JPH02167084A - ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含
む染色体ＤＮＡ断片を組み込んでなる新しい組換えプラ
スミド、該プラスミドを導入して形質転換した宿主及び
該宿主よりＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する
方法に関する。

（従来の技術） ■型制限酵素はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖中のある
特定の塩基配列を認識し、これを切断する権めて特異性
の高い酵素であり、この優れた特異性により遺伝子工学
の分野で幅広く利用されている。

現在までのところ、細菌等から約１００種類の■型制限
酵素が発現され、商品化されている。ＰｖｕＩ制限エン
ドヌクレアーゼ（以下、ＰｖｕＩと略記する）も、この
■型制限酵素のひとつであり、ＤＮＡの塩基配列中のＣ
ＧＡＴＣＧを認識し、これを切断する酵素であり、プロ
テウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ
）ＡＴＣＣ１３３１５において生産されることが知られ
ている［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　３．４５２５（１９８１）］。

■型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低限
、次の４つの条件を満足する必要がある。

すなわち　１．　他の制限酵素を含まない。

２、　フォスファターゼを含まない。

３、　非特異的ＤＮａｓｅを含まない。

４．３′および５′−エキソヌクレ アーゼを含まない。

であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン
交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を組み合わせ
ることにより高純度に精製されている。本発明者らはＰ
ｖｕＩについても他の制限酵素と同様の方法を試みたが
、特にＰｖｕＩにおいては、プロテウスブルガリス（Ｐ
ｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）八ＴＣＣ１３３１５
はＰｖｕ　Ｉ以外にＣＡＧＣＴＧを認識し、これを切断
するＰｖｕ■制限エンドヌクレアーゼをも同時に生産し
、かつ他の制限酵素生産菌よりも非特異的ＤＮａｓｅを
高生産するため、これらを除くことが非常に困難であっ
た。

（発明の目的） 本発明者らは上記方法の欠点であるＰｖｕＩ及びＰｖｕ
■の同時生産と非特異的ＤＮａｓｅの高生産という二点
を解消し、ＰｖｕＩだけを生産する菌株を造成すべく鋭
意研究を行なった。その結果、前記プロテウスブルガリ
ス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）八↑ＣＣ１３
３１５からＰｖｕＩの遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を
抽出し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミド
を作成し、該プラスミドの導入により形質転換させた宿
主を得ることに成功するとともに、該宿主がＰｖｕＩの
みを生産するという事実を発見した。

本発明はこの新しい知見に基づいて完成されたものであ
る。

（発明の構成） 即ち、本発明はプロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のＰｖｕｒ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換え
プラスミド、該プラスミドで形質転換された宿主及び該
形質転換宿主を培養して、培養物がらＰｖｕ　Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼを採取することを特徴とするＩ’ｖｕ
ｌ制限エンドヌクレアーゼの製造方法である。

本発明の上記！ｆｉえプラスミド及びこれを導入した形
質転換宿主はＰＶＬＩＩのみを生産するため、その精製
工程において、Ｐｖｕ■を除去する必要がなく、非特異
的ＤＮａｓｅも少ないため、大量のＰｖｕＩを容易に製
造することが可能となった。

以下本発明につき詳細に説明する。

（ａｌ　　プラスミド及びその調製 本発明の新規プラスミドは、例えばエシエヒリア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物の染色体外遺伝
子（プラスミド）として知られるコリシンＥ１因子等の
、培養された細胞内で増殖しうる形式をとるプラスミド
に、プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａ
ｒｉｓ）由来のＰνｕｌ遺伝子、例えばプロテウスブル
ガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ
１３３１５由来のＰシロ１制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片を組み込んでなるプラスミドであり
、前記ベクターＤＮＡとしては、天然に存在するものを
抽出したものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部
分が一部欠落しているものでもよく、例えばＣｏｌ　Ｅ
ｌの系統、ｐＭＢ　ｌの系統、ｐｓｃＩｏｌの系統、Ｒ
６にの系統、ラムダ−ファージの系統等が挙げられる。

また前記ベクターＤＮＡに前記染色体ＤＮＡ断片を組み
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。

例えば、適当な制限エンドヌクレアーゼで処理して染色
体ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベ
クターＯＮ＾と混合し、リガーゼによって再結合する方
法が用いられる。

ベクターＤＮＡとして例えばｐｔ＋ｃ　１９プラスミド
を用い　これにプロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ１３３１５から調製した染
色体ＤＩＩＡ断片を組み込むことにより、新規なプラス
ミドｐＰｖｕＩＲＭ７が得られる。　ｐＰｖｕＩＲＭ７
の制限酵素地図を第１図に示す、第１図から明らかなよ
うに、このプラスミドはｐｕｃ　１９プラスミドのマル
チクローニングサイトの中の８８鵬Ｈｌサイトに、ブロ
テウスフ゛ルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉ
ｓ）＾ＴＣＣ１３３１５のＰｖｕＩ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が組み込まれた６、６にｂ
の塩基対を有する円形分子である。

（ｂ）＠生物の調製 このようにして得られた前記染色体ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡの結合物を既知の形質転換法、例えば金属イオ
ンによる菌体表面の処理により受容菌の微生物菌体中に
導入すると、所望の遺伝形質とベクターＤＮＡの形質を
併せもつ形質転換株が得られる。

受容菌としては、前記のエシェリヒア・コリ８８１０１
、同＾Ｇ−１．同５ＯＳ−１．同ＪＭ１０９．同ＸＬ−
Ｉ　Ｂ１１ｅ、同ＮＭ５２２等の通常この種の技術分野
で用いられる微生物が有利に用いられる。その典型的な
例としてエシェリヒア・３９８８１０１株が挙げられる
［モレキュラー・クローニング・エイ・ラボラトリ−・
マニュアル、（↑、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　、
＋ｌ’ｌｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ　Ｐ、５０４
（１９８２）参照；遺伝子形質Ｆ−，ｈｓｄ　ｓ２０　
（ｒｓ　、　Ｍｓ）、　ｒｅｃＡ１３．　ａｒａ−１４
１ｐｒｏＡ２＋　ＩａｃＹｌ　、　ｇａｌｋ２．　ｒｐ
ｓＬ　　２０（Ｓｓ’　　）、ｘｙｌ−５，ｍ＋１−１
．ｓｕｐ　　［４４，λ−）］。

このエシェリヒア・コＩＪＩＩＢＩＯＩ株に、前記プラ
スミドｐＰｖｕｆＲＭ７を導入して形質転換法により得
られる微生物は、新規微生物であり、エシェリヒア・コ
’Ｊ　ＩＩＢＩＯＩ（ｐＰｖｕＩＲＭ７）　［Ｂｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ（ｐＰｖｕＩＲ
Ｍ７）　］　と呼称され、昭和６３年１１月２９日付に
て工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託され、その寄
託番号１０４２０号である。このようにして得られたエ
シェリヒア・コリ）１８１０１（ρＰｖｕＩＲＭ７）の
菌学的性質をＤＮＡ受容菌であるエシェリヒア・３９８
８１０１株の性質と比較すると、前者がＰｖｕ　ｒの生
産及びアンピシリン耐性を有するのに対し、後者がこれ
らの特性を有しない点以外は全く同一である。

（Ｃ）　　制限エンドヌクレアーゼの生産工程（ｂ）で
得られた形質転換株を培養するには、特定の遺伝情報に
よって生成される物質の生産に適した培地であって且つ
宿主微生物の生育に適した培地を用い得るが、本発明方
法では、通常エシェリヒア・コリの生育培地として用い
られるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキス、食塩）、ト
リプトン・食塩培地等を基本培地として調製したものを
用いればよい。

その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。

培養方法は、ｐｉ、温度、酸素供給量等の条件として通
常のエシェリヒア属の微生物の生育に通した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい、培養温度は、通常３
０〜３７°ｃ、ｐｏ条件は、ｐ）１５〜８の範囲、特に
中性付近が適当である。

得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法、アフィニティー
クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー
法、ゲル濾過法等を組み合わせることによりＰｖｕＩを
得ることができる。

（発明の効果） 本発明のプラスミド及びこれを導入した形質転換宿主は
ＰｖｕＩだけを生産するため、その精製工程においてＰ
ｖｕ　ＩＩを除去する必要がなく、また、従来の生産菌
よりも非特異的ＤＮａｓθの生産性が低いため、その除
去が容易であり、結果的にＰｖｕＩを容易に製造するこ
とが可能となった。

（実施例） 以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、本
発明は何らこれらに限定されるものではない。

実施例１゜ （１）　　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉの遺伝子をもつ染色体ＯＮへ
の調製プロテウスフ゛ルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕ
ｌ、（ａｒｉｓ）八ＴＣＣ１３３１５をＬ−ｂｒｏｔｈ
培地［水１１当たりポリヘット２１０ｇ、酵母エキス５
　ｇ、　ＮａＣｌ３　ｇをｐＨ７，２に調製したもの］
５０ｍに接種し、３７°Ｃで振盪を行なった。

１６時間後に菌体を集めた０次に集めた菌体を１（ｌｔ
ｅのＴＥＮ　　Ｂｕｆｆｅｒ　　［１（１＋Ｍ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡｌｏ
ｍＭ　ＮａＣ［］で洗浄したのち、５ａｆのＳＥＴ　Ｂ
ｕｆｆｅｒ［２０％５ｕｃｒｏｓｅ、５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、５０＋ｍＭＥＤＴＡ　］に
懸濁し、０．５＋＋ｄ！のりゾチーム［太陽化学■製］
　ｉ８液［５１ｇ　／　ｒｄ　ＴＥＮ　Ｂｕｆｆｅｒ　
］を加えて３７°Ｃで３０分間静置した。

次に５Ｉ１１のＴＩ！Ｎ　Ｂｕｆｆｅｒと５−の２５％
ＳＯＳ溶液を加えてゆっ（り混合したのち、１ｄの５Ｍ
ＮａＣｌ溶液と１０ｍ１のＢｕｆｆｅｒ飽和フェノール
を加えて五分間混合し、６．５０Ｏｒｐｍ、　　４’Ｃ
で５分間の遠心分離を行なった。上清に１０−のクロロ
ホルム−ノルマルアミルアルコール［２４：１］溶液を
加えて５分間の遠心分離を行なった０次に上清に２倍量
の９５％エタノールを加えて、ガラス棒で混合しながら
沈殿してきた染色体ＤＮＡを巻き取ったのち、１０ｍ１
のＴＥＮ　Ｂｕｆｆｅｒに再溶解した。０．０５ｉｄの
ＲＮａｓｅ溶液［１０１１ｇ／ｄ　０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム、０．３ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ４，８）：８０°Ｃ
で１０分間熱処理］を加えて３７°Ｃで２時間静置して
、ＲＮＡを完全分解したのち、０．５ｄのプロナーゼ溶
液［２’　ｌ１１ｇ　／　ｄＴＥＮ　Ｂｕｆｆｅｒ　：
　３７°Ｃで１５分間処理］を加えて３７°Ｃで１時間
静置して残存した夾雑タンパクを完全分解した０次にＩ
Ｏｄのクロロホルム−ｎ−アミルアルコール溶液ヲ加、
ｔ　７５分間混合したのち、６，５００ｒｐ鋤、　　４
’Ｃで５分間の遠心分離を行なった。上清に２倍量の９
５％エタノールを加えて、ガラス棒で混合しながら沈殿
してきた染色体ＤＮＡを巻き取ったのち、２ｄのＴＥＮ
Ｂｕｆｆｅｒに再溶解することにより、約１００μｇの
染色体ＤＮＡを取得した。

（２）　　染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得られた染色体ＤＮＡ　１００μｇについて０．０１
ユニツトの５ａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを加え
、３７°Ｃ１時間の反応を行なうことにより、これを部
分分解した。この部分分解物をあらかじめ２０％、１５
％、１０％、５％の順に重層しておいたシュークロース
溶液に加え、２３．ＯＯＯｒｐｍ、　４°Ｃで１７時間
超遠心分離を行なった。溶液を濃度順に分画することに
より、染色体ＤＮＡを大きさの順に分けた０次にヘクタ
ーブラスミド１１ＤＣ１９［東洋紡績■製］　１８ｇに
ついて８ユニツトのＢａ糟ＨＩ制限エンドヌクレアーゼ
を加え、３７°Ｃ，１時間の反応を行なうことによりこ
れを完全分解し、さらに１ユニツトのアルカリフォスフ
ァターゼを加え、３７°Ｃ１１時間の反応を行なうこと
により、５′末端のリン酸を除去した６以上の方法によ
り得られた３〜５Ｋｂの分画の３μｇの染色体ＤＮＡ断
片と１μｇのｐｕｃ　１９のＯＮ＾断片を混合し、さら
に１鋤ＭＡＴＰおよび５ｍＭジチオスレイトールの存在
下に５ユニツトのＴ４ファージ由来のＤＮＡｌ７ガーゼ
を用いて１５°Ｃ，１６時間の連結反応を行なうことに
より染色体ＩＩＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを取
得した。

（３）　　ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
む組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コＩＪＫ−１２株とエシェリヒア・３９
８株のハイブリッド株であるエシェリヒア・１９８８１
０１株をＬＢ培地［純水ｌＮあたりトリプトン（Ｄｉｆ
ｃｏ）ｌｏｇ、酵母エキス５　ｇ　、　ＮａＣ１１０８
をｐＨ７，０に調製したもの］４０ｄに接種し、３７°
Ｃで振盪培養を行ない、対数増殖期まで生育させた後に
集菌した。これを水冷下、最終濃度０．０５Ｍ　ＣａＣ
１ｚの溶液に！４させてコンピテントな細胞とした。こ
の細物懸濁液に（２）で得たプラスミドＤＮＡの溶解液
を加えて、水冷下で６０分間反応させ、４２°Ｃ１１〜
２分間ヒートションクを与えて、前記（２）で得られた
プラスミドＤＮＡを細胞内に取り込ませた０次いでこの
細胞懸／ｉｒＩ液を別途前記ＬＢ培地に接種し、３７°
Ｃ１３〜５時間振盪培養して形質転換反応を行なった後
、アンピシリン耐性を有し、かつＰｖｕ　Ｉを生産する
株を分離し、エシェリヒア・コリＩＩＢＩＯＩ（ｐＰｖ
ｕＩＲＭ７）　（微工研寄第１０４２０号）を得た。

（４）　　エシェリヒア・コ’Ｊ　ＩＩＢＩＯＩ（ｐＰ
ｖｕＩＲＭ７）によＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの
生産（３）で得られた形質転換株エシェリヒア・コＩＪ
ＩＩＢ１０１（ｐＰｖｕＩＲＭ？）　（微工研寄第１０
４２０号）を前記ＬＢ培地５００　ｍを含む２１１容の
フラスコで、３７°Ｃ１１６時間振盪培養を行なった。

これを遠心分離して集菌、洗浄後１０ｍＭＭｇｃｌｘ、
　７　ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含んだ２０１
１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）２５ａｌｔに懸濁
し、Ｏ′Ｃで１０分間の超音波破砕を行なった。さらに
１２．０００ｒｐ−で１０分間の遠心分離により酵素抽
出液を得た。次にこの酵素抽出液に硫安粉末を水冷上添
加溶解し、３０〜８０％飽和画分を（飽和度は０ｓｂｏ
ｒｎｅ法で表示）を遠心分離により回収した。

この回収沈澱物を２ｍＭメルカプトエタノール、５％グ
リセロールを含んだ１０膳４リンＭｔ緩衝液（ｐＨ７，
５）　２　ｄに溶解し、さらに透析チヱーブに入れて、
１００倍量の同緩衝液に対して１夜透析した。

続いて同緩衝液にて平衡化したホスホセルロース（ワッ
トマン社製）のカラム（容１２０ｍ１）に吸着させた、
５倍量の同緩衝液で洗浄後０〜１．０μｌ［ＣＩグラジ
ェント溶出を行なった。ＰｖｕＥ制限エンドスクレアー
ゼはＭＣＩ？Ｉ！Ａ度０．５Ｍ付近で溶出された。

溶出した酸素液を透析チューブに入れ、２ｍＭメルカプ
トエタノール、５０％グリセロールを含んだリン酸緩衝
液に透析することにより０．２−の酵素液が得られた。

得られた酵素液の酵素活性の測定したところ１０，００
０ユニツトであった。

このようにして得られた酵素液は、他の制限エンドヌク
レアーゼ、フォスファターゼ、非特異的ＤＮａｓｅなど
を含んでおらず、遺伝子工学の分野で利用することが可
能であった。なおＰｖｕＩの活性の測定は、ｌμｇのλ
−ＯＮ＾を１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ρｔ１７．５
）　、７ｍＭ塩化マグネシウム、１５０鵬Ｈ塩化ナトリ
ウム、？　＋ｗＭ２−メルカプトエタノール、１００μ
ｇ／−牛血清アルブミンからなる反応液４５μｌに溶解
し、その混合液に５μｌの酵素液を加えて、３７°Ｃで
１時間の反応を行なった後、アガロースゲル電気泳動を
行なうことにより測定する。酵素活性における１単位は
３７”Ｃ、ＰＨ７，５において１時間に１μｇのλ−Ｄ
ＮＡを完全に分解する酵素活性をいう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の組み換えプラスミドｐｐνｕ［ＰＨ７
の制限酵素地図を示す。 特許出願人　　東洋紡績株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ
   ｇａｒｉｓ）由来のＰｖｕ I 制限エンドヌクレアーゼ
   遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラ
   スミド。
2. （２）プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ
   ｇａｒｉｓ）由来のＰｖｕ I 制限エンドヌクレアーゼ
   遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラ
   スミドで形質転換された宿主。
3. （３）プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ
   ｇａｒｉｓ）由来のＰｖｕ I 制限エンドヌクレアーゼ
   遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラ
   スミドで形質転換された宿主を培養して、該培養物から
   Ｐｖｕ I 制限エンドヌクレアーゼを採取することを特
   徴とするＰｖｕ I 制限エンドヌクレアーゼの製造方法
   。