JP2666535B2 - 大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法 - Google Patents
大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、化学的処理による大腸菌のコンピテントセ
ル化の際に使用するコンピテントセル化緩衝液および該
緩衝液を用いた大腸菌のコンピテントセル化方法に関す
る。
ル化の際に使用するコンピテントセル化緩衝液および該
緩衝液を用いた大腸菌のコンピテントセル化方法に関す
る。
（従来の技術） 大腸菌のコンピテントセル化は、Mendel ＆ Higaによ
る報告以来数多くの調製法が報告されている。特にHana
hanらの報告（J.Mol.Biol.1983 166.557−580）では、
いくつかの大腸菌に関して高効率の形質転換を可能とす
る方法が報告されている。
る報告以来数多くの調製法が報告されている。特にHana
hanらの報告（J.Mol.Biol.1983 166.557−580）では、
いくつかの大腸菌に関して高効率の形質転換を可能とす
る方法が報告されている。
（発明が解決しようとする課題） Hanahanらは、１−5x108colonies/μｇ−pBR322の高
効率の形質転換能を有するコンピテントセルを大腸菌よ
り調製する方法について報告しているが（J.Mol.Biol.1
983 166.557−580）、この方法では、高効率の形質転換
能を有するコンピテントセルを安定して再現性よく調製
する事が困難である。また保存の間にしばしばその形質
転換効率が低下することが観察されている。また、大腸
菌の効率良い軽質転換方法として、最近、高電圧電気穿
孔による方法がWilliam J.Dower,Jeff F.Miller ＆ Cha
rles W.Ragsdaleらによって報告されている。（Nucleic
Acid Research 1988 Vol.166 Number 13 6127−6144）
しかし、電子穿孔法では処理する大腸菌懸濁液の塩濃度
が非常に制限されるため、軽質転換に用いるプラスミド
溶液の状態が著しく限定されていた。
効率の形質転換能を有するコンピテントセルを大腸菌よ
り調製する方法について報告しているが（J.Mol.Biol.1
983 166.557−580）、この方法では、高効率の形質転換
能を有するコンピテントセルを安定して再現性よく調製
する事が困難である。また保存の間にしばしばその形質
転換効率が低下することが観察されている。また、大腸
菌の効率良い軽質転換方法として、最近、高電圧電気穿
孔による方法がWilliam J.Dower,Jeff F.Miller ＆ Cha
rles W.Ragsdaleらによって報告されている。（Nucleic
Acid Research 1988 Vol.166 Number 13 6127−6144）
しかし、電子穿孔法では処理する大腸菌懸濁液の塩濃度
が非常に制限されるため、軽質転換に用いるプラスミド
溶液の状態が著しく限定されていた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、大腸菌の化学的処理によるコンピテン
トセル化の際の、緩衝液について検討しその最適成分を
見いだし、上記の課題を解決する事に成功した。
トセル化の際の、緩衝液について検討しその最適成分を
見いだし、上記の課題を解決する事に成功した。
すなわち、本発明は（ａ）塩化マンガン、（ｂ）塩化
カルシウム、（ｃ）塩化カリウムおよび（ｄ）ピペラジ
ン−N,N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−
（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸、N,N−ビス−（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルフォリ
ノ）プロパンスルホン酸および酢酸カリウムからなる群
から選ばれた少くとも一種の緩衝能を有する化合物を含
むことを特徴とする大腸菌のコンピテントセル化緩衝液
および該緩衝液によって大腸菌を処理することを特徴と
する大腸菌のコンピテントセル化方法である。
カルシウム、（ｃ）塩化カリウムおよび（ｄ）ピペラジ
ン−N,N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−
（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸、N,N−ビス−（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルフォリ
ノ）プロパンスルホン酸および酢酸カリウムからなる群
から選ばれた少くとも一種の緩衝能を有する化合物を含
むことを特徴とする大腸菌のコンピテントセル化緩衝液
および該緩衝液によって大腸菌を処理することを特徴と
する大腸菌のコンピテントセル化方法である。
本発明を実施するに当たっては、まず大腸菌を通常の
液体培養で培養する。本発明において使用される大腸菌
は特に限定されず、例えば、エッシエリヒア コリーDH
5、エッシエリヒア コリーHB101、エッシエリヒア コ
リーJM109等を例示することができる。培地の栄養源と
しては、通常微生物の培養に用いられるものが広く用い
られる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物等が
使用される。炭素源としては特に必要としないが、例え
ばグルコース、シュークロース、マンニトール等を必要
であれば添加してもよい。その他、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リ
ン酸第一カリウム、リン酸第二カリウムなどの塩類が必
要に応じて使用される。
液体培養で培養する。本発明において使用される大腸菌
は特に限定されず、例えば、エッシエリヒア コリーDH
5、エッシエリヒア コリーHB101、エッシエリヒア コ
リーJM109等を例示することができる。培地の栄養源と
しては、通常微生物の培養に用いられるものが広く用い
られる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物等が
使用される。炭素源としては特に必要としないが、例え
ばグルコース、シュークロース、マンニトール等を必要
であれば添加してもよい。その他、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リ
ン酸第一カリウム、リン酸第二カリウムなどの塩類が必
要に応じて使用される。
培養温度は、菌が発育可能な範囲内で適宜変更し得る
が、好ましくは16℃〜37℃、特に17℃〜20℃が好まし
い。
が、好ましくは16℃〜37℃、特に17℃〜20℃が好まし
い。
培養は回転式振とう機、または往復式振とう機を用い
て行う。回転数、または振とう数は、使用する培養器、
及び振とう機の振幅によって適宜設定すればよい。
て行う。回転数、または振とう数は、使用する培養器、
及び振とう機の振幅によって適宜設定すればよい。
培養時間は、使用する大腸菌、培養温度によって異な
る。培養終了は対数増殖期中期が好ましいが、使用する
大腸菌の種類によって適宜決定すればよい。この様にし
て得られた大腸菌の菌体を、延伸分離等によって集め、
コンピテントセル化緩衝液にて処理する。
る。培養終了は対数増殖期中期が好ましいが、使用する
大腸菌の種類によって適宜決定すればよい。この様にし
て得られた大腸菌の菌体を、延伸分離等によって集め、
コンピテントセル化緩衝液にて処理する。
本発明のコンピテントセル化緩衝液は、（ａ）塩化マ
ンガン10〜100mM好ましくは、20〜60mM、（ｂ）塩化カ
ルシウム５〜40mM好ましくは10〜30mM、（ｃ）塩化カリ
ウム10〜1000mM好ましくは100〜500mM、（ｄ）ピペラジ
ン−N,N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−
（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸、N,N−ビス−（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルフォリ
ノ）プロパンスルホン酸および酢酸カリウムからなる群
から選ばれた少くとも１種の緩衝能を有する化合物１〜
50mM、好ましくは１〜40mMを含有し、pHは5.5〜7.5、好
ましくは6.5〜7.0である。なお、前記各物質の添加順
序、添加方法は特に限定されない。
ンガン10〜100mM好ましくは、20〜60mM、（ｂ）塩化カ
ルシウム５〜40mM好ましくは10〜30mM、（ｃ）塩化カリ
ウム10〜1000mM好ましくは100〜500mM、（ｄ）ピペラジ
ン−N,N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−
（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸、N,N−ビス−（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルフォリ
ノ）プロパンスルホン酸および酢酸カリウムからなる群
から選ばれた少くとも１種の緩衝能を有する化合物１〜
50mM、好ましくは１〜40mMを含有し、pHは5.5〜7.5、好
ましくは6.5〜7.0である。なお、前記各物質の添加順
序、添加方法は特に限定されない。
コンピテントセル化緩衝液による処理方法は、集菌し
た大腸菌菌体を氷中で、培地容量の１〜1/5培養量のコ
ンピテントセル化緩衝液で懸濁後氷中に10〜30分放置
後、遠心分離によって再度菌体を集める。この操作を１
〜３回繰り返した後、菌体を氷中で培地容量の1/10〜1/
20容量のコンピテントセル化緩衝液に懸濁後、ジメチル
スルホキシドを４〜10％好ましくは６〜８％となるよう
に添加し、更に、氷中で10〜30分放置する。保存のため
に、この様に調製したコンピテントセル懸濁液を連結保
存用バイアルに分注後、液体窒素液相中にて連結後、液
体窒素気相中で保存する。
た大腸菌菌体を氷中で、培地容量の１〜1/5培養量のコ
ンピテントセル化緩衝液で懸濁後氷中に10〜30分放置
後、遠心分離によって再度菌体を集める。この操作を１
〜３回繰り返した後、菌体を氷中で培地容量の1/10〜1/
20容量のコンピテントセル化緩衝液に懸濁後、ジメチル
スルホキシドを４〜10％好ましくは６〜８％となるよう
に添加し、更に、氷中で10〜30分放置する。保存のため
に、この様に調製したコンピテントセル懸濁液を連結保
存用バイアルに分注後、液体窒素液相中にて連結後、液
体窒素気相中で保存する。
本発明によってコンピテントセル化された大腸菌体の
形質転換効率は、以下に述べる測定法に基づいて測定し
た。
形質転換効率は、以下に述べる測定法に基づいて測定し
た。
形質転換効率の測定法 上記のような方法で調製、保存されているコンピテン
トセルを室温にて溶解後200μを、1ng/μのアンピ
シリン耐性遺伝子を含むプラスミドpBR322溶液１μと
をGreiner製15ml容ポリプロピレンチューブ内で混合
し、氷中30分放置する。次いで、42℃にて30秒加温処理
し、更に氷中にて１分間冷却する。SOC（培地の一種組
成：バクトトリプトン2.0％、バクトイースト抽出物0.5
％、塩化ナトリウム10mM、塩化カリウム2.5mM、硫酸マ
グネシウム10mM、塩化マグネシウム10mM、グルコース20
mM）800μを添加後、37℃にて150rpmの速度で振とう
培養する。１時間後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB
寒天培地に、上記コンピテントセル懸濁液を10〜1000培
希釈後その100μを撒き広げ、37℃で15〜18時間培養
後、形成されたコロニーの数を求める。得られたコロニ
ー数より、pBR3221μｇ当り形質転換される大腸菌の数
を求め、これをコンピテントセルの形質転換効率とす
る。
トセルを室温にて溶解後200μを、1ng/μのアンピ
シリン耐性遺伝子を含むプラスミドpBR322溶液１μと
をGreiner製15ml容ポリプロピレンチューブ内で混合
し、氷中30分放置する。次いで、42℃にて30秒加温処理
し、更に氷中にて１分間冷却する。SOC（培地の一種組
成：バクトトリプトン2.0％、バクトイースト抽出物0.5
％、塩化ナトリウム10mM、塩化カリウム2.5mM、硫酸マ
グネシウム10mM、塩化マグネシウム10mM、グルコース20
mM）800μを添加後、37℃にて150rpmの速度で振とう
培養する。１時間後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB
寒天培地に、上記コンピテントセル懸濁液を10〜1000培
希釈後その100μを撒き広げ、37℃で15〜18時間培養
後、形成されたコロニーの数を求める。得られたコロニ
ー数より、pBR3221μｇ当り形質転換される大腸菌の数
を求め、これをコンピテントセルの形質転換効率とす
る。
（実施例） 次いで実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
本発明は何らこれらにより限定されるものではない。
本発明は何らこれらにより限定されるものではない。
実施例１ エッシエリヒアコリーDH5の凍結保存株を融解後、LB
寒天培地上に撹線し37℃にて１晩培養した。直径1.5−2
mmのコロニーを10−15個取り250mlSOB培地（２％バクト
トリプトン、0.5％バクトイースト抽出物、10mM塩化ナ
トリウム、2.5mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウ
ム、10mM硫酸マグネシウム）/2L−フラスコに植菌し
た。18℃にてOD＝600＝0.6まで約48時間培養した。培養
終了後、フラスコを氷上に移し10分間冷却した。培養液
を500ml溶遠心管に移し、約2500gで10分間４℃で遠心し
た。得られた菌体ペレットを氷冷コンピルテントセル化
緩衝液（塩化マンガン50mM、塩化カルシウム15mM、塩化
カリウム250mM、ピペラジン−N,N′−ビス−（２−エタ
ンスルホン酸）10mM、PH6.7）80mlで懸濁後、氷上で10
分間冷却した。次いで約2500gで10分間４℃で遠心し
た。上清を捨て、得られた菌体を再度上記氷冷コンピテ
ントセル化緩衝液20mlに懸濁し、更にジメチルスルホキ
シドを、1.5ml加え、氷上で10分間冷却した。次いで約1
mlづつ凍結保存用バイアルに移し、液体窒素液相中にて
凍結した。この様に調製した凍結コンピテントセルを液
体窒素気相にて保存した。凍結保存コンピテントセルを
室温にて融解度、１μの1ng/μのプラスミドpBR322
溶液に対し200μ加え、氷中で30分冷却した。次い
で、42℃にて30秒加温処理し、再度氷中にて２分間冷却
した。800μのSOC培地を加え、37℃にて１時間、約15
0rpmの回転数で振とう培養した。１時間後、上記処理液
を10〜1000培希釈後その100μを分取し、約3mlの約50
℃のLB上層寒天培地（LB寒天培地の成分中寒天の濃度を
1.7％→0.5％としたもの）と混合後、50μg/mlのアンピ
シリンを含有するLB寒天培地上に広げた。37℃にて１晩
培養後、培地上に形成された形質転換対のコロニーの数
を求め、形質転換効率を算出した。結果を第１表に示
す。
寒天培地上に撹線し37℃にて１晩培養した。直径1.5−2
mmのコロニーを10−15個取り250mlSOB培地（２％バクト
トリプトン、0.5％バクトイースト抽出物、10mM塩化ナ
トリウム、2.5mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウ
ム、10mM硫酸マグネシウム）/2L−フラスコに植菌し
た。18℃にてOD＝600＝0.6まで約48時間培養した。培養
終了後、フラスコを氷上に移し10分間冷却した。培養液
を500ml溶遠心管に移し、約2500gで10分間４℃で遠心し
た。得られた菌体ペレットを氷冷コンピルテントセル化
緩衝液（塩化マンガン50mM、塩化カルシウム15mM、塩化
カリウム250mM、ピペラジン−N,N′−ビス−（２−エタ
ンスルホン酸）10mM、PH6.7）80mlで懸濁後、氷上で10
分間冷却した。次いで約2500gで10分間４℃で遠心し
た。上清を捨て、得られた菌体を再度上記氷冷コンピテ
ントセル化緩衝液20mlに懸濁し、更にジメチルスルホキ
シドを、1.5ml加え、氷上で10分間冷却した。次いで約1
mlづつ凍結保存用バイアルに移し、液体窒素液相中にて
凍結した。この様に調製した凍結コンピテントセルを液
体窒素気相にて保存した。凍結保存コンピテントセルを
室温にて融解度、１μの1ng/μのプラスミドpBR322
溶液に対し200μ加え、氷中で30分冷却した。次い
で、42℃にて30秒加温処理し、再度氷中にて２分間冷却
した。800μのSOC培地を加え、37℃にて１時間、約15
0rpmの回転数で振とう培養した。１時間後、上記処理液
を10〜1000培希釈後その100μを分取し、約3mlの約50
℃のLB上層寒天培地（LB寒天培地の成分中寒天の濃度を
1.7％→0.5％としたもの）と混合後、50μg/mlのアンピ
シリンを含有するLB寒天培地上に広げた。37℃にて１晩
培養後、培地上に形成された形質転換対のコロニーの数
を求め、形質転換効率を算出した。結果を第１表に示
す。
実施例２ エッシエリヒアコリーBH101を使用大腸菌として実施
例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換を行
い形質転換効率を求めた。結果を第１表に示す。
例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換を行
い形質転換効率を求めた。結果を第１表に示す。
実施例３ エッシエリヒアコリーJM109を使用大腸菌として実施
例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換を行
い形質転換効率を求めた。結果を第１表に示す。
例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換を行
い形質転換効率を求めた。結果を第１表に示す。
実施例４ エッシエリヒアコリーDH5を使用大腸菌として、実施
例１のコンピテントセル化緩衝液組成のうちピペラジン
−N,N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）（PIPES）を
他の緩衝能を有する第２表に示す化合物と置換したコン
ピテントセル化緩衝液（他の成分pHは変更なし）を用い
実施例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換
を行い形質転換効率を求めた。第１図にPIPESを用いた
際に対する相対効率を示す。
例１のコンピテントセル化緩衝液組成のうちピペラジン
−N,N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）（PIPES）を
他の緩衝能を有する第２表に示す化合物と置換したコン
ピテントセル化緩衝液（他の成分pHは変更なし）を用い
実施例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換
を行い形質転換効率を求めた。第１図にPIPESを用いた
際に対する相対効率を示す。
実施例５ コンピテントセル化緩衝液組成を第３表に示す組成と
した種々のコンピテントセル化緩衝液を用いエッシエリ
ヒアコリーDH5を使用大腸菌として実施例１と同様にコ
ンピテントセルの調製及び形質転換を行い形質転換効率
を求めた。ａ〜ｅの結果をそれぞれ、第２〜第６図に示
す。
した種々のコンピテントセル化緩衝液を用いエッシエリ
ヒアコリーDH5を使用大腸菌として実施例１と同様にコ
ンピテントセルの調製及び形質転換を行い形質転換効率
を求めた。ａ〜ｅの結果をそれぞれ、第２〜第６図に示
す。
比較例１ Hanahanらの報告（J.Mol.Biol.1983 166.557−580）
に記載されている条件でエッシエリヒアコリーDH5を使
用大腸菌として用い、コンピテントセルを調製した。使
用緩衝液組成を第４表に示す。また、同時に本発明によ
るコンピテントセル化緩衝液を用いて菌体の処理を行っ
た。結果を第７図に示す。
に記載されている条件でエッシエリヒアコリーDH5を使
用大腸菌として用い、コンピテントセルを調製した。使
用緩衝液組成を第４表に示す。また、同時に本発明によ
るコンピテントセル化緩衝液を用いて菌体の処理を行っ
た。結果を第７図に示す。
なお、第７図において１は37℃にて培養した菌体を本
発明によるコンピテントセル化緩衝液にて処理して得た
コンピテントセルの形質転換効率を100として表してお
り、２は37℃にて培養した菌体をHanahanらの報告に記
載の緩衝液にて処理して得たコンピテントセルの形質転
換効率の１に対する相対値を表している。
発明によるコンピテントセル化緩衝液にて処理して得た
コンピテントセルの形質転換効率を100として表してお
り、２は37℃にて培養した菌体をHanahanらの報告に記
載の緩衝液にて処理して得たコンピテントセルの形質転
換効率の１に対する相対値を表している。
（発明の効果） 本発明の緩衝液を使用して、大腸菌のコンピテントセ
ル化を行うことにより、大腸菌の形質転換効率を、従来
の方法で調製した大腸菌のコンピテントセルを用いて行
う場合に比べて、菌株により２〜10倍高めることができ
る。
ル化を行うことにより、大腸菌の形質転換効率を、従来
の方法で調製した大腸菌のコンピテントセルを用いて行
う場合に比べて、菌株により２〜10倍高めることができ
る。
第１図は緩衝液に含まれる成分としてPIPESを使用した
場合の形質転換効率を100として、PIPESを他の成分に置
換した場合の相対比を示す。 第２図は緩衝液組成のうち、塩化カルシウムの組成を変
化させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第３図は緩衝液組成のうち、塩化マンガンの組成を変化
させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第４図は緩衝液組成のうち、塩化カリウムの組成を変化
させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第５図は緩衝液組成のうち、PIPESの組成を変化させた
場合の形質転換効率の相対比を示す。 第６図は緩衝液組成のpHを変化させた場合の形質転換効
率の相対比を示す。 第７図は、本発明の緩衝液によって処理したコンピテン
トセルの形質転換率と、従来の緩衝液によって処理した
コンピテントセルの形質転換効率の対比を示す。
場合の形質転換効率を100として、PIPESを他の成分に置
換した場合の相対比を示す。 第２図は緩衝液組成のうち、塩化カルシウムの組成を変
化させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第３図は緩衝液組成のうち、塩化マンガンの組成を変化
させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第４図は緩衝液組成のうち、塩化カリウムの組成を変化
させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第５図は緩衝液組成のうち、PIPESの組成を変化させた
場合の形質転換効率の相対比を示す。 第６図は緩衝液組成のpHを変化させた場合の形質転換効
率の相対比を示す。 第７図は、本発明の緩衝液によって処理したコンピテン
トセルの形質転換率と、従来の緩衝液によって処理した
コンピテントセルの形質転換効率の対比を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 野島 博 大阪府豊中市西緑丘１―４―27―123 審査官 斎藤 真由美
Claims (2)
- 【請求項１】（ａ）塩化マンガン、（ｂ）塩化カルシウ
ム、（ｃ）塩化カリウムおよび（ｄ）ピペラジン−N,
N′−ビス−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−ヒ
ドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸、N,N−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−ア
ミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロ
パンスルホン酸および酢酸カリウムからなる群から選ば
れた少なくとも１種の緩衝能を有する化合物を含有する
ことを特徴とする大腸菌のコンピテントセル化緩衝液。 - 【請求項２】請求項（１）の緩衝液によって大腸菌を処
理することを特徴とする大腸菌のコンピテントセル化方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20964190A JP2666535B2 (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | 大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20964190A JP2666535B2 (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | 大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0491783A JPH0491783A (ja) | 1992-03-25 |
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