JPH0491783A - 大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、化学的処理による大腸菌のコンピテントセル
化の際に使用するコンピテントセル化緩衝液および該緩
衝液を用いた大腸菌のコンピテントセル化方法に関する
。

（従来の技術） 大腸菌のコンピテントセル化は、Ｍａｎｄｅｌ　　＆１
（ｉｇａによる報告以来数多くの調製法が報告されてい
る。特にＨａｎａｈａｎらの報告（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ＊
１．１９８３１６６．５５７−５８０　）では、いくつ
かの大腸菌に関して高効率の形質転換を可能とする方法
が報告されている。

（発明が解決しようとする課Ｂ） Ｈａｎａｈａｎらは、１−５ｘｌＯ＠ｃｏｌｏｎｉｅｓ
／　ｇ　ｇ　−１１ＢＲ３２２の高効率の形質転換能を
有するコンピテントセルを大Ｉｌ！菌より調製する方法
について報告しているが（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１９
８３１６６．５５７−５８０）　、この方法では、高効
率の形質転換能を有するコンピテントセルを安定して再
現性よく調製する事が困難である、また保存の間にしば
しばその形質転換効率が低下することが観察されている
。また、大腸菌の効率良い形質転換方法として、最近、
高電圧電気穿孔による方法が一１１１ｉａ僻Ｊ、Ｄｏｉ
ｉｅｒ、Ｊｅｆｆ　Ｆ、Ｍｉｌｌｅｒ＆　Ｃｈａｒｌｅ
ｓ　Ｗ、Ｒａｇｓｄａｌｅらによって報告されている。

　　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ　
１９８８νｏ１．１６６Ｎｕｍｂｅｒ　１３６１．２７
−６１４４）　シかし、電気穿孔法では処理する大腸菌
懸濁液の塩濃度が非常に制限されるため、形質転換に用
いるプラスミ（′溶液の状態が著しく限定されていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、大腸菌の化学的処理によるコンピテント
セル化の際の、緩衝液について検討しその最適成分を見
いだし、上記の課題を解決する事に成功した。

すなわち、本発明は（ａ）塩化マンガン、（ｂ）塩化カ
ルシウム、（ｃ１塩化カリウムおよび（ｄ）ピペラジン
Ｎ、Ｎ’−ビス＝（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２
ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ’　−２−ｘタンス
ルホン酸、Ｎ、Ｎ’−ビス＝（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸、３（Ｎ−モノフォリノ
）プロパンスルホン酸および酢酸カリウムからなる群か
ら選ばれた少くとも一種の化合物を含むことを特徴とす
る大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および該緩衝液に
よって大腸菌を処理することを特徴とする大腸菌のコン
ピテントセル化方法である。

本発明を実施するに当たっては、まず大腸菌を通常の液
体培養で培養する。本発明において使用される大腸菌は
特に限定されず、例えば、工、ンエＩＪ　ヒア　コリー
ＤＨ５、エノンエリヒア　コリー１１８ＩＯＩ、エソシ
エリヒア　コリーＪ？１１０９等を例示することができ
る。培地の栄養源としては、通常微生物の培養に用いら
れるものが広く用いられる。

窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、
例えば、ペプトン、酵母抽出物、内袖出物等が使用され
る。炭素源としては特に必要としないが、例えばグルコ
ース、ンユークロース、マンニトール等を必要であれば
添加してもよい。その他、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸第−
カリウム、リン酸第二カリウムなどの塩類が必要に応じ
て使用される。

培養温度は、菌が発育可能な範囲内で適宜変更し得るが
、好ましくは１６°Ｃ〜３７°Ｃ１特に１７°Ｃ〜２０
°Ｃが好ましい。

培養は回転式振とう機、または往復式振とう機を用いて
行う。回転数、または振とう数は、使用する培養器、及
び振とう機の振幅によって適宜設定すればよい。

培養時間は、使用する大腸菌、培養温度によって異なる
。培養終了は対数増殖期中期が好ましいが、使用する大
腸菌の種類によって適宜決定すればよい、この様にして
得られた大腸菌の菌体を、遠心分離等によって集め、コ
ンピテントセル化緩衝液にて処理する。

本発明のコンピテントセル化緩衝液は、（ａ）塩化マン
ガン１０〜１００ｍＭ好ましくは、２０〜６０＋ｎＭ、
［有］）塩化カルシウム５〜４０ｍＭ好ましくは１０〜
３０５Ｍ、（ｃ）塩化カリウム１０〜１１００（ｌｓ好
ましくは１００〜５００＋Ｍ、（ｄ）ピペラジン−Ｎ、
Ｎ、−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−ヒド
ロキシメチル）ピペラジンＮ′２−エタンスルホン酸、
Ｎ、！１−ビスー（２−ヒドロキシエチル）−２−アミ
ノエタンスルホン酸、３（Ｎ−モノフオリノ）プロパン
スルホン酸および酢酸カリウムからなる群から選ばれた
少（とも一種の化合物１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜４
０ｍＭを含有し、ｐ＋１は５．５〜７．５、好ましくは
６，５〜７．０である。

なお、前記各物質の添加順序、添加方法は特に限定され
ない。

コンピテントセル化緩衝液による処理方法は、集菌した
大腸菌菌体を水中で、培地容量の１〜１１５培養量のコ
ンピテントセル化緩衝液で懸濁復水中に１０〜３０分放
置後、遠心分翻によって再度菌体を集める。この操作を
１〜３回繰り返した後、菌体を水中で培地容量の１／１
０〜１／２０容量のコンビテン１−セル化緩衝液に懸濁
後、ジメチルスルホキシドを４〜１０％好ましくは６〜
８％となるように添加し、更に、水中で１０〜３０分放
置する。保存のために、この樺に調製したコンピテント
セル懸濁液を凍結保存用バイアルに分注後、液体窒素液
相中にて凍結後、液体窒素気相中で保存する。

本発明によってコンピテントセル化された大腸菌の形質
転換効率は、以下に述べる測定法に基づいて測定した。

形質転換効率の測定法 上記のような方法で調製、保存されているコンピテント
セルを室温にて熔解後２００μ！を、ｌｎｇ／ｄのアン
ピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ３２２溶液
１μ！とをＧｒｅｉｎｅｒ製１５１１１製氷５１１１容
ポリプロピレンチユーブ内中３０分放置する。

次いで、４２°Ｃにて３０秒加温処理し、更に水中にて
１分間冷却する。ＳＯＣ（培地の一種組成：ハクトドブ
トワン２．０％、バクトイ−スト抽出物０．５％、塩化
ナトリウムｌ０ｍＭ、塩化カリウム２．５　＋Ｍ、硫酸
マグネシウム１０ｍＭ、塩化マグネシウム１０１、グル
コース２ｍＭ）　８００μ１．を添加後、３７°Ｃにて
１５０ｒｐｍの速度で振とう培養する。１時間後、５０
μｇ／紙のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に、上記コ
ンピテントセル懸濁液を１０〜１０００倍希釈後その］
００μｌを撒き広げ、３７゛Ｃで１５〜１８時間培養後
、形成されたコロニーの数を求める。得られたコロニー
数より、ｐＢＲ３２２１μｇ当り形質転換される大腸菌
のコロニー数を求め、これをコンピテントセルの形質転
換効率とする。

（実施例） 次いで実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明は何らこれらにより限定されるものではない。

実施例１ エソシエリヒアコリー〇）１５の凍結保存株を融解後、
ＬＢ寒天培地上に型線し３７°Ｃにて１晩培養した。

直径１．５−２閣のコロニーを１０−１５個取り２５０
蔽ＳＯＢ培地（２％ハタトドリプトン、０．５％ハクト
イ−スト抽出物、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ
塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マ塩化カルシウムｍＭ硫酸
マグネシウム）／２＋、−フラスコに植菌した。１８°
Ｃにて０口６００＝０．６まで約４８時間培養した。培
養終了後、フラスコを氷上に移し１０分間冷却した。培
養液を５００ｍ？８遠心管に移し、約２５００　ｇ　テ
１０分間４°Ｃで遠心した。得られた菌体ペレットを水
冷コンピルテントセル化緩衝液（塩化マンガン５０ｍｔ
’ｌ、塩化カルシウム１５ｍＭ、塩化カリウム２５０１
１１Ｍ、ピペラジンＮ、Ｎ’−ビス−（２−エタンスル
ホン酸）　１０ｍＭ。

ＰＨ６，７）　ＨＩｌｌで懸濁後、氷上で１０分間冷却
した。

次いで約２５００　ｇで１０分間４°Ｃで遠心した。上
清を捨て、得られた菌体を再度上記氷冷コンピテントセ
ル化緩衝液２０〆に懸濁し、更にジメチルスルホキシド
を、１．５ｄ加え、氷上で１０分間冷却した。

次いで約１紙づつ凍結保存用バイアルに移し、液体窒素
液相中にて凍結した。この様に調製した凍結コンピテン
トセルを液体窒素気相にて保存した。

凍結保存コンピテントセルを室温にて融解後、Ｊｕｌの
１．ｎｇ／ｄのプラスミドｐＢＲ３２２溶液に対し２０
０ｕｌ加え、水中で３０分冷却した。次いで、４２°Ｃ
にて３０秒加温処理し、再度水中にて２分間冷却した。

８００μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃にて１時間、約
１５Ｏｒｐｍ＋の回転数で振とう培養した。１時間後、
上記処理液を１０〜１０００倍希釈後その１００μｌを
分取し、約３ｊＩｉ！の約５０℃のＬＢ上層寒天培地（
ＬＢ寒天培地の成分中寒天の濃度を１．７％→０．５％
としたもの）と混合後、５０μｇ／ｄのアンピシリンを
含有するＬＢ寒天培地上に広げた。３７°Ｃにて１晩培
養後、培地上に形成された形質転換体のコロニーの数を
求め、形質転換効率を算出した。結果を第１表に示す。

実施例２ エノンエリヒアコリー）ＩＢＩＯＩを使用大腸菌として
実施例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換
を行い形質転換効率を求めた。結果を第１表に示す。

実施例３ エンシエリヒアコリーＪＭ］０９を使用大腸菌として実
施例１と同様にコンピテントセルの調製及び形質転換を
行い形質転換効率を求めた。結果を第１表に示す。

第１表 エッ’／１リヒアコリーＤ）１５　　　３．０刈０’ｃ
ｏｌｏｎｉｅｓ／　ｕ　ｇ　−ｐＢＲ３２２エッシエリ
ヒア　コリーＨＢＩＯ１１，１Ｘ１０″ｃｏｌｏｎｊｅ
ｓ／μｇ　　ｐＢＲ３２２エソシエリヒア　コリーＪＭ
Ｉ０９　　１２ＸＩ（１’ｃｏ］ｏｎｉｅｓ／μｇ　−
ｐＢＲ３’；’２実施例４ エッシエリヒアコリ−ＤＨ５を使用大腸菌として、実施
例１のコンピテントセル化緩衝液組成のうちピペラジン
−Ｎ、Ｎ’　ビス−（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰ
ＥＳ）を他の緩衝能を有する第２表に示す化合物と置換
したコンピテントセル化緩衝液（他の成分ｐＨは変更な
し）を用い実施例１と同様にコンピテントセルの調製及
び形質転換を行い形質転換効率を求めた。第１図にＰＩ
ＰＥＳを用いた際に対する相対効率を示す。

第２表 酢酸力ＩＪ　ラム（ｃＩｈＣＯＯＫ） Ｎ−（２−ヒドロキシチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ＮＮ−ビス−（２−ヒド
ロキシエチル）−２−アミノエタンスルホンｖ１（ＢＥ
Ｓ）３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（Ｍ
ＯＰＳ）実施例５ コンピテントセル化緩衝液組成を第３表に示す組成とし
た種々のコンピテントセル化緩衝液を用いエッシエリヒ
アコリーＤ）１５を使用大腸菌とじて実施例１と同様に
コンピテントセルの調製及び形質転換を行い形質転換効
率を求めた。ａ　−ｅの結果をそれぞれ、第２〜第６図
に示す。

第３表 ａ　　　　　　ｂ　　　　　　ｃ　　　　　　ｄ　　　
　　　ｅ塩化カルシウム　０−ヌー門　　　１５ｆｆｉ
？ｌ　　　　１−門　　１−門　　　１−門塩化マンガ
ン　　　５５１１Ｍ　　０−１００ｍＭ　　　　５５１
１と　　５５ｍＭ　　　　５５１１Ｍ塩化カリウム　　
２５０１１Ｍ　　　２５０ｍＭ　　Ｏｏ−１Ｏ００ｓ　
　　２５１）ｎＭ　　　　２５伽門ＰＩＰＥＳ　　　　
　　　１０ｗＭ　　　　１０５Ｍ　　　　ｌ０ｍＭ　　
０−５０１１Ｍ　　　　１０ｍＭｐＨ６，７６，７６，
７６，７５，５−７，５比較例１ ）Ｉａｎａｈａｎらの報告（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１
９８３１６６．５５７５８０）に記載されている条件で
エソソエリヒアコリ−０１１５を使用大腸菌として用い
、コンピテントセルを調製した。使用緩衝液組成を第４
表に示す。

また、同時に本発明によるコンピテントセル化緩衝液を
用いて菌体の処理を行った。結果を第７図に示す。

第４表 １０ｍＭ　　　酢酸カリウム １００１１Ｍ　　　塩化カリウム ４５ｍ？　　　塩化マンガン １０ａＭ　　　塩化カルシウム ３ｓＭ　　　ヘキサアンミンコバルト（ＩＩＩ）　塩化
物１０％　　グリセロール なお、第７図において１は３７°Ｃにて培養した菌体を
本発明によるコンピテントセル化緩衝液にて処理して得
たコンピテントセルの形質転換効率を１００として表し
ており、２は３７°Ｃにて培養した菌体をＨａｎａｈａ
ｎらの報告に記載の緩衝液にて処理して得たコンピテン
トセルの形質転換効率の１に対する相対値を表している
。

（発明の効果） 本発明の緩衝液を使用して、大腸菌のコンピテントセル
化行うことにより、大腸菌の形質転換効率を、従来の方
法で調製した大腸菌のコンピテントセルを用いて行う場
合に比べて、菌株により２〜１０倍高めることができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は緩衝液に含まれる成分として ＰＩＦＥＳを使用した場合の形質転換効率を１００とし
て、ＰＩＦＥＳを他の成分に置換した場合の相対比を示
す。 第２図は緩衝液組成のうち、塩化カルシウムの組成を変
化させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第３図は緩衝液組成のうち、塩化マンガンの組成を変化
させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第４図は緩衝液組成のうち、塩化カリウムの組成を変化
させた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第５図は緩衝液組成のうち、ＰＩＦＥＳの組成を変化さ
せた場合の形質転換効率の相対比を示す。 第６図は緩衝液組成のｐＨを変化させた場合の形質転換
効率の相対比を示す。 第７図は、 本発明の緩衝液によって処理したコ ンピテントセルの形質転換効率と、 従来の緩衝液 によって処理したコンピテントセルの形質転換効率の対
比を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）塩化マンガン、（ｂ）塩化カルシウム、（
   ｃ）塩化カリウムおよび（ｄ）ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−
   ビス−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−ヒドロキ
   シメチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、
   Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノ
   エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モノフォリノ）プロパン
   スルホン酸および酢酸カリウムからなる群から選ばれた
   少くとも一種の化合物を含むことを特徴とする大腸菌の
   コンピテントセル化緩衝液。
2. （２）請求項（１）の緩衝液によって大腸菌を処理する
   ことを特徴とする大腸菌のコンピテントセル化方法。