JPH06501379A - 新規なクローニング及び／又は発現ベクター、それらの製造方法及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なりローニング及び／又は発現ベクター、それらの製造方法及びそれらの使 用 本発明は、グラム陰性菌における広い宿主範囲を持った新規なりローニング及び ／又は発現ベクターに関する。本発明は、特に、組換え体タンパク質又は代謝物 の製造又は生物的転換反応におけるこれらのベクターの使用及びこのようなベク ターを含む宿主細胞にも関する。

分子生物学の最近の進歩は、広い宿主範囲を持った、遺伝子工学的方法において 使用することができる新規なベクターの開発をもたらした。

これらのベクターは、分類学的観点から、それらが複製を行う宿主の遍在的性質 の点で、Ｃｏ１Ｅ１のような狭い宿主特異性を持ったベクターとは対照的である 。この性質は、殆どすべてのグラム陰性菌において複製するいくらかのプラスミ ドの場合に非常に顕著である。このようなプラスミドは、必要な構築物を作るた めに大腸菌（Ｅｓ　ｃｈｅ　ｒ　ｉ　ａｈ　ｉａ　ｃｏｌｉ）のようなバクテリ ア内で使用することができ、次いで選ばれたグラム陰性宿主に直接導入すること ができるという独特な特徴を有する。これらのベクターの他の特徴は、供与国か ら受容菌に接合性伝達（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）のために 可動性である（ｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｓ　ｉｎｇ）か又は可動化される（ｍｏｂ ｉ　Ｉ　ｉ　５ｅｄ）というそれらの持っている性質にある。これらの接合伝達 （ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）は、一般に非常に高い頻度で（ １乃至１０−”）起こり、公知の形質転換系よりは相当に高い頻度である。

文献に記載されたグラム陰性菌における広い宿主範囲を持ったプラスミドは、不 和合性グループＣ，Ｎ、Ｐ、Ｑ及びＷ（ｉｎｃＣ，１ｎｃＮ。

１ｎｃＰ、１ｎｃＱ及び１ｎｃＷ）に属する。これらの中でも、不和合性グルー プのプラスミドＰ及びＱは、最も満足に研究されたプラスミドでありそしてそれ の多数の誘導体が構築されているプラスミドである［シュミドホイザ−（Ｓｃｈ ｍｉｄｈａｕｓｅｒ）等、１９８８］、それらは、殆ど専属的に使用されるもの でもある。これに関して、これらのプラスミドはミキソコッカス・キサンタス（ ＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓＸａｎｔｈｕｓ）、ブラジルヒゾビウム・ジャポニクム（ Ｂｒａｄｙｒｈｊｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）及びバクテロイデス（Ｂ ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属を除いては研究されたすべてのグラム陰性菌において 複製することが記載されている［キュエズ及びスタール（Ｋｕｓ　ａｎｄ　５ｔ ａｈｌ）、１９８９］、不和合性グループＷのプラスミドは、あまり重要にでは なく　（ｍａｒｇｉｎａｌ　ｌｙ）使用されている。その理由は、１つには、そ れらは不和合性グループＰ及びＱのプラスミドより利点が少ないことと、もう１ つは、それらがあまり知られていないからである。

不和合性グループＰは、サブグループ、１ｎｃＰα及び１ｎｃＰβに分けられ、 最も集中的に研究されたプラスミドはＲＫ２、ＲＰ４　（実際は、同じプラスミ ドの２つの独立の単離物である）及びＲ７５１である。

これらのプラスミドは、自己接合性である（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ）であるとい特徴を持っている、即ち、それらは接合機能（ｔｒａ及びｍｏｂ） を持っている。更に、それらは大きい（ＲＫ２はサイズが６０ｋｂである）、低 いコピー数の（ＲＫ２は大腸菌内で４乃至７のコピー数を持っている）プラスミ ドである。

これらのプラスミドの複製は、キュニス及びスタールにより詳細に研究されてい る。かくして複製起点ｏｒｉＶは、（ｉ）８１７−ｂｐ上セグメント（ｉ　ｉ） 大腸菌のＤｎａＡタンパク質のための結合部位により取り囲まれた推定上のプロ モーター及び大腸菌のＩＨＦタンパク質のための推定上の結合部位、（ｉ　ｉ　 １）ＤｎａＡタンパク質のための結合部位の前にある９−ｂｐのＡＴに富んだ配 列及び次いで（ｉｖ）ＧＣに富んだ領域から成ることが知られている。同じフレ ームによりコードされているが異なるコドンで開始される２つのタンパク質Ａ１ 及びＡ２に翻訳されるｔｒｆＡ遺伝子と関連した複製起点は、ＲＫ２と同じ広範 に出現するレプリコンを構成する。宿主に依存して、Ａ２が複製のために必要と 思われるか又はＡ１及びＡ２の両方共必須である（トーツス、１９８６）。これ らのプラスミドの複製は、ｋｉｌ及びｋｏｒ遺伝子が関係している複雑な調節ネ ットワークにより制御される。　［ｋｉｌ−オーバーライド（ｋｉｌ−ｏｖｅｒ ｒｉｄｅ）］遺伝子のためのｋｏｒは、ｋｉｌ遺伝子（ｋｉ　ＩＡＳｋｔ　ＩＢ 、ｋｉ　ＩＣ及びｋｉｌＤ）の致死効果に拮抗し、モしてｔｒｆＡの発現を負の 制御をする（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ）ｏ　５つのｋｏｒ遺伝 子が同定された（ｋ。

ｒＡＳｋｏｒＢ、ｋｏｒＣ，ｋｏｒＥ及びｋｏｒＦ）ｏそれら自体の中でも及び ｔｒｆＡに関するこれらの遺伝子の調節のネットワークは、ＲＫ２レプリコンが 宿主中で複製するその宿主へのＲＫ２レプリコンの適応を許容するものと認めら れる（キュエす及びスタール）。シュミットホイザー及びヘリンスキー（１９８ ５）は、これらの遺伝子の一部の欠失は、いくらかの宿主においてはより低い分 離安定性（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ）をもたらすことも示 した。

この故に、ＲＫ２又はＰＫ４誘導体の最善の可能な安定性を観察するためには、 すべてのこれらの遺伝子が必要であることは明らかである。

いくつかのＲＫ２誘導体が多重宿主ベクターとして構築された。それらは、最初 のベクターのテトラサイクリン耐性遺伝子を保持しているプラスミドである。と いうのはこの遺伝子が複製起点（（＋ｒｉＶ）の近くに位置しているからである 。問題のプラスミドは、例えば、ｐＲＫ２９０、ｐＲＫ４０４及びｐＲＫ４１５ （ディツタ等、１９８０及び１９８５、キーン等、１９８８、シュミットホイザ ー等、１９８８）である。

これらのなかでも、プラスミドｐＲＫ２９０　（ディツタ等、１９８０）はより 詳しく述べられるが、このプラスミドは、多数のグラム陰性菌中での大きい安定 性という特性を示す（シュミットホイザー及びヘリンスキー、１９８５）。この プラスミドは、大腸菌、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュード モナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａＬ　リゾビウム・メリ ロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｔｉｌｏｔｉ）及びロドシュードモナス・スフェ ロイデス（Ｒｈ。

ｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）内で安定に保持される 。しかしながら、他のグラム陰性菌においては、この同じプラスミドが安定であ るとは言えない。これは、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（、Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アゾトバクター（Ａｃｅｔｉ ｎｏｂａｃｔｅｒ）、カラロバフタ−（Ｃａｕｒｏｂａｃｔｅｒ）及びシュード モナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）にあ てはまる（シュミットホイザー及びヘリンスキー、１９８５）。プラスミドｐＲ Ｋ２９０は、サイズが２０ｋｂであり、これはクローニングベクターとしては大 きい。それは、ＲＫ２から出発して一連の引き続く欠失により得られた。伝達機 能（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）（ｔｒａ遺伝子）、カナマイシン 耐性遺伝子及びトランスポゾンＴｎｌの他に、これらの欠失は、ｋｉｌＡ及びｋ ｉｌｃ及びｋｉｌＥ機能を除去した（シュミットホイザー及びヘリンスキー、１ ９８５）。この故に、い（らかのｋｉｌ及びｋｏｒ機能の損失にもかかわらず、 ＲＫ２誘導体における成る程度の安定性を観察することが可能であると思われる 。しかしながら、ただｋｉｌＢ機能を損失しただけで、それ自体いくつかのグラ ム陰性菌においてプラスミドの安定性の顕著な減少を示したこと及びサイズがｐ ＲＫ２９０よりも小さいものであった、試験されたすべてのＲＫ２誘導体は顕著 に安定性が低かったことが観察された（シュミ・ットホイザー及びヘリンスキー 、１９８５）。

ｔｒｆＡの発現の調節系に含まれたＲＫ２の異なる決定基のそれぞれの重要性を 明らかにした研究の他に、これらのプラスミドの分離安定性の原因となっている 可能性のあるフラグメントが見いだされた〔サオラガー（Ｓａｕｒｕｇｅｒ）等 、１９８６］　、ｔ　ｒａ２領域とカナマイシン耐性遺伝子との間に位置したこ のフラグメントは、分配系（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）（ｐａｒ）を コードしている。このフラグメントは大腸菌中でプラスミドｐＢＲ３２２及びｐ ＡｃＹｃ１７７を安定化させることができることが示された（サオラガー等、１ ９８６）。

不和合性グループＱの天然プラスミドに関して、例えば、Ｒ３ＦＩＯ１０、Ｒ１ １６２及びＲ３００Ｂを挙げることができる。これらのプラスミドは、微生物に 依存して、１０乃至６０のコピー数を持っている。

これらのプラスミドのサイズは、不和合性グループＰのプラスミドのすイズより はるかに小さく、事実上、それは１０ｋｂより小さい。

２つのサブ領域、（ｉ）ＡＴに富んだ４０ｂｐ、ＧＣに富んだ６０ｂｐ及び大腸 菌のＤｎａＡタンパク質に結合するための推定上のボックスの３．５反復配列か ら成る領域、及び（１１）他方、４０乃至５０ｂｐのステムを持った二次構造を 形成することができる逆方向反復配列を持った領域、を含んで成るこれらのプラ スミドの複製のためにシス（ｃｉＳ）における必要な領域がある。ＲＳＦＩＯＩ Ｏの複製の開始には、該プラスミドによりコードされた３種のタンパク質：　ｒ ｅｐＡ、ｒｅｐＢ及びｒｅｐＣ遺伝子によりコードされたＲｅｐＡＳＲｅｐＢ及 びＲｅｐＣの存在を必要とする。ＲｅｐＣは、複製起点（上記反復配列における ）を認識しそして複製の開始を正の調節をする。ＲｅｐＡは、ヘリカーゼ活性を 宵しており、ＲｅｐＢ及びＲｅｐＢ＊　（同じフレームによりコードされている が、各々異なるコドンで開始される２つのタンパク質に相当する）は、試験管内 でＲ５ＦＩＯＩＯ特異的プライマーゼ活性を有している。ＲＳＦＩＯＩＯの複製 はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ及び宿主のジャイレースに依存している。ＲＳＦＩ ＯＩＯは、不和合性グループのプラスミドＩｎｃｌａ、ＩｎｃＭ、ＩｎｃＸ及び 最も特定的にはＩｎｃＰのｔｒａ機能により、１つのグラム陰性菌から他のグラ ム陰性菌へと可動化される（ｍｏｂ　ｉ　］　ｉ　ｓ　ｅｄ）ことができる（デ ルビシャイアー及びライレット、１９８７）。

ＲＳＦＩＯＩＯ及びその誘導体の安定性に関する研究は、今日まで述べられたこ とはない。更に、ＲＳＦＩＯＩＯの配列は知られているけれども（ンヨルッ及び ソエルツィンガー、１９８９）、プラスミド安定性の決定基は機能的分析又は分 子分析のいずれによっても同定することができていない。不和合性グループＱの プラスミドが不和合性グループＰのプラスミド程安定ではないと考えるべきあら ゆる理由がある。

これらの研究にもかかわらず、公知の広い宿生範囲のプラスミドは、それらの有 効性及び工業レベルでのそれらの用途に関する多くの欠点を育する。

特に、工業的使用のためには、宿主バクテリアとは独立に、プラスミドベクター は、操作上の制約及び生物学的安全性に対応する多くの特性を持たなければなら ない。

操作上の制約は、本質的にはプラスミドの分離安定性とつながっている。実際、 プラスミドの損失をカウンターセレクトする（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔ）た めに抗生物質の工業的規模での使用を避けることができることが非常に望ましい 。この観点から、工業的使用のためのベクターは、大きい分離安定性を持たなけ ればならない。この安定性は、組換え体菌株の保存の状態から２００ｍ３の工業 的発酵槽の終わりまで行くのに必要な世代の数を表す、少なくとも２５の引き続 く世代にわたり大きくなくてはならない（スタンバリー及びホワイテーカー、１ ９８４）。更に、これらの安定性は、増幅すること、発現すること等が望まれる ＤＮＡ配列を含むヌクレオチド挿入断片（ｉｎｓｅｒｔ）を有するこのようなプ ラスミドの誘導体についても同様でなければならない。

生物学的安全性の制約は、更に、組換え体菌株が生物学的に大きく制限されるこ とを余儀なくする。１９８７年５月７日のＮＨ（の“組換え体ＤＮＡ分子に伴う 研究のためのガイドライン”に記載の生物学的安全性レベル１　（ＢＬＩ）は、 最も少ない制約に対応する。このシステムは、大腸菌及びシュードモナス・プチ ダの両者において、非接合性（ｎｏｎ−ｃｏｎ　ｊｕｇａｔ　１ｖｅ）及び非可 動性（ｎｏｎ−ｍｏｂ　ｉ　１　ｉ　５ａｂｌｅ）プラスミドの使用を想定する 。実際には、組換え停機生物が偶然天然の環境に放出されることがあったとした ならば、このようなプラスミドは他の生物中に伝達されえないことが肝要である （トレボールス等、１９８７）。

今では、文献に記載の広い宿主範囲のプラスミドは、これらの条件を充分に満足 する。第１には、すべての場合にあてはまる非常に良好な分離安定性は決して達 成されたことはない。実際上、これらのプラスミドのいくらかは成る宿主中では 安定であるが、すべてのグラム陰性菌中ではそうではない。更に、これらのプラ スミドの安定性は、多くは、例えば、増幅又は発現することが望まれる配列を含 んでいるＤＮＡフラグメントの挿入の後は、研究されていない。特に、プラスミ ドｐＲＫ２９０に関してそうであり、その安定性はＤＮＡフラグメントの挿入後 は決して研究されていない。更に、先行技術で記載された広い宿主範囲のプラス ミドの他の特徴は、それらが供与菌から受容菌への接合性伝達のために可動化す る（ｍｏｂｉｌｔｓｅ）か又は可動化される（ｍｏｂｉｌｉｓｅｄ）ことができ るということにある。これはｍｏｂ遺伝子座を有するプラスミド、ＲＫ２９０の 場合にもそうである。この故に、これらのプラスミドは、生物学的安全料の制約 と導入れない。その理由は、組換え体生物が偶然放出された場合に、プラスミド が持っているＤＮＡ配列と共に、プラスミドが比較的高い頻度で他の微生物中に 可動化される可能性を妨げることができないからである。

更に、これらのプラスミドのいくらかのものの安定性の欠如は、タンパク質又は 代謝物の生産の低効率とも同義であり、この故に工業的発酵プロセスにおける限 定された興味とも同義である。

本発明の主題の１つは、特に、広い宿主範囲のクローニング及び／又は発現ベク ターが殆どすべてのグラム陰性菌中で複製することができ、大きい分離安定性を 有しており、そして非可動性であることを特徴とする、広い宿主範囲のクローニ ング及び／又は発現ベクターにある。このベクターのすべての誘導体も本発明の 主題である。本発明の意義内では、このベクターの誘導体は、比較的広範な領域 に影響を与える多少の改変（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）又は修飾（ｍｏｄｉｆｉ ｃａｔｉｏｎｓ）（欠失、突然変異、挿入等）にもかかわらず、上記の特徴を保 持している。

本発明に従うベクターは、グラム陰性菌における広い宿主範囲を有する不和合性 グループＰのプラスミド由来のものである。更に、特定的には、それらは、不和 合性グループＰに属するプラスミド由来の複製起点を有する。有利には、それら は、プラスミドＲＫ２由来のものである。

それらは、ベクターについて決して述べられたことのない性質、即ち、グラム陰 性菌における広い宿主範囲、大きい安定性及び可動化＊能の不存在という性質を 兼ね備えている。

本発明に従うベクターの大きい安定性は、安定化性を有する特定のヌクレオチド フラグメントの導入から生じる。特に、天然のプラスミドＲＰ４から生じる特定 のフラグメントを使用することができる。ｐａｒフラグメントと呼ばれるクロー ニングされたフラグメントは、大腸菌中で成る種のプラスミドを安定化させる能 力を有することが、サウラッガー等、１９８６、により述べられている。ｐａｒ フラグメントの挿入は、選ばれた宿主生物及びヌクレオチド挿入断片の性質（遺 伝子、プロモーター等）又はサイズとは無関係に、安定性の相当な増加を伴うこ とが今回見いだされた。実際、本発明に従うベクター及びそれらの誘導体の分離 安定性（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ）は、クローニング ベクターとして使用することができるＲＫ２誘導体の安定性より高く、これは試 験したすべてのグラム陰性菌において見いだされる。

可動化機能の損失は、本発明のベクターの第２の特徴である。この結果として、 ｐＲＫ２９０のようなプラスミドとは対照的に、本発明に従うベクターは、１つ のグラム陰性菌から池のグラム陰性菌へと可動性ではない。故にそれらは、これ らのバクテリアと共にクラス１宿主−ベクター系を形成しそして工業的調節に従 う。本発明に従うベクターのこの非常に有利な性質は、特に、ｍｏｂ遺伝子座を 有する領域の欠失により得られうる。

本発明に従うベクターの第３の性質は、大多数のグラム陰性菌中で複製すること ができる能力にある。この性質は、特に有利である。その理由は、それは、選ば れたグラム陰性菌宿主中にベクターを導入する前に、所望の構築を行うために大 ｍａ中で作業することを可能とするからである。それは、ベクターの所望の使用 （増幅、発現等）又はヌクレオチド挿入断片の性質及びサイズに従って、最も好 適な宿主を選ぶことも可能とする。

特定の態様では、本発明に従うベクターは、多数の単一クローニング部位を有す る多重クローニング部位を有しており、これは、増幅又は発現することが望まれ るヌクレオチド挿入断片の組込み（ｉｎｔｅｇｒａｌｉｏｎ）を相当促進する。

他の態様では、本発明に従うベクターは、特に、抗生物質耐性遺伝子のような選 択可能なマーカーを有する。好ましくは、それらは、ＲＫ２のテトラサイクリン 耐性遺伝子を含む。この耐性遺伝子は殆どすべてのグラム陰性菌においてプラス ミドの存在が選択されることを可能とする。

他の耐性遺伝子を、本発明に記載のベクター中に又はそれらの誘導体中に挿入す ることができる。

本発明の更に特定の主題は、グラム陰性菌における広い宿主範囲を有するクロー ニング及び／又は発現ベクターであって、それがプラスミドＲＫ２由来のもので あり、サイズが２０ｋｂより小さく、プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域を有するＤ ＮＡフラグメントを含み、ｍｏｂ遺伝子座を含まずそして場合により多重クロー ニング部位及び選択可能なマーカーを含むことを特徴とする、クローニング及び ／又は発現ベクターに関する。

本発明に従うベクターは、所定のＤＮＡ配列を増幅又は発現するのに使用するこ とができる。故に、本発明の主題は、組換え体ＤＮＡフラグメントを含む上記の とおりのベクターに関する。

更に詳しくは、組換え体ＤＮＡは、遺伝子発現の調節配列の制御下に、１つ又は それより多くの所定のポリペプチドをコードしている１つ又はそれより多くの構 造遺伝子を含む。更に、本発明に従えば、構造遺伝子は、それら自身のｗ４ｍシ グナル（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｓ）又は異なる調節シグナルの制御 下にあることができる。好ましい態様では、遺伝子発現のためのｔＩＩｗｉ配列 は、プロモーター、ターミネータ−、シグナルペプチド及びリポソーム結合部位 から選ばれた１つ又はそれより多くの要素から成る。

ポリペプチドをコードしている構造遺伝子は、酵素、ホルモン又は成長因子をコ ードしている遺伝子から選ぶことができる。好ましくは、それらは、アルブミン 、ｔＰＡ、ＴＩＭＰ、インターロイキン、アポリポタンパク質及びインターフェ ロンのための構造遺伝子から選ばれる。

本発明の特定の態様では、構造遺伝子（単数又は複数の）は、遺伝子又は生化学 レベルデ、代謝物の生合成に関係する遺伝子（単数又は複数の）、即ち、代謝物 の生合成の経路に関与したポリペプチドをコードしている遺伝子（単数又は複数 の）である。特に、代謝物は、ビタミン、アミノ酸、抗生物質、又は他のバクテ リア代謝物であることができる。

好ましくは、代謝物は、ビタミンＢ１２、ビオチン、リボフラビン、リンン、ト レオニン、メチオニン、ペニシリン及びテトラサイクリンから選ばれる。

好ましい態様では、本発明に従うベクターは、所定のタンパク質の発現及び適当 ならば該タンパク質の分泌を許容するシグナルにより先行される所定のタンパク 質をコードしている構造遺伝子を含む。

本発明の他の主題は、タンパク質又は代謝物を製造する方法であって、該タンパ ク質をコードする構造遺伝子又は、遺伝子又は生化学レベルデで、該代謝物の生 合成に関係する１つ又はそれより多くの遺伝子を含む上記のベクターをグラム陰 性菌に導入し、このバクテリアを前記遺伝子の発現の条件下に培養し、そして、 生成したタンパク質又は代謝物を回収する、ことを特徴とする方法に関する。

本発明に記載のベクターは、殆どすべてのグラム陰性菌において工業的規模で使 用することができる。プラスミドｐＸＬ１６３５の場合には、それは、プラスミ ドＲＫ２の複製が行われるところのすべてのグラム陰性菌、即ち、ミキソコック ス・キサンタス、ブラジルヒゾビウム・ジャポニクム及びバクテロイデス属のバ クテリア（キュニス及びスタール、１９８９）を除（すべてのグラム陰性菌にお いて使用することができる。

それらは、下記の方法で使用することができる。例えば、増幅されるべき遺伝子 （単数又は複数の）を有する１つ又はそれより多くのＤＮＡフラグメントを、例 えば多重クローニング部位にクローニングし、次いで、それにより構築されたプ ラスミドを工業的レベルで使用することが望まれるバクテリアに導入する。エレ クトロボレーシコン（パース等、１９８９）のような形質転換系を、構築された プラスミドを導入するのに使用することができる。組換え体クローンは、プラス ミドにより供給された耐性により選択される。次いで、これらのクローンを、工 業的用途用の組換え体菌株の保存のための標準的方法に従って保存することがで きる（スタンドバリー及びホワイテーカー、１９８４）。

本発明の更なる主題は、本発明に従うベクターを含むグラム陰性菌及びそれらの 使用である。特に、これらのバクテリアは、タンパク質又は代謝物を製造するの に又は直接生物学的転換反応において使用することができる。

本発明の他の主題及び利点は、下記する実施例を読めば明らかとなるであろう。

下記する実施例は説明のためのものであり、非限定性のものである。

クローニング、分子生物学及び生化学の一般的技術プラスミドＤＮＡの塩化セシ ウム／臭化エチジウム勾配遠心分離、制限酵素による消化、ゲル電気泳動、アガ ローカゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶出、大腸菌中での形質転換、核酸 沈殿等のような分子生勧学の標準的方法は、文献に記載されている（マニアラス 等、１９８２、アウスベル等、１９８７）。ヌクレオチド配列は、既に刊行され たプロトコルに従う鎖終結法（ｃｈａｉｎ　ｔｅ、ｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔ ｈｏｄ）により決定された（アウスベル等、１９８７）。

制限酵素は、ニューイングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）［バイオラプス（ｂｉｏｌａｂｓ）コ、ベテスダ・リサーチ・ラ ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）（ＢＲＬ）又はアメルスハム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｔｄ）　Ｃアメルス ハム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）コにより供給された。

連結反応のために、ＤＮＡフラグメントを０．　７％アガロース又は８％アクリ ルアミドゲルでそれらのサイズに従って分離し、電気溶出により精製し、フェノ ールで抽出し、エタノールで沈殿させ、次いでファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（バ イオラプス）の存在下に、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７，４，１０ｍ Ｍ　ＭｇＣｈ、１０ｍＭ　ＤＴＴ。

２ｍＭ　ＡＴＰ中でインキュベージコンする。

必要ならば、突き出した５′末端を有するＤＮＡフラグメントを、下記の緩衝液 ：１００ｍＭ　グリシン、１ｍＭ　ＭｇＣＬ、１ｍＭＺｎｃ１２、ｐＨ１０，５ 、中で３０分間３７℃で子牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ、ファーマシ ア）による処理により脱リン酸化する。

同じ技術を突き出した３′又はプラント末端の脱りん酸化のために使用するが、 この処理は３７℃で１５分間、次いで５６℃で１５分間である。

反応混合物を、１％ＳＤＳ及び１００ｍＭ　ＮａＣ１の存在下に１５分間６８℃ に加熱し、続いてフェノール／クロロホルム抽出及びエタンール沈殿により酵素 を不活化させる。

突き出した５′末端の充填（ｆ　ｉ　］　ｌ　ｉｎｇ−ｉｎ）は、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩ　（バイオラプス）のフレノウフラグメントにより行われる。反 応は、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ緩衝液りＨ７，２，０，４ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、 １０ｍＭ　ＭｇＳＯ３，０，１ｍＭ　ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ中で３０ 分間室温で行う。突き出した３′末端の充填及び／又は消化は、製造業者の推奨 に従ってファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラプス）の存在下に行われる 。

製造業者の推奨を用いて、バイオサーチ８６００自動式ＤＮＡ合成器（Ｂｉｏｓ ｅａｒｃｈ　８６００　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ ）によるシアノエチル基（シン八等、１９８４、ギレス、１９８５）によりβ− 位置で保護されたホスホルアミダイトの化学を使用してオリゴヌクレオチドを合 成する。　アメルスハム・フランス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｆｒａｎｃｅ、ＳＡ ）により分配されたキットを用いて、ティラー等、１９８５により開発された方 法に従って、オリゴデオキシヌクレオチドによる試験管内突然変異誘発を行う。

ヘニ−’！７．１９８４の技術に従うエキソヌクレアーゼＩ　Ｉ　Ｉ及びＳ１ヌ クレアーゼにより行われる欠失を、製造業者により供給されたプロトコルに従っ て、プロメガ・エラーゼーアーペース・システム・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｅ ｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ　”　Ｓｙｓｔｅｍｋｉｔ）（合衆国、ウィスコンシン 州、マジソン）を使用して行った。

連結反応したＤＮＡ５を使用して、コンピテントな状態にされた（ｒｅｎｄｅｒ ｅｄ、ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）菌株ニブラスミドのための大腸菌ＭＣ１０６０［Δ （１ａ　ｃ　Ｉ　０ＰＺＹＡ）ΦＸ７４、ｇａｌＵ。

ｇａ　ＩＫ、ｓ　ｔ　ｒＡ’、ｈｓｄＲコ　（カサダバン等、１９８３）及びＨ Ｂ　１０１　［ｈｓｄＳ２０．５ｕｐＥ４４、ｒｅｃＡ１３、ａｒａ−１４、ｐ ｒｏＡ２、ＩａｃＹｌ、ｇａ　ＩＫ２、ｒｐｓＬ２０Ｓｘｙ＋　−５、ｍｔｌ− １、λ−］　（マニアラス等、１９ｇ２）又はバクテリオファージＭ１３由来の ファージの複製形態のための大腸菌　ＴＧＩ　［Δ（Ｉａｃ　ｐｒｏＡ、Ｂ）、 ５ｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’　ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ”、Ｂ＋、１ａ ｃｌ”、］ａｃＺΔＭ１５コ　（ギプソン、１９８４、Ｌを形質転換する。使用 したｐｏｌＡ菌株は５Ｆ８００　（スタチェル等、１９８５）であり、この菌株 はナリジキシ酸に耐性である（Ｎ　ａ　ｌ　’）　ｏ菌株Ｃ６００［ｔｈｉ−１ 、ｔｈｒｌ、１ｅｕ−Ｂ６、ＩａｃＹｌ、ｔｏｎＡ２１ＳｓｕｐＥ４４、λ−コ 　（マニアラス等、１９８２）の自然にリファンピシン耐性のクローン（ｓｐｏ ｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃｌｏｎ ｅ）（Ｃ６００Ｒｉ　ｆ’）（５０μｇ／ｍｌ）を、大腸菌対大腸菌接合（Ｅ。

ｃｏｌｉ−ｔｏ−Ｅ、ｃｏｌｉ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ）における受容菌と して使用した。

プラスミドＤＮＡ５を、ビルンボイム及びトリー、１９７９、の方法に従って精 製する。プラスミドＤＮＡミニプレバレージョン（ｍｉｎｉｐｒｅｌ）ａｒａｔ ｉｏｎｓ）を、クライン等、１９８０のプロトコルに従って製造する。

細菌学的部分についてはＬＢ培養培地を使用する（マニアラス等、１９８２）。

シュードモナス・デニフィトリカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓ　ｄｅｎｉｆｉｔｒｉｃａｎｓ）　５Ｃ５１０Ｒｉｆ’、アグロバクテリ ウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ）　Ｃ５８Ｃ９（カメロン等、１９８９Ｌ　シュードモナス−プチダ（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ　１ｄａ）　ＫＴ２４４０（レオング等、１９８２） の菌株も、ＬＢ培地で培養するが、インキュベーション温度は３０℃である。

説明された（ディツタ等、１９８０）如くして接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ ）を行った。接合に参加する１０９個の各バクテリアの細胞をろ別しそして０． ４５μｍミリポアフィルタ−に吸着させる。このフィルターを、次いで３７℃の ＬＢ培地の皿でインキュベーションし、しかる後細胞を１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏイ、 １ｍｌに再懸濁させる。このバクテリア懸濁液の希釈物を次いで適当な抗生物質 を補充されたＬＢ培地の皿で平板培養する。

実施例１ニブラスミドｐＸＬ１６３５の構築この実施例は、非可動性であり且つ 非常に大きい分離安定性を有するグラム陰性菌中で多重宿主ベクターをいかに構 築することができるかを説明する。

実施例１．ｌ：ｍｏｂ遺伝子座を損失したｐＲＫ２９０誘導体の製造この実施例 は、ＲＫ２のｍｏｂ遺伝子座をＲＫ２誘導体においていかにして欠失させること ができるかを説明する。

この遺伝子座の欠失は、独特の制限部位がｍｏｂ遺伝子座の近くでは知られてい ないという意味で困難とされる。そうだとすれば、例えば、述べられた如き（マ ニアラス等、１９８２）Ｂａｌ　３１エキソヌクレアーゼを使用する試験管内欠 失を行うことが可能であったであろう。この欠失を行うことができるためには、 我々は、ＲＫ２のｍｏｂ遺伝子座に単一制限部位を導入した。これは、ティラー 等、１９８５の技術に従う指定突然変異誘発（ｃｌｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇ ｅｎｅｓｉｓ）により行った。指定突然変異誘発の技術は、小さなフラグメント に関してのみ行われる。故に、我々は３段階で進行させた。第１に、ファージＭ １３由来のファージへの伝達起点（ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ ｏｒｉＴ）を含むＲＫ２フラグメントのサブクローニング、続く単一制限部位を 導入するための指定突然変異誘発：第２に、このようにして突然変異させたフラ グメントを次いでプラスミドｐＵＣ１３にクローニングしくビエラ及びメッシン グ、１９８２）そしてカナマイシン耐性遺伝子を有するカセットを次いで伝達起 点に存在する制限部位でクローニングし、そうすると導入した突然変異のマーカ ーとして働くであろう。第３に、突然変異したフラグメントを、二重組換え（ｄ ｏｕｂｌｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によりｐＲＫ２９０が持っている野 生型フラグメントと交換する。得られるプラスミドは、伝達起点において単一制 限部位を有するｐＲＫ２９０誘導体である。故に、エキソヌクレアーゼ及び次い でＤＮＡリガーゼを反応させることにより、欠失による突然変異誘発を行うこと が可能である。これらの構築物を下記に説明する。

シスにおいて可動化を達成するのに十分なＲＫ２の７６０−ｂｐＨａｅＩＩフラ グメント（ガイニー及びヤコブソン、１９８２）を、Ｍ１３ｍｐｌＯにクローニ ングした（ビエラ及びメッシング、１９８２）。このフラグメントは、ＲＫ２の 伝達起点を含み（ガイニー及びヤコブソン、１９８３）、そしてプラスミドにク ローニングされると、プラスミドをＲＫ２のｔｒａ機能によりトランスにおいて 可動性とする。このフラグメントを、ＲＫ２のＨａｅｒｌ消化から精製した。末 端をバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより消化した。別に、ファー ジＭ１３ｍｐｌｏの複製形態を、Ｐｓｔｆ及び５ｓｔｌによる消化により線状化 し、末端を、バクテリオファージＴ４ＤＮ、Ａポリメラーゼで消化した。

それにより得られた複製形態及び精製したフラグメントを、−緒に連結し、次い でコンピテントな状態にした大腸菌ＴＧ１細胞中へと形質転換した。組換え体フ ァージが述べられた如く（ビエラ及びメッシング、１９８２）検出された。得ら れる複製形態はｐＸＬ１４１８と名付けられた（第１図参照）。

ＲＫ２の伝達起点を含む１１２−ｂｐＨｐａ　ｒ　Ｉフラグメントの配列は公表 されている（ガイニー及びヤコブソン、１９’８３）。このフラグメントは、ｐ ＸＬ１４１８に保持されている７６０−ｂｐＨａｅ　Ｉ　Ｉフラグメントに含ま れている。各反復配列について１９ｂｐを有する、ヘアピン構造を形成すること ができる逆方向反復塩基配列があることが観察された（第２図参照）。ティラー 等（１９８５）により開発された方法に従う指定突然変異誘発を、この複製形態 から得られた一本鎖ファージＤＮＡに関して行った。使用したオリゴヌクレオチ ドは、下記の配列：５’　−ＣＣＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＧＣＣＡＧ　ＧＴ Ｇｃ−３′を有する。１１２−ｂｐＨｐａＩ　Ｉフラグメントの配列及びオリゴ ヌクレオチドの配列も第２図に示されており、この図に示されたとおり、オリゴ ヌクレオチドの配列は、１つのヌクレオチドのみおいてフラグメントのオリゴヌ クレオチドとは異なっている。この突然変異は、５ｓｔｌ部位を導入する。オリ ゴヌクレオチドは、ｐＸＬ１４１８の複製形態による大腸菌ＴＧ１の感染により 得られた一本鎖ＤＮＡに対して実際に相補性であることが最初に証明された。こ のために、問題のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列プライマーとして使 用された。配列反応が起こることが実際に観察された。ヌクレオチド配列を読み そして最初の塩基は第２図に示された上部績の右端の配列に実際に相当する。

指定突然変異誘発は、述べられた如くして行った。予想した位置に導入された５ ｓｌｒ部位を実際に有する突然変異体クローンが得られる。

これらの複製形態の１つはｐＸＬ１４５４と名付ける（第１図参照）。

ｐＸＬ１４５４を、Ｅｃｏｒｌ及びＨｉｎｄｌＩＩにより消化する。

７６０−ｂｐフラグメントを精製し、次いでＥｃｏｒＩ及びＨｉｎｄｒＩＩで消 化したｐＵＣ１３と連結する。形質転換の後、組換え体クローンが得られた。１ つのプラスミドクローンを選びそしてｐＸＬ１４６１と名付ける（第１図参照） 。

次の工程は、ｐＸＬ１４６１に選択可能なマーカーが存在するように５ｓｔｌ部 位で抗生物質に対する耐性を与えるカセットを導入することから成っていた。こ のために、ｐＸＬ１４６１を５ｓｔｌで線状化し、次いでｐＵｃ４ＫＩＸＸ　（ ファーマンア・フランス社）の精製した５ｓｔＴフラグメントと連結させた。こ の１．６−ｋｂフラグメントは、トランスポゾンＴｎ５のカナマイノン耐性遺伝 子を有する。アンピシリン及びカナマイシンを補充されたＬＢ培地での形質転換 の後、組換え体クローンを選択した。それにより得られたプラスミドをｐＸＬ１ ４６２と名付けた（第１図参照）。

プラスミドｐＲＫ２９０を、大腸菌ｐｏ　ＩＡ菌株５Ｆ８００　にｚ、９チエル 等、１９８５）中に形質転換させる。この種の菌株において、ＲＫ２由来のプラ スミドは、それらの複製は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとは無関係であるので、 複製するが、ｐＵｃ１３は複製しない。ｐＸＬ、１４６２を次いで菌株５Ｆ８０ ０ｐＲＫ２９０中に形質転換させる。形質転換の後、バクテリアを、テトラサイ クリン、カナマイノン及びアンピシリンを補充されたＬＢ培地で平板培養する。

プラスミドｐＸＬ１４６２はこの菌株中では複製することができないので、この プラスミドによる保持されている耐性の獲得は、２つのプラスミド間の相同的組 換えによってのみ起こることができる。実際、これらの２つのプラスミドは、伝 達開始点を有する７６０−ｂｐＨａｅＩＩフラグメントを共通に持っている。故 に、２つのレプリコン間の融合をもたらす、２つのプラスミドの相同領域間の相 同的組換えがあることが可能である。３つの抗生物質に対して耐性のクローンの プラスミドＤＮＡを制限により分析した。

アガロースゲル分析は、それが１つのプラスミドのみを含むことを証明する。制 限消化によるこのプラスミドの分析は、ｐＸＬ１４６２が伝達開始点でプラスミ ドｐＲＫ２９０と実際に組換えが起こったことを示す。

２つのレプリコンの融合から生じるプラスミドはＲＫ２の２つの伝達開始点を育 し、１つは野生型であり、そして１つは突然変異誘発により導入された５ｓｔｌ 部位を有しており、それにはカナマイシン耐性遺伝子を有するカセットがクロー ニングさていた（第３図参照）。このようなプラスミドを含むクローンを、次い でテトラサイクリン及びカナマイシンを補充されたＬＢ培地での希釈培養により 培養する。アンピシリンの不存在は、伝達開始点の７６０−ｂｐフラグメントの 野生型コピーを有するｐＵｃ１３の切除により、１つの組換えイベント（ｓｉｎ ｇｌｅ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａＮｏｎ　ｅｖｅｎｔｓ）が対抗選択されないように することを可能とするであろう。ｐＵｃ１３及び誘導されたプラスミドは複製し ないので、切除されたプラスミドは直ちに失われるであろう。

ｐＲＫ２９０及び突然変異した複製起点のマーカーについて選択性である液体培 地中で、６０世代に相当する一連の希釈培養の後、バクテリアを、同じ抗生物質 を補充されたＬＢ培地で平板培養する。２０００コロニーを、同じ培地で及びア ンビンリンを補充されたＬＢ培地の皿で継代培養した。アンビンリンに感受性の ２つのクローンが得られる。これらのクローンにより保持されたプラスミドを精 製しそして制限により分析する。これらの分析は、これらのプラスミドがＲＫ２ の伝達開始点の野生型コピーを持ったｐＵｃ１３の切除に正確に相当することを 示す。このプラスミドは、ｐＸＬ１５６１と名付ける（第３図参照）。このプラ スミドは伝達開始点において２つのＨ４ｎｄＩＩＩ部位を有するので、Ｈｉｎｄ ｌ　Ｉ　ｒによるプラスミドの消化の後エキソヌクレアーゼによる消化により欠 失を行うことが可能である（第３図参照）。故にプラスミドｐＸＬ１５６１をＨ ｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉにより消化しそして次にヘニコフ（１９８４）の技術により一 連の希釈を行った。この技術は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びＳ１ヌクレアー ゼの引き続く作用を使用し、得られる欠失体は２方向性であり次いでこれらの欠 失体を連結しそして連結体をＭＣ１０６０に形質転換させる。それにより得られ た形質転換体のプラスミドＤＮＡを制限消化により分析する。いくつかのクロー ンは、それらがｍｏｂ遺伝子座において欠失を受けたことを示す。我々は、３． ５ｋｂの欠失を受けたプラスミドを選択した。この欠失は、エキソヌクレアーゼ ＩＩＩがＨ４ｎｄＩｌｌＮ位の両側で同じ速度論でプラスミドのＤＮＡを消化さ れたとすれば、プラスミドの伝達開始点の各側の１．７５ｋｂの欠失に相当する であろう。それにより得られたプラスミドは、ｐＸＬ１５７０と名付ける（第３ 図参照）。

１）ＸＬ１５７０は、１つの制限部位としてＥｃｏＲＩ及びＢｑｌｒｌを有する 。我々は、得られるプラスミドがいくつかのクローニング部位を含むようにＥｃ ｏＲＩに多重クローニング部位を導入しようと試みた。

２つのＥｃｏＲ１部位によりフランキングされた（ｆｌａｎｋｅｄ）多重クロー ニング部位を有するプラスミドｐＦＲ１０（シャビラ等、１９８３）を、多重ク ローニング部位のソースとして使用する。ｐＦＲｌｏを、ｐＸＬ１５７０と同様 に、ＥｃｏＲＩで消化する。２つの消化体を連結し、連結体を大腸菌ＭＣ１０６ ０中に形質転換させる。ｐＸＬ１５９４と名付けられ（第４図参照）、その多重 クローニング部位の方位（（Ｂｉ６Ｈｔａｔｉｏｎ）が決定されている１つを含 む、組換え体クローンが得られる。

実施例１．２　ＲＫ２のｐａｒ遺伝子座を有する非可動性ｐＲＫ２９０誘導体の 構築 この実施例は、ＲＫ２誘導体にＲＰ４のｐａｒ遺伝子座を有するフラグメントを クローニングすることにより、より分離安定性であるプラスミドがいかにして得 られるかを説明する。

ＲＰ４のｐａｒ遺伝子座を含むｐＧＭＡ２８　（ガーリッツ等、１９８８）の２ ．２−ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを精製し、次いでＢｇｌｌＩにより線状化さ れたｐＸＬ１５９４と連結させる。連結体を、大腸菌ＭＣ１０６０中に形質転換 させる。２４の形質転換体のプラスミドＤＮＡを、制限消化により分析しそして ３つのクローンが２．２−ｋｂフラグメントのキャリアーである。それらの内の ２つは同じ方位においてこのフラグメントを有しており、箪３番目のものは逆方 位に相当する。初めの２つのクローンに相当するプラスミドは、ｐＸＬ１６３５ と名付け、他の方位において前記フラグメントを含むプラスミドはＰｘ１１６３ ４と名付ける（第４図参照）。

それにより得られたプラスミドは、伝達開始点の付近の３．　５に、ｂの欠失及 びＲＰ４のｐａｒ領域の組込み及び場合により多重クローニング部位の組込みを 伴った、ＲＫ２の誘導体、更に正確に言えばＤＲＫ２９０の誘導体である。下記 の部位：ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ。

ＨｉｎｄＩＩＩＳＣｌａｌＳＸｂａＩ、Ｘｈｏｒ及び５ｓｔＩを対称クローニン グのために使用することができ、非対称的クローニングのためには、ＥｃｏＲＩ は除外されるべきであるが、他の酵素は使用することができる。

実施例２　ｐＸＬ１６３５の可動化（ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）りＸＬ１６３ ５の可動化を研究した。それは、大腸菌対大腸菌接合伝達（Ｅ、　ｃｏｌｉ−ｔ ｏ−Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒ）に関して行わ れた。３つの参加体（ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ）が関与する伝達（ｔｒａｎｓ ｆｅｒ）（ディツタ等、１９８０により既に記載された方法に従う）は、下記の 菌株を使用して行われた。

可動化されるべきプラスミドを有する菌株：ＨＢｌｏｌ　（ｐＸＬ１６３５）又 はＨＢＩＯＩ　（ｐＲＫ２９０）又はＨＢＩＯＩ　（ｐＸＬ１５７０）又はＨＢ ＩＯＩ　（ｐＵＣ９ｔｅ　ｔ）ＲＫ２誘導体の可動化のための“ヘルパー”プラ スミドを含む菌株：ＨＢ１０１ｐＲＫ２０１３ 受容菌株：Ｃ６００Ｒｉｆ’ プラスミドｐＵＣ９ｔｅｔはファーマシア・フランス社から入手され、それは、 プラスミドｐＲＫ２９０％ｐＸＬ１６３５及びＩ）ＸＬ１５７０と同じ耐性を与 える、ｐＢＲ３２２由来の非可動性プラスミドである。

接合完了体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）を、テトラサイクリン及びリフ ァンピシンを補充されたＬＢ培地で選択する。接合頻度は、受容菌細胞の総数に 対するプラスミドの耐性を実際に獲得した受容菌細胞の数の比として通常の方法 で（ディツタ等、１９８０）計算される。

接合は、供与国としてＨＢＩＯＩにより行われる。供与国はｒｅｃＡ菌株であり 、それによりｐＲＫ２０１３及びｐＸＬ１５７０．ｐＲＫ２９０、ｐＸＬ１６３ ５及びｐＵＣ９ｔｅ　を間で起こる可能性のある相同組換えを回避する。その理 由はこれらのプラスミドは相同配列を冑するからである。

この表から明らかになるとおり、ｍｏｂ遺伝子座の損失は、ｐＸＬ１５７０の接 合頻度とｐＲＫ２９０の接合頻度との間では可動化の殆ど全損失（少なくとも２ Ｘ１０’倍の比率がある）となって表れるが、これに対してこれらのプラスミド は３．５ｋｂの欠失においてのみ異なる。

ＤＸＬ１６３５は、ｐＸＬ１５７０と同じ可動化の性質を有する。既にこれまで に述べたように、ｐＸＬ１５７０及びｐＸＬ１６３５に関してここに観察される 接合は、多分、これらのプラスミド（直接ｐＲＫ２９０由来のものである）と、 相同性の領域を有するｐＲＫ２０１３　（ディツタ等、１９８０）との間の相同 組換えによるものである。対照非可動性プラスミドｐＵＣ９ｔｅ　ｔは、ｐＸＬ １６３５及びｐＸＬ１５７０について観察された頻度と異ならない頻度で可動化 される。これは、これらのプラスミドが実際にそれらの可動化の性質を失ったこ と及びそれらは、説明した実験（この実験において、独立のｒｅｃＡ組換えが起 こっているにちがいない）において供与歯がたとえｒｅｃＡであっても、組換え によってのみ可動化されうることを示す。ｐＲＫ２９０の接合性伝達の機構は大 腸菌の２つの菌株間及び２つのグラム陰性菌間と同じあるので、プラスミドｐＸ Ｌ１６３５は、宿主に関係なく非可動性であると考えられなければならない。

実施例３　大腸菌以外のグラム陰性菌へのｐＸＬ１６３５の導入この実施例は、 種々のグラム陰性菌に非可動性プラスミドｐＸＬ１６３５をいかにして導入する ことができるかを説明する。

プラスミドｐＸＬ１６３５は伝達開始点を持っていないので、それは、大腸菌か ら他のグラム陰性菌に可動化されえない。種々のグラム陰性菌にｐＸＬ１６３５ を導入するためには、エレクトロポレーションによる形質転換の方法（パース等 、１９８９）が使用される。下記のバクテリアを、この方法により、プラスミド ｐＲＫ２９０、ｐＸＬ１５７０及びｐＸＬ１６３５を用いて形質転換する。

シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒ ｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒ４ｆ’、アグロバクテリウム・ツメファシェンス （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８Ｃ９、シュ ードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）Ｔ２４４０ リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２Ｆ３４ ゜ 各バクテリアについて、組換え体クローンを再単離する。プラスミドＤＮＡを生 成し、そしていくつかの制限消化によって最初のプラスミドのそれと異ならない ことが示される。故に、プラスミドｐＸＬ１６３５をグラム陰性菌に導入するこ とができる。

実施例４　ｐＸＬ１６３５の安定性 この実施例は、ｐＸＬ１６３５が種々のグラム陰性菌内でｐＲＫ２９０よりも安 定であることを説明する。

異なる組換え体バクテリア及び親菌株を、抗生物質の添加なしでＬＢ培地で培養 する。定常期に達すると、１／１０００希釈を行う。かくしこれらの菌株を、こ のようにして平均して５０世代にわたり培養する（世代の数は５０で評価されそ して４０乃至６０の範囲内にある）。次いで培養物の希釈物をＬＢ寒天培地で平 板培養する。各培養物について、２００の独立したクローンをプラスミドについ て選択可能な培地で継代培養する。耐性、従でてプラスミドを失ったクローンの 発生率を計算した。この値を下表に示す。

上記の値は、ＬＢ培地中での培養物の５０非選択性世代（５０ｎ。

ｎ−５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）の後プラスミドの耐性を失 ったクローンの％で表した発生率に相当する。

この表から、ｐＸＬ１６３５は、ｐＲＫ２９０及びｐＸＬ１５７０よりもはるか に安定であることは明らかであり、この性質は、検討したすべてのバクテリアに おいて真実である。後者の２つのプラスミドはプラスミドを失ったクローンの同 じ発生率を有する。観察された差は、統計的観点からは有意ではない。故に、３ ．５ｋｂの欠失は、ｐＲＫ２９０の複製及び安定性の性質に影響を与えない。反 対に、ｐＧＭＡ２８の２゜２−ｋｂフラグメントのクローニングは、安定性の相 当な増加を非か起こす。これらの結果は、プラスミドｐＸＬ１６３５が、安定性 の観点からｐＲＫ２９０よりもはるかに有利な性質を有することを明らかに示す 。

これらの利点は、もちろん、公表されたデータに従って、工業的使用のためには ｐＲＫ２９０より有利さが少ない（／ユミットホイザー等、１９８８）他のＲＫ ２誘導体に対しても同じである。

図面の説明 第１図は、ｐＸＬ１４１８、ｐＸＬ１４５４、ｐＸＬ１４６１及びｐＸＬ１４６ ２の構築を示す。この構築は本明細書に詳細に述べられている。

第２図は、ＲＫ２の伝達開始点を含む１１０−ｂｐＨｐａｌ　１７ラグメントの 配列（ガイニー及びヤコブソン、１９８３に従う）を示す。突然変異誘発のため に使用されたオリゴヌクレオチドの配列が示されており、そして導入される５ｓ ｔ１部位も示されている。ヘアピン構造を形成しなければならない２つの逆方向 反復塩基配列は矢印でアンダーラインがなされている。

第３図は、ｐＸＬ１５６１及びｐＸＬ１５７０の構築を示す。構築は本明細書に 詳細に述べられている。

第４図は、ｐＸＬ１５９４、ｐＸＬ１６３５及びｐＸＬ１６３４の構築を示す。

構築は、本明細書に詳細に述べられている。

使用した用語及び略号の定義 組換え体ＤＮＡ：天然にはそのように組み合わされないＤＮＡ配列を、同じ微生 物内で組み合わせるか又は特にＤＮＡフラグメントに突然変異を誘発させること を可能とする技術のセット。

ＡＴＰ：　アデノシン５′−三リン酸 ＢＳＡ：　ン血清アルブミン 停止コドン、翻訳終結コドン ｄＮＴＰ：　２’　−チオキシリすヌクレオシド５′−三リン酸ＤＴＴ　：　ノ チオトレイトール ｋｂ：　キロベース ｂｐ：　塩基対 書誌文献 アウスベル・エフ・エム、アール・ブレンド、アール・エフ・キンストン、デー ・デー・モーμ、ジエー・ニー・スミス、ジエー・ジー・セイドマン及びケイ・ ストルール、１９８７、分子生物学における最近のプロトコル　１９８７−１９ ８８、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ 、Ｍ、、Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ。

ＫＩｎｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、Ｊ、Ａ、Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｇ。

Ｓｅｆｃｔｍａｎ　ａｎｄ　Ｋ、５ｔｒｕｈ１．１９８７．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｊｏｌｏｇｙ１９８７−１９ ８８．Ｊｏｈｎ　ＷｉＩＩｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、）、 バグダサリアン、ジェー・フレイ、及びチー・チミス、１９８１、特定目的のプ ラスミドクローニングベクター、ＩＴ、広い宿主範囲、高いコピー数、Ｒ５ＦＩ ＯＩＯ由来のベクター及びシュードモナスにおける遺伝子クローニングのための 宿主ベクター系、ジェネ　１６．２３７−２４７　（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ、 Ｊ、Ｆｒｅｙ、ａｒｉｄ　Ｋ、Ｔｉｍｍ１ｓ、１９８１．５ｐｅｃｉｆｉｃ−ｐ ｕｒｐｏｓｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ、ｒｒ、Ｂｒ ｏａｄ　ｈｏｓｔｒａｎｇｅ、ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ、ＲＳＦｌｏ ｌｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ、ａｎｄ　ａ　ｈｏｓｔ　ｖｅｃｔ。

ｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ、Ｇｅｎｅ　１６．２３７−２４７）、カメロン・ビー、チー・ブリッ クス、ニス・プリドモア、ジー・プレフォート及びンエー・クロウゼット、１９ ８９、シュードモナス・デニトリフィカンス中での補酵素Ｂ１２生合成、ジャー ナル・オブ・バクテリオロジー、１７１．５４７−５５７　（Ｃａｍｅｒｏｎ　 Ｂ、に、Ｂｒ１ｇｇ５．Ｓ、Ｐｒｉｄｍｏｒｅ、Ｇ、Ｂｒｅｆｏｒｔ　ａｎｄ　 Ｊ。

Ｃｒｏｕｚｅｔ、１９８９．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ 　ｇｅｎｅｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｃｏｅｎｚｙｍｅＢ１２　ｂｉｏｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１゜５４７−５５７）、 カサダバン・エム・ジエー、ニー・マルチネーアリアス、ニス・チー・シャピラ 及びジェー・チョウ、１９８３、大ｍ菌及び酵母中での遺伝子発現を分析するた めのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子融合、メソッズ・インーエンケイモロジー、１ ００．２９３−３０８　（Ｃａｓａｄａｂａｎ。

Ｍ、Ｊ、、Ａ、Ｍａｒｔ　１ｎｅｚ−Ａｒｉａｓ、Ｓ、Ｔ、５ｈａｐｉｒａ　ａ ｎｄ　Ｊ、Ｃｈｏｕ、１９８３　β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ　 ｆｕｓｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉａｎｄ　Ｙｅａｓｔ、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１００゜２９３−３０６）、 デルビシャイアー・チー・エム及びエフ・ニス・ウィレッッ、１９８７、非接合 性プラスミドＲＳＦＩＯＩＯの可動化：その伝達開始点の遺伝子分析、モレキュ ラー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス、２０６．１５４−１６０　（Ｄ ｅｒｂｙｓｈｉｒｅ、に、Ｍ、ａｎｄ　ＮＳ、Ｗｉ　１ｌｅｔｓ、１９８７．Ｍ ｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｎｏｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ｐｌ ａｓｍｉｄ　ＲＳＦｌｏｌｏ：ａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　 ｉｔｓｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

、、２０６．１５４−１６０）、 ニー・ビー、リアング・エックス−・ダブリュ、フィンシー・デー・アール、ガ イニー、デー、ヘリンスキー・デー・アール、１９８５．遺伝子クローニングの ため及び遺伝子発現を監視するために有用な広い宿生範囲のベクターｐＲＫ２９ ０に関係するプラスミド、プラスミド、１３．１４９−１５４　（Ｄｉｔｔａ　 Ｇ、、Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ　Ｔ、。

Ｙａｋｏｂｓｏｎ　Ｅ、、Ｌｕ　Ｐ、、Ｌｉａｎｇ　Ｘ、−Ｗ、、Ｆｉｎｌａｙ 　Ｄ、Ｒ，、Ｇｕｉｎｅｙ　Ｄ、、Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ　Ｄ、Ｒ，。

１９８５、ＰＩａｓｍｉｄｓ　ｒｅｌａｔｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅｂｒｏａｄ　ｈ ｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＲＫ２９０゜ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｇ ｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｆａｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ｐｌａｓｍｉｄ、１３．１４９−１５４）、 ディツタ・ジー、スタッフィールド・ニス、コルビン・デー、ヘリンスキー・デ ー・アール、１９８０、グラム陰性菌のための広い宿生範囲のＤＮＡクローニン グ系、リゾビウム・メリトティの遺伝子バンクの構築、プロシーディンゲス・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・才ブ・ザ・ニー・ニス・ ニー、７７．７３４７−７３５１（Ｄｉｔｔａ　Ｇ、、５ｔａｎｆｉｅｌｃｆ　 Ｓ、、Ｃｏｒｂｉｎ　Ｄ、。

Ｈｅ１ｊｎｓｋｉ　Ｄ、Ｒ，，１９８０，Ｂｒｏａｄ　ｈｏｓｔｒａｎｇｅ　Ｄ ＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　 ｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｂａｎｋ　 ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ　ｔｏｔ　ｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、。

７７．７３４７−７３５１）、 ガーリッツ・エム、オー・フラバク及びエイチ・シュワブ、アブストラクト・第 ８回インターナショナル・バイオテクノロジー・シンポジウム、１９８８、Ａ１ ５６．１２９頁（Ｇｅｒｌ　ｉ　ｔｚ、　Ｍ、、　Ｏ。

Ｈｒａｂａｋ　ａｎｄ　Ｈ，Ｓｃｈｗａｂ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　８ｔｈＩｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、１９ ８８．Ａ１５６．　ｐ、１２９）、ギレス・ジェー・ダブリュ、１９８５、自動 化ＤＮＡ合成の進歩、アメリカン・バイオテクノロジー、１１月／１２月号（Ｇ ｉｌｅｓ、Ｊ。

Ｗ、１９８５．Ａｄａｎｃｅｓ　ｉｎ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ、Ａｍ、Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌ、、Ｎｏｖ、／ＤｅＣ，）、 組換え体ＤＮＡ分子を含む研究のためのガイドライン、ノティス・ナショナル・ インスティチュート・オブ・ヘルス、フェードラル・レジスター、第５１巻、８ ８号、１６９５８−１６９６５　（Ｇｕｉ　ｄｅ　Ｉ　１ｎｅｓ　ｆｏｒ　ｒｅ ｓｅａｒｃｈ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｍｏｌ ｅｃｕｌｅｓ＋Ｎｏｔｉｃｅ、Ｎａｔｉ。

ｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、ＦｅｄｅｒａｌＲｅｇｉｓ ｔｅｒ、Ｖｏｗ、５１．Ｎｏ、８８．１６９５８−１６９６５）、 ガイニー・デー・ジー及びイー・ヤコブソン、１９８３、広い宿主範囲のプラス ミドＲＫ２の伝達開始点の位置及びヌクレオチド配列、プロシーティンゲス・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・ニス・ ニー、８０．３５９５−３５９８、（Ｇｕｉｎｅｙ、Ｄ、Ｇ、ａｎｄ　Ｅ、Ｙａ ｋｏｂｓｏｎ、１９ｇ３゜Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｃｔｉｄｅ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｔｈ ｅｂｒｏａｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＲＫ２．Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．３５９５−３５９８）ヘニ コフ・ニス、１９８４、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる一方向消化はＤＮＡ配 列決定のための目標のブレークポイントを造りだす、ジェネ、２８．３５１−３ ５９、（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　Ｓ、１９８４゜Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｄ ｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｗｉｔｈｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ　ｃｒｅａｔｅｓ 　ｔａｒｇｅｔｅｄｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ。

Ｇｅｎｅ、２８，３５１−３５９）、 キーン・エフ・チー、ニス・タマキ、デー・コバヤシ及びデー・ドロリンガ−１ １９８８、グラム陰性菌中でのＤＮＡクローニングのための改良された広い宿主 範囲のプラスミド、ジエネ、７０．１９１−１９７、（Ｋｅｅｎ、Ｎ、Ｔ、、Ｓ 、Ｔａｍａｋｉ、Ｄ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉａｎｄ　Ｄ、Ｔｒｏｌｌｉｎｇｅｒ、 　１９８８．１ｍｐｒｏｖｅｄｂｒｏａｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍ ｉｄｓ　ｆｏｒＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　 ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｎｅ、７０．１９１−１９７）、キュニス・ニー及びニ ー・スタール、１９８９、グラム陰性菌中でのプラスミドの複製、マイクロバイ オロジカル・レビューズ、５３．４９１−５１６、（ＫＱｅｓ、Ｕ、ａｎｄ　Ｕ 、５ｔａｈ１．１９８９゜Ｒｅｐｌｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｉ ｎ　ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃ、Ｒｅｖ、、５３ ，４９１−５１６）、 レオング・エル・ニス、ジー・ニス・ディツタ及びデー・アール・ヘリンスキー 、１９８２、リゾビウム・メリトティからのδ−アミルプリン酸シンセターゼを コードしているクローニングされた遺伝子の同定、ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー、２５７．８７２４−８７３０、（Ｌｅｏｎｇ、　Ｌ、　 Ｓ、、　Ｇ、　Ｓ、　Ｄｉ　ｔ　ｔａ、ａｎｄＤ、Ｒ，Ｈｅ１ｔｎｓｋｉ、１９ ８２．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ａ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅ　ｃｏ ｄｉｎｇ　ｆｏｒ　δ−ａｍｉｎｏｌｅｖａｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｙｎｔｈ ｅｔａｓｅｆｒｏｍ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｔｏｔｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５７．８７２４−８７３０）、マニアチス・チー、チー・エフ・フ リッチュ及びジー・サムプルツク、１９８２、モレキュラークローニング：実験 室的マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニスヨーク 、コールド・スプリング−ハーバ−１（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ １ｔｓｃｈ。

ａｎｄ　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ）、サウラッガー・ビー・エフ、オー・フラバック、エイチ・シ ュワブ及びアール・エム・ラフエルティ、１９８６、広い宿主範囲のプラスミド ＲＰ４のｐａｒ領域のマツピング及びクローニング、ジャーナル・オブ・バイオ テクノロジー、４．３３３−３４３　（Ｓａｕｒｕｇｇｅｒ、Ｐ。

Ｎ、、Ｏ，Ｈｒａｂａｋ、Ｈ，Ｓｃｈｗａｂ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、Ｌａｆｆｅｒｔ ｙ、１９８６．Ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｒ −ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　 ＲＰ４．Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、。

４．３３３−３４３）、 ンュミットホイザー・チー・ジェー及びデー・アール・ヘリンスキー、１９８５ 、グラム陰性菌の９つの種における複製及び安定な維持に関与した広い宿主範囲 のプラスミドＲＫ２の領域、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー１．１６４． ４４６−４５５　（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ。

Ｔ、Ｊ、ａｎｄ　Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、１９８５．Ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ 　ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＲＫ２　１ｎｖｏｌｖ ｅｄ　ｉｎ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄｓｔａｂｌｅ　ｍａｉｎｔｅｎａ ｎｃｅ　ｉｎ　ｎ１ｎｅ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ 　ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６４．４４６−４５５）、ンュミットホイザー・チー ・ジエー、ジー・ディツタ及びデー・アール・ヘリンスキー、１９８８、グラム 陰性菌のための広い宿生範囲のプラスミドクローニングベクター、アール・エル ・ロドリンガー及びデー・チー・デンハート（編者）、ベクター、分子クローニ ングベクターの調査及びそれらの使用、ボストン、バターワース、（Ｓｃｈｍｉ ｄｈａｕｓｅｒ、Ｔ、Ｊ、、Ｇ、Ｄｉｔｔａ　ａｎｄ　Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｎｓｋ ｉ、１９８８．Ｂｒｏａｄ−Ｈｏｓｔ−Ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄｃｌｏｎｉ ｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉ ａ、Ｉｎ　Ｒ，Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｒ　ａｎｄＤ、Ｔ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ　（ ｅｄ、）、Ｖｅｃｔｏｒｓ、ａ　５ｕｒｖｅｙ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃ ｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅｓ、　Ｂｕｔｔｅｒ ｗｏｒｔｈｓ。

Ｂｏｓｔｏｎ）、 ショルッ・ビー、ブイ・ハリング、ビー・ウィツトマン−リーブホルト、チー・ アシュマン、エム・バグダサリン及びイー・シェルツィンガー、１９８９、広い 宿主範囲のプラスミドＲ５ＦＩＯＩＯの完全なヌクレオチド配列及び遺伝子構成 、ジエネ、７５．２７１−２８８　（Ｓｃｈｏｌｚ、Ｐ、、Ｖ、Ｈａｒｉｎｇ、 Ｂ、Ｗｉ　ｔｔｍａｎ−Ｌｉｅｂｈｏｌｔ、に、Ａｓｈｍａｎ、Ｍ、Ｂａｇｄａ ｓａｒｉａｎａｎｄ　Ｅ、Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒ、１９８９．Ｃｏｍｐｌｅｔ ｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｏｒｇａｎｉｚ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉ ｄ　Ｒ３ＦＩＯＩＯ，Ｇｅｎｅ、７５，２７１−２８８）、 シャピラ・ニス・チー、ジエー・チョウ、エフ・ブイ・リチャウド及びエム・ノ ー・カサダバン、１９８３、β−ガラクトンダーゼの酵素的に活性なカルボキノ 末端部分をコードしているＩａｃＺ遺伝子配列に融合したクローニングされた遺 伝子によりコードされたハイブリッドタンパク質の発現のための新しい多様性を 持ったプラスミドベクター、ジエネ、２５．７１−８３　（Ｓｈａｐ　ｉ　ｒａ Ｓ、に、、Ｊ、Ｃｈｏｕ、Ｆ、Ｖ、Ｒｉｃｈａｕｄ、ａｎｄ　Ｍ、Ｃ。

Ｃａ５ａｄａｂａｎ、１９８３．Ｎｅｗ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｐｌａｓｍｉｄ 　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ　ｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ａ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｅｄ　ｔｏ 　Ｉａｃｚ　ｇｅｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｅｎｚｙｍａ ｔｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐｏｒｔ ｉｏｎ　ｏｆ　β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、Ｇｅｎｅ　２５，７ｌ−８３ ）、シンハ・エフ・デー、ンエートビエルナット、ジエー・マクマヌス及びエイ チ・ケスター、１９８４、ポリマー支持体オリゴヌクレオチド合成、ＸＶＩＩＩ ＋最終製品の保護基脱離及び単離を簡単化するＤ　Ｎ　Ａフラグメントの合成の ためのデオキシヌクレオシドのβ−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミノ− ／Ｎ−モルホリノホスホルアミダイトの使用、ヌクレイツク・アシッズ・リサー チ、１２．４５３９−４５５７（Ｓｊｎｈａ、Ｎ、Ｄ、、Ｊ、Ｂｉｅｒｎａｔ、 Ｊ、ＭｃＭａｎｕｓａｎｄ　Ｈ，Ｋｏｅｓｔｅｒ、１９８４．Ｐｏｌｙｍｅｒ　 ５ｕｐｐ。

ｒｔ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ：ｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＸＶＩｒｒ：Ｕ ｓｅ　ｏｆ　β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−Ｎ、Ｎ−ｄｉａｌｋＹｌａｍｉｎｏ− ／Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｏｆ　ｄｅｏ ｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｄ ＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｓｉｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔ 、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１２．４５３９−４５５７）、スタチェル・ニス・イー 、ジー・アン、シー・フローレス及びイー・ダブリュ・ネスター、１９８５、β −ガラクトシダーゼ遺伝子融合のランダムな発生のためのＴｎ３１ａｃＺトラン スポゾン：アグロバクテリウム中での遺伝子発現の分析への応用、エムボ・ジエ ー、４．８９１−８９８　（Ｓｔａｃｈｅｌ　Ｓ、Ｅ、、Ｇ、Ａｎ、Ｃ，Ｆｌｏ ｒｅｓａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ、１９８５．Ａ　Ｔｎ３１ａｃＺｔｒａｎ ｓｐｏｓｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｎｄｏｍ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　 β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎｓ：ａｐｐｌｉｃａｔ ｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｆｎ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｍｂｏ　Ｊ、、４，８９１−８９ ８）、スタンバリー・ピー・エフ及びニー・ホイテーカー、１９８４、発酵技術 の原理、オックスフォード、ベルガモン・プレス（Ｓｔａｎｂｕｒｒｙ、Ｐ、Ｆ 、ａｎｄ　Ａ、Ｗｈｉｔａｋｅｒ、１９８４．Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｆ ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ）、ティラー・ジェー・ダブリュ 、ジェー・オツド及びエフ・エックスタイン、１９８５、ホスホロチオエート修 飾ＤＮＡを使用する高頻度でのオリゴヌクレオチド−指定突然変異の迅速な発生 、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ、１３．８７６４−８７６５　（Ｔａｙｌ ｏｒ　Ｊ。

Ｗ、、Ｊ、Ｏｔｔ　ａｎｄ　Ｆ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、１９８５．Ｔｈｅｒａｐｉ ｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ。

ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｈｉｇｈｆｒｅｑｕ ｅｎｃｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　 ＤＮＡ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１３゜８７６４−８７６５）、 トーマス・シー・エム、１９８６、プラスミド維持における広い宿主範囲のブラ スミドプＲＫ２の１ｎｃＣ遺伝子座の関与についての証拠、プラスミド、１６． １５−２９　（Ｔｈｏｍａｓ　Ｃ，Ｍ、１９８６゜Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　 ｔｈｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆｔｈｅ　１ｎｃＣ１ｏｃｕｓ　ｏｆ　ｂ ｒｏａｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＲＫ２　ｉｎ　ｐｌａｓｍ ｉｄ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ、１６．１５−２９）、トレボ ルス・ジエー・チー、チー・バーケイ及びニー・ダブリュ・ブルクイン、１９８ ７、土壌及び水の環境中でのバクテリア間の遺伝子伝達、ア・レビュー・カナデ ィアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー、３３．１９１−１９８　（ Ｔｒｅｖｏｒｓ、Ｊ、Ｔ、、Ｔ。

Ｂａｒｋａｙ　ａｎｄ　Ａ、Ｗ、Ｂｏｕｒｑｕｉｎ、１９８７．Ｇｅｎｅ　ｔｒ ａｎｓｆｅｒ　ａｍｏｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　５ｏｔｌ　ａｎｄ　ａｑ ｕａｔｉｃ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ：　ａ　ｒｅｖｉｅｗ、Ｃａｎ、Ｊ、Ｍ ｉｃｒｏｂｊｏ＋、、３３．１９１−１９８）ビエラ・シェー及びジエー・メソ ンング、１９８２、ｐＵＣプラスミド、挿入突然変異誘発のためのＭ１３ｍｐ７ 由来の系及び合成ユニバーサルブライマーによる配列決定、ジェネ、１９．２５ ９−２６８（Ｖｉｅｒａ　Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８２．Ｔｈｅ ｐＵＣｐｌａｓｍｉｄｓ、ａｎ　Ｍ１３ｍｐ７−ｄｅｒｉｖｅｄＳｙｓｔｅｍ　 ｆｏｒ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ　ｗｉｔｈ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ、１９．２５９−２６８）、 パース・アール、ニー・フリーセネガー及びニス・エフ・フィールジー、１９８ ９．１１の異なる属に属するグラム陰性菌の種々の種のエレクトロポレーション による形質転換、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス、２１ ６．１７５−１７７　（Ｗｉ　ｒｔｈ、Ｒ，。

Ａ、Ｆｒｉｅｓｅｎｅｇｅｒ　ａｎｄ　Ｓ、Ｆ、Ｆｉｅｌｄｅｒ。

１９８８、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉｕ　−ｏｕｓｓｐｅ ｃｉｅｓ　ｏｆ　ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｅｌｏｎ ｇｉｎｇ　ｔｏ　１１　ｄｊｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｎｅｒａ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔ ｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏ１．ＧｅｎＧｅｎｅｔ、、２１６．１７５−１７７ ）。

Ｆｉｇｕｒｅ　３ 伝達開始点を除去された Ｆｉｇｕｒｅ　４ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成４年１０月２３ 日 特許庁長官　麻　生　渡　殿　Ｖ 】、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＦＲ９１１００，３３３ ２、発明の名称 ３、特許出願人 名　称　ローン−ブーラン・ビョシミ ４、代理人　〒１０７ ５、補正書の提出年月日 １９９２年３月５日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 ９、プラスミドｐＸＬ１６３．５であって、該プラスミドｐＸＬ１６３５が、プ ラスミドＲＫ２由来のものであることと、サイズが２０ｋｂより小さいことと、 プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域を有するＤＮＡフラグメントを含むことと、ｍｏ ｂ遺伝子座を含まないことと、多重クローニング部位及び抗生物質耐性遺伝子を 含むことを特徴とする、第４図に示されたようなプラスミドｐＸＬ１６３５゜１ ０、更に、組換え体ＤＮＡを含むことを特徴とする、前記請求の範囲の１つに記 載のベクター。

１１、組換え体ＤＮＡが、遺伝子発現の調節配列の制御下に、１つ又はそれより 多くのポリペプチドをコードしている１つ又はそれより多くの構造遺伝子を含む ことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のベクター。

１２　構造遺伝子が、それ自身の調節配列又は異なる配列の制御下にあることが できることを特徴とする請求の範囲第１１項記載のベクタ１３、遺伝子発現の調 節配列が、プロモーター、ターミネータ−、シグナルペプチド及びリポソーム結 合部位から選ばれる１つ又はそれより多くの要素から成ることを特徴とする請求 の範囲第１１項又は１２項記載のベクター。

子から、好ましくは、アルブミン、ｔＰＡ、ＴＩＭＰ、インターログキン、アポ リポタンパク質及びインターフェロンから選ぶことができるタンパク質をコード していことを特徴とする請求の範囲第１１項記載のベクター。

１５、構造遺伝子（１つ又は複数の）が、遺伝子レベル又は生化学的レベルで、 代謝物の生合成に関係している遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第１１ 項記載のベクター。

国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／２ １ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ ＣＬ２Ｒ１：３８） （ＣＬ　２　Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：４０） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：４１） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） Ｉ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．殆どすべてのグラム陰性菌中で複製することができることと、大きな分離安 定性を有することと、非可動性であることを特徴とする、広い宿主範囲のクロー ニング及び／又は発現ベクター。
2. ２．グラム陰性菌中で広い宿主範囲を有する不和合性グループＰのプラスミド由 来の複製起点を有することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のベクター。
3. ３．プラスミドＲＫ２の複製起点を有することを特徴とする、請求の範囲第２項 に記載のベクター。
4. ４．プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域を有するＤＮＡフラグメントを含むことを特 徴とする、請求の範囲第１項に記載のベクター。
5. ５．ｍｏｂ遺伝子座が欠失している、請求の範囲第１項に記載のベクター。
6. ６．更に、多重クローニング部位を含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に 記載のベクター。
7. ７．更に、好ましくは抗生物質耐性遺伝子から成る選択可能なマーカーを含むこ とを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のベクター。
8. ８．グラム陰性菌中で広い宿主範囲を有するクローニング及び／又は発現ベクタ ーであって、該ベクターが、プラスミドＲＫ２由来のものであることと、サイズ が２０ｋｂより小さいことと、プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域を有するＤＮＡフ ラグメントを含むことと、ｍｏｂ遺伝子座を含まないことと、場合により多重ク ローニング部位及び選択可能なマーカーを含むこと、を特徴とするクローニング 及び／又は発現ベクター。
9. ９．プラスミドＲＫ２由来のものであることと、サイズが２０ｋｂより小さいこ とと、プラスミドＲＰ４のｐａｒ領域を有するＤＮＡフラグメントを含むことと 、ｍｏｂ遺伝子座を含まないことと、多重クローニング部位及び抗生物質耐性遺 伝子を含むことを特徴とする、プラスミドｐＸＬ１６３５。
10. １０．更に、組換え体ＤＮＡを含むことを特徴とする、前記請求の範囲の１つに 記載のベクター。
11. １１．組換え体ＤＮＡが、遺伝子発現の調節配列の制御下に、１つ又はそれより 多くのポリペプチドをコードしている１つ又はそれより多くの構造遺伝子を含む ことを特徴とする、請求の範囲第１０項に記載のベクター。
12. １２．構造遺伝子が、それ自身の調節配列又は異なる配列の制御下にあることが できることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載のベクター。
13. １３．遺伝子発現の調節配列が、プロモーター、ターミネーター、シグナルペプ チド及びリボソーム結合部位から選ばれる１つ又はそれより多くの要素から成る ことを特徴とする、請求の範囲第１１項又は１２項記載のベクター。
14. １４．構造遺伝子（１つ又は複数の）が、酸素、ホルモン及び成長因子から、好 ましくは、アルブミン、ｔＰＡ、ＴＩＭＰ、インターロイキン、アポリボタンパ ク質及びインターフェロンから選ぶことができるタンパク質をコードしていこと を特徴とする、請求の範囲第１１項記載のベクター。
15. １５．構造遺伝子（１つ又は複数の）が、遺伝子レベル又は生化学的レベルで、 代謝物の生合成に関係している遺伝子であることを特徴とする、請求の範囲第１ １項記載のベクター。
16. １６．代謝物が、ビタミン、抗生物質、アミノ酸及び他のバクテリア代謝物から 選ばれる、請求の範囲第１５項記載のベクター。
17. １７．代謝物が、ビタミンＢ１２、ビオチン、リボフラビン、リシン、トレオニ ン、メチオニン、ペニシリン及びテトラサイクリンから選ばれることを特徴とす る、請求の範囲第１６項記載のベクター。
18. １８．タンパク質又は代謝物を製造する方法であって、前記タンパク質をコード している構造遺伝子又は、遺伝子レベル又は生化学的レベルで、前記代謝物の生 合成に関係している遺伝子の１つ又はそれより多くを含む請求の範囲第１０項乃 至第１７項のいずれかに記載のベクターを、グラム陰性菌に導入することと、 このバクテリアを前記遺伝子の発現の条件下に培養することと、生成した前記タ ンパク質又は代謝物を回収する、ことを特徴とする方法。
19. １９．請求の範囲第１項乃至第１７項のいずれかに記載のベクターを含むグラム 陰性菌。
20. ２０．タンパク質又は代謝物を生産するための請求の範囲第１９項記載のバクテ リアの使用。
21. ２１．直接、生物学的転換反応における請求の範囲第１９項記載のバクテリアの 使用。