JPH02478A - 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 - Google Patents

部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法

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JPH02478A JP1099888A JP9988889A JPH02478A JP H02478 A JPH02478 A JP H02478A JP 1099888 A JP1099888 A JP 1099888A JP 9988889 A JP9988889 A JP 9988889A JP H02478 A JPH02478 A JP H02478A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、目的とする蛋白質生成物の観点からは不完全
なメツセンジャーＲＮＡ（以下ｍＲＮＡと略す）配列か
らの酵素による逆転写と有機合成を組み合わせることに
より部分的合成遺伝子を作製し、これを微生物により発
現させて所望のポリペプチドを得る方法に関する。
発現された好ましい生成物には、微生物を開裂させて生
物活性物質を生産する際に問題となる、真核性の発現生
成物に共通して存在する、生物活性を不活性化するリー
ダー配列が含まれていない。。
本明細書では、好ましい例として、ヒトの生長ホルモン
（例えば下垂体機能減退接手発育症の治療に有用である
）をコードする（暗号化する）遺伝子の作製およびその
発現について例示する。
遺伝子を構成しているＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、
蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構造遺伝子と、Ｒ
ＮＡポリメラーゼの結合部位、リボゾーム結合のための
情報部位などを提供することによって構造遺伝子の情報
の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の両者を含んでい
る。暗号づけされた蛋白質は、その対応するＤＮＡから
、微生物内で、？Ｉｌの過程を経て発現される。即ち、
■、調節領域（以下プロモーターという）内で酵素ＲＮ
Ａポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿っ
て移動し、その暗号づけされた情報をメツセンジャーリ
ボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写する。
この転写は１個またはそれ以上の終止コドンの位置で終
了する。
２、ｍＲＮＡの「伝言」は、リボゾームにおいて、その
ｌｌＲＮＡが暗号づけているアミノ酸配列を持った蛋白
質に翻訳される。翻訳は開始信号、大抵はＡＴＧ（これ
はｆ−メチオニンと翻訳される）から始まる。
ＤＮＡは遺伝暗号に従い、トリブレット、即ち、アデノ
シン、チミジン、シチジンおよびグアニン（以下各々Ａ
、Ｔ、ＣおよびＧと表わす）から個々別々に選ばれる隣
接する３個のヌクレオチドの「コドン」によって個々の
アミノ酸を指定する。これらはコードストランド（暗号
鎖）、即ち２本鎖（ｄｕｐｔａｘ）　Ｄ　ＮＡの暗号配
列中にある。２本鎖の残りの鎖、即ち「相補ストランド
」は、コードストランド中の相補体と水素結合するヌク
レオチド（塩基）で形成されている。ＡとＴ、およびＣ
（！：Ｇが相捕関係にある。本発明の背景となる上記の
事実およびその他の関連事項はＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎに詳しく述べられている＜Ｂｅｎｊａｍｉｎ　
Ｌｅｖｉｎ、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｉ　、
　２　（１９７４年）および３（１９７７年）。
Ｊ　ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｎ、　
Ｙ、）。
本明細書で言及するこの文献およびその他の文献につい
ては、参考までにその部度言及することとする。
ＤＮＡの組み換えには、別々のＤＮＡ断片の結合を促進
するために、その隣接末端を色々の態様に修復する種々
の方法を利用することができる。
ここでいう「結合Ｊとは、隣接するヌクレオチド間にホ
スホジエステル結合が形成することであり、これは大抵
の場合、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより達成される。例
えば平滑末端（鈍感末端）も直接結合することができる
。あるいはまた、隣接末端に相補性の１本鎖を含んでい
る断片は、水素結合によって、［結合］のためのそれぞ
れの位置に配置されるので好都合である。このような接
着末端と呼ハれる１本鎖は、ターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて鈍感末端にヌクレオチドを付加することに
より生成させることができる。またこれは、鈍感末端の
１本の鎖をλ−エキソヌクレアーゼの如き酵素で切り取
ることにより生成させることもできる。しかしこれは、
制限エンドヌクレアーゼ（以下制限酵素という）による
のが最も普通である。
・この制限酵素は、塩基対が４ないし６個の長さのヌク
レオチドの特異な配列（制限部位という）内またはその
隣接部位のホスホジエステル結合を切断するものであり
、多くの制限酵素およびその認識部位が知られている（
例えばＲ，Ｊ　、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　ＣＲＣＣｒ１ｔ
ｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　Ｉ　２３、（１９７６年１１月）参照）。多
くのものは互い違いに切断し、２本鎖断片の端に短い相
補性の１本鎖配列ができる。相補性配列であるので、は
みでた末端、即ち接着末端は塩基対によって再結合する
ことができる。２個の異なった分子をこの酵素で切断す
ると、相補性１本鎖が交叉した対をつくり、新しいＤ　
Ｎ　Ａ分子ができる。この新しいＤＮＡ分子は、アニー
リングした位置にある１本鎖の切断点を結合するりガー
ゼを用いて、共有結合した完全なＤＮＡ分子とすること
ができる。開裂した２本鎖ＤＮＡに「コターミナル」、
即ち鈍感末端を残す様な制限酵素の場合は、この鈍感末
端を他の鈍感末端配列のものと、例えばＴ４１Ｊガーゼ
により再結合して組換えすることができる。
本発明の目的に使用される「クローニング媒体」は完全
な「レプリコン」を含有する非染色体性の１つの２本鎖
ＤＮＡであり、この媒体は形質転換により中細胞生物（
微生物）に入れられた時、複製され得るものである。こ
の様に形質転換された微生物は形質転換体と呼ばれてい
る。現在クローニング媒体として一般に使用されている
のはビールスまたは細菌から得られるものであり、最も
普通にはプラスミツドと呼ばれる環状の細菌ＤＮＡであ
る。
最近の生化学の進歩により、例えばプラスミツドが外来
性のＤＮＡを含む様な、Ｕ組換型］クローニング媒体が
作製される様になった。特殊な例では、この組み換え体
はへテロローガスＤＮＡを含有することができる。ここ
でいうヘテロローガスＤＮＡとは、この組換型媒体によ
り形質転換することのできる微生物によって通常は産生
されないポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
例えば、プラスミツドを制限酵素で切断して結合可能な
末端を有する直鎖状ＤＮＡを得る。これを結合可能な末
端を持った外来性遺伝子と結合させると、生物学的機能
部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択するのに有
用な表現型の性質が付与されることになる。この組み換
え体を微生物に挿入して形質転換し、この形質転換体を
単離してクローン化する。この目的は外来性遺伝子のコ
ピーを３存している多数の転換体を得ることであり、ま
た特殊な場合には、さらにその遺伝子がコードしている
蛋白質を発現することにある。これに関連する技術およ
びその応用についてはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌｅｓに詳しく記載されている（ＭｉｌｅｓＩｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒ
ｉｅｓ　　Ｉ　Ｏ：　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌｅｓ　：　　Ｉ　ｏ＋ｐａｃｔ　ｏｎ　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｏｃｉｅＬｙ、　Ｂｅｅｒｓ　ａ
ｎｄ　Ｂｏｓｓｅ「「、ｅｄｓ、、　ＲａｖｅｎＰｒｅ
ｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　１９７７年）。
ｔｕφ２により遺伝子の数を増やすためにクローニング
媒体を使用することとは別に、遺伝子がコードしている
蛋白質を実際に発現しようという試みがなされ、そのい
くつかは成功している。その最初の例として、脳ホルモ
ン、ソマトスタチンがＱａＣプロモーターのコントロー
ルの下に大腸菌中で発現された（Ｋ、　Ｉ　ｔａｋｕｒ
ａ　ｅＬ　ａ（１，Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　１９８１０５６
．１９７７年）。極く最近、ヒトインシュリンのＡ鎖お
よびＢ鎖が同じ方法で発現され、結合されてこのホルモ
ンを生成した（Ｄ、Ｖ、ＧｏｅｄｄｅＩ　ｅｔ　ａＱ、
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１２．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ
Ｓ　Ａ７６１０６．１９７９年）。この両者では、遺伝
子はその全てを合成により作製したものであった。
いづれの場合も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的とする
生成物を分解するのは明らかであるので、その生成物を
複合体の形で、即ち、「隔ＩＪ（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎ
ｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）により目的物を保護し、そして
細胞外で切り離されることができて所望の生成物を与え
得る別の蛋白質と結合した複合体の形で生成させる必要
があった。この研究は本出願人の出願に係る英国特許Ｇ
Ｂ２００７６７５Ａ号、ＧＢ２００７６７ＯＡ号、ＧＢ
２００７６７６Ａ号およびＧＢ２００８１２３Ａ号明細
書に記載されている。
以上述べたいくつかの例で合成遺伝子による方法が有用
であることがわかったが、生成物がもっと大きい蛋白質
である場合、例えば成長ホルモン、インターフェロンな
どである場合には、それらの遺伝子はそれに応じてさら
に複雑であり、手軽に合成することができないという現
実的な問題がある。同時に、複合蛋白質を伴なっていな
い生成物を発現することが望ましいであろうが、この様
な発現の必要性から、使用する微生物を、目的とする生
成物を製造するのにもっと好適な微生物に変更しなけれ
ばならない。
ある研究者たちは、有機合成からではなく、組織から精
製した相当するｍＲＮＡからの逆転写により得られた遺
伝子を発現しようと試みた。この試みには２つの８題が
あった。まず第１は、逆転写酵素は所望の全アミノ酸配
列のためのｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を完成しない前に、
ｍＲＮＡからの転写を停止することがある、ということ
である。
従って、例えばＶ　１ｌｌａ　−ＫｏｔａａｒｏｌＴら
はラットのプロインシュリンのためのｃＤＮＡを得たが
、それにはそのインシュリンプリカーサ−（前駆体）の
最初の３個のアミノ酸のためのコドンが欠落していた（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’（ｊ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　７５３７２７．１９７８年）。次に
、プリカーサ−の形で発現されるポリペプチドのための
ｔａＲＮＡを逆転写したところ、生物活性蛋白質ではな
くそのプリカーサ−のためのｃＤＮΔが生成した。とこ
ろでこの生物活性蛋白質は、真核細胞内においてはリー
ダー配列が酵素的に切断除去された結果として生成する
ものである。現在まで、この様な機能を発揮する細菌は
知られていない。従って、ｍＲＮＡ転写体は、生物活性
蛋白質自体ではなくプリカーサ−の形の、リーダー配列
を含んだ発現生成物をう２遺してしまうのである（Ｖ　
１ｌｌａ　−Ｋｏｍａｒ。
「「、前記（ラットプロインシュリン）、Ｐ、Ｈ，Ｓｅ
ｅｂｕｒｇ　ｅｔ　ａＯＮａｔｕｒｅ　２７６．７９５
．１９７８年（ラットのプレ生長ホルモン））。最後に
、ヒトのホルモン類（またはそれらのプリカーサ−）を
１ＲＮＡ転写体から細菌により発現しようという試みで
は、明らかに細胞外で開裂され得ない複合蛋白質が製造
されただけであった（例えば、Ｖ　ｉｌｌａ−Ｋｏｍａ
ｒｏｒｒ、前Ｗｅ（、ペニシリナーゼ・プロインシュリ
ン）、Ｓ　ｅｅｂｕｒＬ前記（ベーターラクタマーゼブ
レ生長ホルモン））。
ヒト生長ホルモン（ＨＧＨ）はヒトの脳下垂体で分泌さ
れる。１９１個のアミノ酸からなり゛、分子量が約２１
，５００であるこのＨＧＨはインシュリンの３倍以上大
きい。これまで、ＨＧＨは限られた供給源、即ちヒトの
死体の下垂体から面倒な抽出によって得られるだけであ
った。この物質は絶えず不足しており、その適用は下垂
体機能減退楼小発育症の治療に制限されており、またそ
れですら、信頼できる計算によると、ヒト由来の］イＧ
Ｈは約５０％の患者に供給するのがやっとである。
従って、ＨＧ　Ｈおよびその他のポリペプチド生成物を
多量に製造し得る新規な方法を開発する必要があり、こ
の要求は、を機合成で製造するには大きすぎるか、従っ
てまた、全合成遺伝子を用いて微生物に発現させること
が困難なポリペプチド類において特に火急を要するもの
である。哺乳類のホルモンをｎ＋ＲＮＡ転写体から発現
する方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得ることを
約束するものではあるが、現在のところ、所望のホルモ
ンを実際に切り離すことのできない、生物活性のない１
９合体を微生物により製造することができるに過ぎない
。
本発明は、面倒な全合成による作製に頼らず、暗号配列
の実質的な部分、好ましくは大部分を逆転写により得、
一方その暗号配列の残りを合成することにより、生物活
性を不活性化するリーダー配列またはその他の異質蛋白
質を伴なっていない所望のポリペプチドを発現すること
のできる完全な遺伝子を得、この部分的合成遺伝子を発
現する方法を提供するものである。あるいは、この合成
による残りの部分は、外来性蛋白質が細胞外で開裂され
て生物活性体が得られる様に設計された、蛋白質分解に
抵抗する複合体を生成させるものであってもよい。従っ
て、本発明は、従来、組織から多額の費用をかけて抽出
することにより、限られた量だけ生産されていた種々の
物質、およびこれまで工業的に生産することの出来なか
ったその他の物質を、微生物学的に生産する方法を可能
にするものである。本明細書では、その最も好ましい実
施形式として、細胞内での蛋白質分解を避け、かつ細胞
外での開裂の間生物活性体を異質蛋白質中に隔離してお
く必要性を避けながら、医学的に重要なポリペプチドホ
ルモン（ＨＧＨ）をｉ［［ｌ　ｆｆｉ　Ｅより発現する
最初の例を提供する。本発明によって利用できる様にな
ったＨＧＨのための微生物資源により、下垂体機能減退
短小発育症の治療、並びにこれまで組織から得ていたホ
ルモンではまかないきれなかったその他の症状、例えば
汎発性胃内出血、仮関節、火傷治療、傷治療、ジストロ
フィーおよび骨結合用として、このホルモンを多量に提
供することが初めて可能となった。
本発明の以上述べた、およびその他の目的や特徴は以下
の記載および好ましい実施形式を例示した添付の図面か
ら、より明らかになるであろう。
第１図は、クローニングに使用するリンカ−開始信号Ａ
ＴＧおよびＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードす
る遺伝子断片を作製するための合成機構を示す。コード
ストランド、即ち上側の鎖（Ｌｌ）および相補性ストラ
ンド、即ち下側の鎖（し）の矢印は、描かれた断片の形
成に使用される第１／ゴヌクレオチドを表わしている。
第２図は、ＵおよびＬオリゴヌクレオチドを結合させて
第１図の遺伝子断片を形成させる結合媒体および該遺伝
子断片のプラスミツドクローニング媒体への挿入を示し
ている。
第３図には、下垂体ｍＲＮＡ転写体のＨａｅｌＩＩ制限
酵素断片のＤＮＡ配列（コードストランドのみ）が描か
れており、それらがコードしているヒト生長ホルモンの
アミノ酸も番号付けして記入しである。ここには非翻訳
ｍＲＮＡに相当するＤＮＡ（スト、プ以下）および主要
な制限部位も示されている。
第４図には、合成に由来しないＨＧＨのアミノ酸をコー
ドする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製およ
びヒト下垂体から単離されたｍＲＮＡからの逆転写によ
る相補ＤＮＡの形の該遺伝子断片の作製が示されている
。
第５図は、第２図および第４図のプラスミツドを用いて
、細菌内でＨＧＨを発現し得るプラスミツドを作製する
方法を示す。
本発明の一般的手法は、−緒になって所望の生成物の発
現をコードする複数個の遺伝子断片を、１つのクローニ
ング媒体中に組み合わせることにある。これらの内部な
くとも１個は、Ｕ　ｆ２１２ｒｉｃｈらの方法（Ａ、　
Ｕ（１２ｒｉｃｈ　ｅｔ　ａ（７，Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ上
旦旦１３１３．１９７７年）などにより組織から単離さ
れたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡ断片で
ある。このｃＤＮＡは目的生成物のためのコドンの実質
的な部分、好ましくは少なくとも大部分を提供し、一方
遺金倉の残りの部分は合成により供給される。この合成
による断片およびｍＲＮＡ転写による断片は別々にクロ
ーンし、最後の組合わせ段階での使用のために量産する
。
合成遺伝子と、ＭａｘａｍおよびＧ　１ｌｂｅｒｔ（Ｐ
　ｒｏｅ。
Ｎａｔ’（！　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７４　５
６０．１９７７年）の方法で決定された相補ＤＮＡの間
に、目的産物のためのコドンをどの様に分配するかは、
種々の考え方によって影響を受ける。逆転写によって得
られる相補ＤＮＡは必ず、少なくとも目的生成物のカル
ボキシル末端部のためのコドンを含有しており、そのカ
ルボキンル末端に隣接する翻訳終止信号の下流に非翻訳
ｍＲＮＡのためのその他のコドンを合せて含有している
。非翻訳ＲＮＡのためのＤＮＡの存在は、はとんど無関
係である。
この種の不当に長い配列は、所望の生成物のためのＤＮ
Ａを複製し、発現するのに使用される細胞源を確保しつ
つ、制限酵素による開裂等によって除去してもよい。特
殊な場合には、このｃＤＮＡは所望の全てのアミノ酸配
列と共に、目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドン
を含んでいる。
例えば、全部ではないが、多くのポリペプチドホルモン
は、リーダー配列や例えば細胞膜移送に関連する蛋白質
の信号配列を含んだプリカーサ−の形で発現される。真
核細胞内で発現される場合には、これらの配列は酵素に
より除去され、ホルモンはそのｙ！１１１Ｌだ形、即ち
生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし微生物細
胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないので、ｍＲ
ＮＡ転写体からこの様な信号配列やリーダー配列を除去
しておくことが望ましい。この様な除去操作中に、翻訳
開始信号も失なわれ、またほとんどの場合、目的産物の
ためのコドンの一部も失なわれる。本発明の部分的合成
遺伝子の合成による成分は、これらの後者のコドンを回
復するものであり、さらに、このハイブリッド（雑種）
遺伝子を最終的に挿入しようとしている媒体が適切に配
置された開始信号を欠いている場合には、新たに翻訳開
始信号を供給するものである。
前駆体生長ホルモンｃＤＮＡからのリーダー配列の除去
は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけている部分の内部
にある制限部位を利用することによって好適に行なうこ
とができる。しかし本発明はこの様な部位を利用できる
かどうかに無関係に実施することもできる。即ち、ｍＲ
ＮＡに由来しない遺伝子を広範囲に合成する必要性を避
けるための、所望のポリペプチドのアミノ末端に十分近
い場所の制限部位を利用できるかどうかに無関係に実施
することができる。所望のポリペプチドおよびリーダー
配列または他の生物活性を不活性化する配列をコードし
ているｃＤＮＡにおいて、後者のコドンと完全な（成熟
）ポリペプチドのためのコドンとの境界は、その完全な
ポリペプチドのアミノ酸配列かられかる。単に選択した
そのペプチドをコードしている遺伝子内へ消化していき
、望ましくないリーダー配列またはその他の配列を除去
すればよい。従って、例えば次の様なｃＤＮＡであると
すると、 ←　ａ　→　　←　ｂ　→ ５’　　ＴＴＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＴ、、。
３’　　ＡＡＴＴＣＧＧＧＡＣＴＡＧＣＡ、、。
１←　Ｃ→１←　ｄ　→ 〔ここで矢印は消化の終止を表わす〕 上側の配列ａおよびｂを除去する様にエキソヌクレアー
ゼ消化の反応条件を選ぶと、その後Ｓｌヌクレアーゼ消
化により下側の配列Ｃおよびｄが自動的に除去される。
あるいは、より正確には、デオキシヌクレオチドトリホ
スフェート（ｄ（Δ、Ｔ、Ｃ。
Ｇ）ＴＰ）の存在下でＤＮＡポリメラーゼ消化を行なう
こともできる。例えば、上の例では、ｄＧＴＰの存在下
でＤＮＡポリメラーゼを作用させて配列Ｃを除去しくＧ
で停止する）、次いでＳｌヌクレアーゼでａを消化する
。ｄＴＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させて
ｄを除去しくＴで停止する）、次いでＳｌヌクレアーゼ
でｂを切断する、等々（Ａ、　　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、Ｄ
ＮＡ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｐａ７−８８、　Ｗ、　
ト１．　　Ｆ　ｒｅｃｍａｎ　　ａｎｄ　　Ｃｏ、、　
　Ｓ　ａｎ　　Ｆ　ｒａｎｃｉｓｃｏ、１９７４年参照
）。
より好ましくは、Ｒａｚｒｎらのミスマツチ（不適切な
組み合せ）修復合成法（Ａ、　　Ｒａｚｉｎ　ｅｔ　ａ
Ｑ、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬ’Ｑ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ　７５，４２６８．１９７８年）を利用して、目的産
物をコードしているｃＤＮＡの部分内の好都合な位置に
制限部位を作ツリしてもよい。この方法によって、ミス
マツチ置換置を含んでいるブライマーを用いて存在して
いるＤＮＡ配列中の１個またはそれ以上の塩基を置換す
ることができる。少なくとも７種の回文的４−塩基対配
列が、既知の制限酵素によって特異的に認識される。そ
れらは、八ＯＣＴ　（Ａ　Ｑｕ　Ｉ）、ＣＣＧ　Ｇ　（
Ｈｐａ　［１）、ＣＧＣＧ（Ｔｈａ　［）、ＧΔＴＣ（
Ｓａｕ３Ａ）、ＧＣＧＣ（Ｈｈａ）、ＧＧＣＣ（Ｈａｅ
■）およびＴＣＧΔ（Ｔａｑｌ）である。確率的には非
常にしばしばあり得ることであるが、ｃＤＮＡ配列が、
上記の様な認識部位と１個の塩基だけが異なっている配
列を含んでいる場合は、修復合成によって、適切な置換
塩基を含んでいる、従って所望の制限部位を含有してい
る複製ｃＤＮＡが得られる。開裂によって望ましくない
リーダー配列のＤＮＡが除去され、その後、完全なポリ
ペプチドの発現に必要なコドンが合成により回復される
（下式参照）。
ミスマツチ修復合成 １←　目的産物のコドン→１ 勿論、所望によりもっと長い制限部位を同様にして挿入
することができるし、また、希望する位置に、その制限
部位に共通している塩基が２個しか存在しない場合でも
、連続修復によって４−塩基−制限部位を作製すること
ができることは容易に理解されるはずである。
この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だけでなく、外
来性ではあるが特別に設計したある大きさの蛋白質を発
現するのが望ましい場合にも応用される。この様な応用
例として次の４種類のものを挙げることができる。まず
第１に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋白と結合する
ことによって免疫原性が付与されるハブテンまたはその
他の免疫決定因子を発現してもよく、この様にしてワク
チンが製造され得る（英国特許第２００８１２３Ａ号明
細書参照）。また、生物学的安全性の見地から、目的と
する生成物を、細胞外で開裂して活性体に変換し得る様
に設計したその他の生物活性不活性化蛋白質との複合体
の形で発現してもよい。
第３の応用は、細胞膜を通って排泄された生成物の輸送
信号ポリペプチドを開裂することが出来るならば、所望
の生成物の前に輸送信号ポリペプチドをつけて、細胞膜
を通して排泄させることにより目的産物を製造すること
ができる。最後に、細胞外で特異的に開裂され得る様に
設計された外来性蛋白質との？１合体は、そうしなけれ
ば微生物宿主にとって内因性の蛋白質分解酵素で容易に
分解されてしまう目的産物を隔離するのに使用し得る。
これらの内、少なくとも最後の３つの応用例では、ｍＲ
ＮＡ転写体の暗号配列を完全にする為に使用される合成
によるこの「アダプター分子」は、例えば酵素の作用に
よって特異的に開裂され得るアミノ酸配列のためのコド
ンをさらに持っていてもよい。例えばトリプシンまたは
キモトリプシンはアルギニン−アルギニン（ａｒｇ　−
ａｒｇ）またはりジン−リジン（ｌｙｓ　−Ｉｙｓ）な
どで特異的に開裂する（英国特許第２００８１２３Ａ号
、前記） 以上記載したことから明らかな様に、本発明は非常に多
方面の応用性を持っており、それらはいづれら以下に述
べる共通した特質をもっている。
■。目的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な
部分をコードしているａ＋ＲＮΔ転写体であるが、それ
自体を発現した場合、目的産物より大きいかあるいは小
さい、異なったポリペプチドが産生されるであろうｍＲ
ＮＡ転写体を使用する。
２、目的産物に含まれているアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列のための蛋白質暗号化コドンが存在する場合は、
これを除去する。
３、有機合成により、所望の配列の残りの部分をコード
する断片を製造する。
４、ｍＲＮＡ転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これをｔ
ｕ製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、ま
たは異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切
断し得る目的産物を発現する。
勿論、発現生成物はいづれの場合も、翻訳開始信号によ
って暗号化されているアミノ酸から始まる（ΔＴＧの場
合はｒ−メチオニン）。これは細胞内で除去されると期
待し得るし、またいづれにせよ、最終生成物の生物活性
には本質的な影響を与えないと期待し得る。
本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の製造に一般に
利用し得るものであるが、特に哺乳動物のポリペプチド
ホルモン類およびその他の医療に使用し得る物質、例え
ばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、すい臓性ポリペ
プチド、アドレノコルチコトロピン、ベーターエンドル
フィン、インターフェロン、ウロキナーゼ、凝血因子、
ヒトアルブミンなどを発現するのに特に適している。以
下に本発明の好ましい実施形式を記載するが、これは、
ヒト生長ホルモンをコードする部分的合成遺伝子を作製
し、クローンし、そして微生物により発現するものであ
る。
ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒体の作製およ
び発現 １、ｍＲＮＡ転写体のＨａｅｍ断片のクローニング ＵＱＱｒｉｃｈらの方法により、ＨＧ　Ｈのためのポリ
アデニル化ｍＲＮＡを、下垂体生長ホルモン産生Ｉｔ！
ｒ！瘍から作製した（Ａ、　Ｕ（！（ｌｒ４ｃｈ　ｅｊ
　ａｎ、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ土旦６，１３］３．１９７
７年）。Ｗｉｃｋｅｎｓらの方法に従い、このＲＮＡ５
μｇから２本鎖（ｄｓと略す）ｃＤＮＡ　１．５μｇを
作製した（Ｗｉｃｋｅｎｓ　ｅｔ　ａσ、Ｊ。
Ｂｉｏ（、ＣｈｅｒＲ，２５３２４８３，１９７８年）
。ただし、２計百の鎖の合成には、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの代りにＲＮＡポリメラーゼｒＫ　Ｉｅｎｏｖ　ｆｒ
ａｇｍｅｎＬｊを使用した（Ｈ，Ｋｌｅｎｏｗ、　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｒｔ’（、Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ
Ａ、昼５　１６８゜１９７０年）。ＨＧｌｌのｊｂｌｌ
　１ｌＩｉパターンについては第３図に示す様に、Ｈａ
ｅｌｌｌ制限部位が３″非暗領域内およびＨＧ　Ｈの２
３および２４番目のアミノ酸をコードする配列内に存在
する。このｄｓ　ＨＧＨｃＤＮＡをＨａｅ■で処理する
とＨＧＨの２４から１９１９１番目ミノ酸をフードする
５５１の塩基対（ｂｐと略す）からなるＤＮＡ断片が得
られる。例えばｃＤＮＡ９０ｎｇをｔ（ａ＋ＪＩで処理
し、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、５５０
ｂｐの領域を溶離すると、約１ｎｇのｃＤＮＡが得られ
る。
Ｂ　ｏｌ　１ｖａｒらの方法によって調製したｐＢ　３
２２を、このｃＤＮＡのためのクローニング媒体として
選択した（Ｆ　、　Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａ（１，Ｇ
ｅｎｅ　２　９５−１１３．１９７７年）。ｐＢＲ３２
２の特徴は十分に解明されており（Ｊ、Ｇ、５ｕｔｃｌ
ｉｆｒｅ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ±３　７０，１９７８年釡照）、これ
は多数のコピーを′ｆ！；１製するプラスミツドである
。また、このプラスミツドはアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性遺伝子（それぞれＡｐＱ％　Ｔｃ”と表
わす。第４図参照）を含んでいるのでアンピシリンおよ
びテトラサイクリンの両者に対して耐性を有し、また、
制限酵素Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲｌおよびＨｉｎｄｌ［Ｉの
認識部位を含んでいる。
ＨａｅｌおよびＰｓＬＩの両者とも、それによる開裂生
成物は鈍感末端を有する。従ってＣｈａｎｇらのｒＧＣ
ティリング法Ｊ（ｃｈａｎｇ、　Ａ、　Ｃ，Ｙ、ｅｔ　
ａ（１，ＮａＬｕｒｅ　２７５　６’ｌ　７．１９７８
年）を用いて、ｐＢＲ３２２をＰｓＬＩで開裂した鈍感
末端生成物とｓＲＮ八転再転写体ａｅｌｌｌで消化した
ものを結合することができ、ｃＤＮＡ断片をｐＢＲ３２
２のＰｓＬ１部位に挿入してｃＤＮＡ上にＨａｅｌＩＩ
制限部位（ＧＧ↓ＣＣ）を復元する一方、その挿入体の
それぞれの末端にＰｓｔｒ制限部位（ｃＴＧＣＡ↓Ｇ）
を復元することができる。
前記した様に、ターミナルデオキ／ヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、３’末端に約２０
ｄＣを付加した（ｃｈａｎｇ、Ａ、Ｙ、Ｃ，、前記）。
同様にして、６０ｎｇのＰｓｔｌで処理したｐＢＲ３２
２の３′末端に約１０個のｄＧを付加した。
このｄＣ付加ｄｓｃＤＮ八へｄＧ付加ベクター（媒体）
ＤＮＡを、１０ｍＭトリス−１−（ｃｌ２（ｐＨ７，５
）、１００ｎ＋Ｍ　ＮａＣｌ２５０．２５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａの１３０μＱ中でアニーリングした。この混合物をＥ
、Ｃｏｆ２ｉＸＩ７７６の形質転換に使用する前に、７
０°Ｃに加熱し、徐々に３７°Ｃまで冷却しく１２時間
）、次いで２０°Ｃに冷却した（６時間）。
Ｘｌ７７６でクローンしたこのプラスミツドｐＨＧＨ３
１につき、ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ’　Ｑ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、
　Ｕ　ＳΔ　７４　５６０．１９７７年）を用いてＤＮ
Ａ配列を分析した結果、第３図に示す様にＦ（ＧＨの２
４から１９１のアミノ酸のためのコドンが確認された。
Ｅ、Ｃｏｇｉ　Ｋ　−１２株Ｘ１７７６はＦ　−ｔｏｎ
　Ａ５３ｄａｐＤ　８ｒｓｒｎ　Ａ　ｌ　　５ｕｐＥ　
４２　　△４０Ｃｇａ１２ｕｖｒＢ）　　λ−Ｌｌｉｎ
　　Ｂ　　２　　ｒｆｂ−２ｎａ１２Ａ　２　５　　ｏ
ｓｓ２　ｔｈｙＡ　５７　ｍｅＬｃ　６５　ｏｓｓ　−
１△２９　［ｂｉｏＨａｓｄ）　ｃｙｃＢ　２ｃｙｃＡ
　ｌ　　ｈｓｄＲ２の遺伝子型を有する。Ｘ１７７６は
アメリカ予防衛生研究所（ＮＩＨ）により、ＥＫ２宿主
ベクター系として公認されている。
ｘ１７７６はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）偏性要求性
菌であり、ムコ多糖類コラン酸（ｃｏｌａｎｉｃ　ａｃ
ｉｄ）を合成することができない。従って、細胞の代謝
および生長を支えるに十分な栄養は存在しているが、Ｄ
ＡＰが欠乏している環境ではＤＡＰ欠乏で死亡する。こ
れはチミンまたはチミジンを要求し、代謝活性を維持す
るに十分な栄徨はあるがチミンおよびチミジンがない環
境では、ＤＮＡの崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する
。Ｘ１７７６は胆汁に対する感受性が極めて強く生存す
ることができない。従ってラットの胃腸管を生きて通過
することができない。また、Ｘ１７７６は洗剤、抗生物
質、薬物および化学薬品に対して感受性が非常に強い。
ざらにＸ１７７６は紫外線による損傷を暗回ｔＷまたは
光回復することができず、従って、野生型のＥ、Ｃｏ１
１（大腸菌）より太陽光に対する感受性が数オーダー強
い。Ｘｌ７７６は多（の形′ｆｆｊＳ人ファージに対し
て抵抗し、種々の突然変異かために、異なったタイプの
Ｆ’１合プラプラスミツドｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ｐｌ
ａｓａ＋１ｄｓ）の遺伝には２９合が不十分である（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）。Ｘ　Ｉ
　７７６は、ナリジクシックアシッド（ｎａｌｉｄｊｘ
ｉｃ　ａｃｊｄ）、サイクロセリンおよびトリメトプリ
ムに対して抵抗性がある。従って、これらの薬物を培地
に加えることにより、この株をモニターし、形質転換中
、汚染菌の形質転換を不可能にすることができる。
Ｘ１７７６は、１０１００ｌ１ΔＰ／ｍ＆および４μｇ
チミジン／ｍＱを追加したしブロスまたはベナセイ（Ｐ
　ｃｎａｓｓａｙ）ブロス中、約５０分の世代時間で生
長し、定常期には８〜ｌ０ＸＩ０８細胞／ｍρの密度に
達する。１〜２分渦巻き状にそして前後にゆっくり振盪
して細胞を１００％生存可能の状ｌｆ！、に保って懸濁
する。Ｘ１７７６についてのさらに詳しいことはＣｕｒ
ｔｉｓらの文献を参照のこと（Ｒ。
Ｃｕｒｔｉｓ　ｅｔ　ａ／、、Ｍｏ１ｅｃｕりａｒ　Ｃ
Ｉｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＤＮ
Ａ、９９−１７７、Ｓ　ｃｏｌｔ　ａｎｄ　Ｗｅｒｎａ
ｒ　ｅｄｓ、＋Δｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ、　Ｎ
、　Ｙ、　１９７７年）。
Ｘ１７７６は１９７９年７月３日、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された
（Ａ　Ｔ　ＣＣ番号３１５３７、無制限寄託）。
ＨＧ　Ｈ部分的合成遺伝子の作製計画は、ｍＲＮＡ転写
体と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂
部位を有する合成遺伝子を作成することであった、従っ
て、第１図に示す様に、このＨＧ　Ｈの最初の２４個の
アミノ酸のための合成遺伝子は、２３番目のアミノ酸に
続いてＨａｅ［開裂部位を含んでいる。この合成断片の
遠位末端にはリンカ−が設けられている。このリンカ−
により、合成断片は、ｍＲＮＡ転写体および合成断片が
最終的に結合するプラスミツドの、制限開裂によって生
じる１本鎖末端とアニーリングすることができる。
第１図に示す様に、２本鎖断片の５°末端には、Ｅｃｏ
ＲｌおよびＨｉｎｄｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼのた
めの一末鎖接舒末端が含まれており、これによりプラス
ミツドの作製が容易に促進される。左末端のメチオニン
コドンは翻訳開始部位を提供している。１ｌｆｆｔ体か
ら１６ｆｆｉ体の種々の大きさの１２本の異なったオリ
ゴヌクレオチドをＣｒｅａ）改良ホスホトリエステル法
により合成した（ｃｒｅａ。
Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ！、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ　　７５　５７６５．１９７８年）。ＵｌからＵ６、
およびし、からｌ、６のこれらのオリゴヌクレオチドは
矢印で示しである。
１０ｇｇのＵ、からＵ、およびＬ２からＬ６を、公知の
方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび（７
”−Ｐ）ＡＴＰを用いて加端酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ
ｌａｔｅ）　した（Ｇ　ｏｅｄｄｅ（、Ｄ　、　Ｖ　、
ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ’　（ｉ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６　１０６．１９７９年
）。
Ｔ４リガーゼを触媒として用いた３つの別々の反応を行
なった：即ち、１０ｇｇの５°−ＯＨ断片Ｕ１を加端酸
化したＵ　＝、　Ｌ　ｓおよびＬ６と結合し：加端酸化
したＵ、、Ｕ、、Ｌ３およびＬ４を結合し：そして１０
ｇｇの５”ＯＨ断片し、を加端酸化したし、。
Ｕ、およびＵ８と結合した。これらの結合反応は３００
ｔｔ（ｌの２ＱｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍ
ＭＭｇＣＬ、１０ｍＭジチオトレイット、０．５＋ｎＭ
ＡＴＰ中、Ｔ、リガーゼ１００単位を用い、４℃で６時
間行なった。次いで、これらの３種の結合混合物を合わ
せ、Ｔ４リガーゼｌｏｏ単位を加え、２０°Ｃで１２時
間反応させた。この混合物ヲエタノールで沈殿させ、１
０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。８４塩
基対移動帯をゲルから切取り、溶離した。ｐＢＲ３２２
（１８ｇ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ［ｌで処理し、
大きい断片をゲル電気泳動法で単離し、合成ＤＮＡと結
合した。
この混合体を用いてＥ、Ｃｏｆｆ１．　Ｋ　−１２株２
９・１（ｅｎｄΔ、ｔｈｉ−、ｈｓｒ−、ｈｓＩＩｌｋ
”　）を形質転換した。
２９４株は１９７８年１０月３０８、Ａ　Ｔ　ＣＣ＋、
：寄託された（Ａ　Ｔ　ＣＣ番号３１４４６、無制限寄
託）。１個の形質転換体のプラスミツドｐＩ（ＧＨ。
からのＥ　ｃｏＲｌ　−Ｈ１ｎｄｌＩ［挿入体の配列を
Ｍａｘａ１１＋およびＧ１１ｂｅｒｔの方法（前記）に
より分析した結果、第１図に示した通りであることを確
認した。
ｐＨＧ　Ｈ３中の合成断片およびｐＨＧＨ３１中のｍＲ
ＮＡ転写体を用い、発現用プラスミツドｐＧＨ６を使用
して、第５図に示す様に、両方の断片を含有するｔｔｉ
製可能なプラスミツドを作製した。まず、縦列１ａｃプ
ロモーターを含有するこの発現用プラスミツドを次の様
にして作製した。Ｂ　ａｃｋｍａｎらの方法に従い、９
５塩基対の非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）　Ｄ　
Ｎ　Ａ断片で分離されている２個の９５塩基対Ｕ　Ｖ　
５　Ｑａｃプロモーター断片を含有する２８５塩基対Ｅ
ｃｏＲ１断片をプラスミツドｐＫ　Ｂ　２６８から単離
した（Ｋ、　Ｂａｃｋｍａｎ、ｅＬ　ａ１２．、　Ｃｅ
１ｌ　　１３巻　６５−７１．１９７８年）。この２８
５塩基対断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位に挿入し
、テトラサイクリン耐性遺伝子を持った適切な解読川内
に向って配置しているプロモーター群を有するクローン
ｐＧＨ１を単離した。このテトラサイクリン耐性遺伝子
から遠位のＥｃｏＲ１部位をＥｃ。
Ｒｒによる部分消化で破壊し、その結果得られる１本ｍ
ＥｃｏＲ１末端をＤＮＡポリメラーゼ１で昨復し、鈍感
末端結合によりプラスミツドを円環化した。作成された
プラスミツドｐＧＨ６は、完成したＨＧＨ用遺伝子を挿
入することができるプロモーター系について適切に配置
された単一のＥｃ。
Ｒ１部位を含有している。
ＲＮＡ転写体と結合させるための合成断片を得るために
、１０８ｇのｐＨＧＨ３をＥｃｏＲＩおよびＨａｅｍ制
限エンドヌクレアーゼで開裂させ、ＨＧｌ］アミノ酸１
〜２３の暗号配列を含有している７７塩基対断片を８％
ポリアクリルアミドゲルで分離した。
次いで５μｇのプラスミツドｐＨＧＨ３１をＨａｅ■で
切断した。５５１塩基対ＨＧ　Ｈ配列および一緒に移動
したｐＢＲ３２２の５４０塩基対をゲル電気泳動法によ
り精製した。次いでＸｍａｒで処理してＨＧＨ配列のみ
を切断し、３″非コード領域から３９塩基対を除去した
。得られた５１２塩基対断片を、５４０塩基対のｐ［３
Ｒ３２２Ｈａｅ［ｌ断片から、６％ポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動により分離した。０．３μｇの７
７塩基χ＝ｊＥｃｏＲｌ　−Ｈａｅ［［ｌ断片を１６μ
ｉ！の反応液中、Ｔ、ｌＪが−セを用いて４°Ｃで１４
時間ポリメリ化した。
Ｊカーゼを不活性化するために、この混合物を７０°Ｃ
で５分間加熱し、次いでＥｃｏＲＩ　（ＥｃｏＲ１部位
によってダイマー化（三爪化）した断片を開裂するため
）およびＳ　ｍａ　Ｉ　（Ｘｍａ　Ｉダイマーを開裂す
るため）で処理し、ＥｃｏＲ１接４末端および５ＩＩｌ
ａ１鈍感末端を有する５９１塩基対断片を得た。６％の
ポリアクリルアミドゲルを用いて精製し、この断片約３
０ｎｇを得た。ところで、発現用プラスミツドｐＧＨ６
はＸｍａｌ認識部位を含んでいないことに留意すべきで
ある。しかしながら、Ｓ　ｍａ　１はＸｍａｌと同じ部
位を認識し、しかしその中間部を切断し、鈍感末端を生
成するのである。従ってｐＨＧＨ３１から導かれたこの
断片の５ｆｆｌａ−切断末端は、鈍感末端でｐＧＨ５に
結合していくことができる。
縦列１２ａｃＵＶ５プロモーターを含む発現用プラスミ
ツドｐＧＨ６を、順次ＨｉｎｄＩ［Ｉ、ヌクレアーゼＳ
ｔおよびＥｃｏＲＩで処理し、ゲル電気泳動法により精
製した。この様にして得たＩＩのＥｃｏＲ１接着末端お
よび１個の鈍感末端を有するベクター５０ｎｇを、１０
ｎｇの５９１塩基対ＨＧＨＤＮＡと結合させた。この結
合混合物を用いてＥ、Ｃｏ（２ｉＸＩ７７６を形質転換
した。テトラサイタリン（１２，５μｇ／ｍのに抵抗し
て生長するコロニーを選択した。ハイブリッド（雑種）
　ＨＧ　ｌ−１遺伝子をｐＧＨ６に挿入することによっ
てテトラサイクリン耐性遺伝子のためのプロモーターが
破壊されるが、１列１２ａｃプロモーターによってテト
ラサイタリン耐性のための構造遺伝子が通読され、この
選択特性が保持されることに注目すべきである。この様
にして約４００の形質転換体を得た。Ｇ　ｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法によるフィルターハイブリ
ダイゼーシコンによってＨＧＨ配列を含む１２のコロニ
ーを確認した（　Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ’　Ｑ、　Ａ
　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　ＳΔ、７２　３９６１　
１９７５年）。これらのコロニーの内、３種のコロニー
から分離したプラスミツドが、Ｉ（ａｅ［Ｉ、Ｐｖｕ■
およびＰｓｔｌで開裂した時、期待する制限パターンを
示した。１ｇのクローン、ｐＨＧＩ−１１０７のＤＮＡ
配列を測定した。
この形質転換体によって発現されたヒト生長ホルモンは
、ファデバスＨＧ　Ｈブライストキット（Ｐｈａｄｃｂ
ａｓ　ＩＩＧＨＰＲＩ　ＳＴ　　Ｋｉｔ、　Ｆａｒｍａ
ｃｉａ）を用い、溶菌上澄液を順次希釈したものを直接
放射免疫分析することにより簡単に検出された。
ＨＧ　Ｈの発現がＱａｃプロモーターのコントロール下
（支配下）で行なわれたことを示すために、ｐｌ（Ｇｌ
−１１０７を＋ｊａｃレプレッサーを過剰生産するＥ、
Ｃｏ１１株Ｄ　Ｉ　２１０Ｃａｃ＋（ｉＱｏ＋　Ｚ　’
ｙ＋）に入れた。インデューサー、ＩＰＴＧ（イ°／プ
ロピルチオガラクトシド）を添加するまで、宵意な量の
ＨＧ　Ｈ２現生成物は検出されなかった。
ｐＨＧＨ１０７のＥｃｏＲ１部位を除去することにより
、（ｊａｃプロモーターのりボゾーム結合部位コドンと
ΔＴＧ開始信号との距離は、天然におけるそのリボゾー
ム結合部位コドンとβ−ガラクトシダーゼのための開始
信号との間の距離と同じになるであろう。この天然の距
離を模倣することによって発現が増加するかどうかを調
べる為に、ｐｌ（Ｇ　Ｈ１０７をＥｃｏＲｌで開裂し、
得られた１本鎖末端をＳｌエンドヌクレアーゼで消化し
、次いでＴ４リガーゼを用いて鈍感末端結合して再環化
することにより、ｐＨＧＨ１０７をｐＨＧＨ１０７−１
に変換した。この様にして得たプラスミツドは同様にＨ
ＧＨを発現することができるけれども、驚くべきことに
、発現の程度はｐＧＨ１０７より低いことが直接放射免
疫分析によってわかった。
本発明は上に述べた好ましい実施形式を限定されるので
はな（、特許請求の範囲の記載によってのみ限定される
ものであることは、当業者には容易に理解されるだろう
。プロモーター系、現プラスミツド、目的とするポリペ
プチド生成物またはその他の因子を種々選択し直すこと
により、これまで述べたものに種々の変更を加えること
は勿論可能である。例えば、他のプロモーター系を本発
明において使用することができる。この様なプロモータ
ー系としてはラムグープロモーター、アルビノースオペ
ロン（Ｐｈｉ　８０ｄ　ａｔａ）、またはコリシンＥｌ
、ガラクトース、アルカリホスファターセあるいはトリ
プトファンプロモーター系などを挙げることができる。
細菌による発現のために使用する宿主生物としては、例
えばエンテロバクテＪアケア（Ｅ　ｎＬｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば大腸菌株、サルモネラ（Ｓ
　ａｈ＋ｏｎｅｌ　Ｉａ）　；バシラーケア（Ｂａｃｉ
ｌｌａｃｅａｅ）、例えば枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ　
５ｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐ　ｎｅｕｍｏｃｏｃ
ｃｕｓ）　；連鎖球菌（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
）　：およびインフルエンザ閑（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ　ｉｒ＋４１ｕｅｎｚａｅ）などが挙げられる。勿論
、どの微生物を選ぶかによって、アメリカ予防衛生研究
所の組み換えＤＮＡのためのガイドライン（４３Ｆ　ｃ
ｄ、　Ｒｅｇ。
６０．０８０．１９７８年）に従って行なわれなければ
ならないクローニングおよび発現操作において、物理的
封じ込めの程度を調節しなければならない。
本発明は実験室規模で実施するのは好ましいけれども、
Ｅ、ＣｏｅｉＸ　ｌ　７７６は、生物学的安全性の為に
故意に虚弱性が導入されているので、大規模に工業生産
するには限界があることがわかった。
生物学的封じ込めよりも、むしろ適当な物理学的封じ込
めを行なえば、Ｅ、　Ｃｏ（１’＋、　Ｋ　−１２株２
９４（前記）およびＥ、Ｃｏ１２ｉ、株ＲＲＩ、遺伝子
型：Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈ１−　Ｒａ−ｒｅｃＡ＋ｓｔ
ｒ’　Ｌａｃｙの様な微生物を大規模操作に使用するこ
とができる。Ｅ、　Ｃｏｆｆ１．　ＲＲＩは、Ｈｒｒド
ナー（高頻度組換型供与菌）としてのＥ、Ｃｏρｉ、Ｋ
１２株ＫＬＩ６とかけあわせることにより、Ｅ、Ｃｏｊ
ｉ、ＨＢＩＯＩ（Ｈ、Ｗ、　Ｂ　ｏｙｅｒら、Ｊ１Ｍｏ
Ｉ２．８ｉｏ、４１　４５９４７２．１９６９年参照）
から得ることができる（　Ｊ　、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ、
　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ（７
ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；　Ｃｏ１２ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２年参照
）。Ｅ、　Ｃｏ１２ｉ、ＲＲＩは、１９７８年ＩＯ月３
０日、ＡＴＣＣに寄託されたく無制限寄託、ＡＴＣＣ番
号３１３４３）。Ｘ１７７６株も同様に１９７９年７月
３日、ＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ番号３１５３７
）。その池、プラスミツドｐｔｌＧＩ−１１０７（ＡＴ
ＣＣ番号４００１１）、ブラスミ、ドｐＧ　Ｈ６（ＡＴ
ＣＣ番号４００１２）、ｐＨＧＨ１０７で形質転換した
Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ番号３１５３８）およびｐＧＨ
５で形質転換したＥ、ＣｏＣ１Ｋ　ｌ　２株２９４（Ａ
ＴＣＣ番号３１５３９）も１９７９年７月３日、ＡＴＣ
Ｃに寄託された。
本発明によって製造される微生物は、ヒト生長ホルモン
を工業的スケールで発酵により製造する方法に使用する
ことができ、多ｍの生成物を得ることができ、従来不可
能であった分野に使用することができる。例えば形質転
換Ｅ、Ｃｏ（ｉ株は、常法により通気し、攪拌している
Ｍ鉄製またはその他の発酵容器中の水性培地、例えば、
適当な栄養物（例えば炭水化物またはグリセロール）、
硫［７ンモニウムの様な窒素源、燐酸カリウムの如き力
Ｊラム源、微量元素、硫酸マグネシウムなどを含んだ、
はぼ中性ｐＨの（例えばｐＨ７±０．３）、約３７°Ｃ
の水性培地中で増殖させることができる。
形質転換微生物は、抗生物質耐性の如き１またはそれ以
上の選択特性を示すことが好ましく。それによって選択
圧がかかって野生型Ｅ、Ｃｏ（ｉの競合増殖が抑制され
る。例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性
微生物の場合、その抗生物質を発酵培地に加え、それに
対する耐性を持っていない野生型生物を選別することが
できる。
発酵が完了したら細菌懸濁液を遠心分離するかあるいは
ブロスから細胞固形物を集め、次いで物理的または化学
的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残骸を除去し、
可溶性生長ホルモンを単離精製する。
ヒト生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれか
の方法により、またはそれらを組み合わせることによっ
て精製することができる。（１）ポリエチレンイミン分
別法、（２）セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ
　　２００によるゲル濾過クロマトグラフィー、（３）
ビオレックス（Ｂ　１ｏｒｅｘ）　　７０レジンまたは
ＣＭセファデックスによるイオン交換クロマトグラフィ
ー、（４）硫酸アンモニウムおよび／またはｐＨ分別法
、および（５）バイブリド−マス（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ｓ）または免疫感作動物から単離した抗−ＨＧＨＩｇＧ
から調製した抗体レジンを用いたアフィニイティークロ
マトグラフィー；このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードする
遺伝子を含有する合成遺伝子断片の模式図、第２図は合
成遺伝子のプラスミツドへの挿入を示す模式図、第３図
はＨＧ　ＨをコードしているｍＲＮＡ転写体のＤＮＡ配
列を示す模式図、第４図はｍＲＮＡ転写体のプラスミツ
ドへの挿入を示す模式図、第５図はＨＧ　Ｈを発現し得
るプラスミツドの作うツを示す模式図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）特定の所望のポリペプチドをコードしている
    、合成りＮＡおよびｃＤＮＡの両者から誘導されたＤＮ
    ＡからなるＤＮＡ配列を微生物中で発現し得る複製可能
    なクローニング媒体で該微生物を形質転換し、 （ｂ）該形質転換微生物を、旺盛な増殖を維持するに必
    要な適当な栄養培地中、通気、撹拌下で培養し、 （ｃ）生産されたポリペプチドを培養混合物から分離す
    ることからなる、該ポリペプチドの生産方法。 ２、合成ＤＮＡ部分が特異的に開裂し得るアミノ酸配列
    を更にコードしており、この配列により細胞外で開裂さ
    せて特定の所望のポリペプチドを生産することができる
    第１項に記載の方法。 ３、特定の所望のポリペプチドがヒト成長ホルモンであ
    る第１項に記載の方法。 ４、特定の所望のポリペプチドがヒト成長ホルモンであ
    る第２項に記載の方法。 ５、ヒト成長ホルモンがそのリーダー配列またはその他
    の異質蛋白質を伴なわずに発現される第３項に記載の方
    法。
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