JPS59125892A - トリプトフアンオペロン遺伝子を持つ溶原性フア−ジ、これを溶原化したトリプトフアン生産性枯草菌及びその利用 - Google Patents
トリプトフアンオペロン遺伝子を持つ溶原性フア−ジ、これを溶原化したトリプトフアン生産性枯草菌及びその利用Info
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- JPS59125892A JPS59125892A JP57227964A JP22796482A JPS59125892A JP S59125892 A JPS59125892 A JP S59125892A JP 57227964 A JP57227964 A JP 57227964A JP 22796482 A JP22796482 A JP 22796482A JP S59125892 A JPS59125892 A JP S59125892A
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- phage
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は改善された高生産性をもってＬ −） リプト
ファンを生産することのできる従来文献未記載のトリプ
トファン生産性枯草菌（バチルス・ズブチリス）、該枯
草菌の造成に有用な溶原性ファーソ、更には、該トリプ
トファン生産性枯草歯を用いて改善された高生産性をも
ってＬ −トリプトファンを製造できる醗酵法Ｌ−トリ
プトファンの製法に関する。
ファンを生産することのできる従来文献未記載のトリプ
トファン生産性枯草菌（バチルス・ズブチリス）、該枯
草菌の造成に有用な溶原性ファーソ、更には、該トリプ
トファン生産性枯草歯を用いて改善された高生産性をも
ってＬ −トリプトファンを製造できる醗酵法Ｌ−トリ
プトファンの製法に関する。
従来、Ｌ−トリプトファンの生産全調整する遺伝情報を
遺伝子操作で組み込んだプラスミドを有する大腸菌及び
それを用いる醗酵法Ｌ−トリプトファンの製法に関する
提案が知られている（例えば、特開昭５７−７１３９７
号％特開昭５７−８０３９８号）。
遺伝子操作で組み込んだプラスミドを有する大腸菌及び
それを用いる醗酵法Ｌ−トリプトファンの製法に関する
提案が知られている（例えば、特開昭５７−７１３９７
号％特開昭５７−８０３９８号）。
よく仰られているように、このような造成プラスミドは
一般に不安定であって、培養中に失われていくため、そ
の安定化手法が確立されない限り実用性に制約を受ける
というトラブルがある。こレニ対して、染色体ＤＮＡに
Ｌ−に−リプトファン生産の遺伝情報を組み込むことが
できれば、上記のような制約から解放されることが予期
される。
一般に不安定であって、培養中に失われていくため、そ
の安定化手法が確立されない限り実用性に制約を受ける
というトラブルがある。こレニ対して、染色体ＤＮＡに
Ｌ−に−リプトファン生産の遺伝情報を組み込むことが
できれば、上記のような制約から解放されることが予期
される。
本発明者等は、後者のタイプの染色体ＤＮＡを持つＬ
−ト１７プトフアン生産性枯草菌を造成すべく研究を行
ってきた。
−ト１７プトフアン生産性枯草菌を造成すべく研究を行
ってきた。
その結果、従来、枯草菌のトリプトファンオペロンの一
部遺伝子をクローニングしたという記載はあったが（例
えば、 ＫｏＭ、 Ｋｇｇｇｉｎｔｔ、 Ｐ、ｒ’Ｅ。
部遺伝子をクローニングしたという記載はあったが（例
えば、 ＫｏＭ、 Ｋｇｇｇｉｎｔｔ、 Ｐ、ｒ’Ｅ。
Ｌｏｖｓｔｔ、 ａｎｄ Ｅ、 Ｊ、 Ｄｗｖａｌｌ、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡＩ ７５ 、１４
２３−１４２７（１９７８）、全遺伝子すなわちトリプ
トファンオペロンをクローニングした実例は知られてい
なかったにも拘わらず、本発明者等の研究によれば、Ｌ
−トリフ’）ファン生産性枯草菌のトリプトファンオペ
ロンのクローニングが可能であり、斯くてトリプトファ
ンオペロン（全遺伝子）を持つ清涼件ファーソを造成す
ることが可能であることを発見し且つその造成に成功し
た。
２３−１４２７（１９７８）、全遺伝子すなわちトリプ
トファンオペロンをクローニングした実例は知られてい
なかったにも拘わらず、本発明者等の研究によれば、Ｌ
−トリフ’）ファン生産性枯草菌のトリプトファンオペ
ロンのクローニングが可能であり、斯くてトリプトファ
ンオペロン（全遺伝子）を持つ清涼件ファーソを造成す
ることが可能であることを発見し且つその造成に成功し
た。
更に、本発明者等は、該トリプトファンオペロン遺伝子
を持つ清涼住ファージを利用して、Ｌ−トリシトファン
生産性枯草菌の染色体ＤＮＡ上に。
を持つ清涼住ファージを利用して、Ｌ−トリシトファン
生産性枯草菌の染色体ＤＮＡ上に。
該菌が本来保有していたトリプトファンオペロンに加え
て、追加のトリプト７アンオペロンヲ新たに導入可能で
あることを発見し且つその造成に成功した。
て、追加のトリプト７アンオペロンヲ新たに導入可能で
あることを発見し且つその造成に成功した。
斯して、本発明者等の研究によれば、トリプトファン合
成に対するトリプトファンによる阻害が解除チｉしたト
リプトファンオペロン分食なくトモ２ケ有する染色体Ｄ
ＮＡｆ持っＬ−トリプトファン生産性枯草菌（バチルス
・ズブチリス）を造成できることが発見され且つその造
成に成功した。
成に対するトリプトファンによる阻害が解除チｉしたト
リプトファンオペロン分食なくトモ２ケ有する染色体Ｄ
ＮＡｆ持っＬ−トリプトファン生産性枯草菌（バチルス
・ズブチリス）を造成できることが発見され且つその造
成に成功した。
そして、この新しいＬ−トリプトファン生産性枯草−を
ハ」いて改善された＾生産性ケもって７．−）リプトフ
ァンを工菓的に有利に製造できることを知った。
ハ」いて改善された＾生産性ケもって７．−）リプトフ
ァンを工菓的に有利に製造できることを知った。
従って、本発明の目的は、上記の新しいＬ−）リプトノ
アン生産性枯草菌及び該酌の造成に有用な溶原性ファー
ソゲ提供するにある。
アン生産性枯草菌及び該酌の造成に有用な溶原性ファー
ソゲ提供するにある。
本発明の他の目的は、上記の新しいＬ −トリシトファ
ン生産性枯草菌金用いて改善された筒中産性ケもってＬ
−トリプトファンを製造できる醗酵法Ｌ−）リプトファ
ンの製法を提供するにある。
ン生産性枯草菌金用いて改善された筒中産性ケもってＬ
−トリプトファンを製造できる醗酵法Ｌ−）リプトファ
ンの製法を提供するにある。
本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるでろろう。
は、以下の記載から一層明らかとなるでろろう。
本発明のトリプトファン合成に対するトリプトファンに
よる阻害が解除さｆ′したトリプトファンオペロン（以
下、ＴＲＰ−ＦＴＲと略記することがある）を少なくと
も２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ −） ＩＪブトフ
ァン生産性枯草菌（バチルス・ズブチリス）の造成に用
いるＴＲＰ−ＦＴＲ分有する染色体ＤＮＡ２組みこんだ
清涼性ファージは。
よる阻害が解除さｆ′したトリプトファンオペロン（以
下、ＴＲＰ−ＦＴＲと略記することがある）を少なくと
も２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ −） ＩＪブトフ
ァン生産性枯草菌（バチルス・ズブチリス）の造成に用
いるＴＲＰ−ＦＴＲ分有する染色体ＤＮＡ２組みこんだ
清涼性ファージは。
該染色体ＤＮＡを持つ形質導入ファージであって、該枯
草菌に溶原化し且つ該枯草菌が本来をするトリプトファ
ン合成に対するトリプトファンによる阻害が解除された
トリプトファンオペロンＴＲＰＦＴＲと同様なＬ−）リ
プトファン生産能を発現可能とする浴涼性ファージであ
る。
草菌に溶原化し且つ該枯草菌が本来をするトリプトファ
ン合成に対するトリプトファンによる阻害が解除された
トリプトファンオペロンＴＲＰＦＴＲと同様なＬ−）リ
プトファン生産能を発現可能とする浴涼性ファージであ
る。
この１’ ７ｔ’ Ｐ −Ｆｉ” Ｒ分有する染色体Ｄ
ＮＡ金持つ清涼性ファーヅは、囲えば、河村らの方法Ｃ
Ｋａｗａｒｎ、ｕｒａ、 Ｆ、 、 ５ａｉｔｏ、 Ｈ
ｏ、 ａｎｄ Ｉｋｇｄａ。
ＮＡ金持つ清涼性ファーヅは、囲えば、河村らの方法Ｃ
Ｋａｗａｒｎ、ｕｒａ、 Ｆ、 、 ５ａｉｔｏ、 Ｈ
ｏ、 ａｎｄ Ｉｋｇｄａ。
Ｙ、：Ｇｇｎｇ、 ５＋８＃（１９７９）〕’ｒ、利用
して造成することができる。
して造成することができる。
たとえは、ＥＲＩの如きｉｆ；ｆＪ限酵累で切断されＯ
たＴ １１ Ｐ −Ｆ Ｔ Ｒｆ有する染色体Ｄ Ｈ’
Ａを持つ枯草菌の染色体ＤＮＡ断片、例えは、５１！
’ＴＣ５−フロロトリプトファン）耐性のトリプトファ
ン生産性枯草菌の染色体ＤＮＡ断片と、同様にして切断
された枯草菌の清涼性ファーゾのＤＮＡ断片。
Ａを持つ枯草菌の染色体ＤＮＡ断片、例えは、５１！
’ＴＣ５−フロロトリプトファン）耐性のトリプトファ
ン生産性枯草菌の染色体ＤＮＡ断片と、同様にして切断
された枯草菌の清涼性ファーゾのＤＮＡ断片。
例えは、ファージｌ１８、ファージφ、。６．ファージ
５ＰＯ２の如き枯草菌の清涼性ファーヅのＤＮＡ断片と
を、たとえばＴ４ リガーゼの如きＤＮＡりが一ゼを用
いて連結し、斯くて形成された連結ＤＮＡを上記溢血性
ファー＝、７を廖原化しているトリプトファン要求性（
ｔｒｐ ）枯草丙申に形質転換してトリプトファン非要
求性（ｔｒｐ ）形質転換体を得、これを培養してファ
ージを６ガ発し、このファージをｔｒｐ−枯草菌中に形
質導入してｔｒｐ 形質導入体を形成し、次いで、該
ｔｒｏ？形質導入体を培養してｔｒｐ”３Ｆ’ｐ質導入
フアーヅを誘発し、７“ＲＰ−ＦＴＲを］１する染色体
ＤＮＡ′ｆｆ：持つことを確認して造成することができ
る。
５ＰＯ２の如き枯草菌の清涼性ファーヅのＤＮＡ断片と
を、たとえばＴ４ リガーゼの如きＤＮＡりが一ゼを用
いて連結し、斯くて形成された連結ＤＮＡを上記溢血性
ファー＝、７を廖原化しているトリプトファン要求性（
ｔｒｐ ）枯草丙申に形質転換してトリプトファン非要
求性（ｔｒｐ ）形質転換体を得、これを培養してファ
ージを６ガ発し、このファージをｔｒｐ−枯草菌中に形
質導入してｔｒｐ 形質導入体を形成し、次いで、該
ｔｒｏ？形質導入体を培養してｔｒｐ”３Ｆ’ｐ質導入
フアーヅを誘発し、７“ＲＰ−ＦＴＲを］１する染色体
ＤＮＡ′ｆｆ：持つことを確認して造成することができ
る。
上記のＴＲＰ−ＦＴＲｆ有する染色体ＤＮＡを持つ溶原
性ファーゾ造成手法の一態様について更に詳しく例示す
る。
性ファーゾ造成手法の一態様について更に詳しく例示す
る。
たとえば、ｓＦＴ耐性トリグトファン生産性枯草枯草染
色体ＤＮＡ断片及びファージρ、１の清涼性ファーソの
染色体ＤＮＡ断片は、以下の如き手法で得ることができ
る。ｓＦＴ耐性トリプトファン生産性枯草菌の染色体Ｄ
ＮＡは、ａ ａ −ｍ ｋ卵白リゾチーム（１ｎｖ／ｍ
ｌ ）で細胞壁を分解し、プロテイナーゼｆｆ（１００
μ９７ｍ１）および５ＤＳ（１１Ｍ ／ Ｖ Ｉソヂイ
ウムドデシルスルフエイト）処理１父フエノール抽出に
工りイ（Ｉることができる。
色体ＤＮＡ断片及びファージρ、１の清涼性ファーソの
染色体ＤＮＡ断片は、以下の如き手法で得ることができ
る。ｓＦＴ耐性トリプトファン生産性枯草菌の染色体Ｄ
ＮＡは、ａ ａ −ｍ ｋ卵白リゾチーム（１ｎｖ／ｍ
ｌ ）で細胞壁を分解し、プロテイナーゼｆｆ（１００
μ９７ｍ１）および５ＤＳ（１１Ｍ ／ Ｖ Ｉソヂイ
ウムドデシルスルフエイト）処理１父フエノール抽出に
工りイ（Ｉることができる。
ファージ、Ｓ’ｌｌのＤＮＡは上記法からりゾチーム処
理全省略して得らｉする。これらのＤＨ’Ａの断片は制
限酵素（例えばＥ、ｏＲｌ）処理によって得ることがで
きる。
理全省略して得らｉする。これらのＤＨ’Ａの断片は制
限酵素（例えばＥ、ｏＲｌ）処理によって得ることがで
きる。
１り）１えは、上述のようにして得ることのできる５Ｆ
’Ｔ耐性トリプトフアン生産性枯草菌の染色体ＤＮＡ断
片とファージρ１１の溶原性ファーヅのＤＮＡし１片と
の連結は、以下の如き手法で行うことができる。枯草圃
采色体ＤＮＡ断片とファージ５１１ＤＮＡ断片全混合し
、１ｒｎＭＡＴＰ、１０ｔｎ Ｍ Ｍ ｇＣｌ、、１０
ｒｒｔＭ ＤＴＴ−ｓ Ｏｒｎ、Ｍ Ｔｒｉｓ−１
１ＣＩ ｐＨ７，８を含む反応液中、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼによって１４℃１晩処理して連結することができる
。
’Ｔ耐性トリプトフアン生産性枯草菌の染色体ＤＮＡ断
片とファージρ１１の溶原性ファーヅのＤＮＡし１片と
の連結は、以下の如き手法で行うことができる。枯草圃
采色体ＤＮＡ断片とファージ５１１ＤＮＡ断片全混合し
、１ｒｎＭＡＴＰ、１０ｔｎ Ｍ Ｍ ｇＣｌ、、１０
ｒｒｔＭ ＤＴＴ−ｓ Ｏｒｎ、Ｍ Ｔｒｉｓ−１
１ＣＩ ｐＨ７，８を含む反応液中、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼによって１４℃１晩処理して連結することができる
。
上述のようにして得ることのできる連結ＤＮＡを、ファ
ージρ３．を溶原化しているｔｒｐ−枯草菌中に形質転
換してｔｐｒ十枯草菌形仙転換体を得る手法は、以下の
ようにして行うことができる。ファーヅρ羞、を溶原化
している枯草菌ＳＤＫＯ５３１ｔｒｐＣ２１ｇｕＡ８
（ｐＨ１）ｋ、ＣＩ培地で３７℃４時間培養後（、’Ｉ
Ｉ培地に２倍に希釈してＤＮＡを加え１時間培養後、ト
リプトファンを含まないＣＩ寒天培地に塗布し、３７℃
２日間培養してｔｒｐ十枯草菌形質転換体を得ることが
できる。
ージρ３．を溶原化しているｔｒｐ−枯草菌中に形質転
換してｔｐｒ十枯草菌形仙転換体を得る手法は、以下の
ようにして行うことができる。ファーヅρ羞、を溶原化
している枯草菌ＳＤＫＯ５３１ｔｒｐＣ２１ｇｕＡ８
（ｐＨ１）ｋ、ＣＩ培地で３７℃４時間培養後（、’Ｉ
Ｉ培地に２倍に希釈してＤＮＡを加え１時間培養後、ト
リプトファンを含まないＣＩ寒天培地に塗布し、３７℃
２日間培養してｔｒｐ十枯草菌形質転換体を得ることが
できる。
史に、上述のようにして得ることのできるｔ ｒｐ＋形
質転快体の培養によるファージの誘発及び斯くて得られ
たファージのｔｒｐ枯草菌中への形質導入によるｔｒｐ
＋形質導入体の形成は、以下の如き手法で行うことがで
きる。ｔγｐ＋形質転換体の１００コロニーを集め、３
７°ＣＬ培地で培養し、マイトマイシンＣ処理によって
ファージを誘発してｍ菌Ｐ２ｉ、を傅、遠心操作によっ
て除１罰後０４５μｍミリポアフイルタ−によシ生菌を
除く。５ＤＲ０５３１ｔｒｐＣ，−１ｔｇｕＡ＠菌をＬ
培地で培養し上述のようにして得ることのできる無菌的
なファージｌ＠菌液と混合して感染させ３０分間吸層さ
せ、トリプトファンを含まないＣＩ寒天培地双によって
３７℃２日間培養してｔｒｐ＋形質導入体を得ることが
できる。
質転快体の培養によるファージの誘発及び斯くて得られ
たファージのｔｒｐ枯草菌中への形質導入によるｔｒｐ
＋形質導入体の形成は、以下の如き手法で行うことがで
きる。ｔγｐ＋形質転換体の１００コロニーを集め、３
７°ＣＬ培地で培養し、マイトマイシンＣ処理によって
ファージを誘発してｍ菌Ｐ２ｉ、を傅、遠心操作によっ
て除１罰後０４５μｍミリポアフイルタ−によシ生菌を
除く。５ＤＲ０５３１ｔｒｐＣ，−１ｔｇｕＡ＠菌をＬ
培地で培養し上述のようにして得ることのできる無菌的
なファージｌ＠菌液と混合して感染させ３０分間吸層さ
せ、トリプトファンを含まないＣＩ寒天培地双によって
３７℃２日間培養してｔｒｐ＋形質導入体を得ることが
できる。
たとえば、上述のように得ることのできるｔｒｐ＋形質
導入体を培養してファージを紳発する手法及びＴＥＰ−
ＦＴＲを有する染色体ＤＮＡを持つ清涼性ファージの確
嵯、取得は例えば以下の如き手法で行うことができる。
導入体を培養してファージを紳発する手法及びＴＥＰ−
ＦＴＲを有する染色体ＤＮＡを持つ清涼性ファージの確
嵯、取得は例えば以下の如き手法で行うことができる。
ｔｒｐ＋形質導入体の単一コロニーをＬ培地で３７℃培
養してマイトマイシンＣにより一発し、フィルター濾過
により無菌的ファージ溶菌液を得る。当該溶菌液中のＴ
ＲＰ−ＦＴＥを組み込んだｔｒｐ形質導入ファージの確
認ハトリプトファンオペロンのＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ。
養してマイトマイシンＣにより一発し、フィルター濾過
により無菌的ファージ溶菌液を得る。当該溶菌液中のＴ
ＲＰ−ＦＴＥを組み込んだｔｒｐ形質導入ファージの確
認ハトリプトファンオペロンのＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ。
Ｅシス−トロンにそれぞれ変異を持つ枯草菌を宿主とし
て夫々のｔｒｐ＋形質導入体ヲ得ることで行うことがで
きる。
て夫々のｔｒｐ＋形質導入体ヲ得ることで行うことがで
きる。
上述のようにして造成できる本発明のトリプトファン合
成に対するトリプトファンによる阻害が解除されたトリ
プトファンオペロンＴ ＲＰ −ＦＴＲを有する染色体
ＤＮＡを持つ浴涼性ファージの一例として、後記芙施例
１，４に記載した枯草菌５ＤＰ−１１及び５ＤＰ−１２
は、工業技術院微生物工業技術研究庚の寄託受託拒否通
知書（通知着量：５７微富文第１４１５号及び１６９１
号）を受けた。該Ｔ ＲＰ −Ｆ Ｔ Ｒ？有する染色
体ＤＮＡを持つ浴涼性ファージ枯草園ファージ８１）Ｐ
−１１及び５ＤＰ−１’ｌは、昭和電工株式会社生化学
研究所に保管されている。
成に対するトリプトファンによる阻害が解除されたトリ
プトファンオペロンＴ ＲＰ −ＦＴＲを有する染色体
ＤＮＡを持つ浴涼性ファージの一例として、後記芙施例
１，４に記載した枯草菌５ＤＰ−１１及び５ＤＰ−１２
は、工業技術院微生物工業技術研究庚の寄託受託拒否通
知書（通知着量：５７微富文第１４１５号及び１６９１
号）を受けた。該Ｔ ＲＰ −Ｆ Ｔ Ｒ？有する染色
体ＤＮＡを持つ浴涼性ファージ枯草園ファージ８１）Ｐ
−１１及び５ＤＰ−１’ｌは、昭和電工株式会社生化学
研究所に保管されている。
該溶原性ファーヅの性質は以下のとおりである。
両ファージ５ＤＰ＝１１．５ＤＰ−１２ともにファージ
ＤＮＡ中に枯草菌トリプトファンオペロン全体のＤＮＡ
が組み込捷れており、それ故トリプトファンオペロン中
の谷シストロンに変異ヲ持つトリプトファン要求性株を
ｔｃｐ十形袈導入する。
ＤＮＡ中に枯草菌トリプトファンオペロン全体のＤＮＡ
が組み込捷れており、それ故トリプトファンオペロン中
の谷シストロンに変異ヲ持つトリプトファン要求性株を
ｔｃｐ十形袈導入する。
さらにり、ｉ ｓ Ｂ 遺伝子をも含むことが枯草７
ｈｉｓ＋ ＢをｈｉｓＢ 形朋転換することで示された。プラーク
形成能については５ＤＰ−１１については不明であるが
５ＤＰ−１２はグラーク形成しない。
ｈｉｓ＋ ＢをｈｉｓＢ 形朋転換することで示された。プラーク
形成能については５ＤＰ−１１については不明であるが
５ＤＰ−１２はグラーク形成しない。
トリシトファン合成に対するトリプトファンによる阻害
が解除されたトリプトファンオペロンＴ ＲＰ −Ｆ’
ｉ’ Ｒｆ少なくとも２ケ有する栄色体ＤＮＡｆ持つ
本発明のＺ、−）リプトラアン生産性枯草菌（バチルス
・ズブチリス）は、栄養培地たとえば寒天栄養培地上、
前述の如きＴＩＩＰ−ＦＴＥを有する染色体ＤＩ’ＪＡ
を持つ溶原性ファーソの共存下に、１’ ＲＰ −Ｆ１
’ Ｒを有する染色体ＤＮＡを持つ枯草菌たとえばｓＦ
Ｔ耐性のトリシトファン生産性枯草菌を培養し、培地に
形成されたｔｒｐ＋形質導入体溶原菌（ＴＲＰ−Ｆ−Ｔ
Ｒｆ有する染色体ＤＮＡｆ持つ清涼性ファージが溶原化
されたＴＥＰ−ＦＴＲを少なくとも２ケ有する染色体Ｄ
ＮＡを持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌）を採取し
、採取した該清涼菌を通商な栄養培地たとえは寒天栄養
培地上で純粋分離（ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｙ １ｓｏ
ｌａｔｉｏｎ） Ｌ、、上記ＴＲＰ−ＦＴＲを有する朶
色体ＤＮＡを持つ枯草菌が本来持っていたＴＲＰ−ＦＴ
Ｒを有するほかに、上記清涼性ファージからの追加のＴ
ＲＰ−ＦＴＲｆ有する染色体ＤＮＡを持つことを確認す
ることによυ造成できる。
が解除されたトリプトファンオペロンＴ ＲＰ −Ｆ’
ｉ’ Ｒｆ少なくとも２ケ有する栄色体ＤＮＡｆ持つ
本発明のＺ、−）リプトラアン生産性枯草菌（バチルス
・ズブチリス）は、栄養培地たとえば寒天栄養培地上、
前述の如きＴＩＩＰ−ＦＴＥを有する染色体ＤＩ’ＪＡ
を持つ溶原性ファーソの共存下に、１’ ＲＰ −Ｆ１
’ Ｒを有する染色体ＤＮＡを持つ枯草菌たとえばｓＦ
Ｔ耐性のトリシトファン生産性枯草菌を培養し、培地に
形成されたｔｒｐ＋形質導入体溶原菌（ＴＲＰ−Ｆ−Ｔ
Ｒｆ有する染色体ＤＮＡｆ持つ清涼性ファージが溶原化
されたＴＥＰ−ＦＴＲを少なくとも２ケ有する染色体Ｄ
ＮＡを持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌）を採取し
、採取した該清涼菌を通商な栄養培地たとえは寒天栄養
培地上で純粋分離（ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｙ １ｓｏ
ｌａｔｉｏｎ） Ｌ、、上記ＴＲＰ−ＦＴＲを有する朶
色体ＤＮＡを持つ枯草菌が本来持っていたＴＲＰ−ＦＴ
Ｒを有するほかに、上記清涼性ファージからの追加のＴ
ＲＰ−ＦＴＲｆ有する染色体ＤＮＡを持つことを確認す
ることによυ造成できる。
上記清涼自の形成は、たとえば以下の如き手法で行うこ
とができる。ｔｒｐ＋形質導入ファージ枯草菌ファージ
５ＤＰ−１１に感受性な５ＦＴ耐性のトリプトファン生
理性枯草菌２６Ｆ１５０株にｔｒｐ＋ｒｐ＋入ファージ
５ＤＰ−ＩＬを感染させ、ファージρ１．に抵抗性とな
った２６Ｆ１ｓＯのｔｒｐ＋形仙、導入ファーソ溶原誦
を得る。トリプトファン生産能の商いｔｒｐ＋１杉質導
入体質導入体ｐｐｍのアンスラニル酸ヲ含むＣｔ培地（
トリプトファンを除く）で３７℃、１０時間培養し、培
地中ノドリフトファンを高速液体クロマトグラフィーで
検定することで行った。得られた２６Ｆ１５０にｔｒｐ
力杉質纒入ファーソが溶原化した株からマイトマイシン
Ｃ誘発によりｔｒｐ＋形儒導形体導入体することで、２
６Ｆ１５ｏ中ｔｒｐ＋形質導入フアーゾが溶原化してい
ることが確認され、当該体中に少なくとも２ケのＴＲＰ
−ＦＴＲが存在することが確認された。
とができる。ｔｒｐ＋形質導入ファージ枯草菌ファージ
５ＤＰ−１１に感受性な５ＦＴ耐性のトリプトファン生
理性枯草菌２６Ｆ１５０株にｔｒｐ＋ｒｐ＋入ファージ
５ＤＰ−ＩＬを感染させ、ファージρ１．に抵抗性とな
った２６Ｆ１ｓＯのｔｒｐ＋形仙、導入ファーソ溶原誦
を得る。トリプトファン生産能の商いｔｒｐ＋１杉質導
入体質導入体ｐｐｍのアンスラニル酸ヲ含むＣｔ培地（
トリプトファンを除く）で３７℃、１０時間培養し、培
地中ノドリフトファンを高速液体クロマトグラフィーで
検定することで行った。得られた２６Ｆ１５０にｔｒｐ
力杉質纒入ファーソが溶原化した株からマイトマイシン
Ｃ誘発によりｔｒｐ＋形儒導形体導入体することで、２
６Ｆ１５ｏ中ｔｒｐ＋形質導入フアーゾが溶原化してい
ることが確認され、当該体中に少なくとも２ケのＴＲＰ
−ＦＴＲが存在することが確認された。
上述のようにして造成できる本発明のトリプトファン合
成に対するトリプトファンによる阻Ｊが解除されたトリ
プトファンオペロンを少なくトモ２ケ有する染色体ＤＮ
Ａ２持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌の一例として
、後記実施例２に記載したｌ々チルス・ズブチリス５Ｄ
−１１（２６Ｆｘ５０＋４８）及び実施例４に記載した
バチルス・ズブチリス５Ｄ−１２＊は、工業技術院微生
物工業研究所の寄託拒否通知書（通知省号；５７微を文
箱１４１４号及び１６９２号）を受けた。
成に対するトリプトファンによる阻Ｊが解除されたトリ
プトファンオペロンを少なくトモ２ケ有する染色体ＤＮ
Ａ２持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌の一例として
、後記実施例２に記載したｌ々チルス・ズブチリス５Ｄ
−１１（２６Ｆｘ５０＋４８）及び実施例４に記載した
バチルス・ズブチリス５Ｄ−１２＊は、工業技術院微生
物工業研究所の寄託拒否通知書（通知省号；５７微を文
箱１４１４号及び１６９２号）を受けた。
該Ｔｌ１Ｐ−ＦＴＲを少なくとも２ケ有する染色体ＤＮ
Ａを持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌バチルス・ズ
ブチリス５Ｄ−Ｌｌ及びｓｎ−１２は、昭和電工株式会
社生化学研究所に保管されている。
Ａを持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌バチルス・ズ
ブチリス５Ｄ−Ｌｌ及びｓｎ−１２は、昭和電工株式会
社生化学研究所に保管されている。
該Ｌ−１−リプトファン生産性枯草菌の性質は以下のと
おりである。栄養要求性がなく、合成培地で増殖可能で
あシ、少なくとも２ケのトリプトファンオペロンを含む
。
おりである。栄養要求性がなく、合成培地で増殖可能で
あシ、少なくとも２ケのトリプトファンオペロンを含む
。
本発明に於て、、ＴＲＰ−ＦＴＲを２ケを超えて有する
染色体ＤＮＡｆ持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌は
、たとえば、以下のようにして造成することができる。
染色体ＤＮＡｆ持つＬ−トリプトファン生産性枯草菌は
、たとえば、以下のようにして造成することができる。
たとえば２６．Ｆ１５０＃４８株にρ１．以外の清涼性
ファーヅφ１ｏ、あるいは５ＰＯ２のｔｒ錯形質導入フ
ァーソを感染させることにより造成することができる。
ファーヅφ１ｏ、あるいは５ＰＯ２のｔｒ錯形質導入フ
ァーソを感染させることにより造成することができる。
φ、。、 、５ＰＯ２のｔｒｐ十形質導入ファージはρ
１□の方法に準じて十 行うことができる。＾いｔｒｐ形質能のあるファージ溶
薗゛液を濃縮によって得、高重複感染度（ｍｒｂｌｔｉ
ｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｇｃｔｉｏｎ、 ＭＯ１
か５以上）で感染することにより一種のファニソの重複
溶原化（ｍｓＬｔｉｐｌｇ ｌｙｓｏｇｇｎｉｚａｔｉ
ｏｎ’）によりＴ ＲＰ −Ｐ’ Ｔ Ｒを２ケを超え
て有する枯草菌を得ることかできる。
１□の方法に準じて十 行うことができる。＾いｔｒｐ形質能のあるファージ溶
薗゛液を濃縮によって得、高重複感染度（ｍｒｂｌｔｉ
ｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｇｃｔｉｏｎ、 ＭＯ１
か５以上）で感染することにより一種のファニソの重複
溶原化（ｍｓＬｔｉｐｌｇ ｌｙｓｏｇｇｎｉｚａｔｉ
ｏｎ’）によりＴ ＲＰ −Ｐ’ Ｔ Ｒを２ケを超え
て有する枯草菌を得ることかできる。
本発明によれば、上述のようにして造成できるＴＲＰ−
Ｆ’ＴＲｑ少なくとも２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ
−トリプトファン生産性枯草菌を利用して、改善され
た筒中産性をもって、造成プラスミドの場合のような不
安定なトラブルを伴うことなしに、工業的に有利にＬ−
トリプトファンを製造することができる。
Ｆ’ＴＲｑ少なくとも２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ
−トリプトファン生産性枯草菌を利用して、改善され
た筒中産性をもって、造成プラスミドの場合のような不
安定なトラブルを伴うことなしに、工業的に有利にＬ−
トリプトファンを製造することができる。
斯くて、本幀明によれば、トリプトファン合成に対する
トリプトファンによる阻害が解除されたトリプトファン
オペロンを少なくとも２り°宿する染色体ＤＮＡｆ持つ
Ｌ −） ＋７プトフアン生産性枯草鋼（バチルス・ズ
ブチリス）を、培地中に培養し、形成された培養培地か
らＬ −トＩＪブトファンを採取することを特徴とする
醗酵法Ｌ−）リプトファンの製法が提供できる。
トリプトファンによる阻害が解除されたトリプトファン
オペロンを少なくとも２り°宿する染色体ＤＮＡｆ持つ
Ｌ −） ＋７プトフアン生産性枯草鋼（バチルス・ズ
ブチリス）を、培地中に培養し、形成された培養培地か
らＬ −トＩＪブトファンを採取することを特徴とする
醗酵法Ｌ−）リプトファンの製法が提供できる。
上記製法は１本発明のＴ １１ Ｐ −ＦＴ Ｒを少な
くとも２ケ有する染色体ＤＮＡ−ｑ持つＬ−ト＋Ｊブト
ファン生産性枯単菌を・１丈用するほかは、それ自体公
知のＬ−トリプトファン生産性枯草菌ヲ用いる醗酵法Ｌ
−トリプトファンの公知製法に準じて行なうことができ
る。
くとも２ケ有する染色体ＤＮＡ−ｑ持つＬ−ト＋Ｊブト
ファン生産性枯単菌を・１丈用するほかは、それ自体公
知のＬ−トリプトファン生産性枯草菌ヲ用いる醗酵法Ｌ
−トリプトファンの公知製法に準じて行なうことができ
る。
利用する栄養培地としては、炭素源、窒素源、ミネラル
、などを含有する公知培地が利用できる。
、などを含有する公知培地が利用できる。
炭素源の例としては、グ、ルコース、フラクトース、シ
ュクロース、りが−ス、酢酸、エタノール、グリセリン
などを例示でき、又、窒素源の例としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー等の有
機窒紫、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナ
トリウム等の無機窒素などを例示できる。更に、ミネラ
ルの例としては。
ュクロース、りが−ス、酢酸、エタノール、グリセリン
などを例示でき、又、窒素源の例としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー等の有
機窒紫、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナ
トリウム等の無機窒素などを例示できる。更に、ミネラ
ルの例としては。
カルシウム塩、ナトリウムりんば塩、カリウムりん酸塩
、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト、モリブデン、す
んなどを例示できる。他の添加剤としてアンスラニル酸
を例示でき、本発明においては、アンスラニル絃含有培
地の利用が必要である。
、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト、モリブデン、す
んなどを例示できる。他の添加剤としてアンスラニル酸
を例示でき、本発明においては、アンスラニル絃含有培
地の利用が必要である。
その１史用重は適宜に選択できるが、例えば１時間あた
り１ｇ７ｉｔの如き使用敏を例示することができる。
り１ｇ７ｉｔの如き使用敏を例示することができる。
培養条件及び培養培地からのＬ −） リプトファンの
採取法も公知の条件を採用でき、たとえば。
採取法も公知の条件を採用でき、たとえば。
約６５〜約＆０のｐＨ条件、たとえば、約３５〜約３７
℃の温度条件、たとえば約３０〜約３６時間の培養期間
を例示することができる。
℃の温度条件、たとえば約３０〜約３６時間の培養期間
を例示することができる。
培養後、培養液中のＬ −） リプトファンは、たとえ
ばイオン交換樹脂に吸着恢、アンモニア水で溶出し、濃
縮などの手法により、採取することができる。
ばイオン交換樹脂に吸着恢、アンモニア水で溶出し、濃
縮などの手法により、採取することができる。
以下、実施例によシ本発明実施の数態様について更に詳
しく説明する。
しく説明する。
実施例１
トリプトファン合成に対するトリプトファンによる阻害
が解除されたトリプト７アンオペロンヲ有する染色体Ｄ
ＮＡを持つ清涼性ファーソ。
が解除されたトリプト７アンオペロンヲ有する染色体Ｄ
ＮＡを持つ清涼性ファーソ。
（ｔ） ｓＦＴ耐性トリプトファン生産性枯草菌株の
分離。
分離。
ドリフトファン生産性枯草画法（バチルス・ズブチリス
ＩＡＭ１０２６株）を２ｏｏｐｉ／ｍ１３の二トロソグ
アニソンで処理したのち、５−７０ロトリプ）７７７（
５ＦＴ）ｔｏｏｏμＦ／ｍｌを含む合成培地（Ｋ、ＨＰ
ｏ、 １．４％、Ｋｌｉ、ＰＯ４０，６％。
ＩＡＭ１０２６株）を２ｏｏｐｉ／ｍ１３の二トロソグ
アニソンで処理したのち、５−７０ロトリプ）７７７（
５ＦＴ）ｔｏｏｏμＦ／ｍｌを含む合成培地（Ｋ、ＨＰ
ｏ、 １．４％、Ｋｌｉ、ＰＯ４０，６％。
Ｃ）ｖＨ，）、８０． ｏ、 ２％、クエン酸ナトリウ
ム・Ｗρ０．１％、 Ｍｇ５Ｏ，・ＴＨ，０５ｍ、Ｍ、
グルコース１％、カザミノＭ０．０２％、寒天１．５
％ ）に、プレート当り約１０６１βｉの細胞をひろげ
て、３７℃で１晩培養した。この方法により５ＦＴ耐注
バチルス・ズブチリスＩＡＭ１０２６株の約１００株を
独立に分離した。得られた耐性株を、それぞ１＋−１１
０ｍ／！の上記合成培地から淋天を除き２００μ９ ／
ｍｌのアントラニル酸を含む培地に、３７℃で２４時
間培養し、培養液中のトリプトファンを尚速液体クロマ
トグラフィーで測定して最もトリプトファン生産性の良
いｓＦＴ耐性トリシトファン生産性枯草枯草２６ ｐ’
１５０株を分離採取した。
ム・Ｗρ０．１％、 Ｍｇ５Ｏ，・ＴＨ，０５ｍ、Ｍ、
グルコース１％、カザミノＭ０．０２％、寒天１．５
％ ）に、プレート当り約１０６１βｉの細胞をひろげ
て、３７℃で１晩培養した。この方法により５ＦＴ耐注
バチルス・ズブチリスＩＡＭ１０２６株の約１００株を
独立に分離した。得られた耐性株を、それぞ１＋−１１
０ｍ／！の上記合成培地から淋天を除き２００μ９ ／
ｍｌのアントラニル酸を含む培地に、３７℃で２４時
間培養し、培養液中のトリプトファンを尚速液体クロマ
トグラフィーで測定して最もトリプトファン生産性の良
いｓＦＴ耐性トリシトファン生産性枯草枯草２６ ｐ’
１５０株を分離採取した。
（２１５ｋ’ １’剛性トリプトフアン生産性枯ＲＬ菌
の染色体ＤＮＡのｔｖｂ製。
の染色体ＤＮＡのｔｖｂ製。
上記（１）で得られた２６Ｆ１５０株を１００ｍ１のＬ
−培地（８，９バクトドリプトン、４．！ｉ’酵母菌抽
出物、４ｇＮａＣ１を１１の水に溶解）に５時間培養し
たのち集菌し、菌体を２０ ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒ ｉ ｓ −ＲＣｌ 、 ０．４ Ｍ ＮａＣｌ、
１０ ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９，０）に懸濁し、リゾチ
ーム１〜／ ｍｌ ’ｆｒ 冷加して３７℃で１０分間
放置したのち。
−培地（８，９バクトドリプトン、４．！ｉ’酵母菌抽
出物、４ｇＮａＣ１を１１の水に溶解）に５時間培養し
たのち集菌し、菌体を２０ ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒ ｉ ｓ −ＲＣｌ 、 ０．４ Ｍ ＮａＣｌ、
１０ ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９，０）に懸濁し、リゾチ
ーム１〜／ ｍｌ ’ｆｒ 冷加して３７℃で１０分間
放置したのち。
ｓｎｓ （リゾイウムドデシルスルフエイト）１％を〃
口えて溶菌する。次いで、常法に従って１等量の水で飽
和したフェノールを加え９０００回転１０分間の遠心処
理して２層に分け、上層のＤＩＳＩＡを２倍電のエタノ
ール（９５％）加えることにより沈澱させ精製して、
５ＦＴ耐性トリプトファン表 生産性枯草菌２６Ｆ１５０株の精製した染色体ＤＮＡ約
５００μｇ全得た。
口えて溶菌する。次いで、常法に従って１等量の水で飽
和したフェノールを加え９０００回転１０分間の遠心処
理して２層に分け、上層のＤＩＳＩＡを２倍電のエタノ
ール（９５％）加えることにより沈澱させ精製して、
５ＦＴ耐性トリプトファン表 生産性枯草菌２６Ｆ１５０株の精製した染色体ＤＮＡ約
５００μｇ全得た。
（３） 枯草菌の清涼住ファージＤＮＡの調製。
枯草菌の清涼性ファーヅρ１１（バチルス・ズブチリス
、１）Ｋ０５３１（ρ１．）株）を、５００罰のＬ−培
地を収容した２１答三角フラスコで３７℃で振盪培髪し
た。菌体濃度が１０ ’ ／ｍｌ（０゜Ｄ、、わが０．
１）に達した時にマイトマイシンＣｆ１μｍ７７ｍ１添
加して更に１０分間振盪培養をつづけた。
、１）Ｋ０５３１（ρ１．）株）を、５００罰のＬ−培
地を収容した２１答三角フラスコで３７℃で振盪培髪し
た。菌体濃度が１０ ’ ／ｍｌ（０゜Ｄ、、わが０．
１）に達した時にマイトマイシンＣｆ１μｍ７７ｍ１添
加して更に１０分間振盪培養をつづけた。
培＃物中の菌体を遠心分離により集めて新しいＬ−培地
５００Ｍに懸濁し、３７℃で菌体が浴解するまで撮盪培
養したのち、遠心分離により上澄液を集めた。この上澄
液にポリエチレングリコール１０％および０．５Ｍとな
るように＃ ａ Ｃｌ ｆ加えて、４℃に一晩放直した
。
５００Ｍに懸濁し、３７℃で菌体が浴解するまで撮盪培
養したのち、遠心分離により上澄液を集めた。この上澄
液にポリエチレングリコール１０％および０．５Ｍとな
るように＃ ａ Ｃｌ ｆ加えて、４℃に一晩放直した
。
一晩放置波、５ｏｏｏτ、ｐ、η４．１０分間の条件で
遠心分離して沈澱物を集め、これを５−の緩衝液（１０
ｍｕ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．１５ Ｍ ＮａＣＬ、１
０ ｍＭ ＭｇＣ１２）に溶かし、これをＣｓＣ１（塩
化セシウム２０％ｗ／ｗ 〜４５ ｑ６ｗ／ｗ ）の密
度勾配遠心にかけてファージρ、１区分を得た。得られ
たファージ４，１区分を同じ緩衝液を用いて透析してＣ
ｓＣ１を除き、次いで、常法に従って、５ＤＳ（１チ）
、フェノール処理によってＤＮＡを精製して、枯草菌溶
原住ファーソρ、１の精製した染色体Ｄ Ｎ’ Ａ約２
ｍｇを得た。
遠心分離して沈澱物を集め、これを５−の緩衝液（１０
ｍｕ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．１５ Ｍ ＮａＣＬ、１
０ ｍＭ ＭｇＣ１２）に溶かし、これをＣｓＣ１（塩
化セシウム２０％ｗ／ｗ 〜４５ ｑ６ｗ／ｗ ）の密
度勾配遠心にかけてファージρ、１区分を得た。得られ
たファージ４，１区分を同じ緩衝液を用いて透析してＣ
ｓＣ１を除き、次いで、常法に従って、５ＤＳ（１チ）
、フェノール処理によってＤＮＡを精製して、枯草菌溶
原住ファーソρ、１の精製した染色体Ｄ Ｎ’ Ａ約２
ｍｇを得た。
（４１ｔ２）で得た染色体ＤＮＡ及び（３）で得たＤＮ
Ａの断片の調製。
Ａの断片の調製。
上記（２）で得た２６Ｆ１５０株の染色体ＤＮＡの１０
μｇと上記（３）で得た枯草両温原性ファージρ１゜の
ＤＮＡ１０μｌｉとを反応液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＬ（ｐｉｉ７．５ ）、５０Ｍ ＮａＣ１，１０ｒｒ
ＬＭＭＱＣＩ、 、 １００μＩ／ゴウシ血清アルブミ
ン）中で、５０ユニツトの制限酵素Ｅ、ｏＲ１の存在下
に３７℃で１時間反応させた。その後、６５℃で５分間
加熱処理して制限酵４Ｅ、ｏＲ１を失活させて反応を停
止させた。
μｇと上記（３）で得た枯草両温原性ファージρ１゜の
ＤＮＡ１０μｌｉとを反応液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＬ（ｐｉｉ７．５ ）、５０Ｍ ＮａＣ１，１０ｒｒ
ＬＭＭＱＣＩ、 、 １００μＩ／ゴウシ血清アルブミ
ン）中で、５０ユニツトの制限酵素Ｅ、ｏＲ１の存在下
に３７℃で１時間反応させた。その後、６５℃で５分間
加熱処理して制限酵４Ｅ、ｏＲ１を失活させて反応を停
止させた。
（５）枯単困采色体Ｄ Ｎ Ａ （２）断片とファージ
ＤＮＡ（３）断片の連結処理。
ＤＮＡ（３）断片の連結処理。
上記（５）で形成きれた２６Ｆ１５０．１木の染色体Ｄ
ＮＡ断片及びファージρ１．のＤ’ＮＡ断片を含有する
Ｅ、ｏｌビＩ反応液に、ＡＴＰＣアデノシン−３−りん
敵）１ ｍＭ、ＤＴＴ （ヅチオスレイトール）１０ｍ
Ｍ及びＴ、すｉｆ −セ１ ｖｒＬｉｔ ｆ ）Ｊｕ工
て全量を２００μｌとし、１５℃で１８時間反応させた
。
ＮＡ断片及びファージρ１．のＤ’ＮＡ断片を含有する
Ｅ、ｏｌビＩ反応液に、ＡＴＰＣアデノシン−３−りん
敵）１ ｍＭ、ＤＴＴ （ヅチオスレイトール）１０ｍ
Ｍ及びＴ、すｉｆ −セ１ ｖｒＬｉｔ ｆ ）Ｊｕ工
て全量を２００μｌとし、１５℃で１８時間反応させた
。
（６）連結ＤＮＡのｔｒｐ−枯草劇中への形質転換によ
るｔｒｐ形賞導入体の形成。
るｔｒｐ形賞導入体の形成。
枯阜凶溶原性ファーソρ１１（バチルス・ズブチリｘＳ
ＤＫ０５３１ ｔｒｐＣ，、Ｉｇｕ Ａ、（ｐ、、）
ｋ）ｅ、５ＷＬｅｏｃ−を培地（Ｋ、ＨＰｏ、 １．４
％、ＫＨ，Ｐｏ、 ０．６ ％、 （Ａ’Ａ）ｔＳ
Ｏｉ Ｏ８２チ、クエン酸ナトリウム・２Ｈ，００，１
％、Ｍ Ｑ Ｓ Ｏ，・ｒＨ，Ｏｓｍ Ｍ 、グＡ／
コー ス０．５％、カザミノ酸０．０２％、ロイシン５
０μＩ／扉ｌ、メチオニン５０μ、Ｆ ／ｍ）で、菌体
増殖を示すＯ−Ｄ、６Ｑの増加が止まる壕で、３７°Ｃ
で振袖培養した。集菌後、とｉ″Ｌを１０ゴのＣ−ｎ培
地（Ｃ−１培地のカザミノばとアミノ酸を１／１０とし
た培地）に懸濁し、この自体懸濁液０．１ ｍｌに上記
（５）で得た連結処理したＤＮＡ液を加え、３７℃で３
０分間振盪した。この液を緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ ７ｙＨ７，４，０，１５Ａ（ＮａＣ１）で１０
倍に希釈して選択用プレートにプレート当り０．１フづ
つスプレッダ−を用いて塗布＋ し、３７°Ｃで２４時間放城してｔｒｐ形質導入体約１
００００ケが得られた。
ＤＫ０５３１ ｔｒｐＣ，、Ｉｇｕ Ａ、（ｐ、、）
ｋ）ｅ、５ＷＬｅｏｃ−を培地（Ｋ、ＨＰｏ、 １．４
％、ＫＨ，Ｐｏ、 ０．６ ％、 （Ａ’Ａ）ｔＳ
Ｏｉ Ｏ８２チ、クエン酸ナトリウム・２Ｈ，００，１
％、Ｍ Ｑ Ｓ Ｏ，・ｒＨ，Ｏｓｍ Ｍ 、グＡ／
コー ス０．５％、カザミノ酸０．０２％、ロイシン５
０μＩ／扉ｌ、メチオニン５０μ、Ｆ ／ｍ）で、菌体
増殖を示すＯ−Ｄ、６Ｑの増加が止まる壕で、３７°Ｃ
で振袖培養した。集菌後、とｉ″Ｌを１０ゴのＣ−ｎ培
地（Ｃ−１培地のカザミノばとアミノ酸を１／１０とし
た培地）に懸濁し、この自体懸濁液０．１ ｍｌに上記
（５）で得た連結処理したＤＮＡ液を加え、３７℃で３
０分間振盪した。この液を緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ ７ｙＨ７，４，０，１５Ａ（ＮａＣ１）で１０
倍に希釈して選択用プレートにプレート当り０．１フづ
つスプレッダ−を用いて塗布＋ し、３７°Ｃで２４時間放城してｔｒｐ形質導入体約１
００００ケが得られた。
（７） Ｔ ＲＰ −Ｆ Ｔ Ｒを有する染色体ＤＮ
Ａを持つｍ原性ンアージの確認及び選択。
Ａを持つｍ原性ンアージの確認及び選択。
上記（６）で得られたｔｒｐ＋形質転換体を１００ケす
つ１００コロニーに集め、５ ｍｌのＬ−培地に懸γ助
した。これをＯ，−Ｄ、、６゜が０．０５となるように
Ｌ−培地で１ｂ°釈したのち、３７°Ｃで振盪培養し、
０ 、− Ｊ）、 ｎｅｏが０．１になった時にマイト
マイシンＣ０１５μｌ／ ／ ｍｌ？加え更に約ｌＯ分
間振舖した。この液を４００ Ｏｒ、 ｐ、η−１１０
分間の条件で遠心処理に賦して果鉋し、この細体を新し
い培地に懸Ｙｌｌｎｌ、、３７℃で３時間振盪培養して
磐田させた。
つ１００コロニーに集め、５ ｍｌのＬ−培地に懸γ助
した。これをＯ，−Ｄ、、６゜が０．０５となるように
Ｌ−培地で１ｂ°釈したのち、３７°Ｃで振盪培養し、
０ 、− Ｊ）、 ｎｅｏが０．１になった時にマイト
マイシンＣ０１５μｌ／ ／ ｍｌ？加え更に約ｌＯ分
間振舖した。この液を４００ Ｏｒ、 ｐ、η−１１０
分間の条件で遠心処理に賦して果鉋し、この細体を新し
い培地に懸Ｙｌｌｎｌ、、３７℃で３時間振盪培養して
磐田させた。
溶菌液を無菌的にミリポアフィルタ−（０，４５μ）に
；１ａ ｔ、て生菌を除去し、この生白１を除去した溶
菌７ｒりを希釈緩衝ｇ、（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＨＣ
ｌ ｐＨ７，４，０，１５＆ ＮａＣ１，１０ｍＭ
ＭｇＣ１，）で１０°〜１０７に希釈した。これらの希
釈液０．１ｍｌと、宿主菌としてバチルス・ズブチリス
５ＤＫ０５３１−ＴｒｐＣ株をＬ−培地にＯ，−Ｄ、６
．。
；１ａ ｔ、て生菌を除去し、この生白１を除去した溶
菌７ｒりを希釈緩衝ｇ、（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＨＣ
ｌ ｐＨ７，４，０，１５＆ ＮａＣ１，１０ｍＭ
ＭｇＣ１，）で１０°〜１０７に希釈した。これらの希
釈液０．１ｍｌと、宿主菌としてバチルス・ズブチリス
５ＤＫ０５３１−ＴｒｐＣ株をＬ−培地にＯ，−Ｄ、６
．。
が０，１となるまで培養したもの０．１Ｍとを、３７℃
３０分反応させ、Ｃ−ｒ培地から要求アミノ酸であるト
リプトファンを除きかつ１．５弼となるように寒天を加
えた平板培地にスプレッダ−で塗布し、３７℃１晩培養
してトリプトファン非要求性となったｍ−Ｃｔτｐ十形
質転換株）を得た。単一の集落を単離し上に述べたごと
くマイトマイシンＣでファージを誘発して＃菌液を得た
。これら溶菌液のプラーク形成能とトリプトファンオペ
ロン中に突然変異をもつトリプトファン要求株であるｔ
ｒｐ Ａ、ｔｒｐＢ、 ｔｒｐＣ，ｔｒｐＤ、 ｔ
ｒｐＢ株を受容菌としてのｔｒｐ形質導入能を調べる。
３０分反応させ、Ｃ−ｒ培地から要求アミノ酸であるト
リプトファンを除きかつ１．５弼となるように寒天を加
えた平板培地にスプレッダ−で塗布し、３７℃１晩培養
してトリプトファン非要求性となったｍ−Ｃｔτｐ十形
質転換株）を得た。単一の集落を単離し上に述べたごと
くマイトマイシンＣでファージを誘発して＃菌液を得た
。これら溶菌液のプラーク形成能とトリプトファンオペ
ロン中に突然変異をもつトリプトファン要求株であるｔ
ｒｐ Ａ、ｔｒｐＢ、 ｔｒｐＣ，ｔｒｐＤ、 ｔ
ｒｐＢ株を受容菌としてのｔｒｐ形質導入能を調べる。
その結果、ｔｒｐ Ａ Ｎｔｒｐ Ｅ株に対して全てだ
ｔｒｐ＋形質導入能が認められた溶菌液を提供した株が
、ＴＲＰ−ＦＴＲを有する染色体ＤＮＡを持つ清涼性フ
ァーソと確認１選択される。
ｔｒｐ＋形質導入能が認められた溶菌液を提供した株が
、ＴＲＰ−ＦＴＲを有する染色体ＤＮＡを持つ清涼性フ
ァーソと確認１選択される。
得られた本発明のＴＲＰ−ＦＴＲを有する染色体ＤＮＡ
を持つ清涼性ファーソは、枯草菌ファージ５ｎｐ−１１
と老台された。
を持つ清涼性ファーソは、枯草菌ファージ５ｎｐ−１１
と老台された。
実施例２
ドリフトファン合成に対するトリプトファンによる阻害
が解除されたトリプトファンオペロンｆ少なくとも２ケ
有する染色体ＤＮＡを持つＬ−トリフ’）ファン生産性
枯草菌（バチルス・ズブチリス）。
が解除されたトリプトファンオペロンｆ少なくとも２ケ
有する染色体ＤＮＡを持つＬ−トリフ’）ファン生産性
枯草菌（バチルス・ズブチリス）。
実）Ｊ１！＋１り１１１のｆｌ）で得られた５ＦＴ耐性
トリプトファン生産性枯草賄株バチルス・ズブチリス２
６Ｆ’１５０株を宿主田とし、実施例１で得られた７°
ＲＰ−Ｆ′Ｉ′Ｒ分有するＤＮＡ′ｆ持つ溶原住ファー
ソ５ＤＰ−１１を用いて１’ｌビＰ−ＦＴＲを少々くと
も２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ−トリブトファン生
産性枯草ｍ′ｆ；ｒ造成した。２６７”１５０株をＬ培
地（バク）ｌｌグトン８１１／１１、酵母菌抽出ζクツ
４ ＆ ／ ｌ、 ＮａＣ；ｌ ４１ ／ ｌ ）で培
養しＯｏＤ、、６゜が０．１ （１０” ｃｅｌｌ／
ｍｌ ）となった所で３５００回転／分１０分間の遠心
処理により集菌し緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｌ ｐＨ７，４のｇ、 １５ ＮａＣｔ。
トリプトファン生産性枯草賄株バチルス・ズブチリス２
６Ｆ’１５０株を宿主田とし、実施例１で得られた７°
ＲＰ−Ｆ′Ｉ′Ｒ分有するＤＮＡ′ｆ持つ溶原住ファー
ソ５ＤＰ−１１を用いて１’ｌビＰ−ＦＴＲを少々くと
も２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ−トリブトファン生
産性枯草ｍ′ｆ；ｒ造成した。２６７”１５０株をＬ培
地（バク）ｌｌグトン８１１／１１、酵母菌抽出ζクツ
４ ＆ ／ ｌ、 ＮａＣ；ｌ ４１ ／ ｌ ）で培
養しＯｏＤ、、６゜が０．１ （１０” ｃｅｌｌ／
ｍｌ ）となった所で３５００回転／分１０分間の遠心
処理により集菌し緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｌ ｐＨ７，４のｇ、 １５ ＮａＣｔ。
１ ’０９７ＺＡ／ ＭｇＣす）に２倍の函度に懸濁す
る。その０． Ｉ ＮＬｌと実施例１で述べたＴＪＩ−
ｔＰ−ＦＴノンを有するＤＮＡを持つ溶涼性ファーソＰ
１−１溶菌液ｏ、ｉ ｍ’ トｆｋ合し３０分間３７°
Ｃで成層させ１０”のρ１．クリアープラーク形成粒子
を加え実施例１に示したＣ−を合成寒天培地にひろげた
。３７℃１晩培養後出現したコロニーをＬ寒天培地（Ｌ
培地に１．５チとなるように寒天を加える。）上で単一
コロニー化によって純化した。このようにして得ｆｃ、
２６ Ｆ １５０ 株のファージρ１１による隘原菌
からｔｒｐ形質導入ρ１１によって浴涼化された株ｆ：
２００μ、ｌｉｔ ／ ｒｎｅのアンスラニル酸を加え
アきノ酸を除いたＣ−１培地で３７℃１０時間培養して
その培地中のトリプトファンを、−・、速液体クロマト
グラフィーにより検定することにより２６ Ｆ １５０
株の生産するトリプトファン粛と比較して１６６倍の蓄
積を示すものとして選んだ。さらに実施例１に示した方
法によりこの賄のマイトマイシンＣ誘発佐の溶菌液にｔ
ｒｐ＋形質能が検出され、ｔｒｐ＋形ａ導入ファーソρ
、１が溶原化されていることが僅認された。
る。その０． Ｉ ＮＬｌと実施例１で述べたＴＪＩ−
ｔＰ−ＦＴノンを有するＤＮＡを持つ溶涼性ファーソＰ
１−１溶菌液ｏ、ｉ ｍ’ トｆｋ合し３０分間３７°
Ｃで成層させ１０”のρ１．クリアープラーク形成粒子
を加え実施例１に示したＣ−を合成寒天培地にひろげた
。３７℃１晩培養後出現したコロニーをＬ寒天培地（Ｌ
培地に１．５チとなるように寒天を加える。）上で単一
コロニー化によって純化した。このようにして得ｆｃ、
２６ Ｆ １５０ 株のファージρ１１による隘原菌
からｔｒｐ形質導入ρ１１によって浴涼化された株ｆ：
２００μ、ｌｉｔ ／ ｒｎｅのアンスラニル酸を加え
アきノ酸を除いたＣ−１培地で３７℃１０時間培養して
その培地中のトリプトファンを、−・、速液体クロマト
グラフィーにより検定することにより２６ Ｆ １５０
株の生産するトリプトファン粛と比較して１６６倍の蓄
積を示すものとして選んだ。さらに実施例１に示した方
法によりこの賄のマイトマイシンＣ誘発佐の溶菌液にｔ
ｒｐ＋形質能が検出され、ｔｒｐ＋形ａ導入ファーソρ
、１が溶原化されていることが僅認された。
得られた本発明の７’ Ａ’ Ｐ −Ｆ’ Ｔ Ｒ全２
ケ有する８１Ｓ色体Ｄ Ｎ Ａ ｆ持つＬ −トＩＪブ
トファン生産性枯Ｊｕｌ＆ま、・ぐチルス・ズブチリス
５Ｄ−１１（２６Ｆ１５０ ＃ ４８ ）と温合された
。
ケ有する８１Ｓ色体Ｄ Ｎ Ａ ｆ持つＬ −トＩＪブ
トファン生産性枯Ｊｕｌ＆ま、・ぐチルス・ズブチリス
５Ｄ−１１（２６Ｆ１５０ ＃ ４８ ）と温合された
。
実／＆列３及び比較例１
醗酵法Ｌ −トリプトファンの！Ｌ′ｌ造。
Ｍｉｌ夾ｈ１１Ｉ抄０２でイ好られた本発明Ｌ−トリプ
トファン生産性枯草田株バチルス・ズブチリス５Ｄ−１
１（２６Ｆ１５０＋４８）、及びその親株の５ＦＴ耐性
トリプトファン生産性枯草肯株バチルス・ズブチリス２
６Ｆ１５０株の夫々を中いて、醗酵法ｂ −ト＋）ブト
ファンの製造ｆ何った。
トファン生産性枯草田株バチルス・ズブチリス５Ｄ−１
１（２６Ｆ１５０＋４８）、及びその親株の５ＦＴ耐性
トリプトファン生産性枯草肯株バチルス・ズブチリス２
６Ｆ１５０株の夫々を中いて、醗酵法ｂ −ト＋）ブト
ファンの製造ｆ何った。
実−一一一一一−４
夫々の菌株を径２．４ｃｒＩＬの試験管中のＮＢ原原料
斜面培地ュートリエント・プロス１０１／／７１゜寒天
１５＆／、／）に３７℃１晩前培養し５１Ｊツヤ−ファ
ーメンタ−中２１の合成培地（ＮαＨ，ＰＯ４・２Ｂ、
０１１．４１１／Ｉｔ、に、１ｉＰｏ、 １２．２ ｆ
ｊ／１１゜（ＮＨ＋ ）２５Ｏ４６，Ｏｙ／ ｌ、 Ｃ
ａ Ｇ ｌ ！ ０．１ ｐ ｐｍ−ＭｎＳ０４−４−
６１ｉ、０１０ ｐｐｍ、Ｆ ｇ Ｓｏ、 −ｒＨ，０
１ｐｐｒｎ、さらに微量金属塩としてＺｒｒ、ＳＯ，・
’ＩＥ、００、８８ ｇ／ ｌ、 Ｇ ｕｓ ０４・５
１１ｔＯＯ０３９９／ Ａ’ −ＣｏＳＯ，・’ＩＢ’
、ＯＯ，４８１／／Ｌ Ｎａｘ、ＭＯ，・２ Ｈ，００
，０５，９／ＩＪ、１Ｊ８ＰＯ，ｏ、 ｏ ｓ ｌ！／
ＩＩを含む溶液を５ｍノ／ｌ加える）に植−した。アン
モニア水によ１）ｐＨを６．８〜７．０に調節し磐存酸
素１ハ約’Ｉｐｐｔｎに制御した。０．Ｄ、、、ｏが３
以上となった時点で７％Ｗ ／ Ｖのアンスラニル酸溶
液を１時間あたり約１１７１１の割り合いで加え、以後
培地中にアンスラニル酸が検出されない程度に加え続け
３０時間３５℃で培養した。Ｌ−トリプトファンの培地
中のＷ＋’ 積ｔｅ！を尚速液体クロマトグラフィーで
＞ｉｉ 量１゜た結果２６ Ｆ’ １５０により９．０
１／１１．一方２６ｐ”１５０＃４８によっては１３．
’１６ｇ／１１のＬ−トリプトファンが蓄積された。
斜面培地ュートリエント・プロス１０１／／７１゜寒天
１５＆／、／）に３７℃１晩前培養し５１Ｊツヤ−ファ
ーメンタ−中２１の合成培地（ＮαＨ，ＰＯ４・２Ｂ、
０１１．４１１／Ｉｔ、に、１ｉＰｏ、 １２．２ ｆ
ｊ／１１゜（ＮＨ＋ ）２５Ｏ４６，Ｏｙ／ ｌ、 Ｃ
ａ Ｇ ｌ ！ ０．１ ｐ ｐｍ−ＭｎＳ０４−４−
６１ｉ、０１０ ｐｐｍ、Ｆ ｇ Ｓｏ、 −ｒＨ，０
１ｐｐｒｎ、さらに微量金属塩としてＺｒｒ、ＳＯ，・
’ＩＥ、００、８８ ｇ／ ｌ、 Ｇ ｕｓ ０４・５
１１ｔＯＯ０３９９／ Ａ’ −ＣｏＳＯ，・’ＩＢ’
、ＯＯ，４８１／／Ｌ Ｎａｘ、ＭＯ，・２ Ｈ，００
，０５，９／ＩＪ、１Ｊ８ＰＯ，ｏ、 ｏ ｓ ｌ！／
ＩＩを含む溶液を５ｍノ／ｌ加える）に植−した。アン
モニア水によ１）ｐＨを６．８〜７．０に調節し磐存酸
素１ハ約’Ｉｐｐｔｎに制御した。０．Ｄ、、、ｏが３
以上となった時点で７％Ｗ ／ Ｖのアンスラニル酸溶
液を１時間あたり約１１７１１の割り合いで加え、以後
培地中にアンスラニル酸が検出されない程度に加え続け
３０時間３５℃で培養した。Ｌ−トリプトファンの培地
中のＷ＋’ 積ｔｅ！を尚速液体クロマトグラフィーで
＞ｉｉ 量１゜た結果２６ Ｆ’ １５０により９．０
１／１１．一方２６ｐ”１５０＃４８によっては１３．
’１６ｇ／１１のＬ−トリプトファンが蓄積された。
実施例４
７’ １１ Ｐ −Ｆ’ Ｔ １１を少々くとも３ケ有
する染色体１）ＨＡを持っＬ −） ＩＪブトファン生
産性枯枯草。
する染色体１）ＨＡを持っＬ −） ＩＪブトファン生
産性枯枯草。
実施９ｉ１３で得た２６Ｆ’−１５０＃４Ｂ株に実施？
ｌ１１の方法によりρ１１のかわシにφ１０５ ’ｌ’
：用いて得た清涼化ファーヅφｔｅｌｌのｔｒｐ＋形質
導入ファージ５ｌ）Ｐ−１２を得た。実施例２の方法で
ρ１１のかわりにφ＋ｏｓ ｋ用いてｔｒｐ＋形質導入
ファー−／に１−１によって清涼化芒れた株を得た。こ
れらの菌株中に二柚類のｔｒｐ＋形質導入ファーヅ５Ｄ
Ｐ−１１と５ＤＰ−１２が浴涼化していることがこれら
の菌株がρ１．とφＬｏｌ＋のファージに対して抵抗性
を示す（ｉ両温ｎ１ｔｙ）ことにより確認された。
ｌ１１の方法によりρ１１のかわシにφ１０５ ’ｌ’
：用いて得た清涼化ファーヅφｔｅｌｌのｔｒｐ＋形質
導入ファージ５ｌ）Ｐ−１２を得た。実施例２の方法で
ρ１１のかわりにφ＋ｏｓ ｋ用いてｔｒｐ＋形質導入
ファー−／に１−１によって清涼化芒れた株を得た。こ
れらの菌株中に二柚類のｔｒｐ＋形質導入ファーヅ５Ｄ
Ｐ−１１と５ＤＰ−１２が浴涼化していることがこれら
の菌株がρ１．とφＬｏｌ＋のファージに対して抵抗性
を示す（ｉ両温ｎ１ｔｙ）ことにより確認された。
特許出願人 昭和電工株式会社
東京都大田区多摩川２丁目２４番
２５号昭和電工株式会社生化学研
究所内
０発 明 者 崎元和範
東京都大田区多摩川２丁目２４番
２５号昭和電工株式会社生化学研
究所内
０発 明 者 安田悦子
東京都太田区多摩川２丁目２４番
２５号昭和電工株式会社生化学研
究所内
０発 明 者 高橋薫
東京都大田区多摩川２丁目２４番
２５号昭和電工株式会社生化学研
究所内
０発 明 者 赤柴健夫
東京都大田区多摩川２丁目２４番
２５号昭和電工株式会社生化学研
究所内
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、トリプトファン合成に対するトリプトファンによる
阻害が解除されたトリプトファンオペロンを少なくとも
２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ−トリプトファン生産
性枯草菌（バチルス・ズブチリス）。 ｚ トリプトファン合成に対するトリプトファンによる
阻害が解除されたトリプトファンオペロンを少なくとも
２ケ有する染色体ＤＮＡを持つＬ−トリプトファン生産
性枯草菌（バチルス・ズブチリス）を、培地中に培養し
、形成された培養培地からＬ−トリプトファンを採取す
ることを特徴とする醗酵法り一トリプトファンの製法。 ３、該培地にアントラニルばを共存させて培養を行うこ
とを特徴とする特許請求の範囲８２項記載の製法。 ４、トリプトファン合成に対するトリプトファンによる
阻害が解除されたトリプトファンオペロンを有する染色
体ＤＮＡを持つ溶原性ファージ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57227964A JPS59125892A (ja) | 1982-12-30 | 1982-12-30 | トリプトフアンオペロン遺伝子を持つ溶原性フア−ジ、これを溶原化したトリプトフアン生産性枯草菌及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57227964A JPS59125892A (ja) | 1982-12-30 | 1982-12-30 | トリプトフアンオペロン遺伝子を持つ溶原性フア−ジ、これを溶原化したトリプトフアン生産性枯草菌及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59125892A true JPS59125892A (ja) | 1984-07-20 |
Family
ID=16869013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57227964A Pending JPS59125892A (ja) | 1982-12-30 | 1982-12-30 | トリプトフアンオペロン遺伝子を持つ溶原性フア−ジ、これを溶原化したトリプトフアン生産性枯草菌及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59125892A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6185184A (ja) * | 1984-10-04 | 1986-04-30 | Showa Denko Kk | 形質転換によるｌ−トリプトフアン生産性微生物及びｌ−トリプトフアン製造法 |
| JPS6188873A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Showa Denko Kk | 形質転換菌及びｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPS6196990A (ja) * | 1984-10-19 | 1986-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
-
1982
- 1982-12-30 JP JP57227964A patent/JPS59125892A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6185184A (ja) * | 1984-10-04 | 1986-04-30 | Showa Denko Kk | 形質転換によるｌ−トリプトフアン生産性微生物及びｌ−トリプトフアン製造法 |
| JPS6188873A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Showa Denko Kk | 形質転換菌及びｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPS6196990A (ja) * | 1984-10-19 | 1986-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
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