatagcagcg ctgcttggga tgagaccctg ctggataagt tttacaccga gctgtaccag 540
cagctgaacg atctggaggc ttgcgtgatc cagggcgtgg gcgtgaccga gacccctctg 600
atgaaggagg atagcatcct ggctgtgagg aagtactttc agaggatcac cctgtacctg 660
aaggagaaga agtacagccc ctgcgcttgg gaagtcgtga gggctgagat catgaggagc 720
tttagcctga gcaccaacct gcaagagagc ttgaggtcta aggagtaaaa agtctagagt 780
cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 840
acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 900
tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 960
tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 1020
ggtaaaatcg ataaggatcc gtcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc 1080
cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct tctttatcat 1140
gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1200
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 1260
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 1320
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1380
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1440
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1500
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 1560
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 1620
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 1680
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 1740
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 1800
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 1860
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 1920
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 1980
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 2040
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 2100
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 2160
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 2220
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 2280
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 2340
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 2400
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 2460
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 2520
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2580
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 2640
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 2700
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 2760
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 2820
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 2880
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 2940
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 3000
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 3060
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgcgccc tgtagcggcg 3120
cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 3180
tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 3240
gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 3300
accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 3360
tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 3420
gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 3480
cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 3540
tattaacgtt tacaatttcc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat 3600
cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc ccaagctacc atgataagta agtaatatta 3660
aggtacggga ggtacttgga gcggccgcaa taaaatatct ttattttcat tacatctgtg 3720
tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact aacatacgct ctccatcaaa acaaaacgaa 3780
acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca gaacatttct 3840
ctatcgatag gtaccgagct cttacgcgtg ctagccccga tgtacgggcc agatatacgc 3900
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 3960
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 4020
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 4080
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 4140
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 4200
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 4260
tattagtcat cgctattacc atgcatggct ttgacctttg ccttactggt ggctctcctg 4320
gtgctta 4327
<210> 25
<211> 244
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The RRE (rev responsive element) sequence
<400> 25
aattgaggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg 60
tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac 120
aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc 180
aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg 240
gtac 244
<210> 26
<211> 158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The ALV CTE (constitutive transport element) sequence
<400> 26
aatgtgggga gggcaaggct tgcgaatcgg gttgtaacgg gcaaggcttg actgagggga 60
caatagcatg tttaggcgaa aagcggggct tcggttgtac gcggttagga gtcccctcag 120
gatatagtag tttcgctttt gcatagggag ggggaaat 158
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p10.0-OM-IFN-1 Primer
<400> 27
ggcgtcgacg gatccgttaa ccctagaact agtggatctc tgcccttgtg ctgac 55
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p10.0-OM-IFN-2
<400> 28
ggcctcgagc ctagactttt tactccttag a 31
<210> 29
<211> 346
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALV vector 5' LTR sequence
<400> 29
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg cttatgtaac gatgagttag 60
caacatgcct tataaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtggg agtaaggtgg 120
tatgatcgtg gtatgatcgt gccttgttag gaaggcaaca gacgggtcta acacggattg 180
gacgaaccac tgaattccgc attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacaa 240
taaacgccat ttgaccattc accacattgg tgtgcacctg ggttgatggc cggaccgttg 300
attccctgrc gactacgagc acatgcatga agcagaaggc ttcatt 346
Claims (27)
- 외인성 누클레오티드 서열을 조류에 도입시켜 유전자이식(transgenic) 조류를 생성하는 단계로서, 상기 외인성 누클레오티드 서열이 레트로바이러스로부터 유래된 선택가능한 마커를 지니지 않는 자가-불활성화 (SIN) 벡터에 함유된 프로모터에 작동적으로 연결된 외인성 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 외인성 누클레오티드 서열을 조류의 게놈에 통합시켜 외인성 단백질이 조류의 자궁관 세포에서 발현되도록 하고, 자궁관의 내강으로 분비되도록 하며, 조류가 낳은 단단한 껍질의 알에 침착되도록 하는 단계;조류가 낳은 알로부터 외인성 단백질을 함유하는 난백을 수득하는 단계; 및난백에 침착된 외인성 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는, 유전자이식 조류에서 외인성 단백질을 생성하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로모터 성분이 자궁관-특이적 프로모터인 방법.
- 제 1항에 있어서, 조류가 닭, 칠면조 및 메추라기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로모터 성분이 조류에 외인성인 코딩 서열에 결합되어 있는 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로모터 성분이 조류 오보뮤코이드 프로모터 성분인 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로모터 성분이 조류 오브알부민 프로모터 성분인 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로모터 성분이 조류 리소자임 프로모터 성분인 방법.
- 제 1항에 있어서, 외인성 단백질이 치료용 단백질인 방법.
- 제 1항에 있어서, 외인성 단백질이 융합 단백질인 방법.
- 제 1항에 있어서, 외인성 단백질이 에리트로포이에틴, 과립구 대식구 집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론(IFN), 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA4)-Fc 융합 단백질, 성장 호르몬, 시토킨, 리소자임, β-카제인, 알부민, α-1 항트립신, 항트롬빈 III, 콜라겐, 인자 X, 섬유소원, 락토페린, 단백질 C, 조직-형 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 소마토트로핀, 키모트립신, 항체. 면역독소, 인자 VIII, b-도메인 결실된 인자 VIII, 인자 VIIa, 인자 IX, 항응고제, 히루딘, 알테플라제, 레테플라제, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), tPA - 5개 도메인 중 3개가 결실됨, 인슐린, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글라르긴, 지속 인슐린 유사체, 글루카곤, 티로이드-자극 호르몬(tsh), 폴리트로핀-베타, 난포-자극 호르몬(fsh), 혈소판-유래 성장 인자(pdgh), IFN-베타, IFN-알파 1, IFN-알파 2, IFN-베타, IFN-베타 1b, IFN-베타 1a, IFN-감마, IFN-감마 1b, 인터류킨(IL)-2, IL-11, B형간염-바이러스 표면 항원(HBsAg), dornase-알파 DNase, 베타 글루코세레브로시다제, 종양 괴사 인자(TNF)-알파, IL-2-디프테리아 독소 융합 단백질, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-IgG 단편 융합 단백질, 라로니다제, DNase, 알레파셉트, 토시투모맵, 뮤린 모노클로날 항체, 알렘투주맵, 라스부리카제, 아갈시다제 베타, 테리파라티드, 부갑상선 호르몬 유도체, 아달리무맵, 아나킨라, 네시리티드, 인간 b-형 나트륨이뇨 펩티드 (hbnp), 집락 자극 인자, 페그비소만트, 인간 성장 호르몬 수용체 길항제, 재조합 활성화된 단백질 c, 오말리주맵, 면역글로불린 E 차단제, 이브리투모맵 티욱세탄, 부신겉질자극 호르몬(ACTH), 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 색소 호르몬, 소마토메딘, 황체형성 호르몬, 융모 생식샘자극호르몬, 시상하부 방출 인자, 에타너셉트(etanercept), 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 갑상샘 자극 호르몬, 인간 면역글로불린 폴리펩티드 D 영역, 인간 면역글로불린 폴리펩티드 J 영역, 인간 면역글로불린 폴리펩티드 C 영역, 인간 면역글로불린 경쇄, 인간 면역글로불린 중쇄, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 레트로바이러스가 조류 백혈증 바이러스 벡터 (ALV), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 레트로바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV) 및 렌티바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 선택가능한 마커를 지니지 않는 통합된 자가-불활성화(SIN) 벡터에 함유된 외인성 코딩 서열에 결합된 프로모터 성분을 포함하는 외인성 누클레오티드 서열을 함유하는 자궁관 세포를 포함하는 유전자이식 조류로서, 프로모터 성분이 자궁관 세포에서 외인성 코딩 서열의 발현을 유도하고 자궁관 세포에서 생성된 외인성 단백질이 자궁관 세포로부터 자궁관의 내강으로 분비되어 유전자이식 조류가 낳은 알의 난백에 침착되는, 유전자이식 조류.
- 제 12항에 있어서, 조류가 닭인 유전자이식 조류.
- 제 12항에 있어서, 자궁관 세포가 대롱샘 세포인 유전자이식 조류.
- 제 12항에 있어서, 프로모터 성분이 조류 오보뮤코이드 프로모터 성분인 유전자이식 조류.
- 제 12항에 있어서, 프로모터 성분이 조류 오브알부민 프로모터 성분인 유전자이식 조류.
- 제 12항에 있어서, 프로모터 성분이 조류 리소자임 프로모터 성분인 유전자이식 조류.
- 제 1항에 있어서, 상기 프로모터 성분이 하기를 함유하는 누클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자와 90% 동일한 핵산을 포함하는 방법:a) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분, 및엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분;b) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,인트론 A,엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분, 및3' UTR;c) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,인트론 A, 및엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분;d) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분, 및3' UTR;e) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,인트론 A,엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분, 및서열번호 22의 누클레오티드 서열 13576 내지 15163에 개시된 3' UTR / DHS A;f) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,엑손 1로부터 5' UTR-3' 부분, 및서열번호 22의 누클레오티드 서열 13576 내지 15163에 개시된 3' UTR / DHS A;g) DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,인트론 A,엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분,부분 3' UTR, 및RRE (Rev 반응 엘리먼트); 및h) ALV CTE,DHS I 및 II을 포함하는 3.5 kb OV 단편,엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분,인트론 A,엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분, 및부분 3' UTR;상기에서,3.5 kb OV 단편은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 3199 내지 6659이고;엑손 L로부터의 5' UTR-5' 부분은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 6659 내지 6705이고;엑손 1로부터의 5' UTR-3' 부분은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 8295 내지 8311이고;3' UTR은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 13576 내지 14209이고;부분 3' UTR은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 13576 내지 13996이고;인트론 A는 서열번호 22의 누클레오티드 서열 6706 내지 8294이고;엑손 L은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 6659 내지 6705이고;엑손 1은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 8295 내지 8478이고;DHS III은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 3253 내지 3559이고;DHS II는 서열번호 22의 누클레오티드 서열 5629 내지 6009이고;DHS I은 서열번호 22의 누클레오티드 서열 6359 내지 6659이고;RRE는 서열번호 25에 개시되어 있고;ALV CTE는 서열번호 26에 개시되어 있다.
- 제 18항에 있어서, 프로모터 성분이 제 18항에 기재된 누클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자와 95% 동일한 핵산을 포함하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 프로모터 성분이 제 18항에 기재된 누클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자와 99% 동일한 핵산을 포함하는 방법.
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