CN1546523A - 一种PEG聚β肽及其制备方法 - Google Patents
一种PEG聚β肽及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1546523A CN1546523A CNA2003101089851A CN200310108985A CN1546523A CN 1546523 A CN1546523 A CN 1546523A CN A2003101089851 A CNA2003101089851 A CN A2003101089851A CN 200310108985 A CN200310108985 A CN 200310108985A CN 1546523 A CN1546523 A CN 1546523A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- poly
- beta
- peptide
- peg
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明属生物基因工程技术领域，涉及一种PEG聚β肽及其制备方法。本发明应用基因工程的方法制备重组三聚β肽和二聚β肽后，进行PEG化，获得PEG－三聚β肽和PEG－二聚β肽，所述产品具有水溶性强、长效和便于使用的特点。本发明能克服小分子多肽在生物体内易被蛋白酶降解，或与体内的蛋白质结合而造成生物稳定性差和易被肾小球滤过的缺陷，可延长体内半衰期，充分发挥其生理作用。本发明作用于肿瘤细胞的黏附过程，可制备用于治疗肿瘤复发转移的药物制剂，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属生物基因工程技术领域，涉及一种PEG聚β肽及其制备方法，具体涉及抗肿瘤转移复发肽-PEG聚β肽及其制备方法。
背景技术
近年来分子生物学及肿瘤治疗学上长足的进步使肿瘤已从不治到可治，治疗手段及效果不断进步，但肿瘤的复发和转移仍是影响病人生存期的重大障碍。据统计，世界每年的肿瘤发病人数在800万左右，我国肿瘤得发病人数占了世界的10％左右，大部分的患者在得病后会发生复发和转移。
肿瘤的转移是一个具有多种分子参与的具有明显靶向性的连续过程。一般要经过肿瘤细胞从原位灶上游出、血管传输、与血管内皮细胞相互作用并出血管，侵犯靶组织，肿瘤扩张性生长等基本步骤。所以肿瘤细胞及血管内皮细胞表面的粘附分子均与转移复发密切关联。从某种意义上讲阻断细胞粘附或由整合蛋白介导的信号传导可能是预防肿瘤转移和复发的最佳途径。
有研究报道，作用于肿瘤侵袭和转移的合成多肽的抑制作用大多涉及从主要的基质蛋白如纤维连接蛋白、胶原蛋白和纤维蛋白原的共有保守序列来的RGD三肽；源自基底膜层粘蛋白的YIGSR五肽；来自纤连蛋白核心序列的抗粘附肽EILDV。
有研究根据整合蛋白亚基的保守序列，设计的抗粘附β肽，证实了它的阻断细胞间粘附(肿瘤细胞与基质、肿瘤细胞间、肿瘤细胞与内皮细胞、肿瘤细胞与淋巴细胞间的相互作用)。应用高转移的人肝癌裸鼠模型LCID20证实了其对肝癌切除术后肝内转移和肺转移的强大抑制作用(J Cancer Res Clin Oncol.2000，126:595-600)，同时研究证明β肽能在促进细胞分化和表型逆转中起作用(J Biochem(Tokyo)1997，121:961-968)。
抗肿瘤研究中多使用的是根据细胞外基质(ECM)如FN等的粘附序列RGDS类的小分子多肽或其衍生物，但由于其分子小、半衰期短，易于酶介，发挥抗复发转移作用剂量大而难以推广。故进而设计了合成肽的多聚体和衍生物，大致包括，(1)核心肽段的重复序列，如(GRGD)n(n＞3).(2)合成肽的多聚乙二醇结合物的合成。(3)合成肽N端的化学修饰如连接6-o-硫酸(6-o-羧甲基)-壳多糖(SCM)，四氢呋喃四羧酸(THFTCA)(4)制备环状多肽如环(RGDT)n，或环RGDPhg等。(5)合成肽N-端的乙酰化。(Res.Adv.In Biosci..&Bioeng.1，65-83，2000)
发明内容
本发明的目的是提供一种新型抗肿瘤转移多肽，包括重组三聚β肽和二聚β肽，及其制备方法，本发明的进一步目的是提供PEG化学修饰重组肽β2和β3复合物及其制备方法。
本发明在前期工作的基础上，应用基因工程的方法制备重组三聚β肽和二聚β肽后，对三聚β肽和二聚β肽进行PEG化，获得PEG-三聚β肽和PEG-二聚β肽，所述产品具有水溶性强、长效和便于使用的特点。
本发明设计编码了三聚β肽的基因序列，构建三聚β肽的重组表达质粒(pET-His-β3)和相应的大肠杆菌表达的工程菌(BL21(DE3)plysS/pET-His-β3)，确立融合蛋白的表达条件和体系并获得一定的产率。
本发明通过下述方法和步骤进行，
一、构建三聚β肽表达质粒
具有(DLYYLMRLSYSMKGG)n-DLYYLMRLSYSMK的氨基酸序列的肽命名为β肽。
三聚β肽的氨基酸序列为：
DLYYLMRLSYSMKGGDLYYLMRLSYSMKGGDLYYLMRLSYSMK，
即β肽-GG-β肽-GG-β肽，简称β3。
二聚β肽的氨基酸序列为：
DLYYLMRLSYSMKGGDLYYLMRLSYSMK，即β肽-GG-β肽，简称β2。
1.根据大肠杆菌的偏爱密码子人工合成编码三聚β肽如下序列的基因片段：
GGA TCC GAT CTG TAT TAT CTG ATG GAT CTG AGC TAT AGC ATG AAAGGC GGC GAC CTG TAC TAC TTA ATG GAC CTG TCT TAT TCT ATG AAG GGTGGT GAT TTA TAC TAT TTG ATG GAT TTG TCC TAC TCC ATG AAA
CTC GAG，两端的酶切位点分别是BamHI和XhoI，装入pUCm-T质粒中。转化大肠杆菌DH5α。
2.采用pET-His(由美国Genepower实验室研发)作为表达载体，其具有如下结构：
pET-His，vector size：2.9kb。
3.设计PCR引物，以pUCm-T-β3为模板，扩增出149bp的β3序列，将其两端的酶切位点该位BamHI和NheI。
引物1为：GAC
GGA TCC GAT CTG TAT TAT CTG ATG；
引物2为：GAC CA
G CTA GCT TTC ATG GAG TAG GAC AAA TCC。
4.用Qiaquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)将上述PCR产物回收，经BamHI和NheI双酶切后回收141bp三聚β肽基因片段。
5.将pET-His表达载体经BamHI和NheI双酶切后，用Qiaquick Gel ExtractionKit(QIAGEN公司)回收2.9kd的切后片段。
6.连接三聚β肽基因片段，连接产物转化大肠杆菌TOP10F’。
7.用PCR法筛选阳性菌落，扩增出149bp产物。
8.将上述筛选的阳性菌落测序。结果显示，β3片断插入正确，序列正确。表达产物为PET-His-β3融合蛋白，共64个氨基酸，序列为：
MGSSHHHHHHSSGLVP RGSDLYYLMDLSYSMKGGD LYYLMDLSYSMKGG
DLYY LMDLSY SMKAS。
二、构建His--β3融合蛋白表达工程菌和建立表达体系
1.将上述重组质粒pET-His-β3转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，11小时后挑取单菌落接种进20ml LB(+glucose 0.2％+Amp 120μg/ml)，80rpm，30℃培养至OD600约为0.5，加入IPTG至终浓度100μg/ml，160rpm，37℃诱导2小时。
2.取1ml菌液离心收集菌体，做15％Tricine SDS-PAGE分析表达情况，结果表明，有明显的7.2kD的β3-His多肽的表达，表达产物约占细胞总蛋白的10％。
3.取1ml菌液离心收集菌体，重悬于PBS溶液中，超声破细菌，12000g离心10分钟，将上清与沉淀分别上样电泳，显示β3的表达产物是以包涵体形式存在的，表达量约为细胞总不溶性蛋白的15％。
三、β3-His的分离和β3、β2、β1的纯化
1.挑取单菌落接种进20ml LB(+glucose 0.2％+Amp 120μg/ml)中，80rpm，30℃培养至OD600约为0.5，作为种子液。将5ml种子液加入200ml LB(+glucose0.2％+Amp 120μg/m1)中，35℃，180转/分2-3小时至OD600＝0.6时加IPTG100μg/ml，30℃诱导2小时。
2.离心收集菌体，重悬于10ml GuNTA-0 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol，6M Guanidium HCl)中，再加入PMSF至1mM。
3.冰上超声破碎细菌，室温放置30分钟，间或混匀。
4. 4℃，15000rpm离心15分钟，弃去沉淀。
5.将1ml NTA树脂加入到层析柱中，用10ml GuNTA-0 Buffer洗柱。
6.上清加入NTA层析柱中，用5ml的GuNTA-0 Buffer洗柱。
7.用5ml的洗脱液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6MGuanidium HCl，60mM Imidazole)洗脱，收集洗脱液。
8.将洗脱液装入透析袋，用PBS透析，4℃过夜，结果显示有白色沉淀析出。
9.离心收集沉淀，将上清和沉淀进行15％Tricine SDS-PAGE分析，结果显示纯化后的7.2kD的His-β3条带，纯度约为99％。
10.将上述His-β3表达产物进一步质谱分析，结果显示表达产物正确。
11.将上述His-β3融合蛋白溶于10％Triton X-100，加入凝血酶酶切20小时，结果产生两个片断，分别是1.8kD的His片断和5.4kD的β3片断，回收率为85％。
12.纯化的β3结构中含有胰蛋白酶酶切位点，按常规进行有限酶介，即可得到β2、β1。
四、制备PEG化学修饰重组三聚β肽(β3)和二聚β肽(β2)复合物
本发明的β3和β2复合物由重组肽β2、β3和聚乙二醇衍生物组成。
所述重组肽β2和β3的N端含有氨基，所述聚乙二醇衍生物-单甲氧基聚乙二醇丙基醛含有醛基，二者在还原剂的作用下发生化学反应，形成复合物。所述复合物具有生物稳定性高和体内半衰期长的优点。
本发明通过化学修饰方法制备重组肽β2、β3复合物。
本发明将上述重组肽和单甲氧基聚乙二醇衍生物-单甲氧基聚乙二醇丙基醛(mPEG-ALD)混和，重组肽β2和β3 N端氨基与mPEG-ALD的醛基在还原剂的作用下发生化学反应，从而获得PEG化学修饰重组肽β2和β3复合物，简称mPEG-β2、mPEG-β3。
本发明mPEG-β2、mPEG-β3能克服由于β2、β3为小分子多肽，在生物体内易被蛋白酶降解，或与体内的蛋白质结合而造成生物稳定性差和易被肾小球滤过的缺陷，可延长体内半衰期，充分发挥其生理作用。本发明作用于肿瘤细胞的黏附过程，可制备用于治疗肿瘤复发转移的药物制剂，具有广泛的应用前景，按保守的估计，10％的病人(约50万)，应用此类药物，每人使用10次(一月的疗程)，每次费用约100元，每年的产值约5亿。
附图说明
图1是pET-His表达质粒的结构示意图
其结构中含有His tag，凝血酶酶切位点和外源基因片段的插入的度克隆
位点，表达的融合蛋白含有His6的标签。
图2是BL21(DE3)plysS/pET-His-β3工程菌表达产物的SDS-PAGE分析图。
图3是His-β3的纯度分析图。
具体实施方式
实施例1制备化学修饰重组β2肽复合物
称取1份重量的β2肽溶于10份重量的二甲亚砜(DMSO)中，使之溶解，再加入990份重量的10mM的Tris-HCl PH6.0溶液，使之充分溶解；
向上述溶液中加入20～330份重量的分子量为20000的丙醛聚乙二醇(ALD-PEG)，混和均匀，混和后的溶液中待修饰的重组β2肽和ALD-PEG的摩尔比为1∶5～50，4℃静置1h；
上述所得混合溶液中加入少量还原剂，如二硫基苏糖醇(DTT)或硼氢氰化钠，4-37℃静置反应12-48h；
反应结束后，取20μl反应物进行SDS-PAGE电泳检查修饰程度；
取修饰反应混合物上凝胶过滤层析柱进行分离纯化，去除未修饰的β2肽和修饰剩余的ALD-PEG，分离纯化条件为：层析柱Superdex75(1×30cm)，缓冲液为含有0.15mol/Lna，CL的5mM PB PH7.4，流速为0.5ml/min，柱压为1.5Mpa；
收集PEG化学修饰β2肽复合物单点修饰吸收峰溶液；
将收集到的PEG单点修饰吸收峰溶液进行浓缩，冷冻干燥得纯化的PEG修饰的重组β2肽复合物。
实施例2制备化学修饰重组β3肽复合物
称取1份重量的β3肽溶于10份重量的二甲亚砜(DMSO)中，使之溶解，再加入990份重量的10mM的Tris-HCl PH6.0溶液，使之充分溶解；
向上述溶液中加入20～330份重量的分子量为20000的丙醛聚乙二醇(ALD-PEG)，混和均匀，混和后的溶液中待修饰的重组β3肽和ALD-PEG的摩尔比为1∶5～50，4℃静置1h；
向上述所得混合溶液中加入少量的还原剂，如二硫基苏糖醇(DTT)或硼氢氰化钠，4-37℃静置反应12-48h；
反应结束后，取20μl反应物进行SDS-PAGE电泳检查修饰程度；
取修饰反应混合物上凝胶过滤层析柱进行分离纯化，去除未修饰的β3肽和修饰剩余的ALD-PEG，分离纯化条件为：层析柱Superdex75(1×30cm)，缓冲液为含有0.15mol/Lna，CL的5mM PB PH7.4，流速为0.5ml/min，柱压为1.5Mpa；
收集PEG化学修饰β3肽复合物单点修饰吸收峰溶液；
将收集到的PEG单点修饰吸收峰溶液进行浓缩，冷冻干燥得纯化的PEG修饰的重组或β3肽复合物。
Claims (11)
1、一种PEG聚β肽，其特征是由重组肽和聚乙二醇衍生物组成，所述重组肽具有下述氨基酸序列(DLYYLMRLSYSMKGG)n-DLYYLMRLSYSMK。
2、按权利要求1所述的PEG聚β肽，其特征是所述重组肽包括重组三聚β肽和二聚β肽。
3、按权利要求2所述的PEG聚β肽，其特征是所述重组三聚β肽具有下述氨基酸序列：DLYYLMRLSYSMKGGDLYYLMRLSYSMKGGDLYYLMRLSYSMK。
4、按权利要求2所述的PEG聚β肽，其特征是所述重组二聚β肽具有下述氨基酸序列：DLYYLMRLSYSMKGGDLYYLMRLSYSMK。
5、按权利要求2所述的PEG聚β肽，其特征是所述重组三聚β肽的融合蛋白的表达产物PET-His-β3融合蛋白具有下述氨基酸序列，
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDLYYLMDLSYSMKGGDLYYLMDLSYSMKGGDLYY LMDLSYSMKAS。
6、权利要求1的PEG聚β肽的制备方法，包括下述步骤，
设计编码三聚β肽的基因序列，构建三聚β肽的重组表达质粒和相应的大肠杆菌表达的工程菌，确立融合蛋白的表达条件和体系，将上述重组肽和单甲氧基聚乙二醇衍生物混和，在还原剂作用下反应。
7、权利要求6的PEG聚β肽的制备方法，其中三聚β肽编码基因序列是，
GGA TCC GAT CTG TAT TAT CTG ATG GAT CTG AGC TAT AGC ATG AAA
GGC GGC GAC CTG TAC TAC TTA ATG GAC CTG TCT TAT TCT ATG AAG
GGT GGT GAT TTA TAC TAT TTG ATG GAT TTG TCC TAC TCC ATG AAA
CTC
GAG，
8、权利要求6所述的PEG聚β肽的制备方法，其特征是所述重组表达质粒是pET-His-β3。
9、权利要求6所述的PEG聚β肽的制备方法，其特征是所述大肠杆菌表达的工程菌是BL21(DE3)plysS/pET-His-β3。
10、权利要求6所述的PEG聚β肽的制备方法，其特征是所述单甲氧基聚乙二醇衍生物是单甲氧基聚乙二醇丙基醛。
11、按权利要求6所述的PEG聚β肽的制备方法，其特征是所述融合蛋白的表达为IPTG诱导表达和透析沉淀。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2003101089851A CN1546523A (zh) | 2003-12-01 | 2003-12-01 | 一种PEG聚β肽及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2003101089851A CN1546523A (zh) | 2003-12-01 | 2003-12-01 | 一种PEG聚β肽及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1546523A true CN1546523A (zh) | 2004-11-17 |
Family
ID=34334969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2003101089851A Pending CN1546523A (zh) | 2003-12-01 | 2003-12-01 | 一种PEG聚β肽及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1546523A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102348715A (zh) * | 2009-02-03 | 2012-02-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
-
2003
- 2003-12-01 CN CNA2003101089851A patent/CN1546523A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102348715A (zh) * | 2009-02-03 | 2012-02-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
| CN102348715B (zh) * | 2009-02-03 | 2017-12-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
| CN108530543A (zh) * | 2009-02-03 | 2018-09-14 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
| CN108530543B (zh) * | 2009-02-03 | 2023-06-23 | 阿穆尼克斯制药公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2005509609A5 (zh) | ||
| WO2009079910A1 (en) | An erythropoietin mimetic peptide derivatives and its pharmaceutical salt, the preparation and uses thereof | |
| CN101260145B (zh) | 一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 | |
| CN1243022C (zh) | 生物修饰重组人生长激素复合物及其制备方法 | |
| CN102286091B (zh) | 胸腺肽α1的固相合成工艺 | |
| CN115960209B (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白及其应用 | |
| CN101525387B (zh) | 重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法 | |
| CN1405181A (zh) | 血清白蛋白与干扰素的融合蛋白 | |
| CN104232666A (zh) | 表达重组艾塞那肽的基因及其载体 | |
| CN111454457B (zh) | 一种以树状分子为侧链的手性肽类抗菌聚合物及其制备方法 | |
| TW201002350A (en) | Polyethylenenized erythropoietin conjugate, preparation thereof and its use | |
| CN1651463A (zh) | 一种单甲氧基聚乙二醇－胰岛素复合物及其制备方法 | |
| CN1546523A (zh) | 一种PEG聚β肽及其制备方法 | |
| CN1990862A (zh) | 重组人α1－胸腺肽生产方法及制剂 | |
| JP5225393B2 (ja) | 水溶性高分子修飾ｇ−ｃｓｆ複合体 | |
| CN1535283A (zh) | 从融合多肽制备感兴趣的多肽的方法 | |
| RU2447149C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN111484551B (zh) | 一种聚乙二醇修饰的重组人碱性成纤维细胞生长因子 | |
| WO2005017174A2 (en) | Process for the purification of recombinant polypeptides | |
| CN102559725A (zh) | 人干细胞生长因子及其聚乙二醇修饰化产物的生产方法及用途 | |
| CN101717432B (zh) | 聚谷氨酸及其在药品、化妆品、食品和水处理中的应用 | |
| CN1513471A (zh) | 低分子量硫酸软骨素注射剂及其制备方法 | |
| CN1321690A (zh) | 一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用 | |
| CN1313489C (zh) | GP－胸腺素α1及其制备方法 | |
| CN1616652A (zh) | 高效表达人α1－胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |