ES2324525T3 - Metodo para promover transferencia de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un complejo electrostático que consiste en un oligonucleótido y un atelocolágeno, para facilitar la transferencia de dicho oligonucleótido a una célula diana, en el que el tamaño del complejo electrostático es 300 nm a 30 µm.
Description
Método para promover transferencia de ácidos
nucleicos.
La presente invención pertenece al campo médico,
específicamente a terapia génica e investigación fundamental
genética. Más específicamente, la invención se refiere a
preparaciones para facilitar la transferencia de un ácido nucleico
deseado a una célula diana y procesos para lo mismo.
Recientemente, la terapia génica se ha estudiado
activamente y se ha aplicado prácticamente a terapia clínica de
diversos cánceres y enfermedades genéticas. La terapia génica es un
enfoque para tratar una enfermedad reparando o corrigiendo un gen
defectuoso y comprende transferir un gen que codifica una enzima
pretendida, citoquina o similar a una célula de un paciente y
permitir que se produzca la sustancia pretendida a partir del gen
en el organismo, tratando de ese modo la enfermedad. La terapia
génica es una medicación que controla una base de vida y tiene un
potencial para tratar diversas enfermedades tales como SIDA,
artritis reumatoide, enfermedades relacionadas con el estilo de
vida, además de cánceres y enfermedades genéticas.
En terapia génica, la eficacia de transferencia
de genes a una célula diana es un factor importante en la eficacia
aumentada de la terapia. La terapia génica para cánceres incluye
terapias por virus tales como adenovirus (Cardiovascular Research,
28, 445 (1994); Science, 256, 808 (1992); Gastroenterology, 106,
1076 (1994); TIBTECH, 11, 182 (1993); J. Biol. Chem, 266, 3361
(1991); Nature Medicine, 1, 583 (1995) y las referencias citadas en
los mismos) y aquellas por formulaciones de liposoma (Biochem
Biophys Acta, 1097, 1 (1991); Human Gene Therapy, 3, 399 (1992);
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11277 (1992)). La eficacia de
transferencia de genes generalmente es más alta en terapia que usa
vectores de virus que en terapia que usa formulaciones de liposoma.
Sin embargo, la terapia que usa vectores de virus padece de un
problema, que difícilmente se conducen administraciones múltiples
debido a respuestas inmunológicas a virus (J. Biol. Chem., 269,
13695 (1994), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10, 369 (1994)).
Por otra parte, ya que los análisis sobre la
información genética humana completa (genoma humano) casi se han
terminado, el enfoque se ha cambiado a estrategias post genoma sobre
cómo utilizar la información genética humana acumulada en los
campos de medicación e industria. Específicamente, se han enfatizado
exámenes sobre funciones génicas humanas, así como las estructuras
y funciones de las proteínas codificadas por los genes que usan la
información genética analizada. Un examen post genómico de este tipo
requiere la expresión y la producción de proteínas, que
necesariamente implican la transferencia de genes pretendidos a
células. Los genes que se tienen que transferir a células
hospedadoras mediante vectores de adenovirus y vectores de liposomas
o vectores de ADN plasmídico no están integrados en el genoma de
las células y se expresan transitoriamente. Tales vectores no
pueden conseguir la expresión constitutiva de los genes, que es
importante en terapia génica y análisis de funciones génicas.
Por tanto, se espera que un enfoque para
transferir eficazmente un ácido nucleico que representa un gen a una
célula deseada y para expresar el gen durante un periodo largo de
tiempo sin la integración del gen en el cromosoma de células
hospedadoras proporcione una gran utilidad.
Los inventores de la presente solicitud
observaron que los colágenos tienen una acción inesperada y crearon
un enfoque para transferir eficazmente un ácido nucleico a una
célula deseada. Específicamente, se ha observado que el contacto de
un colágeno y un ácido nucleico sorprendentemente da como resultado
la formación de un complejo y la formación de un complejo facilita
la transferencia de un ácido nucleico a una célula y expresa el gen
durante un período de tiempo largo. Aunque la Publicación de Patente
Japonesa (kokai) Nº 71542/1997 describe formulaciones que contienen
un gen donde el gen está comprendido en un vehículo de un material
biocompatible tal como un colágeno, las formulaciones son
formulaciones de liberación sostenida que liberan gradualmente el
gen en un organismo vivo.
La invención se basa en el uso recién observado
de un colágeno o un derivado de colágeno.
Más específicamente, la invención se refiere
a:
- (1)
- Una preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico a una célula diana, que comprende un colágeno o un derivado de colágeno;
- (2)
- Una preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico a una célula diana, que comprende un colágeno o un derivado de colágeno en complejo con un ácido nucleico deseado, preferiblemente una preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico, donde el complejo está en forma de partícula, más preferiblemente una preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico, donde el eje principal de la partícula es 300 nm a 300 \mum, preferiblemente 300 nm a 100 \mum, más preferiblemente 300 nm a 50 \mum, aún más preferiblemente 300 nm a 30 \mum; específicamente, una preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico donde el ácido nucleico es un oligonucleótido y en el que la proporción del número de una molécula de colágeno o una molécula de derivado de colágeno al número de un monómero de nucleótido del oligonucleótido en el complejo es 1:1 a 1:200, preferiblemente 1:3 a 1:150, más preferiblemente 1:20 a 1:120 y aún más preferiblemente 1:120;
- (3)
- Una partícula del complejo que comprende un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado;
- (4)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con la presente invención, que comprende mezclar un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en una solución que comprende un agente que inhibe la formación de cuerpo de asociación de colágeno;
- (5)
- Un instrumento médico, cuya superficie está recubierta con una partícula del complejo de acuerdo con (3) anteriormente o un instrumento de cultivo celular, cuya superficie está recubierta con la partícula del complejo;
- (6)
- Un proceso para transferir un ácido nucleico deseado a un célula diana o un proceso para mejorar el nivel de expresión de un ácido nucleico deseado en una célula diana, que comprende usar una partícula del complejo de acuerdo con (3) anteriormente;
- (7)
- Un proceso para examinar la función de un gen o una proteína en una célula diana, que comprende recubrir una superficie sólida con una partícula del complejo de acuerdo con (3) anteriormente que comprende el ácido nucleico que inhibe la expresión del gen o la proteína en una célula; cultivar la célula diana sobre la superficie sólida y examinar el nivel de expresión del ácido nucleico o el nivel de expresión del gen o la proteína en la célula diana o el índice de proliferación o el fenotipo de la célula y
- (8)
- Un proceso de selección para determinar un ácido nucleico que trata una enfermedad, que comprende recubrir una superficie sólida con una partícula del complejo de acuerdo con (3) anteriormente que comprende un candidato de ácido nucleico que inhibe la expresión de un gen asociado con la enfermedad en una célula; cultivar la célula que presenta la afección de la enfermedad en la superficie sólida y examinar el nivel de expresión del gen que se tiene que inhibir con cada uno de los candidatos de ácidos nucleicos o el índice de proliferación o el fenotipo de la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, esos ejemplos ilustran que las
preparaciones para facilitar la transferencia de un ácido nucleico
de acuerdo con la presente invención aumentaron la estabilidad de un
ácido nucleico dentro de una célula ya que han demostrado que
mantienen el ácido nucleico durante un periodo de tiempo más largo
que las formulaciones de liposoma.
De acuerdo con la invención, se ha observado que
un colágeno interacciona electrostáticamente y/o físicamente con un
ácido nucleico para formar un complejo. Por tanto, se cree que el
ácido nucleico mantenido que se ha observado en los ejemplos de
trabajo se obtendría a partir de la formación de complejo
conduciendo a la estabilidad aumentada de ácidos nucleicos dentro
de las células. Esto es bastante diferente del mecanismo de la
liberación sostenida de gen mediante colágenos que se ha entendido
convencionalmente que un gen encapsulado en matriz de colágeno se
libera gradualmente de acuerdo con la degradación biológica de
colágeno.
La Figura comparativa 1 es una fotografía en
sustitución de dibujo que representa una electroforesis en gel de
agarosa que muestra la interacción electroestática entre la
concentración definida de ADN plasmídico y las diversas
concentraciones de atelocolágeno.
La Figura comparativa 2 es una fotografía en
sustitución de dibujo que representa una electroforesis en gel de
agarosa que muestra el efecto de cloruro de sodio sobre la
interacción electroestática entre ADN plasmídico y
atelocolágeno.
La Figura comparativa 3 es una fotografía en
sustitución de dibujo que representa una electroforesis en gel de
agarosa que muestra el efecto de heparán sulfato sobre la
interacción electrostática entre ADN plasmídico y atelocolágeno.
La Figura comparativa 4 es una micrografía que
muestra una forma de los complejos entre ADN plasmídico y
atelocolágeno en diversas concentraciones.
La Figura comparativa 5 es una micrografía que
muestra una forma de los complejos entre ADN plasmídico y
atelocolágeno en diversas concentraciones que se almacenaron durante
una semana.
La Figura comparativa 6 es un gráfico que
muestra una comparación en el tiempo de duración de expresión génica
entre la formulación de gel de atelocolágeno, la formulación de
liposoma catiónica y el ADN plasmídico en una solución de PBS.
\newpage
La Figura comparativa 7 es un gráfico que
muestra la relación entre los complejos que comprenden un colágeno
en diversas concentraciones y la eficacia de transferencia de ADN
plasmídico siete días después de la transfección mediante adición
gota a gota.
La Figura comparativa 8 es un gráfico que
muestra una intensidad de fluorescencia que representa la eficacia
de transferencia de ADN plasmídico en los complejos que comprenden
un colágeno en diversas concentraciones siete días después de la
transfección.
La Figura comparativa 9 es un gráfico que
muestra la relación entre los complejos que comprenden un colágeno
en diversas concentraciones y la eficacia de transferencia de ADN
plasmídico siete días después de la transfección mediante
recubrimiento de sólido.
La Figura comparativa 10 es un gráfico que
muestra la relación entre los complejos que comprenden un ADN
plasmídico en diversas concentraciones y la eficacia de
transferencia de ADN plasmídico siete días después de la
transfección mediante adición gota a gota.
La Figura comparativa 11 es un gráfico que
muestra la relación entre los complejos que comprenden un ADN
plasmídico en diversas concentraciones y la eficacia de
transferencia de ADN plasmídico siete días después de la
transfección mediante recubrimiento de sólido.
La Figura comparativa 12 es un gráfico que
muestra una intensidad de fluorescencia que representa la eficacia
de transferencia de ADN plasmídico siete días después de la
transfección mediante adición gota a gota y una micrografía que
muestra la fluorescencia.
La Figura 13 es un gráfico que muestra los
efectos inhibidores de la presente invención sobre la proliferación
celular.
La Figura comparativa 14 es un gráfico que
muestra que se transfirió adenovirus mediante recubrimiento de
sólido de una manera dependiente de dosis y una micrografía que
muestra la fluorescencia.
La Figura comparativa 15 es un gráfico que
muestra la relación entre el número de colágeno unido a una molécula
de ADN plasmídico y el eje principal promedio de los complejos.
La Figura 16 es un gráfico que muestra la
relación entre el número de monómeros de nucleótido de ácidos
nucleicos deseados por molécula de colágeno y el eje principal
promedio de los complejos.
La Figura 17 es un gráfico que muestra la
relación entre la proporción del número molecular de oligonucleótido
a colágeno en el momento de la mezcla y el número de oligonucleótido
unido a una molécula de colágeno en el complejo.
La Figura 18 es una micrografía de fluorescencia
obtenida observando los complejos que comprenden los
oligonucleótidos liberados a partir de la superficie del instrumento
de cultivo celular de acuerdo con la presente invención con
microscopía de fluorescencia.
La Figura comparativa 19 es una micrografía de
fluorescencia obtenida observando los complejos que comprenden el
ADN plasmídico liberado a partir de la superficie del instrumento de
cultivo celular de acuerdo con la presente invención con microscopía
de fluorescencia.
Como la primera realización, la invención
proporciona una preparación para facilitar la transferencia de un
ácido nucleico a una célula diana, que comprende un colágeno o un
derivado de colágeno. La realización se basa en el efecto de un
colágeno o un derivado de colágeno sobre la facilitación de la
transferencia de un ácido nucleico a una célula diana, que se ha
observado por primera vez. En otras palabras, la presente
realización de la invención proporciona un uso nuevo de un colágeno
o un derivado de colágeno para facilitar la transferencia de un
ácido nucleico a una célula diana.
Como se usa en este documento, "un colágeno o
un derivado de colágeno" generalmente se refiere a cualquier
tipo de colágenos o derivados de colágenos usados en los campos
médico, cosmético, industrial y de alimentos. Preferiblemente se
utiliza un colágeno soluble o un colágeno solubilizado. Los
colágenos solubles son solubles en un agua ácida o neutra o un agua
que contiene una sal, mientras que los colágenos solubilizados
incluyen un colágeno solubilizado enzimáticamente que se puede
solubilizar con una enzima, un colágeno solubilizado con álcali que
se puede solubilizar con un álcali, siendo ambos colágenos
preferiblemente capaces de penetrar a través de una membrana de
filtro que tiene un tamaño de poro de 1 micrómetro. La solubilidad
del colágeno varía dependiendo del grado de entrecruzamiento del
colágeno y a mayor grado de entrecruzamiento, el colágeno es más
difícil de solubilizar. Por consiguiente, el grado de
entrecruzamiento de un colágeno como se usa en la presente
invención es, por ejemplo, no más que un trímero y más
preferiblemente no más que un dímero. El peso molecular preferible
del colágeno es, por ejemplo, de aproximadamente 300.000 a
aproximadamente 900.000 y más preferiblemente de aproximadamente
300.000 a aproximadamente 600.000. Los colágenos como se usa en este
documento incluyen los que se extraen a partir de cualquier especie
animal y se desea que los colágenos preferidos se extraigan a
partir de vertebrados, más preferiblemente los colágenos se extraen
a partir de un mamífero, un ave o un pez y los colágenos más
preferidos se extraen a partir de un mamífero o un ave teniendo una
temperatura de desnaturalización elevada. Se puede usar cualquier
tipo de colágeno y, debido al tipo que existe en organismos
animales, son preferibles los colágenos de tipo I-V.
Por ejemplo, tales colágenos incluyen un colágeno de tipo I
obtenido por extracción ácida a partir de la dermis de un mamífero
y, más preferiblemente, los mismos incluyen, por ejemplo, un
colágeno de tipo I obtenido por extracción ácida a partir de la
dermis de ternera, un colágeno de tipo I producido por ingeniería
genética y similares. Los colágenos obtenidos de tendón, que
también son colágenos de tipo I, no son adecuados debido a que los
mismos tienen un alto grado de entrecruzamiento y son insolubles.
Además, por seguridad es preferible un atelocolágeno que se obtenga
retirando enzimáticamente un telopéptido que tiene una
antigenicidad elevada o un atelocolágeno producido por ingeniería
genética y es más preferible un atelocolágeno que tenga tres o
menos residuos tirosina por 1000 residuos. Alternativamente, si se
desea se pueden utilizar los colágenos que tienen una cadena lateral
modificada, colágenos entrecruzados o similares. Los colágenos que
tienen una cadena lateral modificada incluyen, por ejemplo,
colágenos succinilados y colágenos metilados, mientras que
colágenos entrecruzados incluyen, por ejemplo, colágenos tratados
con glutaraldehído, diisocianato de hexametileno, un compuesto
poliepoxi o similares (Fragrance Journal 1989-12,
104-109, Japanese Patent Publication (kokai) Nº
59522/1995). Los derivados de colágeno preferidos son una gelatina
o un complejo de entrecruzamiento de gelatina o un complejo de
entrecruzamiento de los mismos con un colágeno.
Los colágenos o derivados de colágeno se pueden
usar mezclados con otro material biocompatible. Los materiales
biocompatibles incluyen, por ejemplo, gelatina, fibrina, albúmina,
ácido hialurónico, heparina, condroitin sulfato, chitina, chitosán,
ácido algínico, pectina, agarosa, hidroxiapatita, polipropilenos,
polietilenos, polidimetilsiloxano y un polímero de ácido glicólico,
ácido láctico o aminoácido y un copolímero de los mismos y una
mezcla que contenga dos o más de esos materiales biocompatibles.
Como la segunda realización, la presente
invención proporciona una preparación para facilitar la
transferencia de un ácido nucleico a una célula diana, que
comprende un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico
deseado, preferiblemente comprende partículas de un complejo como un
componente imprescindible.
Los ácidos nucleicos se transfieren difícilmente
a células cuando se administran a células in vitro
exclusivamente en presencia de suero sanguíneo. Los ácidos
nucleicos se pueden transferir eficazmente a células cuando se
forman con un colágeno o un derivado de colágeno en un complejo.
Como se usa en este documento, "un ácido
nucleico" puede ser cualquier polinucleótido o cualquier
oligonucleótido y puede ser cualquier molécula de ADN o ARN. Las
moléculas de ADN un ADN sintetizado. Tanto el ADN como el ARN
pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Los monocatenarios
incluyen una hebra codificante y una hebra no codificante. Como se
usa en este documento, "un ácido nucleico" incluye un derivado
de ADN y un derivado de ARN, un derivado que se refiere a un ácido
nucleico que tiene un enlace fosforotioato o un ácido nucleico que
contiene un internucleótido que tiene un resto fosfato, de azúcar o
de base químicamente modificado para evitar degradaciones
enzimáticas. Como se usa en este documento, "un ácido nucleico"
también incluye virus tales como adenovirus y retrovirus.
Preferiblemente, "un ácido nucleico" es un
oligonucleótido o una ribozima y más preferiblemente un
oligonucleótido o una ribozima que tiene de 5 a 30 unidades.
En el caso de que los ácidos nucleicos sean
oligonucleótidos, los mismos incluyen una secuencia de bases, de la
cual al menos la parte se une de forma complementaria en condición
fisiológica a una hebra sentido o antisentido de un gen que
codifica una proteína que tiene un efecto fisiológico para alterar
la homeostasis de un organismo vivo, un gen específico para virus,
bacterias o similares patógenos y, más específicamente, los mismos
incluyen una secuencia de bases que se une de forma complementaria
al ARN mensajero de un gen específico para un virus, una bacteria o
similares patógeno o un gen que codifica una proteína que tiene un
efecto fisiológico para alterar la homeostasis de un organismo
vivo.
Más específicamente, los oligonucleótidos como
se usan en la presente invención incluyen una secuencia
complementaria a una región que contiene un codón de iniciación de
un ARN mensajero o a un sitio de empalme de un ARN mensajero
precursor. Los ejemplos de los oligonucleótidos como se usan en la
presente invención incluyen, por ejemplo, los que se usan para el
tratamiento o prevención de un cáncer, tales como un oligonucleótido
que tiene una secuencia de
5'-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3' (SEC ID
Nº:1) que inhibe específicamente la expresión de
hst-1; ISIS3521 que inhibe específicamente la
expresión de proteína quinasa C_{\alpha} para tratar eficazmente
cánceres progresivos tales como carcinoma de células no pequeñas de
pulmón y cáncer de colon y que se ha aplicado en los experimentos
al tratamiento de cáncer prostático, cáncer mamario, cáncer ovárico,
cáncer pancreático, cáncer de intestino grueso, carcinoma de
células pequeñas de pulmón; ISIS132/CGP69846A que inhibe
específicamente la expresión de quinasa C-raf y se
ha aplicado en los experimentos al tratamiento de cáncer prostático,
cáncer mamario, cáncer ovárico, cefalofima, cáncer pancreático,
cáncer de intestino grueso, carcinoma de células pequeñas de
pulmón; ISIS 2503 que inhibe específicamente la expresión de Haras y
se ha aplicado en los experimentos al tratamiento de cáncer de
intestino grueso, cáncer mamario, cefalofima, cáncer pancreático y
cáncer de células pequeñas; GEM231 que inhibe específicamente la
expresión de proteína quinasa A de tipo I; MG98 que inhibe
específicamente la expresión de ADN metiltransferasa;
INXC-6295 que inhibe la expresión de
c-myc; INX-3001 que inhibe la
expresión de c-myb y se ha considerado para
aplicarse al tratamiento de leucemia; G-3139
(Genasense) que inhibe la expresión de bc1-2 y se
ha considerado para aplicarse al tratamiento de linfoma no Hodgkin,
cáncer de intestino grueso, carcinoma de células pequeñas de pulmón,
leucemia linfática crónica, leucemia mieloide aguda, cáncer
mamario, linfoma, melanoma, mieloma, carcinoma de células no
pequeñas de pulmón, cáncer prostático; un oligonucleótido que
inhibe la expresión de la proteína MDM2; un oligonucleótido que
inhibe la expresión de VEGF y similares. Además, los ejemplos de
oligonucleótidos usados para el tratamiento o prevención de
enfermedades infecciosas incluyen GEM92 y GPI-2A que
inhiben el crecimiento de VIH. ISIS2922 (formivirsen), Vitravene,
ISIS 13312 y GEM 132 que inhiben el crecimiento de citomegalovirus,
ISIS 14803 que inhibe el crecimiento de virus de hepatitis C y
similares. Los ejemplos de oligonucleótidos usados para el
tratamiento de inflamación incluyen ISIS2302 que inhibe
específicamente la expresión de ICAM-1 y que se ha
aplicado en los experimentos al tratamiento de enfermedad de Crohn,
colitis ulcerativa, inhibición de rechazo de transplante de riñón,
psoriasis y asma; EPI-2000 que inhibe la expresión
de receptor A1 de adenosina y se ha aplicado en los experimentos al
tratamiento de asma y oligonucleótidos que inhiben la expresión de
FNT-_{\alpha}, CD49d (VLA-4),
VCAM-1, PECAM-1 y similares.
Además, los ejemplos de los oligonucleótidos que previenen la
restenosis después de angiogénesis coronaria transluminal
percutánea incluyen Resten-NG que inhibe la
expresión de c-myc.
Los genes que codifican una proteína que muestra
un efecto fisiológico para alterar la homeostasis incluyen, por
ejemplo, una serie de genes, denominados genes de cáncer.
Específicamente, los mismos incluyen genes de factores de
crecimiento, tirosina quinasas de tipo receptoras, tirosina quinasas
de tipo no receptoras, proteínas de unión a GTP,
serina-treonina quinasas, factores de transcripción
y similares. Más específicamente, los mismos incluyen genes que
codifican hst-1 u ornitina descarboxilasa y
similares.
La preparación para facilitar la transferencia
de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede
comprender además un aditivo farmacéuticamente aceptable apropiado
además del complejo de la presente invención. Los aditivos
farmacéuticamente aceptables incluyen un agente que hace isotónico,
un modificador del pH y un agente calmante en caso del uso del
complejo como inyección y un excipiente, un disgregante y un agente
de recubrimiento en caso del uso del complejo como sólido, así como
los que se describen en Japanese Handbook of Pharmaceutical
Excipients (Japan Pharmaceutical Excipientes Council). Los ejemplos
específicos incluyen sales y sacáridos, que se usan para mantener el
pH 6-8 o para mantenerse isotónicos con las
células.
La preparación para facilitar la transferencia
de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede
estar en una forma de sólido o solución. La preparación en una forma
de sólido se carga en una célula deseada tal como está o después de
preparar una solución con agua purificada, una solución fisiológica,
un tampón isotónico con organismos vivos o similares. Tal
preparación en una forma de solución también constituye una parte de
la presente invención.
La administración de la preparación para
facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la
presente invención se puede seleccionar entre vía oral, inyección,
gotas oculares, gotas nasales, vía transpulmonar, absorción
transdérmica y se prefieren la vía oral e inyección. La preparación
se puede administrar a diversos sitios dependiendo de las
enfermedades y se pueden poner en el sitio necesario en el momento
de la operación.
En la presente realización, la invención
proporciona:
- (1)
- Una preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico a un célula diana, que comprende como un componente imprescindible un complejo, preferiblemente partículas de un complejo que comprende un ácido nucleico deseado y un colágeno o un derivado de colágeno, donde el eje principal de la partícula es preferiblemente 300 nm a 300 \mum, más preferiblemente 300 nm a 100 \mum, aun más preferiblemente 300 nm a 50 \mum y lo más preferiblemente 300 nm a 30 \mum.
- (2)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (1) donde la célula diana es una célula animal;
- (3)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (2) donde la célula diana es un órgano o un tejido que requiere tratamiento o las células alrededor del mismo;
- (4)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3) donde el colágeno es atelocolágeno;
- (5)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (4) donde el peso molecular del colágeno es de aproximadamente 300.000 a aproximadamente 900.000;
- (6)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (5) donde el derivado de colágeno es una gelatina o un complejo de entrecruzamiento de gelatina;
- (7)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (5) donde el derivado de colágeno es un complejo de entrecruzamiento de colágeno;
- (8)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (7) donde el ácido nucleico es un oligonucleótido;
- (9)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (8) donde el oligonucleótido tiene una longitud de 5 a 30 unidades;
- (10)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (8) ó (9) donde el oligonucleótido es un ADN o un derivado de ADN;
- (11)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (8) ó (9) donde el oligonucleótido es un ARN o un derivado de ARN;
- (12)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (10) u (11) donde el derivado de ADN o el derivado de ARN tiene al menos un enlace fosforotioato;
- (13)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (7) donde el ácido nucleico es una ribozima o un oligonucleótido;
- (14)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (1) a (13) donde la preparación está en una forma de solución y el complejo comprende 10 mg/ml o menos de un ácido nucleico;
- (15)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (14) donde el complejo comprende 1 mg/ml o menos de un ácido nucleico;
- (16)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (15) donde el complejo comprende 500 \mug/ml o menos de un ácido nucleico;
- (17)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (1) a (16) donde la preparación tiene pH 5 a pH 9, preferiblemente, pH 6 a pH 8;
- (18)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (1) a (17) comprendiendo además ácido fosfórico en una concentración de 0,001 M a 0,1 M;
- (19)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (18) comprendiendo además ácido fosfórico en una concentración de 0,01 M a 0,1 M;
- (20)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (1) a (19) comprendiendo además un agente que inhibe la formación de cuerpo de asociación de colágeno, por ejemplo, sacarosa o arginina y
- (21)
- La preparación para facilitar la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con (1) a (20) comprendiendo además una cantidad apropiada de un aditivo farmacéuticamente aceptable.
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Como la tercera realización, la presente
invención proporciona un complejo que comprende un colágeno o un
derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado. Los complejos
incluyen complejos electrostáticos que se unen y forman por la
fuerza electrostática y complejos físicos que se unen y forman por
la fuerza física tal como unión hidrófoba. Ambos sistemas de unión
pueden coexistir y esta realización también está dentro del alcance
de la presente invención.
Se ha observado por primera vez que un colágeno
interacciona electrostáticamente con un ácido nucleico para formar
un complejo.
Como se usa en este documento, "complejos
electrostáticos" se refiere a complejos poliiónicos entre un
colágeno o un derivado de colágeno que tiene muchas cargas
eléctricas en la molécula y un ácido nucleico y específicamente se
refiere a cuerpos de unión en los que un colágeno o un colágeno
cargado positivamente atrae eléctricamente a un ácido nucleico
cargado negativamente. En los complejos poliiónicos se liberan
muchos contra iones a partir de la molécula en la formación de
complejo y, por lo tanto, se produce un aumento muy grande en la
entropía. Considerando la formación de tales complejos
electrostáticos, se entiende que la expresión sostenida de un ácido
nucleico como se ha observado en los ejemplos de trabajo se
produciría a partir de la formación de complejo que conduce a la
estabilidad aumentada de ácidos nucleicos dentro de las células.
La unidad mínima del complejo de la presente
invención es un complejo formado por una molécula de colágeno y una
molécula de ácido nucleico. Se ha observado que un colágeno forma un
complejo con un ácido nucleico y se asocia de forma estimulante con
otro colágeno para formar un cuerpo de asociación. El cuerpo de
asociación se forma de una manera que una molécula de colágeno que
tiene una forma cilíndrica donde el eje principal es
aproximadamente 300 nm y el diámetro es 1,5 nm se asocia en su
mayoría paralela al eje longitudinal de la molécula. Por
consiguiente, los complejos se forman por la unión no covalente
entre muchos cuerpos de asociación y muchas moléculas de ácido
nucleico e incluyen complejos filamentosos que tienen un eje
longitudinal de 1 nm o más como un resultado de la extensión en
gran parte desarrollada de los cuerpos, complejos filamentosos
donde cuerpos finos se unen cada uno a través de ácidos nucleicos y
complejos de partículas formados por más complejos finos y ácidos
nucleicos.
Los complejos de la presente invención pueden
tener diversas formas.
Los complejos de la presente invención
preferiblemente están en una forma de partícula. Como se usa en este
documento "partícula" se refiere a una forma que podría
adoptar un colágeno o un derivado de colágeno y no significa
necesariamente una forma esférica. El tamaño mínimo de los complejos
de la presente invención es 300 nm que se corresponde con el eje
principal de un complejo formado por una molécula de colágeno. Las
partículas tienen un eje principal de 300 nm a 1 mm y considerando
la eficacia de transferencia de ácidos nucleicos, preferiblemente
tienen un eje principal de 300 nm a 300 \mum, más preferiblemente
300 nm a 100 \mum, aún más preferiblemente 300 nm a 50 \mum y
más preferiblemente 300 nm a 30 \mum.
Se ha observado que la proporción de un colágeno
o un derivado de colágeno a ácido nucleico compuesto en un complejo
es responsable del hecho de que el complejo pueda adoptar diversas
formas o estructuras y que la forma del complejo depende
exclusivamente del desarrollo de la asociación (fibrosis) del
colágeno o derivado de colágeno promovida por la formación del
complejo con el ácido nucleico. También se ha observado que la
formación excesiva de los cuerpos de asociación no es adecuada para
la transferencia del ácido nucleico y se ha observado que la forma
o la estructura del complejo se podría controlar ajustando la
concentración del colágeno o derivado de colágeno y del ácido
nucleico deseado que se tienen que mezclar, así como factores
ambientales tales como concentración de sal, temperatura, pH y
concentración de glucosa. Además, se ha observado y encontrado que
la asociación de colágeno o derivado de colágeno implicada en la
formación de complejo está influida por la longitud del ácido
nucleico, concluyendo que existe una composición de un colágeno o
derivado de colágeno y un ácido nucleico óptima para la asociación
dependiendo de la longitud del ácido nucleico.
La forma de la estructura del complejo puede
influir en la eficacia de transferencia de ácidos nucleicos a las
células. La observación de que los colágenos están en complejo con
ácidos nucleicos y la forma del complejo influye en la eficacia de
transferencia y la eficacia de expresión de ácidos nucleicos en
células proporciona una estrategia para optimizar la eficacia de
transferencia de ácidos nucleicos. Los liposomas usados en
laboratorio para transferir ácidos nucleicos a células diana son
difíciles de utilizar ampliamente desde puntos de vista prácticos,
ya que los mismos tienen tendencia a agregarse inmediatamente cuando
se combinan con ácidos nucleicos, durante el uso tienen eficacia de
transferencia variable y se preparan necesariamente inmediatamente
antes del uso. Sin embargo, los complejos de la presente invención
son estables en la forma o la estructura cuando se almacenan en
espacio frío. El asunto más importante en técnica de transferencia
génica es que los métodos usados ampliamente son pocos. Los
complejos de la presente invención son estables en la forma o la
estructura y se podrían usar de forma práctica.
En la presente realización, la invención
proporciona:
- (1)
- Una partícula del complejo que comprende un ácido nucleico deseado y un colágeno o un derivado de colágeno;
- (2)
- La partícula del complejo de acuerdo con (1), donde el eje principal es 300 nm a 300 \mum;
- (3)
- La partícula del complejo de acuerdo con (2), donde el eje principal es 300 nm a 100 \mum;
- (4)
- La partícula del complejo de acuerdo con (3), donde el eje principal es 300 nm a 50 \mum, preferiblemente 300 nm a 30 \mum;
- (5)
- La partícula del complejo de acuerdo con (1) a (4), donde el ácido nucleico es un ADN plasmídico;
- (6)
- La partícula del complejo de acuerdo con (5), donde la proporción del número de una molécula de colágeno o una molécula de derivado de colágeno al número de un monómero de nucleótido del ADN plasmídico es de 1:20 a 1:el número de un monómero de nucleótido del ADN plasmídico, preferiblemente de 1:50 a 1: el número de un monómero de nucleótido del ADN plasmídico, más preferiblemente 1:50 a 1:4000, aún más preferiblemente 1:50 a 1:2000 y más preferiblemente 1:50 a 1:1000;
- (7)
- La partícula del complejo de acuerdo con (1) a (4), donde el ácido nucleico es un oligonucleótido;
- (8)
- La partícula del complejo de acuerdo con (7), donde la proporción del número de un colágeno o un derivado de colágeno al número de un monómero de nucleótido del oligonucleótido en el complejo es 1:1 a 1:200, preferiblemente 1:3 a 1:150 y más preferiblemente 1:3 a 1:120;
- (9)
- La partícula del complejo de acuerdo con (8), donde la proporción es 1:20 a 1:120;
- (10)
- La partícula del complejo de acuerdo con (9), donde la proporción es 1:50 a 1:120;
- (11)
- La partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que está comprendida en una solución de pH 5 a pH 9, preferiblemente pH 6 a pH 8;
- (12)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende mezclar un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en una solución enfriada hasta 10ºC o menos;
- (13)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende mezclar un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en una solución que comprende ácido fosfórico en una concentración de 0,001 M a 0,1 M;
- (14)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende mezclar un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en una solución que comprende ácido fosfórico en una concentración de 0,01 M a 0,1 M;
- (15)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende mezclar un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en una solución que comprende un agente que inhibe la formación de cuerpo de asociación de colágeno, por ejemplo sacarosa o arginina;
- (16)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende mezclar un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en una solución que comprende una cantidad apropiada de un aditivo farmacéuticamente aceptable donde el aditivo farmacéuticamente aceptable es como se ha definido anteriormente;
- (17)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende combinar dos o más de los procesos de acuerdo con (11) a (16);
- (18)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende además hacer que el complejo pase a través de un filtro que tiene un tamaño de poro de 100 \mum o menos para selección de tamaño.
- (19)
- El proceso de acuerdo con (18), que comprende hacer que el complejo pase a través de un filtro que tiene un tamaño de poro de 10 \mum o menos para selección de tamaño;
- (20)
- Un proceso para preparar una partícula del complejo de acuerdo con (1) a (10), que comprende además centrifugar el complejo a 10.000 rpm o más para concentración y aislamiento;
- (21)
- El proceso de acuerdo con (20), que comprende centrifugar el complejo a 50.000 rpm o más.
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Como se usa en este documento, "el número de
un monómero de nucleótido" se refiere al número de una unidad de
monómero de nucleótido compuesta de un ácido nucleico deseado. Como
se usa en este documento, "la proporción del número de una
molécula de colágeno o una molécula de derivado de colágeno al
número de un monómero de nucleótido" se refiere al número de un
monómero de nucleótido en un ácido nucleico deseado en relación a
una molécula de un colágeno o derivado de colágeno comprendido en
un complejo unido electrostáticamente o físicamente. El número de
un monómero de nucleótido es casi el mismo que "carga negativa de
un ácido nucleico deseado". Como se usa en este documento,
"carga negativa de un ácido nucleico deseado" se refiere al
número de grupos fosfato interpuestos entre nucleótidos compuestos
de un ácido nucleico. Los valores numéricos de la carga negativa
del ácido nucleico son iguales al número de grupos fosfato de un
ácido nucleico, grupos fosfatos interpuestos entre nucleótidos y
grupos que contienen fósforo interpuestos entre nucleótidos (grupos
fosfato y grupos fosforotioatos).
Como se usa en este documento, "un agente que
inhibe la formación de cuerpos de asociación de colágeno" incluye
un agente que inhibe interacciones electrostáticas que causarían la
formación de cuerpos de asociación de colágeno a través de cargas
de aminoácidos básicos y ácidos comprendidos principalmente en una
molécula de colágeno y un agente que inhibe la disposición ordenada
de moléculas de colágeno. Los ejemplos del primero incluyen sales,
aminoácidos y urea y los ejemplos del último incluyen sacáridos
tales como sacarosa y arginina.
La partícula del complejo de acuerdo con la
invención puede estar comprendida en la preparación para facilitar
la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la
invención.
Como la cuarta realización, la invención
proporciona un instrumento médico o un instrumento de cultivo
celular, cuya superficie está recubierta con una partícula del
complejo de acuerdo con la presente invención.
Se ha observado que la eficacia de transferencia
de un ácido nucleico mejora cuando una partícula del complejo de
acuerdo con la presente invención se aplica como recubrimiento sobre
una superficie sólida y las células diana se ponen en contacto con
la misma, en comparación con la adición gota a gota de una partícula
del complejo de acuerdo con la presente invención a las células
diana, en otras palabras, el recubrimiento de sólido de las
partículas de complejo es mejor que la adición gota a gota en
términos de eficacia de transferencia (como se muestra en el Ejemplo
6).
Específicamente, los instrumentos médicos e
instrumentos de cultivo celular de acuerdo con la presente
realización incluyen injertos vasculares artificiales, endoprótesis
vasculares médicas y corazones artificiales. Se requieren injertos
vasculares artificiales para permitir que las células del endotelio
vascular proliferen y se propaguen en su cara interior para inhibir
el desarrollo de fibrina y suprimir la activación de complemento
dentro de los vasos.
Los instrumentos de cultivo celular, cuya
superficie está recubierta con una partícula del complejo que
comprende un ácido nucleico deseado y un colágeno o un derivado de
colágeno incluyen placas, matraces, microplacas de 96 pocillos
usados habitualmente en experimentos de cultivo celular.
El Ejemplo 6 en lo sucesivo ha demostrado que
cantidades de las partículas de complejo aplicadas como
recubrimiento sobre la superficie sólida por área de unidad
influyen drásticamente en la eficacia de transferencia de ácidos
nucleicos a células. Por consiguiente, las cantidades de las
partículas de complejo aplicadas como recubrimiento sobre la
superficie sólida por área de unidad constituyen una parte de la
presente invención.
En este documento se describen lo siguiente;
- (1)
- Un instrumento médico o un instrumento de cultivo celular que está recubierto con una partícula del complejo que comprende un ácido nucleico deseado y un colágeno o un derivado de colágeno;
- (2)
- El instrumento médico o el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1) en el que la partícula del complejo está recubierta para que una cantidad de 0,1 \mug a 50 \mug de un ácido nucleico esté comprendida en 1 centímetro cuadrado;
- (3)
- El instrumento médico o el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1), en el que la partícula del complejo está recubierta para que una cantidad de 0,1 \mug a 50 \mug de un ácido nucleico esté comprendida en 1 centímetro cuadrado;
- (4)
- El instrumento médico o el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (3), en el que la partícula del complejo está recubierta para que una cantidad de 1 \mug a 10 \mug de un ácido nucleico esté comprendido en 1 centímetro cuadrado;
- (5)
- El instrumento médico o el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1), en el que la partícula del complejo que tiene un eje principal de 300 nm a 300 \mum se libera de la superficie sólida cuando se expone a una solución isotónica con un organismo vivo y
- (6)
- El instrumento médico o el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (5), en el que la solución isotónica con un organismo vivo es un tampón de fosfato que comprende cloruro de sodio.
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La distribución factible de la invención en el
mercado es importante para llevar a cabo la presente realización.
Como se ha descrito anteriormente, se requiere que los liposomas se
preparen inmediatamente antes del uso, suponiendo una distribución
extremadamente mala. En general, se cree que es difícil distribuir
adenovirus aplicado como recubrimiento sobre la superficie sólida
de acuerdo con la presente realización. Esto muestra que el
instrumento médico y el instrumento de cultivo celular de acuerdo
con la invención se podrían distribuir factiblemente en el
mercado.
Como se ha descrito anteriormente, se puede usar
una partícula del complejo de acuerdo con la presente invención para
facilitar la transferencia de un ácido nucleico deseado a una célula
diana. Por tanto, como la quinta realización, la presente invención
proporciona un proceso para transferir un ácido nucleico deseado a
una célula diana o un proceso para mejorar el nivel de expresión de
un ácido nucleico deseado en una célula diana, que comprende usar
una partícula del complejo de acuerdo con la presente invención.
Por tanto, en la presente realización, la
invención proporciona:
- (1)
- Un proceso para transferir un ácido nucleico deseado a una célula diana, que comprende usar una partícula del complejo como se ha definido anteriormente que comprende un ácido nucleico deseado y un colágeno o un derivado de colágeno;
- (2)
- Un proceso para mejorar el nivel de expresión de un ácido nucleico deseado en una célula diana, que comprende usar una partícula del complejo como se ha definido anteriormente que comprende un ácido nucleico deseado y un colágeno o un derivado de colágeno;
- (3)
- El proceso de acuerdo con (2), en el que el proceso es mejorar el nivel de expresión,
- (4)
- El proceso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), en el que la partícula del complejo como se ha definido anteriormente se aplica como recubrimiento sobre la superficie sólida y la célula diana se cultiva sobre la superficie sólida.
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De acuerdo con la presente invención en la que
se facilita la transferencia de un ácido nucleico a una célula, es
posible examinar fácilmente la función de un gen o una proteína en
una célula diana. Por ejemplo, el proyecto de genoma humano
identifica un gran número de genes y ha mostrado las secuencias de
bases de los mismos. Es necesario aclarar las funciones de genes
identificados para utilizar esa información de forma práctica en el
campo de medicación o industria alimenticia. Sin embargo, ha estado
claro que el enfoque convencional para examinar la función
produciendo y purificando proteínas de genes una por una requiere
mucho tiempo y no es práctico. Por consiguiente, un proceso para
examinar la función de un gen que comprende transferir un
oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de un gen que
se tiene que examinar a una célula e inhibir la expresión génica
debería ser útil. Por tanto, un liposoma, que es alto en
citotoxicidad, influiría en la información obtenida debido a su
citotoxicidad. Por otra parte, un colágeno como se usa en este
documento difícilmente influye en las células ya que un colágeno
existe de forma original en un organismo vivo y entra en contacto
con las células y, por lo tanto, la invención permite la medición de
funciones génicas sin ruido. Las mediciones particulares comprenden
mezclar un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de un
gen que se tiene que examinar, permitir la formación de partículas
del complejo, después aplicar como recubrimiento y disponer el
mismo sobre la superficie sólida de la placa de cultivo. Las placas
sólidas como se usan en este documento incluyen placas multipocillo
de 96 pocillos y microplacas. Después de que las partículas de
complejo recubiertas se secan e inmovilizan en el sólido, se
siembran y cultivan células en la placa durante varios días. Las
partículas de complejo recubiertas se transfieren eficazmente a
células unidas a la parte recubierta y permiten la expresión de un
gen que se tiene que examinar o la inhibición del mismo durante un
periodo de tiempo largo. Después de algunos días, las funciones de
los genes diana se pueden aclarar examinando la morfología de las
células, el nivel de expresión génica en las células o los tipos o
las cantidades de las proteínas producidas por las células. Las
características de la presente invención también incluyen
transferencia selectiva y eficaz de las partículas de complejo
aplicadas como recubrimiento sobre el sólido a las células unidas a
la parte recubierta. En otras palabras, es posible examinar las
funciones de un gran número de genes en microplacas al mismo tiempo
sin separar las células por pocillos.
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En la presente realización, la invención
proporciona:
- (1)
- Un proceso para examinar la función de un gen o una proteína en una célula diana, que comprende recubrir una superficie sólida con una partícula del complejo de acuerdo con (3) anteriormente de la presente invención que comprende un ácido nucleico que inhibe la expresión del gen o la proteína en una célula; cultivar la célula diana sobre la superficie sólida y examinar el nivel de expresión del ácido nucleico o el nivel de expresión del gen o la proteína en la célula diana o el índice de proliferación o el fenotipo de la célula;
- (2)
- El proceso de acuerdo con (1), en el que el gen o un ácido nucleico que inhibe la expresión de la proteína en una célula es un oligonucleótido antisentido o una ribozima y se examina el nivel de expresión del gen o la proteína.
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De acuerdo con la presente invención en la que
se facilita la transferencia de un ácido nucleico a una célula, es
posible seleccionar un ácido nucleico que sea capaz de compensar
genes normales, reparar o corregir genes defectuosos para tratar
diversas enfermedades tales como enfermedades genéticas, cánceres,
SIDA, artritis reumatoide y enfermedades relacionadas con el estilo
de vida. Por ejemplo, después de que se forman partículas de
complejo con un ácido nucleico que se examina para determinar el
efecto terapéutico sobre enfermedades y un colágeno y se aplican
como recubrimiento, se secan e inmovilizan sobre el sólido como se
ha descrito anteriormente en 6), se cultivan en la placa células
que presentan una patología, transfiriendo eficazmente el ácido
nucleico a la célula que presenta la patología. Los efectos de los
ácidos nucleicos se pueden examinar en base a cambio en la
morfología de las células, muerte celular, proliferación celular,
patrón de expresión génica en las células o los tipos o las
cantidades de las proteínas producidas por las células. Es evidente
que, en la transferencia de ácido nucleico en la realización, se
debe minimizar la influencia y un colágeno, como se usa en este
documento, hace posible examinar el efecto sobre la patología sin
ruido. Las características de la presente invención también
incluyen exámenes coincidentes de un gran número de genes, como se
demuestra mediante el hecho de que ácidos nucleicos que se tienen
que examinar para determinar la función se pueden inmovilizar y
disponer sobre un vehículo sólido de cultivo celular que tiene un
área diminuta.
En la presente realización, la invención
proporciona:
- (1)
- Un proceso para seleccionar un ácido nucleico que trata una enfermedad, que comprende recubrir una superficie sólida con una partícula del complejo de acuerdo con la presente invención que comprende un candidato de ácido nucleico que inhibe la expresión de un gen asociado con la enfermedad en una célula; cultivar la célula que presenta la afección de la enfermedad en la superficie sólida y examinar el nivel de expresión del gen que se tiene que inhibir con cada uno de los candidatos de ácidos nucleicos o el índice de proliferación o el fenotipo de la célula;
- (2)
- Un proceso para examinar un efecto terapéutico de un ácido nucleico que se espera que inhiba la expresión de un gen asociado con una enfermedad, que comprende recubrir una superficie sólida con una partícula del complejo de acuerdo con la presente invención que comprende el ácido nucleico; cultivar la célula que presenta la afección de la enfermedad sobre la superficie sólida y examinar el nivel de expresión del gen o el índice de proliferación o el fenotipo de la célula;
- (3)
- El proceso de acuerdo con (1) ó (2), en el que el ácido nucleico va a inhibir la expresión del gen asociado con la enfermedad en la célula o a tener una función que inhiba la expresión del gen asociado con la enfermedad en la célula y
- (4)
- El proceso de acuerdo con (3), en el que el ácido nucleico que inhibe la expresión del gen asociado con la enfermedad en la célula es el ácido nucleico que tiene una función que inhibe la expresión del gen asociado con la enfermedad en la célula, es un oligonucleótido antisentido o una ribozima.
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- (1)
- Un instrumento de cultivo celular, cuya superficie está recubierta con un ácido nucleico deseado junto con un colágeno o un derivado de colágeno; preferiblemente, el instrumento de cultivo celular en el que el ácido nucleico deseado está en complejo con el colágeno o el derivado de colágeno para formar una partícula del complejo;
- (2)
- Un instrumento de cultivo celular, cuya superficie está recubierta con una película que comprende un colágeno o un derivado de colágeno que contiene un ácido nucleico deseado; preferiblemente, el instrumento de cultivo celular en el que el ácido nucleico deseado está en complejo con el colágeno o el derivado de colágeno para formar una partícula del complejo;
- (3)
- Un instrumento de cultivo celular, cuya superficie está recubierta con una película que comprende un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado;
- (4)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1) a (3), en el que el ácido nucleico constituye una genoteca;
- (5)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (4), en el que el ácido nucleico es un oligonucleótido que constituye una genoteca;
- (6)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (4) ó (5), en el que el ácido nucleico que constituye una genoteca se divide en compartimientos a cierta distancia el uno del otro;
- (7)
- Una película que comprende un colágeno o un derivado de colágeno y un ácido nucleico deseado en la que el ácido nucleico que constituye una genoteca se divide en compartimientos a cierta distancia el uno al otro; preferiblemente, la película en la que el ácido nucleico está en complejo con el colágeno o el derivado de colágeno para formar una partícula del complejo;
- (8)
- La película de acuerdo con (7), en la que el ácido nucleico es un oligonucleótido que constituye una genoteca;
- (9)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (2) ó (3), cuya superficie está recubierta con la película de acuerdo con (7) u (8);
- (10)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (9), que se usa para la expresión de proteínas;
- (11)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (9), que se usa para la inhibición de expresión génica:
- (12)
- Un proceso para examinar la función de un gen en una célula, que comprende cultivar la célula en el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1) a (6) sobre el cual se inmoviliza un ácido nucleico y examinar el índice de proliferación o el fenotipo de la célula o el nivel de producción de determinadas proteínas;
- (13)
- Un proceso para examinar la función de un gen en una célula, que comprende cultivar la célula en el instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1) a (6) en el cual se inmoviliza un oligonucleótido que contiene una secuencia de bases complementaria a un ARN mensajero del gen y examinar el índice de proliferación o el fenotipo de la célula o el nivel de producción de determinadas proteínas y
- (14)
- El instrumento de cultivo celular de acuerdo con (1) a (6), en el que la superficie del instrumento de cultivo celular fuera de la parte inmovilizada por el ácido nucleico es tan altamente hidrófila o hidrófoba según la célula no esté unida;
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Para transferir un ácido nucleico a una célula
diana en fase sólida, la célula se puede cultivar en un instrumento
de cultivo celular, sobre el cual se inmoviliza directamente un
ácido nucleico deseado junto con un colágeno o un derivado de
colágeno o un ácido nucleico deseado en complejo con el colágeno o
el derivado de colágeno para formar una partícula del complejo.
Alternativamente, las células diana se pueden cultivar en un
instrumento de cultivo celular, cuya superficie está recubierta con
una película que comprende un colágeno o se puede usar un derivado
de colágeno que contiene un ácido nucleico deseado o una película
que comprende una partícula del complejo y una película hecha de
agarosa y albúmina que comprende un colágeno o un derivado de
colágeno que contiene un ácido nucleico deseado o una partícula del
complejo.
La presente invención comprende preparar una
genoteca que esté constituida con diversos ácidos nucleicos en
complejo con un colágeno o un derivado de colágeno
independientemente sobre la fase sólida y hace posible examinar las
funciones de los genes en células al mismo tiempo y en la misma
condición. Además, la invención proporciona una genoteca de
expresión génica o una genoteca de inhibición de expresión génica
donde un oligonucleótido que comprende el ADNc de la genoteca se
dispone sobre la fase sólida, permitiendo el examen de las funciones
génicas en una fase de la célula.
Cuando un complejo que comprende un ácido
nucleico se dispone sobre la fase sólida y se cultivan células sobre
el mismo para examinar las funciones del gen transferido, es
necesario evitar la contaminación de las células, a cada una de las
cuales se transfiere ácido nucleico respectivo dispuesto
independientemente.
Las características de la presente invención
también incluyen transferencia selectiva y eficaz de las partículas
de complejo aplicadas como recubrimiento sobre el sólido a las
células unidas a la parte recubierta. En otras palabras, es posible
examinar las funciones de un gran número de genes en microplacas al
mismo tiempo sin dividir las células en compartimientos por
pocillos. Para hacer esto, se pueden usar pocillos para dividir en
compartimientos cada parte dispuesta por los ácidos nucleicos y de 6
a 384 pocillos pueden dividir en compartimientos una placa. Además
de los pocillos, alternativamente, se puede usar superficie en la
fase sólida que sea tan altamente hidrófila o hidrófoba según la
célula no esté unida para evitar que las células se muevan a través
de las partes dispuestas por los ácidos nucleicos. Como se usa en
este documento, la superficie que es altamente hidrófila se refiere
a superficie que tiene un ángulo de contacto con el agua de 40
grados o menos y la superficie que es altamente hidrófoba se
refiere a superficie que tiene un ángulo de contacto con el agua de
110 grados o más. La distancia entre los ácidos nucleicos
dispuestos se debe mantener a lo largo de la longitud de la mayor
extensión de las células sembradas. Por tanto, cuando la superficie
del instrumento de cultivo celular fuera de la parte inmovilizada
por el ácido nucleico o la parte recubierta con una película que
comprende un ácido nucleico, no es necesario realizar el cultivo
dividiendo en compartimientos las células con pocillos y es posible
examinar las funciones de un gran número de los genes en una
microplaca.
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La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes Ejemplos y Experimentos, pero no está
limitada por estos Ejemplos y Experimentos de ninguna manera.
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(Comparativo)
Cantidades iguales tanto de una solución acuosa
que contiene un ADN plasmídico (pCAHST-1: 7,9 Kbp)
incorporado con un gen de factor de crecimiento de fibroblastos
HST-1 (FGF4) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
2890-2984 (1987)) a 10 \mug/ml como de una
solución acuosa neutra que contiene 200, 60, 20, 6, 2, 0,6 y 0
\mug de un atelocolágeno (KOKEN CO., LTD.) se mezclaron y las
mezclas se analizaron en electroforesis en gel de agarosa. La
electroforesis en gel de agarosa se realizó con gel de agarosa al
0,8% en tampón TAE (Tris-acetato) en Unidad de
Electroforesis Horizontal (Mupid, Advance CO.). Después de la
electroforesis, el gel se tiñó con bromuro de etidio y se
fotografió con un transiluminador. Los resultados se muestran en la
Figura 1. pCAHST-1 en presencia del colágeno a 10
\mug/ml o más no se desarrolló en electroforesis y se conservó en
el pocillo. Esto significa que pCAHST-1 a 5
\mug/ml formó complejo con el colágeno a 10 \mug/ml.
De forma similar, cantidades iguales tanto de 10
\mug/ml de pCAHST-1 como de 100 \mug/ml de
colágeno se mezclaron en tampón Tris clorhidrato 10 mM (pH 7,5) que
contenía cloruro de sodio 1,0 M y la mezcla se sometió a
electroforesis, cuyos resultados se muestran en la Figura 2. Cuando
coexistió cloruro de sodio 1,0 M, el pCAHST-1 se
desarrolló en electroforesis sin tomar en cuenta la presencia del
colágeno a 100 \mug/ml. Esto significa que un complejo formado por
pCAHST-1 y el colágeno debería ser un complejo
electrostático.
Además, la formación de un complejo entre 10
\mug/ml de pCAHST-1 y el colágeno en tampón Tris
clorhidrato 10 mM (pH 7,5) que contenía cloruro de sodio 1,0 M se
comparó entre la presencia y la ausencia de heparán sulfato. Los
resultados se muestran en la Figura 3. En ausencia de heparán
sulfato, todos los 5 \mug/ml de pCAHST-1 formaron
complejo con 100 \mug/ml de colágeno, mientras que en presencia de
heparán sulfato, se observó que hubo alguna cantidad de
pCAHST-1 que no formó complejo con colágeno incluso
a 300 \mug/ml. Esto significa que el heparán sulfato que tiene
una carga negativa similar a pCAHST-1 provoca la
competición en formación de complejo con el colágeno entre
pCAHST-1 y heparán sulfato, sugiriendo que
pCAHST-1 y un colágeno forman un complejo
electrostático.
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(Comparativo)
Cantidades iguales tanto de una solución acuosa
que contiene pCAHST-1 a 200 \mug/ml como de una
solución acuosa que contiene un atelocolágeno a 0, 20, 200 y 1000
\mug/ml se mezclaron y a la mezcla se añadió Reactivo de
Cuantificación PicoGreen dsDNA (Molecular Probes) para teñir
pCAHST-1 y se observó por microscopía. Los
resultados se muestran en la Figura 4. En caso de que la
concentración de colágeno después de la mezcla sea 500 \mug/ml
(el 0,05% de colágeno en la figura), se observaron predominantemente
los complejos filamentosos que tienen un eje principal de más de 1
mm, mientras los complejos de partículas que tienen un eje principal
de 10 a 100 \mum se observaron predominantemente en caso de que
la concentración de colágeno fuera 100 \mug/ml (el 0,01% de
colágeno en la figura) y los complejos de partículas que tenían un
eje principal de 10 \mum o menos se observaron predominantemente
en caso de que la concentración de colágeno fuera 10 \mug/ml (el
0,001% de colágeno en la figura). Esto significa que la formación de
los complejos se puede controlar mediante las concentraciones de
ADN plasmídico y colágenos en el momento de la mezcla. Estos
complejos mantuvieron estable su forma a lo largo de una semana o
más cuando se almacenaron a 5ºC (Figura 5). Esto significa que los
complejos se pueden almacenar durante un período de tiempo largo y
se pueden distribuir en el mercado tal como están, sin requerir la
preparación inmediata antes del uso.
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(Comparativo)
Cantidades iguales tanto de una solución acuosa
que contiene un ADN plasmídico que codifica una proteína
fluorescente (EGFP)
(pCMV-EGFP/pEGFP-N1, Clontech Co.) a
200 \mug/ml como de una solución acuosa que contiene un
atelocolágeno al 0,02% (p/p) se mezclaron para preparar una
formulación en una forma de gel.
A células de riñón embrionarias humanas, células
293 cultivadas en una placa (diámetro: 6 cm), se añadieron 100
\mul de la formulación de gel (que contiene 10 \mug de
pCMV-EGFP) en presencia de 2 ml de medio sin suero.
Después, después de cultivarlas a 37ºC durante la noche, las células
se lavaron con PBS para retirar el medio sin suero y la formulación
y se cultivaron en un medio que contenía el 10% de suero de ternera.
Las células se observaron mediante microscopía de fluorescencia con
curso temporal para comprobar la expresión de EGFP. Como un
control, se añadió una solución de PBS que contenía una cantidad
igual de pCMV-EGFP y un complejo de una formulación
de liposoma catiónica y pCMV-EGFP a las células
293.
Los resultados se muestran en la Figura 6. En
caso de la formación de gel de pCMV-EGFP, se observó
la expresión de EGFP y se encontró que la expresión se mantenía
durante un período de tiempo largo hasta 52 días después de la
adición. Por otra parte, en caso de la solución de PBS que contenía
pCMV-EGFP, no se observó expresión de EGFP y en el
caso de la formulación de liposoma catiónica, se observó que la
expresión de EGFP se mantenía solamente durante un período de
tiempo corto de 2 días. Estos resultados muestran que la formulación
de ADN plasmídico con un colágeno promueve la eficacia de expresión
de un ADN plasmídico y mantiene la expresión durante un período de
tiempo más largo.
Esto significa que un complejo como el formado
con un ADN plasmídico y un colágeno promueve la transferencia de un
ADN plasmídico a una célula y mejora la estabilidad del ADN
plasmídico dentro y fuera de la célula, dando como resultado la
extensión de la expresión génica en la célula. Sin estar limitado a
una teoría de funcionamiento particular, se cree que el hecho de
que la expresión se extendiera durante un período de tiempo más
largo en ausencia de cualquier complejo en el sistema muestra que
los complejos interaccionan con las células tan marcadamente como
que los complejos no se retiran mediante el lavado o que los
complejos se incorporan en las células.
\newpage
(Comparativo)
Usando pCMV-EGFP como un ADN
plasmídico, se prepararon complejos que tienen la composición
mostrada en la Tabla 1
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\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que sus eficacias de
transferencia se promueven en el orden de complejo de
EGFG-3 > complejo de EGFG-2 >
complejo de EGFG-4 = complejo de
EGFG-5. No se observó transferencia en
EGFG-1. Esto muestra que la formación de un ADN
plasmídico con un atelocolágeno promueve la eficacia de expresión
de un ADN plasmídico y que la eficacia de expresión en los complejos
que contienen la cantidad igual de ADN plasmídico varía dependiendo
del contenido de atelocolágeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Cero, 10, 50, 100, 250 y 500 \mul de complejo
de EGFG-3 (atelocolágeno al 0,01%, 100 \mug/ml de
pCMV-EGFP), que en el Ejemplo 4 se observó que
tienen la eficacia de transferencia más alta, se añadieron a las
células 293 cultivadas en una placa de 6 pocillos en presencia de 1
ml de medio sin suero. Entonces, después de cultivo a 37ºC durante
la noche, las células se lavaron con PBS para retirar el medio sin
suero y el complejo y el medio se reemplazó por FBS al 10% (un
medio que contiene suero de ternera al 10%). Las células se
observaron mediante microscopía de fluorescencia con curso temporal
a lo largo de 6 días para comprobar la expresión de EGFP.
Cuando se aumentó la cantidad de ADN plasmídico,
entonces la eficacia de transferencia también mejoró. Los datos
particulares se muestran a continuación. En la tabla, la eficacia de
expresión se estimó mediante el recuento del número de células que
emiten fluorescencia causada por expresión de EGFP entre el recuento
de número de todas las células existentes en el compartimiento
definido por el intervalo microscópico.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En primer lugar, se optimizó la composición de
un colágeno y un ADN plasmídico en base a la composición del
complejo de EGFG-3 (el 0,01% de atelocolágeno, 10
\mug/ml de pCMV-EGFP), que se observó que tenía la
eficacia de transferencia más alta y después, los tiempos de
duración de expresión se compararon entre la adición gota a gota y
el recubrimiento de sólido.
(1) Usando pCMV-EGFP como un ADN
plasmídico, se prepararon complejos que tienen las diversas
composiciones de concentraciones de atelocolágeno que se muestran en
la Tabla 3.
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Los complejos preparados se añadieron gota a
gota a las células 293 cultivadas en una placa de 6 pocillos en
presencia de medio sin suero. Entonces, después de cultivarlas a
37ºC durante la noche, las células se lavaron con PBS para retirar
el medio sin suero y el complejo y el medio se reemplazó por un
medio que contenía suero de ternera al 10%. Siete días más tarde,
las células se observaron mediante microscopía de fluorescencia y
se realizó el recuento de las células que expresaban EGFP. Los
resultados se muestran en le Figura 7. Para
EGFG-3B, 3D y 3E, se midieron las intensidades de
fluorescencia de los EGFP expresados (Array Scan II System,
Cellomics, Co.). Las intensidades de fluorescencia relativas se
muestran en la Figura 8.
Los complejos preparados se aplicaron como
recubrimiento sobre una placa de 6 pocillos a 250 \mul/pocillo y
la placa se secó al aire durante 30 minutos. Después, las células
293 (4-5x10^{5} células/pocillo) en un medio que
contenía el 10% de FBS se añadieron a los mismos y se cultivaron a
37ºC durante la noche. Siete días más tarde, las células se
observaron mediante microscopía de fluorescencia y se realizó el
recuento de las células que expresaban EGFP. Los resultados se
muestran en la Figura 9.
La Figura 7 que muestra los resultados de
adición gota a gota y la Figura 9 que muestra los resultados de
recubrimiento de sólido indican que la concentración de colágeno
influye en la eficacia de transferencia y el recubrimiento de sólido
es mejor que la adición gota a gota en eficacia de
transferencia.
(2) Se prepararon complejos que tenían las
diversas composiciones de concentraciones de ADN plasmídico que se
muestran en la Tabla 4 y se compararon las eficacias de
transferencias entre adición gota a gota y recubrimiento de
sólido.
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Los resultados de adición gota a gota se
muestran en la Figura 10 y los resultados de recubrimiento de sólido
se muestran en la Figura 11. Las intensidades relativas de
fluorescencia de EGFP en cada muestra obtenida en recubrimiento de
sólido también se muestran en la Figura 12. Estos resultados
muestran que la concentración de ADN plasmídico influye en la
eficacia de transferencia, específicamente el nivel de expresión de
EGFP y la concentración de plásmido o ADN están en una correlación
positiva y también que el recubrimiento de sólido es mejor en
eficacia de transferencia que la adición gota a gota.
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Diez \muM de un oligonucleótido antisentido
fosforotioato
(5'-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3'; Peso
molecular, aproximadamente 6500; SEC ID Nº: 2) (5) (Sawaday) que
tiene una secuencia complementaria a una secuencia de 4196 pb a 4216
pb del gen HST-1 (FGF4) del factor de crecimiento
de fibroblastos (descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
2890-2984 (1987)) se mezclaron con una solución al
0,05% de atelocolágeno para formar complejos. Los complejos se
aplicaron como recubrimiento al fondo de una placa de 96 pocillos
para cultivo celular y se secaron al aire para obtener un
instrumento de cultivo celular en el que los fondos estaban
recubiertos con el complejo. De forma similar, un oligonucleótido
sentido fosforotioato
(5'-GAGCATCCGCAACATCAACA-3'; SEC ID
Nº: 3) (1) que tiene la misma secuencia que el gen
HST-1, así como oligonucleótidos antisentido
fosforotioato que tienen una secuencia (5'-
AGTCGCATGCACACAACACA-3'; SEC ID Nº: 4) (2) obtenidos
codificando la secuencia de oligonucleótido antisentido y las tres
secuencias aleatorias
(5'-GACCATCGTCGATTCCAGT-3'; SEC ID
Nº: 5) (3),
(5'-CATGAACATCCTGAGCATCC-3'; SEC ID
Nº: 6) (4) y
(5'-GTTCACGAAGAAAGAAGGCT-3'; SEC ID
Nº: 7) (6)) cada una se mezcló con un colágeno para formar
complejos, complejos que se aplicaron como recubrimiento al fondo y
se secaron. En la placa recubierta con esos oligonucleótidos, se
sembraron células NEC8 en las que la proliferación se promovió
mediante sobreexpresión de HST-1 y células HepG2 en
las que la proliferación se promovió por el gen diferente a
HST-1 a 0,5 x 10^{5} células/pocillo y las
células se cultivaron durante 4 días. Después del cultivo, la
inhibición de proliferación celular se ensayó usando Reactivo de
Ensayo de Proliferación Celular TetraColor ONE. Específicamente, la
solución de muestra teñida se determinó espectrométricamente a 650
nm, usando la absorbancia a 450 nm como control (Figura 13).
Como resultado, el efecto inhibidor de la
proliferación de células NEC 8 se observó sólo en el caso del
recubrimiento del complejo formado entre un oligonucleótido
antisentido frente a HST-1 y un colágeno (Figura
13-5). Por otra parte, no se observó efecto
inhibidor en el caso de la aplicación como recubrimiento al fondo de
la placa del complejo formado entre un oligonucleótido sentido
frente a HST-1 y un colágeno (Figura
13-1). También, no se observó efecto inhibidor en
el caso de la aplicación como recubrimiento al fondo de la placa del
complejo formado entre los oligonucleótidos antisentido
fosforotioato que tienen la secuencia que codifica la secuencia de
oligonucleótido antisentido (Figura 13-2) y las
secuencias aleatorias (Figura 13-3, 4, 6) y un
colágeno. Estos resultados muestran que es posible seleccionar un
gen responsable de la proliferación celular sin reactivos para
transferencia génica tales como liposomas catiónicos y lípidos
catiónicos, que habitualmente no se encuentran en organismos vivos,
cuando se aplica como recubrimiento un oligonucleótido antisentido
en complejo con un atelocolágeno sobre la fase sólida y se cultivan
células en la misma. Además, estos resultados muestran que el
presente proceso permite examinar sensiblemente las funciones del
gen usando incluso una pequeña cantidad de las células y los
oligonucleótidos sin ruido debido a daño de las células por los
reactivos de transferencia génica.
\newpage
(Comparativo)
Se mezclaron diez \mul de una solución de un
vector de adenovirus, AdCMVEGFP (K. Aoki, et al., Mol. Ther.
(2000) 1 (6): 555-565) a 1x10^{8} ufp/ml en una
solución de DMEM con 5 \mul de una solución al 2% de un
atelocolágeno en PBS (-). Se añadieron cincuenta \mul de la mezcla
a una placa de cultivo de 24 pocillos (no recubierta) (Corning
Inc.) y la placa se secó al aire con un secador ajustado en modo
frío a temperatura ambiente durante 15 minutos para realizar el
recubrimiento de sólido.
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Mientras la placa de cultivo resultante se dejó
como estaba a temperatura ambiente, se añadió una línea de células
de hepatoma humano, las células HepG2 a la misma a 2 x 10^{5}
células/pocillo 1 día, 7 días y 14 días después de la dejarlas y
cada 2 días más tarde se observó el nivel de expresión de GFP
mediante microscopía de fluorescencia. Como control, se realizó un
experimento similar usando una placa de cultivo recubierta con sólo
adenovirus y con sólo un atelocolágeno.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 5 muestra que el vector de adenovirus
sobrevivió durante el almacenamiento por incluso 14 días, sugiriendo
que el recubrimiento de sólido de la presente invención proporciona
una placa para selección que comprende vectores de adenovirus, que
se podría distribuir de manera práctica en el mercado.
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(Comparativo)
Se mezclaron cantidades iguales tanto de una
solución de un vector de adenovirus AdCMVEGFP (K. Aoki, et
al. Mol. Ther. (2000) 1 (6): 555-565) en DMEM a
4 x 10^{4}, 4 x 10^{5}, 4 x 10^{6} y 4 x 10^{7} ufp/ml como
de una solución de 160 \mug/ml de un atelocolágeno. La mezcla se
podría almacenar a 4ºC durante un período de tiempo largo sin
disminuir la actividad. Cincuenta \mul de la mezcla se añadieron a
una placa de cultivo de 96 pocillos (no recubierta; Coming Inc.) y
la placa se secó al aire para realizar el recubrimiento de sólido.
La placa se puede almacenar al menos durante 2 semanas sin actividad
disminuida. Células madre embrionarias (células ES) se sembraron en
la placa de cultivo resultante y, tres días después, la expresión
de GFP se comprobó con microscopía de fluorescencia, determinando
simultáneamente la intensidad de fluorescencia. Como resultado, se
observó que la intensidad de fluorescencia de GFP está
correlacionada positivamente con la dosis de adenovirus (Figura
14). Los resultados muestran que la presente invención debería
proporcionar una herramienta útil para selección de alto
rendimiento de células ES usando adenovirus y una placa para
selección, que está recubierta con complejos formados por adenovirus
y colágeno.
\newpage
(Comparativo)
Cantidades iguales tanto de una solución acuosa,
un tampón fosfato (PB) 0,1 M o un tampón fosfato que contiene
cloruro de sodio (PBS) 0,01 M, cada uno de los cuales contenía un
ADN plasmídico que codifica una proteína fluorescente (EGFP)
(pCMV-EGFP/ pEGFP-N1, 4,7 kbp,
Clontech Co.) a 200 \mug/ml y se enfrió hasta 10ºC o menos, como
de una solución acuosa que contenía un atelocolágeno (KOKEN CO.,
LTD) del 0,002 al 0,02% (p/p) enfriada hasta 10ºC o menos se
mezclaron y las mezclas se dejaron como estaban durante la noche a
10ºC o menos para preparar una formulación en forma de gel. La
formulación de gel se hizo pasar a través de un filtro que tenía un
tamaño de poro de 70 \mum o 10 \mum para preparar una
formulación de gel que tenía un tamaño ordenado.
A la formulación, se añadió Reactivo de
Cuantificación PicoGreen dsDNA (Molecular Probes) para teñir
pCMV-EGFP y se determinó el eje principal de los
complejos mediante microscopía de fluorescencia. De forma similar,
se mezclaron un ADN plasmídico
(pCMV-HST-1-IL-2,
6,2 kbp) que codificaba el péptido de señal secretoria de
HST-1 e interleuquina 2 y un atelocolágeno para
preparar una formulación en una forma de gel y se determinó el eje
principal de los complejos. Además, la formulación de gel se sometió
a electroforesis en gel de agarosa (tampón
Tris-acetato, gel de agarosa al 0,8%) para separar
ADN plasmídicos formados en complejos de aquellos que no se
formaron en complejos. La banda de los ADN plasmídicos que no se
formaron en complejos se tiñó con bromuro de etidio y se determinó
la intensidad de fluorescencia con
Fluor-S-Multi Imager
(BIO-RAD). La cantidad de los ADN plasmídicos que
no se formaron en complejos se determinó en base a la distribución
normal obtenida a partir de la intensidad de fluorescencia de la
banda del ADN plasmídico con la concentración conocida cuando se
sometió a electroforesis y la proporción de la carga negativa del
ADN contenido en el complejo al peso molecular del colágeno. Los
resultados se muestran en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla, "Disolv." significa
disolvente. "C.C. (%)" significa concentración de colágeno (%).
"Número de M.N por M.C" significa número de monómeros de
nucleótido por molécula de colágeno. "Después de filtro de 70
\mum" significa después de hacer pasar a través de un filtro
que tiene un tamaño de poro de 70 \mum. "Después de filtro de
10 \mum" significa después de hacer pasar a través de un filtro
que tiene un tamaño de poro de 10 \mum.
En los casos tanto de pCMV-EGFP
como de
pCMV-HST-1-IL-2,
se usó un agua sin sales como disolvente para obtener complejos en
los que el eje principal promedio es 122 \mum o más, cuando la
concentración de colágeno fue del 0,05% o más. Cuando la
concentración de colágeno fue del 0,005% al 0,02%, se obtuvieron
complejos que tenían un eje principal promedio de 6,1 \mum a 53
\mum y cuando la concentración de colágeno fue del 0,001%, se
obtuvieron complejos que tenían un eje principal promedio de 10
\mum o menos. Los resultados muestran que la forma o la
estructura de un complejo se puede controlar ajustando la
concentración de un ADN plasmídico y un colágeno que se tienen que
mezclar, cuando se usa un agua sin sales como un disolvente.
Los resultados concuerdan con los obtenidos en
el Ejemplo 2 donde se usó pCAHST-1 para preparar
complejos. Cada uno de los ADN plasmídicos usados en el mismo fue
de tamaño diferente ya que pCAHST-1 es 7,9 kbp,
pCMV-EGFP es 4,7 kbp y
pCMV-HST-1-IL-2
es 6,2 kbp, demostrando que los tamaños de ADN plasmídicos nunca
influyen en la forma o estructura de los complejos que se tienen que
formar.
Por otra parte, se usó tampón fosfato 0,1 M y
tampón fosfato que contenía cloruro de sodio 0,01 M como un
disolvente para obtener complejos que tenían un eje principal
promedio de 3,4 \mum a 29 \mum y no complejos que tenían un
tamaño de 100 \mum o más, cuando la concentración de colágeno fue
del 0,001% al 0,1%. Se creyó que esto fue causado por las sales,
que inhibieron la formación de cuerpos de asociación de colágeno,
demostrando que cuando se preparan complejos en presencia de un
agente que inhibe la formación de cuerpo de asociación de colágeno,
entonces se pueden preparar complejos que tienen un eje principal
promedio de 100 \mum o menos, independientemente de la
concentración de colágeno.
Además, cuando la formulación de gel obtenida
mezclando un ADN plasmídico y un colágeno se hizo pasar a través de
un filtro que tenía un tamaño de poro de 70 \mum o 10 \mum, se
podían preparar complejos que tenían un eje principal promedio más
pequeño y que tenían un tamaño ordenado.
La Figura 15 muestra la relación entre el número
de colágeno unido a una molécula de ADN plasmídico y el eje
principal promedio de los complejos. En los casos tanto de
pCMV-EGFP como de
pCMV-HST-1-IL-2
usados en un agua sin sales, se observó que el eje principal
promedio de los complejos tiende a prolongarse aumentando en el
número de colágeno unido a ADN plasmídico. Por otra parte, cuando se
usó tampón fosfato 0,1 M y tampón fosfato que contenía cloruro de
sodio 0,01 M como un disolvente para preparar complejos, no se
observó una tendencia tal como la anterior y, aún en la condición
de que moléculas de colágeno que tienen un eje principal promedio
de 100 \mum o más se formaron en complejo con un ADN plasmídico en
caso del uso de agua como un disolvente, el eje principal promedio
no excedió 50 \mum. Se entiende que esto está causado por reacción
de extensión a lo largo del eje principal del cuerpo de asociación
de colágeno, del cual la formación se desarrolla mediante la
formación de complejos de un ADN plasmídico y un colágeno como se ha
observado en el caso de que un agua sea un disolvente como se ha
mencionado anteriormente. Por otra parte, en el caso de presencia de
sales, se entiende que el cuerpo de asociación de colágeno formado
por unión de una molécula de colágeno con un ADN plasmídico no se
prolonga bien a lo largo del eje principal y, por lo tanto, se unen
muchos cuerpos de asociación finos a un ADN plasmídico para formar
una estructura. Se conoce que el colágeno forma cuerpos de
asociación finos en concentraciones de sal apropiadas. Por tanto, se
puede considerar que una cantidad parcial de colágeno ya se ha
formado con un ADN plasmídico en cuerpos finos antes de mezclarse
con un ADN plasmídico y los cuerpos de asociación de colágeno finos
se unen a un ADN plasmídico para formar complejos. Esto significa
que se pueden preparar complejos que tienen un eje principal
promedio
de 50 \mum o menos mezclando un ADN plasmídico y un colágeno que se ha formado en cuerpos de asociación finos.
de 50 \mum o menos mezclando un ADN plasmídico y un colágeno que se ha formado en cuerpos de asociación finos.
Para el análisis general de esos resultados
independientemente del tamaño de ADN plasmídicos, se realizó el
recuento del número de monómeros de nucleótido de un ADN plasmídico
por una molécula de colágeno en complejos. La Figura 16 muestra la
relación entre el número de monómeros de nucleótido de ADN
plasmídicos por una molécula de colágeno y el eje principal promedio
de los complejos. Se observó que el eje principal promedio de los
complejos tiene tendencia a prolongarse disminuyendo en el número de
monómeros de nucleótido de ADN plasmídico.
Tomando la Figura 16 y la Tabla 6 en conjunto,
se concluye lo siguiente. Cuando el número de monómeros de
nucleótido es 95 o menos, se obtuvieron complejos que tienen un eje
principal promedio de 120 \mum o más. Esto significa que la
disminución en el número de monómeros de nucleótido por una molécula
de colágeno representa el aumento en el número de moléculas de
colágeno con relación al ADN plasmídico en los complejos y, por
tanto, se pueden preparar complejos que tienen un eje principal
promedio de 120 \mum o menos manteniendo el número de monómeros
de nucleótido de ADN plasmídico por una molécula de colágeno para
que sean 96 o más. Por otra parte, la unidad mínima de los
complejos es un complejo formado por una molécula de colágeno y una
molécula de ADN plasmídico. Una molécula de colágeno y mucho ADN
plasmídico difícilmente forman complejos ya que los ADN plasmídicos
se repelen por su carga negativa y experimentan impedimento
estérico. Por consiguiente, el número máximo de monómeros de
nucleótido por una molécula de colágeno se obtiene formando un
complejo con cada molécula de colágeno y ADN plasmídico y se define
mediante el número de monómeros de nucleótido comprendidos en un ADN
plasmídico.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cantidad igual de una solución acuosa, o un
tampón fosfato (PB) 0,1 M, cada uno de los cuales contenía un
oligonucleótido antisentido fosforotioato
(5'-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3'; Peso
molecular, aproximadamente 6500; SEC ID Nº: 8) (Espec Inc.) que
tiene una secuencia complementaria a una secuencia de 4196 pb a 4216
pb de gen HST-1 (FGF4) de factor de crecimiento de
fibroblastos (descritos en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
2890-2984 (1987)) en una concentración de 2,0 \muM
a 40,0 \muM y se enfrió hasta 10ºC o menos y una solución acuosa
que contenía un atelocolágeno (KOKEN CO., LTD) del 0,002 al 3,0%
(p/p) enfriada hasta 10ºC o menos, tampón fosfato 0,1 M se
mezclaron a 10ºC o menos y las mezclas se dejaron como estaban
durante la noche a 10ºC o menos para preparar formulaciones en una
forma de gel. Las cantidades de oligonucleótidos que formaron
complejo con un colágeno en las formulaciones de gel se determinaron
de la siguiente forma. Las formulaciones de gel se centrifugaron a
150.000 rotaciones por hora a 5ºC para precipitar los complejos y
las cantidades de oligonucleótidos liberados en el sobrenadante se
determinaron mediante HPLC (columna: Puresil C18 5 (Waters), fase
móvil: un gradiente del 24,5% al 35% de acetonitrilo a lo largo de
35 minutos en acetato de amonio 0,1 M que contenía tetrabutil
amonio 5 mM y EDTA 1 mM, caudal: 1 ml/min, longitud de onda de
detección: 260 nm). Se añadió reactivo de tinción de fluorescencia
de ácidos nucleicos Monocatenarios YOYO (Molecular Probes) a las
formulaciones resultantes para teñir los oligonucleótidos, que se
observaron mediante microscopía fluorescente para medir el eje
principal de los complejos. Los resultados se muestran en la Tabla
7.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar al Ejemplo 10 en el que se
usaron ADN plasmídicos, se obtuvieron complejos mezclando
oligonucleótidos y colágenos. En casos de uso tanto de agua sin
sales como de tampón fosfato 0,1 M como disolvente, no hubo cambio
significativo en el eje principal de los complejos entre las
diferencias en las concentraciones de colágeno y oligonucleótido,
lo cual fue diferente del caso de ADN plasmídicos. Se cree que esto
está causado por el hecho de que los oligonucleótidos son más
pequeños que los ADN plasmídicos en tamaño molecular y, por tanto,
se inhibe la formación de cuerpos de asociación de colágeno.
La Figura 17 muestra la relación entre la
proporción de número molecular de oligonucleótidos a colágeno en el
momento de la mezcla y el número de oligonucleótido unido a una
molécula de colágeno en el complejo. Se ha observado que el número
de oligonucleótidos unido a una molécula de colágeno en los
complejos formados tiene tendencia a aumentar como un aumento en el
número de oligonucleótidos con relación al número de moléculas de
colágeno en el momento de la mezcla en los casos en los que se usó
tanto agua como el tampón fosfato como un disolvente. El número
máximo de moléculas de oligonucleótidos unidas a una molécula de
colágeno varía dependiendo de los tipos de disolvente y es 6
moléculas en el caso de agua, mientras que es 3 moléculas en el caso
de tampón fosfato.
Debido a que el peso molecular de un colágeno
(300.000) es incluso más grande que el de un oligonucleótido
(aproximadamente 6.500) y la forma o la estructura de los complejos
depende exclusivamente del número de moléculas de colágeno que
forman complejos, los números de moléculas de colágeno en complejos
que tienen el mismo eje principal es aproximadamente el mismo. Por
consiguiente, incluso para los complejos que tienen el mismo eje
principal, el número de moléculas de oligonucleótido comprendidas en
complejos varía dependiendo del número de oligonucleótidos unidos a
una molécula de colágeno. Debido a que el complejo individual se
pone en contacto con una célula para permitir que los
oligonucleótidos se transfieran a la célula, la transferencia de
oligonucleótidos es más eficaz cuando se usa un complejo que tiene
un contenido alto de moléculas de oligonucleótido. Por consiguiente,
se desea un complejo en el que el número de moléculas de
oligonucleótido por una molécula de colágeno esté aumentado y, en
términos generales, se prefiere un complejo en el que el número de
monómeros de nucleótido unido a una molécula de colágeno esté
aumentado.
\vskip1.000000\baselineskip
Cincuenta \mul de la formulación de gel como
se prepararon en el Ejemplo 11 (11-3, la composición
de la formulación del Ejemplo 7) se añadieron gota a gota al fondo
de una microplaca de 96 pocillos y se secaron pulverizando
directamente un aire frío (temperatura ambiente, 2 horas) o
poniéndolo en un desecador con gel de sílice (temperatura ambiente,
2 días) para preparar un instrumento de cultivo celular, cuya
superficie de cultivo celular está recubierta con un complejo. Se
añadieron cien \mul de tampón fosfato (PBS) 0,01 M, que se había
ajustado para ser isotónico con organismos vivos complementándolo
con cloruro de sodio, a los pocillos del instrumento y el pipeteo
se condujo ligeramente inmediatamente para muestreo. Además, se
añadieron 100 \mul de tampón fosfato (PBS) 0,01 M, que se había
ajustado para ser isotónico con organismos vivos complementándolo
con cloruro de sodio, a los pocillos del instrumento y el
instrumento se dejó durante la noche a 37ºC, seguido de pipeteo de
forma ligera para muestreo. A 10 \mul de la muestra resultante, se
añadieron 2 \mul de reactivo de tinción de fluorescencia de
ácidos nucleicos Monocatenarios YOYO (Molecular Probes) para teñir
los oligonucleótidos y los complejos que se liberaron a partir de la
superficie del instrumento se observaron por microscopía
fluorescente. La micrografía de fluorescencia se muestra en la
Figura 18. En todas las muestras se observaron los complejos que
tienen un eje principal de 50 \mum o menos. Esto significa que la
exposición a PBS permite liberar complejos a partir de la superficie
de un instrumento de cultivo celular. La forma o la estructura de
los complejos liberados no cambió entre antes y después del
recubrimiento de la superficie del instrumento independientemente
del método de secado y la condición de exposición a PBS. Esto
muestra que los complejos se conservan en la superficie de un
instrumento de cultivo celular manteniendo su forma o estructura
independientemente del método de secado y que la forma o la
estructura de los complejos se mantiene en una condición de
temperatura de 37ºC que se usa habitualmente en cultivo celular.
\vskip1.000000\baselineskip
(Comparativo)
Se añadieron cincuenta \mul de la formulación
de gel como se preparó en el Ejemplo 10 (10-3, que
tiene la composición que se observó que era eficaz en eficacia de
transferencia en el Ejemplo 6) gota a gota al fondo de una
microplaca de 96 pocillos y se secó pulverizando directamente un
aire frío (temperatura ambiente, 2 horas) o poniéndola en un
desecador con gel de sílice (temperatura ambiente, 2 días) para
preparar un instrumento de cultivo celular, cuya superficie de
cultivo celular está recubierta con un complejo. Se añadieron cien
\mul de tampón fosfato (PBS) 0,01 M, que se había ajustado para
ser isotónico con organismos vivos complementándolo con cloruro de
sodio, a los pocillos del instrumento y el pipeteo se condujo
ligeramente inmediatamente para muestreo. Además, se añadieron 100
\mul de tampón fosfato (PBS) 0,01 M, que se había ajustado para
ser isotónico con organismos vivos complementándolo con cloruro de
sodio, a los pocillos del instrumento y el instrumento se dejó
durante la noche a 37ºC, seguido de pipeteo de forma ligera para
muestreo. A 10 \mul de la muestra resultante, se añadieron 2
\mul de reactivo de tinción de fluorescencia de ácidos nucleicos
Monocatenarios YOYO (Molecular Probes) para teñir los
oligonucleótidos y los complejos que se liberaron a partir de la
superficie del instrumento se observaron mediante microscopía
fluorescente. La micrografía de fluorescencia se muestra en la
Figura 19. En todas las muestras se observaron los complejos que
tienen un eje principal de 100 \mum o menos. Esto significa que
la exposición a PBS permite liberar complejos a partir de la
superficie de un instrumento de cultivo celular. La forma o la
estructura de los complejos liberados no cambió entre antes y
después del recubrimiento de la superficie del instrumento
independientemente del método de secado y condición de exposición a
PBS. Esto muestra que los complejos se conservan en la superficie de
un instrumento de cultivo celular manteniendo su forma o estructura
independientemente del método de secado y que la forma o la
estructura de los complejos se mantiene en una condición de
temperatura de 37ºC que se usa habitualmente en cultivo celular.
\newpage
(Comparativo)
Se añadieron trescientos \mul de las
formulaciones de gel como se prepararon en el Ejemplo 10,
10-1, 10-4 y 10-7,
que comprendían pCMV-EGFP a una microplaca de
cultivo celular de 6 pocillos y se secaron pulverizando un aire
frío para preparar un instrumento de cultivo celular sobre el cual
se aplicó como recubrimiento un complejo que comprendía
pCMV-EGFP. Como control, se añadieron 300 \mul de
una solución acuosa que comprendía pCMV-EGFP a 100
\mug/ml a una placa y se secó de forma similar. En cada pocillo,
se sembraron 7,5 x 10^{4} células de células 239 y se añadió un
medio DMEM que contenía FBS al 10% a la misma, seguida de cultivo a
37ºC. Desde el inicio del cultivo, el medio se reemplazó con un
medio fresco cada 4 ó 5 días. Once días después de la siembra, las
células se observaron mediante microscopía fluorescente y se realizó
el recuento del número de células que expresaban GFP para estimar la
eficacia de transferencia.
De forma similar, se añadieron 300 \mul o 500
\mul de las formulaciones de gel como se prepararon en el Ejemplo
10, 10-13 a 22 y 24, que comprendían
pCMV-HST-1-IL-2
a una microplaca de cultivo celular de 6 pocillos y se secaron
pulverizando un aire frío para preparar un instrumento de cultivo
celular sobre el que se aplicó como recubrimiento un complejo que
comprendía
pCMV-HST-1-IL-2.
Como control, 300 \mul o 500 \mul de una solución acuosa que
comprendía
pCMV-HST-1-IL-2
a 100 \mug/ml, solución PB o solución PBS se añadieron a una placa
y se secaron de forma similar.
Se sembraron 7,5 x 10^{4} células de células
239 en cada pocillo en los que se habían aplicado como recubrimiento
300 \mul de formulación de gel y se añadió medio DMEM que
contenía FBS al 10% a los mismos, seguido de cultivo a 37ºC durante
10-13 a -19. Ocho días después de la siembra de
células, el medio se reemplazó y se determinó la concentración de
IL-2 en el medio muestreado 11 días después mediante
ELISA (Quamitikine human IL-2 (R&D Systems)).
Para 10-20 a -22, se añadió un medio DMEM a la placa
y se cultivó durante la noche a 37ºC, después de lo cual el medio
se reemplazó al día siguiente con medio DMEM que contenía FBS al 10%
y después se cultivó a 37ºC. Ocho días y 11 días después de la
siembra de células, el medio se reemplazó y se determinó la
concentración de IL-2 en el medio muestreado 15
días después mediante ELISA. Además, para 10-20, 21
y 24, se añadió un medio DMEM que contenía FBS al 10% a la placa y
la placa se cultivó a 37ºC. La concentración de IL-2
en el medio muestreado 8 días después de la siembra de células se
determinó mediante ELISA.
En el pocillo en el que se aplicaron como
recubrimiento 500 \mul de 10-14 a -17, se
sembraron 5 x 10^{4} células de células NIH3T3 y se añadió al
mismo medio DMEM que contenía FBS al 10%, seguido de cultivo a 37ºC.
Ocho días después de la siembra de células, el medio se muestreó y
la concentración de IL-2 en el mismo se determinó
por ELISA.
Los resultados obtenidos en 1) anteriormente y
29 se resumen en las Tablas 8 y 9. Cuando están en complejo con un
colágeno y se aplican como recubrimiento sobre un instrumento de
cultivo celular, tanto pCMV-EGFP como
pCMV-HST-1-IL-2
se podrían transferir eficazmente a células 293 y células NIH3T3. El
resultado muestra que el efecto de los complejos de la presente
invención sobre la facilitación de la transferencia génica no está
influido por los tipos de ADN plasmídico, especies de las células ni
la presencia o ausencia de suero en el cultivo. Además, en el caso
de ADN plasmídicos, se ha observado que el recubrimiento del
complejo que tiene 1112 o menos del monómero de nucleótido por una
molécula de colágeno y que tiene un eje principal promedio de 151
\mum o menos, proporcionó mejor eficacia de transferencia y
expresión génica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Comparativo)
Se sembraron 5 x 10^{4} células de células 239
en una placa de 6 pocillos y se cultivaron en presencia de un medio
DMEM que contenía FBS al 10% a 37ºC. Tres días después de la
siembra, se añadieron a la misma 300 \mul de las formulaciones de
gel como se prepararon en el Ejemplo 10, 10-1,
10-4, 10-7, 10-8,
10-9 y 10-10, que comprendían
pCMV-EGFP y una solución de agua o de PB que
comprendía pCMV-EGFP a 100 \mug/ml como control y
las células se cultivaron en presencia de un medio DMEM que contenía
FBS al 10% a 37ºC. Al día siguiente, los medios se reemplazaron con
un medio fresco y 13 días después por 10-1,
10-4 y 10-7 o 5 días después por
10-8, 10-9 y 10-10,
las células
se observaron mediante microscopía fluorescente, seguido de recuento del número de células que expresaban GFP.
se observaron mediante microscopía fluorescente, seguido de recuento del número de células que expresaban GFP.
\newpage
De forma similar, se sembraron 7,5 x 10^{4}
células de células 239 en una placa de 6 pocillos y se cultivaron
en presencia de un medio DMEM que contenía FBS al 10% a 37ºC. Dos
días después de la siembra, 300 \mul de las formulaciones de gel
como se prepararon en el Ejemplo 10, 10-20 y
10-21, que comprendían
pCMV-HST-1-IL-2
y una solución de PB que comprendía
pCMV-HST-1-IL-2
a 100 \mug/ml como control se añadieron cada una a la misma y las
células se cultivaron en presencia de un medio DMEM que contenía FBS
al 10% a 37ºC. Al día siguiente, los medios se reemplazaron con un
medio fresco y, 5 días más tarde, los medios se muestrearon y se
determinó la concentración de IL-2 en los mismos
mediante ELISA (Quamtikine human IL-2 (R&D
Systems)).
Los resultados se resumen en las Tablas 10, 11 y
12. Cuando estaban en complejo con un colágeno y se añadieron a
células, tanto pCMV-EGFP como
pCMV-HST-1-IL-2
se podían transferir eficazmente a las células 293. Se ha observado
que en el caso de complejos que tienen un eje principal promedio de
53 \mum o menos como se muestra en el presente Ejemplo, la
adición del complejo que tiene 2406 o menos y además 701 o menos de
los monómeros de nucleótido por una molécula de colágeno,
proporcionó mejor eficacia de transferencia y expresión génica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con los complejos de la presente
invención, es posible conservar y estabilizar ácidos nucleicos
deseados formando complejos con colágenos o derivados de colágeno,
2) transferir eficazmente ácidos nucleicos deseados a células
cuando se administran a organismos vivos y 3) expresar e inhibir
ácidos nucleicos deseados sin reactivos para transferencia génica.
Los complejos de la presente invención se pueden aplicar a diversos
aspectos ya que los complejos de la invención tienen ventajas 1) que
los ADN, oligonucleótidos antisentido y vectores de virus se pueden
conservar y estabilizar, 2) que los complejos se pueden almacenar
durante un periodo de tiempo largo en placas secadas donde los
complejos están aplicados como recubrimiento, 3) que los genes se
pueden expresar sin reactivos de transferencia génica cuando las
células se siembran en las placas, 4) que los tipos de sujetos de
ácidos nucleicos y métodos de inmovilización no están limitados a
unos específicos y 5) que el tiempo de duración de la expresión en
el caso de ADN plasmídicos es excelentemente prolongado.
De acuerdo con la presente invención, es posible
examinar fácilmente las funciones de genes o proteínas, cuyas
expresiones están inhibidas por oligonucleótidos antisentido
determinando la proliferación o la morfología de las células o los
niveles de expresión de citoquinas o receptores. No sólo
oligonucleótidos antisentido, sino también otros materiales pueden
formar complejos con colágenos para formar complejos, que a su vez
se pueden aplicar como recubrimiento en placas; en el caso de
ribozimas, es posible realizar una selección similar a la de los
oligonucleótidos antisentido y, además, en el caso de ADN
plasmídicos o adenovirus, es posible examinar las funciones de
genes o proteínas determinando los cambios de las células mediante
la expresión de determinados genes. Se conoce que los colágenos o
derivados de colágenos comprendidos en los complejos de la presente
invención no influyen a las células y la selección usando los
complejos de la presente invención hace posible realizar los
exámenes de funciones génicas, que rara vez evitan las influencias
inespecíficas a células, que se inducirían por reactivos
convencionales para transferencia génica.
<110> Sumitomo Pharmaceuticals Company,
Limited et al.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un proceso para facilitar la
transfección génica
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 663264
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2001-186320
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-06-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2001-278293
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-09-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtaggcg ttgtagttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero antisentido fosforotioato.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtaggcg ttgtagttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero sentido fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcatccgc aacatcaaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero desorganizado fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcgcatgc acacaacaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero aleatorio fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatcgtc gattccagt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero aleatorio fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgaacatc ctgagcatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero aleatorio fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcacgaag aaagaaggct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligómero antisentido fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtaggcg ttgtagttgt
\hfill20
Claims (5)
1. Un complejo electrostático que consiste en un
oligonucleótido y un atelocolágeno, para facilitar la transferencia
de dicho oligonucleótido a una célula diana, en el que el tamaño del
complejo electrostático es 300 nm a 30 \mum.
2. El complejo electrostático de la
reivindicación 1, en el que el oligonucleótido es uno de
5-30 oligómeros.
3. El complejo electrostático de la
reivindicación 1 ó 2, en el que la proporción del número de
moléculas de atelocolágeno al número de monómeros de nucleótido del
oligonucleótido es 1:20 a 1:120.
4. El complejo electrostático de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula diana es una
célula animal.
5. El complejo electrostático de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el oligonucleótido es un
derivado de ADN o un derivado de ARN.
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