ES2610356T3

ES2610356T3 - Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos

Info

Publication number: ES2610356T3
Application number: ES10739085.8T
Authority: ES
Inventors: Volker Schellenberger; Joshua Silverman; Chia-Wei Wang; Benjamin Spink; Willem P. Stemmer; Nathan Geething; Wayne To; Jeffrey L. Cleland
Original assignee: Amunix Operating Inc
Current assignee: Amunix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2010-02-03
Publication date: 2017-04-27
Anticipated expiration: 2030-02-03
Also published as: CN117050147A; JP2016106135A; NZ628987A; HRP20161807T1; KR20110127669A; JP2024081707A; ES2730800T3; US20250051405A1; US20140301974A1; US20180244736A1; PT2393828T; US20100239554A1; US20170037088A1; US8673860B2; JP2012516854A; BRPI1008061B1; US9926351B2; EA201170993A1; CN102348715B; SI2393828T1

Abstract

Un polipeptido recombinante extendido (XTEN) aislado que comprende mas de 100 a 3000 restos de aminoacidos, en donde el XTEN se caracteriza por que: (a) al menos el 90 % de la secuencia de XTEN consiste en motivos de secuencia que no se solapan, seleccionandose los motivos de secuencia entre el grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 1; (b) la suma de restos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) constituye mas del 90 % de la secuencia de aminoacidos total del XTEN; (c) la secuencia de XTEN es sustancialmente no repetitiva por que ninguno de los tres aminoacidos contiguos en la secuencia son tipos de aminoacidos identicos a menos que el aminoacido sea serina, en cuyo caso no mas de tres aminoacidos contiguos son restos de serina; (d) la secuencia de XTEN carece de un epitopo predicho de linfocitos T cuando se analiza mediante el algoritmo TEPITOPE, en donde el algoritmo de prediccion TEPITOPE para epitopos dentro de la secuencia de XTEN se basa en una puntuacion de -6 o superior; (e) la secuencia de XTEN tiene una formacion de enrollamientos aleatorios de mas del 90 % como se determino mediante el algoritmo de Garnier-Osguthorpe-Robson; y (f) la secuencia de XTEN tiene menos del 2 % de helices alfa y el 2 % de laminas beta como se determino mediante el algoritmo de Chou-Fasman

Description

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exclusión por tamaño, IR, RMN, espectroscopia Raman, refractometría y espectroscopia UV/Visible. Se desvelan métodos adicionales en Arnau et al., Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13. La aplicación de estos métodos estaría dentro del alcance de un experto en la materia.

5 Normalmente, el componente XTEN de las proteínas de fusión está diseñado para comportarse como secuencias peptídicas desnaturalizados en condiciones fisiológicas, a pesar de la longitud extendida del polímero. Desnaturalizado describe el estado de un péptido en solución que se caracteriza por una gran libertad conformacional de la cadena peptídica principal. La mayoría de los péptidos y proteínas adoptan una conformación desnaturalizada en presencia de altas concentraciones de desnaturalizantes o a temperatura elevada. Los péptidos en la conformación desnaturalizada tienen, por ejemplo, espectros de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés) característicos y se caracterizan por una falta de interacciones de largo alcance como se determina por RMN. "Conformación desnaturalizada" y "conformación desestructurada" se utilizan como sinónimos en el presente documento. En algunos casos, la divulgación proporciona secuencias XTEN que, en condiciones fisiológicas, pueden parecerse secuencias desnaturalizadas en gran parte desprovistas de estructura secundaria. En otros

15 casos, las secuencias XTEN pueden estar sustancialmente desprovistas de estructura secundaria en condiciones fisiológicas. "En gran medida desprovistas", como se utiliza en este contexto, significa que menos del 50 % de los restos de aminoácidos XTEN de la secuencia de XTEN contribuyen a la estructura secundaria como se mide o se determina por los medios que se describen en el presente documento. "Sustancialmente desprovistas", como se utiliza en este contexto, significa que al menos aproximadamente el 60 % o aproximadamente el 70 % o aproximadamente el 80 % o aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % de los restos de aminoácidos de XTEN de la secuencia de XTEN no contribuyen a la estructura secundaria, como se mide o se determina por los medios que se describen en el presente documento.

Se han establecido diversos métodos en la técnica de discernir la presencia o ausencia de estructuras secundarias y

25 terciarias en un polipéptido dado. En particular, la estructura secundaria puede medirse espectrofotométricamente, por ejemplo, por espectroscopía de dicroísmo circular en la región espectral del "UV lejano" (190-250 nm). Los elementos de estructura secundaria, tales como la hélice alfa y la lámina beta, dan lugar cada uno a una forma y magnitud características de los espectros de CD. La estructura secundaria también puede predecirse a partir de una secuencia peptídica a través de determinados programas de ordenador o algoritmos, tales como el bien conocido algoritmo de Chou-Fasman (Chou, P. Y., et al. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) y el algoritmo de Garnier Osguthorpe-Robson ("GOR") (Garnier J, Gibrat JF, Robson B. (1996), GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol. 266:540-553), como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.º 20030228309A1. Para una secuencia dada, los algoritmos pueden predecir si existe alguna o ninguna estructura secundaria en absoluto, expresado como el total y/o el porcentaje de restos de la

35 secuencia que forman, por ejemplo, hélices alfa o láminas beta o el porcentaje de restos de la secuencia que se predice que dan como resultado la formación de enrollamientos aleatorios (que carecen de estructura secundaria).

En algunos casos, las secuencias de XTEN utilizadas en las composiciones de proteínas de fusión de la invención pueden tener un porcentaje de hélices alfa que va del 0 % a menos de aproximadamente el 5 %, como se determina por un algoritmo de Chou-Fasman. En otros casos, las secuencias de XTEN de las composiciones de proteína de fusión pueden tener un porcentaje de lámina beta que van del 0 % a menos de aproximadamente el 5 %, como se determina por un algoritmo de Chou-Fasman. En algunos casos, las secuencias de XTEN de las composiciones de proteínas de fusión pueden tener un porcentaje de hélice alfa que van del 0 % a menos de aproximadamente el 5 % y un porcentaje de lámina beta que van del 0 % a menos de aproximadamente el 5 %, como se determina por un 45 algoritmo de Chou-Fasman. En realizaciones preferidas, las secuencias de XTEN de las composiciones de proteína de fusión tendrán un porcentaje de hélice alfa de menos de aproximadamente el 2 % y un porcentaje de lámina beta de menos de aproximadamente el 2 %. En otros casos, las secuencias de XTEN de las composiciones de proteínas de fusión pueden tener un alto grado de porcentaje de enrollamiento aleatorio, como se determina por un algoritmo de GOR. En algunas realizaciones, una secuencia de XTEN puede tener al menos aproximadamente el 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 90 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 91 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 92 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 93 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 94 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 96 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 97 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 98 % y más preferentemente al

55 menos aproximadamente el 99 % de enrollamiento aleatorio, como se determina por un algoritmo de GOR.

1. Secuencias no repetitivas

Las secuencias de XTEN de las presentes composiciones pueden ser sustancialmente no repetitivas. En general, las secuencias de aminoácidos repetitivas tienen una tendencia a agregarse o formar estructuras de orden superior, como se ejemplifica por secuencias repetitivas naturales tales como colágenos y cremalleras de leucina, o formar contactos que dan como resultado estructuras cristalinas o pseudocristalinas. Por el contrario, la baja tendencia de las secuencias no repetitivas a agregarse permite el diseño de XTEN de secuencia larga con una frecuencia relativamente baja de aminoácidos cargados que serían propensos a agregarse si las secuencias fueran, de otro 65 modo, repetitivas. Normalmente, las proteínas de fusión BPXTEN comprenden secuencias de XTEN más de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 restos de aminoácidos, preferentemente más de 400 a

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aproximadamente 3000 restos, en la que al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 91 % o aproximadamente el 92 % o aproximadamente el 93 % o aproximadamente el 94 % o aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 96 % o aproximadamente el 97 % o aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % a aproximadamente el 100 % de la secuencia consiste en múltiples unidades de dos o 5 más motivos de secuencias que no se solapan seleccionados entre las secuencias de aminoácidos de la Tabla 1. En algunos casos, el XTEN comprende motivos de secuencia que no se solapan en donde aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 91 % o aproximadamente el 92 % o aproximadamente el 93 % o aproximadamente el 94 % o aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 96 % o aproximadamente el 97 % o aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % a aproximadamente 100 % de la secuencia consiste 10 en dos o más secuencias que no se solapan seleccionadas entre una sola familia de motivos de la Tabla 1, dando como resultado una secuencia "familia" en la que la secuencia general sigue siendo sustancialmente no repetitiva. En consecuencia, en estas realizaciones, una secuencia de XTEN puede comprender múltiples unidades de motivos de secuencia que no se solapan de la familia de motivos AD o la familia de motivos AE o la familia de motivos AF o la familia de motivos AG o la familia de motivos AM o la familia de motivos AQ o la familia BC o la familia BD de las 15 secuencias de la Tabla 1. En otros casos, el XTEN comprende secuencias con motivos de dos o más de las familias

de motivos de la Tabla 1.

Tabla 1: Motivos de secuencia de XTEN de 12 aminoácidos y familias de motivos

Familia de motivos *: SEQ ID NO: SECUENCIA DEL MOTIVO

AD: 182 GESPGGSSGSES

AD: 183 GSEGSSGPGESS

AD: 184 GSSESGSSEGGP

AD: 185 GSGGEPSESGSS

AE, AM: 186 GSPAGSPTSTEE

AE, AM, AQ: 187 GSEPATSGSETP

AE, AM, AQ: 188 GTSESATPESGP

AE, AM, AQ: 189 GTSTEPSEGSAP

AF, AM: 190 GSTSESPSGTAP

AF, AM: 191 GTSTPESGSASP

AF, AM: 192 GTSPSGESST AP

AF, AM: 193 GSTSSTAESPGP

AG, AM: 194 GTPGSGT ASSSP

AG, Am: 195 GSSTPSGATGSP

AG, Am: 196 GSSPSASTGTGP

AG, AM: 197 GASPGTSSTGSP

AQ: 198 GEPAGSPTSTSE

AQ: 199 GTGEPSSTPASE

AQ: 200 GSGPSTESAPTE

AQ: 201 GSETPSGPSETA

AQ: 202 GPSETSTSEPGA

AQ: 203 GSPSEPTEGTSA

BC: 1715 GSGASEPTSTEP

BC: 1716 GSEPATSGTEPS

BC: 1717 GTSEPSTSEPGA

BC: 1718 GTSTEPSEPGSA

BD: 1719 GSTAGSETSTEA

BD: 1720 GSETATSGSETA

BD: 1721 GTSESATSESGA

BD: 1722 GTSTEASEGSAS

* Indica secuencias de motivos individuales que, cuando se usan juntas en diversas permutaciones, dan como resultado una "secuencia familia"

20 En otros casos, la composición BPXTEN pueden comprender una secuencia de XTEN no repetitiva de más de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 restos de aminoácidos, preferentemente más de 400 a aproximadamente 3000 restos, en la que al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 91 % o aproximadamente el 92 % o aproximadamente el 93 % o aproximadamente el 94 % o aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 96 % o aproximadamente el 97 % o aproximadamente el 98 % o

25 aproximadamente el 99 % a aproximadamente el 100 % de la secuencia consiste en motivos de secuencia de 36 aminoácidos que no se solapan seleccionados entre una o más de las secuencias peptídicas de las Tablas 12-15.

En aquellas realizaciones en donde el componente XTEN de la proteína de fusión BPXTEN tiene menos del 100 % de sus aminoácidos que consisten en de cuatro a seis aminoácidos seleccionados entre glicina (G), alanina (A), 30 serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) o menos del 100 % de la secuencia que consiste en los motivos

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intramuscular a un sujeto. En dichos casos, la Cmáx se reduce en comparación con una dosis comparable de una BP no unida a XTEN, contribuyendo así a la capacidad de mantener la BPXTEN dentro del margen terapéutico para la composición. Por tanto, el XTEN confiere la propiedad de un depósito a la BPXTEN administrada, además de las otras propiedades físicas/químicas descritas en el presente documento.

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receptor de polipéptido circulante.

Adicionalmente, la secuencia no repetitiva y la correspondiente falta de epítopos de XTEN pueden limitar la capacidad de las células B para unirse o activarse por XTEN. Una secuencia repetitiva es reconocida y puede formar 5 contactos multivalentes con incluso unas pocas células B y, como consecuencia del entrecruzamiento de múltiples receptores independientes de linfocitos T, puede estimular la proliferación de células B y la producción de anticuerpos. Por el contrario, mientras que un XTEN puede hacer contactos con muchas células B diferentes a lo largo de su secuencia extendida, cada célula B individual puede hacer solamente uno o un pequeño número de contactos con un XTEN individual debido a la falta de repetitividad de la secuencia. Como resultado, los XTEN normalmente puede tener una tendencia mucho menor a estimular la proliferación de las células B y, por tanto, de una respuesta inmunitaria. En una realización, la BPXTEN puede tener una inmunogenicidad reducida en comparación con la BP correspondiente que no se fusiona. En una realización, la administración de hasta tres dosis parenterales de una BPXTEN a un mamífero puede dar como resultado IgG anti-BPXTEN detectable a una dilución de suero de 1:100, pero no a una dilución de 1:1000. En otra realización, la administración de hasta tres dosis

15 parenterales de una BPXTEN a un mamífero puede dar como resultado IgG anti-BP detectable a una dilución de suero de 1:100, pero no a una dilución de 1:1000. En otra realización, la administración de hasta tres dosis parenterales de una BPXTEN a un mamífero puede dar como resultado IgG anti-XTEN detectable a una dilución de suero de 1:100, pero no a una dilución de 1:1000. En las realizaciones anteriores, el mamífero puede ser un ratón, una rata, un conejo o un macaco.

Una característica adicional de los XTEN con secuencias no repetitivas con respecto a las secuencias con un alto grado de repetitividad puede ser que los XTEN no repetitivos forman contactos más débiles con los anticuerpos. Los anticuerpos son moléculas multivalentes. Por ejemplo, IgG tiene dos sitios de unión idénticos e IgM contiene 10 sitios de unión idénticos. Por tanto, los anticuerpos contra secuencias repetitivas pueden formar contactos

25 multivalentes con dichas secuencias repetitivas con alta avidez, lo que puede afectar a la potencia y/o eliminación de dichas secuencias repetitivas. Por el contrario, los anticuerpos contra los XTEN no repetitivos pueden producir interacciones monovalentes, dando como resultado menos probabilidad de aclaramiento inmunitario de modo que las composiciones de BPXTEN pueden permanecer en la circulación durante un mayor período de tiempo.

6. Aumento del radio hidrodinámico

En otro aspecto, la presente invención proporciona XTEN en el que los polipéptidos XTEN pueden tener un alto radio hidrodinámico que confiere un correspondiente aumento del peso molecular aparente de la proteína de fusión BPXTEN que incorpora el XTEN. Como se detalla en el Ejemplo 19, la unión de XTEN a secuencias de BP puede

35 dar como resultado composiciones de BPXTEN que pueden tener un aumento de los radios hidrodinámicos, un aumento del Peso molecular aparente y un aumento del factor de peso molecular aparente en comparación con una BP no unida a un XTEN. Por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas en donde se desea prolongar la semivida, las composiciones en donde un XTEN con un alto radio hidrodinámico se incorpora en una proteína de fusión que comprende una o más BP pueden ampliar eficazmente el radio hidrodinámico de la composición más allá del tamaño de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (correspondiente a un peso molecular aparente de aproximadamente 70 kDa) (Caliceti. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277), dando como resultado una reducción del aclaramiento renal de proteínas circulantes. El radio hidrodinámico de una proteína está determinado por su peso molecular, así como por su estructura, incluyendo su forma y su compacidad. Sin quedar ligado por una teoría particular, el XTEN puede

45 adoptar conformaciones abiertas debido a la repulsión electrostática entre las cargas individuales del péptido o la flexibilidad inherente transmitida por los aminoácidos particulares en la secuencia que carecen de potencial para conferir estructura secundaria. La conformación abierta, extendida y desestructurada del polipéptido XTEN puede tener un mayor radio hidrodinámico proporcional en comparación con los polipéptidos de una secuencia de longitud y/o peso molecular comparables que tienen estructura secundaria y/o terciaria, tales como las proteínas globulares típicas. Los métodos para determinar el radio hidrodinámico son bien conocidos en la técnica, tal como mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), como se describe en las Patentes de los EE.UU. N.º

6.406.632 y 7.294.513. Como demuestran los resultados del Ejemplo 19, la adición de longitudes crecientes de XTEN da como resultado incrementos proporcionales en los parámetros de radio hidrodinámico, Peso molecular aparente y Factor de peso molecular aparente, permitiendo la adaptación de BPXTEN a límites de peso molecular

55 aparente o radio hidrodinámico característicos deseados. En consecuencia, en ciertas realizaciones, la proteína de fusión BPXTEN puede configurarse con un XTEN de manera que la proteína de fusión puede tener un radio hidrodinámico de al menos aproximadamente 5 nm o al menos aproximadamente 8 nm o al menos aproximadamente 10 nm o 12 nm o al menos aproximadamente 15 nm. En las realizaciones anteriores, el gran radio hidrodinámico conferido por el XTEN en una proteína de fusión BPXTEN puede dar como resultado el aclaramiento renal reducido de la proteína de fusión resultante, conduciendo a un aumento correspondiente en la semivida terminal, un aumento del tiempo de residencia medio y/o una disminución de la tasa de aclaramiento renal. En otra realización, un XTEN de una longitud y secuencia elegidas puede incorporarse selectivamente en una BPXTEN para crear una proteína de fusión que tendrá, en condiciones fisiológicas, un peso molecular aparente de al menos aproximadamente 150 kDa o al menos aproximadamente 300 kDa o al menos aproximadamente 400 kDa o

65 al menos aproximadamente 500 kDa o al menos aproximadamente 600 kDa o al menos aproximadamente 700 kDa

o al menos aproximadamente 800 kDa o al menos aproximadamente 900 kDa o al menos aproximadamente

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ser altamente homólogos entre sí, incluso cuando poseen funciones biológicas opuestas. Los péptidos que aumentan la glucosa se ejemplifican por la hormona peptídica glucagón, mientras que los péptidos que disminuyen la glucosa incluyen la exendina-4, el péptido 1 similar al glucagón y la amilina. Sin embargo, el uso de péptidos y/o hormonas terapéuticos, incluso cuando aumenta por el uso de fármacos de molécula pequeña, ha encontrado un 5 éxito limitado en el tratamiento de dichas enfermedades y trastornos. En particular, la optimización de la dosis es importante para los fármacos y productos biológicos utilizados en el tratamiento de enfermedades metabólicas, especialmente aquellos con un marco terapéutico estrecho. Las hormonas en general y los péptidos implicados en la homeostasis de la glucosa con frecuencia tienen un marco terapéutico estrecho. El marco terapéutica estrecho, junto con el hecho de que dichas hormonas y péptidos normalmente tienen una semivida corta, lo que requiere una 10 dosificación frecuente con el fin de lograr el beneficio clínico, dan como resultado dificultades en el manejo de estos pacientes. Si bien las modificaciones químicas de una proteína terapéutica, tales como la pegilación, pueden modificar su tasa de aclaramiento in vivo y la consiguiente semivida sérica, requieren etapas de fabricación adicionales y dan como resultado un producto final heterogéneo. Además, se han notificado efectos secundarios inaceptables por la administración crónica. Como alternativa, la modificación genética por fusión de un dominio Fc a

15 la proteína o péptido terapéutico aumenta el tamaño de la proteína terapéutica, reduciendo la tasa de aclaramiento a través del riñón y promoviendo el reciclaje desde los lisosomas por el receptor FcRn. Desafortunadamente, el dominio Fc no se pliega de manera eficiente durante la expresión recombinante y tiende a formar precipitados insolubles conocidos como cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión deben solubilizarse y la proteína funcional debe renaturalizarse; un proceso largo, ineficiente y caro.

20 Por tanto, un aspecto de la presente invención es la incorporación de péptidos implicados en la homeostasis de la glucosa, la resistencia a la insulina y la obesidad (colectivamente, "péptidos reguladores de la glucosa") en proteínas de fusión BPXTEN para crear composiciones con utilidad en el tratamiento de los trastornos, enfermedades y afecciones relacionadas con la glucosa, la insulina y la obesidad. Los péptidos reguladores de la glucosa pueden

25 incluir cualquier proteína de interés o función biológica, terapéutica o profiláctica que sea útil para prevenir, tratar, mediar o mejorar una enfermedad, trastorno o afección de la homeostasis de la glucosa o la resistencia a la insulina

o la obesidad. Los péptidos reguladores de la glucosa adecuados que pueden unirse al XTEN para crear BPXTEN incluyen todos los polipéptidos biológicamente activos que aumentan la secreción de insulina dependiente de glucosa por las células pancreáticas beta o potencian la acción de la insulina. Los péptidos reguladores de la 30 glucosa también pueden incluir todos los polipéptidos biológicamente activos que estimulan la transcripción de genes proinsulina en las células pancreáticas beta. Además, los péptidos reguladores de la glucosa también pueden incluir todos los polipéptidos biológicamente activos que ralentizan el tiempo de vaciado gástrico y reducen la ingesta de alimentos. Los péptidos reguladores de la glucosa también pueden incluir todos los polipéptidos biológicamente activos que inhiben la liberación de glucagón de las células alfa de los islotes de Langerhans. La Tabla 3 35 proporciona una lista no limitante de secuencias de péptidos reguladores de la glucosa que están incluidos en las proteínas de fusión BPXTEN de la divulgación. Los péptidos reguladores de la glucosa de las composiciones de BPXTEN de la invención pueden ser un péptido que presenta al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia o como alternativa el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91%, el 92 %, el 93%, el 94 %, el 95 %, el 96%, el 97%, el 98 %, el 99% o el 100% de identidad de secuencia

40 con una secuencia de proteína seleccionada de la Tabla 3.

Tabla 3: Péptidos reguladores de la glucosa y sus correspondientes secuencias de aminoácidos

Nombre de la proteína (Sinónimo): SEQ ID NO: Secuencia

Adrenomedulina (ADM): 1

Amilina, de rata: 2 KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY

Amilina, humana: 3 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY

Calcitonina (hCT): 4 CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP

calcitonina, de salmón: 5 CSNLSTCVLGKLSQELHKL.QTYPRTNTGSGTP

Péptido relacionado con el gen de la calcitonina (h-CGRP a): 6 ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNMVPTNVGSKAF

Péptido relacionado con el gen de la calcitonina (h-CGRP β): 7 ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF

Colecistocinina (CCK): 8

CCK-33: 9 KAPSGRMSIVKNLQNLDPSHRISDRDYMGWMDF

CCK-8: 10 DYMGWMDF

Exendina-3: 11 HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS

Exendina-4: 12 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVR LFIEWLKNGGPSSGAPPPS

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FGF-19: 13

FGF-21: 14

Gastrina: 15 QLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDF

Gastrina-17: 16 DPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDF

Polipéptido inhibidor gástrico (GIP): 17 YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ

Grelina: 18 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Glucagón: 19 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT

Péptido similar al glucagón1 (hGLP-1) (GLP-1; 1-37): 20 HDEFERHAEGTFTSDVSSTLEGQAALEFIAWLVKGRG

GLP-1 (7-36), humano: 21 HAEGTFTSDVSSYLEGQAALEFIAWLVKGR

GLP-1 (7-37), humano: 22 HAEGTFTSDVSSTLEGQAALEFIAWLVKGRG

GLP-1, de rana: 23 HAEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGKPKKIRYS

Péptido similar al glucagón2 (GLP-2), humano: 24 HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIETKITD

GLP-2, de rana: 25 HAEGTFTNDMTNYLEEKAAKEFVGWLIKGRP-OH

IGF-1: 26

IGF-2: 27

Péptido INGAP (proteína asociada a la neogénesis del islote): 28

Intermedina (AFP-6): 29 TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY

Leptina, humana: 30

Neuromedina (T-8) porcina: 31 YFLFRPRN

Neuromedina (T-9): 32 GYFLFRPRN

Neuromedina (U25) humana): 33 FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRN

Neuromedina (U25) de cerdo: 34 FKVDEEFQGPIVSQNRRYFLFRPRN

Neuromedina S, humana: 35 ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN

Neuromedina U, de rata: 36 YKVNEYQGPVAPSGGFFLFRPRN

Oxintomodulina (OXM): 37 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA

Péptido YY (PYY): 38 YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY

Pramlintida: 39 KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2

Urocortina (Ucn-1): 40 DNPSLSIDLTFHLLRTLLELARTQSQRERAEQNRIIFDSV

Urocortina (Ucn-2): 41 IVLSLDVPIGLLQILLLQARARAAREQATTNARILARVGHC

Urocortina (Ucn-3): 42 FTLSLDVPTNIMNLLFNIAKAKNLRAQAAANAHLMAQI

"Adrenomedulina" o "ADM" significa la hormona peptídica adrenomedulina humana y especies y variantes de secuencia de la misma que tienen al menos una parte de la actividad biológica de la ADM madura. La ADM se genera a partir de una preprohormona de 185 aminoácidos a través de la escisión y la amidación enzimáticas 5 consecutivas, dando como resultado un péptido bioactivo de 52 aminoácidos con una semivida plasmática medida de 22 min. Las proteínas de fusión de la divulgación que contienen ADM pueden encontrar un uso particular en la diabetes por los efectos estimulantes sobre la secreción de insulina desde las células de los islotes para la regulación de la glucosa o en sujetos con hipotensión sostenida. La infraestructura genómica completa para la AM humana se ha publicado (Ishimitsu, et al., Biochem Biophys Res Commun 203: 631-639 (1994)) y se han clonado

10 análogos de péptidos de ADM, como se describe en la Patente de los EE.UU. N.º 6.320.022.

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"Amilina" significa la hormona peptídica humana denominada amilina, pramlintida y variaciones de especie de las mismas, como se describe en la patente de los EE.UU. N.º 5.234.906, que tiene al menos una parte de la actividad biológica de la amilina madura.

5 La amilina es una hormona polipeptídica de 37 aminoácidos cosecretada con la insulina por las células pancreáticas beta en respuesta a la ingesta de nutrientes (Koda et al., Lancet 339: 1179-1180, 1992) y se ha notificado que modula varias vías clave del metabolismo de los hidratos de carbono, incluyendo la incorporación de glucosa en el glucógeno. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen amilina pueden encontrar un uso particular en la diabetes y la obesidad para regular el vaciado gástrico, suprimir la secreción de glucagón y la ingesta de alimentos, afecta de este modo a la velocidad de aparición de la glucosa en la circulación. Por tanto, las proteínas de fusión pueden complementar la acción de la insulina, que regula la tasa de desaparición de la glucosa de la circulación y su absorción por los tejidos periféricos. Se han clonado análogos de amilina, como se describe en las patentes de los EE.UU. N.º 5.686.411 y 7.271.238. Pueden crearse miméticos de amilina que retienen la actividad biológica. Por ejemplo, la pramlintida tiene la secuencia KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY

15 (SEQ ID NO: 43), en la que los aminoácidos de la secuencia de la amilina de rata se sustituyen por aminoácidos de la secuencia de la amilina humana. En una realización, la divulgación incluye proteínas de fusión que comprenden miméticos de amilina con la secuencia

KCNTATCATX1RLANFLVHSSNNFGX2ILX2X2TNVGSNTY (SEQ ID NO: 44)

en la que X1 es independientemente N o Q y X2 es independientemente S, P o G. En una realización, el mimético de amilina incorporado en una BPXTEN puede tener la secuencia KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY (SEQ ID NO: 45). En otra realización, en la que el mimético de la amilina se utiliza en el extremo C de la BPXTEN, el mimético puede tener la secuencia

25 KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY (NH2) (SEQ ID NO: 46).

"Calcitonina" (CT) significa la proteína calcitonina humana y especies y variantes de secuencia de la misma, incluyendo la calcitonina de salmón ("sCT"), que tiene al menos una parte de la actividad biológica de la CT madura. La CT es un péptido de 32 aminoácidos escindido de una prohormona más grande de la tiroides que parece funcionar en los sistemas nervioso y vascular, pero también se ha informado que es un mediador hormonal potente del reflejo de saciedad. La CT se nombra por su secreción en respuesta a la hipercalcemia inducida y su rápido efecto de hipocalcemia. Se produce en y se secreta desde las células neuroendocrinas de la tiroides denominadas células C. La CT tiene efectos sobre los osteoclastos y la inhibición de las funciones de los osteoclastos por la CT da como resultado una disminución en la resorción ósea. Los efectos in vitro de la CT incluyen la pérdida rápida de los

35 bordes rugosos y la disminución de la liberación de enzimas lisosomales. Una función importante de la CT (1-32) es combatir contra la hipercalcemia aguda en situaciones de emergencia y/o proteger el esqueleto durante los períodos de "estrés de calcio", tales como el crecimiento, el embarazo y la lactancia. (Revisado en Becker, JCEM, 89 (4): 1512-1525 (2004) y Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067-1093 (1999)). Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen calcitonina pueden encontrar un uso particular para el tratamiento de la osteoporosis y como una terapia para la enfermedad ósea de Paget. Se han creado péptidos sintéticos de calcitonina, como se describe en las patentes de los EE.UU. N.º 5.175.146 y 5.364.840.

"Péptido relacionado con el gen de la calcitonina" o "CGRP" significa el péptido CGRP humano y especies y variantes de secuencia del mismo que tienen al menos una parte de la actividad biológica del CGRP maduro. El

45 péptido relacionado con el gen de la calcitonina es un miembro de la familia calcitonina de péptidos, que en los seres humanos existe en dos formas, α-CGRP (un péptido de 37 aminoácidos) y β-CGRP. CGRP tiene un 43-46 % de identidad de secuencia con la amilina humana. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen CGRP pueden encontrar un uso particular en la disminución de la morbilidad asociada a la diabetes, la mejora de la hiperglucemia y la deficiencia de insulina, la inhibición de la infiltración linfocítica en los islotes y la protección de las células beta contra la destrucción autoinmunitaria. Se describen métodos para hacer CGRP sintético y recombinante en la patente de los EE.UU. N.º 5.374.618.

"Colecistocinina" o "CCK" significa el péptido CCK humano y especies y variantes de secuencia del mismo que tienen al menos una parte de la actividad biológica de la CCK madura. CCK-58 es la secuencia madura, mientras

55 que la secuencia de aminoácidos de CCK-33 identificada primero en los seres humanos es la principal forma circulante del péptido. La familia CCK también incluye un fragmento C-terminal in vivo en de 8 aminoácidos ("CCK8"), siendo la pentagastrina o CCK-5 el péptido CCK(29-33) C-terminal y siendo CCK-4 el tetrapéptido terminal CCK(30-33). La CCK es una hormona peptídica del sistema gastrointestinal responsable de estimular la digestión de grasas y proteínas. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen CCK-33 y CCK-8 pueden encontrar un uso particular en la reducción del aumento de la glucosa circulante después de la ingestión de alimentos y en la potenciación del aumento de la insulina circulante. Se han preparado análogos de CCK-8, como se describe en la patente de los EE.UU. N.º 5.631.230.

"Exendina-3" significa un péptido regulador de la glucosa aislado de Heloderma horridum y variantes de secuencia

65 del mismo que tienen al menos una parte de la actividad biológica de la exendina-3 madura. La exendina-3 amida es una forma antagonista específica del receptor de la exendina que media un aumento del AMPc pancreático y la

39

imagen32

de liberación de GH de la grelina. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen grelina pueden encontrar un uso particular como agonistas; por ejemplo, para estimular selectivamente la motilidad del tracto Gl en un trastorno de la motilidad gastrointestinal, para acelerar el vaciado gástrico o para estimular la liberación de hormona del crecimiento. Los análogos de grelina con sustituciones de secuencia o variantes 5 truncadas, tales como los descritos en la patente de los EE.UU. N.º 7.385.026, pueden encontrar un uso particular como compañeros de fusión a XTEN para su uso como antagonistas para mejorar la homeostasis de la glucosa, para el tratamiento de la resistencia a la insulina y para el tratamiento de la obesidad. El aislamiento y la caracterización de la grelina se ha publicado (Kojima M, et al., Ghrelin is a growthhormonereleasing acylated peptide from stomach. Nature. 1999; 402 (6762): 656-660) y se han preparado análogos sintéticos mediante síntesis

10 peptídica, como se describe en la patente de los EE.UU. N.º 6.967.237.

"Glucagón" significa el péptido regulador de la glucosa glucagón humano o especies y variantes de secuencia del mismo, incluyendo la secuencia de 29 aminoácidos nativa y secuencias homólogas; variantes de secuencia naturales, tales como de primates y las no naturales que tienen al menos una parte de la actividad biológica del 15 glucagón maduro. El término "glucagón", como se usa en el presente documento también incluye peptidomiméticos de glucagón. El glucagón natural es producido por el páncreas, se libera cuando los niveles de glucosa en sangre empiezan a caer demasiado, haciendo que el hígado convierta el glucógeno almacenado en glucosa y la libere en el torrente sanguíneo. Si bien la acción del glucagón es opuesta a la de la insulina, que indica a las células del cuerpo que tomen la glucosa de la sangre, el glucagón también estimula la liberación de insulina, de manera que se pueda

20 captar la glucosa recién disponibles en el torrente sanguíneo y se utilice por la insulina dependiente de tejidos. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen glucagón pueden encontrar un uso particular, en el aumento de los niveles de glucosa en sangre en las personas con reservas existentes de glucógeno hepático y el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. El glucagón se ha clonado, como se describe en la patente de los EE.UU. N. º 4.826.763.

25 "GLP-1" significa péptido similar al glucagón humano-1 y variantes de secuencia del mismo que tienen al menos una parte de la actividad biológica del GLP-1 maduro. El término "GLP-1" incluye GLP-1(1-37), GLP-1(7-37) y GLP-1(736)amida humanos. El GLP-1 estimula la secreción de insulina, pero solo durante los períodos de hiperglucemia. La seguridad de GLP-1 en comparación con la insulina se ve reforzada por esta propiedad y por la observación de que

30 la cantidad de insulina secretada es proporcional a la magnitud de la hiperglucemia. La semivida biológica del GLP-1(7-37)OH es de solo 3 a 5 minutos (Pat. de los EE.UU. N.º 5.118.666). Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen GLP-1 pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la diabetes y de los trastornos de resistencia a la insulina para la regulación de la glucosa. El GLP-1 se ha clonado y se han preparado derivados, como se describe en la patente de los EE.UU. N.º 5.118.666. Se muestran ejemplos no limitantes de

35 secuencias de GLP-1 de una amplia diversidad de especies en la Tabla 4, mientras que la Tabla 5 muestra las secuencias de una serie de análogos de GLP-1 sintéticos; todos los cuales se incluyen para su uso en las composiciones de BPXTEN descritas en el presente documento.

Tabla 4: homólogos de origen natural de GLP-1

Nombre del gen: SEQ ID NO: Secuencia

GLP-1 [rana]: 48 HAEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGKPKKIRYS

GLP-1a [Xenopus laevis]: 49 HAEGTFTSDVTQQLDEKAAKEFIDWLINGGPSKEIIS

GLP-1b [Xenopus laevis]: 50 HAEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIIEWLIKGKPK

GLP-1c [Xenopus laevis]: 51 HAEGTFTNDMTNYLEEKAAKEFVGWLIKGRPK

Polipéptido inhibidor gástrico [Mus musculus]: 52 HAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLL

Polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa [Equus]: 53 HAEGTFISDYSIAMDKlRQQDFVNWLL

Péptido similar al glucagón [Petromyzon marinus]: 54 HADGTFTNDMTSYLDAKAARDFVSWLARSDKS

Péptido similar al glucagón [Anguilla rostrata]: 55 HAEGTYTSDVSSYLQDQAAKEFVSWLKTGR

Péptido similar al glucagón [Anguilla anguilla]: 56 HAEGTYTSDVSSYLQDQAAKEFVSWLKTGR

Péptido similar al glucagón [Hydrolagus colliei]: 57 HADGIYTSDVASLTDYLKSKRFVESLSNYNKRQNDRRM

Péptido similar al glucagón [Amia calva]: 58 YADAPYISDVYSYLQDQVAKKWLKSGQDRRE

GLUCJCTPU/38-65: 59 HADGTYTSDVSSYLQEQAAKDFITWLKS

GLUCL_ANGRO/1-28: 60 HAEGTYTSDVSSYLQDQAAKEFVSWLKT

GLUC_BOVIN/98-125: 61 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK

GLUC1_LOPAM/91-118: 62 HADGTFTSDVSSYLKDQAIKDFVDRLKA

GLUCL_HYDCO/1-28: 63 HADGIYTSDVASLTDYLKSKRFVESLSN

GLUC_CAVPO/53-80: 64 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQQFLKWLLN

GLUC_CHIBR/1-28: 65 HSQGTFTSDYSKHLDSRYAQEFVQWLMN

GLUC_LOPAM/53-80: 66 HSEGTFSNDYSKYLEDRKAQEFVRWLMN

GLUC_HYDCO/1-28: 67 HTDGIFSSDYSKYLDNRRTKDFVQWLLS

GLUC_CALMI/1-28: 68 HSEGTFSSDYSKYLDSRRAKDFVQWLMS

GIP_BOVIN/1-28: 69 YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLA

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VIP_MELGA/89-116: 70 HADGIFTTVYSHLLAKLAVKRYLHSLIR

PACA_CHICK/131-158: 71 HIDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLG

VIP CAVPO/45-72: 72 HSDALFTDTYTRLRKQMAMKKYLNSVLN

VIP DIDMA/1-28: 73 HSDAVFTDSYTRLLKQMAMRKYLDSILN

EXE1 HELSU/1-28: 74 HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILG

SLIB_CAPHI/1-28: 75 YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMN

SLIB_ RAT/31-58: 76 HADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIΜN

SLIB_MOUSE/31-58: 77 HVDAIFTTNYRKLLSQLYARKVIQDIMN

PACA_HUMAN/83-110: 78 VAHGILNEAYRKVLDQLSAGKHLQSLVA

PACA_SHEEP/83-110: 79 VAHGILDKAYRKVLDQLSARRYLQTLMA

P ACA_ONCNE/82-109: 80 HADGMFNKAYRKALGQLSARKYLHSLMA

GLUC_BOVIN/146-173: 81 HADGSFSDEMNTVLDSLATRDFINWLLQ

SECR_CANFA/1 -27: 82 HSDGTFTSELSRLRESARLQRLLQGLV

SECR_CHICK/1-27: 83 HSDGLFTSEYSKMRGNAOVQKFIQNLM

EXE3_HELHO/48-75: 84 HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN

Pueden describirse secuencias nativas de GLP mediante varios motivos de secuencia, que se presentan a continuación. Las letras entre corchetes representan aminoácidos aceptables en cada posición de la secuencia: [HVY] [AGISTV] [DEHQ] [AG] [ILMPSTV] [FLY] [DINST] [ADEKNST] [ADENSTV] [LMVY] [ANRSTY] [EHIKNQRST]

5 [AHILMQVY] [LMRT] [ADEGKQS] [ADEGKNQSY] [AEIKLMQR] [AKQRSVY] [AILMQSTV] [GKQR] [DEKLQR] [FHLVWY] [ILV] [ADEGHIKNQRST] [ADEGNRSTW] [GILVW] [AIKLMQSV] [ADGIKNQRST] [GKRSY]. Además, pueden ser útiles análogos sintéticos de GLP-1 como compañeros de fusión a XTEN para crear BPXTEN con actividad biológica útil en el tratamiento de trastornos relacionados con la glucosa. Pueden encontrarse secuencias adicionales homólogas a exendina-4 o GLP-1 mediante técnicas de búsqueda de homología convencionales.

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Tabla 5: Análogos sintéticos de GLP-1

SEQ ID NO:: Secuencia

85: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVKGRG

86: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG

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179: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVRGKGK

"GLP-2" significa péptido similar a glucagón humano-2 y variantes de secuencia del mismo que tienen al menos una

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parte de la actividad biológica del GLP-2 maduro. Más en particular, GLP-2 es un péptido de 33 aminoácidos, cosecretado junto con GLP-1 desde las células endocrinas intestinales en el intestino delgado y grueso.

"IGF-1" o "factor de crecimiento similar a la insulina 1" significa la proteína IGF-1 humana y especies y variantes de

5 secuencia de la misma que tienen al menos una parte de la actividad biológica del IGF-1 maduro. El IGF-1, que una vez se llamó somatomedina C, es una hormona anabólica proteica polipeptídica similar en estructura molecular a la insulina y que modula la acción de la hormona del crecimiento. El IGF-1 consiste en 70 aminoácidos y se produce principalmente en el hígado como una hormona endocrina, así como en los tejidos diana de una forma paracrina/autocrina. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen IGF-1 pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la diabetes y de los trastornos de la resistencia a la insulina para la regulación de la glucosa. El IGF-1 se ha clonado y expresado en E. coli y en levadura, como se describe en la Patente de los EE.UU. N.º 5.324.639.

"IGF-2" o "factor de crecimiento similar a la insulina 2" significa la proteína IGF-2 humana y especies y variantes de

15 secuencia de la misma que tienen al menos una parte de la actividad biológica del IGF-2 maduro. El IGF-2 es una hormona proteica polipeptídica similar en estructura molecular a la insulina, con un papel principal como hormona promotora del crecimiento durante la gestación. El IGF-2 se ha clonado, como se describe en Bell Gl, et al. Isolation of the human insulinlike growth factor genes: insulinlike growth factor II and insulin genes are contiguous. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82(19):6450-4.

"INGAP" o "proteína asociada a la neogénesis de los islotes" o "factor de crecimiento de células beta pancreáticas" significa el péptido INGAP humano y especies y variantes de secuencia del mismo que tienen al menos una parte de la actividad biológica de INGAP madura. La INGAP es capaz de iniciar la proliferación de las células del conducto, un requisito previo para la neogénesis de los islotes. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que

25 contienen INGAP pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la diabetes y de los trastornos de la resistencia a la insulina. La INGAP se ha clonado y expresado, como se describe en R Rafaeloff R, et al., Cloning and sequencing of the pancreatic islet neogenesis associated protein (INGAP) gene and its expression in islet neogenesis in hamsters. J Clin Invest. 1997. 99 (9): 2100-2109.

"Intermedina" o "AFP-6" significa el péptido humano intermedina y especies y variantes de secuencia del mismo que tienen al menos una parte de la actividad biológica de intermedina maduro. La intermedina es un ligando para el receptor similar al receptor de la calcitonina. El tratamiento con intermedina conduce a la reducción de la presión sanguínea tanto en los sujetos normales como en los hipertensos, así como la supresión de la actividad de vaciado gástrico y está implicada en la homeostasis de la glucosa. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones

35 que contienen intermedina pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la diabetes, los trastornos de la resistencia a la insulina y la obesidad. Se han clonado péptidos y variantes de la intermedina, como se describe en la patente de los EE.UU. N.º 6.965.013.

"Leptina" significa la leptina de origen natural procedente de cualquier especie, así como isoformas D o fragmentos biológicamente activos y variantes de secuencia de los mismos. La leptina desempeña un papel clave en la regulación de la ingesta de energía y del gasto de energía, incluyendo el apetito y el metabolismo. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen leptina pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la diabetes para la regulación de la glucosa, los trastornos de la resistencia a la insulina y la obesidad. La leptina es el producto polipeptídico del gen ob como se describe en la Publicación de Patente Internacional. N.º WO 96/05309.

45 La leptina se ha clonado, como se describe en la patente de los EE.UU. N.º 7.112.659 y análogos y fragmentos de leptina en la patente de los EE.UU. N.º 5.521.283, la patente de los EE.UU. N.º 5.532.336, el documento PCT/US96/22308 y el documento PCT/US96/01471.

"Neuromedina" significa la familia neuromedina de péptidos incluyendo los péptidos neuromedina U y S y la secuencia de variantes de los mismos. La hormona peptídica neuromedina U humana activa nativa es la neuromedina-U25, en particular su forma de amida. Son de particular interés sus hormonas y análogos peptídicos activos procesados, los derivados y fragmentos de los mismos. Se incluyen en la familia neuromedina U diversas variantes truncadas o de corte y empalme, por ejemplo, FLFHYSKTQKLGKSNWEELQSPFASQSRGYFLFRPRN (SEQ ID NO: 180). Es un ejemplo de la familia neuromedina S es la neuromedina S humana con la secuencia

55 ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN (SEQ ID NO: 181), en particular su forma amida. Las proteínas de fusión neuromedinas de las presentes composiciones pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la obesidad, la diabetes, la reducción de la ingesta de alimentos y otras afecciones y trastornos relacionados como se describe en el presente documento. Son de particular interés módulos de neuromedina combinados con un péptido de la familia amilina, un péptido de la familia exendina o un módulo de la familia del péptido GLP-1.

"Oxintomodulina" o "OXM" significa oxintomodulina humana y especies y variantes de secuencia de la misma que tienen al menos una parte de la actividad biológica de la OXM madura. La OXM es un péptido de 37 aminoácidos producido en el colon que contiene la secuencia de 29 aminoácidos del glucagón seguida de una extensión carboxiterminal de 8 aminoácidos. Se ha descubierto que la OXM suprime el apetito. Las proteínas de fusión de las 65 presentes composiciones que contienen OXM pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de la diabetes para la regulación de la glucosa, los trastornos de la resistencia a la insulina, la obesidad y puede utilizarse como

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implicados en la homeostasis de la glucosa con frecuencia tienen un marco terapéutico estrecho. El marco terapéutica estrecho, junto con el hecho de que dichas hormonas y péptidos normalmente tienen una semivida corta que requiere una dosificación frecuente con el fin de lograr el beneficio clínico, dan como resultado dificultades en el tratamiento de estos pacientes. Por tanto, sigue existiendo una necesidad de agentes terapéuticos con una mayor

5 eficacia y seguridad en el tratamiento de enfermedades metabólicas.

Por tanto, un aspecto de la presente invención es la incorporación de proteínas metabólicas biológicamente activas involucradas o utilizadas en el tratamiento de enfermedades y trastornos metabólicos y cardiovasculares en proteínas de fusión BPXTEN para crear composiciones con utilidad en el tratamiento de dichos trastornos, 10 enfermedades y afecciones relacionadas. Las proteínas metabólicas pueden incluir cualquier proteína de interés o función biológica, terapéutica o profiláctica que sea útil para prevenir, tratar, mediar o mejorar una enfermedad, trastorno o afección metabólica o cardiovascular. La Tabla 6 proporciona una lista no limitante de dichas secuencias de BP metabólicas que están incluidas en las proteínas de fusión BPXTEN de la divulgación. Las proteínas metabólicas de las composiciones de BPXTEN de la invención pueden ser una proteína que presente al menos

15 aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia o como alternativa el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87%, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97%, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de proteína seleccionada de la Tabla 6.

Tabla 6: Proteínas biológicamente activas para trastornos metabólicos y cardiología

Nombre de la proteína (sinónimo): Secuencia SEC ID N.º

Anti-CD3: Véase las Patentes de los EE.UU. N.º 5.885.573 y 6.491.916

IL-1ra, humana de longitud completa: 1723

IL-1ra, de perro: 1724

IL-1ra, de conejo: 1725

IL-1ra, de rata: 1726

IL-1ra, de ratón: 1727

Anakinra: 1728

Péptido α-natriurético (ANP): SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY 1729

Péptido β-natriurético, humano (BNP humano): SPKMVQGSGGFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH 1730

Péptido natriurético cerebral, de rata; (BNP de rata): NSKMAHSSSCFGQKIDRIGAVSRLGCDGLRLF 1731

Péptido natriurético de tipo C (CNP, porcino): GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC 1732

Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2): 1733

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"Anti-CD3" significa el anticuerpo monoclonal contra la proteína de superficie de linfocitos T CD3, especies y variantes de secuencia y fragmentos del mismo, incluyendo OKT3 (también llamado muromonab) y anticuerpo monoclonal anti-CD3 humanizado (hOKT31 (Ala-Ala)) (KC Herold et al., New England Journal of Medicine 346:16925 1698, 2002). El anti-CD3 evita la activación y proliferación de linfocitos T mediante la unión al complejo receptor de linfocitos T presente en todos los linfocitos T diferenciados. Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen anti-CD3 pueden encontrar un uso particular para retardar la nueva aparición de diabetes de tipo 1, incluyendo el uso de los anti-CD3 como efectores terapéuticos, así como un resto de dirección para una segunda BP terapéutica en la composición BPXTEN. Las secuencias para la región variable y la creación de anti-CD3 se han

10 descrito en las Patentes de los EE.UU. N.º 5.885.573 y 6.491.916.

"IL-1ra" significa la proteína antagonista del receptor de IL-1 humana y especies y variantes de secuencia de la misma, incluyendo la variante de secuencia anakinra (Kineret®), que tiene al menos una parte de la actividad biológica de IL-1ra madura. La IL-1ra humana es una glicoproteína madura de 152 restos de aminoácidos. La acción 15 inhibidora de IL-1ra es resultado de su unión con el receptor de IL-1 de tipo I. La proteína tiene un peso molecular nativo de 25 kDa y la molécula de muestra homología de secuencia limitada a IL-1α (19 %) y a IL-1β (26 %). El anakinra es una la IL-1ra humana recombinante no glucosilada y difiere de la IL-1ra humana endógeno por la adición de una metionina N-terminal. Una versión comercializada de anakinra se comercializa como Kineret. Se une con la misma avidez al receptor de IL-1 como la IL-1ra y la IL-1b nativas, pero no da como resultado la activación del

20 receptor (transducción de señales), un efecto atribuido a la presencia de un solo motivo de unión a receptor en IL1ra frente a dos de dichos motivos en IL-1α e IL-1β. El anakinra tiene 153 aminoácidos y 17,3 kD de tamaño y tiene una semivida notificada de aproximadamente 4-6 horas.

Se ha notificado el aumento de la producción de IL-1 en pacientes con diversas infecciones virales, bacterianas,

25 fúngicas y parasitarias; coagulación intravascular; terapia con altas dosis de IL-2; tumores sólidos; leucemias; enfermedad de Alzheimer; infección por VIH-1; trastornos autoinmunes; traumatismo (cirugía); hemodiálisis; enfermedades isquémicas (infarto de miocardio); hepatitis no infecciosa; asma; radiación UV; traumatismo craneal contuso; pancreatitis; peritonitis; enfermedad de injerto contra hospedador; rechazo de trasplantes; y en sujetos sanos después de un ejercicio extenuante. Existe una asociación entre el aumento de la producción de IL-1b en

30 pacientes con enfermedad de Alzheimer y un posible papel de la IL 1 en la liberación de la proteína precursora de amiloide. También se ha asociado a la IL-1 con enfermedades tales como la diabetes de tipo 2, la obesidad, la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la diabetes de tipo 1, la resistencia a la insulina, los procesos neurodegenerativos de la retina, las patologías y afecciones caracterizadas por la resistencia a la insulina, el infarto agudo de miocardio (IAM), el síndrome coronario agudo (SCA), la ateroesclerosis, los trastornos inflamatorios crónicos, la artritis

35 reumatoide, la enfermedad degenerativa de los discos intervertebrales, la sarcoidosis, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la diabetes gestacional, el apetito excesivo, la saciedad insuficiente, los trastornos metabólicos, los glucagonomas, los trastornos de secreción de las vías respiratorias, la osteoporosis, las enfermedades del sistema nervioso central, la reestenosis, las enfermedades neurodegenerativas, la insuficiencia renal, la insuficiencia cardíaca congestiva, el síndrome nefrótico, la cirrosis, el edema pulmonar, la hipertensión, los trastornos en donde

40 se desea la reducción de la ingesta de alimentos, el síndrome del intestino irritable, el infarto de miocardio, el ictus, los cambios catabólicos posquirúrgicos, el miocardio hibernado, la miocardiopatía diabética, la insuficiencia de la excreción urinaria de sodio, la excesiva concentración urinaria de potasio, afecciones o trastornos asociados a la hipervolemia tóxica, el síndrome de ovario poliquístico, la dificultad respiratoria, las úlceras crónicas de la piel, la nefropatía, la disfunción sistólica del ventrículo izquierdo, la diarrea gastrointestinal, el síndrome de evacuación

45 gástrica rápida postoperatoria, el síndrome del intestino irritable, la polineuropatía de la enfermedad crítica (PNEC), el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), la dislipidemia, la lesión por reperfusión después de la isquemia y el síndrome de factor de riesgo de la cardiopatía coronaria (FRCC). Las proteínas de fusión de las presentes composiciones que contienen IL-1ra pueden encontrar un uso particular en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades y trastornos anteriores. La IL-1ra se ha clonado, como se describe en las patentes de los EE.UU.

50 N.º 5.075.222 y 6.858.409.

"Péptidos natriuréticos" significa el péptido natriurético atrial (ANP), el péptido natriurético cerebral (BNP o péptido natriurético de tipo B) y el péptido natriurético de tipo C (CNP); especies tanto humanas como no humanas y variantes de secuencia de los mismos que tienen al menos una parte de la actividad biológica de los péptidos 55 natriuréticos homólogos maduros. El péptido natriurético atrial alfa (AANP) o (ANP) y el péptido natriurético cerebral (BNP) y el péptido natriurético de tipo C (CNP) son hormonas polipeptídicas homólogas que participan en la regulación de la homeostasis de líquidos y electrolitos. Las secuencias de formas útiles de péptidos natriuréticos se desvelan en la Publicación de Patente de los EE.UU. 20010027181. Los ejemplos de ANP incluyen el ANP humano (Kangawa et al., BBRC 118:131 (1984)) o el de diversas especies, incluyendo el ANP de cerdos y de rata (Kangawa 60 et al., BBRC 121:585 (1984)). El análisis de secuencia revela que preproBNP consiste en 134 restos y se escinde a

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así como la prevención de la hemorragia en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en los pacientes con hemofilia A o B con inhibidores de FVIII o FIX. Además, el factor VIIa puede utilizarse en el tratamiento de episodios hemorrágicos en pacientes con deficiencia congénita de factor VII y la prevención de hemorragias en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con deficiencia congénita de FVII. Sin embargo, 5 la administración intravenosa de productos que contienen factor VIIa puede conducir a efectos secundarios que incluyen episodios trombóticos, fiebre y reacciones en el sitio de inyección. Además, la corta semivida del Factor VIIa de aproximadamente 2 horas, limita su aplicación y puede requerir inyecciones repetidas cada 2-4 horas para conseguir la hemostasia. Por tanto, sigue existiendo una necesidad de composiciones del factor IX y el factor VIIa con semivida prolongada y retención de la actividad cuando se administran como parte de un régimen preventivo y/o

10 terapéutico para la hemofilia B, así como formulaciones que reduzcan los efectos secundarios y puedan administrarse tanto por vía intravenosa como subcutánea.

Los factores de la coagulación para su inclusión en las BPXTEN de las presentes composiciones pueden incluir proteínas de interés o función biológica, terapéutica o profiláctica que sean útiles para prevenir, tratar, mediar o

15 mejorar trastornos, enfermedades o deficiencias de la coagulación sanguínea. Las proteínas de la coagulación adecuados incluyen polipéptidos biológicamente activos que están implicados en la cascada de coagulación como sustratos, enzimas o cofactores.

La Tabla 7 proporciona una lista no limitante de secuencias de factores de la coagulación que están incluidos en las

20 proteínas de fusión BPXTEN de la divulgación. Los factores de la coagulación para su inclusión en las BPXTEN de las presentes composiciones pueden ser una proteína que presente al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia, o, como alternativa, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %,el 90%, el 91%, el 92%, el 93 %,el 94 %,el 95%,el 96%, el97%, el98 %, el99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de proteína seleccionada de la Tabla 7.

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Factor IX, tales como las secuencias de ejemplo de la Tabla 7, así como cualquier proteína o polipéptido sustancialmente homólogos al mismo cuyas propiedades biológicas dan como resultado la actividad del Factor IX. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "resto de Factor IX" incluye proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida, o accidentalmente a través de mutaciones, que

5 dan como resultado una secuencia del factor IX que conserva al menos alguna actividad del factor IX. La expresión "resto de Factor IX" incluye también los derivados que tienen al menos un aminoácido adicional en los extremos N o carboxi terminales de la proteína o interno a la secuencia de restos de Factor IX. Los ejemplos no limitantes de restos de Factor IX incluyen los siguientes: Factor IX; Factor IXa; versiones truncadas del Factor IX; proteínas híbridas y peptidomiméticos que tienen la actividad del Factor IX. Los fragmentos biológicamente activos, las variantes de deleción, las variantes de sustitución o las variantes de adición de cualquiera de los anteriores que mantengan al menos algún grado de actividad de Factor IX o el potencial para la activación también pueden servir como una secuencia de Factor IX.

"Factor VII" (FVII) significa la proteína humana y especies y variantes de secuencias de la misma que tienen al

15 menos una parte de la actividad biológica del Factor VII activado. El Factor VII y el Factor VIIa recombinante humano se han introducido para su uso en la hemorragia incontrolable en pacientes con hemofilia (con deficiencia de Factor VIII o IX) que han desarrollado inhibidores contra el factor de la coagulación de reemplazo. El Factor VII puede activarse por la trombina, el Factor IXa, el Factor Xa o el Factor XIIa a FVIIa. El FVII se convierte en su forma activa, Factor VIIa, mediante la proteolisis del único enlace peptídico en Arg152-Ile153 conduciendo a la formación de dos cadenas polipeptídicas, una cadena ligera N-terminal (24 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. Al contrario que para otros factores de la coagulación dependientes de vitamina K, no se ha descrito ningún péptido de activación, que se retira por escisión durante la activación de estos otros factores de la coagulación dependientes de vitamina K, para el FVII. El sitio de escisión Arg152-lle153 y algunos aminoácidos corriente abajo muestran homología con el sitio de escisión de activación de otros polipéptidos

25 dependientes de vitamina K. El factor humano recombinante VIIa tiene utilidad en el tratamiento de la hemorragia incontrolable en pacientes con hemofilia (con deficiencia de Factor VIII o IX), incluidos los que han desarrollado inhibidores contra el factor de la coagulación de reemplazo. El FVII deberá ser cualquier forma de molécula del Factor VII con las características típicas del Factor VII de la coagulación sanguínea. El FVII incluirá FVII de plasma y cualquier forma de FVII recombinante que sea capaz de mejorar trastornos hemorrágicos en un paciente; por ejemplo, provocados por deficiencias en FVII/FVIIa. En algunas realizaciones, el péptido FVII es la forma activada (FVIIa), un análogo estructural o peptidomimético de cualquiera de los péptidos de FVII descritos en el presente documento, incluyendo las secuencias de la Tabla 7. Se han clonado el Factor VII y el Factor VIIa, como se describe en la Patente de los EE.UU. N.º 6.806.063 y Solicitud de Patente de los EE.UU. N.º 20080261886.

35 En un aspecto, la divulgación proporciona proteínas de fusión BPXTEN monoméricas de FIX que comprenden la secuencia de longitud completa o fragmentos activos o variantes de secuencia o cualquier derivado biológicamente activo del FIX, incluyendo las secuencias de FIX de la Tabla 7, unidos covalentemente a un XTEN, para crear una molécula quimérica. En algunos casos, las proteínas de fusión que comprenden un factor de la coagulación como FIX, comprenden además una o más secuencias de sitios de escisión proteolítica. En otra realización, la proteína de fusión comprende una primera y una segunda secuencia de escisión diferentes. En una realización de lo anterior, la secuencia o secuencias de escisión se seleccionan de la Tabla 10. En los casos en que la presencia del XTEN inhibe la activación del FIX a la forma activada del FIX (en los sucesivo en el presente documento "FIXa") (por ejemplo, en donde el XTEN está unido al extremo C del FIX), el uno o más sitios de escisión proteolítica permiten la liberación de la secuencia de XTEN cuando actúa sobre ellos una proteasa, tal como se describe con más detalle a

45 continuación. En una característica de lo anterior, la composición FIX-XTEN intacta sirve como un profármaco y la liberación del XTEN de la molécula de FIX-XTEN por proteolisis permite que la secuencia liberada del FIX se convierta en FIXa. En una realización, la una o más secuencias de escisión pueden ser una secuencia que tenga al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de la Tabla 10, o al menos aproximadamente el 85 %, o al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 96 %, o al menos aproximadamente el 97 %, o al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de la Tabla 10.

Las proteínas de fusión FIX-XTEN pueden diseñarse en diferentes configuraciones. En una realización, como se ilustra en la FIG. 37A, las proteínas de fusión comprenden componentes en el siguiente orden (del extremo N al C): 55 FIX; y XTEN, en donde el XTEN puede comprender una secuencia de escisión interna a la secuencia de XTEN. En otra realización, como se ilustra en la FIG. 37B, las proteínas de fusión comprenden componentes en el siguiente orden (del extremo N al C): FIX; secuencia de escisión; y XTEN. En algunos casos, como se ilustra en la FIG. 37C y 37D, las proteínas de fusión comprenden componentes en donde el XTEN se encuentra interno al polipéptido FIX, insertado entre los dominios FIX. En una realización, el extremo N del XTEN está unido al extremo C del dominio Gla del FIX y el extremo C del XTEN está unido al extremo N del dominio EGF1 del FIX, dando como resultado un FIX-XTEN donde no se introducen secuencias de escisión adicionales, como se muestra en la FIG. 37C. En otra realización, el extremo N del XTEN está unido al extremo C del dominio EGF1 del FIX y el extremo C del XTEN está unido al extremo N del dominio EGF2 del FIX, dando como resultado un FIX-XTEN donde no se introducen secuencias de escisión adicionales, como se muestra en la FIG. 37C. En otra realización, en la que la secuencia del 65 Factor IX comprende un dominio de péptido de activación que comprende una secuencia PDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDF (SEQ ID NO: 1748), los extremos N y C de la secuencia de XTEN puede

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(d) Proteínas de la hormona del crecimiento

"Hormona del crecimiento" o "GH" significa la proteína de la hormona del crecimiento humana y especies y variantes de secuencia de la misma, e incluye, pero no se limita a, la secuencia de 191 aminoácidos monocatenaria de la GH. 5 Por tanto, la GH puede ser la proteína de longitud completa nativa o puede ser un fragmento truncado o una variante de secuencia que conserva al menos una parte de la actividad biológica de la proteína nativa. Los efectos de la GH en los tejidos del cuerpo en general pueden describirse como anabólicos. Como la mayoría de las demás hormonas proteicas, la GH actúa mediante la interacción con un receptor de membrana plasmática específico, denominado receptor de la hormona del crecimiento. Existen dos tipos conocidos de GH humana (en adelante en el presente 10 documento "hGH") derivados de la glándula pituitaria: uno que tiene un peso molecular de aproximadamente 22.000 Dalton (hGH 22 kD) y el otro que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Dalton (hGH 20 kD). La hGH 20 Kd tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la hGH 22 kD que consiste en 191 aminoácidos a excepción de que faltan los 15 restos de aminoácidos del 32º al 46º de la hGH 22 kD. Algunos informes han demostrado que se ha descubierto que la hGH 20 kD presenta menores riesgos y mayor actividad que hGH 22 kD.

15 La divulgación también contempla el uso de la hGH 20 kD como adecuada para su uso como un polipéptido biológicamente activo para composiciones de BPXTEN en el presente documento.

La invención contempla la inclusión en la BPXTEN de cualesquier secuencias homólogas de GH, fragmentos de secuencias que son naturales, tales como de primates, mamíferos (incluyendo animales domésticos) y variantes de 20 secuencia no naturales que conservan al menos una parte de la actividad biológica o función biológica de la GH y/o que son útiles para prevenir, tratar, mediar o mejorar una enfermedad, deficiencia, trastorno o afección relacionados con la GH. Se describen bien en la bibliografía secuencias de GH de no mamíferos. Por ejemplo, puede encontrarse una alineación de secuencia de la GH de pescado en Genetics and Molecular Biology 2003 26 págs. 295-300. Un análisis de la evolución de las secuencias de la GH aviar se presenta en el Journal of Evolutionary Biology 2006 19

25 págs. 844-854. Además, pueden encontrarse secuencias nativas homólogas a la GH humana mediante técnicas de búsqueda de homología convencionales, tales como NCBI BLAST.

En una realización, la GH incorporada en las presentes composiciones puede ser un polipéptido recombinante con una secuencia que corresponde a una proteína que se encuentra en la naturaleza. En otra realización, la GH puede 30 ser una variante de secuencia, fragmento, homólogo o un mimético de una secuencia natural que conserva al menos una parte de la actividad biológica de la GH nativa. La Tabla 8 proporciona una lista no limitante de secuencias de GH de una amplia diversidad de especies de mamíferos que están incluidas en las proteínas de fusión BPXTEN de la invención. Cualquiera de estas secuencias de GH o derivados homólogos construidos por redistribución de las mutaciones individuales entre especies o familias pueden ser útiles para las proteínas de fusión de la presente

35 invención. La GH que puede incorporarse en una proteína de fusión BPXTEN puede incluir una proteína que presenta al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia o como alternativa el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86%, el 87 %, el 88%, el 89%, el 90%, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %; o el 100 % de identidad de secuencia con una proteína seleccionada de la Tabla 8.

40 Tabla 8: Secuencias de aminoácidos de la hormona de crecimiento de especies animales

GH de especie: Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.

Hombre: imagen42 1750

Cerdo: imagen43 1751

Alpaca: imagen44 1752

Camello: imagen45 1753

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Caballo: imagen46 1754

Elefante: imagen47 1755

Zorro rojo: imagen48 1756

Perro: imagen49 1757

Gato: imagen50 1758

Visón americano: imagen51 1759

Ballena jorobada: imagen52 1760

Delfín: imagen53 1761

Hipopótamo: imagen54 1762

Conejo: imagen55 1763

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Rata: imagen57 1764

Ratón: imagen58 1765

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Hámster: imagen59 1766

Rata topo: imagen60 1767

Cobaya: imagen61 1768

Buey: imagen62 1769

Oveja/cabra: imagen63 1770

Ciervo rojo: imagen64 1771

Jirafa: imagen65 1772

Ciervo ratón-1: imagen66 1773

Lorí perezoso: imagen67 1774

Mono tití: imagen68 1775

Zarigüeya de cola corta: imagen69 1776

Mono (macaco de la India): imagen70 1777

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realización, el espaciador comprende una o más secuencias peptídicas que tienen entre 1-50 restos de aminoácidos de longitud o aproximadamente 1-25 restos o aproximadamente 1-10 restos de longitud. Las secuencias espaciadoras, excluyendo los sitios de escisión, pueden comprender cualquiera de los 20 aminoácidos L naturales y comprenderán preferentemente aminoácidos hidrófilos que están impedidas estéricamente que pueden incluir, pero 5 no se limitan a, glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P). En algunos casos, el espaciador puede ser poliglicinas o polialaninas o es predominantemente una mezcla de combinaciones de restos de glicina y alanina. El polipéptido espaciador excluyendo una secuencia de escisión es en gran parte para sustancialmente desproveer de estructura secundaria. En una realización, una o ambas secuencias espaciadoras en una composición de proteína de fusión BPXTEN pueden contener cada una adicionalmente una secuencia de

10 escisión, que pueden ser idénticas o pueden ser diferentes, en donde sobre la secuencia de escisión puede actuar una proteasa para liberar la BP de la proteína de fusión.

En algunos casos, la incorporación de la secuencia de escisión en la BPXTEN se diseña para permitir la liberación de una BP que se convierte en activa o más activa tras su liberación del XTEN. Las secuencias de escisión están 15 situadas suficientemente cerca de las secuencias de BP, generalmente dentro de 18 o dentro de 12 o dentro de 6 o dentro de 2 aminoácidos de la secuencia terminal BP, de manera que cualesquier restos restantes unidos a la BP después de la escisión no interfieren apreciablemente con la actividad (por ejemplo, tal como la unión a un receptor) de la BP, sino que proporcionan un acceso suficiente a la proteasa para que sea capaz de efectuar la escisión de las secuencias de escisión. En algunas realizaciones, el sitio de escisión es una secuencia que puede ser escindida por 20 una proteasa endógena para el sujeto mamífero de manera que la BPXTEN pueda escindirse después de la administración a un sujeto. En dichos casos, la BPXTEN puede servir como profármaco o depósito circulante para la BP. Los ejemplos de sitios de escisión contemplados por la invención incluyen, pero no se limitan a, una secuencia polipeptídica escindible por una proteasa endógena de mamífero seleccionada entre FXIa, FXIIa, calicreína, FVIIa, FIXa, FXa, FIla (trombina), elastasa-2, granzima B, MMP-12, MMP-13, MMP-17 o MMP-20 o por proteasas de no 25 mamíferos tales como TEV, enterocinasa, proteasa PreScission™ (proteasa del rinovirus 3C) y sortasa A. Se conocen en la técnica secuencias que se sabe que son escindidas por las proteasas anteriores. Se presentan secuencias de escisión y sitios de corte de ejemplo dentro de las secuencias en la Tabla 10, así como variantes de secuencia. Por ejemplo, la trombina (factor de la coagulación II activado) actúa sobre la secuencia LTPRSLLV (SEQ ID NO: 222) [Rawlings N. D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], que se cortaría después de la arginina en la 30 posición 4 de la secuencia. Se produce FIIa activo por escisión de Fll por FXa en presencia de fosfolípidos y calcio y está corriente abajo del factor IX en la vía de coagulación. Una vez activado su papel natural en la coagulación es escindir el fibrinógeno, el cual, a su vez, inicia la formación de coágulos. La actividad de FIIa está estrechamente controlada y solo se produce cuando es necesaria para la correcta hemostasia. Sin embargo, como la coagulación es un proceso en curso en mamíferos, mediante la incorporación de la secuencia LTPRSLLV (SEQ ID NO: 223) en 35 la BPXTEN entre la BP y el XTEN, el dominio XTEN se eliminaría de la BP contigua simultáneamente a la activación ya sea de la vía de coagulación extrínseca o de la intrínseca cuando se requiere coagulación fisiológicamente, liberando de este modo la BP a lo largo del tiempo. De forma similar, la incorporación de otras secuencias en la BPXTEN sobre las que se actúa por proteasas endógenas proporcionaría una liberación sostenida de BP que puede, en algunos casos, proporcionar un mayor grado de actividad para la BP desde la forma "profármaco" de la

40 BPXTEN.

En algunos casos, solo los dos o tres aminoácidos que flanquean ambos lados del sitio de corte (de cuatro a seis aminoácidos en total) se incorporarían en la secuencia de escisión. En otros casos, la secuencia de escisión conocida puede tener una o más deleciones o inserciones o una o dos o tres sustituciones de aminoácidos para

45 cualesquier uno o dos o tres aminoácidos en la secuencia conocida, en la que las deleciones, inserciones o sustituciones dan como resultado la susceptibilidad reducida o potenciada, pero no una ausencia de susceptibilidad a la proteasa, dando como resultado una capacidad de adaptar la velocidad de liberación de la BP desde el XTEN. Se muestran sustituciones de ejemplo en la Tabla 10.

50 Tabla 10: Secuencias de escisión por proteasas

Proteasa que actúa sobre la secuencia: SEQ ID NO: Secuencia de escisión de ejemplo Sitio de corte mínimo *

FXIa: 224 KLTR↓VVGG KD/FL/T/R↓VA/VE/GT/GV

FXIIa: 225 TMTR↓IVGG NA

Calicreína: 226 SPFR↓STGG -/-/FL/RY↓SR/RT/-/-

FVIIa: 227 LQVR↓IVGG NA

FIXa: 228 PLGR↓IVGG -/-/G/R↓-/-/-/-

FXa: 229 IEGR↓TVGG IA/E/GFP/R↓STI/VFS/-/G

FIla (trombina): 230 LTPR↓SLLV -/-/PLA/R↓SAG/-/-/

Elastasa-2: 231 LGPV↓SGVP -/-/-/VIAT↓-/-/-/

Granzima-B: 232 VAGD↓SLEE V/-/-/D↓-/-/-/

MMP-12: 233 GPAG↓LGGA G/PA/-/G↓L/-/G/- (SEQ ID NO: 241)

MMP-13: 234 GPAG↓LRGA G/P/-/G↓L/-/GA/- (SEQ ID NO: 242)

MMP-17: 235 APLG↓LRLR -/PS/-/-↓LQ/-/LT/-

MMP-20: 236 PALP↓LVAQ NA

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Las propiedades farmacocinéticas de una BP que pueden potenciarse mediante la unión de un XTEN dado a la BP incluyen la semivida terminal, el área bajo la curva (AUC), la Cmáx, el volumen de distribución y la biodisponibilidad.

Como se describe con más detalle en los Ejemplos relativos a las características farmacocinéticas de las proteínas de fusión que comprenden XTEN, se descubrió sorprendentemente que el aumento de la longitud de la secuencia de XTEN podría conferir un aumento desproporcionado en la semivida terminal de una proteína de fusión que comprende XTEN. En consecuencia, la divulgación proporciona proteínas de fusión BPXTEN que comprenden XTEN en donde el XTEN puede seleccionarse para proporcionar una semivida dirigida para la composición de BPXTEN administrada a un sujeto. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona proteínas de fusión monoméricas que comprenden XTEN en donde el XTEN se selecciona para conferir un aumento de la semivida terminal para la BPXTEN administrada, en comparación con la BP correspondiente no unida a la proteína de fusión, al menos aproximadamente dos veces más larga o un aumento de la semivida terminal de al menos aproximadamente tres veces o al menos aproximadamente cuatro veces o al menos aproximadamente cinco veces

: o al menos aproximadamente seis veces o al menos aproximadamente siete veces o al menos aproximadamente ocho veces o al menos aproximadamente nueve veces o al menos aproximadamente diez veces o al menos aproximadamente 15 veces o al menos 20 veces o más en comparación con la BP no unida a la proteína de fusión. De forma similar, las proteínas de fusión BPXTEN pueden tener un aumento del AUC de al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 100 % o al menos aproximadamente el 150 % o al menos aproximadamente el 200 % o al menos aproximadamente el 300 % de aumento del AUC en comparación con la BP correspondiente no unida a la proteína de fusión. Los parámetros farmacocinéticos de una BPXTEN pueden determinarse por métodos convencionales que implican la dosificación, la toma de muestras de sangre a intervalos de tiempo y el ensayo de la proteína utilizando ELISA, HPLC, radioensayo u otros métodos conocidos en la técnica o como se describe en el presente documento, seguidos de cálculos convencionales de los datos para derivar la semivida y otros parámetros de FC.

La divulgación proporciona además BPXTEN que comprenden una primera y una segunda molécula de BP, opcionalmente separadas por una secuencia espaciadora que puede comprender además una secuencia de escisión, o separadas por una segunda secuencia de XTEN. En una realización, la BP tiene menos actividad cuando se une a la proteína de fusión en comparación con una BP correspondiente no unida a la proteína de fusión. En dicho caso, como se ilustra en la FIG. 38, la BPXTEN puede diseñarse de manera que tras la administración a un sujeto, el componente BP se libere gradualmente por la escisión de la secuencia o secuencias de escisión, con lo que se recupera la actividad o la capacidad de unirse a su receptor o ligando diana. En consecuencia, la BPXTEN de lo anterior sirve como un profármaco o un depósito de circulación, dando como resultado una semivida terminal más larga en comparación con una BP no unida a la proteína de fusión.

(c): Farmacología y propiedades farmacéuticas de BPXTEN

La presente divulgación proporciona composiciones de BPXTEN que comprenden BP unida covalentemente a XTEN que pueden tener propiedades potenciadas en comparación con la BP no unida a XTEN, así como métodos para potenciar la actividad o el efecto terapéuticos y/o biológicos de los dos respectivos componentes de BP de las composiciones. Además, la divulgación proporciona composiciones de BPXTEN con propiedades potenciadas en comparación con las proteínas de fusión conocidos en la técnica que contienen compañeros polipeptídicos de inmunoglobulina, polipéptidos de longitud más corta y/o compañeros polipeptídicos con secuencias repetitivas. Además, las proteínas de fusión BPXTEN proporcionan ventajas significativas sobre los conjugados químicos, tales como construcciones pegiladas, en particular el hecho de que las proteínas de fusión BPXTEN recombinantes pueden hacerse en sistemas de expresión de células bacterianas, que pueden reducir el tiempo y el coste, tanto en la investigación y las etapas de desarrollo y fabricación de un producto, así como dar como resultado un producto definido más homogéneo con menor toxicidad para el producto como para los metabolitos de BPXTEN en comparación con los conjugados pegilados.

Como agentes terapéuticos, las BPXTEN puede poseer varias ventajas con respecto a los productos terapéuticos que no comprenden XTEN incluyendo, por ejemplo, un aumento de la solubilidad, una mayor estabilidad térmica, una inmunogenicidad reducida, un aumento del peso molecular aparente, una reducción del aclaramiento renal, una reducción de la proteolisis, un metabolismo reducido, una eficiencia terapéutica potenciada, una dosis terapéutica efectiva más baja, un aumento de la biodisponibilidad, un aumento del tiempo entre dosis para mantener los niveles sanguíneos dentro del margen terapéutico para la BP, una tasa de absorción "adaptada", una estabilidad de la liofilización potenciada, una estabilidad en suero/plasma potenciada, un aumento de la semivida terminal, un aumento de la solubilidad en el torrente sanguíneo, una disminución de la unión por anticuerpos neutralizantes, una disminución del aclaramiento mediado por receptor, efectos secundarios reducidos, una conservación de la afinidad de unión receptor/ligando o de la activación receptor/ligando, estabilidad a la degradación, estabilidad a la congelación-descongelación, estabilidad a las proteasas, estabilidad a la ubiquitinación, facilidad de administración, compatibilidad con otros excipientes o vehículos farmacéuticos, persistencia en el sujeto, un aumento de la estabilidad en almacenamiento (por ejemplo, aumento del período de validez), una reducción de la toxicidad en un organismo o ambiente y similares. El efecto neto de las propiedades potenciadas es que la BPXTEN puede dar como resultado en un efecto terapéutico y/o biológico potenciado cuando se administra a un sujeto con una

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mediante un ensayo de unión de tipo competencia que detecte los cambios en la capacidad de unirse específicamente a un receptor o ligando. Adicionalmente, pueden utilizarse técnicas tales como citometría de flujo o resonancia de plasmón superficial para detectar acontecimientos de unión. Los ensayos pueden comprender moléculas de receptor soluble o pueden determinar la unión a receptores expresados por células. Dichos ensayos pueden incluir ensayos a base de células, incluyendo ensayos para determinar la proliferación, la muerte celular, la apoptosis y la migración celular. Otros ensayos posibles pueden determinar la unión al receptor de polipéptidos expresados, en donde el ensayo puede comprender moléculas de receptor soluble o puede determinar la unión a receptores expresados por células. La afinidad de unión de una BPXTEN por los receptores o ligandos de la BP correspondiente diana puede ensayarse utilizando ensayos de unión de unión o competitivos, tales como ensayos Biacore con receptores unidos a microplaca o proteínas de unión o ensayos ELISA, como se describe en la patente de los EE.UU. 5.534.617, ensayos que se describen en los ejemplos en el presente documento, ensayos de radioreceptores u otros ensayos conocidos en la técnica. Además, pueden compararse variantes de secuencia de BP (ensayadas como componentes individuales o como proteínas de fusión BPXTEN) con la BP nativa utilizando un ensayo de unión ELISA competitivo para determinar si tienen la misma especificidad de unión y afinidad que la BP nativa o alguna parte de las mismas de manera que sean adecuadas para su inclusión en la BPXTEN.

La divulgación proporciona BPXTEN aislada en la que la afinidad de unión a receptores o ligandos diana de BP diana de BP para la BPXTEN puede ser de al menos aproximadamente el 10 % o al menos aproximadamente el 20 % o al menos aproximadamente el 30 % o al menos aproximadamente el 40 % o al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % o más de la afinidad de una BP nativa no unida a XTEN por el receptor

o ligando diana. En algunos casos, la afinidad de unión Kd entre la BPXTEN objeto y un receptor o un ligando nativos de BPXTEN es al menos aproximadamente 104 M, como alternativa al menos aproximadamente 105 M, como alternativa al menos aproximadamente 106 M o al menos aproximadamente 107 M de la afinidad entre la BPXTEN y un receptor o un ligando nativos.

En otros casos, la divulgación proporciona BPXTEN aislada en la que la proteína de fusión está diseñada para unirse con alta afinidad a un receptor diana, dando como resultado una actividad antagonista para el ligando nativo. Un ejemplo no limitante de una BPXTEN de este tipo es IL-1raXTEN, que se configura para unirse a un receptor de IL-1 de manera que la composición unida interfiere sustancialmente con la unión de IL-1α y/o IL-1β al receptor de IL

1. En ciertos casos, la interferencia por un antagonista de BPXTEN (tal como, pero no limitado a IL-1raXTEN) con la unión del ligando nativo al receptor diana puede ser de al menos aproximadamente el 1 % o aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 20 % o aproximadamente el 30 % o aproximadamente el 40 % o aproximadamente el 50 % o aproximadamente el 60 % o aproximadamente el 70 % o aproximadamente el 80 % o aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %. En otras realizaciones, la divulgación proporciona proteínas de fusión BPXTEN aisladas (tales como, pero no limitadas a IL-1raXTEN) en donde la unión de la proteína de fusión aislada a un receptor celular desencadena menos del 20 % o menos del 10 % o menos del 5 % de activación de las vías de señalización de la célula con antagonista de BPXTEN unido en comparación a las evocadas por el ligando nativo. En otros casos, las composiciones de BPXTEN antagonistas se unen al receptor diana con una constante de disociación de aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, aproximadamente 500 pM o menos, aproximadamente 250 pM o menos, aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos o aproximadamente 25 pM o menos. Los ejemplos no limitantes de construcciones específicas de BPXTEN antagonista pueden incluir IL-ra-AM875, IL1ra-AE864 o IL-1ra-AM1296.

En algunos casos, las proteínas de fusión BPXTEN de las presentes composiciones conservan al menos aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o 99 % por ciento de la actividad biológica de la BP correspondiente no unida a la proteína de fusión con respecto a una actividad biológica in vitro o a un efecto farmacológico conocido o asociado al uso de la BP nativa en el tratamiento y la prevención de afecciones y trastornos metabólicos. En algunos casos de la realización anterior, la actividad del componente BP puede manifestarse por la proteína de fusión BPXTEN intacta, mientras que en otros casos la actividad del componente BP se manifiesta principalmente tras la escisión y la liberación de la BP de la proteína de fusión por la acción de una proteasa que actúa sobre una secuencia de escisión incorporada en la proteína de fusión BPXTEN. En lo anterior, como se ilustra en la FIG. 3, la BPXTEN puede diseñarse para reducir la afinidad de unión del componente BP por el receptor o ligando cuando se une al XTEN pero que tenga una afinidad aumentada cuando se libera de XTEN a través de la escisión de la secuencia o secuencias de escisión incorporadas en la secuencia de BPXTEN, como se ha descrito con más detalle anteriormente.

En otros casos, las BPXTEN se diseñan para reducir la afinidad de unión del componente BP cuando están unido al XTEN para, por ejemplo, aumentar la semivida terminal de la BPXTEN administrada a un sujeto mediante la reducción del aclaramiento mediado por receptor o para reducir la toxicidad o los efectos secundarios debidos a la composición administrada. Cuando la dosis o concentración sanguínea sin efecto toxicológico de una BP no unida a un XTEN es baja (lo que significa que el péptido nativo tiene un alto potencial para dar como resultado efectos secundarios), la invención proporciona proteínas de fusión BPXTEN en donde la proteína de fusión se configura

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fusión, determinada en condiciones comparables. Expresado de otra manera, el componente de BP de la BPXTEN configurada puede tener una afinidad de unión que es tan pequeña como aproximadamente el 0,01 % o al menos aproximadamente el 0,1 % o al menos aproximadamente el 1 % o al menos aproximadamente el 2 % o al menos aproximadamente el 3 % o al menos aproximadamente el 4 % o al menos aproximadamente el 5 % o al menos aproximadamente el 10 % o al menos aproximadamente el 20 % de la del componente de BP correspondiente de una BPXTEN en una configuración en la que la afinidad de unión del componente de BP no se reduce. En las realizaciones anteriores descritas anteriormente en este párrafo, la afinidad de unión de la BPXTEN configurada por el receptor diana se "reduciría sustancialmente" en comparación con una BP nativa correspondiente o una BPXTEN con una configuración en la que la afinidad de unión del componente de BP correspondiente no se reduce. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones y métodos para producir composiciones con un RMC reducido mediante la configuración de la BPXTEN de manera que sea capaz de unirse a y activar un número suficiente de receptores para obtener una respuesta biológica deseada in vivo y además evitar la activación de más receptores que los que se requieren para la obtención de dicha respuesta. En una realización, la BPXTEN se configura de manera que la BP objeto esté en el extremo N de la BPXTEN, en la que el RMC de la BPXTEN administrada se reduce en comparación con una BPXTEN configurada con la BP objeto unida al extremo C de un XTEN y se conserva al menos una parte de la actividad biológica de la BP nativa. En otra realización, la BPXTEN se configura de manera que la BP objeto está en el extremo C de la BPXTEN, en la que el RMC de la BPXTEN administrada se reduce en comparación con una BPXTEN configurada con la BP objeto en el extremo N de la BPXTEN y se conserva al menos una parte de la actividad biológica de la BP nativa. En otra realización, la BPXTEN se configura, del extremo N al C, como XTEN-BP-XTEN, en la que el RMC de la BPXTEN administrada se reduce en comparación con una BPXTEN configurada con un XTEN y se conserva al menos una parte de la actividad biológica de la BP nativa. Será evidente para un experto en la materia que se contemplan otras configuraciones para conseguir esta propiedad; por ejemplo, la adición de una segunda molécula de la BP o una secuencia espaciadora. En las realizaciones anteriores descritas anteriormente en este párrafo, la semivida de la BPXTEN puede aumentarse al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 75 % o al menos aproximadamente el 100 % o al menos aproximadamente el 150 % o al menos aproximadamente el 200 % o al menos aproximadamente el 300 % en comparación con una BPXTEN configurada en la que la afinidad de unión y el RMC del componente de BP no se reducen. En las realizaciones anteriores descritas anteriormente en este párrafo, el aumento de la semivida puede permitir dosis más altas y la reducción de la frecuencia de dosificación en comparación con BP no unida a XTEN o en comparación con configuraciones de BPXTEN en donde el componente de BP conserva una afinidad de unión al receptor comparable a la BP nativa.

También pueden utilizarse ensayos biológicos específicos in vivo y ex vivo para evaluar la actividad biológica de cada BPXTEN configurada y/o componente de BP que ha de incorporarse en la BPXTEN. Por ejemplo, el aumento de la secreción de insulina y/o de la transcripción de las células beta pancreáticas puede medirse por métodos conocidos en la técnica. La captación de glucosa por los tejidos también puede evaluarse por métodos tales como el ensayo de fijación de glucosa y similares. Otros parámetros in vivo y ex vivo adecuados para evaluar la actividad de las proteínas de fusión BPXTEN administradas en el tratamiento de enfermedades y trastornos metabólicos incluyen el nivel de glucosa en ayunas, el nivel de glucosa postprandial máximo, la homeostasis de la glucosa, la respuesta al ensayo de tolerancia oral a la glucosa, la respuesta a la prueba de la insulina, HA1c, la ingesta calórica, la saciedad, la velocidad de vaciado gástrico, la secreción pancreática, la secreción de insulina, la sensibilidad a la insulina de los tejidos periféricos, la masa de células beta, la destrucción de las células beta, los niveles o perfiles de lípidos en sangre, el índice de masa corporal o el peso corporal. Basándose en los resultados de estos ensayos u otros ensayos conocidos en la técnica, la configuración o la composición de la BPXTEN pueden confirmarse o, si es necesario, ajustarse y volver a ensayarse para confirmar la afinidad de unión a la diana o la actividad biológica.

Se conocen en la técnica diversos ensayos y métodos específicos para medir las propiedades físicas y estructurales de las proteínas expresadas incluyendo métodos para determinar propiedades tales como la agregación de proteínas, la solubilidad, la estructura secundaria o terciaria, las propiedades de fusión, la contaminación y el contenido de agua. Dichos métodos incluyen la centrifugación analítica, EPR, HPLC-intercambio iónico, HPLCexclusión por tamaño, HPLC-fase inversa, dispersión de la luz, electroforesis capilar, dicroísmo circular, calorimetría diferencial de barrido, fluorescencia, HPLC-intercambio iónico, HPLC-exclusión por tamaño, IR, RMN, espectroscopia Raman, refractometría y espectroscopia UV/Visible. Se desvelan métodos adicionales en Arnau et al., Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13. La aplicación de estos métodos estaría dentro del alcance de un experto en la materia.

V). USOS DE LAS COMPOSICIONES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

En otro aspecto, la invención proporciona un método para conseguir un efecto beneficioso en una enfermedad, trastorno o afección mediada por BP. La presente invención aborda desventajas y/o limitaciones de BP que tienen una semivida terminal relativamente corta y/o un marco terapéutico estrecho entre la dosis eficaz mínima y la dosis máxima tolerada.

En una realización, la divulgación proporciona un método para conseguir un efecto beneficioso en un sujeto que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de una BPXTEN. La cantidad eficaz puede producir un efecto beneficioso para ayudar a tratar una enfermedad o trastorno.

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niveles anteriores a la dosis. En otras realizaciones, el método puede dar como resultado niveles de glucosa en el ensayo de tolerancia oral a la glucosa de 120 minutos (ETOG) de menos de aproximadamente 200 mg/dl, más preferentemente de menos de aproximadamente 190 mg/dl, más preferentemente de menos de aproximadamente 180 mg/dl, más preferentemente de menos de aproximadamente 170 mg/dl, más preferentemente de menos de aproximadamente 160 mg/dl, más preferentemente de menos de aproximadamente 150 mg/dl y más preferentemente de menos de aproximadamente 140 mg/dl. Otros ejemplos de métodos de tratamiento que se están evaluando por un parámetro incluyendo la mejora de los tiempos de protrombina en un sujeto con hemofilia; por ejemplo, la administración de una BPXTEN que comprende un FIX puede dar como resultado un tiempo de protrombina que es al menos aproximadamente el 40 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 50 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 60 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % o más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % en comparación con un sujeto normal.

La invención contempla adicionalmente que la BPXTEN utilizada de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento puede administrarse en combinación con otros métodos de tratamiento y composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de la diabetes, la resistencia a la insulina, los trastornos metabólicos, los trastornos de la coagulación o los trastornos hemorrágicos. Dichas composiciones, pueden incluir, por ejemplo, inhibidores de DPP-IV, insulina, análogos de insulina, agonistas de PPAR gamma, agonistas de acción dual de PPAR, agonistas de GLP-1 o análogos, inhibidores de PTP1B, inhibidores de SGLT, secretagogos de insulina, agonistas de RXR, inhibidores de la glucógeno sintasa cinasa-3, sensibilizadores a la insulina, moduladores inmunitarios, agonistas de receptores adrenérgicos beta-3, agonistas de Pan-PPAR, inhibidores de 11 beta-HSD1, biguanidas, inhibidores de la alfa-glucosidasa, meglitinidas, tiazolidindionas, sulfonilureas y otros medicamentos para la diabetes conocidos en la técnica o fármacos antihipertensivos, antagonistas del calcio o factores de la coagulación y productos relacionados. En algunos casos, la administración de una BPXTEN puede permitir el uso de dosis más bajas de la composición farmacéutica coadministrada para conseguir un efecto clínico comparable o parámetro medido para la enfermedad, trastorno o afección en el sujeto.

No obstante lo anterior, en ciertas realizaciones, la BPXTEN utilizada de acuerdo con los métodos de la presente invención puede prevenir o retrasar la necesidad de métodos adicionales de tratamiento o del uso de fármacos u otras composiciones farmacéuticas en sujetos con enfermedades relacionados con la glucosa, enfermedades o trastornos metabólicos, alteraciones de la coagulación o trastornos del crecimiento por carencia de la hormona del crecimiento. En otras realizaciones, la BPXTEN puede reducir la cantidad, la frecuencia o la duración de los métodos de tratamiento adicionales o fármacos u otras composiciones farmacéuticas requeridas para el tratamiento de la enfermedad, trastorno o afección subyacente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de diseño de composiciones de BPXTEN con propiedades farmacológicas o farmacéuticas deseadas. Las proteínas de fusión BPXTEN se diseñan y se preparan con varios objetivos en mente (en comparación con los componentes de BP no unidos a la proteína de fusión), incluyendo la mejora de la eficacia terapéutica para el tratamiento de enfermedades o trastornos metabólicos, la mejora de las características farmacocinéticas de las proteínas de fusión comparadas con la BP, la reducción de la dosis o la frecuencia de la dosificación necesaria para conseguir un efecto farmacológico, la potenciación de las propiedades farmacéuticas y la potenciación de la capacidad de los componentes de BP para permanecer dentro del margen terapéutico durante un período prolongado de tiempo.

En general, las etapas en el diseño y la producción de las proteínas de fusión y las composiciones de la invención pueden, como se ilustra en las FIG. 4-6, incluir: (1) la selección de BP (por ejemplo, proteínas nativas, hormonas peptídicas, análogos peptídicos o derivados con actividad, fragmentos de péptidos, etc.) para el tratamiento de la enfermedad, trastorno o afección particular; (2) la selección del XTEN conferirá las características FC deseadas y fisicoquímicas de la BPXTEN resultante (por ejemplo, la administración de la composición a un sujeto da como resultado la proteína de fusión se mantiene dentro del margen terapéutico durante un período mayor en comparación con BP no unida a XTEN); (3) el establecimiento de una configuración del extremo N al C de la BPXTEN para conseguir la eficacia o los parámetros FC deseados; (4) el establecimiento del diseño del vector de expresión que codifica la BPXTEN configurada; (5) la transformación de un hospedador adecuado con el vector de expresión; y (6) la expresión y la recuperación de la proteína de fusión resultante. Para las BPXTEN para las que se desea un aumento en la semivida (mayor de 16 h) o un período de tiempo aumentado que transcurre dentro de un margen terapéutico, el XTEN elegido para su incorporación tendrá generalmente al menos aproximadamente 500 o aproximadamente 576 o aproximadamente 864 o aproximadamente 875 o aproximadamente 913 o aproximadamente 924 restos de aminoácidos donde se ha de incorporar un solo XTEN en la BPXTEN. En otra realización, la BPXTEN puede comprender un primer XTEN de las longitudes que preceden y un segundo XTEN de aproximadamente 144 o aproximadamente 288 o aproximadamente 576 o aproximadamente 864 o aproximadamente 875 o aproximadamente 913 o aproximadamente 924 restos de aminoácidos.

En otros casos, cuando no es necesario el aumento de la semivida, pero se desea un aumento en una propiedad farmacéutica (por ejemplo, la solubilidad), puede diseñarse una BPXTEN que incluya XTEN de longitudes más cortas. En algunas realizaciones de lo anterior, la BPXTEN puede comprender una BP unida a un XTEN que tiene al menos aproximadamente 24 o aproximadamente 36 o aproximadamente 48 o aproximadamente 60 o

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aproximadamente el 80 % o más de su actividad original en solución durante períodos de hasta 5 semanas o más en diversas condiciones de temperatura. En algunas realizaciones, la BPXTEN conserva al menos aproximadamente el 50 % o aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % y más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % o más de su actividad original en solución cuando se calienta a 80 ºC durante 10 min. En otras realizaciones, la BPXTEN conserva al menos aproximadamente el 50 %, preferentemente al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % o como alternativa al menos aproximadamente el 90 % o más de su actividad original en solución cuando se calienta o se mantiene a 37 ºC durante aproximadamente 7 días. En otra realización, la proteína de fusión BPXTEN conserva al menos aproximadamente el 80 % o más de su actividad funcional después de la exposición a una temperatura de aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 70 ºC durante un período de tiempo de aproximadamente una hora a aproximadamente 18 horas. En las realizaciones anteriores descritas anteriormente en este párrafo, la actividad conservada de BPXTEN sería al menos aproximadamente dos veces o al menos aproximadamente tres veces o al menos aproximadamente cuatro veces o al menos aproximadamente cinco veces

o al menos aproximadamente seis veces mayor en un punto temporal dado que la de la correspondiente BP no unida a la proteína de fusión.

VI). SECUENCIAS DE ADN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona ácidos polinucleicos aislados que codifican polipéptidos quiméricos BPXTEN y secuencias complementarias a las moléculas de ácido polinucleico que codifican polipéptidos quiméricos BPXTEN, incluyendo variantes homólogas. En otro aspecto, la invención abarca métodos para producir ácidos polinucleicos que codifican polipéptidos quiméricos BPXTEN y secuencias complementarias a moléculas de ácido polinucleico que codifican polipéptidos quiméricos BPXTEN, incluyendo variantes homólogas. En general y como se ilustra en las FIG. 4-6, los métodos de producción de una secuencia de polinucleótidos que codifica para una proteína de fusión BPXTEN y que expresa el producto génico resultante incluyen nucleótidos de ensamblaje que codifican BP y XTEN, la unión de los componentes en el marco, la incorporación del gen codificante en un vector de expresión apropiado, la transformación de una célula hospedadora apropiada con el vector de expresión y provocar que se exprese la proteína de fusión en la célula hospedadora transformada, produciendo de este modo el polipéptido BPXTEN biológicamente activo. Pueden utilizarse técnicas recombinantes convencionales de biología molecular para fabricar los polinucleótidos y vectores de expresión de la presente divulgación.

De acuerdo con la invención, pueden utilizarse secuencias de ácidos nucleicos que codifican BPXTEN para generar moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de proteínas de fusión BPXTEN en células hospedadoras apropiadas. Se prevé que varias estrategias de clonación son adecuadas para la realización de la presente invención, muchas de las cuales pueden utilizarse para generar una construcción que comprende un gen que codifica para una proteína de fusión de las presentes composiciones de BPXTEN o su complemento. En una realización, la estrategia de clonación se utilizaría para crear un gen que codifica una BPXTEN monomérica que comprende al menos una primera BP y al menos un primer polipéptido XTEN o su complemento. En otra realización, la estrategia de clonación se utilizaría para crear un gen que codifica una BPXTEN monomérica que comprende una primera y una segunda molécula de la BP y al menos un primer XTEN (o su complemento) que se utilizarían para transformar una célula hospedadora para la expresión de la proteína de fusión utilizada para formular una composición de BPXTEN. En las realizaciones anteriores descritas anteriormente en este párrafo, el gen puede comprender adicionalmente nucleótidos que codifican secuencias espaciadoras que también pueden codificar la secuencia o secuencias de escisión.

En el diseño de una secuencia de XTEN deseada, se descubrió que la naturaleza no repetitiva del XTEN de las composiciones de la invención puede conseguirse a pesar del uso de una metodología molecular de "componente básico" en la creación de las secuencias que codifican XTEN. Esto se consiguió mediante el uso de una biblioteca de polinucleótidos que codifican la secuencia de motivos que después se multimerizan para crear los genes que codifican las secuencias de XTEN (véanse las FIG. 4 y 5). Por tanto, mientras que el XTEN expresado puede consistir en múltiples unidades de tan solo cuatro diferentes motivos de secuencia, puesto que los propios motivos consisten en secuencias de aminoácidos no repetitivos, la secuencia global de XTEN se convierte en no repetitiva. En consecuencia, en una realización, los polinucleótidos que codifican XTEN comprenden múltiples polinucleótidos que codifican secuencias no repetitivas, o motivos, unidas operativamente en marco y en el que las secuencias de aminoácidos de XTEN expresadas resultantes son no repetitivas.

En una metodología, se prepara primero una construcción que contiene la secuencia de ADN que corresponde a la proteína de fusión BPXTEN. Puede obtenerse ADN que codifica la BP de las composiciones a partir de una biblioteca de ADNc preparada utilizando métodos convencionales a partir de tejido o células aisladas que se cree que poseen ARNm de BP y que lo expresan en un nivel detectable. Si es necesario, la secuencia codificante puede obtenerse utilizando procedimientos convencionales de extensión de cebadores como se describe en Sambrook, et al., indicado anteriormente, para detectar precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que puede no haberse transcrito inversamente en ADNc. En consecuencia, puede obtenerse ADN convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de dichas fuentes. El gen o genes que codifican BP también pueden obtenerse de una biblioteca genómica o crearse mediante procedimientos de síntesis convencionales conocidos en la técnica (por ejemplo, la síntesis automatizada de ácidos nucleicos) utilizando secuencias de ADN obtenidas a

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se describen con más detalle a continuación.

La FIG. 5 es un diagrama de flujo esquemático de etapas no limitantes representativas en el ensamblaje de una construcción de polinucleótidos de XTEN y una construcción de polinucleótidos de BPXTEN en las realizaciones de 5 la divulgación. Pueden hibridarse los oligonucleótidos individuales 501 en motivos de secuencia 502 tales como un motivo de 12 aminoácidos ("12-meros''), que posteriormente se ligan con un oligo que contiene Bbsl y sitios de restricción KpnI 503. Se hibridan motivos de secuencias adicionales de una biblioteca hasta el 12-mero hasta que se consigue la longitud deseada del gen XTEN 504. El gen XTEN se clona en un vector de relleno. El vector puede codificar opcionalmente una secuencia Flag 506 seguida de una secuencia de relleno que está flanqueada por sitios

10 BsaI, Bbsl y KpnI 507 y, en este caso, un solo gen de BP (que codifica la exendina-4 en este ejemplo) 508, dando como resultado el gen que codifica una BPXTEN que comprende una única BP 500. Se proporciona una lista no exhaustiva de los nombres de XTEN y las SEQ ID NO. para polinucleótidos que codifican XTEN y secuencias precursoras en la Tabla 11.

15 Tabla 11: Secuencias de ADN de XTEN y secuencias precursoras

Nombre de XTEN: SEQ ID NO: Secuencia de ADN

AE144: 247 imagen82

AF144: 248

AE288: 249

76 77

AE576: 250

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AF576: 251

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imagen85

79 80

AF864: 254

Se insertó XXXX en dos áreas donde no hay disponible ninguna información de secuencia.

imagen86

AM923: 256

AE912: 257

82

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84 85

BC864: 259 imagen89

BD864: 260

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Puede clonarse la biblioteca de genes que codifican XTEN en uno o más vectores de expresión conocidos en la técnica. Para facilitar la identificación de miembros de la biblioteca que se expresan bien, puede construirse la biblioteca como fusión a una proteína indicadora. Son ejemplos no limitantes de genes indicadores adecuados la

5 proteína verde fluorescente, luciferasa, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. Por detección, pueden identificarse secuencias de XTEN cortas que pueden expresarse en alta concentración en el organismo hospedador de elección. Posteriormente, puede generarse una biblioteca de dímeros de XTEN aleatorios y repetirse la detección para altos niveles de expresión. Posteriormente, las construcciones resultantes pueden detectarse para varias propiedades tales como el nivel de expresión, la estabilidad de proteasas o la unión a antisuero.

10 Un aspecto de la invención es proporcionar secuencias de polinucleótidos que codifican los componentes de la proteína de fusión en el que la creación de la secuencia se ha sometido a la optimización de codones. Es de particular interés la optimización de codones con el objetivo de mejorar la expresión de las composiciones de polipéptidos y para mejorar la estabilidad genética del gen codificante en los hospedadores de producción. Por

15 ejemplo, la optimización de codones es de particular importancia para secuencias de XTEN que son ricas en glicina

o que tienen secuencias de aminoácidos muy repetitivas. La optimización de codones puede realizarse utilizando programas informáticos (Gustafsson, C., et al (2004) Trends Biolechnol., 22: 346-53), algunos de los cuales

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Tabla 26: Análisis por SEC de diversos polipéptidos

Nombre de la construcción: XTEN o compañero de fusión Proteína PM real de la proteína terapéutica (kDa) PM aparente (kDa) Factor de peso molecular aparente RH (nm)

AC14: Y288 Glucagón 28,7 370 12,9 7,0

AC28: Y144 Glucagón 16,1 117 7,3 5,0

AC34: Y72 Glucagón 9,9 58,6 5,9 3,8

AC33: Y36 Glucagón 6,8 29,4 4,3 2,6

AC89: AF120 Glucagón 14,1 76,4, 5,4 4,3

AC88: AF108 Glucagón 13,1 61,2 4,7 3,9

AC73: AF144 Glucagón 16,3 95,2 5,8 4,7

AC53: AG576 GFP 74,9 339 4,5 7,0

AC39: AD576 GFP 76,4 546 7,1 7,7

AC41: AE576 GFP 80,4 760 9,5 8,3

AC52: AF576 GFP 78,3 526 6,7 7,6

AC85: AE864 Exendina4 83,6 938 11,2 8,9

AC114: AM875 Exendina4 82,4 1344 16,3 9,4

AC143: AM875 hGH 100,6 846 8,4 8,7

AC227: AM875 IL-1ra 95,4 1103 11,6 9,2

AC228: AM1296 IL-1ra 134,8 2286 17,0 10,5

Ejemplo 20: Farmacocinética de polipéptidos extendidos fusionados a GFP en macacos

5 La farmacocinética de GFP-L288, L576-GFP, GFP-XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576 y XTEN_AD836-GFP se sometió a ensayo en macacos para determinar el efecto de la composición y la longitud de los polipéptidos desestructurados en los parámetros FC. Las muestras de sangre se analizaron en diversos momentos después de la inyección y la concentración de GFP en plasma se midió por ELISA utilizando un anticuerpo policlonal contra GFP para la captura y una preparación biotinilada del mismo anticuerpo policlonal para la detección. Los resultados se

10 resumen en la FIG. 23. Los resultados muestran un sorprendente aumento de la semivida al aumentar la longitud de la secuencia de XTEN. Por ejemplo, se determinó una semivida de 10 h para GFP-XTEN_L288 (con 288 restos de aminoácidos en el XTEN). La duplicación de la longitud del compañero de fusión polipeptídico desestructurado a 576 aminoácidos aumentó la semivida de 20 a 22 h para múltiples construcciones de proteína de fusión; es decir, GFP-XTEN_L576, GFP XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576. Un aumento adicional de la longitud del compañero de fusión

15 desestructurado a 836 restos dio como resultado una semivida de 72-75 h para XTEN_AD836-GFP. Por tanto, el aumento de la longitud del polímero en 288 restos de 288 a 576 restos aumentó la semivida in vivo en aproximadamente 10 h. Sin embargo, aumentar la longitud de polipéptido en 260 restos de 576 restos a 836 restos aumentó la semivida en más de 50 h. Estos resultados muestran que existe un umbral sorprendente de longitud del polipéptido desestructurado que da como resultado una ganancia mayor que la proporcional en la semivida in vivo.

20 Por tanto, se espera que las proteínas de fusión que comprenden polipéptidos extendidos no estructurados tengan propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con los polipéptidos de longitudes más cortas.

Ejemplo 21: Estabilidad en suero de XTEN

25 Una proteína de fusión que contenía XTEN_AE864 fusionada al extremo N de GFP se incubó en plasma de mono y lisado de riñón de rata durante hasta 7 días a 37 ºC. Se retiraron muestras en el tiempo 0, el día 1 y el día 7 y se analizaron por SDS PAGE seguido de detección utilizando análisis Western y detección con anticuerpos contra GFP como se muestra en la FIG. 13. La secuencia de XTEN_AE864 mostró signos insignificantes de degradación tras 7 días en plasma. Sin embargo, XTEN_AE864 se degradó rápidamente en el lisado de riñón de rata tras 3 días. La

30 estabilidad in vivo de la proteína de fusión se ensayó en muestras de plasma en donde GFP_AE864 se inmunoprecipitó y se analizó mediante SDS-PAGE como se ha descrito anteriormente. Las muestras que se retiraron hasta 7 días después de la inyección mostraron muy pocos signos de degradación. Los resultados demuestran la resistencia de BPXTEN a la degradación debido a las proteasas séricas; un factor en la potenciación de las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de fusión BPXTEN.

35

Ejemplo 22: Construcción de genes y vectores de XTEN_IL-1ra del componente BPXTEN

El gen que codifica la IL-1ra humana de 153aa se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores ATAAAGGGTCTCCAGGTCGTCCGTCCGGTCGTAAATC (SEQ ID NO: 756) y 5’40 AACTCGAAGCTTTTATTCGTCCTCCTGGAAGTAAAA (SEQ ID NO: 757), que introdujo sitios de restricción flanqueando Bsal e HindIII (subrayado) que son compatibles con los sitios Bbsl y HindIII que flanquean el relleno en el vector de destino de XTEN (FIG. 7C). Los vectores de destino de XTEN contienen el gen de resistencia a kanamicina y son derivados de pET30 de Novagen en el formato de dominio de unión a celulosa (CDB)-XTEN

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* Valor predicho basado en la escala alométrica

Ejemplo 29: Aumento de la solubilidad y la estabilidad de la BP por unión a XTEN

Con el fin de evaluar la capacidad de XTEN para mejorar las propiedades físicas/químicas de la solubilidad y la

5 estabilidad, se prepararon y evaluaron proteínas de fusión de glucagón más XTEN de longitud más corta. Los artículos de ensayo se prepararon en solución salina tamponada con Tris a pH neutro y la caracterización de la solución de Gcg-XTEN fue por HPLC de fase inversa y cromatografía de exclusión por tamaño para afirmar que la proteína era homogénea y no agregada en solución. Los datos se presentan en la Tabla 30. Con fines comparativos, se midió el límite de solubilidad del glucagón no modificado en el mismo tampón a 60 µΜ (0,2 mg/ml) y el resultado

10 demostró que para todas las longitudes de XTEN añadidas, se consiguió un aumento sustancial de la solubilidad. Es importante destacar que, en la mayoría de los casos las proteínas de fusión glucagón-XTEN se prepararon para conseguir concentraciones diana y no se evaluaron para determinar los límites máximos de solubilidad para la construcción dada. Sin embargo, en el caso del glucagón unido al XTEN AF-144, se determinó el límite de solubilidad, con el resultado de que se logró un aumento de 60 veces en la solubilidad, en comparación con el

15 glucagón no unido a XTEN. Además, la BPXTEN glucagón-AF144 se evaluó para determinar la estabilidad y se descubrió que era estable en formulación líquida durante al menos 6 meses en condiciones de refrigeración y durante aproximadamente un mes a 37 ºC (datos no mostrados).

Conclusiones: Los datos apoyan la conclusión de que la unión de polipéptidos XTEN de longitud corta a una

20 proteína biológicamente activa, tal como glucagón puede potenciar notablemente las propiedades de solubilidad de la proteína por la proteína de fusión resultante, así como conferir estabilidad a las concentraciones de proteína más altas.

Tabla 30: Solubilidad de construcciones de glucagón-XTEN

Artículo de ensayo: Solubilidad

Glucagón: 60 µΜ

Glucagón-Y36: >370 µΜ

Glucagón-Y72: >293 µΜ

Glucagón-AF108: >145 µΜ

Glucagón-AF120: >160 µΜ

Glucagón-Y144: >497 µΜ

Glucagón-AE144: >467 µΜ

Glucagón-AF144: >3600 µΜ

Glucagón-Y288: >163 µΜ

25

Ejemplo 30: Caracterización de la estructura secundaria de BPXTEN

La BPXTEN Ex4-AE864 se evaluó para determinar el grado de estructura secundaria de mediante espectroscopia de dicroísmo circular. La espectroscopia de DC se realizó en un espectropolarímetro Jasco J-715 (Jasco 30 Corporation, Tokio, Japón) equipado con controlador de temperatura Peltier Jasco (TPC-348WI). La concentración de proteína se ajustó a 0,2 mg/ml en fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, NaCl 50 mM. Los experimentos se realizaron utilizando células de cuarzo HELLMA con una longitud de trayectoria óptica de 0,1 cm. Los espectros de DC se obtuvieron a 5 º, 25 º, 45 º y 65 ºC y se procesaron utilizando el software de Jasco J-700 versión 1.8.01 (Construcción 1) para Windows. Las muestras se equilibraron a cada temperatura durante 5 min antes de realizar las

35 mediciones de DC. Todos los espectros se registraron por duplicado de 300 nm a 185 nm utilizando un ancho de banda de 1 nm y una constante de tiempo de 2 s, a una velocidad de barrido de 100 nm/min. El espectro de DC mostrado en la FIG. 24 no muestra evidencia de estructura secundaria estable y es coherente con un polipéptido desestructurado.

40 Ejemplo 31: Actividad biológica de construcciones de glucagón y Ex4 BPXTEN

Se ensayaron glucagón y exendina-3 purificados, cada uno unido a Y288 como una proteína de fusión BPXTEN, para determinar la actividad biológica utilizando un ensayo celular in vitro. En pocas palabras, se utilizó una estirpe celular de receptor de glucagón optimizado para calcio estable ChemiScreen para los ensayos de movilización de 45 calcio en tiempo real para el glucagón y las construcciones de glucagón-XTEN, mientras que se utilizó una estirpe celular del receptor de la exendina-4 optimizado que expresa el receptor de GLP-1 nativo, para la exendina-4 y las construcciones de Ex4. En este sistema, las células expresan los receptores nativos y la activación de este receptor da como resultado el flujo de calcio dentro de la célula que puede detectarse utilizando un aparato FLIPR. Como se muestra en la FIG. 27, el glucagón nativo da como resultado un aumento de la señal de una manera dependiente de 50 la dosis. Se descubrió que la CE50 para el glucagón nativo en este sistema es de 4,1 nM. La titulación de la construcción glucagón-Y288 produjo una curva de respuesta comparable, con una CE50 de 72 nM. Como se muestra en la FIG. 28, la exendina-4 nativa de dos fuentes comerciales diferentes (AnaSpec y Tocris) da como resultado un aumento de la señal de una manera dependiente de la dosis, con una CE50 (indicada en la línea discontinua) de 75 pM y 110 pM, respectivamente. La titulación de la construcción exendina-4-Y576 proporcionó una

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características descritas en las realizaciones de BPXTEN desveladas en el presente documento.

Tabla 32: Cálculos de predicción de CHOU·FASMAN y de GOR de secuencias polipeptídicas

NOMBRE de SEQ: SEQ ID NO: Secuencia N.º de Residuos Cálculo de Chou-Fasman Cálculo de GOR

758: GSTSESPSGTAP 12 Totales de restos *: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E:0,0 No determinado

759: GTS TPESGSASP 12 Totales de restos: H: 0 E: 0 ciento: H: 0,0 E: 0,0 No determinado

760: GTSPSGESSTAP 12 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 No determinado

761: GSTSSTAESPGP 12 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 No determinado

762: imagen167 24 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 91,67 %

763: 36 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 94,44 %

764: imagen168 48 Totales de restos : H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 93,75 %

765: 60 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 96,67 %

766: 108 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 97,22 %

767: 216 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 99,07 %

768: imagen169 432 Totales de restos: H: 2 E: 3 porcentaje: H: 0,5 E: 0,7 99,54 %

AE864: 769 864 Totales de restos: H: 2 E: 3 porcentaje: H: 0,2 E: 0,3 99,77 %

165 166 167 168 169 170 171 172 173

AD 576: 770 imagen170 576 Totales de restos: H: 7 E: 0 porcentaje: H: 1,2 E: 0,0 99,65 %

AE576: 771 imagen171 576 Totales de restos: H: 2 E: 0 porcentaje: H: 0,4 E: 0,0 99,65 %

AF540: 772 540 Totales de restos: H: 2 E: 0 porcentaje: H: 0,4: 0,0 E 99,65

AF504: 773 504 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0: 0,0 E 94,44 %

AE864: 774 imagen172 864 Totales de restos: H: 2 E: 3 porcentaje: H: 0,2 E: 0,4 99,77 %

AF864: 775 875 Totales de restos: H: 2 E: 0 porcentaje: H: 0,2 E: 0,0 95,20 %

AG864: 776 imagen173 868 Totales de restos: H: 0 E: 0 porcentaje: H: 0,0 E: 0,0 94,70 %

AM875: 777 imagen174 875 Totales de restos: H: 7 E: 3 porcentaje: H: 0,8 E: 0,3 98,63

AM 129 6: 778 1318 Totales de restos: H: 7 E: 0 porcentaje: H: 0,7 E: 0,0 99,17 %

AM923: 779 imagen175 924 Totales de restos: H: 4 E: 3 porcentaje: H: 0,4 E: 0,3 98,70 %

AE912: 780 imagen176 913 Totales de restos: H: 8 E: 3 porcentaje: H: 0,9 E: 0,3 99,45 %

BC 864: 220 imagen177 Totales de restos: H: 0 E: ciento: H: 0 E: 0 99,77 %

781: 84 totales de restos: H: 58 E: 0 porcentaje: H: 69,0 E: 0,0 78,57 %

* H: hélice alfa E: lámina beta

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I: 0 1,1 1,5 0,5 - 0,7 0,4 - -0,6

K: -999 1,1 0 -1 - 1,3 -0,9 - -0,2

L: 0 1 1 0 - 0,2 0,2 - -0

M: 0 1,1 1,4 0 - -0,9 1,1 - 1,1

N: -999 0,8 0,5 0,2 - -0,6 -0,1 - -0,6

P: -999 -0,5 0,3 -1 - 0,5 0,7 - -0,3

Q: -999 1,2 0 0 - -0,3 -0,1 - -0,2

R: -999 2,2 0,7 -1 - 1 -0,9 - 0,5

S: -999 -0,3 0,2 0,7 - -0,1 0,07 - 1,1

T: -999 0 0 -1 - 0,8 -0,1 - -0,5

V: 0 2,1 0,5 0 - 1,2 0,2 - 0,3

W: -1 -0,1 0 -1 - -1,4 -0,6 - -1

Y: -1 0,9 0,8 -1 - -1,4 -0,1 - 0,3

Tabla 36: Potencial de bolsillo para el alelo HLA*0401B.

Aminoácido: P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

A: -999 0 0 0 - 0 0 - 0

C: -999 0 0 0 - 0 0 - 0

D: -999 -1,3 -1,3 1,4 - -1,1 -0,3 - -1,7

E: -999 0,1 -1,2 1,5 - -2,4 0,2 - -1,7

F: 0 0,8 0,8 -0,9 - -1,1 -1 - -1

G: -999 0,5 0,2 -1,6 - -1,5 -1,3 - -1

H: -999 0,8 0,2 1,1 - -1,4 0 - 0,08

I: -1 1,1 1,5 0,8 - -0,1 0,08 - -0,3

K: -999 1,1 0 -1,7 - -2,4 -0,3 - -0,3

L: -1 1 1 0,8 - -1,1 0,7 - -1

M: -1 1,1 1,4 0,9 - -1,1 0,8 - -0,4

N: -999 0,8 0,5 0,9 - 1,3 0,6 - -1,4

P: -999 -0,5 0,3 -1,6 - 0 -0,7 - -1,3

Q: -999 1,2 0 0,8 - -1,5 0 - 0,5

R: -999 2,2 0,7 -1,9 - -2,4 -1,2 - -1

S: -999 -0,3 0,2 0,8 - 1 -0,2 - 0,7

T: -999 0 0 0,7 - 1,9 -0,1 - -1,2

V: -1 2,1 0,5 -0,9 - 0,9 0,08 - -0,7

W: 0 -0,1 0 -1,2 - -1 -1,4 - -1

Y: 0 0,9 0,8 -1,6 - -1,5 -1,2 - -1

Tabla 37: potencial de bolsillo para el alelo HLA*0701B.

Aminoácido: P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

A: -999 0 0 0 - 0 0 - 0

C: -999 0 0 0 - 0 0 - 0

183 184 185 186 187 188 189 190

Aminoácido: P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

D: -999 -1,3 -1,3 -1,6 - -2,5 -1,3 - -1,2

E: -999 0,1 -1,2 -1,4 - -2,5 0,9 - -0,3

F: 0 0,8 0,8 0,2 - -0,8 2,1 - 2,1

G: -999 0,5 0,2 -1,1 - -0,6 0 - -0,6

H: -999 0,8 0,2 0,1 - -0,8 0,9 - -0,2

I: -1 1,1 1,5 1,1 - -0,5 2,4 - 3,4

K: -999 1,1 0 -1,3 - -1,1 0,5 - -1,1

L: -1 1 1 -0,8 - -0,9 2,2 - 3,4

M: -1 1,1 1,4 -0,4 - -0,8 1,8 - 2

N: -999 0,8 0,5 -1,1 - -0,6 1,4 - -0,5

P: -999 -0,5 0,3 -1,2 - -0,5 -0,2 - -0,6

Q: -999 1,2 0 -1,5 - -1,1 1,1 - -0,9

R: -999 2,2 0,7 -1,1 - -1,1 0,7 - -0,8

S: -999 -0,3 0,2 1,5 - 0,6 0,4 - -0,3

T: -999 0 0 1,4 - -0,1 0,9 - 0,4

V: -1 2,1 0,5 0,9 - 0,1 1,6 - 2

W: 0 -0,1 0 -1,1 - -0,9 1,4 - 0,8

Y: 0 0,9 0,8 -0,9 - -1 1,7 - 1,1

Tabla 38: Potencial de bolsillo para el alelo HLA*1501B.

Aminoácido: P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

A: -999 0 0 0 - 0 0 - 0

C: -999 0 0 0 - 0 0 - 0

D: -999 -1,3 -1,3 -0,4 - -0,4 -0,7 - -1,9

E: -999 0,1 -1,2 -0,6 - -1 -0,7 - -1,9

F: -1 0,8 0,8 2,4 - -0,3 1,4 - -0,4

G: -999 0,5 0,2 0 - 0,5 0 - -0,8

H: -999 0,8 0,2 1,1 - -0,5 0,6 - -1,1

I: 0 1,1 1,5 0,6 - 0,05 1,5 - 0,7

K: -999 1,1 0 -0,7 - -0,3 -0,3 - -1,7

L: 0 1 1 0,5 - 0,2 1,9 - 0,5

M: 0 1,1 1,4 1 - 0,1 1,7 - 0,08

N: -999 0,8 0,5 -0,2 - 0,7 0,7 - -1,2

P: -999 -0,5 0,3 -0,3 - -0,2 0,3 - -1,1

Q: -999 1,2 0 -0,8 - -0,8 -0,3 - -1,6

R: -999 2,2 0,7 0,2 - 1 -0,5 - -1

S: -999 -0,3 0,2 -0,3 - 0,6 0,3 - -0,3

T: -999 0 0 -0,3 - -0 0,2 - -0,2

V: 0 2,1 0,5 0,2 - -0,3 0,3 - 0,3

W: -1 -0,1 0 0,4 - -0,4 0,6 - -1,4

Aminoácido: P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Y: -1 0,9 0,8 2,5 - 0,4 0,7 - -0,9

Tabla 39: Actividad biológica de ejemplo, ensayos de ejemplo e indicaciones preferidas para las BP

Proteína biológicamente activa: Actividad biológica Ensayo de actividad de ejemplo Indicación preferida

Péptido natriurético de: Estimula el músculo La inhibición de la Insuficiencia cardíaca

tipo B (BNP, péptido: liso, angiotensina puede congestiva; sobrecarga

natriurético cerebral): relajación y vasodilatación, natriuresis y supresión de renina-angiotensina y endotelina. determinarse utilizando ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando un ensayo de proliferación in vitro con fibroblastos cardíacos de rata como se describe en Naunyn Schiniedebergs Arch Pharmacol 1999 359 (5): 394-9. La vasodilatación, puede medirse en los animales por la medición de las respuestas miógenas de las arterias renales pequeñas en un sistema arteriográfico isobárico (véase Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2002 Agosto; 283 (2): R349-R355). La natriuresis se determina midiendo la cantidad de sodio en la orina. de volumen cardíaco; descompensación cardíaca; insuficiencia cardíaca; disfunción ventricular izquierda; disnea.

calcitonina (calcitonina de salmón (salcatonina); calcitonina humana-de salmón híbrida; Forcaltonina; Fortical; (CAS-2121S-62-3): Regula los niveles de calcio y fosfato en el suero; provoca una reducción en el calcio sérico – un efecto contrario al de la hormona humana paratiroidea. Bioensayo de rata hipocalcémica, ensayo de resorción ósea y el ensayo de fosa, ensayo de unión al receptor de CT, ensayo de estimulación de AMPC: J Bone Miner Res 1999 Agosto; 14 (8): 1425-31 Trastornos óseos; prevención de fracturas, hipercalcemia, hipercalcemia maligna; osteoporosis, enfermedad de Paget, osteopenia, osteoclastogénesis; osteolisis; osteomielitis; osteonecrosis, pérdida de hueso periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteopetrosis: enfermedad ósea periodontal, lítica o metastásica; inhibición de la diferenciación de osteoclastos; trastornos óseos, consolidación y regeneración ósea.

Exendina-4 (AC-2993): Estimula la síntesis y liberación de insulina; mejora la sensibilidad del tejido adiposo, el músculo y el hígado a la insulina; estimula la captación de glucosa; ralentiza el proceso digestivo; suprime el apetito; bloquea la secreción de glucagón. La actividad puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de captación de [3-H]glucosa. (J Biol Chem 22 de octubre de 1999; 274(43): 30864-30873) o utilizando un ensayo en células en el que una estirpe celular indicadora se transforma con el receptor nativo de GLP-1 y la señalización a través del receptor se mide midiendo la movilización del calcio tras el contacto con la célula con la composición de la exendina-4. La actividad puede ensayarse in vivo mediante el control de los niveles de glucosa en suero en un sujeto después de la administración. Ratas, ratones, perros y cerdos son todos modelos animales adecuados para evaluar la actividad biológica in vivo midiendo los niveles de glucosa en suero después de la administración al animal. Hiperglucemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes de tipo 1; diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID); diabetes mellitus insulinodependiente (DMID); obesidad, enfermedades del corazón, hiperglucemia, retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos vasculares; síndrome X.

Receptor del péptido: Utilización de la grasa La utilización de la Las más preferidas:

inhibidor gástrico o: como fuente de energía grasa como fuente de obesidad; diabetes;

fragmentos o variantes: predominante energía puede medirse aumento de peso

de GenBank (número: aumentada; como se describe en corporal; apetito

de registro NM 000164): disminución de la acumulación de grasa en los adipocitos. Miyawaki et al., Nat. Medicine, 2002, Vol 8 (7): 738-742. excesivo; resistencia a la insulina. Otros: pérdida de peso corporal, desgaste por SIDA, pérdida de apetito.

Glucagón (CAS 1694132-5): Induce hiperglucemia. La actividad del glucagón puede ensayarse in vitro utilizando un ensayo de captación de [3-H]glucosa. (J Biol Chem 22 de octubre de 1999; 274 (43): 30.86430.873). La actividad puede ensayarse in vivo mediante el control de los niveles de glucosa en suero en un sujeto después de la administración. Ratas, ratones, perros y cerdos son todos los modelos animales adecuados para evaluar la actividad biológica in vivo mediante la medición de los niveles de glucosa en suero después de la administración al animal. Hipoglucemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes de tipo 1; diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID); diabetes mellitus insulinodependiente (DMID); obesidad, enfermedades del corazón, hiperglucemia, retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X; trastornos endocrinos.

Péptido similar al: Estimula la síntesis y La actividad de GLP1 Hiperglucemia;

glucagón 1 (GLP1;: liberación de insulina; puede ensayarse in diabetes; diabetes

insulinotropina): mejora la sensibilidad de los tejidos adiposo, muscular y hepático a la insulina; estimula la captación de glucosa; retarda el proceso digestivo; suprime el apetito; bloquea la secreción de glucagón. vitro utilizando un ensayo de captación de [3-H]-glucosa. (J Biol Chem, 22 de octubre de 1999; 274 (43): 30864-30873) o utilizando un ensayo en células en el que una estirpe celular indicadora se transforma con el receptor nativo de GLP-1 y la señalización a través del receptor se mide midiendo la movilización del calcio tras el contacto con la célula con la composición de GLP-1. La actividad puede ensayarse in vivo mediante el control de los niveles de glucosa en suero en un sujeto después de la administración. Ratas, ratones, perros y cerdos son todos modelos animales adecuados para evaluar la actividad biológica in vivo midiendo los niveles de glucosa en suero después de la administración al animal. insípida; diabetes mellitus; diabetes de tipo 1; diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID); diabetes mellitus insulinodependiente (DMID); obesidad, enfermedades del corazón, hiperglucemia, retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

Antagonista del receptor de IL-1 (anakinra; receptor soluble de la interleucina-1; IRAP; KINERET; ANTRIL): Se une al receptor de IL-1 sin necesidad de activar las células diana; inhibe la unión de IL-1-alfa e IL-1-beta; y neutraliza la actividad biológica de IL-1-alfa e IL-1-beta. Competencia por la unión a los receptores de IL-1 en las células YT-NCI o C3H/HeJ (Carter et al., Nature 344: 633-638,1990.); inhibición de la adhesión celular de leucocitos a células endoteliales inducida por IL-1 (Carter y otros, Nature 344: 633-638, 1990); Ensayos de proliferación sobre células A375-C6, una estirpe celular de melanoma humano altamente susceptible a la acción antiproliferativa de IL-1 (Murai T et al., J. Biol Chem. 276: 6797-6806, 2001). Enfermedad autoinmune; artritis, artritis reumatoide, asma, diabetes, diabetes mellitus; GVHD; trastornos inflamatorios intestinales; enfermedad de Crohn; inflamación ocular; psoriasis; choque séptico; rechazo de trasplantes; trastornos inflamatorios; trastornos reumáticos; osteoporosis; osteoporosis posmenopáusica; ictus.

Leptina: Controla la obesidad a través de la regulación del apetito, la reducción de peso corporal y el descenso de la insulina y el nivel de glucosa. Los ensayos pueden incluir la modulación in vivo de la ingesta de alimentos, la reducción en el peso corporal y la reducción de los niveles de insulina y glucosa en ratones ob/ob, radioinmunoensayo (RIA) y activación del receptor de leptina en un ensayo en células descrito en Protein Expr Purif Diciembre de 1998; 14 (3): 335-42 Hiperglucemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes de tipo 1; diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID); diabetes mellitus insulinodependiente (DMID); obesidad, enfermedades del corazón, hiperglucemia, retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

Pramlintida (amilina): Retrasa el vaciado Los ensayos pueden Tratamiento de la

(CAS 151126-32-8): gástrico; disminuye la ingesta de alimentos. incluir la evaluación de apetito y la ingesta de alimentos, medida por métodos conocidos en la técnica (Batterham et al Nature 2002; 418: 650654.); La captación de glucosa puede medirse mediante un ensayo del músculo soleo ex vivo como se describe en la solicitud de patente de los EE.UU. N.º 20020187923. La actividad puede ensayarse in vivo mediante el control de los niveles de glucosa en suero en un sujeto después de la administración. Ratas, ratones, perros y cerdos son todos los modelos animales adecuados para evaluar la actividad biológica in vivo mediante la medición de los niveles de glucosa en suero después de la administración al animal. obesidad; tratamiento de la diabetes; supresión de la ganancia de peso corporal; supresión del apetito; tratamiento de trastornos endocrinos; Hiperglucemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes de tipo 1; diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID); diabetes mellitus insulinodependiente (DMID); obesidad, enfermedades del corazón, hiperglucemia, retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

PYY (Péptido YY),: Disminuye el apetito; El apetito y la ingesta Tratamiento de la

incluyendo PYY336: aumenta la saciedad; de alimentos pueden obesidad; tratamiento

(restos de aminoácidos: disminuye la ingesta de medirse por métodos de la diabetes;

31-64 de PYY de: alimentos. tales como se supresión de la

longitud completa,: describen en ganancia de peso

restos de aminoácidos: Batterham et al. Nature corporal; supresión del

3-36 de PYY maduro): 2002; 418: 650654) apetito. Hiperglucemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes de tipo 1; diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID); diabetes mellitus insulinodependiente (DMID); obesidad, enfermedades del corazón, hiperglucemia, retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

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