CH661939A5 - Verfahren zum konstruieren von sich replizierenden clonierenden vektoren und deren verwendung zur mikrobiellen expression von quasi-synthetischen genen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung stellt Methoden und Mittel zur Expression quasi-synthetischer Gene zur Verfügung, wo-50 bei durch reverse Transkription ein wesentlicher Bestandteil, vorzugsweise die Mehrheit der codierenden Sequenz zur Verfügung gestellt wird, ohne den arbeitsaufwendigen Umweg der vollständigen synthetischen Konstruktion, während die Synthese des Rests der codierenden Sequenz ein komplettes 55 Gen liefert, das fähig ist zur Expression des gewünschten Polypeptids, ohne die Begleitung von bioinaktivierenden Leader-Sequenzen oder anderem Fremdprotein. Alternativ dazu kann der syntetische Rest ein gegen Proteolyse resistentes Konjugat ergeben, so gebaut, dass das Schneiden des 6o Fremdproteins ausserhalb der Zelle ermöglicht ist, wodurch die bioaktive Form erhalten wird. Die Erfindung stellt folglich Methoden und Mittel für die mikrobielle Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch kostenaufwendige Ex-65 traktion aus Gewebe hergestellt werden konnten und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet waren. In ihrer am meisten bevorzugten Form stellt die Erfindung die erste Möglichkeit dar, mit der ein medizinisch signifikan-

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tes Polypeptidhormon (menschliches Wachstumshormon) bakteriell exprimiert wird, wobei sowohl die intrazelluläre Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Kompartimentie-rung der bioaktiven Form mit Fremdprotein bis zum extrazellulären Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Kom-partimentierung der bioaktiven Form mit Fremdprotein bis zum extrazellulären Schneiden vermieden wird. Der mikrobielle Ursprung für menschliches Wachstumshormon, ermöglicht durch die Erfindung, bietet vorerst einen reichen Vorrat des Hormons für die Behandlung von Zwergenwuchs, zusammen mit anderen Anwendungsmöglichkeiten, die bisher jenseits der Kapazität der Hormone lagen, die aus Geweben zu erhalten waren, einschliesslich diffusem Magenbluten, Pseudoarthrose, der Therapie von Brandwunden, Wundheilung, Dystrophie und der Heilung von Knochen-brüchen.

Die Art, auf welche diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung erreicht werden können, wird aus der folgenden Spezialbeschreibung verständlich sowie aus den beigefügten Zeichnungen, die sich auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung beziehen. Es zeigen:

Fig. 1 das Syntheseschema für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim Clonen verwendet werden. Die Pfeile im codierenden oder oberen Strang («U») und in dem komplementären oder unteren Strang («L») bezeichnen die Oligonucleotide, die miteinander verbunden wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;

Fig. 2 die Verbindungen der «U»- und «L»-01igonucleo-tiden, für die Bildimg des Genfragments aus Fig. 1, und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendem Vektor;

Fig. 3 die DNA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines Haelll-Restriktionsenzymfragments eines Hypophysen-mRNA-Transkripts, mit den numerierten Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren. Schlüsselrestriktionserkennungsstellen sind bezeichnet, ebenso DNA (auf «Stop» folgende) für nicht translatierte mRNA;

Fig. 4 die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein Genfragment, das für die Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplementäre DNA durch reverse Transkription von mRNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;

Fig. 5 die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons fähig ist, beginnend mit dem Plasmiden der Figuren 2 und 3.

Der generelle Weg der Erfindung ist die Kombination mehrerer Genfragmente in einem einzigen clonierenden Vektor, wobei diese Genfragmente in Kombination für die Expression des gewünschten Produkts codieren. Von den Genfragmenten ist mindestens eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet ist, welche aus Gewebe isoliert wurde, wie durch die Methode nach A. Ullrich et al., Science 196,1313 (1977). Die cDNA stellt vorzugsweise einen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons für das gewünschte Produkt zur Verfügung, während restliche Teile des Gens synthetisch erhalten werden. Die synthetischen und die mRNA-Transkriptfragmente werden getrennt geclont, um ausreichende Mengen für den Einsatz in dem späteren Kombinationsschritt zur Verfügung zu stellen.

Eine Vielzahl von Überlegungen beeinflusst die Verteilung der Codons für das Endprodukt, z.B. zwischen synthetischer und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxam und Gilbert, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977). Komplementäre DNA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche ; Weise Codons für mindestens eine Carboxyl-Endgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Translations-Stopsigna-len, benachbart zum Carboxylende liegende Codons für nicht translatierte mRNA. Die Anwesenheit von DNA für it nicht translatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermässig verlängerte Sequenzen dieser Art z.B. durch Schneiden mit Restriktionsenzymen entfernt werden können, um zelluläres Material zu erhalten, das für die Replikation und Expression der DNA für das angestrebte Produkt benö-i5tigt wird. In besonderen Fällen wird die cDNA Codons für die vollständige, gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso wie fremde Codons stromaufwärs vom Aminoende des angestrebten Produkts. Zum Beispiel werden viele, wenn nicht alle, Polypeptidhormone in einer Vorläuferform expri-20 miert mit Leader- oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispielsweise beim Transport zur Zellwand beteiligt ist. Während der Expression in eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt, so dass das Hormon in seiner freien, bioaktiven Form in den periplasmatischen 25 Raum eindringt. Man kann sich jedoch nicht darauf verlassen, dass mikrobielle Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert, Sequenzen, die für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mRNA-Tran-skript zu entfernen. Im Verlauf dieses Entfernungsvorgangs 30 geht auch das Translations-Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige Codons für das angestrebte Produkt entfernt. Die synthetische Komponente des quasisynthetischen Genprodukts der Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso stellt sie ein neues Translations-35 Startsignal zur Verfügung, wobei der Vektor, in dem sich das Hybridgen letztlich entwickeln wird, selbst keinen günstig gelegenen Start aufweist.

Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus Wachstumshor-mon-cDNA wird begünstigt durch das Zurverfügungstellen 40 einer Restriktionserkennungsstelle innerhalb des das Wachstumshormon codierenden Teil des Gens. Die Erfindung kann nichtsdestotrotz auch ohne das Zurverfügungstellen einer solchen Erkennungsstelle durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Re-45 striktionserkennungsstelle, die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten Polypeptids liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht von mRNA abgeleitet ist. In jeder cDNA, die für das gewünschte Polypeptid und eine Leader-50 oder andere bioinaktivierende Sequenz codiert, wird sich daher die Grenze zwischen den Codons der letzteren und denen für das reife Polypeptid an der Aminosäurensequenz des reifen Polypeptids zeigen. Man kann einfach in die Gene verdauen, die für das Peptid der Wahl codieren, und so die un-55 gewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen. Wenn daher beispielsweise eine cDNA folgender Struktur gegeben ist:

60

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hH~H /

TTAAGC CCTGATCGT AATTCGGGACTAGCA

j+_c->|*-d—vj V

etc,

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wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet ist, kann eine Reaktionsbedingung für eine Exonu-clease-Verdauung gewählt werden, um die oberen Sequenzen «a» und «b» zu entfernen, wonach eine Sl-Nuclease-Verdau-ung automatisch die unteren Sequenzen «c» und «d» eliminiert. Alternativ dazu und präziser kann man DNA-Polyme-rase-Verdauung in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphos-phaten («d(A, T, C, G,) TP») einsetzen. Im obengenannten Beispiel wird daher DNA-Polymerase in der Gegenwart von dGTP die Sequenz «c» entfernen (und bei «G» anhalten), daraufhin wird Sl-Nuclease «a» verdauen; DNA-Polymerase in Gegenwart von dTTP wird «d» entfernen und bei «T» anhalten) und Sl-Nuclease wird dann «b» herausschneiden usw. Siehe allgemein A. Kornberg, DNA Synthesis, S. 87-88, W. H. Freeman und Co., San Francisco (1974).

Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Restriktions-erkennungsstelle an einem passenden Punkt innerhalb des Bereichs der cDNA, die für das gewünschte Produkt codiert, konstruieren, durch Anwendung der «unpassenden» (mis-match) Reparatursynthesetechnik von A. Razin et al., Proc.

Nat'l. Acad. Sei. USA 75, 4268 (1978). Bei dieser Technik können eine oder mehrere Basen in eine bestehende DNA-Sequenz substituiert werden, wobei Primer verwendet wer-5den, die den unpassenden Substituenten enthalten. Mindestens sieben palindromartige 4-Basenpaarsequenzen werden selektiv durch bekannte Restriktionsenzyme erkannt, das sind AGCT (Alul), CCGG (Hpall), CGCG (Thal), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC (Haelll), und TCGA

10(TaqI). Wenn die cDNA-Sequenz eine Sequenz enthält, die sich von einer derartigen Erkennungsstelle in nur einer einzigen Base unterscheidet, was statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese eine replizierte cDNA zu erhalten, die die geeignete, substituierte Base enthält und da-

15 mit die gewünschte Restriktionserkennungsstelle. Durch einen Schnitt wird die DNA von unerwünschten Leader entfernt, wonach durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptids benötigt werden. Zum Beispiel:

20

»Leader -

Codon für gewünschtes Produkt—»4 •a*

1

CAGG

"mismatch"Reparatursynthese ic

CDNA

-CCGG

Synthese quasisynthetische DNA

Codons für gewünschtes *i* Produkt

Es ist natürlich offensichtlich, dass längere Restriktions-erkennungsstellen auf ähnliche Weise eingesetzt werden können, wo das erwünscht ist, oder dass durch sukzessive Reparatur 4-Basenpaar-Restriktionserkennungsstellen gebildet werden können, wo lediglich 2 Basen gemeinsam mit der Erkennungsstelle am gewünschten Punkt erscheinen usw.

Es werdem sich Anwendungsmöglichkeiten zeigen, bei denen es wünschenswert ist, nicht nur die Aminosäuresequenz des angestrebten Produkts, sondern auch eine bestimmte Menge fremdes, aber speziell hergestelltes Protein zu exprimieren. Vier derartige Anwendungen werden durch Beispiele erwähnt werden. Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf welche Immunogenität durch Konjugation zu einem zusätzlichen Protein übertragen wird, so dass eine Vaccine produziert wird. Siehe allgemein GB-Pa-tent 2 008 123 A. Es kann jedoch wieder aus Sicherheitsgründen wünschenswert sein, das angestrebte Produkt als eine Konjugate eines anderen, bioinaktiven Proteins zu exprimieren, die so gebaut sind, dass extrazelluläres Schneiden ermöglicht ist, um die aktive Form zu erhalten. Drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange das Signal-Peptid danach geschnitten werden kann. Schliesslich kann eine Fremdverbindung verwendet werden, die so gebaut ist, dass ein spezifischer extrazellulärer Schnitt möglich ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen des mi-4S krobiellen Wirts. Zumindest in den letzten drei Anwendungsbereichen kann der synthetische molekulare Adapter, der verwendet wird, um die codierende Sequenz des mRNA-Transkripts zu vervollständigen, zusätzlich Codons eingebaut haben für Aminosäuresequenzen, die spezifisch ge-50 schnitten werden, beispielsweise durch enzymatische Wirkung. Beispielsweise schneidet Trypsin oder Chymotrypsin bei Arg-Arg oder Lys-Lys usw. Siehe GB-Patent 2 008 123 A.

Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, dass die Erfindung in ihrem breitesten Bereich die mannigfaltigsten Anwendungen erlaubt, von denen alle die folgenden Eigenschaften gemeinsam aufweisen:

- Es wird ein mRNA-Transkript verwendet, das für eignen wesentlichen Bestandteil der angestrebten Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, das jedoch, falls es alleine exprimiert wird, ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würde, entweder kleiner oder grösser als das angestrebte Produkt;

- Protein codierende Codons für andere als solche Aminosäuren, die im angestrebten Produkt enthalten sind, werden, falls vorhanden, entfernt;

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- organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz codieren; und

- das mRNA-Transkript und das (die) synthetische(n) Fragment(e) werden zusammengefügt und in einen Promoter enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes, konjugiertes Protein, oder das angestrebte Produkt konjugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und exprimiert wird.

Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall mit der Aminosäure beginnen, für die das Translations-Startsignal codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin). Man kann erwarten, dass diese Aminosäure intrazellulär entfernt wird, oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden Produkts im wesentlichen unbeeinflusst lässt.

Obwohl die Erfindung ein Verfahren allgemeiner Anwendbarkeit bei der Produktion von nützlichen Proteinen, einschliesslich Antikörpern, Enzymen und ähnlichem zur Verfügung stellt, ist die Erfindung im besonderen auf die Expression von Polypeptidhormonen von Säugetieren und anderen Substanzen mit medizinischer Anwendung gerichtet, z.B. Glucagon, gastrointestinale Inhibitorpolypeptide, Polypeptide der Bauchspeicheldrüse, Adrenokortikotropin, ß-En-dorphine, Interferon, Urokinase, Blutgerinnungsfaktoren, menschliches Albumin usw. Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform, die die Erfindung erläutert, beschrieben; bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für menschliches Wachstumshormon codiert, konstruiert, ge-clont und mikrobiell exprimiert wird.

Konstruktion und Expression eines clonierenden Vektors für menschliches Wachstumshormon

1. Cionieren des Hae-III-Fragments des mRNA-Transkripts (Fig. 3 und 4)

Polyadenylierte mRNA für menschliches Wachstumshormon (HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzierenden Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). 1,5 ng von Doppelstrang-(«ds»)-cDNA wird präpariert aus 5 ng dieser RNA, im wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al., J. Biol. Chem. 253 2483 (1978), mit der Ausnahme, dass die RNA-Polymerase «Klenow-Fragment», (H. Klenow, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 65, 168 (1970) ) für die DNA-Poly-merase I in der Zweit-Strangsynthese eingesetzt wurde. Das Restriktionsmuster von HGH ist derartig, dass Hae-III-Restriktionserkennungsstellen in der 3' nichtcodierenden Region und in der Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und 24 des HGH codieren, vorhanden sind, wie gezeigt in Fig. 3. Eine Behandlung der ds-HGH-cDNA mit Hae-III gibt ein DNA-Fragment von 551 Basenpaaren («bp»), die für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH codieren. 90 ng der cDNA wird mit Hae-III behandelt, in einem 8%igen Poly-acrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die Region bei 550 bp eluiert. Man erhält annähernd 1 ng cDNA.

pBR322, hergestellt nach F. Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95-113, wird als clonierender Vektor für die cDNA ausgewählt. pBR322 ist vollständig charakterisiert, (J. G. Sutclif-fe, Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 (1978) ), ist ein mit zahlreichen Kopien (multicopy) replizierendes Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-Resistenz aufweist, die auf den Einschluss der korrespondierenden Gene («ApR» bzw. «TcR» in Fig. 4) zurückzuführen sind, wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Pstl, EcoRI und Hindill enthält, wie in der Figur gezeigt.

Die Schneideprodukte von Haelll und Pstl haben stumpfe Enden. Es kann folglich das GC-Anhängeverfahren nach Chang A.C.Y, et al., Nature 275 617 (1978) angewendet werden, um die stumpfendigen Produkte der Pstl-Schnitte von pBR322 mit der Haelll-Verdauung des mRNA-Tran-skripts zu verbinden, so dass das cDNA-Fragment in die Pstl-Erkennungsstelle von pBR322 eingefügt wird, und zwar s in der Weise, dassdie Haelll-Restriktionserkennungsstellen (GG (GGJ.CC) auf der cDNA und die Pstl-Restriktionser-kennungsstellen (CTGCAJ.G) an jedem Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden.

Es wird also terminale Desoxynucleotid-Transferase io (TdT) verwendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3'-Ende anzufügen, wie bereits früher beschrieben, Chang A.Y.C., a.a.O. Auf ähnliche Weise werden an das 3'-Ende von 60 ng Pstl-behandeltem pBR322 etwa 10 dG-Reste angehängt. Das Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDNA mit der dG-15 ergänzten Vektor-DNA wird in 130 jo.1 von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 100 mM NaCl und 0,25 mM EDTA durchgeführt. Die Mischung wird auf 70 °C erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37 °C abgekühlt, und schliesslich auf 20 °C (6 Stunden) abgekühlt, ehe es zum Transformieren von E. coli x 1776 2o verwendet wird. Eine DNA-Sequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasmids in x 1776, stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH überein, wie in Fig. 3 gezeigt. 25 Der Stamm E. coli K-12 X1776 hat den Genotyp F'ton-A53, dapD8, minAl, supE42, A40 (gal-uvrB), X", minB2, rfb-2, nalA25, oms-2, thyA57*, metC65, oms-1, A29 (bioH-asd), cycB2, cycAl, hsdR2. x 1776 wurde vom National Institutes of Health als ein EK2 Wirts-Vektor-System beschei-3o nigt.

xl776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelin-säure (DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolan-(colanic)säure synthetisieren. Die Zelle unterliegt daher dem 35 DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP begrenzt ist, jedoch genügend Nährsubstrat vorhanden ist, um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der Stamm ist Thymin- oder Thymidin-be-dürftig und unterliegt dem Thymin-Mangeltod mit Abbau l0 der DNA, wenn Thymin und Thymidin in der Umgebung fehlen, jedoch genügend Nährsubstrate vorhanden sind, um die Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten. xl776 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, d.h. unfähig, eine Passage durch den Intestinal-45 trakt von Ratten zu überleben. xl776 ist hochgradig empfindlich gegen Detergentien, Antibiotika, Arzneimittel und Chemikalien. xl776 kann weder die Dunkelreparatur noch die Photo-Reaktivierung von UV-induzierten Schäden durchführen und ist daher um mehrere Grössenordnungen 50 empfindlicher gegen Sonnenlicht als der Wildtypstamm von E. coli. xl776 ist resistent gegen viele transduzierende Pha-gen und lässt bei der Konjugation nur mangelhaft die genetische Übertragung von vielen verschiedenen Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasmiden zu, was auf die An-55 Wesenheit von verschiedenen Mutationen zurückzuführen ist. xl776 ist resistent gegen Nalidixinsäure, Cycloserin und Trimethoprim. Diese Substanzen können daher dem Medium zugegeben werden, um das Überprüfen des Stamms zu ermöglichen und eine Transformation von Kontaminanten 60 während der Transformation auszuschliessen.

xl776 wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min. sowohl in L-Nährmedium (L-broth) als auch Penassay-Me-dium (Penassay broth), wenn dieses mit 100 ng DAP/ml und 4 ng Thymidin/ml supplementiert wird und erreicht eine 65 Enddichte von 8-10 x 108 Zellen/ml in der stationären Phase. Vorsichtiges, kreisförmiges Hin- und Herschütteln für eine Zeitspanne von 1 bis 2 Minuten suspendiert die Zellen vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100%. Zu

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sätzliche Details bezüglich xl776 sind zu finden bei R. Curtis et al., Molecular Cloning of Recombinant DNA, 99-177, Scott und Werner, eds., Academic Press (N.Y. 1977). xl776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection am 3. Juli 1979 unter der Nummer ATCC 31 537 hinterlegt.

2. Konstruktion und Cionieren des synthetischen Genfragments (Fig. 1 und 2)

Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH-quasi-synthetischen Gens, dass ein synthetisches Fragment konstruiert wird, das stumpfendige Restriktionsschneidestellen aufweist, die an den Punkten sitzen, an denen an das Fragment das mRNA-Transkript angeknüpft werden soll. Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren des HGH enthält daher, wie in Fig. 1 gezeigt, eine auf die Aminosäure 23 folgende Haelll-Schneideerkennungsstelle. Das distale Ende des synthetischen Fragments wird mit einem Verbindungselement (im folgenden «Linker») versehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dem Plasmid erhalten wird, in das das mRNA-Transkript und das synthetische Fragment letzlich eingebaut werden sollen.

Wie in Fig. 1 gezeigt, haben die5'-Enden des doppelsträngigen Fragments einzelsträngige cohäsive Enden für die EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonucleasen, um die Plas-mid-Konstruktion zu erleichtern. Das Codon für Methionin am linken Ende stellt eine Erkennungsstelle für die Initiation der Translation zur Verfügung. Es werden zwölf verschiedene Oligonucleotide, die in ihrer Grösse von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem bewährten Phosphotriester-Verfahren nach Crea, R. Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 75, 5765 (1978). Diese Oligonucleotide, U[ bis U6 und L] bis L6 sind durch Pfeile bezeichnet.

10 |ig Substanz von U2 einschliesslich U6 und L2 einschliesslich L6 werden unter Verwendung der T4-Polynucleo-tidkinase und (y32-P) ATP phosphoryliert, und zwar nach dem veröffentlichten Verfahren von Goeddel, D.V. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979).

Es werden drei getrennte T4-Ligase-katalysierte Reaktionen durchgeführt: lOjxg des 5'-OH-Fragments Uj werden mit phosphoryliertem U2, Ls und L6 vereint; phosphoryliertes U3, U4, L3 und L4 werden vereint; weiterhin werden 10 ng des 5'-OH-Fragments Lj mit phosphoryliertem L2, U5 und U6 vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4 °C für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300 pl von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,10 mM Dithiothrei-tol und 0,5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4-Ligase verwendet werden. Die drei Verknüpfungsmischungen werden dann vereint, 100 Einheiten T4-Ligase zugegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20 °C ablaufen lässt. Die Mischung wird dann mit Äthanol ausgefallt und auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen. Die Bande, die bis zur 84 Basenpaar-Stelle gewandert ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert. pBR322 (1 (ig) wird mit EcoRI und Hindlll behandelt, das grosse Fragment durch Gel-elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DNA verknüpft. Diese Mischung wird verwendet, um den Stamm E. coli K-12 294 (end A, thi~, hsr~, hsmk+) zu transformieren. Der Stamm 294 wurde am 30. Oktober 1978 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31 466 ohne Einschränkungen hinterlegt. Eine Sequenzanalyse nach der Maxam und Gilbert-Technik, a.a.O., bei der EcoRI - Hin-dlll-Insertion von einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte das in Fig. 1 Dargestellte.

3. Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression von HGH (Fig. 5)

Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mRNA-Transkript in pHGH31 wird ein zur Replikation fä-; higes Plasmid konstruiert, das beide Fragmente enthält, wobei das Expressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Fig. 5 gezeigt. Das Expressionsplasmid, das einen lac-Pro-moter als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermassen konstruiert. Ein 285 Basenpaare langes EcoRI-Fragment, i(das zwei 95 Basenpaare lange UV5-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche durch ein 95 Basenpaar langes, heterologes DNA-Fragment getrennt sind, wird aus dem Plasmid pKB268 isoliert, siehe K. Backman et al., Cell. Vol. 13, 65-71 (1978). Das 285 bp-Fragment wird in die EcoRI-Er-iskennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGHl isoliert, in dem die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene EcoRI-Erkennungsstelle wird durch teilweise EcoRI-Ver-20dauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI-Enden mit DNA-Polymerase I repariert und das Plasmid durch stumpfendige Verbindung wieder in Ringform gebracht. Das resultierende Plasmid, pGH6, enthält eine einzige EcoRI-Erkennungsstelle, die passend liegt im Hinblick 25 auf das Promoter-System, in das das komplette Gen für HGH eingebaut werden kann.

Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem RNA-Transkript fertigzustellen, werden lOjxg von pHGH3 mit EcoRI- und HaelH-Restriktionsendonucleasen 30 geschnitten und das 77 Basenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8%igen Polyacrylamid-Gel isoliert.

Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 (5(ig) mit Haelll geschnitten. Die 551 bp HGH-Sequenz und ein mit-35 gewandertes 540 bp Haelll-Fragment von pBR322 werden durch Gel-Elektrophorese gereinigt. Eine anschliessende Behandlung mit Xmal schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3'-nichtcodierenden Region entfernt werden. Das resultierende 512 bp-Fragment wird von dem 40 540 bp pBR322-HaeIII-Stück durch Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel getrennt. 0,3 ng des 77 bp EcoRI-Haelll-Fragments werden mit T4-Ligase in einer 16nl Reaktion 14 Stunden lang bei 4 °C polymerisiert. Die Mischung wird dann für 5 Minuten (5') auf 70 °C erhitzt, um 45 die Ligase zu inaktivieren, anschliessend mit EcoRI behandelt (um Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer EcoRI-Erkennungsstellen dimerisiert haben), weiterhin mit Smal behandelt (um Xmal-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591 bp-Fragment mit einem EcoRI-Ende, das cohäsiv ist, 50 und einem Smal-Ende, das stumpf ist, erhalten wird. Nach der Reinigung auf einem 6%igen Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses Fragments. Es sollte bemerkt werden, dass das Expressionsplasmid pGH6 keine Xmal-Er-kennungsstelle enthält. Smal erkennt jedoch die gleiche Er-55 kennungsstelle wie Xmal, aber schneidet genau durch die Mitte, so dass stumpfe Enden erhalten werden. Das Sma-geschnittene Ende des Fragments, das von gHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pGH6 gebunden werden.

60 Das Expressionsplasmid pGH6, das den lac-UV5-Pro-moter in Tandemform enthält, wird sukzessive mit Hindlll, Nuclease S1 und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt. 50 ng des resultierenden Vektors, der ein-cohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird 65 mit 10 ng der 591 bp HGH-DNA verbunden. Diese Verbindungsmischung wird verwendet, um E. coli xl776 zu transformieren. Die Kolonien werden durch Wachstum auf Tetracyclin (12,5 ng/ml) selektiert. Es ist bemerkenswert, dass

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die Insertion des hybriden HGH-Gens in pGH6 den Promoter für die Tetracyclin-Resistenz zerstört, dass jedoch der Tandem-lac-Promoter das Durchlesen der Strukturgene für Tetracyclin-Resistenz erlaubt und auf diese Weise die Selektionscharakteristik erhalten bleibt. Es wurden annähernd 400 Transformanten erhalten. Mit der Grunstein-Hogness-Methode, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 72,3961 (1975), wurden durch Füterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequenz enthalten. Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben das erwartete Restriktionsmuster, wenn sie mit Haelll, PvuII und Pstl geschnitten wurden. Von einem Clon, pHGH107, wurde die DNA-Sequenz bestimmt.

Menschliches Wachstumshormon, das von Transformanten produziert wird, kann ohne weiteres durch direkten Ra-dioimmunoassay nachgewiesen werden, welcher aus Verdünnungsreihen des Überstands lysierter Zellen durchgeführt wird, unter Verwendung von Phadebas HGH PRIST kit (Farmacia).

Um aufzuzeigen, dass die HGH-Expression unter der Kontrolle des lac-Promoters steht, wird pHGH107 in einen E. coli-Stamm D1210 (lac+(iQ0+z+y+) ), einem Stamm, der den lac-Repressor überproduziert, transformiert. Bis zur Zugabe des Induktors IPTG (Isopropylthiogalactosidolipo-id) kann keine nennenswerte Menge von HGH-Expression nachgewiesen werden.

Ein Entfernen der EcoRI-Erkennungsstelle in PHGH107 hätte zur Folge, dass das ATG-Startsignal von den Codons der Ansatzstelle für die Ribosomen des lac-Promoters den gleichen Abstand hätte, den diese Codons natürlicherweise vom Startsignal für B-Galactosidase haben. Um festzustellen, ob die Expression durch Nachahmung dieses natürlichen Abstands zu steigern ist, wurde pHGH107 in pHGH107-l überführt, indem das erstere Plasmid mit EcoRI geöffnet wurde, die entstehenden Einzelstrangenden mit Sl-Endonuclease verdaut wurden und das Plasmid durch Verbinden der stumpfen Enden mit T4-Ligase wieder in Ringform überführt wurde. Obwohl sich zeigte, dass das erhaltene Plasmid in ähnlicher Weise zur Expression von HGH fähig war, produzierte es jedoch HGH überraschenderweise in geringerem Umfang als pHGH107, wie durch direkten Radioimmunoassay gezeigt werden konnte.

Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschliesslich auf den Schutzbereich der Patentansprüche. Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, des angestrebten Polypeptidprodukts oder sonstigem. Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem Arabinose-Operon (phi80 dara) oder dem Colicin-El-, Galactose-alka-lische Phosphatase- oder Tryptophan-Promoter. Wirtsorganismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familie der Enterobacteria-ceae, z.B. die Stämme Escherichia coli und Salmonella; aus der Familie der Bacillaceae, z.B. Bacillus subtilis; weiterhin Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae. Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien für rekombinante DNA des National Institutes of Health, 43 Fed. Reg. 60 080 (1978) durchgeführt werden sollen.

Für die Arbeit der vorhegenden Erfindung im Labormassstab eignet sich der Stamm E. coli xl776 besonders gut, es könnte sich jedoch zeigen, dass für die industrielle Herstellung im grossen Massstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden. Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherr-sschung, eher als biologischer, können für die Arbeit im grossen Massstab auch solche Organismen wie E. coli K-12 Stamm 294, a.a.O., und E. coli Stamm RR1, Genotyp: Pro Leu~Thi~RB-recA+Strr Lac y~ verwendet werden. E. coli RR1 wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HB 101 ic(H.W. Boyer et al., J. Mol. Bio. (1969) 41 459-472) mit dem Stamm E. coli K-12, Stamm KL16 als Hfr-Donor erhalten. Siehe auch J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Eine Kultur von E. coli RR1 wurde am 30. Oktober 1978 bei der American Ty-15 pe Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der Nummer ATCC 31 343 hinterlegt. Auf ähnliche Weise wurde eine Kultur von xl776 am 3. Juli 1979 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31 537 hinterlegt. Am 3. Juli 1979 wurden 2tbei der American Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pHGH107 (ATCC 40 011); Plasmid pGH6 (ATCC 40 012); der Stamm xl776, der mit pHGH107 transformiert wurde (ATCC 31 538) und E. coli K-12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATCC 31 539).

25 Die mit den erfindungsgemäss hergestellten Vektoren transformierten Organismen können für die in industriellem Massstab durchgeführte fermentative Produktion von menschlichem Wachstumshormon eingesetzt werden, wodurch ein Produkt in solchen Mengen und für Anwendungsgebiete erhalten wird, wie es bisher unerreichbar war. Beispielsweise können transformierte E. coli-Kulturen gezüchtet werden in wässrigem Medium in einem Stahl- oder einem anderen Fermentationsgefäss, auf übliche Weise belüftet und geschüttelt, in wässrigem Medium bei beispielsweise 37 °C 35und nahezu neutralem pH (beispielsweise pH 7 + 0,3), ergänzt mit geeigneten Nährsubstraten, beispielsweise Kohlenhydrat oder Glycerin, Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat, Kaliumquellen, wie Kaliumphosphat, Spurenelementen, Magnesiumsulfat und ähnlichem. Transformante Organis-^men weisen vorzugsweise eine oder mehrere Selektionscharakteristiken auf, beispielsweise Antibiotika-Resistenzen, so dass ein Selektionsdruck ausgeübt werden kann, um konkurrierendes Wachstum von Wildtyp E. coli zu behindern. Für den Fall eines gegen Ampicillin oder Tetracyclin resistenten «Organismus kann beispielsweise das Antibiotikum zum Fer-mentationsmedium gegeben werden, so dass Wildtyp-Orga-nismen ausselektiert werden, die nicht gegen diese Antibiotika resistent sind.

Nachdem vollständig fermentiert wurde, wird die bakte-50rielle Suspension zentrifugiert oder die Zellmasse auf andere Weise aus der Kulturbrühe gesammelt, daraufhin mit physikalischen oder chemischen Mitteln lysiert. Die Zelltrümmer werden vom Überstand getrennt und das lösliche Wachstumshormon isoliert und gereinigt.

55 Menschliches Wachstumshormon kann aus Bakterienextrakt gereinigt werden, indem man eine der folgenden Methoden oder eine Kombination dieser anwendet: (1) Poly-äthylimin-Fraktionierung; (2) Gel-Filtrierungs-Chromato-graphie auf Sephacryl S-200; (3) Ionenaustausch-Chromato-^graphie auf Biorex-70 Harz oder CM Sephadex; (4) Ammo-niumsulfat und/oder ph-Fraktionierung; und (5) Affinitäts-Chromatographie, wobei Antikörper-Harze verwendet werden, die aus anti-HGH IgG hergestellt werden, welches aus immunosensitivierten Tieren oder Hybridgeweben (hybrido-65mas) isoliert wurde; das Hormon wird unter sauren oder mild denaturierenden Bedingungen herausgelöst.

C

5 Blatt Zeichnungen

Claims (23)

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   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zum Konstruieren eines replizierenden clo-nierenden Vektors, der in einem miktrobiellen Organismus zur Expression eines speziellen Polypeptids mit bekannter Aminosäuresequenz fähig ist, bei dem ein für das Polypeptid codierendes Gen in den clonierenden Vektor eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters für die Expression gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein erstes, durch reverse Transkription von Boten-RNA erhaltenes Genfragment für ein Expressionsprodukt erhalten wird, das sich von dem Polypeptid unterscheidet, wobei das Fragment zumindest einen Bestandteil der für das Polypeptid codierenden Sequenz enthält,

   b) in den Fällen, in denen das erste Fragment Protein codierende Codons für Aminosäuresequenzen enthält, die sich von denen, die in dem Polypeptid enthalten sind, unterscheiden, diese Codons eliminiert werden, während zumindest ein Bestandteil der genannten codierenden Sequenz beibehalten wird und das erhaltene Fragment dennoch für ein Expressionsprodukt codiert, das sich von dem Polypeptid unterscheidet, wobei das Produkt aus dem Schritt (a) oder, falls erforderlich, aus dem Schritt (b) ein Fragment darstellt, das für weniger als alle Aminosäuren des Polypeptids codiert, dass ferner,

   c) durch organische Synthese ein oder mehr Genfragmente, die für den Rest der Aminosäuresequenz des Polypeptids codieren, bereitgestellt werden, wobei mindestens eines dieser Fragmente für den Amino-Ende-Bestandteil des Polypeptids codiert, und d) dass das oder die Genfragmente aus Schritt (c) und dasjenige, das in Schritt (a) oder (b), je nach Sachlage, hergestellt wurde, in einem sich replizierenden, clonierenden Vektor in richtiger Lesephase zueinander und unter der Kontrolle eines Promoters für die Expression angeordnet werden, wodurch ein sich replizierender, clonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der Aminosäuresequenz des Polypeptids fähig ist.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der clonierende Vektor aus Schritt (d) ein bakterielles Plasmid ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das für den Amino-Ende-Bestandteil des Polypeptids codierende, synthetische Fragment zusätzlich für die Expression einer spezifisch schneidbaren Aminosäuresequenz codiert, und dass die Fragmente stromabwärts von und in Lesephase mit exprimierten, Protein codierenden Codons angeordnet werden, wodurch das konjugierte Expressionsprodukt des Plasmids spezifisch geschnitten werden kann, um das Polypeptid zu erhalten.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids ohne anhängendes Fremdprotein exprimierbar ist.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment aus Schritt (a) mindestens eine Mehrheit der codierenden Sequenz für das Polypeptid enthält.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadruch gekennzeichnet, dass ein synthetisches Fragment (c) und ein mRNA-Tran-skript-Fragment (a) oder (b) vor ihrer Anordnung im clonierenden Vektor miteinander verknüpft werden, und wobei die entgegengesetzten Enden des Fragments und des Transkripts unterschiedlich entwerder einzelsträngig oder stumpf sind, so dass sichergestellt ist, dass die Verknüpfung der beiden Fragmente in der richtigen Orientierung für die Expression des Polypeptids erfolgt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid das menschliche Wachstumshormon ist, und dass das erste Fragment Protein codierende Codons für

   Aminosäuresequenzen enthält, die sich von denen im menschlichen Wachstumshormon unterscheiden, und wobei der Eliminierungsschritt (b) das Haelll-Restriktionsenzym-fragment des ersten Fragments liefert.

   s 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) einschliesst: das Verdauen des Haelll-Frag-ments mit einem anderen Restriktionsenzym, das Abschneiden von Codons für untranslatierte Boten-RNA und das gleichzeitige Bereitstellen eines Einzelstrangendes an einem icEnde des entstehenden Fragments.
8. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Restriktionsenzym Xma I ist.
9. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid das menschliche Wachstumshormon ist isund Codons für die Aminosäuren 1-24 des menschlichen Wachstumshormons diejenigen sind, die in Fig. 1 dargestellt sind.
10. 11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid das menschliche Wachstumshormon ist,

    zound die Codons für die Aminosäuren 1-24 des menschlichen Wachstumshormons diejenigen sind, die in Figur 1 dargestellt sind.
11. 12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Codons für die Aminosäuren 1-24 diejenigen sind,

    25 die in Figur 1 dargestellt sind.
12. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der clonierende Vektor aus Schritt (d) pHGH 107 oder pHGH 107-1 ist, wobei letzteres aus pHGH 107 durch Ent-

    30fernung einer EcoRI-Erkennungsstelle erhalten wird.
13. 14. Replizierbarer clonierender Vektor, der in einem transformierten Bakterium zur Expression eines Säugerpoly-peptids fähig ist, welchem kein fremdes, konjugiertes Protein anhängt, wobei das für das Säugerpolypeptid codierende

    35 Gen zu einem wesentlichen Anteil aus c-DNA oder einer Re-plikation dieser DNA und der restliche Anteil aus einer synthetischen DNA besteht, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13.

    40 15. Ein clonierender Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugerpolypeptid menschliches Wachstumshormon ist.
14. 16. Ein clonierender Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der replizierbare, clonierende Vektor

    45 ein bakterielles, sich replizierendes Plasmid ist, das in einem transformierten Bakterium zur Expression von Wachstumshormonen fähig ist, welchen kein fremdes, konjugiertes Protein anhängt.
15. 17. Plasmid nach Anspruch 16, dessen für menschliches so Wachstumshormon codierendes Gen als wesentlichen Bestandteil cDNA oder Replikationsprodukte von dieser enthält.
16. 18. Plasmid nach Anspruch 17, das eine Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum aufweist.

    55 19. Plasmid nach Anspruch 18, dem der tet-Promoter fehtl und das trotzdem Tetracyclinresistenz aufweist.
17. 20. Plasmid nach Anspruch 19, in dem das für das menschliche Wachstumshormon codierende Gen unter der Kontrolle eines lac-Promoters in Tandem-Struktur ist. 6o 21. Plasmid nach Anspruch 16, das in transformierten E. coli-Bakterien fähig ist zur Expression der Aminosäuresequenz, deren Abfolge in den Figuren 1 und 3 dargestellt ist. 22. Plasmid pHGH 107 (ATCC 40 011) nach Anspruch
18. 16.

    65 23. Plasmid pHGH 107-1 nach Anspruch 16.
19. 24. Verfahren zum Herstellen von menschlichen Wachstumshormon, unter Verwendung eines Plasmides gemäss Anspruch 16, das folgende Schritte enthält:

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    a) Behandeln einer lebensfähigen Kultur bakterielle Plasmide nach Anspruch 14 enhaltender Transformanten in einem Fermentationsgefäss, das mit Belüftungs- und Schütteloder Rühr-Mittel ausgestattet ist, in einer wässrigen, Nährsubstrate enthaltenden Fermentationsbouillon,

    b) Wachsenlasses der Kultur unter Belüften und Schütteln oder Rühren, während zusätzliche Nährsubstrate zugegeben werden, die erforderlich sind, um verstärktes Wachstum zu erhalten,

    c) Abtrennen der erhaltenen Zellmasse aus der Fermentationsbouillon,

    d) Lysieren der Zellen, um deren Inhalt freizulegen,

    e) Trennen der Zelltrümmer vom Uberstand und f) Isolieren und Reinigen des menschlichen Wachstumshormons, das im Überstand enthalten ist.
20. 25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien Transformanten von E.coli sind, die eine Selektionseigenschaft aufweisen und dass ein Selektionsdruck angewendet wird, um konkurrierendes Wachstum von E. coli-Wildtyp zu behindern.
21. 26. Ein Plasmid als clonierender Vektor zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, das Funktionsgene für Amipicillin- und Tetracylinresistenz enthält, sowie einen lac-Promotor in Tandem-Struktur, der zwischen den genannten Genen liegt und so orientiert ist, dass er die Expression in Richtung des Gens für Tetracyclinresistenz in Gang setzt, das ferner eine Mehrzahl von Restriktionserkennungs-stellen enthält, die stromabwärts vom genannten Promoter-System liegen, die jeweils cohäsive und stumpfe Enden nach dem Schneiden liefern, wodurch richtiges Einfügen von hete-rologer DNA zwischen den genannten Erkennungsstellen ermöglicht wird, so dass diese unter die Kontrolle des genannten Promoter-Systems gelangt.
22. 27. Plasmid pGH6 (ATCC 31 539) nach Anspruch 26.

    Die DNA (Desoxyribonucleinsäure), aus der Gene bestehen, enthält sowohl Protein codierende oder Struktur»-Gene als auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information dadurch vermitteln, dass sie Bereiche (sites) für die RNA-Polymerase-Bindung, Information für ribosomale Bindestellen usw. bereitstellen. Codiertes Protein wird von der korrespondierenden DNA innerhalb eines Organismus durch einen vielstufigen Prozess exprimiert, wobei:

    1. das Enzym RNA-Polymerase in der Kontrollregion (im folgenden «Promotor» genannt) aktiviert wird und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information im Boten-(Messenger)-Ribonucleinsäure (mRNA) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren «Stop»-Codons beendet wird;
23. 2. die mRNA-Botschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem «Start»-Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in «f-Methionin» translatiert wird).

    In Übereinstimmung mit dem genetischen Code, spezifiziert die DNA jede Aminosäure durch ein Triplet oder «Co-don» von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Gua-nin, die im folgenden A, T, C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-(«Duplex»)-DNA auf, dessen bleibender oder «komplementärer» Strang aus Nucleotiden («Basen») gebildet wird, die mit den ihnen komplementären Basen im codierenden Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist komplementär zu T und C komplementär zu G. Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert in Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) und 3 (1977), John Wiley und Sons, N.Y. Diese und andere Veröffentlichungen, die hier angesprochen sind, sind sdurch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.

    Schneiden und Verbinden von DNA

    Es stehen eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekom-bination zur Verfügung, nach denen aneinander angrenzende ic Enden separater DNA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden geschieht durch Bildung von Phosphodiester-bindungen zwischen aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch die Wirkung eines Enzyms, einer T4 DNA-15 Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die jeweiligen Enden in die Position für 2c die anschliessende Verbindung gebracht werden. Solche Einzelstränge, als cohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, dass man an stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, dass ein Strang eines stumpfen 25 Endes mit einem Enzym wie A.-Exonuclease abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restriktionsendonu-cleasen (im folgenden «Restriktionsenzyme»), die Phospho-diesterbindungen in und im Bereich von spezifischen Nucleo-tidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren 30 haben («Restriktionserkennungsstelle»), schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erkennungsstellen bekannt. Siehe z.B. R. J. Roberts, CRC Criticai Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Viele davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangse-35 quenzen an den Enden eines an sich doppelsträngigen Fragments entstehen. Als komplementäre Sequenzen können die überstehenden oder «cohäsiven» Enden durch Basenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuz-40 weise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül. Durch die Verwendung von Ligase, das die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste kova-lente Bindung. Restriktionsenzyme, die an geschnittener 45 doppelsträngiger DNA «stumpfe» Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch beispielsweise T4-Ligase.

    Clonierende Vektoren und rekombinante DNA 50 Für den vorliegenden Zweck wird folgendes «clonierender Vektor» genannt: ein nichtchromsomales Stück einer doppelsträngigen DNA, das ein intaktes Replikon enthält, so dass der Vektor repliziert werden kann, wenn er in einen einzelligen Organismus («Mikrobe») durch Transformation 55 gebracht wird. Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird «Transformante» genannt. Derzeit sind die clonierenden Vektoren, die üblicherweise verwendet werden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DNA, genannt «Plasmide».

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    Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von «rekombinanten» clonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das exogene DNA enhält, bestehen. In besonderen Beispielen es kann die Rekombinante «heterologe» DNA einschliessen, wobei damit eine DNA gemeint ist, die für Polypeptide codiert, die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt werden, welcher empfindlich ist für die Transformation

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    durch den rekombinanten Vektor. Es werden somit Plasmide mit. Restriktionsenzymen geschnitten, um lineare DNA zur Verfügung zu stellen, die verbindbare Enden hat. Diese werden an ein exogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon und eine phänotypische Eigenschaft aufweist, die benutzt werden kann, um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird durch Transformation in einen Mikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist, grosse Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für welches das Gen codiert. Über die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, N.Y. (1977). .

    Expression von rekombinanter DNA

    Neben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrössern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluss des lac-Promoters in einem E. coli-Bakterium exprimiert (K. Itakura et al., Science 198,1056 (1977) ). Kürzlich gelang auf die gleiche Weise die Expression der A- und B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das Hormon bilden (D.V. Goeddel et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei., USA 76, 106 (1979) ). In jedem Fall wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert. In jedem Fall würden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen Herstellung in konjugierter Form notig ist, d.h. als Tandem mit einem anderen Protein, das das gewünschte Produkt durch Komparti-mentierung schützt und das ausserhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden, veröffentlichten englischen Patentschriften des Anmelders des vorliegenden Patents beschrieben: GB 2 007 675 A; GB 2 007 670 A; GB 2 007 676 A; GB 2 008 123 A.

    Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmässig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den Fall von sehr viel grösseren Proteinprodukten, z.B. Wachstumshormonen, Interferon usw., deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu exprimieren, da die Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material erfordert, das innerhalb des Organismus besser für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet werden könnte.

    In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse Transkription von korrespondierender Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde. Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens kann die reverse Transkriptase die Transkription von der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cDNA für die komplette, gewünschte Aminosäuresequenz beenden. So haben beispielsweise Villa-Komaroff et al. eine cDNA für Ratten-Proinsulin erhalten, dem die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat'l. Acad. Sei., USA 75, 3727 (1978) ). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert werden, eine cDNA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryoti-schen Zelle Führersequenzen (im folgenden Leader-Sequen-zen) enzymatisch abgetrennt werden. Bisher ist keine Bakte-5rienzelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so dass das mRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben hat, die die Leader-Sequenz der Vorläuferform enthalten, als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff, a.a.O. (Ratten-Proinsulin); P.H. Seeburg et al., Nature 276, ic 795 (1078 ) (Rattenwachstumshormon) ).

    Schliesslich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offen-ls sichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z.B. Villa-Komaroff, a.a.O. (Penicillinase-Proinsulin); Seeburg, a.a.O. (ß-Lactamase-Wachstumshormon).

    Menschliches Wachstumshormon 20 Menschliches Wachstumshormon («HGH») wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren und ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 21,500, mehr als dreimal so gross wie Insulin. Bis zur vorliegenden Erfindung konnte menschliches Wachstumshormon 25 nur arbeitsaufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden - der Hypophyse aus menschlichen Leichen. Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Funktionsstörung der Hypophyse verursachtem hypophysären Zwergenwuchs 30 begrenzt, und sogar hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, dass vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, dass nicht mehr als 50% der Betroffenen damit behandelt werden können.

    35 Zusammengefasst besteht daher eine Notwendigkeit für neue Methoden, um HGH und andere Polypeptidprodukte in grossen Mengen herzustellen. Diese Notwenigkeit ist besonders akut in dem Fall, wenn Polypeptide zu gross sind, um organische Synthese zuzulassen oder, aus diesem Grund, 40 mikrobiologische Expression von vollständigen synthetischen Genen. Die Expression von Säugetierhormonen von mRNA-Transkripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten, die dem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits jedoch bis heute lediglich die mikrobielle 45 Produktion von bioinaktiven Konjugaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können.