CS250655B2 - Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration - Google Patents

Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration Download PDF

Info

Publication number
CS250655B2
CS250655B2 CS823457A CS345782A CS250655B2 CS 250655 B2 CS250655 B2 CS 250655B2 CS 823457 A CS823457 A CS 823457A CS 345782 A CS345782 A CS 345782A CS 250655 B2 CS250655 B2 CS 250655B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
fragment
polypeptide
growth hormone
cloning
human growth
Prior art date
Application number
CS823457A
Other languages
English (en)
Inventor
David V Goeddel
Herbert L Heyneker
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26733870&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CS250655(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Priority to CS823457A priority Critical patent/CS250655B2/cs
Publication of CS250655B2 publication Critical patent/CS250655B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká exprese genů v mikroorganismech.
Genetická exprese
Desoxyribonukleová kyselina obsahuje kód pro bílkovinu, to znamená tak zvaný strukturální gen a současně řídicí oblasti, které zprostředkovávají expresi této informace tak, že vznikají místa pro vazbu RNA polymerázy, místa pro vazbu ribosomů a podobně. Dochází k expresi bílkoviny z odpovídajícího DNA v průběhu několikastupňového postupu, který je možno popsat následujícím způsobem:
1. Enzym RNA-polymeráza se aktivuje v řídicí oblasti a pohybuje se podél strukturálního genu, čímž dochází k transkripci kódované informace do ribonukleové kyseliny (mRNA) tak dlouho, až dojde ke konci transkripce na podkladě zvláštních kodonů, které ji zastavují. Řídicí oblast tohoto typu je také nazývána promotor.
2. Informace mRNA se přenese ribosomem do bílkoviny, pro jejíž ' sled aminokyselin je kódem uvedený gen, k translaci dochází k místě signálu pro počátek translace, obvykle ATG („f-methionin“).
V souhlasu s genetickým kódem specifikuje DNA každou aminokyelinu trojicí ne2 boli kodonem tří sousedících nukleotidů, které se volí ze skupiny adenosin, thymidin, cytidin a guanin, zkratkami pro tyto nukleotidy jsou A, T, C nebo G. Tyto nukleotidy jsou zahrnuty v kódovém sledu DNA s dvojitým řetězcem, druhý, komplementární řetězec je tvořen bázemi, které jsou vázány vodíkovým můstkem ke komplementární bázi v kódovacím řetězci. A je komplementem pro T, C je komplementem pro G. Podrobně jsou tyto skutečnosti popsány například v publikaci Benjamin ' Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) a 3 (1977), John Wiley and Sons., N. Y.
Štěpení a vazba DNA
Pro rekombinaci DNA je možno užít řadu způsobů, podle nichž je možno zvláštním způsobem upravit jednotlivá zakončení fragmentů DNA, tak, aby vazba byla snadnější. Jde zejména o tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi sousedními nukleotidy, nejčastěji působením enzymu T4 DNA ligázy. Tímto způsobem je možno přímo vázat jednotlivá zakončení. Je také možno postupovat tak, že fragmenty, které obsahují komplementární jednotlivé řetězce je možno doplnit. Toto doplnění je možno provést vazbou nukleotidů působením enzymu,
obecně nazývaného terminální transferáza nebo tak, že se odštěpí část zakončení enzymem — exonukleázou.
Nejčastěji se však užívá restrikční endonukleázy, která štěpí fosfodiesterovou vazbu tak, že vzniká fragment 4 až 6 párů bází. Štěpení je prováděno na zcela zvláštních místech, v nichž může ke štěpení dojít. Je známa řada restrikčních enzymů i místa jejich působení jak bylo popsáno například v publikaci R. J. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Působením celé řady restrikčních endonukleáz vznikají krátké komplementární úseky s jednoduchým řetězcem na konci dvojitých fragmentů. Tyto fragmenty je pak možno vzájemně vázat.
V případě, že se štěpí uvedeným enzymem dvě molekuly různého typu, vzniká nová molekula DNA, které je možno dodat integritu působením enzymu ligázy, čímž dojde ke spojení jednoduchých zakončení. Tímto způsobem je možno užít restrikčních enzymů ke štěpení DNA s dvojitým řetězcem s následnou rekombinací například působením T4 ligázy s jiným řetězcem.
Klonování s rekombinantní DNA
Prostředkem pro klonování je dvojitá DNA nechromozomální povahy, která obsahuje neporušený replikon, takže může dojít k replikaci při včlenění do jednobuněčného organismu, například mikroorganismu jeho transformací. Takový organismus se pak často nazývá transformantem. Prostředky pro klonování jsou obvykle odvozeny z virů a bakterií, nejčastěji jde o DNA bakteriálního původu s dvojitým řetězcem, čili o plasmidy.
Na základě pokroku v biochemii v posledních letech bylo možno sestrojit prostředky pro klonování například takové rekombinantní prostředky, které obsahují DNA exogenního původu.
V některých případech . může rekombinační DNA obsahovat heterologní DNA, to jest DNA, která je kódem pro polypeptidy, které se obvykle v organismu, který je transformován prostředkem pro klonování neprodukují. Postupuje se tak, že se plasmidy štěpí restrikčním enzymem, čímž se získá lineární DNA se zakončeními, schopnými vazby. Tato zakončení se váží na exogenní gen se zakončeními, schopnými vazby, čímž vzniká biologická funkční skupina s neporušeným replikonem a s fenotypickou vlastností, kterou je možno. použít při selekci transformantů. Rekombinační skupina se pak včlení do mikroorganismu transformací a transformant se' izoluje a klonuje, čímž je možno získat množství organismů, které obsahují kopii exogenního genu a ve zvláštních případech může dojít k expresi bílkoviny, pro níž je gen kódem. Postupy pro tento případ a potenciální použití jsou shrnuty v publikaci Miles International Symposium Series 10; Recombinant Molecules: Impact on Science and Society,
Beers and Bosseff, eds., Raven Press, N. Y.
(1977).
Exprese rekombinantní DNA
Kromě použití prostředků pro klonování ke zvýšení množství genů replikací byly také prováděny pokusy k expresi bílkoviny, pro níž je uvedený gen kódem. V. některých případech byly tyto pokusy úspěšné. Prvním případem byla exprese genu pro hormon somatostatin působením lac promotoru v Escherichia coli, jak bylo popsáno v publikaci K. Itakura a další, Science 198, 1 056 (1977). V poslední době se podařilo dosáhnout exprese řetězce A a B lidského inzulínu stejným způsobem a tyto řetězce vázat na výsledný hormon, jak bylo popsáno v publikaci D. V. Goeddel a další, Proč. Nat‘1. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979).
V každém z těchto případů byly geny získány v úplném stavu syntézou a v každém z těchto případů bylo užito různých enzymů a současně bylo nutno chránit produkt proti působení proteolytických enzymů, které by způsobily degradaci požadovaného produktu. Bylo tedy nutno produkt získat v konjugované formě, to znamená spolu s další bílkovinou, která způsobila ochranu proti uvedeným enzymům.
Mimo buňku pak bylo nutno tuto bílkovinu opět odštěpit k získání výsledného produktu. Tyto postupy byly popsány v následujících britských patentech č. 2 0θ7 675, 2 007 670 A, 2 007 676 A a 2 008 123 A.
Syntetický gen bylo možno použít v několika uvedených případech, ke skutečným potížím však dochází, jakmile jde o daleko větší bílkovinné produkty, jako jsou růstový hormon, interferon a podobně, protože geny pro tyto látky jsou daleko komplikovanější a není možno je snadno syntetizovat. Současně by bylo. velmi žádoucí, aby došlo. k expresi těchto látek, zejména bez konjugované bílkoviny, to znamená, že je nutno zvolit vhodný organismus, který by mohl vytvářet požadovaný produkt.
Řada pracovníků se pokoušela dosáhnout exprese genu nikoliv organickou syntézou, avšak reverzní transkripcí z odpovídající mRNA, která byla získána čištěním z tkání. Tento postup je však spojen s dvojím problémem. Reverzní transkriptáza může zastavit transkripci dříve, než je získána sestava cDNA nutná k získání úplného sledu aminokyselin. Villa-Komaroff a další například získali cDNA pro krysí proinzulín bez kodonů pro první tři aminokyseliny prekursoru inzulínu, jak bylo popsáno v publikaci Proč. Naťl. Acad. Sci., USA 75, 3 727 (1978).
Reverzní transkripcí mRNA pro polypeptidy, k jejichž expresi dochází působením prekursoru byla získána cDNA pro prekursor a nikoliv pro biologicky aktivní bílkovinu, která jinak v eukaryotické buňce vzniká, v případě, že se odstraní enzymatickým způsobem řídicí sled. Až dosud nebyla prokázána podobná schopnost pro bakteriální buňku, tak, že transkripty mRNA vedly k expresi produktů, které obsahovaly řídicí sled prekursoru a nikoliv biologicky účinnou bílkovinu jako takovou. Pro krysí proinzulín byl tento postup popsán v svrchu uvedené publikaci Villa-Komaroffa a pro prekursor růstového hormonu krysy byl postup popsán v publikaci P. H. Seeburg a další. Nátuře 276, 795 (1978).
Je tedy možno uzavřít, že až dosud pokusy o expresi lidských hormonů v bakteriích nebo v expresi prekursorů těchto hormonů na podkladě transkripce mRNA vedly náhodně pouze k produkci konjugovaných bílkovin, které bylo někdy obtížné štěpit mimo buňku, jak bylo popsáno pro případ penicllinázy ve svrchu uvedené publikaci Villa-Komaroffa a pro β-laktamázu ve svrchu uvedené publikaci Seeburgové.
Lidský růstový hormon
Lidský růstový hormon („HGH“) je vylučován podvěskem mozkovým čili hypofýzou. Sestává ze 191 aminokyselin a má molekulovou hmotnost 21 500, je tedy třikrát větší než inzulín. Až dosud bylo možno lidský růstový hormon získat pouze velmi pracnou extrakcí z omezeného zdroje, kterým jsou hypofýzy z mrtvol. Nesnadná dostupnost této látky způsobila i omezené použití při léčbě hypofyzárního trpaslictví a nebylo možno pomýšlet n léčbu více než 50 % nejnutnějších případů.
Bylo by tedy zapotřebí navrhnout nová způsoby pro získání HGH a dalších polypeptidů ve větším množství, tato potřeba je zvláště naléhavá v případě polypeptidů, které jsou příliš veliké pro organickou syntézu nebo pro mikrobiální expresi ze syntetických genů. Exprese hormonů savců pomocí transkripce mRNA by mohla pomoci odstranit obtíže, spojené se syntézou, avšak až dosud docházelo pouze k výrobě mikrobiálních biologicky neúčinných konjugátů, z nichž bylo velmi obtížné odštěpit požadovaný hormon.
Předmětem vynálezu je způsob pěstování životaschopné kultury mikroorganismu s obsahem replikovatelného prostředku pro klonování za současné exprese polypeptidů se známým sledem aminokyselin tak, že se gen, který je kódem pro polypeptid včlení do prostředku pro klonování a je řízen promotorem pro expresi, vyznačující se tím, že se reverzní transkripcí z mRNA získá první fragment genu pro expresi produktu, odlišného od uvedeného polypeptidů, přičemž tento fragment obsahuje část sledu, který je kódem pro uvedený polypeptid, první fragment obsahuje kodony, které jsou kódem pro sled aminokyselin, odlišný od sledu v polypeptidů, tento sled se oddělí a získá se sled, který obsahuje část kódu, přičemž tento fragment však je kódem pro produkt, odlišný od uvedeného polypeptidů, načež se provede organická syntéza jednoho nebo většího počtu fragmentů genu, které jsou kódem pro zbytek sledu aminokyselin uvedeného polypeptidů a alespoň jeden z těchto fragmentů je kódem pro koncovou část aminokyselin v uvedeném polypeptidů a syntetický fragment nebo výsledný fragment se spojí v replikaceschopném prostředku při klonování ve správné fázi vzhledem k sobě navzájem zařízení promotoru pro expresi, čímž dochází ke vzniku replikaceschopného prostředku pro klonování, při jehož použití dochází k expresi sledu aminokyselin uvedeného polypeptidů, načež se prostředkem pro klonování transformuje mikroorganismus, který se pěstuje v živném prostředí s obsahem živných látek. Mikrobiální zdroje lidského růstového hormonu poprvé umožňují získání většího množství hormonu k léčbě hypofyzárního trpaslictví a pro další použití, na němž až dosud nebylo možno pomýšlet vzhledem k omezenému množství hormonu.
Jde zejména o difúzní žaludeční krvácení. degeneraci kloubů, léčbu spálenin a jiných ran, různé typy dystrofií a kostní náhrady.
Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy, na nichž jsou znázorněna výhodná provedení způsobu podle vynálezu.
Na obr. 1 je znázorněno schéma pro konstrukci fragmentu genu, který je kódem pro prvních 24 aminokyselin lidského růstového hormonu spolu se signálem pro start ATG a s vaznými místy, jichž se užívá při klenování. Šipka v kódu, čili horním řetězci (U) a komplementárním neboli dolním řetězci (L) označuje oligonukleotidy, které byly spojeny za vzniku znázorněného fragmentu.
Na obr. 2 je znázorněno spojení oligonukleotidů U a L za vzniku fragmentu genu z obr. 1 a jeho včlenění do plasmidu za účelem klonování.
Na obr. 3 je znázorněn sled DNA, a to pouze kódovací řetězec po působení restrikčního enzym” Hae III na transkript mRNA hypofýzy, přičemž jsou číslovány aminokyseliny růstového· hormonu, pro které je tento sled kódem. Jsou také označena místa pro působení restrikčního enzymu, například úsek DNA po kodonu, který zastaví translaci mRNA.
Na obr. 4 je znázorněna konstrukce prostředku pro klonování z fragmentu genu, který je kódem pro aminokyseliny lidského růstového hormonu a konstrukce tohoto fragmentu genu jako komplementární
DNA reverzní transkripcí z mRNA, izolované z hypofýzy.
Na obr. 5 je znázorněna konstrukce plasmidu, který způsobí v bakterii expresi lidského růstového hormonu, a to počínaje plasmidy z obr. 2 a 3.
Obecným postupem vynálezu je kombinace jednoduchého prostředku pro klonování z většího počtu fragmentu genu, které jsou kódem pro expresi požadovaného produktu. Alespoň jeden fragment musí být cDNA-fragment odvozený reverzní trans^ kripcí z mRNA, izolované z tkáně, jak bylo popsáno v publikaci A. Ullrich a další, Science 196, 1 313 (1977). Tato cDNA je podstatnou částí, s výhodou alespoň převážnou částí kodonů pro požadovaný produkt, zbývající část genu je doplněna synteticky. Syntetický fragment a fragment vzniklý transkripcí mRNA se skloňují odděleně, čímž se získá větší množství těchto fragmentů pro příští vzájemnou vazbu.
Celá řada podmínek ovlivňuje rozdělení kodonů pro výsledný produkt mezi syntetickou část a část, získanou transkripcí, jak je popsáno například při získání komplementární DNA v publikaci Maxam a Gilbert, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977). Komplementární DNA, získaná reverzní transkripcí bude vždy obsahovat kodony alespoň pro tu koncovou část požadovaného produktu, která obsahuje karboxyskupinu a další kodony pro mRNA, u níž nedošlo к translaci, a to směrem od signálu pro ukončení translace, který je nejblíže karboxylové skupině. Přítomnost DNA pro RNA, u níž nedošlo к přenosu nemá význam, i když je možno odstranit příliš dlouhé řetězce tohoto typu, například odštěpením restrikčním enzymem., aby bylo možno zachovat buněčné zdroje, užívané při replikaci a expresi DNA požadovaného produktu. Ve zvláštních případech bude cDNA obsahovat kodony pro celý požadovaný sled aminokyselin a další kodony směrem od aminokyseliny požadovaného produktu. Například převážná část polypeptidových hormonů nebo snad všechny tyto hormony se získají z prekursorů, které obsahují řídicí nebo signální sled bílkoviny, tak, jak je na tuto bílkovinu vázán například při průchodu buněčnou membránou. Při expresi z eukaryotických buněk jsou tyto sledy enzymaticky odstraňovány, takže hormon se dostává do periplazmatického prostoru ve své volné, biologicky účinné formě. Není však možno očekávat, že mikrobiální buňky splní tutéž funkci a je tedy žádoucí odstranit uvedené sledy a řídicí sledy z transkriptu mRNA. V tomto případě je však ztracen i signál pro počátek a obvykle také některé kodony pro výsledný produkt. Syntetická složka takto získaného genu tedy doplní tyto ztracené kodony i nový signál pro start, v případě, že prostředek pro přenos hybridního genu nemá signál pro start.
Odstranění řídicího sledu z cDNA prekursoru růstového hormonu je možno provést poměrně výhodným způsobem, protože ten to sled obsahuje místo pro působeení restrikčního hormonu. Způsob podle vynálezu je však možno provádět i v případě, že se takové místo ve sledu nenachází a i bez ohledu na možnost získání takového místa dostatečně blízko aminokyseliny požadovaného polypeptidu, čímž je nutno syntetizovat větší úsek genu, který nelze odvodit od mRNA. To znamená, že v jakémkoliv kódu cDNA pro požadovaný polypeptíd se může objevit i sled, který inaktivuje výsledný produkt, a to na hranici řídicího sledu a sledu pro požadovaný polypeptíd. Je pak možno postupovat tak, že se gen rozdělí ve zvoleném peptidu a odstraní se nežádoucí řídicí sled nebo jiný sled. Je tedy možno štěpit danou cDNA jako:
I I ’ kde konec štěpení je znázorněn šipkou, re akční podmínky pro exonukleázu je možno volit tak, aby byly odstraněny horní sledy a a b, načež SI nukleáza automaticky odstraní spodní sledy c a d. Je také možno postupovat přesněji tak, že se užije DNA polymeráza za přítomnosti desoxynukleotidtrifosfátů [d (A, T, C, G) ТР].
Ve svrchu uvedeném případě tedy DNA polymeráza za přítomnosti dGTP odstraní sled c a zastaví se u G, SI nukleáza pak odštěpí sled a, DNA polymeráza za přítomnosti dTTP odštěpí sled d a zastaví se u T a SI nukleáza pak odštěpí sled b atd. Tento způsob je popsán v publikaci A. Kornberg, DNA Synthesis, str. 87 až 88, W. H. Freeman a Co., San Fancisco (1974).
S výhodou je možno jednoduchým způsobem postupovat tak, že se vytvoří místo pro působení restrikčního enzymu na vhodném místě cDNA, která je kódem pro požadovaný produkt způsobem, uvedeným, v publikaci A. Razin a další, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 75, 4 268 (1978). Tímto způsobem se nahradí jedna nebo větší počet bází v existujícím sledu DNA, přičemž se užije vhodného substituentu. Alespoň sedm úseků o čtyřech párech bází je známo pro známé restrikční enzymy, to jest AGCT (Alu I), CCGG (Нра II), CGCG (The I), GATC (Sau ЗА), GCGC (Hha), GGCC (Нае III), a TCGA (Tag I)·
V případě, že sled cDNA obsahuje sled, který se od místa působení restrikčního en250655 zymu odlišuje jedinou bází, což je statisticky velmi pravděpodobné, je možno tuto bázi nahradit tak, že se získá cDNA, která obsahuje správnou bázi a tedy žádané místo pro působení restrikčního enzymu. Štěpe ním se pak oddělí DNA od nežádoucího řídicího sledu, načež se syntézou nahradí kodony, jichž je zapotřebí k expresi úplného polypeptidu. Postupuje se například následujícím způsobem:
kodony pro požadovaný
produkt |---cDNA
CAGG doplnění místa pro působení restrikčního enzymu l
CCGG syntetický ' sled д
GG
|------- “I částečně syntckodony pro·· požadovaný , tichá DNA produkt
Je samozřejmé, že je možno včlenit v případě potřeby i delší místa pro působení restrikčního enzymu nebo včlenit několik míst nebo postupně vytvořit restrikční místo o čtyřech párech bází i tehdy, kdy sled obsahuje pouze dvě báze.
Může být žádoucí, aby nedošlo pouze k expresi sledu aminokyselin požadovaného produktu, nýbrž současně k ' expresi cizorodé, avšak specificky uspořádané bílkoviny. Jako příklad může · být uvedeno několik možností. Polosyntetický gen může být například heptenem nebo jnou, z imunologického hlediska určující látkou, přičemž k imunologické reakci může dojít při spojení s další bílkovinou, čímž vznikne vakcína. Podobný způsob je popsán například v britském patentu č. 2 008 123A. Může být také žádoucí, aby došlo k expresi požadovaného produktu ve spojení s další, biologicky neúčinnou bílkovinou s následným mimobuněčným odštěpením, této bílkoviny za vzniku účinné formy. Je rovněž možno postupovat tak, aby signální polypeptid předcházel požadovanému produktu, tak, aby bylo možno dosáhnout produkce i průcho du buněčnou membránou, pokud ovšem je signální peptid možno odštěpit. Mimoto je možno užít cizorodého konjugátu, určeného k specifickému odštěpení mimo buňku tak, aby byly chráněny produkty, které by jinak bylv rozloženy endogenními proteázam.i mikrobiální buňky. Alespoň v posledních třech případech je možno k doplnění kódového sledu transkriptu mRNA užít kodonů pro sled aminokyselin, který je specificky odštěpitelný například působením enzym.u. Trypsin nebo· chvmotrypsin, například specificky štěpí vazby arg—arg nebo lys—lvs. iak bylo popsáno v britském patentu č. 2 008 123A.
Z toho, co bylo uvedeno ie zřeimé, že ve svém neiširším významu dovoluje způsob podle vynálezu řadu možností. Je možno postupovat například následujícím způsobem:
— Užije se transkriptu mRNA, který je kódem pro podstatnou část sledu aminokyselin žádaného polypeptidu, avšak při vlastní expresi došlo k produkci odlišného polypeptidu, a to buď o něco menšího, nebo o něco· menšího než požadovaný produkt.
Odstraní se kodony pro sled aminokyselin, který se liší od sledu v požadovaném produktu.
— Organickou syntézou se získají fragmenty, které jsou kódem pro zbývající část požadovaného sledu.
Transkript mRNA a syntetický fragment nebo fragmenty se spojí a včlení do prostředku pro klonování, pro replikaci a expresi požadovaného produktu bez konjugované bílkoviny nebo požadovaného produktu s konjugovanou bílkovinou, která je specificky odštěpitelná z výsledného produktu.
Je samozřejmé, že v každém případě bude produkt začínat aminokyselinou, pro níž ie kódem signál pro start, například v případě ATG jde o f-methionin. Tato část bude patrně uvnitř buňky odstraněna nebo v každém případě neovlivňuje biologickou účinnost výsledného produktu.
Přestože způsob podle vynálezu je obecným způsobem pro výrobu cenných bílkovin včetně protilátek, enzymů a podobně, je zvláště vhodný к dosažení exprese hormonů savců typu polypeptidů a jiných látek s léčebným použitím, jako jsou glukagon, gastrointestinální inhibiční polypeptid, polypeptid ze slinivky břišní, adrenokortikotropní, β-endorfiny, interferon, urokináza, faktory, ovlivňující srážení krve, lidský albumin a podobně.
Vynález bude osvětlen následujícím příkladem, v němž je konstruován polysyntetický gen, který je kódem pro lidský růstový hormon, tento gen je klonován a dochází к jeho mikrobiální expresi.
Příklad
Konstrukce a exprese prostředku pro klonování lidského růstového hormonu
1. Klonování fragmentu po štěpení Нае III, získaného z transkriptu mRNA (obr. 3 a 4)
Polyadenylovaná mRNA pro lidský růstový hormon (HGH) byla připravena z nádorů, produkujících lidský růstový hormon způsobem, který byl popsán v publikaci A. Ullrich a další. Science 196, 1 313 (1977). 1,5 (ug cDNA s dvojitým řetězcem (ds) bylo připraveno z 5 této RNA způsobem, popsaným v publikaci Wickens a další, J. Biol. Chem. 253, 2 483 (1978) s tím rozdílem, že bylo užito RNA polymerázy „Klenowův fragment“, popsané v publikaci H. Klenow, Proč. Naťl. Sci. USA, 65, 168 (1970) místo DNA polymerázy I při syntéze druhého řetězce. Místa pro působení restrikčních endonukleáz v restrikčním enzymu jsou rozložena tak, že místo pro působení Нае III je uloženo v 3‘ nekódovací oblasti a v kódovací oblasti pro aminokyseliny 23 a 24, jak je znázorněno na obr. 3. Při působení Нае III na ds cDNA růstového hor monu poskytuje fragment DNA o 551 párech bází (bp), který je kódem pro aminokyseliny 24 až 191 růstového hormonu. Tímto způsobem bylo zpracováno 90 ng cDNA enzymem Нае II, načež byla provedena elektroforéza na 8% polyakrylamidovém gelu a oblast při 550 bp byla vymyta. Tímto způsobem byl získán přibližně 1 ng cDNA.
Plasmid pBR322 byl připraven způsobem podle publikace 1'. Bolivar a další, Gene 2 (1977) str. 95 až 113 a byl užit jako prostředek pro klonování svrchu uvedené cDNA. Tento plasmid byl plně popsán v publikaci J. G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 (1978), jde o repliknceschopný plasmid, který předává rosistenci proti ampicilimi i proti tetracyklinu vzhledem ke včlenění odpovídajících genů (AP1: a TcR, jak je znázorněno na obr. 4), a který obsahuje místa pro působení restrikčních enzymů Pst I, EcoRI a Hind III, jak je na obr. 4 rovněž znázorněno.
Získají se štěpné produkty působením enzymu Нае III a Pst I. Pak se užije způsobu podle publikace Chang A. C. Y. a další, Nátuře 275, 617 (1978) к doplnění získaných zakončení při štěpení uvedeného plasmidu enzymem Pst I a po působení enzymu Нае III na transkript mRNA, fragment cDNA se včlení do plasmidu pBR322 v místě po štěpení enzymem Pst I, takže se získá zpět místo pro štěpení enzymem Hae III v cDNA a dojde к restituci míst pro působení enzymu Pst I (CTGGAÍn na každém konci včleněného sledu.
Bylo tedy užito terminální desoxynukleotidyltransferázy (TdT) к připojení přibližně 20 zbytků dC к 3‘-zakončení, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ghange A. Y. G. 60 ng plasmidu pBR322 po působení enzymu Pst I bylo spojeno s přibližně 10 zbytky dG na 3‘-zakončení. Po spojení ds cDNA se zbytky dC s vektorem. DNA se zbytky dC, které bylo provedeno ve 130 μΐ 10 mmol Tris-HCl o pH 7,5, 100 mmol NaCl, 0,25 mmol EDTA byla směs zahřáta na 70 °C, nechala se zchladnout v průběhu 12 hodin na teplotu 37 °C, pak v průběhu 6 hodin na teplotu 20 °C a pak byl materiál užit к transformaci Elscherichia coli xl 776. Analýza sledu DNA plasmidu pHGH31 klonovaného v xl776 způsobem, popsaným v
259655 publikaci Maxam a Gilbert, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977) potvrdila kodony pro aminokyseliny 24 až 191 růstového hormonu, jak je znázorněno na obr. 3.
Escherichia coli K—12 kmen xl 776 má genotyp F~ tonA53 dapD8 minAl supE42 A40(gal-uvrB) λ = minB2 rfb-2 na 1A25 oms-2 thyA57* metC65 oms-1 A29(bioH-asd) cycB2 cycA! hsdR2. Kmen xl 776 byl potvrzen National Institutes of Health jako EK2 vektor.
Kmen xl 776 potřebuje ke svému růstu kyselinu diaminopimelovou (DAP) a není schopen syntetizovat mukopolysacharid kyselinu kolanovou. Dochází tedy k omezení jeho růstu nebo k jeho eliminaci v prostředí, kde se kyselina diaminopimelová nevyskytuje, avšak prostředí jinak obsahuje dostatečné množství živin pro buněčný metabolismus a růst. Kmen také vyžaduje přítomnost thyminu nebo thymidinu a dochází k rozkladu jeho DNA v případě, že živné prostředí neobsahuje thymin a thymidin, i když obsahuje dostatečné množství živin pro metabolickou účinnost. Kmen xl 776 je velmi citlivý na přítomnost žluči a není schopen přežití v zažívací soustavě krysy. Tento kmen je také nesmírně citlivý na smáčedla, antibiotika a jiná léčiva chemické látky. Není schopen se zotavit po ozáření ultrafialovým světlem a je velmi citlivý na sluneční světlo, daleko citlivější než jiné typy Escherichia coli. Kmen xl 776 je však odolný proti různým fágům, a je velm.i obtížné včlenit různé plasmidy vzhledem k přítomnosti různých mutací. Tento kmen je odolný proti kyselině nalidlxinové, cykloserinu a trimethoprlmu. Tyto látky je tedy možno přidávat k živnému prostředí k řízení růstu tohoto kmene a k jeho ochraně proti kontaminaci jinými kmeny v průběhu transformace.
Kmen xl 776 má generační dobu přibližně 50 minut v živném prostředí L nebo v prostředí Penessay při přidání 100 pg DAP/ /ml a 4 gg thymidinu/ml a dosahuje konečné hustoty 8 až 10 χ 108 buněk/ml ve stacionární fázi. Opatrné míchání a třepání kultury po dobu 1 až 2 minut zajistí rovnoměrnou suspenzi buněk, které si uchovávají 100% životnost. Další podrobnosti, týkající se kmene xl 776 je možno získat v publikaci R. Curtis a další, Molecul-ar Cloning of Recombinant DNA, 99 až 177, Scott a Werner, eds., Academie Press (N. Y. 1977). Kmen xl 776 byl uložen ve sbírce A:m^i'ičan Type Culture Collection ' [3. července 1979, č. ATCC 31 537) a je k dispozici bez omezení.
2. Konstrukce a klonování syntetického fragmentu genu (obr. 1 a 2)
Konstrukce polosyntetického genu pro lidský růstový hormon zahrnuje konstrukci syntetického fragmentu s místem po štěpení restrikční endonukleázou tak, aby ten to fragment mohl být spojen s transkriptem mRNA. Jak je znázorněno na obr. 1, syntetická část genu pro prvních 24 aminokyselin lidského růstového hormonu obsahuje místo pro štěpení enzymem Hae III za aminokyselinou 23. Distální konec syntetického fragmentu je opatřen skupinou, která dovoluje jeho připojení k jednoduchému řetězci, který se získá tak, že se štěpí restrikční endonukleázou plasmid, k němuž bude připojen transkript mRNA spolu se syntetickým fragmentem.
Jak je znázarněno na obr. 1 5‘ zakončení dvojitého fragmentu má zakončení pro působení restrikčních endonukleáz EcoRI a Hind III, aby byla usnadněna konstrukce plasmidu. Kodon pro methionin na levém konci je zároveň místem pro počátek translace. Dvanáct různých oligonukleotidů, obsahující 11 až 16 bází bylo syntetizováno zlepšenou fosfotriesterovou metodou, popsanou v publikaci Cres, R. Proč. Naťl. Acad. Sci. ' USA 75, 5 765 (1978). Tyto oligonukleotidy Ut až Uf a L2 až Lo jsou označeny šipkami.
pg U2 až Ufi a L2 až L6 bylo fosforylováno při použití T4 polynukleotidkináhy a (y33-^f’)ATP známým způsobem, popsaným v publikaci Goeddel D. V. a další, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 76, 106 (1979).
Byly provedeny tři oddělené reakce, katalvzované T4 ligázou. 10 pg 5‘-OH fragmentu Ui bylo spojeno s fosforylovs.ným U2, L5 a LG, fosforylované U3, U4, L3 a L4 byly spojeny a 10 pg 5‘-OH fragmentu Lj bylo spojeno s fosforylovaným L2, U5 a UG. Tyto vazné reakce byly prováděny při teplotě 4 CC po dobu 6 hodin ve 300 pl 20 mmolů Tris-lICl o pH 7,5, mmol MgCl2, 10 mmolů dithiothreitolu, 0,5 mmolu AŤP při použití 100 Jednotek T4 ligázy. Tři reakční směsi pak byly slity, bylo přidáno 100 jednotek T4 ligázy a reakce probíhala 12 hodin při teplotě 20 °C.
Směs byla vysrážena ethanolem. a byla provedena elektroforéza na 10% polyakrylamidovém gelu. Pás, označující fragment s 84 páry bází byl vyjmut z gelu a odděleně vymýván. 1 plasmidu pBR322 byl zpracován působením enzymu Eco RI a Hind III, velký fragment byl izolován elektroforézou na gelu a navázán na syntetickou DNA. Směs byla užita k transformaci Escherichia coli, K—12 kmen 294 (end A, thi, har-, hamk +). Kmen 294 byl uložen 30. října 1978 v Američan Type Culture CoUection (ATCC č. 31 446) a je k dispozici bez omezení. Při analýze sledu způsobem podle svrchu uvedené publikace Maxama a Giiberta na včleněném úseku po působení restrikčních endonukleáz Eco Rl a Hind III na plasmid pHGH3 potvrdila strukturu z obr. 1.
3. Konstrukce plasmidu pro bakteriální expresi lidského růstového hormonu (obr,
5)
Při použití syntetického fragmentu v pHGH3 a mENA transkriptu v pHGH31 byl konstruován replikaceschopný plasmid, který obsahoval oba fragmenty, a to při použití plasmidu pGH6, jak je znázorněno na obr. 5. Tento plasmid, který obsahuje spojené lac promotory byl poprvé konstruován následujícím způsobem. Fragment o 285 párech bází po působení endonukleázy Eco RI s obsahem 95 párů bází UV5 lac promotoru, odděleného 95 páry bází heterolognílio DNA fragmentu byl izolován z plasmidu pKB263 způsobem podle publikace K. Backman a další Cell, sv. 13, 65 až 71 (1978). Fragment o 285 párech bází byl včleněn do místa pro štěpení enzymem Eco RI v plasmidu pBR322 a klon pGHl byl izolován pomocí promotoru, orientovaný správným směrem vzhledem ke genu pro odolnost proti tetracyklinu. Místo pro působení enzymu Eco RI distálně vzhledem к uvedenému genu bylo rozrušeno působením tohoto enzymu a jednoduchý řetězec s tímto zakončením byl izolován pomocí DNA polymerázy 1 s následným spojením vzniklých zakončení. Výsledný plasmid pGH6 obsahuje jediné místo pro působení enzymu Eco RI ve správné poloze vzhledem к promotoru, do tohoto místo je možno vložit úplný gen pro lidský růstový hormon.
К získání syntetického fragmentu pro spojení s transkriptem RNA bylo rozštěpeno 10 tug plasmidu pHGH3 působením enzymů Eco RI а Нае III a fragment o 77 párech bází s obsahem žádaného sledu pro aminokyselinu 1 až 23 lidského růstového hormonu byl izolován na 8% polyakrylamidovém gelu.
/.zg plasmidu pHGH31 bylo pak rozštěpeno enzymem Нае III. Sled lidského růstového hormonu o 551 párech bází a fragment po štěpení plasmidu pBR322 enzymem Пае III o 540 párech bází byly čištěny elektroforézou na gelu. Po štěpení působením enzymu Xma I byl odštěpen pouze sled pro lidský růstový hormon, který oddělil 39 párů bází od oblasti v blízkosti 3‘-zakončení, která nebyla kódem pro tento hormon. Výsledný fragment o 512 párech bází byl oddělen od fragmentu o 540 párech bází, získaného z plasmidu pBR322 štěpením enzymem Нае III elektroforézou na 6% polyakrylamidovém gelu. 0,3 ^g fragmentu o 77 párech bází po štěpení enzymy Eco RI a Нае III bylo polymerováno působením T/{ ligázy v 16 μΐ reakční směsi po dobu 14 hodin při teplotě 4 °C. Směs byla zahřívána na teplotu 70 °C po dobu 5 minut к inaktivaci enzymu a pak byla podrobena působení enzymu Eco RI к odštěpení fragmentů, které byly podrobeny dimerizaci na místech pro působení tohoto enzymu, a působení enzymu Srna I к rozštěpení dimerů v místě působení Srna I, čímž byl získán fragrae ít o 591 párech bází se zakončeními, vzniklými po působení enzymu Eco RI, zakončení po působení enzymu Srna I nebyla schopna se opět vázat. Po čištění na 6% polyakrylamidovém gelu bylo získáno přibližně 30 ng tohoto fragmentu. Je nutno uvést, že plasmid pGH6 neobahuje místo pro působení enzymu Xma I. Na druhé straně místo pro působení enzymu Srna I je totéž jako pro působení enzymu Xma I, avšak rozdělení probíhá uprostřed tohoto místa a vzniklá zakončení nejsou schopna se navzájem opět vázat. To znamená, že fragment po rozštěpení enzymem Srna I, získaný štěpením plasmidu pHGH31 je možno navázat na plasmid pGH6.
Plasmid pGH6, který obsahuje promotory lac UV5 byl postupně zpracováván působením enzymu Hind III, nukleázy SI a Eco RI a byl čištěn elektroforézou na gelu. 50 mg výsledného vektoru, který obsahoval jedno místo pro působení enzymu Eco RI a jedno jeho zakončení bylo vázáno na 10 ng DNA lidského růstového hormonu o 591 párech bází. Tato směs byla užita к transformaci Escherichia coli kmene x.l 776. Kolonie byly izolovány s ohledem na růst na prostředí, které obsahovalo 12,5 pg tetracyklinu/ /ml. Je nutno uvést, že včlenění hybridního genu pro lidský růstový hormon do plasmidu pGH6 zničí promotor pro odolnost proti telracyklinu, avšak svrchu uvedený lac promotor dovoluje správné odečtení strukturálního genu pro odolnost proti tetracyklinu, takže tato vlastnost, umožňující správnou selekci kolonií je zachována. Tímto způsobem bylo získáno přibližně 400 transformantů. Při hybridizaci podle publikace Grunstein - Hogness, Proč. Ňatťl. Acad. Sci. USA, 72, 3 861 (1975) bylo prokázáno 12 kolonií, které obsahovaly sled pro lidský růstový hormon. Plasmidy, izolované ze tří z těchto kolonií měly požadovaná místa pro štěpení enzymem Нае III, Pvu II a Pst I. Byl rovněž stanoven DNA sled pro jeden klon plasmidu pGHG107.
Lidský růstový hormon, к jehož expresi došlo transformanty bylo možno snadno zjistit přímou radioimunologickou zkouškou, která byla provedena na zřeďovacích sériích supernatantů rozrušených buněk při použití zkušební sestavy HGH PRIST (Farmacia).
Aby bylo možno prokázat, že exprese lidského růstového hormonu je řízena lac promotorem byl transformován plasmid pGHG 107 do Escherichia coli kmene Dl 210 [lac + (i°O + zfy+)L· u něhož dochází к nadprodukci lac represoru. Dosažené hladiny exprese lidského růstového hormonu není možno prokázat dříve než po přidání IPTG (isopropylthiogalaktosid).
Odstraněním místa pro působení enzymu
Eco RI v plasmidu pGH107 by byl oddělen
ATG signál pro start v téže vzdálenosti od kodonů, vážících ribosom lac promotoru, jako je tomu v přírodním stavu a současně signál pro start pro /Sz-galaktosidázu. Aby bylo možno zjistit, zda by exprese byla zvýr r η r v 5 sena napodobením tohoto přírodního stavu, byl převeden plasmid pGH107 na plasmid pGH107—1 otevřením působením enzymu Fco Rl a působením SI endonukleázy na výsledné jednoduché řetězce s obnovením kruhu působením , ligázy. Přestože výsledný plasmid bylo možno použít k dosažení exprese lidského růstového hormonu, nebyla tato exprese vyšší než při použití plasmidu pGH107, jak bylo možno prokázat přímen radioimunolngickou zkouškou.
Je zřejmé, že způsob podle vynálezu nemůže být omezen na uvedené výhodné provedení, nýbrž je tímto provedením pouze ilustrován. Je možno užít dalších variaci, a to jak co do volby promotoru, plasmidu, tak do volby výsledného polypeptidu a podobně. Je možno například užít jiné promotory, jako jsou promotor lambda, operou pro arabinózu (plii 80 d ara) nebo kolicin El, galaktózn, alkalickou losfatázu nebo promotor pro tryptofan.
Je možno užít jiné organismy pro expresi, například z čeledi Enterobacteriacoae, například kmeny Escherichia coli a Salmonella, Bacillaceae, například Bacillus subtilis, Pneumococcu.s, Streptococcus a Herno . phílus influenzae. Je samozřejmé, že volba organismu ovlivní . klonování a expresi, která by měla být provedena v souhlase s předpisy, vydanými National Institutes of Helath Guidelines for Recombinant DNA, 43 Fod. Reg. 60 080 (1978).
Způsob podle vynálezu, tak, jak byl popsán ve svrchu uvedeném příkladu na Escherichia coli kmen xl 776 byl prováděn v laboratorním měřítku. Bylo by však možno jej provádět pouze v omezeném průmyslovém měřítku, vzhledem k potenciálnímu biologickému nebezpečí. Jiné mikroorganismy, například Escherichia coli K—12 kmen 294 a Escherichia coli kmen RR1, genotyp Pro~Leu~Thi~RB — recA + Atr’’ Lac y_ by však bylo možno užít ve větším měřítku. Kmen Escherichia coli RR1 je odvozen od Escherichia coli HB101, který byl popsán v publikaci H. W. Boyer a další, J. Mol. Bio. (3969) 41, 459 až 472, spojením s kmenem Escherichia coli K12, kmen KL16 jako donorem Hfr, jak bylo popsáno v publikaci J. H. Miller, Experiments in Motecular Genetics (Cold Sprig Harbor, New York, 1972).
Kultura Escherichia coli RR1 byla ulože na 30. října 1978 v Američan Type Culture Collection pod číslem ATCC 31 343 a je dosažitelná bez omezení. Kultura kmene xl 776 byla uložena v téže sbírce 3. července 1979 pod číslem ATCC 31 537. 3. července 1979 byl rovněž v téže sbírce uložen plasmid pHGH107 pod číslem ATCC 40 011, plasmid pGH6 pod číslem ATCC 40 012, kmen xl 778, transformovaný plasmidem pHGH107 pod číslem ATCC 31 538 a Escherichia coli K12 kmen 294, transformovaný pGFI6 pod číslem ATCC 31 539.
Organismy, které jo možno získat způsobem podle vynálezu, je možno užít při průmyslové fcrinentact k produkci, lidského růstového hormonu., čímž je možno získat množství, kterých až dosud nebylo možno dosáhnout. Transíormant kultur Es<^’h:e?ichia coli je například možno pěstoval ve vodných prostředích v nádobách z nerezové oceli uebo v jiných nádobách, za běžného provzdušiíování a míchání například při teplotě 37 °C a v blízkosti. neutrálního pH, .například při pil 7 -it- 0,3, živné prostředí obsahuje běžné živné složky jako uhlohydráty, gíycerol, zdroje dusíku. jako síran amonný, zdroj draslíku jako fosforečnan amonný, stepové prvky, síran - hořečnatý a. podobně. Transforrnanty obvykle mají vlastnosti, které umožňují jejich selekci, například odolnost proti některým antibiotikům, čímž je možno tyto kmeny oddělit a zamezit růst divokých typů Escherichia coli. Jako příklad je možno uvést, že v případe organismů, o . · dolných proti ampicílinu a tstracyklinu je možno přidat k živnému prostředí uvedená antibiotika k zamezení růstu divokých organismů, které odolné nejsou.
Po skončení fermentace se suspenze bakterií odstředí nebo jinak oddělí a pak.se rozruší fyzikálně nebo chemicky. Buněčná drť se oddělí od supernatantu a rozpustný růstový hormon se izoluje a čistí.
Lidský růstový hormon je možno čistit buď frakcionací polyethyleniminem, nebo gelovou filtrací na gelu SephakryI-S-200, i.ontoměničovou chromatografií na pryskyřici B.iorex-70 nebo CM Sephadex, frakcionací síranem amonným nebo změnou pH a popřípadě chromatografií při použití protilátek proti antiimunoglobinu proti uvedenému hormonu ze senzibil izovaných zvířat nebo hybridů.

Claims (22)

  1. PŘEDMÉT
    1. Způsob pěstování životaschopné kultury mikroorganismu s obsahem replikovatelného prostředku pro klonování za současné exprese polypeptidu se známým sledem aminokyselin tak, že se gen, který je kódem pro polypeptid včlení do prostředku pro klonování a je řízen promotorem pro expresi, vyznačující se tím, že se reverzní transkripcí z mRNA získá první fragment
    VYNÁLEZU genu pro expresi produktu, odlišného od uvedeného polypeptidu, přičemž tento fragment obsahuje část sledu, který je kódem pro uvedený polypeptid, první fragment obsahuje kedony, které jsou kódem pro sled aminokyselin, odlišný od sledu v poL/peptidi..i, tento sled se oddělí a získá se sled, který obsahuje část kódu, přičemž terno frag ment však je kódem pro produkt, odlišný od uvedeného polypeptidu, načež se provede organická syntéza jednoho nebo většího počtu fragmentů genu, které jsou kódem pro zbytek sledu aminokyselin uvedeného polypeptidu a alespoň jeden z těchto fragmentů je kódem pro koncovou část aminokyselin v uvedeném polypeptidu a syntetický fragment nebo výsledný fragment se spojí v replikaceschopném prostředku při klonování ve správné fázi vzhledem k sobě navzájem zařízení promotoru pro expresi, čímž dochází ke vzniku replikaceschopného prostředku pro klonování, při jehož použití dochází k expresi sledu aminokyselin uvedeného polypeptidu, načež se prostředkem pro klonování transformuje mikrorganismus, který se pěstuje v živném, prostředí s obsahem živných látek.
  2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako prostředku pro klonování užije bakteriálního plasmidu. .
  3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že syntetický fragment je kódem pro terminální část polypeptidu, počínaje od aminoskupiny a mimoto je kódem pro expresi specificky odjtěpitelného sledu aminokyselin, přičemž fragmenty se nacházejí ve fázi s kodony, které jsou kódem, pro bílkoviny, takže produkt exprese konjugovaného plasmidu je možno specificky rozštěpit za získání žádaného polypeptidu.
  4. 4. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že sled aminokyselin polypeptidu je schopen exprese i bez použití zevní bílkoviny.
  5. 5. Způsob podle bodu 4, vyznačující se tím, že první fragment obsahuje alespoň většinu sledu, který je kódem pro žádaný polypeptid.
  6. 6. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se syntetický fragment a fragment, který je transkriptem mRNA spojí před včleněním do prostředku pro klonování, opačné konce fragmentu a transkriptu mají jednoduché řetězce, aby bylo možno zajistit vazbu obou, fragmentu ve správném, pořadí, nutném pro expresi požadovaného polypoptidn.
  7. 7. Způsob podle bodu 5, vyznačující se tím, že se jako polypeptidu užije lidského růstového hormonu, první fragment obsahuje kodony, které jsou kódem pro sled aminokyselin, odlišný od sledu v lidském růstovém hormonu a fragment prvního úseku se získá po štěpení restrikčním enzymem Hae III.
  8. 8. Způsob podle bodu 7, vyznačující se tím, že se provádí zpracovávání fragmentu po působení Hae III jiným restrikčním enzymem, čímž dojde k odštěpení kodonů pro mRNA, u níž nedošlo· k translaci a současně vzniká zakončení s jediným řetězcem na jednom konci výsledného fragmentu.
  9. 9. Způsob podle bodu 8, vyznačující se tím, že se jako druhého restrikčního enzymu užije Xma I,
  10. 10. Způsob podle bodu 1 pro expresi lidského růstového organismu v mikrobiálním organismu, přičemž se včleňuje gen, který je kódem pro lidský růstový hormon do prostředku pro klonování zařízení promotoru pro exrpesi, , vyznačující se tím, že se vytvoří první fragment genu, který obsahuje část kódu pro sled lidského růstového hormonu, avšak obsahuje pouze kód pro část sledu aminokyselin lidského růstového hormonu, načež se připraví alespoň jeden další fragment genu, který je kódem pro zbývající část sledu aminokyselin lidského růstového hormonu, a to tak, že alespoň jeden z těchto fragmentů je kódem pro terminální část lidského růstového hormonu, a tyto fragmenty se uloží ve správné vzájemné fázi do replikovatelného prostředku pro klonování za řízení promotoru pro· expresi a za vzniku replikovatelného prostředku pro klonování pro expresi sledu aminokyselin lidského růstového hormonu bez zevní konjugované bílkoviny, a prostředkem pro klonování se transformuje mikroorganismus, který se pěstuje v živném prostředí s obsahem živných látek.
  11. 11. Způsob podle bodu 10, vyznačující se tím, že se volí fragmenty pro podstatnou, část genu pro lidský růstový hormon s obsahem DNA nebo z materiálu po její replikaci.
  12. 12. Způsob podle bodů 2 až 11, vyznačující se tím, že se užije plasmidu, odolného alespoň proti jednomu antibiotiku.
  13. 13. Způsob podle bodu 12, vyznačující se tím, že se užije plasmidu, prostého promotoru pro odolnost proti tetracyklinu, avšak odolného proti tetracyklinu.
  14. 14. Způsob podle bodů 10 nebo 11, vyznačující se tím, že po uložení do plasmidu , je gen pro lidský růstový hormon řízen lac — — promotory.
  15. 15. Způsob podle bodu 14, vyznačující se tím, že se jako plasmidu užije plasmidu pIICHl 07.
  16. 16. Způsob podle bodu 14, vyznačující se Um, že se jako plasmidu užije plasmidu pHCIIÍ.07—1.
  17. 17. Způsob podle bodů 1 až 9, vyznačující se tím, že so kultura mikroorganismu pěstuje ve fermentační nádobě za současného míchání a provzdušňování ve vodném prostředí s obsahem živných látek, při růstu kultury za stálého provzdušňování a míchání se přidávají další živné látky, nutné k udržení prudkého růstu, výsledná buněčná hmota se oddělí od živného prostředí, buňky se rozruší k uvolnění jejich obsahu, buněčná drť se oddělí od supernatantu a polypeptid se ze supernatantu izoluje a čistí.
  18. 18. Způsob podle bodů 10 až 16, pro výrobu lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že se kultura mikroorganismu uloží do, fermentační nádoby, opatřené prostředky pro provzdušňování a míchání do
    2 5 3 β S S vodného fermentačního prostředí s obsahem živných látek, a pak se tato kultura pěstuje za provzdušňování a míchání a současného dodávání dalších živin k udržení prudkého růstu, výsledný buněčný materiál se oddělí od fermentačního prostředí a buňky se rozruší k uvolnění svého obsahu, buněčná drť se izoluje od supernatantu a lidský růstový hormon, obsažený v supernatantu se izoluje a čistí.
  19. 19. Způsob podle bodů 17 a 18, vyznačující se tím, že se užije transformantu Escherichia coli a provádí se selekce k vyloučení růstu divokých kmenů Escherichia coli.
  20. 20. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se mezi funkční geny pro odolnost proti ampicilinu a tetracyklinu uloží systém lac-promotoru, orientovaný k vyvolání exprese ve směru pro gen pro odolnost proti tetracyklinu, načež se směrem od tohoto systému uloží několik specifických míst pro působení restrikčních enzymů za vzniku zakončení různého typu po rozštěpení a za správného včlenění heterologní DNA do těchto míst pod řízením uvedeného systému promotoru, načež se prostředkem pro klonování transformuje mikroorganismus a transformovaný mikroorganismus se pěstuje v živném prostředí s obsahem živných látek.
  21. 21. Způsob podle bodu 20, vyznačující se tím, že se jako prostředku pro klonování užije plasmidu pGH6.
  22. 22. Způsob podle bodů '1 až 16 a 20 až 21 pro výrobu polypeptidu včetně exprese prostředku pro klonování, vyznačující se tím, že prostředek pro klonování obsahuje kód pro aminokyseliny 1 až 191 lidského růstového hormonu.
CS823457A 1979-07-05 1982-05-12 Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration CS250655B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS823457A CS250655B2 (en) 1979-07-05 1982-05-12 Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/055,126 US4342832A (en) 1979-07-05 1979-07-05 Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
CS804809A CS250652B2 (en) 1979-07-05 1980-07-04 Method of reproducible means' structure for asexual regeneration
CS823457A CS250655B2 (en) 1979-07-05 1982-05-12 Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS250655B2 true CS250655B2 (en) 1987-05-14

Family

ID=26733870

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS804809A CS250652B2 (en) 1979-07-05 1980-07-04 Method of reproducible means' structure for asexual regeneration
CS823457A CS250655B2 (en) 1979-07-05 1982-05-12 Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration
CS842708A CS254973B2 (en) 1979-07-05 1984-04-09 Method of replicable cloning means structure

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS804809A CS250652B2 (en) 1979-07-05 1980-07-04 Method of reproducible means' structure for asexual regeneration

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS842708A CS254973B2 (en) 1979-07-05 1984-04-09 Method of replicable cloning means structure

Country Status (42)

Country Link
US (7) US4342832A (cs)
EP (1) EP0022242B1 (cs)
JP (4) JPH0612996B2 (cs)
KR (2) KR830003574A (cs)
AR (1) AR244341A1 (cs)
AT (1) ATE82324T1 (cs)
AU (2) AU533697B2 (cs)
BE (1) BE884012A (cs)
BG (1) BG41135A3 (cs)
BR (1) BR8008736A (cs)
CA (2) CA1164375A (cs)
CH (1) CH661939A5 (cs)
CS (3) CS250652B2 (cs)
DD (3) DD210070A5 (cs)
DE (3) DE3023627A1 (cs)
DK (2) DK173503B1 (cs)
EG (1) EG14819A (cs)
ES (2) ES8105386A1 (cs)
FI (2) FI802030A7 (cs)
FR (2) FR2460330B1 (cs)
GB (2) GB2121047B (cs)
GR (1) GR69320B (cs)
HK (3) HK87384A (cs)
IE (3) IE50461B1 (cs)
IL (3) IL60312A (cs)
IT (1) IT1131393B (cs)
KE (3) KE3446A (cs)
MX (1) MX172674B (cs)
MY (3) MY8500764A (cs)
NL (1) NL930114I2 (cs)
NO (2) NO167673C (cs)
NZ (2) NZ201312A (cs)
OA (1) OA06562A (cs)
PH (1) PH19814A (cs)
PL (1) PL149278B1 (cs)
PT (1) PT71487A (cs)
RO (1) RO93374B (cs)
SG (1) SG56984G (cs)
WO (1) WO1981000114A1 (cs)
YU (3) YU163580A (cs)
ZA (1) ZA803600B (cs)
ZW (1) ZW14180A1 (cs)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US6455275B1 (en) 1980-02-25 2002-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
US4711843A (en) * 1980-12-31 1987-12-08 Cetus Corporation Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
US6610830B1 (en) 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
IE53166B1 (en) * 1980-08-05 1988-08-03 Searle & Co Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression
US7101981B1 (en) 1980-08-26 2006-09-05 Regents Of The University Of California Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli
US4725549A (en) * 1980-09-22 1988-02-16 The Regents Of The University Of California Human and rat prolactin and preprolactin cloned genes
NZ198445A (en) * 1980-09-25 1984-05-31 Genentech Inc Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
JPS57181098A (en) * 1981-04-30 1982-11-08 Japan Found Cancer Novel recombinant dna
US4810645A (en) * 1981-08-14 1989-03-07 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4801685A (en) * 1981-08-14 1989-01-31 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
NZ201918A (en) * 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5254463A (en) * 1981-09-18 1993-10-19 Genentech, Inc. Method for expression of bovine growth hormone
US4880910A (en) * 1981-09-18 1989-11-14 Genentech, Inc. Terminal methionyl bovine growth hormone and its use
US5236831A (en) * 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4446235A (en) * 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
US4665160A (en) * 1982-03-22 1987-05-12 Genentech, Inc. Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4652639A (en) * 1982-05-06 1987-03-24 Amgen Manufacture and expression of structural genes
HU197349B (en) * 1982-05-25 1989-03-28 Lilly Co Eli Process for producing cloning vectors usable for the expression of growth hormones
US4778759A (en) * 1982-07-09 1988-10-18 Boyce, Thompson Institute For Plant Research, Inc. Genetic engineering in cyanobacteria
US4891315A (en) * 1982-10-25 1990-01-02 American Cyanamid Company Production of herpes simplex viral porteins
AU2038283A (en) * 1982-08-10 1984-03-07 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The The use of eucaryotic promoter sequences in the production ofproteinaceous materials
US4530904A (en) * 1982-09-03 1985-07-23 Eli Lilly And Company Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria
JPS59501852A (ja) * 1982-09-16 1984-11-08 アムジエン 鳥類の成長ホルモン
CA1209501A (en) * 1982-09-16 1986-08-12 Nikos Panayotatos Expression vector
US4666839A (en) * 1982-12-01 1987-05-19 Amgen Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin
JPS59106297A (ja) * 1982-12-07 1984-06-19 Rikagaku Kenkyusho ヒト生長ホルモンのカルボキシ末端遺伝子の合成法
DK55685A (da) * 1985-02-07 1986-08-08 Nordisk Gentofte Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet
US5618697A (en) * 1982-12-10 1997-04-08 Novo Nordisk A/S Process for preparing a desired protein
US4634678A (en) * 1982-12-13 1987-01-06 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms
GB8303383D0 (en) * 1983-02-08 1983-03-16 Biogen Nv Sequences recombinant dna molecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
IL71991A (en) 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
BG49718A3 (bg) * 1983-07-15 1992-01-15 Bio- Technology General Corp Метод за получаване на полипептид със супероксиддисмутазна активност
US4900811A (en) * 1983-07-21 1990-02-13 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
US5242798A (en) * 1983-07-21 1993-09-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
JPS60137291A (ja) * 1983-12-26 1985-07-20 Takeda Chem Ind Ltd 発現ベクター
CA1213537A (en) * 1984-05-01 1986-11-04 Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee Polypeptide expression method
CA1272144A (en) * 1984-06-29 1990-07-31 Tamio Mizukami Fish growth hormone polypeptide
US5489529A (en) * 1984-07-19 1996-02-06 De Boer; Herman A. DNA for expression of bovine growth hormone
WO1986002068A1 (fr) * 1984-09-26 1986-04-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Separation mutuelle de proteines
US4680262A (en) * 1984-10-05 1987-07-14 Genentech, Inc. Periplasmic protein recovery
EP0177343B1 (en) * 1984-10-05 1992-07-22 Genentech, Inc. Dna, cell cultures and methods for the secretion of heterologous proteins and periplasmic protein recovery
NZ213759A (en) * 1984-10-19 1989-01-27 Genentech Inc Lhrh-ctp protein conjugates influencing prolactin fsh and lh release
US4645829A (en) * 1984-10-29 1987-02-24 Monsanto Company Method for separating polypeptides
US4652630A (en) * 1985-02-22 1987-03-24 Monsanto Company Method of somatotropin naturation
US4861868A (en) * 1985-02-22 1989-08-29 Monsanto Company Production of proteins in procaryotes
DK151585D0 (da) * 1985-04-03 1985-04-03 Nordisk Gentofte Dna-sekvens
EP0200986B2 (en) 1985-04-25 1998-03-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant human interleukin-1
IL79289A (en) * 1985-07-05 1992-01-15 Whitehead Biomedical Inst Introduction and expression of foreign genetic material into keratinocytes using a recombinant retrovirus
US5041381A (en) 1986-07-03 1991-08-20 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US4892764A (en) * 1985-11-26 1990-01-09 Loctite Corporation Fiber/resin composites, and method of making the same
US5552528A (en) * 1986-03-03 1996-09-03 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bovine b-endothelial cell growth factor
US5827826A (en) 1986-03-03 1998-10-27 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Compositions of human endothelial cell growth factor
EP0245218B1 (en) * 1986-05-07 1993-12-29 ENIRICERCHE S.p.A. A plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone
EP0252588A3 (en) * 1986-05-12 1989-07-12 Smithkline Beecham Corporation Process for the isolation and purification of p. falciparum cs protein expressed in recombinant e. coli, and its use as a vaccine
US4806239A (en) * 1986-11-28 1989-02-21 Envirotech Corporation Apparatus for shifting filter plates in a filter press
JPS63159244A (ja) * 1986-12-23 1988-07-02 三菱マテリアル株式会社 二層の押出成形珪酸質―石灰質系成形品の製造方法
JPH0720436B2 (ja) * 1986-12-31 1995-03-08 株式会社ラッキー 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法
WO1988005082A1 (en) * 1987-01-07 1988-07-14 Allied Corporation Microbial production of peptide oligomers
US4977089A (en) * 1987-01-30 1990-12-11 Eli Lilly And Company Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms
WO1988010119A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
FR2624835B2 (fr) * 1987-08-05 1990-09-07 Hassevelde Roger Support ergonomique a creme glacee, a cuillere integree, transformable en tout autre objet apres son utilisation premiere
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
IT1223577B (it) * 1987-12-22 1990-09-19 Eniricerche Spa Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura
JPH0231042U (cs) * 1988-08-19 1990-02-27
US5130422A (en) * 1988-08-29 1992-07-14 Monsanto Company Variant somatotropin-encoding DNA
JPH04500970A (ja) 1988-09-02 1992-02-20 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ マクロファージ由来炎症メディエーター　（ｍｉｐ―２）
US5079230A (en) * 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
US5082767A (en) * 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
US5075227A (en) * 1989-03-07 1991-12-24 Zymogenetics, Inc. Directional cloning
US4960301A (en) * 1989-03-27 1990-10-02 Fry Steven A Disposable liner for pickup truck beds
US5164180A (en) 1989-05-18 1992-11-17 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests
US5266477A (en) * 1990-02-02 1993-11-30 Pitman-Moore, Inc. Monoclonal antibodies which differentiate between native and modified porcine somatotropins
CA2041446A1 (en) 1990-05-15 1991-11-16 August J. Sick Bacillus thuringiensis genes encoding novel dipteran-active toxins
US5849694A (en) * 1990-07-16 1998-12-15 Synenki; Richard M. Stable and bioactive modified porcine somatotropin and pharmaceutical compositions thereof
US5202119A (en) * 1991-06-28 1993-04-13 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response
US5744139A (en) * 1991-06-28 1998-04-28 University Of Tennessee Research Corporation Insulin-like growth factor I (IGF-1) induced improvement of depressed T4/T8 ratios
HUT67319A (en) * 1991-08-30 1995-03-28 Life Medical Sciences Inc Compositions for treating wounds
US5591709A (en) * 1991-08-30 1997-01-07 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for treating wounds
US5317012A (en) * 1991-10-04 1994-05-31 The University Of Tennessee Research Corporation Human growth hormone induced improvement in depressed T4/T8 ratio
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
AU5446494A (en) * 1992-10-22 1994-05-09 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Growth hormone fragment hgh 108-129
DE69434492T2 (de) 1993-03-10 2006-07-13 Smithkline Beecham Corp. Phosphodiesterase des menschlichen gehirns
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US5760187A (en) * 1996-02-22 1998-06-02 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Purification process of a human growth hormone
JP3794748B2 (ja) * 1996-03-04 2006-07-12 第一アスビオファーマ株式会社 メタノール代謝系を有する微生物の培養法
WO1998007830A2 (en) * 1996-08-22 1998-02-26 The Institute For Genomic Research COMPLETE GENOME SEQUENCE OF THE METHANOGENIC ARCHAEON, $i(METHANOCOCCUS JANNASCHII)
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
JP2001510989A (ja) * 1996-11-01 2001-08-07 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規コーディング配列
US6068991A (en) * 1997-12-16 2000-05-30 Bristol-Myers Squibb Company High expression Escherichia coli expression vector
CA2314429C (en) 1997-12-18 2010-03-02 Ecogen, Inc. Insect-resistant transgenic plants and methods for improving .delta.-endotoxin activity against target insects
US6087128A (en) * 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
WO1999050302A1 (en) 1998-03-31 1999-10-07 Tonghua Gantech Biotechnology Ltd. Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence and its application to insulin production
US6512162B2 (en) 1998-07-10 2003-01-28 Calgene Llc Expression of eukaryotic peptides in plant plastids
US6271444B1 (en) 1998-07-10 2001-08-07 Calgene Llc Enhancer elements for increased translation in plant plastids
EP1742058B1 (de) 1998-08-28 2011-11-30 febit holding GmbH Träger für Analytbestimmungsverfahren und Verfahren zur Herstellung des Trägers
DE50015858D1 (de) 1999-02-19 2010-03-18 Febit Holding Gmbh Verfahren zur Herstellung von Polymeren
US6946265B1 (en) 1999-05-12 2005-09-20 Xencor, Inc. Nucleic acids and proteins with growth hormone activity
US6187750B1 (en) 1999-08-25 2001-02-13 Everyoung Technologies, Inc. Method of hormone treatment for patients with symptoms consistent with multiple sclerosis
AT408721B (de) 1999-10-01 2002-02-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend ein antigen
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
US6562790B2 (en) 2000-02-05 2003-05-13 Chein Edmund Y M Hormone therapy methods and hormone products for abating coronary artery blockage
WO2001079444A2 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc Albumin fusion proteins
US6995246B1 (en) * 2000-10-19 2006-02-07 Akzo Nobel N.V. Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions
DE60136958D1 (de) 2000-12-01 2009-01-22 Takeda Pharmaceutical Verfahren zur herstellung einer zubereitung mit einer bioaktiven substanz
AU2002226049A1 (en) * 2000-12-05 2002-06-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered plasmids and their use for in situ production of genes
US20020164712A1 (en) * 2000-12-11 2002-11-07 Tonghua Gantech Biotechnology Ltd. Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence
US20030143191A1 (en) * 2001-05-25 2003-07-31 Adam Bell Chemokine beta-1 fusion proteins
US6720538B2 (en) * 2001-06-18 2004-04-13 Homedics, Inc. Thermostat variation compensating knob
EP2305311A3 (en) 2001-10-10 2011-07-20 BioGeneriX AG Glycoconjugation of peptides
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
CA2484556A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2277888A3 (en) 2001-12-21 2011-04-27 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and erythropoietin
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
TWI281864B (en) * 2002-11-20 2007-06-01 Pharmacia Corp N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation
RU2233879C1 (ru) * 2002-12-17 2004-08-10 Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина
RU2357750C2 (ru) 2002-12-31 2009-06-10 Элтус Фармасьютикалз Инк. Кристаллы человеческого гормона роста и способы их получения
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
WO2004074345A2 (en) * 2003-02-19 2004-09-02 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
JP2007523605A (ja) * 2003-05-09 2007-08-23 ファーメクサ エイ／エス 細胞毒性が低減された免疫原性ヒトＴＮＦαアナログおよびそれらの製造方法
GB2426521A (en) * 2004-02-02 2006-11-29 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
WO2006001027A1 (en) * 2004-06-23 2006-01-05 Usv Limited Chimeric human growth hormone derived from the placenta and pituitary isoform and processes for obtaining said chimera
WO2009100255A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
US8282921B2 (en) * 2004-08-02 2012-10-09 Paul Glidden tRNA synthetase fragments
US20060024288A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Pfizer Inc. tRNA synthetase fragments
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
AU2005323106B2 (en) * 2004-12-22 2010-07-29 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
AU2005322019B2 (en) 2004-12-22 2010-08-26 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
CA2607901C (en) 2005-06-13 2016-08-16 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating degenerative bone disorders using a syk inhibitory 2,4-pyrimidinediamine
WO2007005995A2 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Emisphere Technologies, Inc. Compositions for buccal delivery of human growth hormone
WO2007019646A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 University Of Technology, Sydney Liver-directed gene therapy
ES2547554T3 (es) 2005-11-16 2015-10-07 Ambrx, Inc. Métodos y composiciones que comprenden aminoácidos no naturales
CA2634053A1 (en) * 2005-12-23 2007-07-05 Altus Pharmaceuticals Inc. Compositions comprising polycation-complexed protein crystals and methods of treatment using them
DE102006039479A1 (de) 2006-08-23 2008-03-06 Febit Biotech Gmbh Programmierbare Oligonukleotidsynthese
EP2120869A2 (en) 2006-12-18 2009-11-25 Altus Pharmaceuticals Inc. Human growth hormone formulations
US20080260820A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Gilles Borrelly Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides
AU2008279584A1 (en) * 2007-04-27 2009-01-29 Dow Global Technologies Inc. Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles
EP2147105B1 (en) 2007-05-02 2013-04-24 Merial Limited Dna plasmids having improved expression and stability
WO2009012502A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Self- anchoring mems intrafascicular neural electrode
US7939447B2 (en) * 2007-10-26 2011-05-10 Asm America, Inc. Inhibitors for selective deposition of silicon containing films
SI2279007T1 (sl) 2008-04-29 2016-09-30 Ascendis Pharma Growth Disorders Division A/S Spojine pegiliranega rekombinantnega humanega rastnega hormona
CN102171341A (zh) * 2008-04-30 2011-08-31 格兰达利斯有限公司 高纯度质粒dna制备物及其制备方法
EP2303314B1 (en) 2008-06-25 2013-12-11 Braasch Biotech LLC Chloramphenicol acetyl transferase (cat)-defective somatostatin fusion protein and uses thereof in cattle
US8425914B2 (en) * 2008-06-25 2013-04-23 Braasch Biotech Llc Methods for enhanced somatostatin immunogenicity in the treatment of obesity
US8703717B2 (en) * 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
NZ606427A (en) 2009-02-03 2014-10-31 Amunix Operating Inc Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
US20100216648A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
WO2011028228A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
WO2011073234A2 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Ascendis Pharma As Growth hormone composition
PE20121799A1 (es) 2009-12-21 2013-01-02 Ambrx Inc Polipeptidos de somatotropina porcina modificados y sus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
US20110237509A1 (en) 2010-02-17 2011-09-29 Elona Biotechnologies hGH AND METHODS FOR PREPARING hGH
EP2446898A1 (en) 2010-09-30 2012-05-02 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients
CA2824143C (en) 2011-01-14 2018-12-18 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
RU2473556C1 (ru) * 2011-07-14 2013-01-27 Закрытое акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Промышленный способ получения и очистки рекомбинантного гормона роста человека из телец включения
HK1204770A1 (en) 2012-02-07 2015-12-04 Global Bio Therapeutics, Inc. Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof
CA2864126A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
ES2935489T3 (es) 2012-02-15 2023-03-07 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
WO2013148325A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
CN104364259A (zh) 2012-03-26 2015-02-18 普罗努塔利亚公司 营养性片段、蛋白质和方法
JP2015518470A (ja) 2012-03-26 2015-07-02 プロニュートリア・インコーポレイテッドＰｒｏｎｕｔｒｉａ， Ｉｎｃ． 栄養タンパク質および方法
SG11201405842PA (en) 2012-03-26 2014-10-30 Pronutria Inc Charged nutritive proteins and methods
US9457096B2 (en) 2012-07-06 2016-10-04 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Concet) Protozoan variant-specific surface proteins (VSP) as carriers for oral drug delivery
CN105813579B (zh) 2013-08-08 2019-05-07 全球生物疗法有限公司 用于微创手术过程的夹具装置和其应用
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
JP2016537402A (ja) 2013-09-25 2016-12-01 アクセラ・ヘルス・インコーポレイテッドＡｘｃｅｌｌａ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ． 癌の処置における、腫瘍形成、癌細胞の増殖および浸潤の予防および低減のための組成物および配合物、ならびにその生成方法および使用方法
MX394222B (es) 2014-11-18 2025-03-24 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Nuevos profarmacos polimericos de la hormona del crecimiento humana (hgh).
SI3220892T1 (sl) 2014-11-21 2022-01-31 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Oblike odmerjanja dolgotrajno delujočega rastnega hormona
MX2018001497A (es) 2015-08-03 2018-05-15 Bioverativ Therapeutics Inc Proteinas de fusion de factor ix y metodos para producirlas y usarlas.
EP3448885A4 (en) 2016-04-26 2020-01-08 R.P. Scherer Technologies, LLC ANTIBODY CONJUGATES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
IL319473A (en) 2016-12-02 2025-05-01 Bioverativ Therapeutics Inc Methods for treating hemophilic arthritis using chimeric blood clotting factors
DK3793588T3 (da) 2018-05-18 2025-06-16 Bioverativ Therapeutics Inc Fremgangsmåder til behandling af hæmofili a
KR20210024082A (ko) 2018-06-25 2021-03-04 제이씨알 파마 가부시키가이샤 단백질 함유 수성 액제
CN109486847B (zh) * 2018-12-17 2021-03-02 江南大学 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统
US12303553B2 (en) 2019-03-04 2025-05-20 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Long-acting growth hormone dosage forms with superior efficacy to daily somatropin
WO2024175780A1 (en) 2023-02-23 2024-08-29 Micropep Technologies S.A. Micropeptides to improve plant immunity and application thereof

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3853833A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Hormone Res Foundation Synthetic human growth-promoting and lactogenic hormones and method of producing same
US3853832A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Harmone Res Foundation Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
NL7607683A (nl) * 1976-07-12 1978-01-16 Akzo Nv Werkwijze ter bereiding van nieuwe peptiden en peptide-derivaten en de toepassing hiervan.
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4363877B1 (en) * 1977-09-23 1998-05-26 Univ California Recombinant dna transfer vectors
NZ187300A (en) * 1977-05-27 1982-08-17 Univ California Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism
CH630089A5 (de) * 1977-09-09 1982-05-28 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von siliciummodifizierten imidyl-phthalsaeurederivaten.
JPS5449837A (en) * 1977-09-19 1979-04-19 Kobashi Kogyo Kk Safety apparatus of soil block making machine
ZA782933B (en) * 1977-09-23 1979-05-30 Univ California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4407948A (en) * 1977-09-23 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4321365A (en) * 1977-10-19 1982-03-23 Research Corporation Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
AT373281B (de) * 1977-11-08 1984-01-10 Genentech Inc Verfahren zur herstellung eines strukturgens
AT373280B (de) 1977-11-08 1984-01-10 Genentech Inc Verfahren zur erzeugung eines spezifischen polypeptids aus einem mikrobiellen rekombinations -clonbildungstraeger
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4356270A (en) * 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
BR7807288A (pt) * 1977-11-08 1979-06-12 Genentech Inc Processo para sintese de polinucleotidos
DE2862495D1 (en) * 1977-11-08 1989-05-24 Genentech Inc Plasmid for transforming bacterial host to render it capable of polypeptide expression
US4652525A (en) * 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
FI792481A7 (fi) * 1978-08-11 1981-01-01 The Regents Of The Univ Of Enkaroyyttisen proteiinin synteesi mikro-organismia käyttäen.
EP0009930B2 (en) * 1978-10-10 1988-08-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Recombinant dna, method for preparing it and production of foreign proteins by unicellular hosts containing it
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
ZA802992B (en) * 1979-06-01 1981-10-28 Univ California Human pre-growth hormone
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
GR70279B (cs) * 1979-09-12 1982-09-03 Univ California
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it
GR79124B (cs) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
CA1267615A (en) * 1984-08-27 1990-04-10 Dan Hadary Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
RO93374B (ro) 1988-01-31
BG41135A3 (bg) 1987-04-15
NO167673C (no) 1991-11-27
DD210071A5 (de) 1984-05-30
GB2121047B (en) 1984-06-06
IE50462B1 (en) 1986-04-30
DE3050725C2 (cs) 1988-03-10
PL149278B1 (en) 1990-01-31
BR8008736A (pt) 1981-04-28
IL69492A (en) 1985-04-30
GB2055382A (en) 1981-03-04
NZ201312A (en) 1983-09-30
EP0022242B1 (en) 1992-11-11
YU121183A (en) 1984-02-29
SG56984G (en) 1985-03-08
WO1981000114A1 (en) 1981-01-22
AR244341A1 (es) 1993-10-29
IL69492A0 (en) 1983-11-30
FI850198A0 (fi) 1985-01-16
JP2622479B2 (ja) 1997-06-18
US4634677A (en) 1987-01-06
ES493149A0 (es) 1981-05-16
KR870000701B1 (ko) 1987-04-07
HK87484A (en) 1984-11-16
KE3450A (en) 1984-10-05
JPH05268970A (ja) 1993-10-19
CS270884A2 (en) 1987-07-16
PH19814A (en) 1986-07-08
PL225376A1 (en) 1983-07-18
JPH02478A (ja) 1990-01-05
CH661939A5 (de) 1987-08-31
YU121283A (en) 1984-02-29
JPH0648987B2 (ja) 1994-06-29
US5424199A (en) 1995-06-13
KR830003574A (ko) 1983-06-21
NO167674B (no) 1991-08-19
NZ194043A (en) 1983-09-30
HK87384A (en) 1984-11-16
KE3446A (en) 1984-10-05
DD157343A5 (de) 1982-11-03
IL60312A (en) 1985-04-30
NO810608L (no) 1981-02-20
ZW14180A1 (en) 1980-09-10
MY8500763A (en) 1985-12-31
FR2460330B1 (fr) 1985-07-19
US4601980A (en) 1986-07-22
DK172132B1 (da) 1997-11-24
DD210070A5 (de) 1984-05-30
JPH0612996B2 (ja) 1994-02-23
DK97381A (da) 1981-03-04
AU1838883A (en) 1984-01-05
MX172674B (es) 1994-01-06
CA1164375A (en) 1984-03-27
DK173503B1 (da) 2001-01-15
ATE82324T1 (de) 1992-11-15
NO167673B (no) 1991-08-19
AU533697B2 (en) 1983-12-08
US4604359A (en) 1986-08-05
US4658021A (en) 1987-04-14
IT8023070A0 (it) 1980-06-26
HK87584A (en) 1984-11-16
US4342832A (en) 1982-08-03
RO93374A (ro) 1988-01-30
DK251490D0 (da) 1990-10-18
IE50460B1 (en) 1986-04-30
ES499043A0 (es) 1982-06-01
US5795745A (en) 1998-08-18
GR69320B (cs) 1982-05-14
EG14819A (en) 1985-03-31
FR2460330A1 (fr) 1981-01-23
AU574351B2 (en) 1988-07-07
NO860680L (no) 1981-02-20
PT71487A (en) 1980-08-01
BE884012A (fr) 1980-12-29
IT1131393B (it) 1986-06-18
FI850198L (fi) 1985-01-16
AU2583484A (en) 1984-07-12
EP0022242A2 (en) 1981-01-14
FI802030A7 (fi) 1981-01-06
ES8105386A1 (es) 1981-05-16
YU163580A (en) 1984-02-29
GB2121047A (en) 1983-12-14
IE801214L (en) 1981-01-05
EP0022242A3 (en) 1982-04-07
DE3023627A1 (de) 1981-01-22
CA1202256A (en) 1986-03-25
JPH08242881A (ja) 1996-09-24
FR2518572B1 (fr) 1985-08-23
NL930114I1 (nl) 1993-10-18
ES8205265A1 (es) 1982-06-01
IE50461B1 (en) 1986-04-30
IL60312A0 (en) 1980-09-16
DK251490A (da) 1990-10-18
MY8500764A (en) 1985-12-31
NL930114I2 (nl) 1994-10-17
JPS5621596A (en) 1981-02-28
MY8500765A (en) 1985-12-31
AU5949880A (en) 1981-01-15
OA06562A (fr) 1981-07-31
NO167674C (no) 1991-11-27
DE3050722C2 (cs) 1987-09-24
FR2518572A1 (fr) 1983-06-24
CS254973B2 (en) 1988-02-15
FI850198A7 (fi) 1985-01-16
GB2055382B (en) 1983-10-19
IE842193L (en) 1981-01-05
KE3451A (en) 1984-10-05
CS250652B2 (en) 1987-05-14
ZA803600B (en) 1981-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS250655B2 (en) Method of microorganisme&#39;s viable culture&#39;s cultivation with means content for asexual regeneration
US4431740A (en) DNA Transfer vector and transformed microorganism containing human proinsulin and pre-proinsulin genes
US4440859A (en) Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4898830A (en) Human growth hormone DNA
IE48385B1 (en) Synthesis of a eucaryotic protein by a microorganism
GB1565190A (en) Recombinant dna transfer vector and microorganism containing a gene from a higher organism
KR870000501B1 (ko) 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법
KR900001014B1 (ko) 소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법
JP2612264B2 (ja) Ｄｎａ配列体
Miller Use of recombinant DNA technology for the production of polypeptides
CA1302321C (en) Preparation of polypeptides
CA1156166A (en) Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
JPH01273591A (ja) ヒト成長ホルモン分泌プラスミド、ならびにそれを用いた形質転換体および蛋白質分泌生産法
GB2121048A (en) Microbial expression of quasi- synthetic genes
JPH1014578A (ja) 入れ換え変異体遺伝子ｄｎａの構築
CS227002B2 (cs) Způsob výroby vektoru pro přenos DNA