JPH08242881A - 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 - Google Patents
部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法Info
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- JPH08242881A JPH08242881A JP7310696A JP31069695A JPH08242881A JP H08242881 A JPH08242881 A JP H08242881A JP 7310696 A JP7310696 A JP 7310696A JP 31069695 A JP31069695 A JP 31069695A JP H08242881 A JPH08242881 A JP H08242881A
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- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細菌以外の微生物での真核性ペプチドの製造
方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）特定の所望のポリペプチドをコー
ドしている、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡの両者から誘導
されたＤＮＡからなるＤＮＡ配列を該微生物中で発現し
得る複製可能なクローニング媒体で微生物を形質転換
し、（ｂ）得られた形質転換微生物を、旺盛な増殖を維
持するに必要な適当な栄養培地中、通気、撹拌下で培養
し、（ｃ）生産されたポリペプチドを培養混合物から分
離することからなる方法。
方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）特定の所望のポリペプチドをコー
ドしている、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡの両者から誘導
されたＤＮＡからなるＤＮＡ配列を該微生物中で発現し
得る複製可能なクローニング媒体で微生物を形質転換
し、（ｂ）得られた形質転換微生物を、旺盛な増殖を維
持するに必要な適当な栄養培地中、通気、撹拌下で培養
し、（ｃ）生産されたポリペプチドを培養混合物から分
離することからなる方法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、目的とする蛋白質
生成物の観点からは不完全なメッセンジャーＲＮＡ(以
下mＲＮＡと略す)配列からの酵素による逆転写と有機合
成を組み合わせることにより部分的合成遺伝子を作製
し、これを微生物（但し、細菌を除く）により発現させ
て所望のポリペプチドを得る方法に関する。発現された
好ましい生成物には、微生物を開裂させて生物活性物質
を生産する際に問題となる、真核性の発現生成物に共通
して存在する、生物活性を不活性化するリーダー配列が
含まれていない。本明細書では、好ましい例として、ヒ
トの生長ホルモン(例えば下垂体機能減退矮小発育症の
治療に有用である)をコードする(暗号化する)遺伝子の
作製およびその発現について例示する。
生成物の観点からは不完全なメッセンジャーＲＮＡ(以
下mＲＮＡと略す)配列からの酵素による逆転写と有機合
成を組み合わせることにより部分的合成遺伝子を作製
し、これを微生物（但し、細菌を除く）により発現させ
て所望のポリペプチドを得る方法に関する。発現された
好ましい生成物には、微生物を開裂させて生物活性物質
を生産する際に問題となる、真核性の発現生成物に共通
して存在する、生物活性を不活性化するリーダー配列が
含まれていない。本明細書では、好ましい例として、ヒ
トの生長ホルモン(例えば下垂体機能減退矮小発育症の
治療に有用である)をコードする(暗号化する)遺伝子の
作製およびその発現について例示する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子を構成しているＤＮＡ(デオキシ
リボ核酸)は、蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構
造遺伝子と、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、リボゾー
ム結合のための情報部位などを提供することによって構
造遺伝子の情報の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の
両者を含んでいる。暗号づけされた蛋白質は、その対応
するＤＮＡから、微生物内で、複数の過程を経て発現さ
れる。即ち、 １．調節領域(以下プロモーターという)内で酵素ＲＮＡ
ポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿って
移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリボ
核酸(mＲＮＡ)に転写する。この転写は１個またはそれ
以上の終止コドンの位置で終了する。 ２．mＲＮＡの「伝言」は、リボゾームにおいて、そのmＲ
ＮＡが暗号づけているアミノ酸配列を持った蛋白質に翻
訳される。翻訳は開始信号、大抵はＡＴＧ(これはf−メ
チオニンと翻訳される)から始まる。ＤＮＡは遺伝暗号
に従い、トリプレット、即ち、アデノシン、チミジン、
シチジンおよびグアニン(以下各々Ａ,Ｔ,ＣおよびＧと
表わす)から個々別々に選ばれる隣接する３個のヌクレ
オチドの「コドン」によって個々のアミノ酸を指定する。
これらはコードストランド(暗号鎖)、即ち２本鎖(duple
x)ＤＮＡの暗号配列中にある。２本鎖の残りの鎖、即ち
「相補ストランド」は、コードストランド中の相補体と水
素結合するヌクレオチド(塩基)で形成されている。Ａと
Ｔ、およびＣとＧが相補関係にある。本発明の背景とな
る上記の事実およびその他の関連事項はＧene Ｅxpress
ionに詳しく述べられている(Ｂenjamin Ｌewin,Ｇene
Ｅxpression１,２(１９７４年)および３(１９７７年),
Ｊohn Ｗiley and Ｓons,Ｎ.Ｙ.)。本明細書で言及する
この文献およびその他の文献については、参考までにそ
の都度言及することとする。
リボ核酸)は、蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構
造遺伝子と、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、リボゾー
ム結合のための情報部位などを提供することによって構
造遺伝子の情報の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の
両者を含んでいる。暗号づけされた蛋白質は、その対応
するＤＮＡから、微生物内で、複数の過程を経て発現さ
れる。即ち、 １．調節領域(以下プロモーターという)内で酵素ＲＮＡ
ポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿って
移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリボ
核酸(mＲＮＡ)に転写する。この転写は１個またはそれ
以上の終止コドンの位置で終了する。 ２．mＲＮＡの「伝言」は、リボゾームにおいて、そのmＲ
ＮＡが暗号づけているアミノ酸配列を持った蛋白質に翻
訳される。翻訳は開始信号、大抵はＡＴＧ(これはf−メ
チオニンと翻訳される)から始まる。ＤＮＡは遺伝暗号
に従い、トリプレット、即ち、アデノシン、チミジン、
シチジンおよびグアニン(以下各々Ａ,Ｔ,ＣおよびＧと
表わす)から個々別々に選ばれる隣接する３個のヌクレ
オチドの「コドン」によって個々のアミノ酸を指定する。
これらはコードストランド(暗号鎖)、即ち２本鎖(duple
x)ＤＮＡの暗号配列中にある。２本鎖の残りの鎖、即ち
「相補ストランド」は、コードストランド中の相補体と水
素結合するヌクレオチド(塩基)で形成されている。Ａと
Ｔ、およびＣとＧが相補関係にある。本発明の背景とな
る上記の事実およびその他の関連事項はＧene Ｅxpress
ionに詳しく述べられている(Ｂenjamin Ｌewin,Ｇene
Ｅxpression１,２(１９７４年)および３(１９７７年),
Ｊohn Ｗiley and Ｓons,Ｎ.Ｙ.)。本明細書で言及する
この文献およびその他の文献については、参考までにそ
の都度言及することとする。
【０００３】ＤＮＡの組み換えには、別々のＤＮＡ断片
の結合を促進するために、その隣接末端を色々の態様に
修復する種々の方法を利用することができる。ここでい
う「結合」とは、隣接するヌクレオチド間にホスホジエス
テル結合が形成することであり、これは大抵の場合、酵
素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより達成される。例えば平滑末
端(鈍感末端)も直接結合することができる。あるいはま
た、隣接末端に相補性の１本鎖を含んでいる断片は、水
素結合によって、「結合」のためのそれぞれの位置に配置
されるので好都合である。このような接着末端と呼ばれ
る１本鎖は、ターミナルトランスフェラーゼを用いて鈍
感末端にヌクレオチドを付加することにより生成させる
ことができる。またこれは、鈍感末端の１本の鎖をλ−
エキソヌクレアーゼの如き酵素で切り取ることにより生
成させることもできる。しかしこれは、制限エンドヌク
レアーゼ(以下制限酵素という)によるのが最も普通であ
る。この制限酵素は、塩基対が４ないし６個の長さのヌ
クレオチドの特異な配列(制限部位という)内またはその
隣接部位のホスホジエステル結合を切断するものであ
り、多くの制限酵素およびその認識部位が知られている
(例えばＲ.Ｊ.Ｒoberts,ＣＲＣ Ｃritical Ｒeviews in
Ｂiochemistry,１２３,(１９７６年１１月)参照)。多
くのものは互い違いに切断し、２本鎖断片の端に短い相
補性の１本鎖配列ができる。相補性配列であるので、は
みでた末端、即ち接着末端は塩基対によって再結合する
ことができる。２個の異なった分子をこの酵素で切断す
ると、相補性１本鎖が交叉した対をつくり、新しいＤＮ
Ａ分子ができる。この新しいＤＮＡ分子は、アニーリン
グした位置にある１本鎖の切断点を結合するリガーゼを
用いて、共有結合した完全なＤＮＡ分子とすることがで
きる。開裂した２本鎖ＤＮＡに「コターミナル」、即ち鈍
感末端を残す様な制限酵素の場合は、この鈍感末端を他
の鈍感末端配列のものと、例えばＴ４リガーゼにより再
結合して組換えすることができる。
の結合を促進するために、その隣接末端を色々の態様に
修復する種々の方法を利用することができる。ここでい
う「結合」とは、隣接するヌクレオチド間にホスホジエス
テル結合が形成することであり、これは大抵の場合、酵
素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより達成される。例えば平滑末
端(鈍感末端)も直接結合することができる。あるいはま
た、隣接末端に相補性の１本鎖を含んでいる断片は、水
素結合によって、「結合」のためのそれぞれの位置に配置
されるので好都合である。このような接着末端と呼ばれ
る１本鎖は、ターミナルトランスフェラーゼを用いて鈍
感末端にヌクレオチドを付加することにより生成させる
ことができる。またこれは、鈍感末端の１本の鎖をλ−
エキソヌクレアーゼの如き酵素で切り取ることにより生
成させることもできる。しかしこれは、制限エンドヌク
レアーゼ(以下制限酵素という)によるのが最も普通であ
る。この制限酵素は、塩基対が４ないし６個の長さのヌ
クレオチドの特異な配列(制限部位という)内またはその
隣接部位のホスホジエステル結合を切断するものであ
り、多くの制限酵素およびその認識部位が知られている
(例えばＲ.Ｊ.Ｒoberts,ＣＲＣ Ｃritical Ｒeviews in
Ｂiochemistry,１２３,(１９７６年１１月)参照)。多
くのものは互い違いに切断し、２本鎖断片の端に短い相
補性の１本鎖配列ができる。相補性配列であるので、は
みでた末端、即ち接着末端は塩基対によって再結合する
ことができる。２個の異なった分子をこの酵素で切断す
ると、相補性１本鎖が交叉した対をつくり、新しいＤＮ
Ａ分子ができる。この新しいＤＮＡ分子は、アニーリン
グした位置にある１本鎖の切断点を結合するリガーゼを
用いて、共有結合した完全なＤＮＡ分子とすることがで
きる。開裂した２本鎖ＤＮＡに「コターミナル」、即ち鈍
感末端を残す様な制限酵素の場合は、この鈍感末端を他
の鈍感末端配列のものと、例えばＴ４リガーゼにより再
結合して組換えすることができる。
【０００４】本発明の目的に使用される「クローニング
媒体」は完全な「レプリコン」を含有する非染色体性の１
つの２本鎖ＤＮＡであり、この媒体は形質転換により単
細胞生物(微生物)に入れられた時、複製され得るもので
ある。この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼
ばれている。現在クローニング媒体として一般に使用さ
れているのはビールスまたは細菌から得られるものであ
り、最も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌Ｄ
ＮＡである。最近の生化学の進歩により、例えばプラス
ミッドが外来性のＤＮＡを含む様な、「組換型」クローニ
ング媒体が作製される様になった。特殊な例では、この
組み換え体はヘテロローガスＤＮＡを含有することがで
きる。ここでいうヘテロローガスＤＮＡとは、この組換
型媒体により形質転換することのできる微生物によって
通常は産生されないポリペプチドをコードするＤＮＡを
意味する。例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して
結合可能な末端を有する直鎖状ＤＮＡを得る。これを結
合可能な末端を持った外来性遺伝子と結合させると、生
物学的機能部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択
するのに有用な表現型の性質が付与されることになる。
この組み換え体を微生物に挿入して形質転換し、この形
質転換体を単離してクローン化する。この目的は外来性
遺伝子のコピーを含有している多数の転換体を得ること
であり、また特殊な場合には、さらにその遺伝子がコー
ドしている蛋白質を発現することにある。これに関連す
る技術およびその応用についてはＲecombinant Ｍolecu
les に詳しく記載されている(Ｍiles Ｉnternational
Ｓymposium Ｓeries １０ ; Ｒecombinant Ｍolecules
: Ｉmpact on Ｓcience and Ｓociety,Ｂeers and Ｂo
sseff,eds.,Ｒaven Ｐress,Ｎ.Ｙ.１９７７年)。
媒体」は完全な「レプリコン」を含有する非染色体性の１
つの２本鎖ＤＮＡであり、この媒体は形質転換により単
細胞生物(微生物)に入れられた時、複製され得るもので
ある。この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼
ばれている。現在クローニング媒体として一般に使用さ
れているのはビールスまたは細菌から得られるものであ
り、最も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌Ｄ
ＮＡである。最近の生化学の進歩により、例えばプラス
ミッドが外来性のＤＮＡを含む様な、「組換型」クローニ
ング媒体が作製される様になった。特殊な例では、この
組み換え体はヘテロローガスＤＮＡを含有することがで
きる。ここでいうヘテロローガスＤＮＡとは、この組換
型媒体により形質転換することのできる微生物によって
通常は産生されないポリペプチドをコードするＤＮＡを
意味する。例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して
結合可能な末端を有する直鎖状ＤＮＡを得る。これを結
合可能な末端を持った外来性遺伝子と結合させると、生
物学的機能部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択
するのに有用な表現型の性質が付与されることになる。
この組み換え体を微生物に挿入して形質転換し、この形
質転換体を単離してクローン化する。この目的は外来性
遺伝子のコピーを含有している多数の転換体を得ること
であり、また特殊な場合には、さらにその遺伝子がコー
ドしている蛋白質を発現することにある。これに関連す
る技術およびその応用についてはＲecombinant Ｍolecu
les に詳しく記載されている(Ｍiles Ｉnternational
Ｓymposium Ｓeries １０ ; Ｒecombinant Ｍolecules
: Ｉmpact on Ｓcience and Ｓociety,Ｂeers and Ｂo
sseff,eds.,Ｒaven Ｐress,Ｎ.Ｙ.１９７７年)。
【０００５】複製により遺伝子の数を増やすためにクロ
ーニング媒体を使用することとは別に、遺伝子がコード
している蛋白質を実際に発現しようという試みがなさ
れ、そのいくつかは成功している。その最初の例とし
て、脳ホルモン、ソマトスタチンがlac プロモーターの
コントロールの下に大腸菌中で発現された(Ｋ.Ｉtakura
et al.Ｓcience １９８ １０５６．１９７７年)。極く
最近、ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖が同じ方法で
発現され、結合されてこのホルモンを生成した(Ｄ.Ｖ.
Ｇoeddel et al.Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ７６
１０６、１９７９年)。この両者では、遺伝子はその
全てを合成により作製したものであった。いづれの場合
も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的とする生成物を分解
するのは明らかであるので、その生成物を複合体の形
で、即ち、「隔離」(compartmentalization)により目的物
を保護し、そして細胞外で切り離されることができて所
望の生成物を与え得る別の蛋白質と結合した複合体の形
で生成させる必要があった。この研究は本出願人の出願
に係る英国特許ＧＢ２００７６７５Ａ号、ＧＢ２００７
６７０Ａ号、ＧＢ２００７６７６Ａ号およびＧＢ２００
８１２３Ａ号明細書に記載されている。
ーニング媒体を使用することとは別に、遺伝子がコード
している蛋白質を実際に発現しようという試みがなさ
れ、そのいくつかは成功している。その最初の例とし
て、脳ホルモン、ソマトスタチンがlac プロモーターの
コントロールの下に大腸菌中で発現された(Ｋ.Ｉtakura
et al.Ｓcience １９８ １０５６．１９７７年)。極く
最近、ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖が同じ方法で
発現され、結合されてこのホルモンを生成した(Ｄ.Ｖ.
Ｇoeddel et al.Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ７６
１０６、１９７９年)。この両者では、遺伝子はその
全てを合成により作製したものであった。いづれの場合
も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的とする生成物を分解
するのは明らかであるので、その生成物を複合体の形
で、即ち、「隔離」(compartmentalization)により目的物
を保護し、そして細胞外で切り離されることができて所
望の生成物を与え得る別の蛋白質と結合した複合体の形
で生成させる必要があった。この研究は本出願人の出願
に係る英国特許ＧＢ２００７６７５Ａ号、ＧＢ２００７
６７０Ａ号、ＧＢ２００７６７６Ａ号およびＧＢ２００
８１２３Ａ号明細書に記載されている。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】以上述べたいくつかの例で合
成遺伝子による方法が有用であることがわかったが、生
成物がもっと大きい蛋白質である場合、例えば成長ホル
モン、インターフェロンなどである場合には、それらの
遺伝子はそれに応じてさらに複雑であり、手軽に合成す
ることができないという現実的な問題がある。同時に、
複合蛋白質を伴なっていない生成物を発現することが望
ましいであろうが、この様な発現の必要性から、使用す
る微生物を、目的とする生成物を製造するのにもっと好
適な微生物に変更しなければならない。ある研究者たち
は、有機合成からではなく、組織から精製した相当する
mＲＮＡからの逆転写により得られた遺伝子を発現しよ
うと試みた。この試みには２つの問題があった。まず第
１は、逆転写酵素は所望の全アミノ酸配列のためのcＤ
ＮＡ(相補ＤＮＡ)を完成しない前に、mＲＮＡからの転
写を停止することがある、ということである。従って、
例えばＶilla−Ｋomaroffらはラットのプロインシュリ
ンのためのcＤＮＡを得たが、それにはそのインシュリ
ンプリカーサー(前駆体)の最初の３個のアミノ酸のため
のコドンが欠落していた(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci．,
ＵＳＡ、７５ ３７２７、１９７８年)。次に、プリカー
サーの形で発現されるポリペプチドのためのmＲＮＡを
逆転写したところ、生物活性蛋白質ではなくそのプリカ
ーサーのためのcＤＮＡが生成した。ところでこの生物
活性蛋白質は、真核細胞内においてはリーダー配列が酵
素的に切断除去された結果として生成するものである。
現在まで、この様な機能を発揮する細菌は知られていな
い。従って、mＲＮＡ転写体は、生物活性蛋白質自体で
はなくプリカーサーの形の、リーダー配列を含んだ発現
生成物を製造してしまうのである(Ｖilla−Ｋomaroff、
前記(ラットプロインシュリン)、Ｐ.Ｈ.Ｓeeburg et al
Ｎature ２７６、７９５、１９７８年(ラットのプレ生
長ホルモン))。最後に、ヒトのホルモン類(またはそれ
らのプリカーサー)をmＲＮＡ転写体から細菌により発現
しようという試みでは、明らかに細胞外で開裂され得な
い複合蛋白質が製造されただけであった(例えば、Ｖill
a−Ｋomaroff、前記(ペニシリナーゼ・プロインシュリ
ン)、Ｓeeburg、前記(ベーターラクタマーゼ−プレ生長
ホルモン))。
成遺伝子による方法が有用であることがわかったが、生
成物がもっと大きい蛋白質である場合、例えば成長ホル
モン、インターフェロンなどである場合には、それらの
遺伝子はそれに応じてさらに複雑であり、手軽に合成す
ることができないという現実的な問題がある。同時に、
複合蛋白質を伴なっていない生成物を発現することが望
ましいであろうが、この様な発現の必要性から、使用す
る微生物を、目的とする生成物を製造するのにもっと好
適な微生物に変更しなければならない。ある研究者たち
は、有機合成からではなく、組織から精製した相当する
mＲＮＡからの逆転写により得られた遺伝子を発現しよ
うと試みた。この試みには２つの問題があった。まず第
１は、逆転写酵素は所望の全アミノ酸配列のためのcＤ
ＮＡ(相補ＤＮＡ)を完成しない前に、mＲＮＡからの転
写を停止することがある、ということである。従って、
例えばＶilla−Ｋomaroffらはラットのプロインシュリ
ンのためのcＤＮＡを得たが、それにはそのインシュリ
ンプリカーサー(前駆体)の最初の３個のアミノ酸のため
のコドンが欠落していた(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci．,
ＵＳＡ、７５ ３７２７、１９７８年)。次に、プリカー
サーの形で発現されるポリペプチドのためのmＲＮＡを
逆転写したところ、生物活性蛋白質ではなくそのプリカ
ーサーのためのcＤＮＡが生成した。ところでこの生物
活性蛋白質は、真核細胞内においてはリーダー配列が酵
素的に切断除去された結果として生成するものである。
現在まで、この様な機能を発揮する細菌は知られていな
い。従って、mＲＮＡ転写体は、生物活性蛋白質自体で
はなくプリカーサーの形の、リーダー配列を含んだ発現
生成物を製造してしまうのである(Ｖilla−Ｋomaroff、
前記(ラットプロインシュリン)、Ｐ.Ｈ.Ｓeeburg et al
Ｎature ２７６、７９５、１９７８年(ラットのプレ生
長ホルモン))。最後に、ヒトのホルモン類(またはそれ
らのプリカーサー)をmＲＮＡ転写体から細菌により発現
しようという試みでは、明らかに細胞外で開裂され得な
い複合蛋白質が製造されただけであった(例えば、Ｖill
a−Ｋomaroff、前記(ペニシリナーゼ・プロインシュリ
ン)、Ｓeeburg、前記(ベーターラクタマーゼ−プレ生長
ホルモン))。
【０００７】ヒト生長ホルモン(ＨＧＨ)はヒトの脳下垂
体で分泌される。１９１個のアミノ酸からなり、分子量
が約２１,５００であるこのＨＧＨはインシュリンの３
倍以上大きい。これまで、ＨＧＨは限られた供給源、即
ちヒトの死体の下垂体から面倒な抽出によって得られる
だけであった。この物質は絶えず不足しており、その適
用は下垂体機能減退矮小発育症の治療に制限されてお
り、またそれですら、信頼できる計算によると、ヒト由
来のＨＧＨは約５０％の患者に供給するのがやっとであ
る。従って、ＨＧＨおよびその他のポリペプチド生成物
を多量に製造し得る新規な方法を開発する必要があり、
この要求は、有機合成で製造するには大きすぎるか、従
ってまた、全合成遺伝子を用いて微生物に発現させるこ
とが困難なポリペプチド類において特に火急を要するも
のである。哺乳類のホルモンをmＲＮＡ転写体から発現
する方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得ることを
約束するものではあるが、現在のところ、所望のホルモ
ンを実際に切り離すことのできない、生物活性のない複
合体を微生物により製造することができるに過ぎない。
体で分泌される。１９１個のアミノ酸からなり、分子量
が約２１,５００であるこのＨＧＨはインシュリンの３
倍以上大きい。これまで、ＨＧＨは限られた供給源、即
ちヒトの死体の下垂体から面倒な抽出によって得られる
だけであった。この物質は絶えず不足しており、その適
用は下垂体機能減退矮小発育症の治療に制限されてお
り、またそれですら、信頼できる計算によると、ヒト由
来のＨＧＨは約５０％の患者に供給するのがやっとであ
る。従って、ＨＧＨおよびその他のポリペプチド生成物
を多量に製造し得る新規な方法を開発する必要があり、
この要求は、有機合成で製造するには大きすぎるか、従
ってまた、全合成遺伝子を用いて微生物に発現させるこ
とが困難なポリペプチド類において特に火急を要するも
のである。哺乳類のホルモンをmＲＮＡ転写体から発現
する方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得ることを
約束するものではあるが、現在のところ、所望のホルモ
ンを実際に切り離すことのできない、生物活性のない複
合体を微生物により製造することができるに過ぎない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、面倒な全合成
による作製に頼らず、暗号配列の実質的な部分、好まし
くは大部分を逆転写により得、一方その暗号配列の残り
を合成することにより、生物活性を不活性化するリーダ
ー配列またはその他の異質蛋白質を伴なっていない所望
のポリペプチドを発現することのできる完全な遺伝子を
得、この部分的合成遺伝子を発現する方法を提供するも
のである。あるいは、この合成による残りの部分は、外
来性蛋白質が細胞外で開裂されて生物活性体が得られる
様に設計された、蛋白質分解に抵抗する複合体を生成さ
せるものであってもよい。従って、本発明は、従来、組
織から多額の費用をかけて抽出することにより、限られ
た量だけ生産されていた種々の物質、およびこれまで工
業的に生産することの出来なかったその他の物質を、微
生物学的に生産する方法を可能にするものである。本明
細書では、その最も好ましい実施形式として、細胞内で
の蛋白質分解を避け、かつ細胞外での開裂の間生物活性
体を異質蛋白質中に隔離しておく必要性を避けながら、
医学的に重要なポリペプチドホルモン(ＨＧＨ)を細菌に
より発現する最初の例を提供する。本発明によって利用
できる様になったＨＧＨのための微生物資源により、下
垂体機能減退矮小発育症の治療、並びにこれまで組織か
ら得ていたホルモンではまかないきれなかったその他の
症状、例えば汎発性胃内出血、仮関節、火傷治療、傷治
療、ジストロフィーおよび骨結合用として、このホルモ
ンを多量に提供することが初めて可能となった。本発明
の以上述べた、およびその他の目的や特徴は以下の記載
および好ましい実施形式を例示した添付の図面から、よ
り明らかになるであろう。
による作製に頼らず、暗号配列の実質的な部分、好まし
くは大部分を逆転写により得、一方その暗号配列の残り
を合成することにより、生物活性を不活性化するリーダ
ー配列またはその他の異質蛋白質を伴なっていない所望
のポリペプチドを発現することのできる完全な遺伝子を
得、この部分的合成遺伝子を発現する方法を提供するも
のである。あるいは、この合成による残りの部分は、外
来性蛋白質が細胞外で開裂されて生物活性体が得られる
様に設計された、蛋白質分解に抵抗する複合体を生成さ
せるものであってもよい。従って、本発明は、従来、組
織から多額の費用をかけて抽出することにより、限られ
た量だけ生産されていた種々の物質、およびこれまで工
業的に生産することの出来なかったその他の物質を、微
生物学的に生産する方法を可能にするものである。本明
細書では、その最も好ましい実施形式として、細胞内で
の蛋白質分解を避け、かつ細胞外での開裂の間生物活性
体を異質蛋白質中に隔離しておく必要性を避けながら、
医学的に重要なポリペプチドホルモン(ＨＧＨ)を細菌に
より発現する最初の例を提供する。本発明によって利用
できる様になったＨＧＨのための微生物資源により、下
垂体機能減退矮小発育症の治療、並びにこれまで組織か
ら得ていたホルモンではまかないきれなかったその他の
症状、例えば汎発性胃内出血、仮関節、火傷治療、傷治
療、ジストロフィーおよび骨結合用として、このホルモ
ンを多量に提供することが初めて可能となった。本発明
の以上述べた、およびその他の目的や特徴は以下の記載
および好ましい実施形式を例示した添付の図面から、よ
り明らかになるであろう。
【０００９】
【発明の実施の形態】第１図および第２図は、クローニ
ングに使用するリンカー、開始信号ＡＴＧおよびＨＧＨ
の最初の２４個のアミノ酸をコードする遺伝子断片を作
製するための合成機構を示す。コードストランド、即ち
上側の鎖(Ｕ)および相補性ストランド、即ち下側の鎖
(Ｌ)の矢印は、描かれた断片の形成に使用されるオリゴ
ヌクレオチドを表わしている。第３図および第４図は、
ＵおよびＬオリゴヌクレオチドを結合させて第１図およ
び第２図の遺伝子断片を形成させる結合媒体および該遺
伝子断片のプラスミッドクローニング媒体への挿入を示
している。第５図および第６図には、下垂体mＲＮＡ転
写体のＨaeIII制限酵素断片のＤＮＡ配列(コードストラ
ンドのみ)が描かれており、それらがコードしているヒ
ト生長ホルモンのアミノ酸も番号付けして記入してあ
る。ここには非翻訳mＲＮＡに相当するＤＮＡ(ストップ
以下)および主要な制限部位も示されている。第７図お
よび第８図には、合成に由来しないＨＧＨのアミノ酸を
コードする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製
およびヒト下垂体から単離されたmＲＮＡからの逆転写
による相補ＤＮＡの形の該遺伝子断片の作製が示されて
いる。第９図および第１０図は、第３，４図、および第
７，８図のプラスミッドを用いて、細菌内でＨＧＨを発
現し得るプラスミッドを作製する方法を示す。
ングに使用するリンカー、開始信号ＡＴＧおよびＨＧＨ
の最初の２４個のアミノ酸をコードする遺伝子断片を作
製するための合成機構を示す。コードストランド、即ち
上側の鎖(Ｕ)および相補性ストランド、即ち下側の鎖
(Ｌ)の矢印は、描かれた断片の形成に使用されるオリゴ
ヌクレオチドを表わしている。第３図および第４図は、
ＵおよびＬオリゴヌクレオチドを結合させて第１図およ
び第２図の遺伝子断片を形成させる結合媒体および該遺
伝子断片のプラスミッドクローニング媒体への挿入を示
している。第５図および第６図には、下垂体mＲＮＡ転
写体のＨaeIII制限酵素断片のＤＮＡ配列(コードストラ
ンドのみ)が描かれており、それらがコードしているヒ
ト生長ホルモンのアミノ酸も番号付けして記入してあ
る。ここには非翻訳mＲＮＡに相当するＤＮＡ(ストップ
以下)および主要な制限部位も示されている。第７図お
よび第８図には、合成に由来しないＨＧＨのアミノ酸を
コードする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製
およびヒト下垂体から単離されたmＲＮＡからの逆転写
による相補ＤＮＡの形の該遺伝子断片の作製が示されて
いる。第９図および第１０図は、第３，４図、および第
７，８図のプラスミッドを用いて、細菌内でＨＧＨを発
現し得るプラスミッドを作製する方法を示す。
【００１０】本発明の一般的手法は、一緒になって所望
の生成物の発現をコードする複数個の遺伝子断片を、１
つのクローニング媒体中に組み合わせることにある。こ
れらの内少なくとも１個は、Ｕllrichらの方法(Ａ.Ｕll
rich et al,Ｓcience １９６１３１３、１９７７年)な
どにより組織から単離されたmＲＮＡの逆転写によって
得られるcＤＮＡ断片である。このcＤＮＡは目的生成物
のためのコドンの実質的な部分、好ましくは少なくとも
大部分を提供し、一方遺伝子の残りの部分は合成により
供給される。この合成による断片およびmＲＮＡ転写に
よる断片は別々にクローンし、最後の組合わせ段階での
使用のために量産する。
の生成物の発現をコードする複数個の遺伝子断片を、１
つのクローニング媒体中に組み合わせることにある。こ
れらの内少なくとも１個は、Ｕllrichらの方法(Ａ.Ｕll
rich et al,Ｓcience １９６１３１３、１９７７年)な
どにより組織から単離されたmＲＮＡの逆転写によって
得られるcＤＮＡ断片である。このcＤＮＡは目的生成物
のためのコドンの実質的な部分、好ましくは少なくとも
大部分を提供し、一方遺伝子の残りの部分は合成により
供給される。この合成による断片およびmＲＮＡ転写に
よる断片は別々にクローンし、最後の組合わせ段階での
使用のために量産する。
【００１１】合成遺伝子と、Ｍaxam およびＧilbert(Ｐ
roc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４ ５６０、１９７
７年)の方法で決定された相補ＤＮＡの間に、目的産物
のためのコドンをどの様に分配するかは、種々の考え方
によって影響を受ける。逆転写によって得られる相補Ｄ
ＮＡは必ず、少なくとも目的生成物のカルボキシル末端
部のためのコドンを含有しており、そのカルボキシル末
端に隣接する翻訳終止信号の下流に非翻訳mＲＮＡのた
めのその他のコドンを合せて含有している。非翻訳ＲＮ
ＡのためのＤＮＡの存在は、ほとんど無関係である。こ
の種の不当に長い配列は、所望の生成物のためのＤＮＡ
を複製し、発現するのに使用される細胞源を確保しつ
つ、制限酵素による開裂等によって除去してもよい。特
殊な場合には、このcＤＮＡは所望の全てのアミノ酸配
列と共に、目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドン
を含んでいる。例えば、全部ではないが、多くのポリペ
プチドホルモンは、リーダー配列や例えば細胞膜移送に
関連する蛋白質の信号配列を含んだプリカーサーの形で
発現される。真核細胞内で発現される場合には、これら
の配列は酵素により除去され、ホルモンはその遊離した
形、即ち生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし
微生物細胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないの
で、mＲＮＡ転写体からこの様な信号配列やリーダー配
列を除去しておくことが望ましい。この様な除去操作中
に、翻訳開始信号も失なわれ、またほとんどの場合、目
的産物のためのコドンの一部も失なわれる。本発明の部
分的合成遺伝子の合成による成分は、これらの後者のコ
ドンを回復するものであり、さらに、このハイブリッド
(雑種)遺伝子を最終的に挿入しようとしている媒体が適
切に配置された開始信号を欠いている場合には、新たに
翻訳開始信号を供給するものである。
roc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４ ５６０、１９７
７年)の方法で決定された相補ＤＮＡの間に、目的産物
のためのコドンをどの様に分配するかは、種々の考え方
によって影響を受ける。逆転写によって得られる相補Ｄ
ＮＡは必ず、少なくとも目的生成物のカルボキシル末端
部のためのコドンを含有しており、そのカルボキシル末
端に隣接する翻訳終止信号の下流に非翻訳mＲＮＡのた
めのその他のコドンを合せて含有している。非翻訳ＲＮ
ＡのためのＤＮＡの存在は、ほとんど無関係である。こ
の種の不当に長い配列は、所望の生成物のためのＤＮＡ
を複製し、発現するのに使用される細胞源を確保しつ
つ、制限酵素による開裂等によって除去してもよい。特
殊な場合には、このcＤＮＡは所望の全てのアミノ酸配
列と共に、目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドン
を含んでいる。例えば、全部ではないが、多くのポリペ
プチドホルモンは、リーダー配列や例えば細胞膜移送に
関連する蛋白質の信号配列を含んだプリカーサーの形で
発現される。真核細胞内で発現される場合には、これら
の配列は酵素により除去され、ホルモンはその遊離した
形、即ち生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし
微生物細胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないの
で、mＲＮＡ転写体からこの様な信号配列やリーダー配
列を除去しておくことが望ましい。この様な除去操作中
に、翻訳開始信号も失なわれ、またほとんどの場合、目
的産物のためのコドンの一部も失なわれる。本発明の部
分的合成遺伝子の合成による成分は、これらの後者のコ
ドンを回復するものであり、さらに、このハイブリッド
(雑種)遺伝子を最終的に挿入しようとしている媒体が適
切に配置された開始信号を欠いている場合には、新たに
翻訳開始信号を供給するものである。
【００１２】前駆体生長ホルモンcＤＮＡからのリーダ
ー配列の除去は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけてい
る部分の内部にある制限部位を利用することによって好
適に行なうことができる。しかし本発明はこの様な部位
を利用できるかどうかに無関係に実施することもでき
る。即ち、mＲＮＡに由来しない遺伝子を広範囲に合成
する必要性を避けるための、所望のポリペプチドのアミ
ノ末端に十分近い場所の制限部位を利用できるかどうか
に無関係に実施することができる。所望のポリペプチド
およびリーダー配列または他の生物活性を不活性化する
配列をコードしているcＤＮＡにおいて、後者のコドン
と完全な(成熟)ポリペプチドのためのコドンとの境界
は、その完全なポリペプチドのアミノ酸配列からわか
る。単に選択したそのペプチドをコードしている遺伝子
内へ消化していき、望ましくないリーダー配列またはそ
の他の配列を除去すればよい。従って、例えば式：
ー配列の除去は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけてい
る部分の内部にある制限部位を利用することによって好
適に行なうことができる。しかし本発明はこの様な部位
を利用できるかどうかに無関係に実施することもでき
る。即ち、mＲＮＡに由来しない遺伝子を広範囲に合成
する必要性を避けるための、所望のポリペプチドのアミ
ノ末端に十分近い場所の制限部位を利用できるかどうか
に無関係に実施することができる。所望のポリペプチド
およびリーダー配列または他の生物活性を不活性化する
配列をコードしているcＤＮＡにおいて、後者のコドン
と完全な(成熟)ポリペプチドのためのコドンとの境界
は、その完全なポリペプチドのアミノ酸配列からわか
る。単に選択したそのペプチドをコードしている遺伝子
内へ消化していき、望ましくないリーダー配列またはそ
の他の配列を除去すればよい。従って、例えば式：
【化１】 （ここで矢印は消化の終止を表わす。）の様なcＤＮＡ
であるとすると、上側の配列aおよびbを除去する様にエ
キソヌクレアーゼ消化の反応条件を選ぶと、その後Ｓ１
ヌクレアーゼ消化により下側の配列cおよびdが自動的に
除去される。あるいは、より正確には、デオキシヌクレ
オチドトリホスフェート(d(Ａ,Ｔ,Ｃ,Ｇ)ＴＰ)の存在下
でＤＮＡポリメラーゼ消化を行なうこともできる。例え
ば、上の例では、dＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて配列Ｃを除去し(Ｇで停止する)、次いで
Ｓ１ヌクレアーゼでaを消化する。dＴＴＰの存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼを作用させてdを除去し(Ｔで停止す
る)、次いでＳ１ヌクレアーゼでbを切断する、等々
(Ａ．Ｋornberg,ＤＮＡ Ｓynthesis,p８７−８８、Ｗ.
Ｈ.Ｆreeman and Ｃo.,Ｓan Ｆrancisco、１９７４年参
照)。
であるとすると、上側の配列aおよびbを除去する様にエ
キソヌクレアーゼ消化の反応条件を選ぶと、その後Ｓ１
ヌクレアーゼ消化により下側の配列cおよびdが自動的に
除去される。あるいは、より正確には、デオキシヌクレ
オチドトリホスフェート(d(Ａ,Ｔ,Ｃ,Ｇ)ＴＰ)の存在下
でＤＮＡポリメラーゼ消化を行なうこともできる。例え
ば、上の例では、dＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて配列Ｃを除去し(Ｇで停止する)、次いで
Ｓ１ヌクレアーゼでaを消化する。dＴＴＰの存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼを作用させてdを除去し(Ｔで停止す
る)、次いでＳ１ヌクレアーゼでbを切断する、等々
(Ａ．Ｋornberg,ＤＮＡ Ｓynthesis,p８７−８８、Ｗ.
Ｈ.Ｆreeman and Ｃo.,Ｓan Ｆrancisco、１９７４年参
照)。
【００１３】より好ましくは、Ｒazinらのミスマッチ
(不適切な組み合せ)修復合成法(Ａ．Ｒazin et al,Ｐro
c.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７５,４２６８、１９７８
年)を利用して、目的産物をコードしているcＤＮＡの部
分内の好都合な位置に制限部位を作製してもよい。この
方法によって、ミスマッチ置換分を含んでいるプライマ
ーを用いて存在しているＤＮＡ配列中の１個またはそれ
以上の塩基を置換することができる。少なくとも７種の
回文的４−塩基対配列が、既知の制限酵素によって特異
的に認識される。それらは、ＡＧＣＴ(Ａlu I)、ＣＣＧ
Ｇ(Ｈpa II)、ＣＧＣＧ(Ｔha I)、ＧＡＴＣ(Ｓau ３
Ａ)、ＧＣＧＣ(Ｈha)、ＧＧＣＣ(Ｈae III)およびＴＣ
ＧＡ(Ｔaq I)である。確率的には非常にしばしばあり得
ることであるが、cＤＮＡ配列が、上記の様な認識部位
と１個の塩基だけが異なっている配列を含んでいる場合
は、修復合成によって、適切な置換塩基を含んでいる、
従って所望の制限部位を含有している複製cＤＮＡが得
られる。開裂によって望ましくないリーダー配列のＤＮ
Ａが除去され、その後、完全なポリペプチドの発現に必
要なコドンが合成により回復される（次式参照）。
(不適切な組み合せ)修復合成法(Ａ．Ｒazin et al,Ｐro
c.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７５,４２６８、１９７８
年)を利用して、目的産物をコードしているcＤＮＡの部
分内の好都合な位置に制限部位を作製してもよい。この
方法によって、ミスマッチ置換分を含んでいるプライマ
ーを用いて存在しているＤＮＡ配列中の１個またはそれ
以上の塩基を置換することができる。少なくとも７種の
回文的４−塩基対配列が、既知の制限酵素によって特異
的に認識される。それらは、ＡＧＣＴ(Ａlu I)、ＣＣＧ
Ｇ(Ｈpa II)、ＣＧＣＧ(Ｔha I)、ＧＡＴＣ(Ｓau ３
Ａ)、ＧＣＧＣ(Ｈha)、ＧＧＣＣ(Ｈae III)およびＴＣ
ＧＡ(Ｔaq I)である。確率的には非常にしばしばあり得
ることであるが、cＤＮＡ配列が、上記の様な認識部位
と１個の塩基だけが異なっている配列を含んでいる場合
は、修復合成によって、適切な置換塩基を含んでいる、
従って所望の制限部位を含有している複製cＤＮＡが得
られる。開裂によって望ましくないリーダー配列のＤＮ
Ａが除去され、その後、完全なポリペプチドの発現に必
要なコドンが合成により回復される（次式参照）。
【００１４】
【化２】
【００１５】勿論、所望によりもっと長い制限部位を同
様にして挿入することができるし、また、希望する位置
に、その制限部位に共通している塩基が２個しか存在し
ない場合でも、連続修復によって４−塩基制限部位を作
製することができることは容易に理解されるはずであ
る。この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だけでな
く、外来性ではあるが特別に設計したある大きさの蛋白
質を発現するのが望ましい場合にも応用される。この様
な応用例として次の４種類のものを挙げることができ
る。まず第１に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋白と
結合することによって免疫原性が付与されるハプテンま
たはその他の免疫決定因子を発現してもよく、この様に
してワクチンが製造され得る(英国特許第２００８１２
３Ａ号明細書参照)。また、生物学的安全性の見地か
ら、目的とする生成物を、細胞外で開裂して活性体に変
換し得る様に設計したその他の生物活性不活性化蛋白質
との複合体の形で発現してもよい。第３の応用は、細胞
膜を通って排泄された生成物の輸送信号ポリペプチドを
開裂することが出来るならば、所望の生成物の前に輸送
信号ポリペプチドをつけて、細胞膜を通して排泄させる
ことにより目的産物を製造することができる。最後に、
細胞外で特異的に開裂され得る様に設計された外来性蛋
白質との複合体は、そうしなければ微生物宿主にとって
内因性の蛋白質分解酵素で容易に分解されてしまう目的
産物を隔離するのに使用し得る。これらの内、少なくと
も最後の３つの応用例では、mＲＮＡ転写体の暗号配列
を完全にする為に使用される合成によるこの「アダプタ
ー分子」は、例えば酵素の作用によって特異的に開裂さ
れ得るアミノ酸配列のためのコドンをさらに持っていて
もよい。例えばトリプシンまたはキモトリプシンはアル
ギニン−アルギニン(arg−arg)またはリジン−リジン(l
ys−lys)などで特異的に開裂する(英国特許第２００８
１２３Ａ号、前記)。
様にして挿入することができるし、また、希望する位置
に、その制限部位に共通している塩基が２個しか存在し
ない場合でも、連続修復によって４−塩基制限部位を作
製することができることは容易に理解されるはずであ
る。この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だけでな
く、外来性ではあるが特別に設計したある大きさの蛋白
質を発現するのが望ましい場合にも応用される。この様
な応用例として次の４種類のものを挙げることができ
る。まず第１に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋白と
結合することによって免疫原性が付与されるハプテンま
たはその他の免疫決定因子を発現してもよく、この様に
してワクチンが製造され得る(英国特許第２００８１２
３Ａ号明細書参照)。また、生物学的安全性の見地か
ら、目的とする生成物を、細胞外で開裂して活性体に変
換し得る様に設計したその他の生物活性不活性化蛋白質
との複合体の形で発現してもよい。第３の応用は、細胞
膜を通って排泄された生成物の輸送信号ポリペプチドを
開裂することが出来るならば、所望の生成物の前に輸送
信号ポリペプチドをつけて、細胞膜を通して排泄させる
ことにより目的産物を製造することができる。最後に、
細胞外で特異的に開裂され得る様に設計された外来性蛋
白質との複合体は、そうしなければ微生物宿主にとって
内因性の蛋白質分解酵素で容易に分解されてしまう目的
産物を隔離するのに使用し得る。これらの内、少なくと
も最後の３つの応用例では、mＲＮＡ転写体の暗号配列
を完全にする為に使用される合成によるこの「アダプタ
ー分子」は、例えば酵素の作用によって特異的に開裂さ
れ得るアミノ酸配列のためのコドンをさらに持っていて
もよい。例えばトリプシンまたはキモトリプシンはアル
ギニン−アルギニン(arg−arg)またはリジン−リジン(l
ys−lys)などで特異的に開裂する(英国特許第２００８
１２３Ａ号、前記)。
【００１６】以上記載したことから明らかな様に、本発
明は非常に多方面の応用性を持っており、それらはいづ
れも以下に述べる共通した特質をもっている。 １．目
的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分を
コードしているmＲＮＡ転写体であるが、それ自体を発
現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さい、異
なったポリペプチドが産生されるであろうmＲＮＡ転写
体を使用する。 ２．目的産物に含まれているアミノ酸
配列以外のアミノ酸配列のための蛋白質暗号化コドンが
存在する場合は、これを除去する。
明は非常に多方面の応用性を持っており、それらはいづ
れも以下に述べる共通した特質をもっている。 １．目
的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分を
コードしているmＲＮＡ転写体であるが、それ自体を発
現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さい、異
なったポリペプチドが産生されるであろうmＲＮＡ転写
体を使用する。 ２．目的産物に含まれているアミノ酸
配列以外のアミノ酸配列のための蛋白質暗号化コドンが
存在する場合は、これを除去する。
【００１７】３．有機合成により、所望の配列の残りの
部分をコードする断片を製造する。 ４．mＲＮＡ転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複
製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、また
は異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断
し得る目的産物を発現する。勿論、発現生成物はいづれ
の場合も、翻訳開始信号によって暗号化されているアミ
ノ酸から始まる(ＡＴＧの場合はf−メチオニン)。これ
は細胞内で除去されると期待し得るし、またいづれにせ
よ、最終生成物の生物活性には本質的な影響を与えない
と期待し得る。
部分をコードする断片を製造する。 ４．mＲＮＡ転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複
製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、また
は異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断
し得る目的産物を発現する。勿論、発現生成物はいづれ
の場合も、翻訳開始信号によって暗号化されているアミ
ノ酸から始まる(ＡＴＧの場合はf−メチオニン)。これ
は細胞内で除去されると期待し得るし、またいづれにせ
よ、最終生成物の生物活性には本質的な影響を与えない
と期待し得る。
【００１８】本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の
製造に一般に利用し得るものであるが、特に哺乳動物の
ポリペプチドホルモン類およびその他の医療に使用し得
る物質、例えばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、す
い臓性ポリペプチド、アドレノコルチコトロピン、ベー
ターエンドルフィン、インターフェロン、ウロキナー
ゼ、凝血因子、ヒトアルブミンなどを発現するのに特に
適している。以下に本発明の好ましい実施形式を記載す
るが、これは、ヒト生長ホルモンをコードする部分的合
成遺伝子を作製し、クローンし、そして微生物により発
現するものである。
製造に一般に利用し得るものであるが、特に哺乳動物の
ポリペプチドホルモン類およびその他の医療に使用し得
る物質、例えばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、す
い臓性ポリペプチド、アドレノコルチコトロピン、ベー
ターエンドルフィン、インターフェロン、ウロキナー
ゼ、凝血因子、ヒトアルブミンなどを発現するのに特に
適している。以下に本発明の好ましい実施形式を記載す
るが、これは、ヒト生長ホルモンをコードする部分的合
成遺伝子を作製し、クローンし、そして微生物により発
現するものである。
【００１９】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。なお以下の実施例は単なる例示に過ぎず、い
かなる意味においても、本発明を制限するものではな
い。 実施例１ ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒体
の作製および発現 １．mＲＮＡ転写体のＨae III断片のクローニング Ｕllrichらの方法により、ＨＧＨのためのポリアデニル
化mＲＮＡを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た(Ａ.Ｕllrich et al.Ｓcience １９６,１３１３、１
９７７年)。Ｗickensらの方法に従い、このＲＮＡ５μg
から２本鎖(dsと略す)cＤＮＡ１.５μgを作製した(Ｗic
kens et al.Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５３ ２４８３、１９７
８年)。ただし、２番目の鎖の合成には、ＤＮＡポリメ
ラーゼIの代りにＲＮＡポリメラーゼ「Ｋlenow frag-men
t」を使用した(Ｈ.Ｋlenow,Ｐroc.Ｎart'l.Ａcad.Ｓci.
ＵＳＡ.６５ １６８,１９７０年)。ＨＧＨの制限パタ
ーンについては図５，図６に示す様に、ＨaeIII制限部
位が３'非暗号領域内およびＨＧＨの２３および２４番
目のアミノ酸をコードする配列内に存在する。このdsＨ
ＧＨ cＤＮＡをＨaeIIIで処理するとＨＧＨの２４から
１９１番目のアミノ酸をコードする５５１の塩基対(bp
と略す)からなるＤＮＡ断片が得られる。例えばcＤＮＡ
９０ngをＨaeIIIで処理し、８％ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、５５０bp の領域を溶離すると、約１n
gのcＤＮＡが得られる。Ｂolivarらの方法によって調製
したpＢ３２２を、このcＤＮＡのためのクローニング媒
体として選択した(Ｆ.Ｂolivar et al.Ｇene ２ ９５
−１１３、１９７７年)。pＢＲ３２２の特徴は十分に解
明されており(Ｊ.Ｇ.Ｓutcliffe,ＣoldＳpring Ｈarbor
Ｓymposium ４３ ７０、１９７８年参照)、これは多数
のコピーを複製するプラスミッドである。また、このプ
ラスミッドはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子(それぞれＡpR、ＴcRと表わす。図７，図８参照)
を含んでいるのでアンピシリンおよびテトラサイクリン
の両者に対して耐性を有し、また、制限酵素ＰstI、Ｅc
oＲIおよびＨindIIIの認識部位を含んでいる。ＨaeIII
による開裂生成物は鈍感末端を有する。従ってＣhangら
の「ＧＣテイリング法」(Ｃhang.Ａ.Ｃ.Ｙ.et al.Ｎature
２７５ ６１７、１９７８年)を用いて、pＢＲ３２２
をＰstIで開裂した粘着末端生成物とmＲＮＡ転写体をＨ
aeIIIで消化したものを結合することができ、cＤＮＡ断
片をpＢＲ３２２のＰstI部位に挿入してcＤＮＡ上にＨa
eIII制限部位(ＧＧ↓ＣＣ)を復元する一方、その挿入体
のそれぞれの末端にＰstI制限部位(ＣＴＧＣＡ↓Ｇ)を
復元することができる。
説明する。なお以下の実施例は単なる例示に過ぎず、い
かなる意味においても、本発明を制限するものではな
い。 実施例１ ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒体
の作製および発現 １．mＲＮＡ転写体のＨae III断片のクローニング Ｕllrichらの方法により、ＨＧＨのためのポリアデニル
化mＲＮＡを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た(Ａ.Ｕllrich et al.Ｓcience １９６,１３１３、１
９７７年)。Ｗickensらの方法に従い、このＲＮＡ５μg
から２本鎖(dsと略す)cＤＮＡ１.５μgを作製した(Ｗic
kens et al.Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５３ ２４８３、１９７
８年)。ただし、２番目の鎖の合成には、ＤＮＡポリメ
ラーゼIの代りにＲＮＡポリメラーゼ「Ｋlenow frag-men
t」を使用した(Ｈ.Ｋlenow,Ｐroc.Ｎart'l.Ａcad.Ｓci.
ＵＳＡ.６５ １６８,１９７０年)。ＨＧＨの制限パタ
ーンについては図５，図６に示す様に、ＨaeIII制限部
位が３'非暗号領域内およびＨＧＨの２３および２４番
目のアミノ酸をコードする配列内に存在する。このdsＨ
ＧＨ cＤＮＡをＨaeIIIで処理するとＨＧＨの２４から
１９１番目のアミノ酸をコードする５５１の塩基対(bp
と略す)からなるＤＮＡ断片が得られる。例えばcＤＮＡ
９０ngをＨaeIIIで処理し、８％ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、５５０bp の領域を溶離すると、約１n
gのcＤＮＡが得られる。Ｂolivarらの方法によって調製
したpＢ３２２を、このcＤＮＡのためのクローニング媒
体として選択した(Ｆ.Ｂolivar et al.Ｇene ２ ９５
−１１３、１９７７年)。pＢＲ３２２の特徴は十分に解
明されており(Ｊ.Ｇ.Ｓutcliffe,ＣoldＳpring Ｈarbor
Ｓymposium ４３ ７０、１９７８年参照)、これは多数
のコピーを複製するプラスミッドである。また、このプ
ラスミッドはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子(それぞれＡpR、ＴcRと表わす。図７，図８参照)
を含んでいるのでアンピシリンおよびテトラサイクリン
の両者に対して耐性を有し、また、制限酵素ＰstI、Ｅc
oＲIおよびＨindIIIの認識部位を含んでいる。ＨaeIII
による開裂生成物は鈍感末端を有する。従ってＣhangら
の「ＧＣテイリング法」(Ｃhang.Ａ.Ｃ.Ｙ.et al.Ｎature
２７５ ６１７、１９７８年)を用いて、pＢＲ３２２
をＰstIで開裂した粘着末端生成物とmＲＮＡ転写体をＨ
aeIIIで消化したものを結合することができ、cＤＮＡ断
片をpＢＲ３２２のＰstI部位に挿入してcＤＮＡ上にＨa
eIII制限部位(ＧＧ↓ＣＣ)を復元する一方、その挿入体
のそれぞれの末端にＰstI制限部位(ＣＴＧＣＡ↓Ｇ)を
復元することができる。
【００２０】前記した様に、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ(ＴdＴ)を用いて、３'末端
に約２０dＣを付加した(Ｃhang,Ａ.Ｙ.Ｃ．,前記)。同
様にして、６０ngのＰstIで処理したpＢＲ３２２の３'
末端に約１０個のdＧを付加した。このdＣ付加ds cＤＮ
ＡとdＧ付加ベクター(媒体)ＤＮＡを、１０mＭトリス−
ＨＣl(pＨ７.５)、１００mＭ ＮaＣl、０.２５mＭ ＥＤ
ＴＡの１３０μl中でアニーリングした。この混合物を
Ｅ.Ｃoli×１７７６の形質転換に使用する前に、７０℃
に加熱し、徐々に３７℃まで冷却し(１２時間)、次いで
２０℃に冷却した(６時間)。×１７７６でクローンした
このプラスミッドpＨＧＨ３１につき、ＭaxamおよびＧi
lbertの方法(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４
５６０、１９７７年)を用いてＤＮＡ配列を分析した結
果、図５，図６に示す様にＨＧＨの２４から１９１のア
ミノ酸のためのコドンが確認された。
オチジルトランスフェラーゼ(ＴdＴ)を用いて、３'末端
に約２０dＣを付加した(Ｃhang,Ａ.Ｙ.Ｃ．,前記)。同
様にして、６０ngのＰstIで処理したpＢＲ３２２の３'
末端に約１０個のdＧを付加した。このdＣ付加ds cＤＮ
ＡとdＧ付加ベクター(媒体)ＤＮＡを、１０mＭトリス−
ＨＣl(pＨ７.５)、１００mＭ ＮaＣl、０.２５mＭ ＥＤ
ＴＡの１３０μl中でアニーリングした。この混合物を
Ｅ.Ｃoli×１７７６の形質転換に使用する前に、７０℃
に加熱し、徐々に３７℃まで冷却し(１２時間)、次いで
２０℃に冷却した(６時間)。×１７７６でクローンした
このプラスミッドpＨＧＨ３１につき、ＭaxamおよびＧi
lbertの方法(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７４
５６０、１９７７年)を用いてＤＮＡ配列を分析した結
果、図５，図６に示す様にＨＧＨの２４から１９１のア
ミノ酸のためのコドンが確認された。
【００２１】Ｅ.Ｃoli Ｋ−１２株×１７７６はＦ- ton
Ａ５３dapＤ８min Ａ１ supＥ４２△４０〔gal−uvr
Ｂ〕λ- min Ｂ２ rfb−２ nalＡ２５ oms−２ thyＡ５
７ metＣ６５ oms−１ △２９〔bioＨ−asd〕cycＢ２
cycＡ１ hsdＲ２の遺伝子型を有する。×１７７６はア
メリカ予防衛生研究所(ＮＩＨ)により、ＥＫ２宿主ベク
ター系として公認されている。 ×１７７６はジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)偏性要求性菌
であり、ムコ多糖類コラン酸(colanic acid)を合成する
ことができない。従って、細胞の代謝および生長を支え
るに十分な栄養は存在しているが、ＤＡＰが欠乏してい
る環境ではＤＡＰ欠乏で死亡する。これはチミンまたは
チミジンを要求し、代謝活性を維持するに十分な栄養は
あるがチミンおよびチミジンがない環境では、ＤＮＡの
崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。×１７７６は胆
汁に対する感受性が極めて強く生存することができな
い。従ってラットの胃腸管を生きて通過することができ
ない。また、×１７７６は洗剤、抗生物質、薬物および
化学薬品に対して感受性が非常に強い。さらに×１７７
６は紫外線による損傷を暗回復または光回復することが
できず、従って、野生型のＥ.Ｃoli(大腸菌)より太陽光
に対する感受性が数オーダー強い。×１７７６は多くの
形質導入ファージに対して抵抗し、種々の突然変異がた
めに、異なったタイプの複合プラスミッド(conjugative
plasmids)の遺伝には複合が不十分である(conjugation
deficient)。×１７７６は、ナリジクシックアシッド
(nalidixic acid)、サイクロセリンおよびトリメトプリ
ムに対して抵抗性がある。従って、これらの薬物を培地
に加えることにより、この株をモニターし、形質転換
中、汚染菌の形質転換を不可能にすることができる。
Ａ５３dapＤ８min Ａ１ supＥ４２△４０〔gal−uvr
Ｂ〕λ- min Ｂ２ rfb−２ nalＡ２５ oms−２ thyＡ５
７ metＣ６５ oms−１ △２９〔bioＨ−asd〕cycＢ２
cycＡ１ hsdＲ２の遺伝子型を有する。×１７７６はア
メリカ予防衛生研究所(ＮＩＨ)により、ＥＫ２宿主ベク
ター系として公認されている。 ×１７７６はジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)偏性要求性菌
であり、ムコ多糖類コラン酸(colanic acid)を合成する
ことができない。従って、細胞の代謝および生長を支え
るに十分な栄養は存在しているが、ＤＡＰが欠乏してい
る環境ではＤＡＰ欠乏で死亡する。これはチミンまたは
チミジンを要求し、代謝活性を維持するに十分な栄養は
あるがチミンおよびチミジンがない環境では、ＤＮＡの
崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。×１７７６は胆
汁に対する感受性が極めて強く生存することができな
い。従ってラットの胃腸管を生きて通過することができ
ない。また、×１７７６は洗剤、抗生物質、薬物および
化学薬品に対して感受性が非常に強い。さらに×１７７
６は紫外線による損傷を暗回復または光回復することが
できず、従って、野生型のＥ.Ｃoli(大腸菌)より太陽光
に対する感受性が数オーダー強い。×１７７６は多くの
形質導入ファージに対して抵抗し、種々の突然変異がた
めに、異なったタイプの複合プラスミッド(conjugative
plasmids)の遺伝には複合が不十分である(conjugation
deficient)。×１７７６は、ナリジクシックアシッド
(nalidixic acid)、サイクロセリンおよびトリメトプリ
ムに対して抵抗性がある。従って、これらの薬物を培地
に加えることにより、この株をモニターし、形質転換
中、汚染菌の形質転換を不可能にすることができる。
【００２２】×１７７６は、１００μg ＤＡＰ／mlおよ
び４μgチミジン／mlを追加したＬブロスまたはペナセ
イ(Ｐenassay)ブロス中、約５０分の世代時間で生長
し、定常期には８〜１０×１０8細胞／mlの密度に達す
る。１〜２分渦巻き状にそして前後にゆっくり振盪して
細胞を１００％生存可能の状態に保って懸濁する。×１
７７６についてのさらに詳しいことはＣurtisらの文献
を参照のこと(Ｒ.Ｃurtiset al.,Ｍolecular Ｃloning
of Ｒecombinant ＤＮＡ、９９−１７７、Ｓcottand Ｗ
erner eds.,Ａcademic Ｐress、Ｎ.Ｙ.１９７７年)。×
１７７６は１９７９年７月３日、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された(Ａ
ＴＣＣ番号３１５３７、無制限寄託)。
び４μgチミジン／mlを追加したＬブロスまたはペナセ
イ(Ｐenassay)ブロス中、約５０分の世代時間で生長
し、定常期には８〜１０×１０8細胞／mlの密度に達す
る。１〜２分渦巻き状にそして前後にゆっくり振盪して
細胞を１００％生存可能の状態に保って懸濁する。×１
７７６についてのさらに詳しいことはＣurtisらの文献
を参照のこと(Ｒ.Ｃurtiset al.,Ｍolecular Ｃloning
of Ｒecombinant ＤＮＡ、９９−１７７、Ｓcottand Ｗ
erner eds.,Ａcademic Ｐress、Ｎ.Ｙ.１９７７年)。×
１７７６は１９７９年７月３日、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された(Ａ
ＴＣＣ番号３１５３７、無制限寄託)。
【００２３】２．合成遺伝子断片の作製およびクローニ
ング(図１，図２および図３，図４参照) ＨＧＨ部分的合成遺伝子の作製計画は、mＲＮＡ転写体
と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部
位を有する合成遺伝子を作成することであった、従っ
て、図１，図２に示す様に、このＨＧＨの最初の２４個
のアミノ酸のための合成遺伝子は、２３番目のアミノ酸
に続いてＨaeIII開裂部位を含んでいる。この合成断片
の遠位末端にはリンカーが設けられている。このリンカ
ーにより、合成断片は、mＲＮＡ転写体および合成断片
が最終的に結合するプラスミッドの、制限開裂によって
生じる１本鎖末端とアニーリングすることができる。
ング(図１，図２および図３，図４参照) ＨＧＨ部分的合成遺伝子の作製計画は、mＲＮＡ転写体
と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部
位を有する合成遺伝子を作成することであった、従っ
て、図１，図２に示す様に、このＨＧＨの最初の２４個
のアミノ酸のための合成遺伝子は、２３番目のアミノ酸
に続いてＨaeIII開裂部位を含んでいる。この合成断片
の遠位末端にはリンカーが設けられている。このリンカ
ーにより、合成断片は、mＲＮＡ転写体および合成断片
が最終的に結合するプラスミッドの、制限開裂によって
生じる１本鎖末端とアニーリングすることができる。
【００２４】図１，図２に示す様に、２本鎖断片の５'
末端には、ＥcoＲIおよびＨindIII制限エンドヌクレア
ーゼのための一本鎖接着末端が含まれており、これによ
りプラスミッドの作製が容易に促進される。左末端のメ
チオニンコドンは翻訳開始部位を提供している。１１量
体から１６量体の種々の大きさの１２本の異なったオリ
ゴヌクレオチドをＣreaの改良ホスホトリエステル法に
より合成した(Ｃrea,Ｒ,Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳ
Ａ ７５ ５７６５、１９７８年)。Ｕ1からＵ6、および
Ｌ1からＬ6のこれらのオリゴヌクレオチドは矢印で示し
てある。１０μgのＵ2からＵ6およびＬ2からＬ6を、公
知の方法に従い、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼおよび
(γ32−Ｐ)ＡＴＰを用いて加燐酸化(phosphorylate)し
た(Ｇoeddel,Ｄ.Ｖ.ら、Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.Ｕ
ＳＡ ７６ １０６、１９７９年)。Ｔ4リガーゼを触媒
として用いた３つの別々の反応を行なった:即ち、１０
μgの５'−ＯＨ断片Ｕ1を加燐酸化したＵ2,Ｌ5およびＬ
6と結合し:加燐酸化したＵ3,Ｕ4,Ｌ3およびＬ4を結合
し:そして１０μgの５'−ＯＨ断片Ｌ1を加燐酸化したＬ
2,Ｕ5およびＵ6と結合した。これらの結合反応は３００
μlの２０mＭトリス−塩酸(pＨ７.５)、１mＭ ＭgＣ
l2、１０mＭジチオトレイット、０.５mＭ ＡＴＰ中、Ｔ
4リガーゼ１００単位を用い、４℃で６時間行なった。
次いで、これらの３種の結合混合物を合わせ、Ｔ4リガ
ーゼ１００単位を加え、２０℃で１２時間反応させた。
この混合物をエタノールで沈殿させ、１０％ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動した。８４塩基対移動帯をゲ
ルから切取り、溶離した。pＢＲ３２２(１μg)をＥcoＲ
IおよびＨindIIIで処理し、大きい断片をゲル電気泳動
法で単離し、合成ＤＮＡと結合した。この混合体を用い
てＥ.Ｃoli.Ｋ−１２株２９４(endＡ.thi- 、hsr- 、hs
mk + )を形質転換した。２９４株は１９７８年１０月３
０日、ＡＴＣＣに寄託された(ＡＴＣＣ番号３１４４
６、無制限寄託)。１個の形質転換体のプラスミッドpＨ
ＧＨ3からのＥcoＲI−ＨindIII挿入体の配列をＭaxamお
よびＧilbertの方法(前記)により分析した結果、図１，
図２に示した通りであることを確認した。
末端には、ＥcoＲIおよびＨindIII制限エンドヌクレア
ーゼのための一本鎖接着末端が含まれており、これによ
りプラスミッドの作製が容易に促進される。左末端のメ
チオニンコドンは翻訳開始部位を提供している。１１量
体から１６量体の種々の大きさの１２本の異なったオリ
ゴヌクレオチドをＣreaの改良ホスホトリエステル法に
より合成した(Ｃrea,Ｒ,Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳ
Ａ ７５ ５７６５、１９７８年)。Ｕ1からＵ6、および
Ｌ1からＬ6のこれらのオリゴヌクレオチドは矢印で示し
てある。１０μgのＵ2からＵ6およびＬ2からＬ6を、公
知の方法に従い、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼおよび
(γ32−Ｐ)ＡＴＰを用いて加燐酸化(phosphorylate)し
た(Ｇoeddel,Ｄ.Ｖ.ら、Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.Ｕ
ＳＡ ７６ １０６、１９７９年)。Ｔ4リガーゼを触媒
として用いた３つの別々の反応を行なった:即ち、１０
μgの５'−ＯＨ断片Ｕ1を加燐酸化したＵ2,Ｌ5およびＬ
6と結合し:加燐酸化したＵ3,Ｕ4,Ｌ3およびＬ4を結合
し:そして１０μgの５'−ＯＨ断片Ｌ1を加燐酸化したＬ
2,Ｕ5およびＵ6と結合した。これらの結合反応は３００
μlの２０mＭトリス−塩酸(pＨ７.５)、１mＭ ＭgＣ
l2、１０mＭジチオトレイット、０.５mＭ ＡＴＰ中、Ｔ
4リガーゼ１００単位を用い、４℃で６時間行なった。
次いで、これらの３種の結合混合物を合わせ、Ｔ4リガ
ーゼ１００単位を加え、２０℃で１２時間反応させた。
この混合物をエタノールで沈殿させ、１０％ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動した。８４塩基対移動帯をゲ
ルから切取り、溶離した。pＢＲ３２２(１μg)をＥcoＲ
IおよびＨindIIIで処理し、大きい断片をゲル電気泳動
法で単離し、合成ＤＮＡと結合した。この混合体を用い
てＥ.Ｃoli.Ｋ−１２株２９４(endＡ.thi- 、hsr- 、hs
mk + )を形質転換した。２９４株は１９７８年１０月３
０日、ＡＴＣＣに寄託された(ＡＴＣＣ番号３１４４
６、無制限寄託)。１個の形質転換体のプラスミッドpＨ
ＧＨ3からのＥcoＲI−ＨindIII挿入体の配列をＭaxamお
よびＧilbertの方法(前記)により分析した結果、図１，
図２に示した通りであることを確認した。
【００２５】３．細菌によるＨＧＨの発現のためのプラ
スミッドの作製(図９，図１０) pＨＧＨ３中の合成断片およびpＨＧＨ３１中のmＲＮＡ
転写体を用い、発現用プラスミッドpＧＨ６を使用し
て、図９，図１０に示す様に、両方の断片を含有する複
製可能なプラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロ
モーターを含有するこの発現用プラスミッドを次の様に
して作製した。Ｂackmanらの方法に従い、９５塩基対の
非相同(heterologous)ＤＮＡ断片で分離されている２個
の９５塩基対ＵＶ５lacプロモーター断片を含有する２
８５塩基対ＥcoＲI断片をプラスミッドpＫＢ２６８から
単離した(Ｋ.Ｂackman,et al., Ｃell １３巻 ６５−
７１、１９７８年)。この２８５塩基対断片をpＢＲ３２
２のＥcoＲI部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝
子を持った適切な解読相内に向って配置しているプロモ
ーター群を有するクローンpＧＨ１を単離した。このテ
トラサイクリン耐性遺伝子から遠位のＥcoＲI部位をＥc
oＲIによる部分消化で破壊し、その結果得られる１本鎖
ＥcoＲI末端をＤＮＡポリメラーゼIで修復し、鈍感末端
結合によりプラスミッドを再環化した。作成されたプラ
スミッドpＧＨ６は、完成したＨＧＨ用遺伝子を挿入す
ることができるプロモーター系について適切に配置され
た単一のＥcoＲI部位を含有している。
スミッドの作製(図９，図１０) pＨＧＨ３中の合成断片およびpＨＧＨ３１中のmＲＮＡ
転写体を用い、発現用プラスミッドpＧＨ６を使用し
て、図９，図１０に示す様に、両方の断片を含有する複
製可能なプラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロ
モーターを含有するこの発現用プラスミッドを次の様に
して作製した。Ｂackmanらの方法に従い、９５塩基対の
非相同(heterologous)ＤＮＡ断片で分離されている２個
の９５塩基対ＵＶ５lacプロモーター断片を含有する２
８５塩基対ＥcoＲI断片をプラスミッドpＫＢ２６８から
単離した(Ｋ.Ｂackman,et al., Ｃell １３巻 ６５−
７１、１９７８年)。この２８５塩基対断片をpＢＲ３２
２のＥcoＲI部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝
子を持った適切な解読相内に向って配置しているプロモ
ーター群を有するクローンpＧＨ１を単離した。このテ
トラサイクリン耐性遺伝子から遠位のＥcoＲI部位をＥc
oＲIによる部分消化で破壊し、その結果得られる１本鎖
ＥcoＲI末端をＤＮＡポリメラーゼIで修復し、鈍感末端
結合によりプラスミッドを再環化した。作成されたプラ
スミッドpＧＨ６は、完成したＨＧＨ用遺伝子を挿入す
ることができるプロモーター系について適切に配置され
た単一のＥcoＲI部位を含有している。
【００２６】ＲＮＡ転写体と結合させるための合成断片
を得るために、１０μgのpＨＧＨ３をＥcoＲIおよびＨa
eIII制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、ＨＧＨアミノ
酸１〜２３の暗号配列を含有している７７塩基対断片を
８％ポリアクリルアミドゲルで分離した。次いで５μg
のプラスミッドpＨＧＨ３１をＨaeIIIで切断した。５５
１塩基対ＨＧＨ配列および一緒に移動したpＢＲ３２２
の５４０塩基対をゲル電気泳動法により精製した。次い
でＸmaIで処理してＨＧＨ配列のみを切断し、３'非コー
ド領域から３９塩基対を除去した。得られた５１２塩基
対断片を、５４０塩基対のpＢＲ３２２ＨaeIII断片か
ら、６％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によ
り分離した。０.３μgの７７塩基対ＥcoＲI−ＨaeIII断
片を１６μlの反応液中、Ｔ4リガーゼを用いて４℃で１
４時間ポリメリ化した。リガーゼを不活性化するため
に、この混合物を７０℃で５分間加熱し、次いでＥcoＲ
I(ＥcoＲI部位によってダイマー化(二量化)した断片を
開裂するため)およびＳmaI(ＸmaIダイマーを開裂するた
め)で処理し、ＥcoＲI接着末端およびＳmaI鈍感末端を
有する５９１塩基対断片を得た。６％のポリアクリルア
ミドゲルを用いて精製し、この断片約３０ngを得た。と
ころで、発現用プラスミッドpＧＨ６はＸmaI認識部位を
含んでいないことに留意すべきである。しかしながら、
ＳmaIはＸmaIと同じ部位を認識し、しかしその中間部を
切断し、鈍感末端を生成するのである。従ってpＨＧＨ
３１から導かれたこの断片のＳma−切断末端は、鈍感末
端でpＧＨ６に結合していくことができる。
を得るために、１０μgのpＨＧＨ３をＥcoＲIおよびＨa
eIII制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、ＨＧＨアミノ
酸１〜２３の暗号配列を含有している７７塩基対断片を
８％ポリアクリルアミドゲルで分離した。次いで５μg
のプラスミッドpＨＧＨ３１をＨaeIIIで切断した。５５
１塩基対ＨＧＨ配列および一緒に移動したpＢＲ３２２
の５４０塩基対をゲル電気泳動法により精製した。次い
でＸmaIで処理してＨＧＨ配列のみを切断し、３'非コー
ド領域から３９塩基対を除去した。得られた５１２塩基
対断片を、５４０塩基対のpＢＲ３２２ＨaeIII断片か
ら、６％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によ
り分離した。０.３μgの７７塩基対ＥcoＲI−ＨaeIII断
片を１６μlの反応液中、Ｔ4リガーゼを用いて４℃で１
４時間ポリメリ化した。リガーゼを不活性化するため
に、この混合物を７０℃で５分間加熱し、次いでＥcoＲ
I(ＥcoＲI部位によってダイマー化(二量化)した断片を
開裂するため)およびＳmaI(ＸmaIダイマーを開裂するた
め)で処理し、ＥcoＲI接着末端およびＳmaI鈍感末端を
有する５９１塩基対断片を得た。６％のポリアクリルア
ミドゲルを用いて精製し、この断片約３０ngを得た。と
ころで、発現用プラスミッドpＧＨ６はＸmaI認識部位を
含んでいないことに留意すべきである。しかしながら、
ＳmaIはＸmaIと同じ部位を認識し、しかしその中間部を
切断し、鈍感末端を生成するのである。従ってpＨＧＨ
３１から導かれたこの断片のＳma−切断末端は、鈍感末
端でpＧＨ６に結合していくことができる。
【００２７】縦列lacＵＶ５プロモーターを含む発現用
プラスミッドpＧＨ６を、順次ＨindIII、ヌクレアーゼ
Ｓ１およびＥcoＲIで処理し、ゲル電気泳動法により精
製した。この様にして得た１個のＥcoＲI接着末端およ
び１個の鈍感末端を有するベクター５０ngを、１０ngの
５９１塩基対ＨＧＨ ＤＮＡと結合させた。この結合混
合物を用いてＥ.Ｃoli×１７７６を形質転換した。テト
ラサイクリン(１２.５μg／ml)に抵抗して生長するコロ
ニーを選択した。ハイブリッド(雑種)ＨＧＨ遺伝子をp
ＧＨ６に挿入することによってテトラサイクリン耐性遺
伝子のためのプロモーターが破壊されるが、縦列lacプ
ロモーターによってテトラサイクリン耐性のための構造
遺伝子が通読され、この選択特性が保持されることに注
目すべきである。この様にして約４００の形質転換体を
得た。Ｇrunstein−Ｈognessの方法によるフィルターハ
イブリダイゼーションによってＨＧＨ配列を含む１２の
コロニーを確認した(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,
７２ ３９６１、１９７５年)。これらのコロニーの
内、３種のコロニーから分離したプラスミッドが、Ｈae
III、ＰvuIIおよびＰstIで開裂した時、期待する制限パ
ターンを示した。１個のクローン、pＨＧＨ１０７のＤ
ＮＡ配列を測定した。
プラスミッドpＧＨ６を、順次ＨindIII、ヌクレアーゼ
Ｓ１およびＥcoＲIで処理し、ゲル電気泳動法により精
製した。この様にして得た１個のＥcoＲI接着末端およ
び１個の鈍感末端を有するベクター５０ngを、１０ngの
５９１塩基対ＨＧＨ ＤＮＡと結合させた。この結合混
合物を用いてＥ.Ｃoli×１７７６を形質転換した。テト
ラサイクリン(１２.５μg／ml)に抵抗して生長するコロ
ニーを選択した。ハイブリッド(雑種)ＨＧＨ遺伝子をp
ＧＨ６に挿入することによってテトラサイクリン耐性遺
伝子のためのプロモーターが破壊されるが、縦列lacプ
ロモーターによってテトラサイクリン耐性のための構造
遺伝子が通読され、この選択特性が保持されることに注
目すべきである。この様にして約４００の形質転換体を
得た。Ｇrunstein−Ｈognessの方法によるフィルターハ
イブリダイゼーションによってＨＧＨ配列を含む１２の
コロニーを確認した(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,
７２ ３９６１、１９７５年)。これらのコロニーの
内、３種のコロニーから分離したプラスミッドが、Ｈae
III、ＰvuIIおよびＰstIで開裂した時、期待する制限パ
ターンを示した。１個のクローン、pＨＧＨ１０７のＤ
ＮＡ配列を測定した。
【００２８】この形質転換体によって発現されたヒト生
長ホルモンは、フアデバスＨＧＨプライストキット(Ｐh
adebas ＨＧＨ ＰＲＩＳＴ Ｋit、Ｆarmacia)を用い、
溶菌上澄液を順次希釈したものを直接放射免疫分析する
ことにより簡単に検出された。ＨＧＨの発現がlacプロ
モーターのコントロール下(支配下)で行なわれたことを
示すために、pＨＧＨ１０７をlacレプレッサーを過剰生
産するＥ.Ｃoli株Ｄ１２１０lac＋(iQo＋Ｚty＋)に入れ
た。インデューサー、ＩＰＴＧ(イソプロピルチオガラ
クトシド)を添加するまで、有意な量のＨＧＨ発現生成
物は検出されなかった。
長ホルモンは、フアデバスＨＧＨプライストキット(Ｐh
adebas ＨＧＨ ＰＲＩＳＴ Ｋit、Ｆarmacia)を用い、
溶菌上澄液を順次希釈したものを直接放射免疫分析する
ことにより簡単に検出された。ＨＧＨの発現がlacプロ
モーターのコントロール下(支配下)で行なわれたことを
示すために、pＨＧＨ１０７をlacレプレッサーを過剰生
産するＥ.Ｃoli株Ｄ１２１０lac＋(iQo＋Ｚty＋)に入れ
た。インデューサー、ＩＰＴＧ(イソプロピルチオガラ
クトシド)を添加するまで、有意な量のＨＧＨ発現生成
物は検出されなかった。
【００２９】pＨＧＨ１０７のＥcoＲI部位を除去するこ
とにより、lacプロモーターのリボゾーム結合部位コド
ンとＡＴＧ開始信号との距離は、天然におけるそのリボ
ゾーム結合部位コドンとβ−ガラクトシダーゼのための
開始信号との間の距離と同じになるであろう。この天然
の距離を模倣することによって発現が増加するかどうか
を調べる為に、pＨＧＨ１０７をＥcoＲIで開裂し、得ら
れた１本鎖末端をＳ１エンドヌクレアーゼで消化し、次
いでＴ４リガーゼを用いて鈍感末端結合して再環化する
ことにより、pＨＧＨ１０７をpＨＧＨ１０７−１に変換
した。この様にして得たプラスミッドは同様にＨＧＨを
発現することができるけれども、驚くべきことに、発現
の程度はpＧＨ１０７より低いことが直接放射免疫分析
によってわかった。 本発明は上に述べた好ましい実施
形式を限定されるのではなく、特許請求の範囲の記載に
よってのみ限定されるものであることは、当業者には容
易に理解されるだろう。プロモーター系、親プラスミッ
ド、目的とするポリペプチド生成物またはその他の因子
を種々選択し直すことにより、これまで述べたものに種
々の変更を加えることは勿論可能である。例えば、他の
プロモーター系を本発明において使用することができ
る。この様なプロモーター系としてはラムダ−プロモー
ター、アルビノースオペロン(Ｐhi ８０d ara)、または
コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリホスファターゼ
あるいはトリプトファンプロモーター系などを挙げるこ
とができる。細菌による発現のために使用する宿主生物
としては、例えばエンテロバクテリアケア(Ｅnterobact
eriaceae)、例えば大腸菌株、サルモネラ(Ｓalmonell
a);バシラーケア(Ｂacillaceae)、例えば枯草菌(bacill
ussubtilis);肺炎球菌(Ｐneumococcus);連鎖球菌(Ｓtre
ptococcus);およびインフルエンザ菌(Ｈaemophilus inf
luenzae)などが挙げられる。勿論、どの微生物を選ぶか
によって、アメリカ予防衛生研究所の組み換えＤＮＡの
ためのガイドライン(４３Ｆed.Ｒeg.６０,０８０、１９
７８年)に従って行なわれなければならないクローニン
グおよび発現操作において、物理的封じ込めの程度を調
節しなければならない。
とにより、lacプロモーターのリボゾーム結合部位コド
ンとＡＴＧ開始信号との距離は、天然におけるそのリボ
ゾーム結合部位コドンとβ−ガラクトシダーゼのための
開始信号との間の距離と同じになるであろう。この天然
の距離を模倣することによって発現が増加するかどうか
を調べる為に、pＨＧＨ１０７をＥcoＲIで開裂し、得ら
れた１本鎖末端をＳ１エンドヌクレアーゼで消化し、次
いでＴ４リガーゼを用いて鈍感末端結合して再環化する
ことにより、pＨＧＨ１０７をpＨＧＨ１０７−１に変換
した。この様にして得たプラスミッドは同様にＨＧＨを
発現することができるけれども、驚くべきことに、発現
の程度はpＧＨ１０７より低いことが直接放射免疫分析
によってわかった。 本発明は上に述べた好ましい実施
形式を限定されるのではなく、特許請求の範囲の記載に
よってのみ限定されるものであることは、当業者には容
易に理解されるだろう。プロモーター系、親プラスミッ
ド、目的とするポリペプチド生成物またはその他の因子
を種々選択し直すことにより、これまで述べたものに種
々の変更を加えることは勿論可能である。例えば、他の
プロモーター系を本発明において使用することができ
る。この様なプロモーター系としてはラムダ−プロモー
ター、アルビノースオペロン(Ｐhi ８０d ara)、または
コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリホスファターゼ
あるいはトリプトファンプロモーター系などを挙げるこ
とができる。細菌による発現のために使用する宿主生物
としては、例えばエンテロバクテリアケア(Ｅnterobact
eriaceae)、例えば大腸菌株、サルモネラ(Ｓalmonell
a);バシラーケア(Ｂacillaceae)、例えば枯草菌(bacill
ussubtilis);肺炎球菌(Ｐneumococcus);連鎖球菌(Ｓtre
ptococcus);およびインフルエンザ菌(Ｈaemophilus inf
luenzae)などが挙げられる。勿論、どの微生物を選ぶか
によって、アメリカ予防衛生研究所の組み換えＤＮＡの
ためのガイドライン(４３Ｆed.Ｒeg.６０,０８０、１９
７８年)に従って行なわれなければならないクローニン
グおよび発現操作において、物理的封じ込めの程度を調
節しなければならない。
【００３０】本発明は実験室規模で実施するのは好まし
いけれども、Ｅ.Ｃoli×１７７６は、生物学的安全性の
為に故意に虚弱性が導入されているので、大規模に工業
生産するには限界があることがわかった。生物学的封じ
込めよりも、むしろ適当な物理学的封じ込めを行なえ
ば、Ｅ.Ｃoli.Ｋ−１２株２９４(前記)およびＥ.Ｃoli.
株ＲＲI、遺伝子型:Ｐro- Ｌeu- Ｔhi- ＲB - recＡ＋Ｓ
trr Ｌacy- の様な微生物を大規模操作に使用すること
ができる。Ｅ.Ｃoli.ＲＲIは、Ｈfrドナー(高頻度組換
型供与菌)としてのＥ.Ｃoli.Ｋ１２株ＫＬ１６とかけあ
わせることにより、Ｅ.Ｃoli.ＨＢ１０１(Ｈ.Ｗ.Ｂoyer
ら、Ｊ.Ｍol.Ｂio.４１ ４５９−４７２、１９６９年
参照)から得ることができる(Ｊ.Ｈ.Ｍiller,Ｅxperimen
ts in Ｍolecular Ｇenetics; Ｃold Ｓpring Ｈarbor,
Ｎew Ｙork,１９７２年参照)。Ｅ.Ｃoli.ＲＲIは、１９
７８年１０月３０日、ＡＴＣＣに寄託された(無制限寄
託、ＡＴＣＣ番号３１３４３)。×１７７６株も同様に
１９７９年７月３日、ＡＴＣＣに寄託された(ＡＴＣＣ
番号３１５３７)。その他、プラスミッドpＨＧＨ１０７
(ＡＴＣＣ番号４００１１)、プラスミッドpＧＨ６(ＡＴ
ＣＣ番号４００１２)、pＨＧＨ１０７で形質転換した×
１７７６株(ＡＴＣＣ番号３１５３８)およびpＧＨ６で
形質転換したＥ.ＣoliＫ１２株２９４(ＡＴＣＣ番号３
１５３９)も１９７９年７月３日、ＡＴＣＣに寄託され
た。
いけれども、Ｅ.Ｃoli×１７７６は、生物学的安全性の
為に故意に虚弱性が導入されているので、大規模に工業
生産するには限界があることがわかった。生物学的封じ
込めよりも、むしろ適当な物理学的封じ込めを行なえ
ば、Ｅ.Ｃoli.Ｋ−１２株２９４(前記)およびＥ.Ｃoli.
株ＲＲI、遺伝子型:Ｐro- Ｌeu- Ｔhi- ＲB - recＡ＋Ｓ
trr Ｌacy- の様な微生物を大規模操作に使用すること
ができる。Ｅ.Ｃoli.ＲＲIは、Ｈfrドナー(高頻度組換
型供与菌)としてのＥ.Ｃoli.Ｋ１２株ＫＬ１６とかけあ
わせることにより、Ｅ.Ｃoli.ＨＢ１０１(Ｈ.Ｗ.Ｂoyer
ら、Ｊ.Ｍol.Ｂio.４１ ４５９−４７２、１９６９年
参照)から得ることができる(Ｊ.Ｈ.Ｍiller,Ｅxperimen
ts in Ｍolecular Ｇenetics; Ｃold Ｓpring Ｈarbor,
Ｎew Ｙork,１９７２年参照)。Ｅ.Ｃoli.ＲＲIは、１９
７８年１０月３０日、ＡＴＣＣに寄託された(無制限寄
託、ＡＴＣＣ番号３１３４３)。×１７７６株も同様に
１９７９年７月３日、ＡＴＣＣに寄託された(ＡＴＣＣ
番号３１５３７)。その他、プラスミッドpＨＧＨ１０７
(ＡＴＣＣ番号４００１１)、プラスミッドpＧＨ６(ＡＴ
ＣＣ番号４００１２)、pＨＧＨ１０７で形質転換した×
１７７６株(ＡＴＣＣ番号３１５３８)およびpＧＨ６で
形質転換したＥ.ＣoliＫ１２株２９４(ＡＴＣＣ番号３
１５３９)も１９７９年７月３日、ＡＴＣＣに寄託され
た。
【００３１】本発明によって製造される微生物は、ヒト
生長ホルモンを工業的スケールで発酵により製造する方
法に使用することができ、多量の生成物を得ることがで
き、従来不可能であった分野に使用することができる。
例えば形質転換Ｅ.Ｃoli株は、常法により通気し、攪拌
している鋼鉄製またはその他の発酵容器中の水性培地、
例えば、適当な栄養物(例えば炭水化物またはグリセロ
ール)、硫酸アンモニウムの様な窒素源、燐酸カリウム
の如きカリウム源、微量元素、硫酸マグネシウムなどを
含んだ、ほぼ中性pＨの(例えばpＨ７±０.３)、約３７
℃の水性培地中で増殖させることができる。形質転換微
生物は、抗生物質耐性の如き１またはそれ以上の選択特
性を示すことが好ましく。それによって選択圧がかかっ
て野生型Ｅ.Ｃoliの競合増殖が抑制される。例えば、ア
ンピシリンまたはテトラサイクリン耐性微生物の場合、
その抗生物質を発酵培地に加え、それに対する耐性を持
っていない野生型生物を選別することができる。
生長ホルモンを工業的スケールで発酵により製造する方
法に使用することができ、多量の生成物を得ることがで
き、従来不可能であった分野に使用することができる。
例えば形質転換Ｅ.Ｃoli株は、常法により通気し、攪拌
している鋼鉄製またはその他の発酵容器中の水性培地、
例えば、適当な栄養物(例えば炭水化物またはグリセロ
ール)、硫酸アンモニウムの様な窒素源、燐酸カリウム
の如きカリウム源、微量元素、硫酸マグネシウムなどを
含んだ、ほぼ中性pＨの(例えばpＨ７±０.３)、約３７
℃の水性培地中で増殖させることができる。形質転換微
生物は、抗生物質耐性の如き１またはそれ以上の選択特
性を示すことが好ましく。それによって選択圧がかかっ
て野生型Ｅ.Ｃoliの競合増殖が抑制される。例えば、ア
ンピシリンまたはテトラサイクリン耐性微生物の場合、
その抗生物質を発酵培地に加え、それに対する耐性を持
っていない野生型生物を選別することができる。
【００３２】発酵が完了したら細菌懸濁液を遠心分離す
るかあるいはブロスから細胞固形物を集め、次いで物理
的または化学的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残
骸を除去し、可溶性生長ホルモンを単離精製する。ヒト
生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれかの方
法により、またはそれらを組み合わせることによって精
製することができる。(１)ポリエチレンイミン分別法、
(２)セファクリル(Ｓephacryl)Ｓ−２００によるゲル濾
過クロマトグラフィー、(３)ビオレックス(Ｂiorex)−
７０レジンまたはＣＭセファデックスによるイオン交換
クロマトグラフィー、(４)硫酸アンモニウムおよび／ま
たはpＨ分別法、および(５)ハイブリドーマス(hybridom
as)または免疫感作動物から単離した抗−ＨＧＨ ＩgＧ
から調製した抗体レジンを用いたアフィニィティークロ
マトグラフィー;このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
るかあるいはブロスから細胞固形物を集め、次いで物理
的または化学的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残
骸を除去し、可溶性生長ホルモンを単離精製する。ヒト
生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれかの方
法により、またはそれらを組み合わせることによって精
製することができる。(１)ポリエチレンイミン分別法、
(２)セファクリル(Ｓephacryl)Ｓ−２００によるゲル濾
過クロマトグラフィー、(３)ビオレックス(Ｂiorex)−
７０レジンまたはＣＭセファデックスによるイオン交換
クロマトグラフィー、(４)硫酸アンモニウムおよび／ま
たはpＨ分別法、および(５)ハイブリドーマス(hybridom
as)または免疫感作動物から単離した抗−ＨＧＨ ＩgＧ
から調製した抗体レジンを用いたアフィニィティークロ
マトグラフィー;このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
【図１】 ＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードす
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の前半部分の模式
図。
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の前半部分の模式
図。
【図２】 ＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードす
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の後半部分の模式
図。
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の後半部分の模式
図。
【図３】 合成遺伝子のプラスミッドへの挿入工程の前
半部分を示す模式図。
半部分を示す模式図。
【図４】 合成遺伝子のプラスミッドへの挿入工程の後
半部分を示す模式図。
半部分を示す模式図。
【図５】 ＨＧＨをコードしているmＲＮＡ転写体のＤ
ＮＡ配列の前半部分を示す模式図。
ＮＡ配列の前半部分を示す模式図。
【図６】 ＨＧＨをコードしているmＲＮＡ転写体のＤ
ＮＡ配列の後半部分を示す模式図。
ＮＡ配列の後半部分を示す模式図。
【図７】 mＲＮＡ転写体のプラスミッドへの挿入工程
の前半部分を示す模式図。
の前半部分を示す模式図。
【図８】 mＲＮＡ転写体のプラスミッドへの挿入工程
の後半部分を示す模式図。
の後半部分を示す模式図。
【図９】 ＨＧＨを発現し得るプラスミッドの作製工程
の前半部分を示す模式図。
の前半部分を示す模式図。
【図１０】 ＨＧＨを発現し得るプラスミッドの作製工
程の後半部分を示す模式図。
程の後半部分を示す模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/36 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 細菌以外の微生物によりポリペプチドを
製造する方法であって、（ａ）特定の所望のポリペプチ
ドをコードしている、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡの両者
から誘導されたＤＮＡからなるＤＮＡ配列を該微生物中
で発現し得る複製可能なクローニング媒体で該微生物を
形質転換し、（ｂ）得られた形質転換微生物を、旺盛な
増殖を維持するに必要な適当な栄養培地中、通気、撹拌
下で培養し、（ｃ）生産されたポリペプチドを培養混合
物から分離することからなる方法。 - 【請求項２】 合成ＤＮＡ部分が特異的に開裂し得るア
ミノ酸配列を更にコードしており、この配列により細胞
外で開裂させて特定の所望のポリペプチドを生産するこ
とができる請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 特定の所望のポリペプチドがヒト成長ホ
ルモンである請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 特定の所望のポリペプチドがヒト成長ホ
ルモンである請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 ヒト成長ホルモンがそのリーダー配列ま
たはその他の異質蛋白質を伴なわずに発現される請求項
３に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US055126 | 1979-07-05 | ||
| US06/055,126 US4342832A (en) | 1979-07-05 | 1979-07-05 | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1099888A Division JPH0648987B2 (ja) | 1979-07-05 | 1989-04-18 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242881A true JPH08242881A (ja) | 1996-09-24 |
Family
ID=26733870
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55092161A Expired - Lifetime JPH0612996B2 (ja) | 1979-07-05 | 1980-07-04 | 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法 |
| JP1099888A Expired - Lifetime JPH0648987B2 (ja) | 1979-07-05 | 1989-04-18 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
| JP4256344A Expired - Lifetime JP2622479B2 (ja) | 1979-07-05 | 1992-09-25 | ヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細菌プラスミド |
| JP7310696A Pending JPH08242881A (ja) | 1979-07-05 | 1995-11-29 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55092161A Expired - Lifetime JPH0612996B2 (ja) | 1979-07-05 | 1980-07-04 | 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法 |
| JP1099888A Expired - Lifetime JPH0648987B2 (ja) | 1979-07-05 | 1989-04-18 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
| JP4256344A Expired - Lifetime JP2622479B2 (ja) | 1979-07-05 | 1992-09-25 | ヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細菌プラスミド |
Country Status (42)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US4342832A (ja) |
| EP (1) | EP0022242B1 (ja) |
| JP (4) | JPH0612996B2 (ja) |
| KR (2) | KR830003574A (ja) |
| AR (1) | AR244341A1 (ja) |
| AT (1) | ATE82324T1 (ja) |
| AU (2) | AU533697B2 (ja) |
| BE (1) | BE884012A (ja) |
| BG (1) | BG41135A3 (ja) |
| BR (1) | BR8008736A (ja) |
| CA (2) | CA1164375A (ja) |
| CH (1) | CH661939A5 (ja) |
| CS (3) | CS250652B2 (ja) |
| DD (3) | DD210071A5 (ja) |
| DE (3) | DE3050722C2 (ja) |
| DK (2) | DK173503B1 (ja) |
| EG (1) | EG14819A (ja) |
| ES (2) | ES493149A0 (ja) |
| FI (2) | FI802030A (ja) |
| FR (2) | FR2460330B1 (ja) |
| GB (2) | GB2055382B (ja) |
| GR (1) | GR69320B (ja) |
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| KE (3) | KE3450A (ja) |
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| NL (1) | NL930114I2 (ja) |
| NO (2) | NO167673C (ja) |
| NZ (2) | NZ201312A (ja) |
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| ZW (1) | ZW14180A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4898830A (en) * | 1979-07-05 | 1990-02-06 | Genentech, Inc. | Human growth hormone DNA |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US6455275B1 (en) | 1980-02-25 | 2002-09-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| US4711843A (en) * | 1980-12-31 | 1987-12-08 | Cetus Corporation | Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| US4370417A (en) * | 1980-04-03 | 1983-01-25 | Abbott Laboratories | Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator |
| US6610830B1 (en) | 1980-07-01 | 2003-08-26 | Hoffman-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferons |
| IE53166B1 (en) * | 1980-08-05 | 1988-08-03 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression |
| US7101981B1 (en) | 1980-08-26 | 2006-09-05 | Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli |
| US4725549A (en) * | 1980-09-22 | 1988-02-16 | The Regents Of The University Of California | Human and rat prolactin and preprolactin cloned genes |
| NZ198445A (en) * | 1980-09-25 | 1984-05-31 | Genentech Inc | Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology |
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| JPS57181098A (en) * | 1981-04-30 | 1982-11-08 | Japan Found Cancer | Novel recombinant dna |
| US4801685A (en) * | 1981-08-14 | 1989-01-31 | Hoffmann-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L |
| US4810645A (en) * | 1981-08-14 | 1989-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L |
| US5254463A (en) * | 1981-09-18 | 1993-10-19 | Genentech, Inc. | Method for expression of bovine growth hormone |
| US4880910A (en) * | 1981-09-18 | 1989-11-14 | Genentech, Inc. | Terminal methionyl bovine growth hormone and its use |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| US5236831A (en) * | 1981-12-29 | 1993-08-17 | Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| US4665160A (en) * | 1982-03-22 | 1987-05-12 | Genentech, Inc. | Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome |
| US4652639A (en) * | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| GB2121054B (en) * | 1982-05-25 | 1986-02-26 | Lilly Co Eli | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| US4778759A (en) * | 1982-07-09 | 1988-10-18 | Boyce, Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Genetic engineering in cyanobacteria |
| US4891315A (en) * | 1982-10-25 | 1990-01-02 | American Cyanamid Company | Production of herpes simplex viral porteins |
| WO1984000775A1 (en) * | 1982-08-10 | 1984-03-01 | Univ Columbia | The use of eucaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials |
| US4530904A (en) * | 1982-09-03 | 1985-07-23 | Eli Lilly And Company | Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria |
| CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
| WO1984001150A1 (en) * | 1982-09-16 | 1984-03-29 | Amgen | Avian growth hormones |
| US4666839A (en) * | 1982-12-01 | 1987-05-19 | Amgen | Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin |
| JPS59106297A (ja) * | 1982-12-07 | 1984-06-19 | Rikagaku Kenkyusho | ヒト生長ホルモンのカルボキシ末端遺伝子の合成法 |
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| US5618697A (en) * | 1982-12-10 | 1997-04-08 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing a desired protein |
| US4634678A (en) * | 1982-12-13 | 1987-01-06 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms |
| GB8303383D0 (en) * | 1983-02-08 | 1983-03-16 | Biogen Nv | Sequences recombinant dna molecules |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| US4859600A (en) * | 1983-04-25 | 1989-08-22 | Genentech, Inc. | Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone |
| IL71991A (en) | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US5242798A (en) * | 1983-07-21 | 1993-09-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same |
| US4900811A (en) * | 1983-07-21 | 1990-02-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same |
| JPS60137291A (ja) * | 1983-12-26 | 1985-07-20 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現ベクター |
| CA1213537A (en) * | 1984-05-01 | 1986-11-04 | Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee | Polypeptide expression method |
| CA1272144A (en) * | 1984-06-29 | 1990-07-31 | Tamio Mizukami | Fish growth hormone polypeptide |
| US5489529A (en) * | 1984-07-19 | 1996-02-06 | De Boer; Herman A. | DNA for expression of bovine growth hormone |
| WO1986002068A1 (en) * | 1984-09-26 | 1986-04-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Mutual separation of proteins |
| US4680262A (en) * | 1984-10-05 | 1987-07-14 | Genentech, Inc. | Periplasmic protein recovery |
| ATE78515T1 (de) * | 1984-10-05 | 1992-08-15 | Genentech Inc | Dna, zellkulturen und verfahren zur sekretion von heterologen proteinen und periplasmische proteinrueckgewinnung. |
| NZ213759A (en) * | 1984-10-19 | 1989-01-27 | Genentech Inc | Lhrh-ctp protein conjugates influencing prolactin fsh and lh release |
| US4645829A (en) * | 1984-10-29 | 1987-02-24 | Monsanto Company | Method for separating polypeptides |
| US4652630A (en) * | 1985-02-22 | 1987-03-24 | Monsanto Company | Method of somatotropin naturation |
| US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| DK151585D0 (da) * | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Nordisk Gentofte | Dna-sekvens |
| DE3683186D1 (de) * | 1985-04-25 | 1992-02-13 | Hoffmann La Roche | Rekombinantes humaninterleukin-1. |
| AU6131086A (en) * | 1985-07-05 | 1987-01-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Epithelial cells expressing foreign genetic material |
| US5041381A (en) | 1986-07-03 | 1991-08-20 | Schering Corporation | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
| US4892764A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-09 | Loctite Corporation | Fiber/resin composites, and method of making the same |
| US5552528A (en) * | 1986-03-03 | 1996-09-03 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Bovine b-endothelial cell growth factor |
| US5827826A (en) | 1986-03-03 | 1998-10-27 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Compositions of human endothelial cell growth factor |
| EP0245218B1 (en) * | 1986-05-07 | 1993-12-29 | ENIRICERCHE S.p.A. | A plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone |
| EP0252588A3 (en) * | 1986-05-12 | 1989-07-12 | Smithkline Beecham Corporation | Process for the isolation and purification of p. falciparum cs protein expressed in recombinant e. coli, and its use as a vaccine |
| US4806239A (en) * | 1986-11-28 | 1989-02-21 | Envirotech Corporation | Apparatus for shifting filter plates in a filter press |
| JPS63159244A (ja) * | 1986-12-23 | 1988-07-02 | 三菱マテリアル株式会社 | 二層の押出成形珪酸質―石灰質系成形品の製造方法 |
| WO1988005079A1 (en) * | 1986-12-31 | 1988-07-14 | Lucky, Ltd. | Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene |
| WO1988005082A1 (en) * | 1987-01-07 | 1988-07-14 | Allied Corporation | Microbial production of peptide oligomers |
| US4977089A (en) * | 1987-01-30 | 1990-12-11 | Eli Lilly And Company | Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms |
| WO1988010119A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Genetics Institute, Inc. | Novel thrombolytic proteins |
| FR2624835B2 (fr) * | 1987-08-05 | 1990-09-07 | Hassevelde Roger | Support ergonomique a creme glacee, a cuillere integree, transformable en tout autre objet apres son utilisation premiere |
| US5268267A (en) * | 1987-08-21 | 1993-12-07 | The General Hospital Corporation | Method for diagnosing small cell carcinoma |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| JPH0231042U (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-27 | ||
| US5130422A (en) * | 1988-08-29 | 1992-07-14 | Monsanto Company | Variant somatotropin-encoding DNA |
| ATE154364T1 (de) | 1988-09-02 | 1997-06-15 | Univ Rockefeller | Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip- 2) |
| US5079230A (en) * | 1988-09-12 | 1992-01-07 | Pitman-Moore, Inc. | Stable bioactive somatotropins |
| US5082767A (en) * | 1989-02-27 | 1992-01-21 | Hatfield G Wesley | Codon pair utilization |
| US5075227A (en) * | 1989-03-07 | 1991-12-24 | Zymogenetics, Inc. | Directional cloning |
| US4960301A (en) * | 1989-03-27 | 1990-10-02 | Fry Steven A | Disposable liner for pickup truck beds |
| US5164180A (en) | 1989-05-18 | 1992-11-17 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests |
| US5266477A (en) * | 1990-02-02 | 1993-11-30 | Pitman-Moore, Inc. | Monoclonal antibodies which differentiate between native and modified porcine somatotropins |
| CA2041446A1 (en) | 1990-05-15 | 1991-11-16 | August J. Sick | Bacillus thuringiensis genes encoding novel dipteran-active toxins |
| US5849694A (en) * | 1990-07-16 | 1998-12-15 | Synenki; Richard M. | Stable and bioactive modified porcine somatotropin and pharmaceutical compositions thereof |
| US5202119A (en) * | 1991-06-28 | 1993-04-13 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response |
| US5744139A (en) * | 1991-06-28 | 1998-04-28 | University Of Tennessee Research Corporation | Insulin-like growth factor I (IGF-1) induced improvement of depressed T4/T8 ratios |
| HUT67319A (en) * | 1991-08-30 | 1995-03-28 | Life Medical Sciences Inc | Compositions for treating wounds |
| US5591709A (en) * | 1991-08-30 | 1997-01-07 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for treating wounds |
| US5317012A (en) * | 1991-10-04 | 1994-05-31 | The University Of Tennessee Research Corporation | Human growth hormone induced improvement in depressed T4/T8 ratio |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| WO1994008611A1 (en) * | 1992-10-22 | 1994-04-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | GROWTH HORMONE FRAGMENT hGH 108-129 |
| JPH08508640A (ja) | 1993-03-10 | 1996-09-17 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | ヒト脳ホスホジエステラーゼ |
| FR2738842B1 (fr) * | 1995-09-15 | 1997-10-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique |
| GB9526733D0 (en) * | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| US5760187A (en) * | 1996-02-22 | 1998-06-02 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Purification process of a human growth hormone |
| JP3794748B2 (ja) * | 1996-03-04 | 2006-07-12 | 第一アスビオファーマ株式会社 | メタノール代謝系を有する微生物の培養法 |
| WO1998007830A2 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | The Institute For Genomic Research | COMPLETE GENOME SEQUENCE OF THE METHANOGENIC ARCHAEON, $i(METHANOCOCCUS JANNASCHII) |
| MX9605082A (es) * | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| WO1998019689A1 (en) * | 1996-11-01 | 1998-05-14 | Smithkline Beecham Corporation | Novel coding sequences |
| US6068991A (en) * | 1997-12-16 | 2000-05-30 | Bristol-Myers Squibb Company | High expression Escherichia coli expression vector |
| BR9814294B1 (pt) | 1997-12-18 | 2011-10-18 | polipeptìdeo cry3bb de b, thuringiensis modificado, composição compreendendo o mesmo, processo para a produção da referida composição, polinucleotìdeo, vetor, vìrus, microorganismo transgênico e métodos para matar e controlar uma população de insetos coleópteros e para preparar uma planta transgênica resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a ataque por insetos coleópteros. | |
| US6087128A (en) | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
| DK1066328T3 (da) | 1998-03-31 | 2009-02-09 | Tonghua Gantech Biotechnology | Kimært protein, der indeholder en intramolekylær chaperon-lignende sekvens, og dets anvendelse til insulinproduktion |
| US6271444B1 (en) | 1998-07-10 | 2001-08-07 | Calgene Llc | Enhancer elements for increased translation in plant plastids |
| US6512162B2 (en) | 1998-07-10 | 2003-01-28 | Calgene Llc | Expression of eukaryotic peptides in plant plastids |
| DE19940749A1 (de) | 1998-08-28 | 2000-05-18 | Febit Ferrarius Biotech Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren |
| ATE456652T1 (de) * | 1999-02-19 | 2010-02-15 | Febit Holding Gmbh | Verfahren zur herstellung von polymeren |
| US6946265B1 (en) | 1999-05-12 | 2005-09-20 | Xencor, Inc. | Nucleic acids and proteins with growth hormone activity |
| US6187750B1 (en) | 1999-08-25 | 2001-02-13 | Everyoung Technologies, Inc. | Method of hormone treatment for patients with symptoms consistent with multiple sclerosis |
| AT408721B (de) | 1999-10-01 | 2002-02-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend ein antigen |
| GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
| US6562790B2 (en) | 2000-02-05 | 2003-05-13 | Chein Edmund Y M | Hormone therapy methods and hormone products for abating coronary artery blockage |
| CA2747325A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6995246B1 (en) * | 2000-10-19 | 2006-02-07 | Akzo Nobel N.V. | Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions |
| DE60136958D1 (de) | 2000-12-01 | 2009-01-22 | Takeda Pharmaceutical | Verfahren zur herstellung einer zubereitung mit einer bioaktiven substanz |
| WO2002046435A2 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Engineered plasmids and their use for in situ production of genes |
| US20020164712A1 (en) * | 2000-12-11 | 2002-11-07 | Tonghua Gantech Biotechnology Ltd. | Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence |
| US20030143191A1 (en) * | 2001-05-25 | 2003-07-31 | Adam Bell | Chemokine beta-1 fusion proteins |
| US6720538B2 (en) * | 2001-06-18 | 2004-04-13 | Homedics, Inc. | Thermostat variation compensating knob |
| DK1578771T3 (da) | 2001-10-10 | 2013-06-10 | Novo Nordisk As | Remodellering og glycokonjugering af peptider |
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| EP1463752A4 (en) | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
| ES2425738T3 (es) | 2001-12-21 | 2013-10-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de la albúmina |
| CA2498319A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| PA8588901A1 (es) * | 2002-11-20 | 2005-02-04 | Pharmacia Corp | Conjugados de hormona de crecimiento humana pegilados n-terminales y proceso para su preparacion |
| CA2512052C (en) | 2002-12-31 | 2016-06-21 | Altus Pharmaceuticals Inc. | Human growth hormone crystals and methods for preparing them |
| EP1594530A4 (en) | 2003-01-22 | 2006-10-11 | Human Genome Sciences Inc | HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN |
| JP2006517995A (ja) * | 2003-02-19 | 2006-08-03 | ファルマシア・コーポレーション | 活性化されたポリエチレングリコールエステル類 |
| CA2524623A1 (en) * | 2003-05-09 | 2004-11-18 | Pharmexa A/S | Immunogenic human tnf alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation |
| US8778880B2 (en) * | 2004-02-02 | 2014-07-15 | Ambrx, Inc. | Human growth hormone modified at position 35 |
| ATE502957T1 (de) * | 2004-06-23 | 2011-04-15 | Usv Ltd | Chimeres, von den placenta- und hypophysenisoformen abgeleitetes humanes wachstumshormon und verfahren zur gewinnung der chimere |
| US20060024288A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Pfizer Inc. | tRNA synthetase fragments |
| US8282921B2 (en) * | 2004-08-02 | 2012-10-09 | Paul Glidden | tRNA synthetase fragments |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| SG161210A1 (en) * | 2004-12-22 | 2010-05-27 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| AU2005322019B2 (en) | 2004-12-22 | 2010-08-26 | Ambrx, Inc. | Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid |
| KR20070090023A (ko) * | 2004-12-22 | 2007-09-04 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형 인간 성장 호르몬 |
| WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| WO2006135915A2 (en) | 2005-06-13 | 2006-12-21 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating degenerative bone disorders |
| WO2007005995A2 (en) * | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Emisphere Technologies, Inc. | Compositions for buccal delivery of human growth hormone |
| WO2007019646A1 (en) * | 2005-08-19 | 2007-02-22 | University Of Technology, Sydney | Liver-directed gene therapy |
| WO2007059312A2 (en) | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Ambrx, Inc. | Methods and compositions comprising non-natural amino acids |
| AU2006330833A1 (en) * | 2005-12-23 | 2007-07-05 | Altus Pharmaceuticals Inc. | Compositions comprising polycation-complexed protein crystals and methods of treatment using them |
| DE102006039479A1 (de) | 2006-08-23 | 2008-03-06 | Febit Biotech Gmbh | Programmierbare Oligonukleotidsynthese |
| DK2486916T3 (en) | 2006-12-18 | 2015-06-15 | Ajinomoto Althea Inc | Formulations of Human Growth Hormone |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| JP2010524508A (ja) * | 2007-04-27 | 2010-07-22 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 可溶性組換え二十面体ウイルス様粒子の生産及びインビボ組織化の改善 |
| JP2010525812A (ja) | 2007-05-02 | 2010-07-29 | メリアル リミテッド | 発現及び安定性が改善されたｄｎａプラスミド |
| WO2009012502A1 (en) * | 2007-07-19 | 2009-01-22 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Self- anchoring mems intrafascicular neural electrode |
| US7939447B2 (en) * | 2007-10-26 | 2011-05-10 | Asm America, Inc. | Inhibitors for selective deposition of silicon containing films |
| NZ620606A (en) | 2008-02-08 | 2015-08-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| SI2279007T1 (sl) | 2008-04-29 | 2016-09-30 | Ascendis Pharma Growth Disorders Division A/S | Spojine pegiliranega rekombinantnega humanega rastnega hormona |
| US8647857B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-02-11 | Gradalis, Inc. | Processes for the digestion of colanic acid |
| ES2445403T3 (es) * | 2008-06-25 | 2014-03-03 | Braasch Biotech Llc | Proteína de fusión de somatostatina deficiente en cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el uso de ésta en ganado vacuno vacuno |
| NZ590010A (en) * | 2008-06-25 | 2013-01-25 | Braasch Biotech Llc | Compositions and methods treating growth hormone deficiency and/or an insulin-like growth factor 1 deficiency with somatostatin and an adjuvant |
| US8703717B2 (en) * | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| LT2393828T (lt) | 2009-02-03 | 2017-01-25 | Amunix Operating Inc. | Prailginti rekombinantiniai polipeptidai ir juos apimančios kompozicijos |
| US9238878B2 (en) | 2009-02-17 | 2016-01-19 | Redwood Bioscience, Inc. | Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use |
| WO2010094772A1 (en) | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Febit Holding Gmbh | Synthesis of sequence-verified nucleic acids |
| US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| CA2772051C (en) | 2009-08-24 | 2020-08-18 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same |
| CA2784793A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-07-21 | Ambrx, Inc. | Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses |
| SG181769A1 (en) | 2009-12-21 | 2012-07-30 | Ambrx Inc | Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses |
| WO2011103325A1 (en) | 2010-02-17 | 2011-08-25 | Elona Biotechnologies | Methods for preparing human growth hormone |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
| CN103415621A (zh) | 2011-01-14 | 2013-11-27 | 雷德伍德生物科技股份有限公司 | 醛标记免疫球蛋白多肽及其使用方法 |
| RU2473556C1 (ru) * | 2011-07-14 | 2013-01-27 | Закрытое акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" | Промышленный способ получения и очистки рекомбинантного гормона роста человека из телец включения |
| CA2863964C (en) | 2012-02-07 | 2021-10-26 | Global Bio Therapeutics Usa, Inc. | Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof |
| KR102008190B1 (ko) | 2012-02-15 | 2019-08-07 | 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. | 재조합 인자 viii 단백질 |
| ES2935489T3 (es) | 2012-02-15 | 2023-03-07 | Bioverativ Therapeutics Inc | Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas |
| JP2015519879A (ja) | 2012-03-26 | 2015-07-16 | プロニュートリア・インコーポレイテッドＰｒｏｎｕｔｒｉａ， Ｉｎｃ． | 荷電栄養タンパク質および方法 |
| JP2015518470A (ja) | 2012-03-26 | 2015-07-02 | プロニュートリア・インコーポレイテッドＰｒｏｎｕｔｒｉａ， Ｉｎｃ． | 栄養タンパク質および方法 |
| WO2013148325A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Pronutria, Inc. | Nutritive fragments, proteins and methods |
| CN104364259A (zh) | 2012-03-26 | 2015-02-18 | 普罗努塔利亚公司 | 营养性片段、蛋白质和方法 |
| US9457096B2 (en) | 2012-07-06 | 2016-10-04 | Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Concet) | Protozoan variant-specific surface proteins (VSP) as carriers for oral drug delivery |
| EP3030163B1 (en) | 2013-08-08 | 2019-03-20 | Global Bio Therapeutics, Inc. | Clamp device for minimally invasive procedures |
| US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
| RU2016110842A (ru) | 2013-09-25 | 2017-10-30 | Пронутриа Биосайенсис, Инк. | Композиции и составы для предотвращения и уменьшения опухолеобразования, пролиферации и инвазии раковых клеток, и способы их получения и применения при лечении раковых заболеваний |
| EA201890423A1 (ru) | 2015-08-03 | 2018-07-31 | Биовератив Терапьютикс Инк. | Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения |
| CN109071634A (zh) | 2016-04-26 | 2018-12-21 | R.P.谢勒技术有限责任公司 | 抗体偶联物及其制备和使用方法 |
| KR20210024082A (ko) | 2018-06-25 | 2021-03-04 | 제이씨알 파마 가부시키가이샤 | 단백질 함유 수성 액제 |
| CN109486847B (zh) * | 2018-12-17 | 2021-03-02 | 江南大学 | 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统 |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3853832A (en) * | 1971-04-27 | 1974-12-10 | Harmone Res Foundation | Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it |
| US3853833A (en) * | 1971-04-27 | 1974-12-10 | Hormone Res Foundation | Synthetic human growth-promoting and lactogenic hormones and method of producing same |
| GB1521032A (en) * | 1974-08-08 | 1978-08-09 | Ici Ltd | Biological treatment |
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| NL7607683A (nl) * | 1976-07-12 | 1978-01-16 | Akzo Nv | Werkwijze ter bereiding van nieuwe peptiden en peptide-derivaten en de toepassing hiervan. |
| US4190495A (en) * | 1976-09-27 | 1980-02-26 | Research Corporation | Modified microorganisms and method of preparing and using same |
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| US4363877B1 (en) * | 1977-09-23 | 1998-05-26 | Univ California | Recombinant dna transfer vectors |
| CH630089A5 (de) * | 1977-09-09 | 1982-05-28 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von siliciummodifizierten imidyl-phthalsaeurederivaten. |
| JPS5449837A (en) * | 1977-09-19 | 1979-04-19 | Kobashi Kogyo Kk | Safety apparatus of soil block making machine |
| ZA782933B (en) * | 1977-09-23 | 1979-05-30 | Univ California | Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria |
| US4407948A (en) * | 1977-09-23 | 1983-10-04 | The Regents Of The University Of California | Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria |
| US4321365A (en) * | 1977-10-19 | 1982-03-23 | Research Corporation | Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules |
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| IE47889B1 (en) * | 1977-11-08 | 1984-07-11 | Genentech Inc | Synthetic dna and process tehrefor |
| BR7807288A (pt) * | 1977-11-08 | 1979-06-12 | Genentech Inc | Processo para sintese de polinucleotidos |
| GR72861B (ja) | 1977-11-08 | 1983-12-13 | Genentech Inc | |
| GB2007676B (en) * | 1977-11-08 | 1982-09-08 | Genentech Inc | Method and means for microbial polypeptide expression |
| US4356270A (en) * | 1977-11-08 | 1982-10-26 | Genentech, Inc. | Recombinant DNA cloning vehicle |
| US4652525A (en) * | 1978-04-19 | 1987-03-24 | The Regents Of The University Of California | Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes |
| US4565785A (en) * | 1978-06-08 | 1986-01-21 | The President And Fellows Of Harvard College | Recombinant DNA molecule |
| US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| FI792481A (fi) * | 1978-08-11 | 1980-02-12 | Univ California | Syntes av enkaroytiskt protein genom anvaendning av mikro-organismer |
| EP0009930B2 (en) * | 1978-10-10 | 1988-08-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Recombinant dna, method for preparing it and production of foreign proteins by unicellular hosts containing it |
| US4332892A (en) * | 1979-01-15 | 1982-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| US4898830A (en) * | 1979-07-05 | 1990-02-06 | Genentech, Inc. | Human growth hormone DNA |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| GR70279B (ja) * | 1979-09-12 | 1982-09-03 | Univ California | |
| IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| GR79124B (ja) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| US4859600A (en) * | 1983-04-25 | 1989-08-22 | Genentech, Inc. | Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone |
| CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
-
1979
- 1979-07-05 US US06/055,126 patent/US4342832A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
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-
1983
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-
1984
- 1984-04-09 CS CS842708A patent/CS254973B2/cs unknown
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-
1985
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-
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