JPH0822223B2 - ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 - Google Patents
ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法Info
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- JPH0822223B2 JPH0822223B2 JP63321317A JP32131788A JPH0822223B2 JP H0822223 B2 JPH0822223 B2 JP H0822223B2 JP 63321317 A JP63321317 A JP 63321317A JP 32131788 A JP32131788 A JP 32131788A JP H0822223 B2 JPH0822223 B2 JP H0822223B2
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- pvu
- restriction endonuclease
- restriction
- dna fragment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はPvu I制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含
む染色体DNA断片を組み込んでなる新しい組換えプラス
ミドを導入して形質転換した微生物および該微生物より
Pvu I制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関す
る。
む染色体DNA断片を組み込んでなる新しい組換えプラス
ミドを導入して形質転換した微生物および該微生物より
Pvu I制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関す
る。
（従来の技術） II型制限酵素はデオキシリボ核酸（DNA）鎖中のある
特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性
の高い酵素であり、この優れた特異性により遺伝子工学
の分野で幅広く利用されている。
特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性
の高い酵素であり、この優れた特異性により遺伝子工学
の分野で幅広く利用されている。
現在までのところ、細菌等から約100種類のII型制限
酵素が発現され、商品化されている。Pvu I制限エンド
ヌクレアーゼ（以下、Pvu Iと略記する）も、このII型
制限酵素のひとつであり、DNAの塩基配列中のCGTCGを認
識し、これを切断する酵素であり、プロテウスブルガリ
ス（Proteus vulgaris）ATCC13315において生産される
ことが知られている［Nucleic Acids Research 9,4525
（1981）］。
酵素が発現され、商品化されている。Pvu I制限エンド
ヌクレアーゼ（以下、Pvu Iと略記する）も、このII型
制限酵素のひとつであり、DNAの塩基配列中のCGTCGを認
識し、これを切断する酵素であり、プロテウスブルガリ
ス（Proteus vulgaris）ATCC13315において生産される
ことが知られている［Nucleic Acids Research 9,4525
（1981）］。
II型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低
限、次の４つの条件を満足する必要がある。
限、次の４つの条件を満足する必要がある。
すなわち 1. 他の制限酵素を含まない。
2. フォスファターゼを含まない。
3. 非特異的DNaseを含まない。
4. ３′および５′−エキソヌクレアーゼを含まない。
であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン
交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を組み合わせ
ることにより高純度に精製されている。本発明者らはPv
u Iについても他の制限酵素と同様の方法を試みたが、
特にPvu Iにおいては、プロテウスブルガリス（Proteus
vulgaris）ATCC13315はPvu I以外にCAGCTGを認識し、
これを切断するPvu II制限エンドヌクレアーズをも同時
に生産し、かつ他の制限酵素生産菌よりも非特異的DNas
eを高生産するため、これらを除くことが非常に困難で
あった。
塩析法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン
交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を組み合わせ
ることにより高純度に精製されている。本発明者らはPv
u Iについても他の制限酵素と同様の方法を試みたが、
特にPvu Iにおいては、プロテウスブルガリス（Proteus
vulgaris）ATCC13315はPvu I以外にCAGCTGを認識し、
これを切断するPvu II制限エンドヌクレアーズをも同時
に生産し、かつ他の制限酵素生産菌よりも非特異的DNas
eを高生産するため、これらを除くことが非常に困難で
あった。
（発明の目的） 本発明者らは上記方法の欠点であるPvu I及びPvu II
の同時生産と非特異的DNaseの高生産という二点を解消
し、Pvu Iだけを生産する菌株を造成すべく鋭意研究を
行なった。その結果、前記プロテウスブルガリス（Prot
eus vulgaris）ATCC13315からPvu Iの遺伝子を含む染色
体DNA断片を抽出し、これをベクターに組み込んで組換
えプラスミドを作成し、該プラスミドの導入により形質
転換させた宿主を得ることに成功するとともに、該宿主
がPvu Iのみを生産するという事実を発見した。
の同時生産と非特異的DNaseの高生産という二点を解消
し、Pvu Iだけを生産する菌株を造成すべく鋭意研究を
行なった。その結果、前記プロテウスブルガリス（Prot
eus vulgaris）ATCC13315からPvu Iの遺伝子を含む染色
体DNA断片を抽出し、これをベクターに組み込んで組換
えプラスミドを作成し、該プラスミドの導入により形質
転換させた宿主を得ることに成功するとともに、該宿主
がPvu Iのみを生産するという事実を発見した。
本発明はこの新しい知見に基づいて完成されたもので
ある。
ある。
（発明の構成） 即ち、本発明は制限酵素、Sua3AIにより切断された3.
9Kbであるプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）A
TCC13315由来の染色体DNA断片であって、Pvu I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含み、他の制限エンドヌクレア
ーゼ、フォスファターゼおよび非特異的DNase遺伝子を
含まない第１図に示されるDNA断片を組み込んだ組換え
プラスミドで形質転換された微生物および該微生物を培
養して、該培養物からPvu I制限エンドクヌレアーゼを
採取することを特徴とするPvu I制限エンドヌクレアー
ゼの製造方法である。
9Kbであるプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）A
TCC13315由来の染色体DNA断片であって、Pvu I制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を含み、他の制限エンドヌクレア
ーゼ、フォスファターゼおよび非特異的DNase遺伝子を
含まない第１図に示されるDNA断片を組み込んだ組換え
プラスミドで形質転換された微生物および該微生物を培
養して、該培養物からPvu I制限エンドクヌレアーゼを
採取することを特徴とするPvu I制限エンドヌクレアー
ゼの製造方法である。
本発明の上記組換えプラスミド及びこれを導入した形
質転換宿主はPvu Iのみを生産するため、その精製工程
において、Pvu IIを除去する必要がなく、非特異的DNas
eも少ないため、大量のPvu Iを容易に製造することが可
能となった。
質転換宿主はPvu Iのみを生産するため、その精製工程
において、Pvu IIを除去する必要がなく、非特異的DNas
eも少ないため、大量のPvu Iを容易に製造することが可
能となった。
以下本発明につき詳細に説明する。
（ａ） プラスミド及びその調製 本発明の新規プラスミドは、例えばエンシェヒリア
（Escherichia）属に属する微生物の染色体外遺伝子
（プラスミド）として知られるコリシンE1因子等の、培
養された細胞内で増殖しうる形式をとるプラスミドに、
プロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）由来のPvu
I遺伝子、例えばプロテウスブルガリス（Proteus vulga
ris）ATCC13315由来のPvu I制限エンドヌクレアーズ遺
伝子を含むDNA断片を組み込んでなるプラスミドであ
り、前記ベクターDNAとしては、天然に存在するものを
抽出したものの他、増殖に必須な部分以外のDNAの部分
が一部欠落しているものでもよく、例えばCol E1の系
統、pMBlの系統、pSClolの系統、R6Kの系統、ラムダー
ファージの系統等が挙げられる。
（Escherichia）属に属する微生物の染色体外遺伝子
（プラスミド）として知られるコリシンE1因子等の、培
養された細胞内で増殖しうる形式をとるプラスミドに、
プロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）由来のPvu
I遺伝子、例えばプロテウスブルガリス（Proteus vulga
ris）ATCC13315由来のPvu I制限エンドヌクレアーズ遺
伝子を含むDNA断片を組み込んでなるプラスミドであ
り、前記ベクターDNAとしては、天然に存在するものを
抽出したものの他、増殖に必須な部分以外のDNAの部分
が一部欠落しているものでもよく、例えばCol E1の系
統、pMBlの系統、pSClolの系統、R6Kの系統、ラムダー
ファージの系統等が挙げられる。
また前記ベクターDNAに前記染色体DNA断片を組み込む
方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適
当な制限エンドヌクレアーゼで処理して染色体DNAを特
定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと
混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。
方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば、適
当な制限エンドヌクレアーゼで処理して染色体DNAを特
定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと
混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。
ベクターDNAとして例えばpUC19プラスミドを用い、こ
れにプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）ATCC13
315から調製した染色体DNA断片を組み込むことにより、
新規なプラスミドpPvuIRM7が得られる。pPvuIRM7の制限
酵素地図を第１図に示す。第１図から明らかなように、
このプラスミドはpUC19プラスミドのマルチクローニン
グサイトの中のBamHIサイトに、プロテウスブルガリス
（Proteus vulgaris）ATCC13315のPvu I制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた6.6Kbの塩
基対を有する円形分子である。
れにプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）ATCC13
315から調製した染色体DNA断片を組み込むことにより、
新規なプラスミドpPvuIRM7が得られる。pPvuIRM7の制限
酵素地図を第１図に示す。第１図から明らかなように、
このプラスミドはpUC19プラスミドのマルチクローニン
グサイトの中のBamHIサイトに、プロテウスブルガリス
（Proteus vulgaris）ATCC13315のPvu I制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子を含むDNA断片が組み込まれた6.6Kbの塩
基対を有する円形分子である。
pUC19プラスミド中のBamHI断片の大きさは、2.7Kbで
あり、上記Pvu I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むD
NA断片の大きさは、3.9Kbである。
あり、上記Pvu I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むD
NA断片の大きさは、3.9Kbである。
（ｂ） 微生物の調製 このようにして得られた前記染色体DNA断片とベクタ
ーDNAの結合物を既知の形質転換法、例えば金属イオン
による菌体表面の処理により受容菌の微生物菌体中に導
入すると、所望の遺伝形質とベクターDNAの形質を併せ
もつ形質転換株が得られる。
ーDNAの結合物を既知の形質転換法、例えば金属イオン
による菌体表面の処理により受容菌の微生物菌体中に導
入すると、所望の遺伝形質とベクターDNAの形質を併せ
もつ形質転換株が得られる。
受容菌としては、前記のエシエリヒア・コリHB101,同
AG−1,同SCS−1,同JM109,同XL−1 Blie,同NM522等の通
常この種の技術分野で用いられる微生物が有利に用いら
れる。その典型的な例としてエシエリヒア・コリHB101
株が挙げられる［モレキュラー・クローニング・エイ・
ラボラトリー・マニュアル、（T.Maniatis et al.,Mole
cular Cloning P.504（1982）参照；遺伝子形質F-,hsd
s20（rs,Ms）,recA13,ara−14,proA2,lacY1,galk2,rpsL
20（Sm′）,xy1−5,m＋ｌ−1,sup E44,λ−）］。
AG−1,同SCS−1,同JM109,同XL−1 Blie,同NM522等の通
常この種の技術分野で用いられる微生物が有利に用いら
れる。その典型的な例としてエシエリヒア・コリHB101
株が挙げられる［モレキュラー・クローニング・エイ・
ラボラトリー・マニュアル、（T.Maniatis et al.,Mole
cular Cloning P.504（1982）参照；遺伝子形質F-,hsd
s20（rs,Ms）,recA13,ara−14,proA2,lacY1,galk2,rpsL
20（Sm′）,xy1−5,m＋ｌ−1,sup E44,λ−）］。
このエシエリヒア・コリHB101株に、前記プラスミドp
PvuIRM7を導入して形質転換法により得られる微生物
は、新規微生物であり、エシエリヒア・コリHB101（pPv
uIRM7）［Escherichia coli HB101（pPvuIRM7）］と呼
称され、昭和63年11月29日付にて工業技術院微生物工業
技術研究所へ寄託され、その寄託番号10420号である。
このようにして得られたエシエリヒア・コリHB101（pPv
uIRM7）の菌学的性質をDNA受容菌であるエシエリヒア・
コリHB101株の性質と比較すると、前者がPvu Iの生産及
びアンピシリン耐性を有するのに対し、後者がこれらの
特性を有しない点以外は全く同一である。
PvuIRM7を導入して形質転換法により得られる微生物
は、新規微生物であり、エシエリヒア・コリHB101（pPv
uIRM7）［Escherichia coli HB101（pPvuIRM7）］と呼
称され、昭和63年11月29日付にて工業技術院微生物工業
技術研究所へ寄託され、その寄託番号10420号である。
このようにして得られたエシエリヒア・コリHB101（pPv
uIRM7）の菌学的性質をDNA受容菌であるエシエリヒア・
コリHB101株の性質と比較すると、前者がPvu Iの生産及
びアンピシリン耐性を有するのに対し、後者がこれらの
特性を有しない点以外は全く同一である。
（ｃ） 制限エンドヌクレアーゼの生産 工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、特
定の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培
地であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得
るが、本発明方法では、通常エシエリヒア・コリの生育
培地として用いられるLB培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、トリプトン・食塩培地等を基本培地として
調製したものを用いればよい。
定の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培
地であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得
るが、本発明方法では、通常エシエリヒア・コリの生育
培地として用いられるLB培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、トリプトン・食塩培地等を基本培地として
調製したものを用いればよい。
その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にアミノ
酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は、pH、温度、酸素供給量等の条件として通
常のエシエリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常30
〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、特に中性付近が適
当である。
常のエシエリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常30
〜37℃、pH条件は、pH5〜８の範囲、特に中性付近が適
当である。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等
により抽出し、次いで除核酸法、塩析法、アフィニティ
ークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィ
ー法、ゲル濾過法等を組み合わせることによりPvu Iを
得ることができる。
により抽出し、次いで除核酸法、塩析法、アフィニティ
ークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィ
ー法、ゲル濾過法等を組み合わせることによりPvu Iを
得ることができる。
（発明の効果） 本発明のプラスミド及びこれを導入した形質転換宿主
はPvu Iだけを生産するため、その精製工程においてPvu
IIを除去する必要がなく、また、従来の生産菌よりも
非特異的DNaseの生産性が低いため、その除去が容易で
あり、結果的にPvu Iを容易に製造することが可能とな
った。
はPvu Iだけを生産するため、その精製工程においてPvu
IIを除去する必要がなく、また、従来の生産菌よりも
非特異的DNaseの生産性が低いため、その除去が容易で
あり、結果的にPvu Iを容易に製造することが可能とな
った。
（実施例） 以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例1. （１） Pvu Iの遺伝子をもつ染色体DNAの調製 プロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）ATCC1331
5をＬ−broth培地［水１当たりポリペプトン10g、酵
母エキス5g、NaCl5gをpH7.2に調製したもの］50mlに接
種し、37℃で振盪を行なった。16時間後に菌体を集め
た。次に集めた菌体を10mlのTEN Buffer［10mM Tris−H
Cl（pH7.6）,1mM EDTA,10mM Nacl］で洗浄したのち、5m
lのSET Beffer［20％sucrose,50mM Tris−HCl（pH7.
6）,50mM EDTA］に懸濁し、0.5mlのリゾチーム［太陽化
学（株）製］溶液［5mg/ml TEN Buffer］を加えて37℃
で30分間静置した。
5をＬ−broth培地［水１当たりポリペプトン10g、酵
母エキス5g、NaCl5gをpH7.2に調製したもの］50mlに接
種し、37℃で振盪を行なった。16時間後に菌体を集め
た。次に集めた菌体を10mlのTEN Buffer［10mM Tris−H
Cl（pH7.6）,1mM EDTA,10mM Nacl］で洗浄したのち、5m
lのSET Beffer［20％sucrose,50mM Tris−HCl（pH7.
6）,50mM EDTA］に懸濁し、0.5mlのリゾチーム［太陽化
学（株）製］溶液［5mg/ml TEN Buffer］を加えて37℃
で30分間静置した。
次に5mlのTEN Bufferと5mlの25％SDS溶液を加えてゆ
っくり混合したのち、1mlの5M NaCl溶液と10mlのBuffer
飽和フェノールを加えて五分間混合し、6,500rpm,4℃で
５分間の遠心分離を行なった。上清に10mlのクロロホル
ム−ノルマルアミルアルコール［24:1］溶液を加えて５
分間の遠心分離を行なった。次に上清に２倍量の95％エ
タノールを加えて、ガラス棒で混合しながら沈殿してき
た染色体DNAを巻き取ったのち、10mlのTEN Bufferに再
溶解した。0.05mlのRNase溶液［10mg/ml0.1M酢酸ナトリ
ウム、0.3mM EDTA（pH4.8）:80℃で10分間熱処理］を加
えて37℃で２時間静置して、RNAを完全分解したのち、
0.5mlのプロナーゼ溶液［2mg/ml TEN Buffer:37℃で15
分間処理］を加えて37℃で１時間静置して残存した夾雑
タンパクを完全分解した。次に10mlのクロロホルム−ｎ
−アミルアルコール溶液を加えて５分間混合したのち、
6,500rpm,4℃で５分間の遠心分離を行なった。上清に２
倍量の95％エタノールを加えて、ガラス棒で混合しなが
ら沈殿してきた染色体DNAを巻き取ったのち、2mlのTEN
Bufferに再溶解することにより、約00μｇの染色体DNA
を取得した。
っくり混合したのち、1mlの5M NaCl溶液と10mlのBuffer
飽和フェノールを加えて五分間混合し、6,500rpm,4℃で
５分間の遠心分離を行なった。上清に10mlのクロロホル
ム−ノルマルアミルアルコール［24:1］溶液を加えて５
分間の遠心分離を行なった。次に上清に２倍量の95％エ
タノールを加えて、ガラス棒で混合しながら沈殿してき
た染色体DNAを巻き取ったのち、10mlのTEN Bufferに再
溶解した。0.05mlのRNase溶液［10mg/ml0.1M酢酸ナトリ
ウム、0.3mM EDTA（pH4.8）:80℃で10分間熱処理］を加
えて37℃で２時間静置して、RNAを完全分解したのち、
0.5mlのプロナーゼ溶液［2mg/ml TEN Buffer:37℃で15
分間処理］を加えて37℃で１時間静置して残存した夾雑
タンパクを完全分解した。次に10mlのクロロホルム−ｎ
−アミルアルコール溶液を加えて５分間混合したのち、
6,500rpm,4℃で５分間の遠心分離を行なった。上清に２
倍量の95％エタノールを加えて、ガラス棒で混合しなが
ら沈殿してきた染色体DNAを巻き取ったのち、2mlのTEN
Bufferに再溶解することにより、約00μｇの染色体DNA
を取得した。
（２） 染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られた染色体DNA100μｇについて0.01ユニ
ットのSau3AI制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃１時
間の反応を行なうことにより、これを部分分解した。こ
の部分分解物をあらかじめ20％、15％、10％、５％の順
に重層しておいたシュークロース溶液に加え、23,000rp
m,4℃で17時間超遠心分離を行なった。溶液を濃度順に
分画することにより、染色体DNAを大きさの順に分け
た。次にベクタープラスミドpUC19［東洋紡績（株）
製］１μｇについて８ユニットのBamHI制限エンドヌク
レアーゼを加え、37℃、１時間の反応を行なうことによ
りこれを完全分解し、さらに１ユニットのアルカリフォ
スファターゼを加え、37℃、１時間の反応を行なうこと
により、５′末端のリン酸を除去した。以上の方法によ
り得られた３〜5Kbの分画の３μｍの染色体DNA断片と１
μｇのpUC19のDNA断片を混合し、さらに1mMATPおよび5m
Mジチオスレイトールの存在下に５ユニットのT4ファー
ジ由来のDNAリガーゼを用いて15℃、16時間の連結反応
を行なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドD
NAを取得した。
ットのSau3AI制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃１時
間の反応を行なうことにより、これを部分分解した。こ
の部分分解物をあらかじめ20％、15％、10％、５％の順
に重層しておいたシュークロース溶液に加え、23,000rp
m,4℃で17時間超遠心分離を行なった。溶液を濃度順に
分画することにより、染色体DNAを大きさの順に分け
た。次にベクタープラスミドpUC19［東洋紡績（株）
製］１μｇについて８ユニットのBamHI制限エンドヌク
レアーゼを加え、37℃、１時間の反応を行なうことによ
りこれを完全分解し、さらに１ユニットのアルカリフォ
スファターゼを加え、37℃、１時間の反応を行なうこと
により、５′末端のリン酸を除去した。以上の方法によ
り得られた３〜5Kbの分画の３μｍの染色体DNA断片と１
μｇのpUC19のDNA断片を混合し、さらに1mMATPおよび5m
Mジチオスレイトールの存在下に５ユニットのT4ファー
ジ由来のDNAリガーゼを用いて15℃、16時間の連結反応
を行なうことにより染色体DNAを組み込んだプラスミドD
NAを取得した。
（３） Pvu I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む組
換えプラスミドによる形質転換 イシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒア・コリＢ
株のハイブリッド株であるエシエリヒア・コリHB101株
をLB培地［純水１あたりトリプトン（Difco）10g、酵
母エキス5g、NaCl10gをpH7.0に調製したもの］40mlに接
種し、37℃で振盪培養を行ない、対数増殖期まで生育さ
せた後に集菌した。これを水冷下、最終濃度0.05M CaCl
2の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。この
細胞懸濁液に（２）で得たプラスミドDNAの溶解液を加
えて、水冷下で60分間反応させ、42℃、１〜２分間ヒー
トショックを与えて、前記（２）で得られたプラスミド
DNAを細胞内に取り込ませた。次いでこの細胞懸濁液を
別途前記LB培地に接種し、37℃、３〜５時間振盪培養し
て形質転換反応を行なった後、アンピシリン耐性を有
し、かつPvu Iを生産する株を分離し、エシエリヒア・
コリHB101（pPvuIRM7）（微工研菌寄第10420号）を得
た。
換えプラスミドによる形質転換 イシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒア・コリＢ
株のハイブリッド株であるエシエリヒア・コリHB101株
をLB培地［純水１あたりトリプトン（Difco）10g、酵
母エキス5g、NaCl10gをpH7.0に調製したもの］40mlに接
種し、37℃で振盪培養を行ない、対数増殖期まで生育さ
せた後に集菌した。これを水冷下、最終濃度0.05M CaCl
2の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。この
細胞懸濁液に（２）で得たプラスミドDNAの溶解液を加
えて、水冷下で60分間反応させ、42℃、１〜２分間ヒー
トショックを与えて、前記（２）で得られたプラスミド
DNAを細胞内に取り込ませた。次いでこの細胞懸濁液を
別途前記LB培地に接種し、37℃、３〜５時間振盪培養し
て形質転換反応を行なった後、アンピシリン耐性を有
し、かつPvu Iを生産する株を分離し、エシエリヒア・
コリHB101（pPvuIRM7）（微工研菌寄第10420号）を得
た。
（４） エシエリヒア・コリHB101（pPvuIRM7）によPvu
I制限エンドヌクレアーゼの生産 （３）で得られた形質転換株エシエリヒア・コリHB10
1（pPvuIRM7）（微工研菌寄第10420号）を前記LB培地50
0mlを含む２容のフラスコで、37℃、16時間振盪培養
を行なった。これを遠心分離して集菌、洗浄後10mMMgCl
2,7mM2−メルカプトエタノールを含んだ20mMトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間の超音波
破砕を行なった。さらに12,000rpmで10分間の遠心分離
により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出液に硫安粉
末を氷冷下添加溶解し、30〜80％飽和画分を（飽和度は
Osborne法で表示）を遠心分離により回収した。
I制限エンドヌクレアーゼの生産 （３）で得られた形質転換株エシエリヒア・コリHB10
1（pPvuIRM7）（微工研菌寄第10420号）を前記LB培地50
0mlを含む２容のフラスコで、37℃、16時間振盪培養
を行なった。これを遠心分離して集菌、洗浄後10mMMgCl
2,7mM2−メルカプトエタノールを含んだ20mMトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）25mlに懸濁し、０℃で10分間の超音波
破砕を行なった。さらに12,000rpmで10分間の遠心分離
により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出液に硫安粉
末を氷冷下添加溶解し、30〜80％飽和画分を（飽和度は
Osborne法で表示）を遠心分離により回収した。
この回収沈澱物を2mMメルカプトエタノール、５％グ
リセロールを含んだ10mMリン酸緩衝液（pH7.5）2mlに溶
解し、さらに透析チューブに入れて、100倍量の同緩衝
液に対して１夜透析した。続いて同緩衝液にて平衡化し
たホスホセルロース（ワットマン社製）のカラム（容量
20ml）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後０〜1.
0MKClグラジエント溶出を行なった。Pvu I制限エンドス
クレアーゼはKCl濃度0.5M付近で溶出された。溶出した
酸素液を透析チューブに入れ、2mMメルカプトエタノー
ル、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析する
ことにより0.2mlの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性の測定したところ10,000ユニットであった。
リセロールを含んだ10mMリン酸緩衝液（pH7.5）2mlに溶
解し、さらに透析チューブに入れて、100倍量の同緩衝
液に対して１夜透析した。続いて同緩衝液にて平衡化し
たホスホセルロース（ワットマン社製）のカラム（容量
20ml）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後０〜1.
0MKClグラジエント溶出を行なった。Pvu I制限エンドス
クレアーゼはKCl濃度0.5M付近で溶出された。溶出した
酸素液を透析チューブに入れ、2mMメルカプトエタノー
ル、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析する
ことにより0.2mlの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性の測定したところ10,000ユニットであった。
このようにして得られた酵素液は、他の制限エンドヌ
クレアーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを
含んでおらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能
であった。なおPvu Iの活性の測定は、１μｇのλ−DNA
を10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、7mM塩化マグネシウ
ム、150mM塩化ナトリウム、7mM2−メルカプトエタノー
ル、100μg/ml牛血清アルブミンからなる反応液45μ
に溶解し、その混合液に５μの酵素液を加えて、37℃
で１時間の反応を行なった後、アガロースゲル電気泳動
を行なうことにより測定する。酵素活性における１単位
は37℃、pH7.5において１時間に１μｇのλ−DNAを完全
に分解する酵素活性をいう。
クレアーゼ、フォスファターゼ、非特異的DNaseなどを
含んでおらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能
であった。なおPvu Iの活性の測定は、１μｇのλ−DNA
を10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、7mM塩化マグネシウ
ム、150mM塩化ナトリウム、7mM2−メルカプトエタノー
ル、100μg/ml牛血清アルブミンからなる反応液45μ
に溶解し、その混合液に５μの酵素液を加えて、37℃
で１時間の反応を行なった後、アガロースゲル電気泳動
を行なうことにより測定する。酵素活性における１単位
は37℃、pH7.5において１時間に１μｇのλ−DNAを完全
に分解する酵素活性をいう。
第１図は本発明の組み換えプラスミドpPvuIRM7の制限酵
素地図を示す。
素地図を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:37） Ｃ１２Ｒ 1:37）
Claims (2)
- 【請求項１】制限酵素、Sau3AIにより切断された3.9Kb
であるプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）ATCC
13315由来の染色体DNA断片であって、Pvu I制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含み、他の制限エンドヌクレアー
ゼ、フォスファターゼおよび非特異的DNase遺伝子を含
まない、下記に示されるDNA断片を組み込んだ組換えプ
ラスミドで形質転換された微生物。 - 【請求項２】制限酵素、Sau3AIにより切断された3.9Kb
であるプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）ATCC
13315由来の染色体DNA断片であって、Pvu I制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含み、他の制限エンドヌクレアー
ゼ、フォスファターゼおよび非特異的DNase遺伝子を含
まない、下記に示されるDNA断片を組み込んだ組換えプ
ラスミドで形質転換された微生物を培養し、該培養物か
らPvu I制限エンドヌクレアーゼを採取することを特徴
とするPvu I制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63321317A JPH0822223B2 (ja) | 1988-12-19 | 1988-12-19 | ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
| US07/451,201 US5049501A (en) | 1988-12-19 | 1989-12-14 | Production method for PvuI restriction endonuclease |
| DE68914620T DE68914620T2 (de) | 1988-12-19 | 1989-12-15 | Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonucklease PvuI. |
| EP89123299A EP0374771B1 (en) | 1988-12-19 | 1989-12-15 | Production method for PvuI restriction endonuclease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63321317A JPH0822223B2 (ja) | 1988-12-19 | 1988-12-19 | ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02167084A JPH02167084A (ja) | 1990-06-27 |
| JPH0822223B2 true JPH0822223B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=18131236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63321317A Expired - Fee Related JPH0822223B2 (ja) | 1988-12-19 | 1988-12-19 | ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5049501A (ja) |
| EP (1) | EP0374771B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0822223B2 (ja) |
| DE (1) | DE68914620T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| WO1994025567A1 (en) * | 1993-04-23 | 1994-11-10 | American Cyanamid Company | CLONING AND EXPRESSION OF THE CHONDROITINASE I AND II GENES FROM $i(P. VULGARIS) |
| US5716617A (en) * | 1994-04-22 | 1998-02-10 | American Cyanamid Company | Compositions of proteus vulgaris chondroitinase I and chondroitinase II |
| US5888798A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | American Cyanamid Company | Chondroitinase I and chondroitinase II producing mutants of P. vulgaris |
| DE112011105840B3 (de) * | 2010-02-05 | 2018-07-12 | New England Biolabs, Inc. | Restriktionsendonukleasen mit hoher Genauigkeit |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| SU1294824A1 (ru) * | 1985-05-06 | 1987-03-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | Рекомбинантна плазмида @ 5 @ ,способ ее конструировани и штамм @ . @ @ 600 @ 5 @ -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы @ п |
-
1988
- 1988-12-19 JP JP63321317A patent/JPH0822223B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-12-14 US US07/451,201 patent/US5049501A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-15 EP EP89123299A patent/EP0374771B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-15 DE DE68914620T patent/DE68914620T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68914620D1 (de) | 1994-05-19 |
| JPH02167084A (ja) | 1990-06-27 |
| EP0374771A1 (en) | 1990-06-27 |
| EP0374771B1 (en) | 1994-04-13 |
| DE68914620T2 (de) | 1994-10-06 |
| US5049501A (en) | 1991-09-17 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |