NO167674B - Fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid. - Google Patents

Fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid. Download PDF

Info

Publication number
NO167674B
NO167674B NO86860680A NO860680A NO167674B NO 167674 B NO167674 B NO 167674B NO 86860680 A NO86860680 A NO 86860680A NO 860680 A NO860680 A NO 860680A NO 167674 B NO167674 B NO 167674B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
plasmid
polypeptide
dna
gene
fragment
Prior art date
Application number
NO86860680A
Other languages
English (en)
Other versions
NO167674C (no
NO860680L (no
Inventor
David V Goeddel
Herbert L Heyneker
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26733870&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO167674(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO860680L publication Critical patent/NO860680L/no
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of NO167674B publication Critical patent/NO167674B/no
Publication of NO167674C publication Critical patent/NO167674C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et plasmid som i en mikrobiell organisme kan utrykke et spesielt polypeptid med kjent aminosyresekvens, hvor et gen som koder for polypeptidet er innført i en et plasmid og satt under kontroll av en ekspresjonspromoter.
Genetisk ekspresjon:
DNA (deoksyribonukleinsyre) hvorfra gener fremstilles, omfatter både proteinkodende eller "strukturelle" gener og kontrollområder som formidler ekspresjonen av deres informasjon gjennom tilveiebringelse av seter for RNA-polymerase-binding, informasjon for ribosomale bindingsseter, osv. Innkodet protein blir "uttrykt" fra dets tilsvarende DNA ved en flertrinnsprosess i en organisme hvorved: 1. Enzymet RNA-polymerase aktiveres i kontrollområdet (i det følgende betegnet "promoter") og beveger seg langs det strukturelle gen og transkriberer dets innkodende informasjon til mRNA inntil transkripsjon er avsluttet ved en eller flere "stopp"-kodoner. 2. mRNA oversettes ved ribosomene til et protein hvis aminosyresekvens genet koder, idet dette begynner ved et translasjonsstartsignal, vanligvis ATG (som er translatert "f-metionin").
Ifølge den genetiske kode spesifiserer DNA hver aminosyre ved en triplet eller "kodon" av tre tilgrensende nukleotider individuelt valgt fra adenosin, tymidin, cytidin og guanin eller, slik som her benyttet, A, T, C eller G. Disse opptrer i den kodende kjede eller kodende sekvens av dobbeltkjedet ("dupleks") DNA, hvis gjenværende eller "komplementære" kjede er dannet av nukleotider ("baser") som hydrogenbindes til deres komplementer i den kodende kjede. A kompiementerer T, og C komplementerer G. Disse og andre trekk som vedrører bakgrunnen for foreliggende oppfinnelse, er inngående omtalt i Benjamin Lewin, Gene Expression, 1, 2 (1974) og 3 (1977), John Wiley and Sons, N.Y.
DNA- spalting og llgering:
En rekke forskjellige teknikker er tilgjengelige for DNA-kombinasjon, hvorved tilgrensende ender av separate DNA-fragmenter tilpasses på en eller annen måte for å lette llgering. Det sistnevnte begrep angår dannelse av fosfor-diester-bindinger mellom tilgrensende nukleotider, oftest ved hjelp av enzymet T4 DNA-ligase. Butte ender kan således direkte ligeres. Fragmentene inneholdende komplementære enkeltkjeder ved deres tilgrensende ender blir alternativt begunstiget ved hydrogenbInding, hvilket posisjonerer de respektive ender for etterfølgende llgering. Slike enkeltkjeder som betegnes kohesive termini, kan dannes ved addisjon av nukleotider til butte ender under anvendelse av terminal transferase, og 1 visse tilfeller ved å fjerne en av kjedene ved en butt ende ved hjelp av et enzym, slik som"Y-ekso-nuklease. Den mest vanlige teknikk er å bruke restriksjonsendonukleaser (i det følgende betegnet "restriksjonsenzymer"), som spalter fosfodiesterbindinger i og omkring enestående sekvenser av nukleotider med en lengde på ca. 4-6 basepar ("restriksjonsseter"). Mange restriksjonsenzymer og deres gjenkjennende seter er kjente, kfr.f.eks. R.J. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Mange foretar kutt i. sikksakkmønster hvilket gir korte komplementære enkeltkjedede sekvenser ved endene på dupleks-fragmentene. Som komplementære sekvenser kan de fremskytende eller "kohesive" ender rekombineres ved basepardannelse. Når to forskjellige molekyler spaltes med dette enzym, vil tverr-pardannelse av de komplementære enkeltkjeder utvikle et nytt DNA-molekyl som kan gis kovalent integritet ved anvendelse av ligase for å tette enkeltkjede-bruddene som gjenstår ved sammenføyningspunktet. Restriksjonsenzymer som gir ko- terminale eller "butte" ender på dupleks DNA som har blitt spaltet, tillater rekomblnasjon via f.eks.T4-ligase med andre sekvenser som har butte ender.
Klonlngsvektorer og rekombinant DNA:
For foreliggende formål menes det med en "kloningsvektor" en lkke-kromosomal lengde av dupleks DNA omfattende en intakt replikon, slik at vektoren kan replikeres når den anbringes inne i en encellet organisme ("mikrobe") ved transformasjon. En således transformert organisme kalles en "transformant". De klonlngsvektorer som i dag anvendes, er avledet fra virus og bakterier og er vanligvis ringer av bakterie-DNA betegnet "plasmider".
Biokjemisk forskning i de senere år har ført til konstruksjon av "rekombinant"-klonlngsvektorer hvori f.eks. plasmider dannes slik at de inneholder eksogent DNA. I visse tilfeller kan rekomblnanten inneholde "heterologt" DNA, dvs. DNA som koder for polypeptider som vanligvis ikke dannes av den organisme som er mottagelig for transformasjon ved hjelp av rekombinant-vektoren. Plasmidene blir således spaltet med restriksjonsenzymer slik at det oppnås lineært DNA som har ligerbåre termini. Disse bindes til et eksogent gen med ligerbare termini, slik at det oppnås en biologisk funksjo-nell del med en intakt replikon og en fenotyp egenskap som er nyttig ved valg av transformanter. Rekombinantvektoren innføres i en mikroorganisme ved transformasjon, og transfor-manten isoleres og klones med det formål å oppnå store populasjoner som inneholder kopier av det eksogene gen, og i visse tilfeller, med det formål å uttrykke det protein for hvilket genet koder. Den tilknyttende teknologi og dens potensielle anvendelser beskrives in extenso i Miles International Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers and Bosseff; Raven Press, N.Y., (1977).
Rekomblnant- DNA ekspresjon
Foruten bruken av klonlngsvektorer for å øke mengden av gener ved replikasjon har det med hell vært foretatt noen forsøk på å uttrykke proteiner som genene koder for. Her ble først et gen for hjernehormonet somatostatlon under innvirkning av lac-promoteren uttrykt i E. coli bakterier, kfr. K. Itakura et al., Science 198, 1056, (1977). Senere ble A- og B-kjedene i humaninsulin uttrykt på samme måte og kombinert for dannelse av hormonet, kfr. D.V. Goeddel et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei, USA, 106 (1979). I hvert tilfelle ble genene konstruert i sin helhet ved syntese. I hvert tilfelle ville proteolytiske enzymer i cellen antageligvis nedbryte det ønskede produkt, hvilket nødvendiggjør dets dannelse i konjugert form, dvs. i tandem med et annet protein som beskyttet det ved oppdeling i seksjoner uten innbyrdes forbindelse, og som kunne avspaltes ekstracellulært for dannelse av det ønskede produkt. Dette arbeid er beskrevet i GB nr. 2007.675.A, 2007.670.A, 2007.676.A, og 2008.123.A.
Mens forsøk med det syntetiske gen har vist seg å være nyttig i de ovenfor omtalte tilfeller, oppstår virkelige vanskelig-heter med langt; større proteinprodukter, f.eks. veksthormon, interferon, osv/., hvis gener er tilsvarende mer komplekse og mindre mottagelige for enkel syntese. Samtidig ville det være ønskelig å uttrykke slike produkter uledsaget av konjugat protein, idet nødvendigheten av dettes ekspresjon krever bruk av ressurser i organismen som heller kan benyttes bedre til konstruksjon av det ønskede produkt.
Andre har forsøkt å uttrykke gener avledet ikke ved organisk syntese, men ved revers transkripsjon fra den tilsvarende mRNA renset fra. vev. Denne utførelse har vært forbundet med to problemer. For det første kan revers transkriptase stoppe transkripsjonen fra mRNA like før fullendelse av cDNA for hele den ønskede aminosyresekvens. Villa-Komaroff et al. oppnådde således f.eks. cDNA for rotte-proinsulin som manglet kodoner for de tre første aminosyrer i insulin-forløperen, kfr. Proe. Nat'l. Acad. Sei., USA 75 3727 (1978). Videre har revers transkripsjon av mRNA for polypeptider som er uttrykt i forløper-form, gitt cDNA for forløper-formen 1 stedet for det bioaktlve protein som resulterer når ledersekvenser i en eukaryot celle, fjernes enzymatisk. Hittil har det ikke vært vist at en bakteriell celle har en slik egenskap, slik at mRNA-transkripter har gitt ekspresjonsprodukter inneholdende ledersekvensene i forløper-formen i stedet for det bioaktlve protein, kfr. Villa-Komaroff, supra (rotte proinsulin); P.H. Seeburg et al., Nature 276, 795 (1978) (rotte-prevekst-hormon).
Forsøk foretatt av andre for bakterielt å uttrykke human-hormoner (eller deres forløpere) fra mRNA-transkripter, har av og til bare ledet til dannelse av konjugerte proteiner som tydeligvis ikke er mottagelige for ekstracellulær spalting; Seeburg, supra, (p-laktamase-preveksthormon).
Humant veksthormon
Humant veksthormon ("HGH") utskilles i hypofysen. Det består av 191 aminosyrer og er med sin molekylvekt på ca. 21.500 mer enn tre ganger så stort som insulin. Tidligere kunne humant veksthormon bare oppnås ved tungvint ekstraksjon fra en begrenset kilde, nemlig hypofysen fra døde mennesker. Den følgelige knapphet av stoffet har begrenset dets anvendelse til behandling av dvergvekst ved nedsatt hypofyseaktivitet, og selv her antyder pålitelige beregninger at humant avledet HGH er tilgjengelig i tilstrekkelig mengde til å tjene høyst ca. 50# av aktuelle pasienter.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et plasmid som i en bakteriell organisme kan uttrykke et spesielt polypeptid med kjent aminosyresekvens, hvorved et gen som koder for polypeptidet innføres 1 et plasmid og settes under kontroll av en ekspresjonspromoter, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man: a) tilveiebringer et cDNA-fragment som omfatter en vesentlig del av, men mindre enn hele den kodende sekvensen for nevnte polypeptid; b) gjennom organisk syntese tilveiebringer ett eller flere genfragmenter som koder for resten av aminosyresekvensen i polypeptidet, idet minst ett av nevnte fragmenter koder for amino-terminaldelen 1 polypeptidet; og c) innordner cDNA'et fra trinn a) og DNA'et oppnådd ved organisk syntese i trinn b) i et plasmid i riktig leseramme 1
forhold til hverandre og under kontroll av en ekspresjonspromoter ;
hvorved det dannes et plasmid som kan uttrykke aminosyresekvensen til nevnte polypeptid.
Det er foretrukket at nevnte humant veksthormon uttrykkes uledsaget av fremmed protein.
Dette representerer den første anledning hvorved et medisinsk betydelig polypeptid-hormon (humant veksthormon) har blitt bakterielt uttrykt med samtidig unngåelse av både intra-cellulær proteo.lyse og nødvendighet for oppdeling i seksjoner ("compartmentalizing") av den bioaktlve form i fremmed protein før ekstracellulær spalting. Mikrobielle kilder for human-veksthormon tilgjengeliggjort ved foreliggende oppfinnelse gir for første gang tilstrekkelig mengder av hormonet for behandling av dvergvekst ved nedsatt hypofyse-aktlvitet sammen med andre anvendelser som hittil har ligget utenfor kapasiteten hos vevsavledede hormonkilder, inkludert diffus gastrisk blødning, pseudoarthrosis, brannsårterapi, sårleging, dystrofi og ben-sammenvoksing.
Foreliggende oppfinnelse vil fremgå mer detaljert fra nedenstående beskrivelse og fra de medfølgende tegninger som angår en foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse, idet
figur 1 viser det syntetiske skjema for konstruksjon av et genfragment som koder for de første 24 aminosyrer i humant veksthormon sammen med startsignal-ATG og bindingselementer benyttet ved kloning. Pilene i den kodende eller den øvre kjede ("U") og i den komplementære eller lavere kjede ("L") Indikerer oligonukleotidene som er sammeføyet til dannelse av det viste fragment;
figur 2 viser sammenføyning av "U"- og "L"-oligonukleotidene til dannelse av genfragmentet i figur 1, og dets innføring i en plasmid-klonlngsvektor;
figur 3 illustrerer DNA-sekvenser (bare kodende kjede) hos Haelll-restriksjonsenzymfragmentet i et mRNA-transkript fra hypofysen, med de nummererte aminosyrer i humant veksthormon for hvilket de koder. De viktigste restriksjonsseter er indikert, slik som tilfellet er for DNA (etter stopp) for utranslatert mRNA;
figur 4 illustrerer konstruksjonen av en kloningsvektor for et genfragment som koder for aminosyre i humant veksthormon som ikke er fremstilt syntetisk, og konstruksjonen av nevnte genfragment som komplementær DNA ved revers transkripsjon fra mRNA isolert fra en kilde for human hypofyse; og
figur 5 illustrerer konstruksjonen av et plasmid som i bakterier kan uttrykke humant veksthormon begynnende med plasmidene 1 figurene 2 og 3.
Den generelle metode ifølge oppfinnelsen innebærer kombina-sjonen i et enkelt plasmid av flere genfragmenter som i kombinasjon koder for ekspresjon av det ønskede produkt. Av disse er minst ett cDNA-fragment oppnådd ved revers transkripsjon fra mRNA isolert fra vev, som ved fremgangsmåten ifølge A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). cDNA tilveiebringer en vesentlig del og fortrinnsvis i det minste en større del, av kodonene for det ønskede produkt, mens gjenværende deler av genet tilveiebringes syntetisk. De syntetiske og mRNA-transkriptfragmentene klones separat for tilveiebringelse av tilstrekkelige mengder for bruk i det senere kombinas;jonstrinn.
En rekke hensyn innvirker på fordelingen av kodoner for endeproduktet, slik som mellom syntetisk og cDNA, særlig DNA-sekvensen hos komplementært DNA bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert, Proe. Nat'1. Acad. Sei, UA, 74, 560 (1977). Komplementært DNA oppnådd ved revers transkripsjon vil uunngåelig Inneholde kodoner for i det minste en karboksy-terminaldel av det ønskede produkt, samt andre kodoner for utranslatert mRNA i nedstrømsretningen fra translasjons-stoppsignalet (slngalene) tilgrensende karboksyterminusen. Tilstedeværelsen av cDNA for utranslatert RNA er stort sett irrelevant, skjønt urimelig lange sekvenser av denne type kan fjernes slik som ved spalting med restriksjonsenzym, for å bevare cellulære forråd benyttet ved replikering og ekspresjon av DNA for det ønskede produkt. I spesielle tilfeller vil cDNA inneholde kodoner for hele den ønskede aminosyresekvens samt fremmede kodoner i oppstrømsretningen fra amino-terminalen i det ønskede produkt. F.eks. er mange, om ikke alle, polypeptid-hormoner uttrykt i forløper-form med leder-eller slgnalsekvenser av protein involvert, f.eks. i transport i cellemembranen. Ved ekspresjon fra eukaryotiske celler blir disse sekvenser fjernet enzymatisk slik at hormonet kommer inn i de periplasmatiske rom i sin frie, bioaktlve form. Man kan imidlertid ikke stole på mikrobielle celler når det gjelder å utføre denne funksjon, og det er følgelig ønskelig å fjerne sekvenser som koder for silke signaler eller ledersekvenser fra mRNA-transkriptet. I løpet av denne fjerningsprosess går også translasjons-startsignalet tapt, og noen kodoner for det ønskede produkt vil nesten uvegerlig også bli fjernet. Den syntetiske komponent i det kvasi-syntetiske genprodukt returnerer disse sistnevnte kodoner samtidig som de på nytt tilfører et translasjonsstartsignal hvor vektoren, i hvilken det hybride gen til slutt vil innordne seg, mangler en riktig beliggende start.
Eliminasjon av ledersekvensen fra prevekst-hormon cDNA fremmes ved tilgjengeligheten av et restriksjonssete innen den veksthormon-kodende del av genet. Oppfinnelsen kan Ikke desto mindre utføres uten hensyn til tilgjengeligheten av et slikt sete, eller ihvertfall uten hensyn til tilgjengeligheten av et restriksjonssete som er tilstrekkelig nær amino-terminalen i det ønskede polypeptid for å unngå behovet for utstrakt syntese av genkomponenten som ikke er avledet fra mRNA. I enhver cDNA som koder for det ønskede polypeptid og en ledersekvens eller en annen bloinaktiverende sekvens, vil således grensen mellom den sistnevntes kodoner og de i det ferdige polypeptid fremgå fra aminosyresekvensen i det ferdige polypeptid. Man kan ganske enkelt foreta spalting til det kodende gen fra det valgte peptid og dermed fjerne den uønskede ledersekvens eller en annen sekvens. F.eks., gitt cDNA slik som
hvor endepunktet for spalting er indikert med en pil , kan således bet Inge 1 sene for eks onuklease-spal ting velges slik at man fjerner de øvre sekvenser "a" og "b", hvoretter Sl-nuklease-spalting automat! sk vil eliminere de nedre sekvenser
"c" og "d". Alternativt og mer nøyaktig kan man benytte DNA-polymerase-spalting i nærvær av deoksymikleotid-trifosfater ( "d(A,T,C,G)TP" )i. I det foregående eksempel vil således DNA-polymerase i nærvær av dGTP fjerne sekvens "c" (deretter stopp ved "g"), Sl-nuklease vil deretter spalte "a"; DNA-polymerase i nærvær av dTTP vil fjerne "d", deretter stopp ved "T", og Sl-nuklease vil deretter fjerne "b", osv. Se generelt A. Kornberg, DNA Synthesis, pp. 87-88, W.H. Freeman og Co., San Francisco (1974).
Mer spesielt kan man på enkel måte konstruere et restriksjonssete ved et passende punkt i den del av det cDNA som koder for det ønskede produkt, ved anvendelse av "mismatch"-reparasjonssynteseteknikken ifølge A. Razin et al., Proe. Nat* 1. Acad. Sei. USA 75, 4268 (1978). Ved hjelp av denne teknikk kan en eller flere baser substitueres i en eksisterende DNA-sekvens under anvendelse av primere inneholdende den mispassede substituent. Minst syv palindrome 4-basepar sekvenser gjenkjennes entydig av kjente restriksjonsenzymer, dvs. AGCT (Alul), CCG (Hpall), CGCG (Thai), GATC (Sau3A), GCGT (Hha), GGCC (Haelll) og TC GA (Taql). Når cDNA-sekvensen inneholder en sekvens som adskiller seg fra en slik posisjon i en enkelt bane, hvilket statistisk er meget sannsynlig, vil reparasjonssyntese gi repllkat cDNA inneholdende den riktige substituentbase og således det ønskede restriksjonssete. Spalting vil fjerne DNA fra den uønskede leder hvoretter syntese vil gi kodoner som er nødvendig for ekspresjon av det fullstendige polypeptid. F.eks.: ; Det vil naturligvis forstås at lengre restriksjonsseter likeledes kan innføres når det er ønsket, eller at suksessive reparasjoner kan skape 4-basepar-restriksjonsseter når bare to baser som er felles for setet, forekommer ved det ønskede punkt, etc. ;Det vil forekomme anvendelser hvorved det er ønskelig ikke bare å uttrykke aminosekvensen for det ønskede produkt, men også et mål for fremmed, men spesifikt konstruert protein. Fire slike anvendelser kan eksempelvis nevnes. Først, det kvasi-syntetiske gen kan representere et hapten eller en annen immunologisk determinant hvorpå immunogenlsitet gis ved konjugering til ytterligere protein, slik at vaksiner fremstilles, se generelt britisk patent nr. 2008.123.A. Det kan videre være ønskelig av bio-sikkerhetsmessige grunner å uttrykke det ønskede produkt som et konjugat med et annet, bio-inaktiverende protein som er slik konstruert at det tillater ekstracellulær spalting for dannelse av den aktive form. For det tredje vil det være anvendelser hvor transport-signal-polypeptider vil være forut for det ønskede produkt og dermed tillate produksjon av dette slik at det kan utskilles gjennom cellemembranen, men dette forutsetter at signal-peptidet deretter kan spaltes. Sluttlig, fremmed konjugat som er slik konstruert at det tillater spesifikk spalting ekstracellulært, kan benyttes for å seksjonsoppdele ønskede produkter som ellers er mottagelige for nedbrytning av proteaser endogent i forhold til den mikrobielle vert. I det minste i de sist angitte tre anvendelser kan det syntetiske adaptor-molekyl benyttes for å fullende kodingssekvensen i mRNA-transkripteit, i tillegg inkorporere kodoner for aminosyresekvenser som er spesifikt spaltbare, slik som ved enzymatisk behandling. Trypsin vil f.eks. spaltes spesifikt ved arg-arg eller lys-lys, etc., se britisk patent nr. 2008.123.A, Supra. ;Fra det ovenstående fremkommer mange anvendelser som hver har følgende trekk felles: det anvendes et mRNA-transkript som koder for en vesentlig del av den ønskede aminosyresekvens i polypeptidet, men som hvis det uttrykkes alene, ville gi et forskjellig polypeptid enten mindre eller større enn det ønskede produkt; ;proteinkodende kodoner for aminosyresekvenser andre enn de som inneholdes i det ønskede produkt, hvis slike er til stede, fjernes; ;organiske synteser gir fragment(er) som koder for resten av den ønskede sekvens; og ;mRNA-transkrlptet og det syntetiske fragment(er) kombineres og plasseres i en promoterholdig kloningsvektor for replikasjon og ekspresjon av enten det ønskede produkt uten eksternt konjugert protein, eller det ønskede produkt konjugert til, men spesifikt spaltbart fra eksternt protein. ;Ekspresjonsproduktet vil naturligvis i hvert tilfelle begynne med aminosyren som er kodet for av translasjons-startsignalet (i tilfellet for ATG, f-metionin). Man kan forvente at denne fjernes intracellulært eller lhvertfall gjør at bio- aktiviteten til det sluttlige produkt forblir vesentlig upåvirket. ;En foretrukken utførelse som illustrerer oppfinnelsen, er omtalt i det nedenstående, hvorved det konstrueres, klones og uttrykkes mikrobielt et kvasi-syntetisk gen som koder for humant veksthormon. ;Konstruksjon og ekspresjon av en kloningsvektor for humant veksthormon 1. Kloning av HaeIII- fragmentet i mRNA- transkrlptet ( figurene ;3 og 4) ;Polyadenylert mRNA for humant veksthormon (HGH) ble fremstilt fra hypofyseveksthormon-produserende tumorer ved hjelp av metoden ifølge A. Ullrich et al., Science 196, 1313 ;(1977). 1,5 pg dobbeltkjedet (ds") cDNA ble fremstilt fra 5 jjg av det RNA slik som vesentlig beskrevet av Wickens et al., J. Biol.Chem. 253 2483 (1978), med unntagelse av at RNA-polymerase "Klenow fragment", H. Klenow, Proe. Nat'l. Aci. USA. 65, 168 (1970), ble utbyttet med DNA-polymerase I i syntesen av den andre kjede. Restriksjonsmønsteret for HGH er slik at Haelll-restriksjonsseter er til stede i det 3' ikke-kodende område og i den sekvens som koder for aminosyrer 23 og 24 i HGH, som vist på figur 3. Behandling av ds HGH cDNA med Haelll gir et DNA-fragment med 551 basepar ("bp") som koder for aminosyrer 24-191 i HGH. Således ble 90 ng cDNA behandlet med Haelll, elektroforesebehandlet på en 8% polyakrylamidgel, hvoretter området ved 550 bp ble eluert. Omtrent 1 ng cDNA ble oppnådd. ;pBR322 fremstilt ifølge F. Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95-113 ble valgt som kloningsbærer for cDNA. pBR322 er blitt fullstendigkarakterisertav J.G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium, 43, 70 (1978) og er et multikopi-replike- ;rende plasmid som utviser både amplcillin- og tetracyklin-resistens p.g.a. dets innhold av de tilsvarende gener ("Ap<K>" og "Tc<*>", resp. figur 4), og som inneholder gjenkjennings-posisjoner for restriksjonsenzymene Pstl, EcoRI og Hindlll som vist på figuren.
Terminal-deoksynukleotidyl-transferase (TdT) ble således benyttet for å addere omtrent 20 dC-rester pr. 3'-terminal som beskrevet av Chang, A.Y.C. supra. 60 ng av Pstl-behandling pBR322 ble likeledes endeavslutningsbehandlet med ca. 10 dG-rester pr. 3'-terminal. Forsterkning av dC-ende-avsluttet ds cDNA med den dG-endeavsluttede vektor DNA ble foretatt i 130 pl 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,25 mM EDTA. Blandingen ble oppvarmet til 70°C, fikk avkjøles langsomt til 37°C (12 timer), og deretter til 20°C (6 timer) før den ble benyttet for å transformere E. coil xl776. DNA-sekvensanalyse av plasmidet pHGH31 klonet i xl776 ved hjelp av metoden ifølge Maxam og Gilbert, Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977), resulterte i bekreftelse av kodonene for aminosyrer 24-191 i HGH som vist på figur 3.
E. coil K-12 stamme xl776 har genotypen F" tonA53 dapD8 minAl supE42A40]gal-uvrB§-Y~ minBr rfb-2 nalA25 oms-2 thyA57<x>metC65 oms-1A29]bioH-asd§ cycB2 cycAl hsdR2. xl776 er godkjent a.v the National Inst 1 tutes of Health som er. et EK2 vertvektorsystem.
xl776 har et obligatkrav for diaminopimelinsyre (DAP) og kan ikke syntetisere mukopolysakkaridcholansyren. Det gjennomgår således DAP-fri død i alle miljøer hvor DAP er begrensende, men hvor tilstrekkelige næringsmidler eksisterer til å underholde cellulær metabolisme og vekst. Det kreves tymin eller tymidin og gjennomgår tyminfri død med nedbrytning av DNA når tymin og tymidin er fraværende i miljøet, men når tilstrekkelige næringsmidler er til stede til å underholde metabolisk aktivitet. xl776 er meget følsom overfor galle og er således ikke 1 stand til å overleve og således ikke i
stand til å overleve passasje gjennom mavetarmkanalen hos rotter. xl776 er meget følsom overfor vaskemidler, anti-biotika, legemidler og kjemikalier. xl776 kan ikke utføre hverken mørke- eller fotoreparasjon av UV-lndusert skade og er således flere størrelsesordener mer følsom overfor sollys enn udyrkede stammer av E. coil. xl776 er resistent overfor mange transduserende farger og er konjugasjonsmangelfull med hensyn til arv av mange forskjellige typer konjugative plasmider p.g.a. tilstedeværelsen av forskjellige mutasjoner. xl776 er resistent overfor nalidiksinsyre, cykloserin og trimetoprim. Disse legemidler kan derfor tilsettes til media for å tillate kontroll av stammen og utelukke transformasjon av kontaminerende elementer under transformasjon.
xl776 vokser med en generasjonstid på ca. 50 min. i enten L-buljong eller Penassay-bul jong ved tilsetning av 100 jjg DAP/ml og 4 yg tymidin/ml, og når sluttlige tettheter på 8-10x 10<8>celler/ml ved stasjonær fase. Forsiktig omrøring ved dreiing og rysting frem og tilbake i 1-2 minutter suspenderer cellene tilstrekkelig under opprettholdelse av 100% leve-dyktighet. Ytterligere detaljer angående xl776 finnes i R. Curtis et al., Molecular Cloning of Recombinant DNA, 99-177, Scott og Werner, eds., Academic Press (N.Y. 1977).X1776 er deponert i the American Type Culture Colleetion (3. Juli 1979: ATCC-betegnelse nr. 31, 1957) uten begrensning.
2. Konstruksjon og kloning av det syntetiske genfragment
( figurene 1 og 2)
Metoden for konstruksjon av det HGH-kvasi-syntetiske gen omfattet konstruksjon av et syntetisk fragment omfattende et buttendet restriksjonsspaltingssete tilgrensende det punkt ved hvilket fragmentet ville bli sammenføyet med mRNA-transkriptet. Som vist på figur 1 inneholdt således det syntetiske gen for de første 24 aminosyrer i HGH et Haelll-spaltingssete etter aminosyre 23. Den distale enden 1 det syntetiske fragment ble forsynt med et "bindende element" som ga adgang til sammenføyning med en enkeltkjedet terminal resulterende fra restriksjonsspaltinger i plasmidet hvori mRNA-transkriptet og det syntetiske fragment til slutt ville bli tilføyet.
Som vist på figur 1 har 5'-endene i dupleksfragmentet enkeltkjedede, kohesive termini for EcoRI- og Hindlll-restriksjonsendonukleaser for å lette plasmidkonstruksjon. Metionin-kodonet ved den venstre ende gir et sete for initiering av translasjon. Tolv forskjellige oligonukleotider som varierer i størrelse fra undekaner til heksadekaner ble syntetisert ved den forbedrede fosfotriester-metoden ifølge Crea, R. Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA 75, 5765(1978). Disse oligonukleotider, U^- U^, og - , er vist med piler.
Mengder på lOpg av U2til U5og L2til L5ble fosforylert under anvendelse av T4polynukleotid-kinase og ("y<32->P)ATP ved hjelp av en kjent metode, C. Goeddel, D.V. et al., Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979).
Tre separate T^ligasekatalyserte reaksjoner ble foretatt: 10 pg av 5'-0H fragment U^ble kombinert med det fosforylerte U2, L5og Lfcj fosforylert U3, U4, L3og L4ble kombinert; og 10 >jg av 5'-fragment Lj ble kombinert med fosforylert L2, U5og Ufc. Disse ligeringer ble utført ved 4°C i 6 timer i 300 jjI av 20 mM tris-HCl (pH 7,5), mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP under anvendelse av 100 enheter med T4-ligase. De tre 1igerlngsblandinger ble deretter kombinert, 100 enheter T4-ligase ble tilsatt, og reaksjonen fikk forløpe i 12 timer ved 20°C. Blandingen ble etanolutfelt og elektroforesebehandlet på en 10% polyakrylamidgel. Båndet som migrerte ved 84 basepar, ble skilt fra gelen og eluert. pBR322 (ljjg) ble behandlet med EcoRI og Hindlll, det største fragment ble isolert ved gel-elektroforese og ligert med det syntetiske DNA. Denne blanding ble benyttet til å transformere E. coli K-12 stamme 294 (ende A, thi~, hsr~, hsmjj"1"). Stamme 294 ble deponert den 30. oktober 1978 ved American Type Culture Collection (ATCC Nr. 31446), uten begrensning. Sekvensanalyse Ifølge Maxam og Gilbert-teknikken, Supra, på den EcoRI-Hindlll-tllføyende del fra et plasmid pHGH av en transformant bekreftet det som er vist på flg. 1.
3. Konstruksjon av<p>lasmid for bakteriell ekspresjon av HGH
( figur 5)
Med det syntetiske fragment i pHGH3 og mRNA-transkriptet pHGH31 ble det konstruert et replikerbart plasmid inneholdende begge fragmenter, under anvendelse av ekspresjonsplasmidet pHG6 som vist på figur 5. Ekspresjonsplasmidet som inneholder tandem-lac-promotere, ble først konstruert som følger. Et 285 basepar EcoRI-fragment inneholdende to 95 basepar UV5 lac-promoterfragmenter adskilt ved et 95 baseparheterologt DNA-fragment, ble Isolert fra plasmid pKB268, K. Backman, et al., Cell. Vol. 13, 65-71 (1978). 285 bp-fragmentet ble innført i EcoRI-setet i pBR322 og en klon pGHl Isolert med promoterene orientert mot og i riktig leseramme i forhold til genet for tetracyklin-resistens. EcoRI-posisjonen beliggende distalt i forhold til sistnevnte gen ble ødelagt ved partiell EcoRI-nedbrytning, reparasjon av de resulterende enkeltkjedede EcoRI-ender med DNA-polymerase I og sirkulasjon av plasmidet ved buttende llgering. Det resulterende plasmid, pGH6, inneholder et enkelt EcoRI-sete som er riktig plassert med hensyn til promote-systemet hvori det kompletterte gen for HGH kunne innføres.
For å klargjøre det syntetiske fragment for kombinasjon med RNA-transkriptet ble 10 pg av pHGH spaltet med EcoRI- og Haelll-restriksjonsendonukleaser, og 77 basepar-fragmenter inneholdende kodende sekvenser for HGH aminosyrer 1-23 ble isolert fra en 8% polyakrylamidgel.
Plasmidet pHGH31 (5>jg) ble deretter spaltet med Haelll. 551 bp HGH-sekvensen, og et komigrerende 540 bp HaeIII-fragment av pBR322 ble renset ved gelelektroforese. Etterfølgende behandling med Xmal spaltet bare HGH-sekvensen og fjernet dermed 39-baseparene fra det 3'-ikke-kodende området. Det resulterende 512 bp-fragment ble separert fra 540 bp pBR322 Haelll-delen ved elektroforese på en 6$ polyakrylamidgel. 0,3 g av 77 bp EcoRI-HaeIII-fragmentet ble polymerisert med T4-ligase i en 6 >j1 reaksjonsbeholder i 14 timer ved 4°C. Blandingen ble oppvarmet til 70°C i 5 minutter for å inaktivere ligasen, og deretter behandlet med EcoRI (for å spalte fragmenter som var dimerisert gjennom deres EcoRI-seter) og med Smal (for å spalte Xmal-dimerer) hvilket ga et 591 bp-fragment med en EcoRI "kohesiv" ende og en Smal "butt" ende. Etter rensing på en b% polyakrylamidgel ble omtremt 30 hg av dette fragment oppnådd. Det skal bemerkes at ekspresjonsplasmidet pGH6 ikke inneholder noen Xmal gjenkjennelsess-ete. Smal gjenkjenner imidlertid det samme sete som Xmal, men skjærer gjennom dens midtre del og gir dermed butte ender. Den Sma-avspaltede terminal i fragmentet avledet fra gHGH31 kan følgelig være buttende-ligert Inn i pGH6.
Ekspresjonsplasmidet pGH6 inneholdende lac UV5-promotere ble behandlet suksessivt med Hindlll nuklease Sl og EcoRI og renset ved gelelektroforese. 50 ng av den resulterende vektor som hadde en EcoRI-kohesiv ende og en butt ende, ble ligert til 10 ng av 591 bp. HGH DNA. Llgerlngsblandingen ble benyttet for å transformere E. coli xl776. Kolonier ble valgt for vekst på tetracyklln (12,5 jjg/ml). Det skal påpekes at innføring av hybrid-HGH-genet i pGH6 ødelegger promoteren med hensyn til det tetracykllnresistente gen, men at tandem-lac-promoteren tillater gjennomlesing av det strukturelle gen for tet-resistens under bibeholdelse av denne utvelgelses-egenskap. Omtrent 400 transformanter ble oppnådd. Filter-hybridisering ifølge Grunstein/Hogness-metoden, Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975), identifiserte 12 kolonier inneholdende HGH-sekvenser. Plasmidet isolert fra tre av disse kolonier ga de forventede restriksjonsmønstre ved spalting med Haelll, PvuII og Pstl. DNA-.sekvensen for en klon, pHGH107, ble bestemt.
Fjerning av EcoRI-setet i pGH107 vil etterlate ATG-startsignalet i samme avstand fra ribosombindingssete-kodonene i lac-promoteren som tilfellet er i naturen mellom slike kodoner og startsignalet for B-galaktosidase. For å bestemme om ekspresjon ville forøkes ved å etterligne dette naturlige mellomrom ble pGH107 omdannet til pGH107-l ved åpning av den førstnevnte med EcoRI, spalting av de resulterende enkeltkjedede ender med Sl-endenuklease, resirkularisering ved buttende-ligering med T4-ligase. Selvom det resulterende plasmid likeledes viste seg å kunne uttrykke HGH, gjorde det dette i mindre grad enn tilfellet var for pGH107, som vist ved direkte radioimmunobestemmelse.
Det er klart at variasjoner av det ovenfor angitte kan foretas avhengig blant annet av promotersystem, parenteralt plasmid, ønsket polypeptidprodukt, osv. Andre promotersystemer som kan anvendes 1 foreliggende oppfinnelse, inkluderer f.eks. X-promoteren, arabinose-operon (phi 80 d ara) eller kolisin El, galaktose, alkalisk fosfatase eller tryptofan-promotersystemer.
E. coil xl776 kan, selvom det er foretrukket brukt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse utført i laboratoriemåle-stokk, vise seg å ha begrenset nyttevirkning i industriell stor målestokk p.g.a. svekkelser som med vilje er inkorporert deri av bio-sikkerhetsmessige grunner. Med passende nivåer av fysisk, snarere enn biologisk innhold, kunne slike organismer som E. coil K-12 stamme 294 supra og E. coli stamme RR1, genotype: Pro~Leu~Thi~R3-recA-Str<r>Lac y~, benyttes i operasjon i større målestokk. E. coli RR1 er avledet fra E. coli HB101 (E.W. Boyer et al., J. Mol. Bio (1969) 41 459-472) ved krysning med E. coli K12 stamme KL16 som Hfr-donor- Se J. E. Miller, Experlments in Molecular Genetlcs (Cold Spring Harbor, New York, 1972). En kultur av E. coli RR1 ble deponert den 30. oktober 1978 hos the American Type Culture Collection, uten begrensning med hensyn til adgang (ATCC No. 31343). En kultur av xl776 ble likeledes deponert den 3. juli 1979 hos the American Type Collection (ATCC No. 31537). Deponeringer av de følgende ble foretatt hos the American Type Culture Collection den 3. juli 1979: plasmid pHGH107 (ATCC No. 40011); plasmid pGH6 (ATCC No. 40012); stamme xl776 transformert med pHGH107 (ATCC No. 31538) og E. coli Kli stamme 294 transformert med pGH6 (ATCC No. 31539).

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et plasmid som i en bakteriell organisme kan uttrykke et spesielt polypeptid med kjent aminosyresekvens, hvorved et gen som koder for polypeptidet innføres i et plasmid og settes under kontroll av en ekspresjonspromoter, karakterisert vedat man: a) tilveiebringer et cDNA-fragment som omfatter en vesentlig del av, men mindre enn hele den kodende sekvensen for nevnte polypeptid; b) gjennom organisk syntese tilveiebringer ett eller flere genfragmenter som koder for resten av aminosyresekvensen i polypeptidet, idet minst ett av nevnte fragmenter koder for amino-terminaldelen i polypeptidet; og c) innordner cDNA'et fra trinn a) og DNA<*>et oppnådd ved organisk syntese i trinn b) i et plasmid i riktig leseramme i forhold til hverandre og under kontroll av en ekspresjonspromoter ; hvorved det dannes et plasmid som kan uttrykke aminosyresekvensen til nevnte polypeptid.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat ved at humant veksthormon uttrykkes uledsaget av fremmed protein.
NO86860680A 1979-07-05 1986-02-24 Fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid. NO167674C (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/055,126 US4342832A (en) 1979-07-05 1979-07-05 Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
PCT/US1980/000838 WO1981000114A1 (en) 1979-07-05 1980-07-03 Microbial expression of quasi-synthetic genes
NO81810608A NO167673C (no) 1979-07-05 1981-02-20 Fremgangsmaate for fremstilling av et polypeptid.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO860680L NO860680L (no) 1981-02-20
NO167674B true NO167674B (no) 1991-08-19
NO167674C NO167674C (no) 1991-11-27

Family

ID=26733870

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO81810608A NO167673C (no) 1979-07-05 1981-02-20 Fremgangsmaate for fremstilling av et polypeptid.
NO86860680A NO167674C (no) 1979-07-05 1986-02-24 Fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO81810608A NO167673C (no) 1979-07-05 1981-02-20 Fremgangsmaate for fremstilling av et polypeptid.

Country Status (42)

Country Link
US (7) US4342832A (no)
EP (1) EP0022242B1 (no)
JP (4) JPH0612996B2 (no)
KR (2) KR830003574A (no)
AR (1) AR244341A1 (no)
AT (1) ATE82324T1 (no)
AU (2) AU533697B2 (no)
BE (1) BE884012A (no)
BG (1) BG41135A3 (no)
BR (1) BR8008736A (no)
CA (2) CA1164375A (no)
CH (1) CH661939A5 (no)
CS (3) CS250652B2 (no)
DD (3) DD210071A5 (no)
DE (3) DE3050722C2 (no)
DK (2) DK173503B1 (no)
EG (1) EG14819A (no)
ES (2) ES493149A0 (no)
FI (2) FI802030A (no)
FR (2) FR2460330B1 (no)
GB (2) GB2055382B (no)
GR (1) GR69320B (no)
HK (3) HK87484A (no)
IE (3) IE50461B1 (no)
IL (3) IL69492A (no)
IT (1) IT1131393B (no)
KE (3) KE3450A (no)
MX (1) MX172674B (no)
MY (3) MY8500764A (no)
NL (1) NL930114I2 (no)
NO (2) NO167673C (no)
NZ (2) NZ201312A (no)
OA (1) OA06562A (no)
PH (1) PH19814A (no)
PL (1) PL149278B1 (no)
PT (1) PT71487A (no)
RO (1) RO93374B (no)
SG (1) SG56984G (no)
WO (1) WO1981000114A1 (no)
YU (3) YU163580A (no)
ZA (1) ZA803600B (no)
ZW (1) ZW14180A1 (no)

Families Citing this family (184)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US6455275B1 (en) 1980-02-25 2002-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
US4711843A (en) * 1980-12-31 1987-12-08 Cetus Corporation Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
US6610830B1 (en) 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
IE53166B1 (en) * 1980-08-05 1988-08-03 Searle & Co Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression
US7101981B1 (en) 1980-08-26 2006-09-05 Regents Of The University Of California Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli
US4725549A (en) * 1980-09-22 1988-02-16 The Regents Of The University Of California Human and rat prolactin and preprolactin cloned genes
NZ198445A (en) * 1980-09-25 1984-05-31 Genentech Inc Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
JPS57181098A (en) * 1981-04-30 1982-11-08 Japan Found Cancer Novel recombinant dna
US4801685A (en) * 1981-08-14 1989-01-31 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4810645A (en) * 1981-08-14 1989-03-07 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US5254463A (en) * 1981-09-18 1993-10-19 Genentech, Inc. Method for expression of bovine growth hormone
US4880910A (en) * 1981-09-18 1989-11-14 Genentech, Inc. Terminal methionyl bovine growth hormone and its use
NZ201918A (en) * 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5236831A (en) * 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4446235A (en) * 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
US4665160A (en) * 1982-03-22 1987-05-12 Genentech, Inc. Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome
US4652639A (en) * 1982-05-06 1987-03-24 Amgen Manufacture and expression of structural genes
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
GB2121054B (en) * 1982-05-25 1986-02-26 Lilly Co Eli Cloning vectors for expression of exogenous protein
US4778759A (en) * 1982-07-09 1988-10-18 Boyce, Thompson Institute For Plant Research, Inc. Genetic engineering in cyanobacteria
US4891315A (en) * 1982-10-25 1990-01-02 American Cyanamid Company Production of herpes simplex viral porteins
WO1984000775A1 (en) * 1982-08-10 1984-03-01 Univ Columbia The use of eucaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials
US4530904A (en) * 1982-09-03 1985-07-23 Eli Lilly And Company Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria
CA1209501A (en) * 1982-09-16 1986-08-12 Nikos Panayotatos Expression vector
WO1984001150A1 (en) * 1982-09-16 1984-03-29 Amgen Avian growth hormones
US4666839A (en) * 1982-12-01 1987-05-19 Amgen Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin
JPS59106297A (ja) * 1982-12-07 1984-06-19 Rikagaku Kenkyusho ヒト生長ホルモンのカルボキシ末端遺伝子の合成法
DK55685A (da) * 1985-02-07 1986-08-08 Nordisk Gentofte Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet
US5618697A (en) * 1982-12-10 1997-04-08 Novo Nordisk A/S Process for preparing a desired protein
US4634678A (en) * 1982-12-13 1987-01-06 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms
GB8303383D0 (en) * 1983-02-08 1983-03-16 Biogen Nv Sequences recombinant dna molecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
IL71991A (en) 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
BG49718A3 (en) * 1983-07-15 1992-01-15 Bio Technology General Corp Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty
US5242798A (en) * 1983-07-21 1993-09-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
US4900811A (en) * 1983-07-21 1990-02-13 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
JPS60137291A (ja) * 1983-12-26 1985-07-20 Takeda Chem Ind Ltd 発現ベクター
CA1213537A (en) * 1984-05-01 1986-11-04 Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee Polypeptide expression method
CA1272144A (en) * 1984-06-29 1990-07-31 Tamio Mizukami Fish growth hormone polypeptide
US5489529A (en) * 1984-07-19 1996-02-06 De Boer; Herman A. DNA for expression of bovine growth hormone
WO1986002068A1 (en) * 1984-09-26 1986-04-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Mutual separation of proteins
US4680262A (en) * 1984-10-05 1987-07-14 Genentech, Inc. Periplasmic protein recovery
ATE78515T1 (de) * 1984-10-05 1992-08-15 Genentech Inc Dna, zellkulturen und verfahren zur sekretion von heterologen proteinen und periplasmische proteinrueckgewinnung.
NZ213759A (en) * 1984-10-19 1989-01-27 Genentech Inc Lhrh-ctp protein conjugates influencing prolactin fsh and lh release
US4645829A (en) * 1984-10-29 1987-02-24 Monsanto Company Method for separating polypeptides
US4652630A (en) * 1985-02-22 1987-03-24 Monsanto Company Method of somatotropin naturation
US4861868A (en) * 1985-02-22 1989-08-29 Monsanto Company Production of proteins in procaryotes
DK151585D0 (da) * 1985-04-03 1985-04-03 Nordisk Gentofte Dna-sekvens
DE3683186D1 (de) * 1985-04-25 1992-02-13 Hoffmann La Roche Rekombinantes humaninterleukin-1.
AU6131086A (en) * 1985-07-05 1987-01-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US5041381A (en) 1986-07-03 1991-08-20 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US4892764A (en) * 1985-11-26 1990-01-09 Loctite Corporation Fiber/resin composites, and method of making the same
US5552528A (en) * 1986-03-03 1996-09-03 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bovine b-endothelial cell growth factor
US5827826A (en) 1986-03-03 1998-10-27 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Compositions of human endothelial cell growth factor
EP0245218B1 (en) * 1986-05-07 1993-12-29 ENIRICERCHE S.p.A. A plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone
EP0252588A3 (en) * 1986-05-12 1989-07-12 Smithkline Beecham Corporation Process for the isolation and purification of p. falciparum cs protein expressed in recombinant e. coli, and its use as a vaccine
US4806239A (en) * 1986-11-28 1989-02-21 Envirotech Corporation Apparatus for shifting filter plates in a filter press
JPS63159244A (ja) * 1986-12-23 1988-07-02 三菱マテリアル株式会社 二層の押出成形珪酸質―石灰質系成形品の製造方法
WO1988005079A1 (en) * 1986-12-31 1988-07-14 Lucky, Ltd. Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene
WO1988005082A1 (en) * 1987-01-07 1988-07-14 Allied Corporation Microbial production of peptide oligomers
US4977089A (en) * 1987-01-30 1990-12-11 Eli Lilly And Company Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms
WO1988010119A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
FR2624835B2 (fr) * 1987-08-05 1990-09-07 Hassevelde Roger Support ergonomique a creme glacee, a cuillere integree, transformable en tout autre objet apres son utilisation premiere
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
IT1223577B (it) * 1987-12-22 1990-09-19 Eniricerche Spa Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura
JPH0231042U (no) * 1988-08-19 1990-02-27
US5130422A (en) * 1988-08-29 1992-07-14 Monsanto Company Variant somatotropin-encoding DNA
ATE154364T1 (de) 1988-09-02 1997-06-15 Univ Rockefeller Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip- 2)
US5079230A (en) * 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
US5082767A (en) * 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
US5075227A (en) * 1989-03-07 1991-12-24 Zymogenetics, Inc. Directional cloning
US4960301A (en) * 1989-03-27 1990-10-02 Fry Steven A Disposable liner for pickup truck beds
US5164180A (en) 1989-05-18 1992-11-17 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests
US5266477A (en) * 1990-02-02 1993-11-30 Pitman-Moore, Inc. Monoclonal antibodies which differentiate between native and modified porcine somatotropins
CA2041446A1 (en) 1990-05-15 1991-11-16 August J. Sick Bacillus thuringiensis genes encoding novel dipteran-active toxins
US5849694A (en) * 1990-07-16 1998-12-15 Synenki; Richard M. Stable and bioactive modified porcine somatotropin and pharmaceutical compositions thereof
US5202119A (en) * 1991-06-28 1993-04-13 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response
US5744139A (en) * 1991-06-28 1998-04-28 University Of Tennessee Research Corporation Insulin-like growth factor I (IGF-1) induced improvement of depressed T4/T8 ratios
HUT67319A (en) * 1991-08-30 1995-03-28 Life Medical Sciences Inc Compositions for treating wounds
US5591709A (en) * 1991-08-30 1997-01-07 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for treating wounds
US5317012A (en) * 1991-10-04 1994-05-31 The University Of Tennessee Research Corporation Human growth hormone induced improvement in depressed T4/T8 ratio
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1994008611A1 (en) * 1992-10-22 1994-04-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research GROWTH HORMONE FRAGMENT hGH 108-129
JPH08508640A (ja) 1993-03-10 1996-09-17 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ヒト脳ホスホジエステラーゼ
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US5760187A (en) * 1996-02-22 1998-06-02 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Purification process of a human growth hormone
JP3794748B2 (ja) * 1996-03-04 2006-07-12 第一アスビオファーマ株式会社 メタノール代謝系を有する微生物の培養法
WO1998007830A2 (en) * 1996-08-22 1998-02-26 The Institute For Genomic Research COMPLETE GENOME SEQUENCE OF THE METHANOGENIC ARCHAEON, $i(METHANOCOCCUS JANNASCHII)
MX9605082A (es) * 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
WO1998019689A1 (en) * 1996-11-01 1998-05-14 Smithkline Beecham Corporation Novel coding sequences
US6068991A (en) * 1997-12-16 2000-05-30 Bristol-Myers Squibb Company High expression Escherichia coli expression vector
BR9814294B1 (pt) 1997-12-18 2011-10-18 polipeptìdeo cry3bb de b, thuringiensis modificado, composição compreendendo o mesmo, processo para a produção da referida composição, polinucleotìdeo, vetor, vìrus, microorganismo transgênico e métodos para matar e controlar uma população de insetos coleópteros e para preparar uma planta transgênica resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a ataque por insetos coleópteros.
US6087128A (en) 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
DK1066328T3 (da) 1998-03-31 2009-02-09 Tonghua Gantech Biotechnology Kimært protein, der indeholder en intramolekylær chaperon-lignende sekvens, og dets anvendelse til insulinproduktion
US6271444B1 (en) 1998-07-10 2001-08-07 Calgene Llc Enhancer elements for increased translation in plant plastids
US6512162B2 (en) 1998-07-10 2003-01-28 Calgene Llc Expression of eukaryotic peptides in plant plastids
DE19940749A1 (de) 1998-08-28 2000-05-18 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren
ATE456652T1 (de) * 1999-02-19 2010-02-15 Febit Holding Gmbh Verfahren zur herstellung von polymeren
US6946265B1 (en) 1999-05-12 2005-09-20 Xencor, Inc. Nucleic acids and proteins with growth hormone activity
US6187750B1 (en) 1999-08-25 2001-02-13 Everyoung Technologies, Inc. Method of hormone treatment for patients with symptoms consistent with multiple sclerosis
AT408721B (de) 1999-10-01 2002-02-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend ein antigen
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
US6562790B2 (en) 2000-02-05 2003-05-13 Chein Edmund Y M Hormone therapy methods and hormone products for abating coronary artery blockage
CA2747325A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6995246B1 (en) * 2000-10-19 2006-02-07 Akzo Nobel N.V. Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions
DE60136958D1 (de) 2000-12-01 2009-01-22 Takeda Pharmaceutical Verfahren zur herstellung einer zubereitung mit einer bioaktiven substanz
WO2002046435A2 (en) * 2000-12-05 2002-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered plasmids and their use for in situ production of genes
US20020164712A1 (en) * 2000-12-11 2002-11-07 Tonghua Gantech Biotechnology Ltd. Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence
US20030143191A1 (en) * 2001-05-25 2003-07-31 Adam Bell Chemokine beta-1 fusion proteins
US6720538B2 (en) * 2001-06-18 2004-04-13 Homedics, Inc. Thermostat variation compensating knob
DK1578771T3 (da) 2001-10-10 2013-06-10 Novo Nordisk As Remodellering og glycokonjugering af peptider
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
EP1463752A4 (en) 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
ES2425738T3 (es) 2001-12-21 2013-10-17 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de la albúmina
CA2498319A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
PA8588901A1 (es) * 2002-11-20 2005-02-04 Pharmacia Corp Conjugados de hormona de crecimiento humana pegilados n-terminales y proceso para su preparacion
CA2512052C (en) 2002-12-31 2016-06-21 Altus Pharmaceuticals Inc. Human growth hormone crystals and methods for preparing them
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
JP2006517995A (ja) * 2003-02-19 2006-08-03 ファルマシア・コーポレーション 活性化されたポリエチレングリコールエステル類
CA2524623A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-18 Pharmexa A/S Immunogenic human tnf alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation
US8778880B2 (en) * 2004-02-02 2014-07-15 Ambrx, Inc. Human growth hormone modified at position 35
ATE502957T1 (de) * 2004-06-23 2011-04-15 Usv Ltd Chimeres, von den placenta- und hypophysenisoformen abgeleitetes humanes wachstumshormon und verfahren zur gewinnung der chimere
US20060024288A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Pfizer Inc. tRNA synthetase fragments
US8282921B2 (en) * 2004-08-02 2012-10-09 Paul Glidden tRNA synthetase fragments
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
SG161210A1 (en) * 2004-12-22 2010-05-27 Ambrx Inc Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
AU2005322019B2 (en) 2004-12-22 2010-08-26 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
KR20070090023A (ko) * 2004-12-22 2007-09-04 암브룩스, 인코포레이티드 변형 인간 성장 호르몬
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
WO2006135915A2 (en) 2005-06-13 2006-12-21 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating degenerative bone disorders
WO2007005995A2 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Emisphere Technologies, Inc. Compositions for buccal delivery of human growth hormone
WO2007019646A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 University Of Technology, Sydney Liver-directed gene therapy
WO2007059312A2 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Ambrx, Inc. Methods and compositions comprising non-natural amino acids
AU2006330833A1 (en) * 2005-12-23 2007-07-05 Altus Pharmaceuticals Inc. Compositions comprising polycation-complexed protein crystals and methods of treatment using them
DE102006039479A1 (de) 2006-08-23 2008-03-06 Febit Biotech Gmbh Programmierbare Oligonukleotidsynthese
DK2486916T3 (en) 2006-12-18 2015-06-15 Ajinomoto Althea Inc Formulations of Human Growth Hormone
US20080260820A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Gilles Borrelly Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides
JP2010524508A (ja) * 2007-04-27 2010-07-22 ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド 可溶性組換え二十面体ウイルス様粒子の生産及びインビボ組織化の改善
JP2010525812A (ja) 2007-05-02 2010-07-29 メリアル リミテッド 発現及び安定性が改善されたｄｎａプラスミド
WO2009012502A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Self- anchoring mems intrafascicular neural electrode
US7939447B2 (en) * 2007-10-26 2011-05-10 Asm America, Inc. Inhibitors for selective deposition of silicon containing films
NZ620606A (en) 2008-02-08 2015-08-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
SI2279007T1 (sl) 2008-04-29 2016-09-30 Ascendis Pharma Growth Disorders Division A/S Spojine pegiliranega rekombinantnega humanega rastnega hormona
US8647857B2 (en) * 2008-04-30 2014-02-11 Gradalis, Inc. Processes for the digestion of colanic acid
ES2445403T3 (es) * 2008-06-25 2014-03-03 Braasch Biotech Llc Proteína de fusión de somatostatina deficiente en cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el uso de ésta en ganado vacuno vacuno
NZ590010A (en) * 2008-06-25 2013-01-25 Braasch Biotech Llc Compositions and methods treating growth hormone deficiency and/or an insulin-like growth factor 1 deficiency with somatostatin and an adjuvant
US8703717B2 (en) * 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
LT2393828T (lt) 2009-02-03 2017-01-25 Amunix Operating Inc. Prailginti rekombinantiniai polipeptidai ir juos apimančios kompozicijos
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
CA2772051C (en) 2009-08-24 2020-08-18 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
CA2784793A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
SG181769A1 (en) 2009-12-21 2012-07-30 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011103325A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Elona Biotechnologies Methods for preparing human growth hormone
EP2446898A1 (en) 2010-09-30 2012-05-02 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients
CN103415621A (zh) 2011-01-14 2013-11-27 雷德伍德生物科技股份有限公司 醛标记免疫球蛋白多肽及其使用方法
RU2473556C1 (ru) * 2011-07-14 2013-01-27 Закрытое акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Промышленный способ получения и очистки рекомбинантного гормона роста человека из телец включения
CA2863964C (en) 2012-02-07 2021-10-26 Global Bio Therapeutics Usa, Inc. Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof
KR102008190B1 (ko) 2012-02-15 2019-08-07 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 재조합 인자 viii 단백질
ES2935489T3 (es) 2012-02-15 2023-03-07 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
JP2015519879A (ja) 2012-03-26 2015-07-16 プロニュートリア・インコーポレイテッドＰｒｏｎｕｔｒｉａ， Ｉｎｃ． 荷電栄養タンパク質および方法
JP2015518470A (ja) 2012-03-26 2015-07-02 プロニュートリア・インコーポレイテッドＰｒｏｎｕｔｒｉａ， Ｉｎｃ． 栄養タンパク質および方法
WO2013148325A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
CN104364259A (zh) 2012-03-26 2015-02-18 普罗努塔利亚公司 营养性片段、蛋白质和方法
US9457096B2 (en) 2012-07-06 2016-10-04 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Concet) Protozoan variant-specific surface proteins (VSP) as carriers for oral drug delivery
EP3030163B1 (en) 2013-08-08 2019-03-20 Global Bio Therapeutics, Inc. Clamp device for minimally invasive procedures
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
RU2016110842A (ru) 2013-09-25 2017-10-30 Пронутриа Биосайенсис, Инк. Композиции и составы для предотвращения и уменьшения опухолеобразования, пролиферации и инвазии раковых клеток, и способы их получения и применения при лечении раковых заболеваний
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
CN109071634A (zh) 2016-04-26 2018-12-21 R.P.谢勒技术有限责任公司 抗体偶联物及其制备和使用方法
KR20210024082A (ko) 2018-06-25 2021-03-04 제이씨알 파마 가부시키가이샤 단백질 함유 수성 액제
CN109486847B (zh) * 2018-12-17 2021-03-02 江南大学 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3853832A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Harmone Res Foundation Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it
US3853833A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Hormone Res Foundation Synthetic human growth-promoting and lactogenic hormones and method of producing same
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
NL7607683A (nl) * 1976-07-12 1978-01-16 Akzo Nv Werkwijze ter bereiding van nieuwe peptiden en peptide-derivaten en de toepassing hiervan.
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
NZ187300A (en) * 1977-05-27 1982-08-17 Univ California Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism
US4363877B1 (en) * 1977-09-23 1998-05-26 Univ California Recombinant dna transfer vectors
CH630089A5 (de) * 1977-09-09 1982-05-28 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von siliciummodifizierten imidyl-phthalsaeurederivaten.
JPS5449837A (en) * 1977-09-19 1979-04-19 Kobashi Kogyo Kk Safety apparatus of soil block making machine
ZA782933B (en) * 1977-09-23 1979-05-30 Univ California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4407948A (en) * 1977-09-23 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4321365A (en) * 1977-10-19 1982-03-23 Research Corporation Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
IE47889B1 (en) * 1977-11-08 1984-07-11 Genentech Inc Synthetic dna and process tehrefor
BR7807288A (pt) * 1977-11-08 1979-06-12 Genentech Inc Processo para sintese de polinucleotidos
GR72861B (no) 1977-11-08 1983-12-13 Genentech Inc
GB2007676B (en) * 1977-11-08 1982-09-08 Genentech Inc Method and means for microbial polypeptide expression
US4356270A (en) * 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
US4652525A (en) * 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
FI792481A (fi) * 1978-08-11 1980-02-12 Univ California Syntes av enkaroytiskt protein genom anvaendning av mikro-organismer
EP0009930B2 (en) * 1978-10-10 1988-08-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Recombinant dna, method for preparing it and production of foreign proteins by unicellular hosts containing it
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
ZA802992B (en) * 1979-06-01 1981-10-28 Univ California Human pre-growth hormone
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
GR70279B (no) * 1979-09-12 1982-09-03 Univ California
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it
GR79124B (no) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
CA1267615A (en) * 1984-08-27 1990-04-10 Dan Hadary Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
NZ201312A (en) 1983-09-30
AU2583484A (en) 1984-07-12
NO167673C (no) 1991-11-27
CA1164375A (en) 1984-03-27
ES499043A0 (es) 1982-06-01
IT1131393B (it) 1986-06-18
BE884012A (fr) 1980-12-29
JP2622479B2 (ja) 1997-06-18
NO167674C (no) 1991-11-27
MY8500764A (en) 1985-12-31
KR870000701B1 (ko) 1987-04-07
CS254973B2 (en) 1988-02-15
WO1981000114A1 (en) 1981-01-22
US4342832A (en) 1982-08-03
IE801214L (en) 1981-01-05
DD157343A5 (de) 1982-11-03
EP0022242A3 (en) 1982-04-07
JPH02478A (ja) 1990-01-05
EG14819A (en) 1985-03-31
DK97381A (da) 1981-03-04
DD210070A5 (de) 1984-05-30
FI850198L (fi) 1985-01-16
ES8105386A1 (es) 1981-05-16
PL225376A1 (en) 1983-07-18
CH661939A5 (de) 1987-08-31
FI850198A0 (fi) 1985-01-16
JPH05268970A (ja) 1993-10-19
KR830003574A (ko) 1983-06-21
DE3050722C2 (no) 1987-09-24
FR2518572A1 (fr) 1983-06-24
ATE82324T1 (de) 1992-11-15
PH19814A (en) 1986-07-08
IL60312A (en) 1985-04-30
MX172674B (es) 1994-01-06
JPH0612996B2 (ja) 1994-02-23
GB2121047A (en) 1983-12-14
IE50462B1 (en) 1986-04-30
NL930114I2 (nl) 1994-10-17
GB2055382B (en) 1983-10-19
DK172132B1 (da) 1997-11-24
JPH0648987B2 (ja) 1994-06-29
US4634677A (en) 1987-01-06
KE3450A (en) 1984-10-05
EP0022242A2 (en) 1981-01-14
JPS5621596A (en) 1981-02-28
US4601980A (en) 1986-07-22
US5424199A (en) 1995-06-13
FI802030A (fi) 1981-01-06
FR2460330A1 (fr) 1981-01-23
IL69492A (en) 1985-04-30
PL149278B1 (en) 1990-01-31
US4604359A (en) 1986-08-05
US4658021A (en) 1987-04-14
NZ194043A (en) 1983-09-30
IL60312A0 (en) 1980-09-16
HK87584A (en) 1984-11-16
JPH08242881A (ja) 1996-09-24
FR2460330B1 (fr) 1985-07-19
KE3451A (en) 1984-10-05
GR69320B (no) 1982-05-14
YU121183A (en) 1984-02-29
ES493149A0 (es) 1981-05-16
IE50460B1 (en) 1986-04-30
DE3050725C2 (no) 1988-03-10
NO167673B (no) 1991-08-19
NO860680L (no) 1981-02-20
AU1838883A (en) 1984-01-05
CA1202256A (en) 1986-03-25
RO93374A (ro) 1988-01-30
CS270884A2 (en) 1987-07-16
AR244341A1 (es) 1993-10-29
NO810608L (no) 1981-02-20
ZA803600B (en) 1981-07-29
DD210071A5 (de) 1984-05-30
CS250652B2 (en) 1987-05-14
IE842193L (en) 1981-01-05
AU533697B2 (en) 1983-12-08
ZW14180A1 (en) 1980-09-10
AU5949880A (en) 1981-01-15
DK251490D0 (da) 1990-10-18
PT71487A (en) 1980-08-01
DE3023627A1 (de) 1981-01-22
EP0022242B1 (en) 1992-11-11
CS250655B2 (en) 1987-05-14
ES8205265A1 (es) 1982-06-01
IE50461B1 (en) 1986-04-30
IT8023070A0 (it) 1980-06-26
DK251490A (da) 1990-10-18
YU163580A (en) 1984-02-29
GB2121047B (en) 1984-06-06
IL69492A0 (en) 1983-11-30
NL930114I1 (nl) 1993-10-18
OA06562A (fr) 1981-07-31
US5795745A (en) 1998-08-18
MY8500763A (en) 1985-12-31
AU574351B2 (en) 1988-07-07
HK87384A (en) 1984-11-16
KE3446A (en) 1984-10-05
BG41135A3 (en) 1987-04-15
RO93374B (ro) 1988-01-31
YU121283A (en) 1984-02-29
DK173503B1 (da) 2001-01-15
HK87484A (en) 1984-11-16
GB2055382A (en) 1981-03-04
BR8008736A (pt) 1981-04-28
MY8500765A (en) 1985-12-31
FR2518572B1 (fr) 1985-08-23
SG56984G (en) 1985-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO167674B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid.
EP0154133B1 (en) Plasmidic expression vehicles, and method of producing a polypeptide therewith
EP0131843B1 (en) Expression vectors for enhanced production of polypeptides, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods
US4898830A (en) Human growth hormone DNA
EP0075444A2 (en) Methods and products for facile microbial expression of DNA sequences
EP0219237A1 (en) A bacterial methionine N-terminal peptidase, its preparation and application
EP0070675A1 (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
HU197937B (en) Process for producing new cloning carriers usable for the expression of polypeptides in microbiological host cells
EP0295285B1 (en) Method for the production of bovine growth hormone using a synthetic gene
US5470721A (en) Production of human somatomedin C
GB2121048A (en) Microbial expression of quasi- synthetic genes
JPH0691833B2 (ja) 利尿作用を有するポリペプチドの製造方法