JP2000506865A

JP2000506865A - インターフェロンをコードする遺伝子の標的を定めた送達

Info

Publication number: JP2000506865A
Application number: JP9532785A
Authority: JP
Inventors: シー．チョウ，ヘンリー; ジェイ．カーロー，デニス
Original assignee: ジイミューンリスポンスコーポレイション
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2000-06-06
Also published as: EP0904373A1; US20040002466A1; US6331525B1; AU2322397A; WO1997033998A1; AU728146B2; CA2248538A1; US6069133A

Abstract

(57)【要約】核酸結合剤と細胞表面上の成分に結合するリガンドとの結合体に遊離可能に結合されたインターフェロンをコードする遺伝子を含む分子複合体。好適具体例において、この遺伝子は、ヒトＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γをコードする。この複合体を用いて、イン・ビボ又はイン・ビトロにおいて、選択した細胞におけるインターフェロンの標的を定めた発現を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】インターフェロンをコードする遺伝子の標的を定めた送達発明の背景インターフェロン（ＩＦＮ）の産生は、ウイルス、微生物、腫瘍及び他の抗原に対する免疫系の非特異的防護の一つである。細胞を直接保護するのではなく、ＩＦＮは、周囲の細胞を、それらの細胞上のＩＦＮ特異的レセプターに結合することにより活性化し、それにより、細胞内エフェクター蛋白質の産生を活性化する（Baron等(1994)Antiviral Res.24:97-110）。次いで、これらのエフェクター蛋白質は、種々の免疫応答（例えば、抗腫瘍、抗ウイルス及び免疫調節性の応答）を媒介する。インターフェロンは、蛋白質分子の３つのファミリー、α、β及びγよりなっており、これらは、それらを誘導する因子及びそれらを産生する細胞型が異なっている。一つのヒトＩＦＮ−β遺伝子と一つのヒトＩＦＮ−γ遺伝子しか存在しないのに、少なくとも１７の異なるヒトＩＦＮ−α遺伝子が存在し、その各々が特異的免疫機能の調節において別々の役割を演じることはありそうなことである。これらの１７の遺伝子の内に、遺伝子のサブグループ（変異物）もある。例えば、ヒトＩＦＮ−α２に関して、３つのサブ遺伝子、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ− α２ｂ及びＩＦＮ−α２ｃがある。ヒトＩＮＦ−αは、幾つかの型の白血球（例えば、Ｂリンパ球及びマクロファージ）において、外来細胞、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、細菌細胞及びウイルスエンベロープにより誘導される。ＩＦＮの第２の型であるＩＦＮ−βは、繊維芽細胞、上皮細胞及びマクロファージを含む多くの体細胞において、ウイルスその他の外来の核酸により誘導される。ＩＦＮの第３の型であるＩＦＮ−γは、Ｔ細胞において、Ｔ細胞が特異的レセプターを有する外来抗原により誘導される。前述のＩＦＮ遺伝子の殆どの配列は、それらが天然に存在するならば、刊行されており、多くは、American Type Culture Coll ection（ＡＴＣＣ）（メリーランド、Rockville在）に寄託されている。特に、ヒトＩＦＮ−α１及びＩＦＮ−α２の配列は、Weber等(1987) EMBO J.6:591-598に刊行されている。ヒトＩＦＮ−α２ｂの配列は、Streuli等( 1980)Science 209:1343-1347に刊行されている。ＩＦＮは、広範囲の治療用途を有する（Baron等(1991)JAMA 266:1375-1383）。最近の進歩は、食品医薬品局（ＦＤＡ）に、ヘアリーセル白血病、尖圭コンジローム、ＡＩＤＳ患者におけるカポジ肉腫及びＣ型肝炎感染の臨床治療におけるＩＦＮの使用を認めさせた。これらのＦＤＡが認可した臨床適用に加えて、ＩＦＮ−αは、他の国において、基底細胞癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫、喉頭乳頭腫、骨髄性白血病、慢性デルタ肝炎感染及び慢性Ｂ型肝炎感染を含む約１０の他の病気について臨床的に評価されてきた（Baron等(1991) 、前出、1379）。ＩＦＮ療法の利用が特に有望な一つの領域は、慢性のウイルス感染例えばＨＩＶ及び肝炎ウイルス感染の治療にある。臨床的に頑固なＢ型肝炎（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎（ＨＢＣ）感染を外因性のＩＦＮの投与により阻止し得るということが示されている（Hoofnagle(1992)，Interferon:Principles and Medical Applica tions （Baron等、(編)),433-462。例えば、慢性のＨＢＶ感染した患者に対して行なわれた最近の臨床研究は、５×１０⁶ＵのＩＦＮ−αの１６週間にわたる投与がＨＢＶウイルスＤＮＡ及びＢ型肝炎抗原の消失を生じることを示した（Baro n等(1991)、前出、1379）。慢性のウイルス感染におけるＩＦＮの自然の役割は完全には決定されていないが、産生部位、感染部位に対する分布、感染部位における濃度及びＩＦＮに対するウイルスの感受性等の多くの変数がそのイン・ビボでの産生及び機能を支配している。ＩＦＮ療法は、現在、外因性ＩＦＮを、一般に静脈注射により、一定の頻度で（例えば、毎日）、患者に投与することを含む。標的組織（例えば、感染細胞の周囲の組織）におけるＩＦＮの十分な濃度を達成するためには、高投薬量が、しばしば必要とされる。更に、患者は、しばしば、ＩＦＮの全身的送達と関連した種々の副作用及び／又は末梢毒性を経験する。ＩＦＮ置換療法の改良型は、大いに治療価値を有するであろう。発明の要約本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）をコードする遺伝子の選択した細胞への標的を定めた送達のための分子複合体を提供する。この複合体は、核酸結合剤（例えば、ポリカチオン）及び標的細胞表面上の成分に結合して結果的にその細胞により内在化されるリガンドよりなるキャリアー分子に分離可能に結合されたＩＦＮ蛋白質好ましくはヒトＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γをコードする遺伝子を含む。好適具体例において、この遺伝子は、ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする。この分子複合体は、この分子複合体のキャリアー蛋白質により種々の細胞を標的とすることができる。一具体例において、このキャリアーのリガンドは、肝細胞上のアシアロ糖蛋白質レセプターに結合する。他の具体例において、このリガンドは、Ｔ及びＢ細胞上のＣＤ３又はＣＤ５レセプターに対する抗体である。この分子複合体を、選択した細胞にイン・ビボで送達して、ＩＦＮ療法に応答する広範囲の病気を治療することができる。或は、この分子複合体を、選択した細胞にイン・ビトロ（培養中）で送達して、従来のＩＦＮ蛋白質療法において外因性蛋白質として患者に投与することのできる組換えＩＦＮを生成することができる。図面の簡単な説明図１は、ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする種々のプラスミドを注入されたマウスにおけるＩＦＮ−α発現レベル（ｐｇ／ｍｌＩＦＮ−α）のグラフ表示である。これらのプラスミドをポリリジン及び肝細胞上に存在するアシアロ糖蛋白質レセプターに結合するアシアロオロソムコイドのキャリアー分子に複合体化されたプラスミドから作られた標的を定めた分子複合体の形態で投与した。図２は、ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードするプラスミドｐＪ７ΩＩＦＮαの種々の投薬量（１０μｇ、２５μｇ及び５０μｇ）を注射されたマウスにおけるＩＦＮ−α発現レベル（ｐｇ／ｍｌＩＦＮ−α）のグラフ表示である。発現レベルを、注射後２４、４８及び９６時間にて測定した。このプラスミドを、ポリリジンと肝細胞上に存在するアシアロ糖蛋白質レセプターに結合するアシアロオロソムコイドとのキャリアー分子と複合体化されたプラスミドよりなる標的を定めた分子複合体の形態で投与した。図３は、ＣＭＶプロモーターにより発現されるヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子とその下流に続くＳＶ４０小型ｔイントロン（ＩＶＳ）及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む発現プラスミドｐＪ７ΩＩＦＮαのマップを示している。図４は、ＳＶ４０初期プロモーターにより発現されるヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子とその下流に続くＳＶ４０小型ｔイントロン（ＩＶＳ）及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む発現プラスミドｐＳＶＩＦＮαのマップを示している。図５は、ＳＶ４０初期プロモーターにより発現されるヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子とその下流に続くＨＢＶ配列（(a)エンハンサーＩ及びＩＩ、(b)Ｘ遺伝子、及び(c)ＨＢＶポリアデニル化シグナルを含有）とその下流に続くＳＶ４０小型ｔイントロン（ＩＶＳ）及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む発現プラスミドｐＳＶＩＦＮαＲＶのマップを示している。図６は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーにより発現されるヒトＩＦＮ−α ２ｂ遺伝子とその下流に続くＳＶ４０小型ｔイントロン（ＩＶＳ）及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む発現プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαのマップを示している。このプラスミドは、ｐＪ７ΩＩＦＮα（図３）と同じであるが、但し、ＡＵＧ開始コドンに隣接する領域は、発現を最適化するように改変してある。図７は、発現プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢのマップを示している。このプラスミドは、ｐＪ７ΩｈＩＦＮα（図６）と同じであるが、但し、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーは、２コピーのアルファ−１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーと結合したチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターにより置換されている。更に、ＳＶ４０小型ｔイントロン（ＩＶＳ）は、インターフェロン遺伝子の直ぐ上流に位置されている。図８は、発現プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮα−非ＳＢのマップを示している。このプラスミドは、図５に示したｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢと同じであるが、但し、ＩＦＮ遺伝子の３’非コード配列の領域が存在しない。図９は、ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードするプラスミドｐＪ７ｈΩＩＦＮα、ｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢ及びｐＪ７ｈΩＩＦＮα−非ＳＢの１０μｇを注射されたマウスにおけるＩＦＮ−α発現レベル（ｐｇ／ｍｌＩＦＮ−α）のグラフ表示である。グラフ上の各点は、４匹のマウスから得られた値の平均を表している。発現レベルを、注射後３日毎に測定した。プラスミドを、ポリリジン及びアシアロオロソムコイドのキャリアー分子に複合体化したプラスミドよりなる標的を定めた分子複合体の形態にて投与した。ＩＦＮ−αの血清濃度を、実施例に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。グラフの影を付けた領域は、筋肉注射の４〜１２時間後の患者におけるピークのＩＦＮ−α血清濃度の領域を示している。図１０は、ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードするプラスミドｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢの１０μｇを注射されたマウスにおけるＩＦＮ−α発現レベル（ｐｇ／ｍｌＩＦＮ−α）のグラフ表示である。発現レベルを、注射後１８５日まで、種々の時点において測定した。各実験群（第１、２及び３群）において用いたマウスの数を図面の中の説明文中に列記した（ｎ＝として）。第１及び２群には、ポリリジン及びアシアロオロソムコイドのキャリアー分子と複合体化したプラスミドよりなる標的を定めた分子複合体の形態のプラスミドを投与した。第３群には、ポリリジン及びラクトースのキャリアー分子と複合体化したプラスミドよりなる標的を定めた分子複合体の形態のプラスミドを投与した。各群のプロットの印は、その群についての、各時点における平均血清濃度を表している。合成の発現プロフィル（太い実線）は、最後の共通時点（１５３日目）までの３つのすべての群（合計４匹のマウス）から得られた値の平均を表している。ＩＦＮ−αの血清濃度を、具体例に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。グラフの影を付けた領域は、慢性ＨＢＶに対する標準的な蛋白質療法を受けた患者における筋肉注射の４〜１２時間後のピークＩＦＮ−α血清濃度（１００〜６００ｐｇ／ｍｌ）の範囲を示している。図１１は、天然のヒトＩＦＮ−α２（SEQ ID NO:１）及びＩＦＮ−α１（SEQ ID NO:２）の整列させたアミノ酸配列を示している。これらの２つの配列間で異なる２８アミノ酸に下線を引いてある。２つの矢印は、ＩＦＮ−α２蛋白質において、図１２に示したように、（マウスにおいて組換えにより発現された場合の）生物学的活性を、未置換のＩＦＮ−α２蛋白質と比較して増大させるために行なわれた２つのアミノ酸置換を示している。これらの２つのアミノ酸置換は、ＩＦＮ−α１配列（図に示してある）に由来し、パネルＢに示したＩＦＮ−２α −Ｋ１２１Ｒ１２５に対応する。パネルＢは、ヒトＩＦＮ−α２ｂの抗ウイルス活性（マウス細胞におけるもの）に対する種々の単一アミノ酸置換（SEQ ID NO: ３〜１２）の効果を示している。矢印は、パネルＡにおいて矢印で示された２つのアミノ酸置換を含むＩＦＮ−α２ｂハイブリッドを示している。「増大率（En hancement Factor）」は、示したアミノ酸の置換に際して抗ウイルス活性が増大する率である。下段に記載したアミノ酸は、ＩＦＮ−α２に由来するものである。上段に記載したアミノ酸は、ＩＦＮ−α１の残基を表している。図１２は、図１１に示したＩＦＮ−２α−Ｋ１２１Ｒ１２５ハイブリッド蛋白質のＩＦＮ−α活性の増大を、このハイブリッドをコードするプラスミドを注射されたマウスにおける増大されたＭＨＣクラスＩ抗原誘導により測定して示している。このハイブリッドをコードするプラスミドは、プラスミドｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢ（図７）と同じであるが、但し、ヒトＩＦＮ−α２ｂコード配列は残基１２１のＡｒｇ（Ｒ）の代わりにＬｙｓ（Ｋ）をコードし、残基１２５のグルタミン（Ｑ）の代わりにＡｒｇ（Ｒ）をコードするように改変された。ポリリジン及びアシアロオロソムコイドのキャリアー分子と複合体化されたプラスミドよりなる標的を定めた分子複合体の形態の１０μｇのプラスミドをマウスに注射した。注射の１０日後に、単離脾臓細胞のＦＡＣＳ分析のために脾臓を取り出した。パネルＡ〜Ｅは、ＦＡＣＳ分析の結果を示している。パネルＢ〜Ｅの影を付けた領域は、対照（パネルＡ）と比較してのＭＨＣクラスＩ抗原染色性細胞の増加を示す右側シフトを示している（これは、プラスミドＩＦＮ−２α−Ｋ１２１Ｒ１２５ハイブリッド蛋白質を注射されたマウスにて生じている）。発明の詳細な説明本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）をコードする遺伝子を含む可溶性分子複合体及びこの複合体を用いて遺伝子を選択的に標的細胞に送達してその遺伝子のイン・ビボ又はイン・ビトロでの発現を得る方法を提供する。この複合体のＩＦＮ遺伝子は、遺伝子結合剤及び標的細胞表面上の成分に結合するリガンドを含むキャリアー分子に遊離可能に結合される。この複合体のリガンドの細胞への結合に続いて、この複合体は、細胞により内在化される（例えば、エンドサイトーシスにより）。すべての場合において、この複合体は、イン・ビボ投与された場合に生理的バリヤーを通過して標的細胞又は組織に到達し得るだけ溶液に可溶性である。Ｉ．インターフェロン遺伝子この分子複合体の遺伝子は、任意の形態のＩＦＮをコードすることができる。好適具体例において、この遺伝子は、ＩＦＮのヒト型をコードする。これは、ヒトＩＦＮの３つの公知の型、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−ベータ及びＩＦＮ−γを含む。この遺伝子は又、例えば、コードされる蛋白質の抗原性を減じるために、キメラＩＦＮ遺伝子であってもよい。ヒトＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γをコードする公知の遺伝子は１つしか存在しないが、少なくとも７つの公知のヒトＩＦＮ−αをコードする遺伝子がある（Baron等、前出）。本発明は、これらの公知のＩＦＮ遺伝子の何れかの標的を定めた送達を包含し、該遺伝子の多くは、American Type Culture Collection （メリーランド、Rockville在）より入手することができる。更に、これらの遺伝子の多くのヌクレオチド配列は、刊行されており、それ故、公衆が入手することができる。特に、ヒトＩＦＮ−α１の配列は、Weber等(1987)EMBO J.6:591-598に刊行されている。ヒトＩＦＮ−α２の配列は、Weber等(1987)、前出及びStreuli等 (1980)Science 209:1343-1347（ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする配列）に刊行されている。この複合体における使用に好適な遺伝子は、ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードし、これは、ＡＴＣＣから、プラスミドｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ（ＡＴＣＣ寄託番号５３３６９）として入手可能である。この遺伝子は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ又はこれらのアナログであってよく、ＩＦＮを、発現に適した形態で、好ましくは、標的細胞によるコードされたインターフェロン蛋白質のプロセッシング及び分泌にも適した形態でコードする配列を含む。従って、この遺伝子は、ＩＦＮをコードする配列だけでなく、プロモーター及びエンハンサーを含む遺伝子の転写に必要な遺伝子調節配列をも含む。これらの転写調節エレメントは、天然の配列であってよく、或は、それらは、外因性配列例えば他の真核生物又はウイルス遺伝子由来のものであってよい。例えば、適当なプロモーターには、広範囲のウイルス性プロモーター例えばＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターが含まれる。転写調節エレメントには、遺伝子の構成的転写又は誘導可能な転写へ導く配列も含まれる。転写調節配列は、当分野において周知であり、Goeddel，Gene expression Technology:Me thods in Enzymology ，185頁、Academic Press，カリフォルニア、San Diego在(1990)に記載されている。遺伝子から転写されたｍＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を増大させるために、ＩＦＮ蛋白質をコードする配列に隣接する５’及び／又は３’非翻訳配列を除去し、改変し又は他の遺伝子からの配列で置換することができる。一具体例において、ヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子（Streuli等(1980)、前出）を、ＥｃｏＲＩ制限部位からＳＰＥ−１制限部位までの３’非コード配列の領域を除去することにより改変する。ＩＦＮ蛋白質をコードする配列は又、その蛋白質の細胞内交通及び／又は分泌を可能にする適当なシグナル配列をも含む。このＩＦＮ蛋白質をコードする配列は、更に、この蛋白質の適当な翻訳後修飾例えばリン酸化、グリコシル化及びファルネシル化に必要な特異的配列を含むことができる。一具体例において、ＩＦＮ蛋白質をコードする配列を、前述の遺伝子調節及びプロセッシング配列（例えば、プロモーター及びエンハンサーエレメント）の何れか又はすべてを含む発現ベクター例えばプラスミド又は可動遺伝性因子に挿入する。この複合体中での使用に適した発現ベクターは、ｐＪ７Ω（Morgenstern 等(1990)Nucl.Acids Res.18(4):1068）である。このベクターは、遺伝子の転写を駆動するのに適当なプロモーター例えばＣＭＶプロモーター又はチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（Hayashi等(1993)Molec.Endocrinol.7:10 49-1060）を含むことができる。このベクターは又、適当なエンハンサー例えばＣＭＶエンハンサー又はアルファ−１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー（Rouet等(1992)J.Biol.Chem.267:20765-20773）をも含むことができる。このベクターは又、遺伝子転写物の発現を増大させ、細胞内交通を指図する適当なイントロン及び／又はポリアデニル化シグナル例えばＳＶ４0小型ｔイントロン（ＩＶＳ）及びＳＶ４0ポリアデニル化シグナルをも含むことができる。ｐＪ７Ωを主鎖として採用するものを含むこの発明での使用に適した幾つかのプラスミド構築物を、図３〜８に示してある。しかしながら、当業者は、公知のＩＦＮ遺伝子を細胞による発現のために挿入することのできる他のプラスミドを公知の材料及び技術を用いて構築することができる。従って、任意の及びすべてのかかる構築物は、本発明の範囲内に包含されるものである。ＩＩキャリアー分子ＩＦＮ遺伝子を、核酸結合剤及び細胞表面上の成分に結合するリガンドよりなるキャリアー分子に遊離可能に結合し、それにより、ポリヌクレオチド−キャリアー複合体を形成する。このポリヌクレオチド−キャリアー複合体のキャリアー分子は、次の少なくとも２つの機能・を遂行する：（１）それは、ＩＦＮをコードする遺伝子（例えば、発現プラスミド中）に、標的細胞による内在化の前に、細胞外でポリヌクレオチドの有意の分離が起きるのを阻止するだけ十分安定な仕方で結合し、そして（２）それは、標的細胞表面上の成分に結合しそれによりポリヌクレオチド−キャリアー複合体が細胞により内在化される。一般に、このキャリアーは、細胞特異的なリガンド及び例えば結合体化したカチオン性部分よりなる。この細胞特異的なリガンドは、細胞表面成分例えば蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、脂質又はこれらの組合せに結合する。それは、典型的には、細胞表面レセプターに結合する。カチオン性部分は、例えば、静電気的に、ポリヌクレオチドに結合する。キャリアー分子のリガンドは、細胞表面レセプターに結合する任意の天然及び合成のリガンドであってよい。このリガンドは、細胞表面成分により認識されるだけ十分に露出された官能基を有する蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、糖ペプチド又は糖脂質であってよい。それは又、生物的有機体例えばウイルス、細胞（例えば、哺乳動物、細菌、原生動物の細胞）の成分であってもよい。或は、リガンドは、細胞表面成分に結合する抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆ(ａｂ')₂フラグメント）又はそのアナログ（例えば、一本鎖抗体）を含むことができる（例えば、Chen等(1994)FEBS Letters 338:167-169,Ferkol等(1993 )J.Clin.Invest.92:2394-2400及びRojanasakul等(1994)Pharmaceutical Res.11( 12):1731-1736参照）。かかる抗体は、標準的手順で生成することができる。このキャリアーの形成に有用なリガンドは、標的とされる特定の細胞によって変化する。肝細胞を標的とするためには、ガラクトース末端を有する炭水化物（例えば、天然の糖蛋白質から得られる炭水化物トリー）を含む蛋白質及びポリペプチドを用いることができる。例えば、末端ガラクトース残基を含むか酵素処理により末端ガラクトース残基を（例えば、化学的又は酵素的脱シアル化により）露出させることのできる天然糖蛋白質を用いることができる。一具体例において、このリガンドは、アシアロ糖蛋白質例えばアシアロオロソムコイド、アシアロフェチュイン又は脱シアル化した水疱性口内炎ウイルスである。或は、肝細胞を標的とするのに適したリガンドを、ガラクトース末端を有する炭水化物（例えば、ガラクトース、マンノース、ラクトース、アラビノガラクタン等）をガラクトースを有しない蛋白質又はポリペプチド（例えば、ポリカチオン）に、例えば還元ラクトサミネーションにより化学結合させることにより調製することができる。露出された末端ガラクトース残基を有する他の広範囲の合成糖蛋白質を形成する方法（そのすべては、肝細胞を標的とするために利用することができる）は、例えば、Chen等(1994)Human Gene Therapy 5:429-435及び Ferkol等(1993)FASEB 7:1081-1091（ポリカチオン性ヒストン及びアルブミンのＥＤＣを用いるガラクトシル化）；Perales等(1994)PNAS 91:4086-4090及び Midoux等(1993)Nucleic Acids Research 21(4):871-878（α−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネート及び４−イソチオシアネートフェニルβ−Ｄ −ラクトシドを用いるポリリジンのラクトシル化及びガラクトシル化）； Martinez-Fong(1994)Hepatology 20(6):1602-1608（シアノボロヒドリドナトリウムを用いるポリリジンのラクトシル化及びＳＰＤＰを用いるアシアロフェチュイン−ポリリジン結合体の製造）；及びPlank等(1992)Bioconjugate Chem.3: 533-539（４つの末端ガラクトース残基の合成キャリアーペプチドへの還元的カップリングとそれに続くＳＰＤＰを用いるこのキャリアーのポリリジンへの結合）に記載されている。この複合体のキャリアー成分は、ポリヌクレオチド−キャリアー複合体を他の細胞特に自然にＩＦＮ蛋白質を生成する細胞の表面レセプターを標的とするために、他の型のリガンドを含むことができる。例えば、マンノースを用いて、自然にＩＦＮ−αを生成するクッパー細胞及びマクロファージを標的とすることができる。マンノース６−リン酸糖蛋白質を用いて、自然にＩＦＮ−ベータを生成する繊維芽細胞を標的とすることができる。肺胞界面活性物質例えばプロテインＡを用いて、自然にＩＦＮ−βを生成する上皮細胞を標的とすることができる（例えば、Ross等(1995)Human Gene Therapy 6:31-40参照）。抗分泌成分抗体も又、自然にＩＦＮ−βを生成する肺及び肝臓の上皮細胞上のポリマー免疫グロブリンレセプターを標的とするために用いることができる（例えば、Perales等(1994)E ur.J.Biochem.226:255-266参照）。トランスフェリンを用いて、平滑筋細胞を標的とすることができる（例えば、Wagner等(1990)PNAS 87:3410-3414米国特許第５，３５４，８４４号（Beug等）参照）。内性因子−ビタミンＢ１２及び胆汁酸（例えば、Kramer等(1992)J.Biol.Chem.267:18598-18604参照）を用いて、腸細胞を標的とすることができる。インシュリンを用いて、脂肪細胞及び筋肉細胞を標的とすることができる（例えば、Rosenkranz等(1992)Experimental Cell Rese arch 199:323-329及びHuckett等(1990)Chemical Pharmacology 40(2):253-263参照）。アポリポ蛋白質Ｅを用いて、神経細胞を標的とすることができる。このキャリアー分子のカチオン性部分は、負に帯電したポリヌクレオチドに静電気的に結合することのできる任意の正に帯電した種であってよい。このキャリアー中で用いるのに適したカチオン性部分は、ポリカチオン例えばポリリジン（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、塩基性蛋白質例えばヒストン（Chen等、前出）、アビジン、プロタミン（例えば、Wagner等、前出参照）、改変アルブミン（即ち、Ｎ−アシルウレアアルブミン）（例えば、Huckett等参照）及びポリアミドアミンカスケードポリマー（例えば、Haensler等(1993)Bioconjugate Chem.4:372-379参照）である。好適なポリカチオンは、ポリリジン（例えば、３，８００〜６０，０００ダルトン）である。一具体例において、このキャリアーは、約１７，０００ダルトンの分子量を有するポリリジン（２６，０００ダルトンのＭＷを有する臭化水素塩として購入）を含み、これは、約１００〜１２０リジン残基の鎖長に相当する。他の具体例において、このキャリアーは、約２，６００ダルトンの分子量を有するポリカチオン（４，０００のＭＷを有する臭化水素塩として購入）を含み、これは、約１５〜１０リジン残基の鎖長に相当する。このキャリアーは、カチオン部分と細胞特異的リガンドとを、当分野で周知の標準的架橋剤を用いて結合することにより形成することができる。この結合は、典型的には、共有結合である。好適な結合は、ペプチド結合である。これは、水溶性のカルボジイミド例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を用いて、McKee等(1994)Bioconjugat e Chem. 5:306-311又はJung,G.等(1981)Biochem.Biophys.Res.Commun. 101:599- 606又はGrabarek等(1990)Anal.Biochem. 185:131に記載されたように形成することができる。或は、結合は、架橋試薬例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、クロラムブチルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）（ＳＩＡＢ）、スルホ−ＳＩＡＢ及びスルホ−スクシンイミジル−４−マレイミドフェニル−ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）を用いて形成することのできるジスルフィド結合である。強い非共有結合例えばアビジン−ビオチン相互作用も又、カチオン性部分を、種々の細胞結合剤に結合して適当なキャリアー分子を形成するのに利用することができる。この結合反応は、キャリアーを形成するのに用いる特定のカチオン性部分及び細胞結合剤に対して最適化させることができる。カチオン性部分の細胞結合剤に対する最適比（ｗ：ｗ）は、経験的に決定することができる。この比は、キャリアー中で用いられるカチオン性部分（例えば、ポリカチオン）の寸法及び複合体化されるべきポリヌクレオチドの寸法によって変化する。しかしながら、この比は、一般に、約０．２〜５．０（カチオン性部分：リガンド）に及ぶ。未結合の成分及び集塊は、分子ふるい又はイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Aqua pore（商標）カチオン交換材、Rainin）により、キャリアーから分離することができる。この発明の一具体例において、アシアロオロソムコイドとポリリジンとの結合体よりなるキャリアーを、架橋剤１−（３−ジメチルアミノプロビル）−３−エチルカルボジイミドを用いて形成する。透析後、この結合体を、結合体化してない成分から、調製用酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ４〜５）により分離する。この結合体を、更に、カルボキシメチル官能化カラムにて精製することができる（１９９３年４月５日出願の米国特許出願第０８／０４３，００８号参照。その教示を、参考として、本明細書中に援用する）。キャリアー分子がカチオン性成分（例えば、遺伝子に静電気的に結合するポリカチオン）を含む場合、キャリアー分子の正味の正電荷に関係する分子間及び分子内会合（例えば、水素結合）のために、キャリアー分子の凝集が起こり得る。従って、この発明の好適具体例において、このキャリアー分子を、それらの凝集（即ち、電荷遮蔽剤の不在時に起きるであろう凝集）を阻止するのに十分な量の電荷遮蔽剤を含む溶液中で形成する。一具体例において、このキャリアー溶液を、上記のようにキャリアー分子を形成し（例えば、カチオン性部分と細胞結合剤との結合による）、次いで、それらのキャリアー分子をそれらの凝集を阻止するのに十分な量の電荷遮蔽剤と混合することにより調製する。用語「電荷遮蔽剤」は、ここで用いる場合、（ａ）個々のカチオン性キャリアー分子間の及び／又は同じキャリアー分子の異なる部分間の電荷相互作用（例えば、水素結合）を減少させ；及び／又は（ｂ）カチオン性キャリアー分子と溶媒との間の電荷相互作用を減少させることのできる任意の薬剤を包含することを意図している。用語「凝集を阻止する」は、ここで用いる場合、カチオン性キャリアー分子の解離、及び／又は凝集の阻止をいう。用語「キャリアー分子の凝集を阻止するのに十分」は、ここで用いる場合、キャリアー分子が、ポリヌクレオチドと複合体化された場合に、細胞により容易に取り込まれ及び／又は容易に生理的バリヤー（例えば、血液／組織バリヤー）を通過し得る解離のレベルをいう。一般に、この分散性のレベルは、キャリアー分子が、レーザー光散乱分析により測定して、約２０ｎｍ以下の、好ましくは約１５ｎｍ以下の、最も好ましくは約１０ｎｍ以下の半径を有する場合に達成される。キャリアー分子（単独又はポリヌクレオチドと複合体化したもの）の凝集のレベルを測定する他の方法には、例えば、ショ糖密度勾配分析、電子顕微鏡検査（ＥＭ）、円偏光二色性（ＣＤ）及び分光測光法（例えば、２６０ｎｍでの吸光度）が含まれる。この発明の好適具体例において、電荷遮蔽剤は、塩である。適当な塩には、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）、リン酸ナトリウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ₄）ＳＯ₄）、リン酸アンモニウム（ＮＨ₄Ｈ₂ＰＯ₄）、硫酸カリウム（Ｋ₂ＳＯ₄）、リン酸カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）、リン酸マグネシウム（ＭｇＨＰＯ₄）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）及び塩化リチウム（ＬｉＣｌ）その他の様々なものが含まれる。特に好適な具体例において、この塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。キャリアー分子を実質的に解離させるのに用いることのできる他の電荷遮蔽剤には、例えば、デタージェント及び両親媒性界面活性剤例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルのＢＲＩＪファミリー、ＳＰＡＮソルビタン脂肪酸エステル及びソルビタン脂肪酸エステルのＴＷＥＥＮポリオキシエチレン誘導体が含まれ、これらは、すべて、デラウェア、WilmingtonのICI Americas，Inc．より入手可能である。塩（例えば、ＮａＣｌ）を電荷遮蔽剤として用いる場合、キャリアー分子の凝集を阻止するのに適当な塩の量は、キャリアー分子の濃度によって変化する。しかしながら、この濃度は、一般に、少なくとも約１．０Ｍ以上である。例えば、約０．５〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアー分子を含む溶液については、この塩を約１．０〜１０Ｍの濃度に加えることができる。好適具体例において、これらのキャリアー分子は、キャリアー溶液中に、約３．０〜７．０ｍｇ／ｍＬの、好ましくは約５．０〜６．０ｍｇ／ｍＬの、最も好ましくは約５．６ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。キャリアー分子のこれらの濃度において、それぞれ、約１．０〜５．０Ｍの、好ましくは約４．０〜５．０Ｍの、最も好ましくは約４．７Ｍの塩濃度のキャリアー溶液を調製することができる。しかしながら、キャリアー分子の凝集を阻止するのに適当な任意所定の電荷遮蔽剤の量は、経験的に決定することができる。例えば、キャリアー分子の試料を、前記のように、電荷遮蔽剤の種々の濃度で調製することができ、次いで、キャリアー分子の凝集のレベルを、上に開示した技術（例えば、レーザー光散乱分析、ショ糖密度勾配分析、電子顕微鏡検査（ＥＭ）、円偏光二色性（ＣＤ）及び分光測光法）の何れかによって試験することができる。電荷遮蔽剤に加えて、このキャリアー溶液は、適宜、キャリアー分子の凝集を更に阻止するための他の分散助剤をも含むことができる。前述のように、カチオン性キャリアー分子の凝集は、主として、キャリアー分子の正味の正電荷に関係する分子間及び分子内会合（例えば、水素結合）から生じると考えられる。それ故、キャリアー分子の正味の正電荷を減じる薬剤は、これらの分子会合を減じてカチオン性キャリアー分子の分散性を促進することができる。従って、この発明の一具体例において、キャリアー溶液は、電荷遮蔽剤に加えて、電荷中和剤を含む。用語「電荷中和剤」は、ここで用いる場合、カチオン性キャリアー分子の正電荷の一部を中和する（即ち、脱プロトン化による）ことのできる任意の薬剤を包含することを意図している。この発明の好適具体例において、電荷中和剤は、塩基である。適当な塩基には、例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ）、アルキルアミン、アルコキシド及びトリエタノールアミンが含まれる。特に好適な具体例において、この塩基は、水酸化ナトリウムである。カチオン性キャリアー溶液は、電荷中和剤を、キャリアー分子の正電荷の一部を中和するのに十分な量で含む。この部分的中和は、キャリアー分子の電荷会合及び凝集を減じるが、これらのキャリアー分子に結合した全体としての正味の正電荷を保持する（それで、それらは、負に帯電したポリヌクレオチドに静電気的に結合することができる）。この発明の一具体例において、電荷中和剤を、キャリアー溶液に、キャリアー分子の正電荷の約５〜２０％（例えば、約１０％）を中和するのに十分な量で加える。この電荷中和剤は、キャリアー溶液に、電荷遮蔽剤の前に、後に、又は該剤と同時に加えることができる。塩基を電荷中和剤として用いる場合には、キャリアー溶液を、約０．５〜２０ｍｇ／ｍＬの、好ましくは約３〜７ｍｇ／ｍＬの、一層好ましくは約５〜６ｍｇ／ｍＬの、最も好ましくは約５．６ｍｇ／ｍＬの濃度にてキャリアー分子を含むキャリアー溶液に対して、それぞれ、約１０〜１０００ｍＭの、好ましくは約１０〜１００ｍＭの、一層好ましくは約５０〜７０ｍＭの、最も好ましくは約５９ｍＭの塩基濃度にて調製することができる。次いで、このキャリアー溶液を活発に混合して、分子キャリアー凝集物の解離を促進することができる。ＩＩＩインターフェロンをコードする遺伝子を含む分子複合体の形成この発明の分子複合体のキャリアー分子の形成後に、ＩＦＮをコードする遺伝子（例えば、発現プラスミド）を、キャリアーに、（ａ）その遺伝子が、標的細胞による内在化前の細胞外での遺伝子の有意の分離を阻止するだけ十分に安定であり（イン・ビボ、エキス・ビボ又はイン・ビトロの何れかで）、（ｂ）その遺伝子が、細胞内の適当な条件下で機能的形態で遊離され、（ｃ）その遺伝子がダメージを受けず、且つ（ｄ）キャリアーが、細胞に結合するその能力を保持するように結合する。一般に、キャリアーと遺伝子との間の結合は、非共有結合である。適当な非共有結合には、例えば、静電気結合、水素結合、疎水結合、抗ポリヌクレオチド抗体結合、挿入剤により媒介される結合、及びストレプトアビジン又はアビジンのポリヌクレオチド含有ビオチン化ヌクレオチドへの結合が含まれる。しかしながら、このキャリアーは又、例えば、化学的架橋剤を用いて、遺伝子に、直接、結合（例えば、共有結合）することもできる（例えば、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合体及びその治療用途」と題するＷＯ−Ａ−９１／０４７５３（Cetus Corp．）に記載されたように）。ＩＦＮをコードする遺伝子（例えば、ベクター中）を、キャリアー溶液と合わせて（且つ平衡化させて）、実質的に分散性の及び可溶性のポリヌクレオチド− キャリアー複合体を形成する。この遺伝子を、キャリアー溶液と、ポリヌクレオチド−キャリアー溶液が終濃度の電荷遮蔽剤及び、適宜、電荷中和剤を含み、該終濃度はポリヌクレオチド（即ち、ＩＦＮ遺伝子）の如何なる実質的なコンホメーションにもダメージを与えず又は変化（例えば、変性）を誘導せず、それにより、そのポリヌクレオチドが実質的に機能的であり続け且つキャリアー分子と複合体を形成するのに適した形態であり続けるように合わせる。一般に、これは、１．０Ｍ未満の、好ましくは０．７５Ｍ未満の、最も好ましくは０．５Ｍ未満（例えば、約０．１５〜０．５Ｍ）の電荷遮蔽剤（例えば、塩）の終濃度及び１０ｍＭ未満の、好ましくは４．０ｍＭ未満の、最も好ましくは約２．０ｍＭの電荷中和剤の濃度に対応する。一具体例において、このポリヌクレオチドを、例えば、ナノピュア水で希釈してから（又は、希釈と同時に）、キャリアー溶液と合わせて、その際に電荷遮蔽剤（例えば、塩）及び電荷中和剤（例えば、塩基）の所望の終濃度にする。ポリヌクレオチドを、電荷遮蔽剤として塩（例えば、ＮａＣｌ）を含むキャリアー溶液に加える場合には、ポリヌクレオチドを、１．０Ｍ未満の、好ましくは０．５Ｍ未満の、一層好ましくは約０．１５〜０．５Ｍ、最も好ましくは約０．３Ｍ（生理的濃度の約２倍）の塩終濃度を生じる濃度まで希釈することができる。この塩濃度においては、キャリアー分子は、高レベルの分散性を保持し、ポリヌクレオチドは、機能的であり続ける。キャリアー溶液が電荷遮蔽剤と共に電荷中和剤（例えば、塩基）を含むならば、ポリヌクレオチドの添加後にキャリアー溶液中の電荷中和剤の終濃度は、やはり、実質的にポリヌクレオチドの機能にダメージを与えず、該機能を変化させず又は阻害しない濃度であるべきである。例えば、塩基を電荷中和剤として用いる場合には、ポリヌクレオチド−キャリアー溶液は、５０ｍＭ未満の、好ましくは１０ｍＭ未満の、一層好ましくは４．０ｍＭ未満（例えば、約１．０〜４．０ｍＭ）の、最も好ましくは約２．０ｍＭの終濃度の塩基を含むことができる。この発明の好適具体例において、ポリヌクレオチド−キャリアー複合体が形成される最終的な溶液は、（ａ）約３．０〜７．０ｍｇ／ｍＬの、好ましくは約５．０〜６．０ｍｇ／ｍＬのキャリアー分子濃度、（ｂ）約０．１５〜０．５Ｍの、好ましくは約０．３Ｍの塩濃度、（ｃ）約１．０〜４．０ｍＭの、好ましくは約２．０ｍＭの塩基濃度及び（ｃ）適当なＤＮＡの終濃度（例えば、１０μｇ／ｍＬ）を有する。このポリヌクレオチド（即ち、ＩＦＮ遺伝子）を、溶液中で可溶性であり続ける安定な複合体を形成するのに適した量のキャリアー溶液と合わせる。一般に、このポリヌクレオチドを、約１：０．２〜１：２０（例えば、約１：１〜１：１０、又は約１：１．５〜１：５）の重量比（ｗ：ｗ）（ポリヌクレオチド対キャリアー）で、キャリアー溶液に加える。これらの重量比（ポリヌクレオチド対キャリアー）で形成された複合体は、それぞれ、約１０〜１０００％（例えば、約５０〜５００％又は約７５〜２５０％）の対応する電荷中和比（即ち、負に帯電したポリヌクレオチドの正に帯電したキャリアーによる中和のパーセント）を有する。所定のポリヌクレオチド−キャリアー複合体の性能は、複合体中のポリヌクレオチド電荷中和のレベルにより影響を受け得る。ＩＦＮをコードする遺伝子を含む所定の複合体についてポリヌクレオチド電荷中和の最適レベルは、ＩＦＮ遺伝子の性質（例えば、如何なる種類のベクター中にあるか）及び使用する特定のカチオン性キャリアー分子の寸法及び電荷に依存し得る。かかる複合体についてのポリヌクレオチド電荷中和の適当なレベルは、一般に、上記の範囲内に入るが、所定のＩＦＮ遺伝子複合体の最適レベルは、経験的に決定することができる。例えば、特定のＩＦＮ遺伝子複合体について、一連の調製物を、各ポリヌクレオチド電荷中和の程度を変えて作成することができる。次いで、これらの試料の性能を、例えば、下記の実施例に記載のように、イン・ビトロ又はイン・ビボ発現アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）で各試料を用いて得られたＩＦＮ発現のレベルを測定することにより試験することができる。ポリヌクレオチド（ＩＦＮ遺伝子）−キャリアー複合体の形成の後に、その複合体を、適宜、適当なフィルターを通して押し出してから、細胞に投与することができる（イン・ビトロ又はイン・ビボで）。用語「押し出す」は、ここで用いる場合、これらの複合体を瀘過装置を通過させ、その後、濾過された製品を収集することを意味する。複合体の押出しは、（１）複合体の寸法を減じ、それによりそれらを一層容易に標的細胞により内在化させることができ、（２）複合体の均一性を増大させることができ、そして（３）複合体の性能を、ＩＦＮ発現レベルにより測定して、改良することができる。一層大きい複合体を小さくして一層小さく一層均一な複合体の割合を増大させる任意の押出装置を用いることができるが、複合体の押出しのための好適な装置は、Emulsi-Flex-C5（カナダ国、Otta wa在、Avestin，Inc．）に取付けた５０ｎｍフィルターである。Ｖインターフェロンをコードする遺伝子を含む分子複合体の投与この発明の可溶性分子複合体を用いて、ＩＦＮをコードする遺伝子を、イン・ビトロ又はイン・ビボで、選択した細胞に送達することができ且つそれらの細胞におけるＩＦＮの発現を得ることができる。一具体例において、この複合体を、適当な培地にて培養中の標的細胞に、それらの細胞によるエンドサイトーシスによる取り込みを助ける条件下で接触させる（例えば、該細胞とインキュベートする）。他の具体例において、この複合体を、イン・ビボで、患者に、製薬上許容し得るキャリアーにて投与する。用語「製薬上許容し得るキャリアー」は、ここで用いる場合、例えば塩溶液及び水性緩衝液、溶媒、分散媒、抗菌及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む本発明のポリヌクレオチド−キャリアー複合体をイン・ビボ投与のために安定化させるための任意の生理学的に許容し得るキャリアーを包含することを意図している。製薬上活性な物質に対してかかる媒質及び薬剤を用いることは、当分野で周知である。如何なる慣用の媒質でも、本発明のポリヌクレオチド−キャリアー複合体と相容れないものでない限り、治療用組成物におけるそれらの使用は、企図される。すてべの場合において、この製薬組成物は、無菌でなければならず且つ容易に注射可能な程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず且つ、汚染作用又は微生物例えば細菌及びカビに対して保護されていなければならない。これらのポリヌクレオチド−キャリアー複合体の分解酵素（例えば、ヌクレアーゼ）からの保護は、この組成物に保護用コーティング又はヌクレアーゼ阻害剤を含むことにより達成することができる。微生物の作用の防御は、種々の抗菌及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。この発明の分子複合体は、任意の適当な投与経路によりイン・ビボで投与することができる。適当な投薬量は、選択した投与経路によって変化し得る。これらの複合体は、好ましくは、ここに規定したような生理的に許容し得るキャリアーを含む溶液にて静脈に注射する。無菌の注射溶液は、ポリヌクレオチドキャリアー複合体を、必要な量で、上記の成分の一つ又は一組を含む適当な緩衝液に取り込ませ、必要なら、その後瀘過除菌することにより調製することができる。他の適当な投与経路には、脈管、皮下（ゆっくり放出するインプラントを含む）、局所的及び経口投与が含まれる。適当な投薬量は、当分野で常例的に行なわれているようにして、経験的に決定することができる。マウスに、マウス２０ｇ当り１．０ｍｇまでの投薬量のポリヌクレオチドを、又はマウスの血液１．４ｍＬ当り約１．０ｍＬの複合体を投与することができる。更に、適当な投薬量は、公知事実に基づいて決定することができる。この発明を、下記の実施例により更に説明するが、これを、主題の発明を更に限定するものと解釈すべきではない。この出願中で引用されるすべての参考文献及び公開された特許出願を、参考として本明細書中に援用する。実施例１ − ＩＦＮ−αをコードするプラスミドの調製種々の発現プラスミドを、下記のように、メリーランド、Rockville在、Ameri can Type Culture Collectionより入手したヒトＩＦＮ−α２ｂクローン、ｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ（ＡＴＣＣ５３３６９）を用いて調製した。このクローンは、図１１に示したアミノ酸配列（SEQ ID NO:１）を有するヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする（Streuli等(1980)Science 209:1343-1347）。各プラスミドのマップを、図３〜８に示す。ｐＪ７ΩＩＦＮα：プラスミドｐＪ７ΩＩＦＮαを、ｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮの９９１ｂｐのＳａｌＩ〜ＥｃｏＲＩ断片をベクターｐＪ７Ω（Morgenstern等(19 90)Nucl.Acids Res.18(4):1068）のＳａｌ〜ＥｃｏＲＩ部位にクローン化することにより調製した。その結果生成したプラスミドｐＪ７ΩＩＦＮαは、ＣＭＶプロモーターにより発現されるヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子（この遺伝子の３’側には、ＳＶ４０小型ｔイントロン及びＳＶ４０ポリアデニル化配列が隣接している）を含む。ｐＪ７ΩｈＩＦＮα：プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαを、プラスミドｐＪ７Ω ＩＦＮαと同様に調製したが、但し、Kozak等(1986)Cell 44:283-292に記載されたように、ＡＵＧ開始コドンに隣接する点突然変異（即ち、３つのヌクレオチドの改変）を作って、ＩＦＮ−α２ｂについて公知の５’コンセンサス配列とマッチさせた（ＷＯ８６／０６０９７も参照）。ｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢ：プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢを、プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαと同様に調製したが、但し、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを、２コピーのアルファ−１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー（Rouet等(1992)J.Biol.Chem.267:20765-20773）と結合されたチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（Hayashi等(1993)Molec.Endocrinol.7:1049-1 060）で置き換え、ＳＶ４０小型ｔイントロン（ＩＶＳ）をＩＦＮ遺伝子の下流ではなく直ぐ上流に位置させた。ｐＪ７ΩｈＩＦＮα−非ＳＢ：プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮα−非ＳＢを、プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢと同様に調製したが、但し、ＩＦＮ遺伝子のＥｃｏＲＩ制限部位からＳＰＥ−１制限部位にまで及ぶＩＦＮ−α２ｂ遺伝子の３ ’非コード配列（Streuli等(1980)、前出）の領域を除去した。ｐＳＶＩＦＮα：プラスミドｐＳＶＩＦＮαを、ｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮの９９１ｂｐのＳａｌＩ〜ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＳＶＨＢＶ₂（Merwin等(1949 )Bioconjugate Chem.5:612-620）のＳａｌＩ〜ＢｇｌＩＩ部位にクローン化することにより調製した（ＢｇｌＩＩ部位を鈍端化し、そこにＥｃｏＲＩリンカーを連結してから、ｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ断片のライゲーションを行なった）。その結果生成したプラスミドｐＳＶＩＦＮαは、ＳＶ４０初期プロモーターにより発現されるヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子を含み、その遺伝子の３’側は、ＳＶ４０小型ｔイントロン及びＳＶ４０ポリアデニル化配列により終端している。ｐＳＶＩＦＮαＲＶ：プラスミドｐＳＶＩＦＮαＲＶを、ｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮの９９１ｂｐの９９１ｂｐのＳａｌＩ〜ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＳＶＨＢＶ₂（Merwin等(1949)Bioconjugate Chem.5:612-620）のＳａｌＩ〜ＥｃｏＲＶ部位にクローン化することにより調製した（ｐＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ断片のＥｃｏＲＩ部位を鈍端化してからライゲーションを行なった）。その結果生成したプラスミドｐＳＶＩＦＮαＲＶは、ＳＶ４０初期プロモーターにより発現されるヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子を含み、その遺伝子の３’側は、エンハンサー１及びエンハンサー２配列、Ｘ遺伝子及びＨＢＶポリアデニル化配列を含むＨＢＶ配列に隣接し、ＳＶ４０小型ｔイントロン及びＳＶ４０ポリアデニル化配列が続いている。実施例２ − ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードするプラスミドを含む標的を定めた複合体の形成実施例１で調製したヒトＩＦＮ−α２ｂ発現プラスミドの各々を含む標的を定めた分子複合体を下記のように形成した：ＡＳＯＲとポリ−Ｌ−リジンとの結合体を、McKee等(1994)Bioconjugate Chem .5:306-311により報告されたのと同様にカルボジイミドカップリングにより調製した。要するに、ＡＳＯＲ、２６ｋＤポリ−Ｌ−リジン及びＥＤＣ（１：１：０．５容積比）を、次のように反応させた。ＥＤＣ（乾燥物）を攪拌しているＡＳＯＲ水溶液に直接加えた。２６ｋＤポリリジンを加えて、反応混合物をｐＨ５．５〜６．０に調節し、周囲温度で２時間攪拌した。ＡＳＯＲ濃度は、最終的反応条件において５ｍｇ／ｍＬであった。この反応を、Ｎａ₃ＰＯ₄（２００ｍＭ、ｐＨ１１）を終濃度１０ｍＭまで加えることにより消滅させた。この結合体を、先ず、Fast Flow Q セファロースアニオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharma cia）にて精製して５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で溶出し、次いで、超純水に対して透析した。ＡＳＯＲ−ポリ−Ｌ−リジン結合体（濃度約５．６ｍｇ／ｍＬ）のアリコートを反応器に取り、それに、５ＭＮａＣｌを加えて約４．７ＭＮａＣｌの終濃度を得、１ＭＮａＯＨを加えて約５９ｍＭＮａＯＨの終濃度を得た。これらの溶液を激しく混合した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の実施例１で調製した各プラスミド（即ち、ｐＪ７ΩＩＦＮα、ｐＪ７ΩｈＩＦＮα、ｐＪ７ΩｈＩＦＮ αＳＢ、ｐＪ７ΩｈＩＦＮα非ＳＢ、ｐＳＶＩＦＮα及びｐＳＶＩＦＮαＲＶ）を、ナノピュア水を加えることにより希釈し、次いで、ＡＳＯＲ−ポリ−Ｌ−リジン結合体溶液と合わせて、３００ｍＭＮａＣｌ及び２ｍＭＮａＯＨの終濃度並びに１０μｇ／ｍｌのプラスミドの終濃度を達成した。複合体を、ＤＮＡの負電荷の５０％を中和するのに十分なＤＮＡのキャリアーに対する比を用いて形成した。この比を決定するために、精製した透析した結合体溶液のアリコートを凍結乾燥し、重量測定して超純水に特定の濃度（ｗ／ｖ）で溶解させた。ポリリジンは２８０ｎｍで最小吸光度を有するので、この結合体のＡＳＯＲ成分（ｗ／ｖ）を、２８０ｎｍでの吸光度係数を用いて計算した。この結合体の組成を、この結合体の濃度（ｗ／ｖ）をＡＳＯＲの濃度（ｗ／ｖ）（ＵＶ吸光度により測定）と比較することにより評価した。２つの測定間の差異は、結合体のポリリジン成分に帰するものとした。次いで、電荷の中和に必要な結合体のＤＮＡに対する比（ｗ：ｗ）を、決定されたカチオン組成を用いて計算した。上記のプロトコールで用いた材料及び方法は、次の通りである：プロタミン、ポリ−Ｌ−リジン（２６ｋＤ；平均ＭＷ）は、ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Co.より購入した。１−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］−３− エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）は、ウィスコンシン、Milwaukee在、Aldrich Chemical Coより購入した。オロソムコイドは、カリフォルニア、Los Angeles在、Alpha Therapeuticsより購入した。アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）は、オロソムコイド（１５ｍｇ／ｍｌ）から、０．１Ｎ硫酸を用いる７６℃１時間の加水分解により調製した。ＡＳＯＲを、反応混合物から、１．０ＮのＮαＯＨでｐＨ５．５まで中和すること及び室温での水に対する徹底的な透析により精製した。ＡＳＯＲ濃度を、０．９２ｍＬｍｇ^-1，ｃｍ^-1の吸光度係数を用いて２８０ｎｍにて測定した。Warren(1959)J.Biol.Chem.234:1971-1975のチオバルビツール酸アッセイを用いて、ＯＲの脱シアル化を確認した。上記の方法により調製したＡＳＯＲが９８％脱シアル化されたことを測定した。実施例３ − ヒトＩＦＮ−α２ｂをコードするプラスミドを含む標的を定めた複合体を用いるイン・ビボ発現アッセイ実施例２で形成した標的を定めた分子複合体の投与後に得られるイン・ビボでのヒトＩＦＮ−α２ｂの発現レベル、持続期間及び生物学的活性を研究するために、下記のようにマウスにおけるアッセイを行なった：Ｉ．治療上有意のレベルで長期間のＩＦＮ発現を示すイン・ビボアッセイ複合体溶液（ｐＪ７ΩＩＦＮα−Ｐ１−ＡＳＯＲ、ｐＪ７ΩｈＩＦＮα−Ｐ１ −ＡＳＯＲ、ｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢ−Ｐ１−ＡＳＯＲ、ｐＪ７ΩｈＩＦＮ α−非ＳＢ−Ｐ１−ＡＳＯＲ、ｐＳＶＩＦＮα−Ｐ１−ＡＳＯＲ及びｐＳＶＩＦＮαＲＶ−Ｐ１−ＡＳＯＲ、１０μｇＤＮＡ／ｍｌ）の１．０ｍｌの投与量を、雌の成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（１８〜２０ｇｍ）に尾静脈から注射した。図１及び図２に示したプラスミドｐＪ７ΩＩＦＮ、ｐＳＶＩＦＮα及びｐＳＶＩＦＮα ＲＶごとに２匹のマウスに注射した。図９に示したプラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮ α、ｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢ及びｐＪ７ΩｈＩＦＮα−非ＳＢごとに４匹のマウスに注射した。更に、対照用マウスには、同様に処方したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）プラスミド含有複合体の１．０ｍｌの注射をした。ｐＪ７ΩＩＦＮα、ｐＳＶＩＦＮα及びｐＳＶＩＦＮαＲＶを含む複合体について、血液試料を、注射後２４、４８及び９６時間にて、後眼窩穿刺により、これらの動物から採取した。ｐＪ７ΩｈＩＦＮα、ｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢ及びｐＪ７ΩｈＩＦＮα−非ＳＢを含む複合体について、血液試料を、注射後３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６及び３９日目に、同様の方法（即ち、後眼窩穿刺）により、これらの動物から採取した。試料からの血清を、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩＦＮ−α２ｂ蛋白質について分析した。定量的ＥＬＩＳＡを、ヒト特異的ＩＦＮ−α２検出キット（Endogenカタログ番号E H-IFNA）を用いて、製造者の薦めるプロトコールに従って行なった。このＥＬＩＳＡアッセイは、マウスインターフェロン又は他の型のヒトインターフェロンと交差反応しない。これらの結果を標準曲線と比較して、各試料中に存在するヒトＩＦＮ−α２ｂの量（ｐｇ／ｍｌ）を評価した。ｈＧＨ複合体で処理した対照用動物は、如何なる測定可能なヒトＩＦＮ−α２ｂをも生成しなかった。これらの結果を、図１、２及び９に示す。図１は、マウス当り１０μｇの投与量の各プラスミド複合体の注射の２４時間後のマウスにおけるヒトＩＦＮ−α２ｂの発現のレベルを示している。最高の発現（１７５ｐｇ／ｍｌに達する）は、ｐＪ７ΩＩＦＮα−Ｐ１−ＡＳＯＲを含む複合体について得られた。３つのすべてのプラスミド複合体についての平均の発現は、８５ｐｇ／ｍｌであった。図２は、１０μｇ、２５μｇ及び５０μｇのプラスミドｐＪ７ΩＩＦＮ（複合体として）の注射後２４、４８及び９６時間の時点におけるマウスにおけるヒトＩＦＮ−α２ｂの発現のレベルを示している。１０μｇのプラスミドの投薬量は、２４時間の時点における８０ｐｇ／ｍｌから９６時間の時点における約１７ｐｇ／ｍｌにまで及ぶ発現レベルを生じた。２５μｇのプラスミドの投薬量は、２４時間の時点における約６５ｐｇ／ｍｌから９６時間の時点における約１９ｐｇ／ｍｌにまで及ぶ発現レベルを生じた。５０μｇのプラスミドの投薬量は、２４時間の時点における約１１０ｐｇ／ｍ１から９６時間の時点における約５５ｐｇ／ｍｌにまで及ぶ発現レベルを生じた。図９は、１０μｇのプラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮα、ｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢ及びｐＪ７ΩｈＩＦＮα−非ＳＢ（複合体として）を注射したマウスにおけるＩＦＮ−α２ｂの発現のグラフ表示である。発現レベルを、注射後３９日目まで３日毎に測定した。注射後１及び２日目に、ｐＪ７ΩｈＩＦＮαは、５，０００〜１１，０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−α２ｂを生成したが、１８日目までに発現レベルは減少した。プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢ及びｐＪ７ΩｈＩＦＮα− 非ＳＢの場合は、約１，０００ｐｇ／ｍｌのピーク血清濃度が達成され、発現は、控目な下げ傾向のみを伴って、１か月より長期間（少な＜とも３８日間に達する）にわたって持続した。プラスミドｐＪ７ΩｈＩＦＮαＳＢの発現（即ち、ＩＦＮ−α２ｂの血清レベル）の測定を１８５日中継続し、図１０に示したように、発現は、控目な下げ傾向を伴うだけで持続した。全体的に、これらの結果は、ＩＦＮの予想外に長期間のイン・ビボ発現が、動物モデルにおいて、この発明のＩＦＮプラスミド複合体により達成し得ることを示している。例えば、慢性ＨＢＶを治療するためのＩＦＮ−α蛋白質の標準的投薬量での治療を受けたヒト患者において、ＩＦＮ−αの血清濃度は急速に低下し、普通、注射後１６時間程で検出不能となる（「Drug F acts and Comparisons」、前出）。更に、図９及び１０に示した結果は、長期間のイン・ビボでのＩＦＮの発現が動物モデルにおいて、ヒトにおいて治療効果があることが示された範囲内に十分入るレベルで達成され得ることを示している。特に、図９及び１０の影を付けた領域は、慢性ＨＢＶに対する標準的蛋白質療法を受けている患者で筋肉注射の４〜１２時間後におけるピークのＩＦＮ−αの血清濃度の範囲（１００〜６００ｐｇ／ｍｌ）を示している（例えば、「Drug Facts and Comparisons」、1992年版、Olin，B.R.等編、ミズーリ、St.Louis在、2445-2460頁）。図９において、ＩＦＮ−α２ｂの発現のレベルは、最後のデータ点（３８日目）まで、ヒトについての治療的範囲内にあり続けた。図１０において、ＩＦＮ−α２ｂの発現のレベルは、３つのすべての試験群（１〜３）の合成について、ヒトについての治療的範囲内に５６日目まであり続け且つ８１〜９８日もやはり治療的範囲内にあった。第１群は、連続的に９０日目まで、ヒトについての治療的範囲内の発現レベルを生じた。第２群は、５４日目まで及びその後再び８０〜１８５日において、ヒトについての治療的範囲内の発現レベルを生じた。全体的に、これらの結果は、長期間のイン・ビボＩＦＮ発現が動物モデルにおいて、本発明によって、治療上有意のレベルで達成され得ることを示している。ＩＩ．生物学的に活性なＩＦＮのイン・ビボでの発現を示すアッセイこの発明のプラスミド複合体を注射されたマウスにおいてイン・ビボで組換えにより発現されたＩＦＮ−α２ｂ蛋白質の生物学的活性についてアッセイするために、下記の研究を行なった。プラスミドｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢ（図７）を、標準的ＰＣＲ媒介の位置指定突然変異導入法を用いて改変してヒトＩＦＮ−α２ｂのコード配列を、残基１２１のＡｒｇ（Ｒ）の代りにＬｙｓ（Ｋ）をコードし且つ残基１２５のグルタミン（Ｑ）の代りにＡｒｇ（Ｒ）コードするように変化させたが、これらは、ヒトＩＦＮ−α１中のこれらの位置に天然に見出されるアミノ酸である（図１１ａ）。この変化は、マウスにおいて発現されたヒトＩＦＮα２の生物学的活性を増大させることが見出されている（Weber等(1987)EMBO J.6:591-598）（図１１ｂ）。対照用マウス（即ち、未改変のｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢ）及び試験用マウス（即ち、改変したｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢ）において発現されたヒトＩＦＮ−α２の生物学的活性を、増大されたＭＨＣクラスＩ抗原により測定した。ＭＨＣクラスＩの誘導は、ＩＦＮの生物学的に対する技術的に認められたマーカーである（Pestka等(1987)Ann.Rev.Biochem.56:727-777）。実施例２に記載のようにして調製した標的を定めた分子複合体の形態のプラスミド１０μｇをマウスに尾静脈から注射した。注射後１０日目に、脾臓を単離脾臓のＦＡＣＳ分析用に取り出した。ｐＪ７ｈΩＩＦＮαＳＢを含む未改変プラスミド複合体（即ち、図１１(a) に示したＩＦＮ−α２配列を有するヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする）を注射したマウスからの脾臓細胞を対照（パネルＡ）として用いた。パネルＡ−Ｅは、ＦＡＣＳ分析の結果を示している。パネルＡ（対照）は、２匹のマウス由来のクラスＩ抗原染色性脾臓細胞集団に変化のないことを示した。しかしながら、パネルＢ−Ｅ（赤で影を付けた領域）は、パネルＡ（対照）と比較して、ＭＨＣクラスＩ抗原染色性細胞の明白な増加を示した。パネルＡの曲線をパネルＢ（緑にて示される）に重ね合わせて、この右向きシフトを目立たせてある。同量のＭＨＣクラスＩ抗原誘導は、全量で１００，０００ＩＵのマウスＩＦＮ−α蛋白質で処理した（２．５日にわたって、蛋白質の５回の筋肉注射による）マウスにおいても認められた。全体的に、これらの結果は、本発明の方法及びプラスミド複合体によりイン・ビボで発現されたＩＦＮが生物学的活性を有することを示している。同等物この発明を、その好適な具体例を参照して記載してきたが、他の具体例も同様の結果を達成することができる。当業者は、常例的実験を用いて、ここに記載した特定の具体例に対する多くの同等物を認識し又は確かめることができるであろう。かかる同等物は、この発明の範囲内にあると考えられ、後記の請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 37/66 ＺＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者カーロー，デニスジェイ. アメリカ合衆国 92067 カリフォルニア, ランチョーサンテフェ，ロスピーノース 4466，ピーオーボックス1176

Claims

【特許請求の範囲】１．インターフェロンをコードする遺伝子を、イン・ビボで、標的細胞に送達し、その結果、治療上有意のレベルで、その遺伝子の蛋白質としての発現及びその蛋白質の細胞による分泌を生じる方法であって、該方法は、核酸結合剤と標的細胞表面上の成分に結合するリガンドとの結合体に遊離可能に結合されたインターフェロンをコードする遺伝子を含む分子複合体を患者に投与することを含み、該遺伝子は、コードされた蛋白質の標的細胞による発現、プロセッシング及び分泌に必要な遺伝子調節エレメントに操作可能に結合されており且つこの分子複合体はウイルス性又は非ウイルス性のエンドソーム溶解成分を有しない、上記の方法。２．遺伝子がヒトインターフェロンをコードする、請求項１に記載の方法。３．ヒトインターフェロンがＩＦＮ−αである、請求項１に記載の方法。４．遺伝子がヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする、請求項１に記載の方法。５．遺伝子が発現ベクターに含まれている、請求項１に記載の方法。６．核酸結合剤がポリカチオンである、請求項１に記載の方法。７．ポリカチオンがポリリジンである、請求項６に記載の方法。８．リガンドが末端炭水化物残基を含む、請求項１に記載の方法。９．リガンドがアシアロ糖蛋白質レセプターに結合する、請求項１に記載の方法。１０．リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求項１に記載の方法。１１．リガンドを、ガラクトース、マンノース及びラクトースよりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。１２．分子複合体を静脈から投与する、請求項１に記載の方法。１３．核酸結合剤と細胞表面上の成分に結合するリガンドとの結合体に遊離可能に結合されたインターフェロンをコードする遺伝子を含む分子複合体であって、該遺伝子が、コードされた産物の細胞による発現、プロセッシング及び分泌に必要な遺伝子調節エレメントに結合されており、ウイルス性又は非ウイルス性エンドソーム溶解成分を含まず且つ患者に投与したときにその患者において治療上有意のレベルでインターフェロンの発現を引き起こすことのできる、上記の分子複合体。１４．遺伝子がヒトインターフェロンをコードする、請求項１３に記載の分子複合体。１５．ヒトインターフェロンがＩＦＮ−αである、請求項１３に記載の分子複合体。１６．遺伝子がヒトＩＦＮ−α２ｂをコードする、請求項１３に記載の分子複合体。１７．遺伝子が発現ベクターに含まれている、請求項１３に記載の分子複合体。１８．核酸結合剤がポリカチオンである、請求項１３に記載の分子複合体。１９．ポリカチオンがポリリジンである、請求項１８に記載の分子複合体。２０．リガンドが末端炭水化物残基を含む、請求項１３に記載の分子複合体。２１．リガンドがアシアロ糖蛋白質レセプターに結合する、請求項１３に記載の分子複合体。２２．リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求項１３に記載の分子複合体。２３．リガンドを、ガラクトース、マンノース及びラクトースよりなる群から選択する、請求項１３に記載の分子複合体。２４．請求項１３の分子複合体及び製薬上許容し得るキャリアーを含む組成物。２５．インターフェロンを培養中で組換えにより発現させる方法であって、宿主細胞を核酸結合剤と宿主細胞表面上の成分に結合するリガンドとの結合体に遊離可能に結合されたインターフェロンをコードする遺伝子を含む分子複合体とインキュベートすることを含み、該遺伝子が、コードされたインターフェロン蛋白質の宿主細胞による発現、プロセッシング及び分泌に必要な遺伝子調節エレメントに結合されており、該分子複合体がウイルス性又は非ウイルス性のエンドソーム溶解成分を含まない、上記の方法。２６．遺伝子がヒトインターフェロンをコードする、請求項２５に記載の方法。２７．遺伝子がヒトＩＦＮ−αをコードする、請求項２５に記載の方法。２８．結合体がアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドに結合されたポリカチオンを含む、請求項２５に記載の方法。