CN104232666A - 表达重组艾塞那肽的基因及其载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供表达重组艾塞那肽的基因及其载体，以多基因串联的方式构建本发明所述的基因，其适于在表达载体中高效率稳定地表达重组艾塞那肽融合蛋白。

Description

表达重组艾塞那肽的基因及其载体

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种表达重组艾塞那肽的基因及其载体。 

本发明还涉及重组艾塞那肽的制备方法。 

背景技术

艾塞那肽(Exendin-4，降血糖药)是首个在美国获准上市用于治疗II型糖尿病的肠促胰岛素分泌肽，是一个由39个氨基酸组成的多肽，能有效地控制II型糖尿病患者的血糖。Exendin-4的作用机制包括促胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、增加β细胞质量、减缓胃排空和抑制食欲等。艾塞那肽可以通过化学合成或基因重组的方法获得。 

目前，重组艾塞那肽的生产方法集中在采用单个艾塞那肽基因或单个融合蛋白基因进行表达，属于单基因表达，所得融合蛋白经纯化、水解等工艺步骤后，获得重组艾塞那肽。但对于艾塞那肽而言这种表达方式往往表达率低，造成艾塞那肽产量和纯度偏低，产业化受到很大影响。所以，提高艾塞那肽表达率，对促进艾塞那肽产业化效率有重大意义。 

刘延杰等(生物技术，2011年，21(5))报道的利用艾塞那肽在大肠杆菌中的串联表达，但由于文献采用的仅仅是艾塞那肽基因多拷贝重复，表达出的是一整条含有多个艾塞那肽分子的蛋白链，该链经肠激酶水解得到分子量4773道尔顿的艾塞那肽分子，比分子量4187道尔顿的天然艾塞那肽分子增加了5个氨基酸，即在艾塞那肽分子的C端留存了肠激酶位点(DDDDK)不能除去，因而其得到的不是真实的艾塞那肽，而是艾塞那肽的类似物。事实上，这种串联设计方式所具有的缺陷是现有生物技术无法解决的。 

杨利军等报道的一种小肽的多顺反子串联表达方法(中国生物工程杂志，，2006年，26(11))，在目的基因5′端设计SD序列和起始密码ATG，在目的基因3′端设计终止密码，在每一顺反子前设计合适限制性DNA酶切位点使目的基因以三拷贝串联方式排列，每一拷贝都有独立的起始密码和终止密码。顺反子之间有设计的SD序列，然后利用pet系列表达载体对多顺反子串联基因进行表达，使表达产率有提高，但这种表达缺点是表达产物的N端仍保留有蛋氨酸无法去掉，不能得到完全真实的目标蛋白。而且，因为表达的是细菌外源蛋白，所以 表达产物往往以包涵体形式存在，给后续纯化带来困难。 

金明飞等报道了一种基因串联原核高效表达胸腺肽α1(中国生物工程杂志，2007，27(1))的方法，通过人工合成含有SD序列、胸腺肽α1基因、纯化标签和酶切位点的DNA序列作为构建元件，利用同尾酶将其依次克隆到pET-32a中，得到含有1～8个不同重复数目的各自含SD序列基因的串联表达载体，表达蛋白经纯化后、酶切出多个胸腺肽α1。这种表达方式不但在每个串联的基因中不含有伴体蛋白分子，而且在将串联基因与pet-32a质粒重组时，去掉了pet-32a质粒中的硫氧还蛋白基因，所以表达出的是胸腺肽α1的串联体，而非融合蛋白。对于细菌来说，这种纯粹的外源多肽或蛋白，要么以分泌蛋白形式分泌到胞外，要么以包涵体形式存在于胞内；如果以可溶的形式存在于胞内，就极易被胞内的水解酶大量降解，造成表达率极低。事实上，对于艾塞那肽来说，在我们的一个实施例中，以这种思路来设计，并没有表达成功。 

发明内容

本发明的一个目的是提供表达重组艾塞那肽的基因，以多基因串联的方式构建本发明所述的基因，其适于在表达载体中高效率稳定地表达重组艾塞那肽融合蛋白。 

本发明的另一个目的是提供含有本发明表达重组艾塞那肽基因的表达载体，所述表达载体优选为质粒载体。 

本发明也提供包含所述表达载体的宿主，所述宿主优选为大肠杆菌。 

本发明还提供一种重组艾塞那肽的制备方法，包括构建本发明所述的表达重组艾塞那肽的基因，将所述基因转入表达载体，用所述表达载体转化宿主，培养所述转化的宿主获得重组艾塞那肽融合蛋白，分离并纯化获得的融合蛋白。 

根据本发明的一方面，构建表达重组艾塞那肽的基因，一种表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，具有由下述表达元件串联组成的表达序列： 

(M—H—B—C—D—E—F)—(L—S—M—H—B—C—D—E—F)_n

其中M为起始密码子；H为编码his标签的核苷酸序列；B为编码伴体蛋白的核苷酸序列；C为编码连接肽的核苷酸序列；D为编码肠激酶识别位点的核苷酸序列；E为编码艾塞那肽的核苷酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核苷酸序列；S为SD序列；n为正整数；F为终止密码子； 

所述基因所表达的融合蛋白的特征为：每一个融合蛋白分子由一个起始氨 基酸、一个his标签、一个伴体蛋白分子、一个连接肽、一个肠激酶位点和一个艾塞那肽分子组成。 

将上述基因串联后与质粒重组后，形成串联表达载体，表达载体转化到宿主细胞中，通过发酵或细胞培养，产生融合蛋白。融合蛋白经层析、水解等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽具有完全相同的氨基酸序列。 

在本发明中，融合蛋白是可溶性表达，而非包涵体表达。表达的融合蛋白位于细胞内，并不分泌到细胞外。 

在已报道的艾塞那肽表达设计中，往往采用单个艾塞那肽基因或单个融合蛋白基因进行表达。但艾塞那肽不同于其它多肽，对于艾塞那肽来说，这种单个基因的表达方式往往表达率很低。本发明的设计是考虑到现有许多市售质粒都有一个强力启动子，在强力启动子的作用下，基因的转录速度极快，能以极快的速度产生大量的mRNA分子，但是，由于翻译速度跟不上，造成部分细胞内mRNA分子被降解，浪费细胞内资源，使得蛋白表达效率低下，目标蛋白产量很少。因而，本发明将多个融合蛋白基因进行串联，串联后的多个基因受同一启动子调控，转录出的mRNA具有多个核糖体结合位点和起始密码子，可以同时结合多个核糖体并同时进行多个融合蛋白分子的翻译，使得融合蛋白的表达效率得到显著提高。 

在本发明中，表达出的融合蛋白分子由起始氨基酸即蛋氨酸、his标签、伴体蛋白、连接肽、肠激酶位点、艾塞那肽6个部分组成。虽然设计了多个融合蛋白基因进行串联表达，但每一个基因表达出的融合蛋白分子的氨基酸序列是完全相同的。 

本发明中伴体蛋白(或称分子伴侣、或分子伴侣蛋白)可以帮助艾塞那肽正确折叠。更且，由于采用的伴体蛋白为细菌的一些自身蛋白，在翻译后的蛋白修饰中，细菌不会将这种融合蛋白视为外源蛋白而酶解之，所以，可有效地减少艾塞那肽在细胞内降解，维持艾塞那肽结构稳定。优选的伴体蛋白为细菌硫氧还蛋白(TRX) 

本发明中设计了his标签作为纯化标签，his标签是由4～10个组氨酸构成一段序列，可以与金属离子，如镍离子或锌离子有高亲和力，所以利用金属离子亲和层析可有效对融合蛋白进行纯化。 

本发明设计了肠激酶识别位点，即天冬氨酸—天冬氨酸—天冬氨酸—天冬氨酸—赖氨酸，即DDDDK五个氨基酸，肠激酶的高度专一性水解能力可保证艾塞那肽N端正确性，使重组艾塞那肽与天然艾塞那肽具有完全相同的氨基酸序列。 

本发明中的连接肽是由多个甘氨酸和丝氨酸交替相连构成，优选的氨基酸数为5～10个，其意义在于可以让伴体蛋白更有效地促进艾塞那肽折叠以及使肠激酶位点更好地暴露。 

在本发明中，由于转录出的mRNA在翻译时，可以让一个以上的核糖体同时结合到mRNA分子上，为了让相邻核糖体有充分的间隔，所以设计了L序列作为间隔序列，以减少相互之间的干扰。L序列的设计是利用了pet22b质粒中T7启动子和乳糖操纵子之后，SD序列之前的一段序列，该序列为TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTT。 

在本发明中，串联了多个融合表达基因，除第一融合蛋白基因外，后续的每个融合蛋白基因前面都设计有SD序列。在本发明中，SD序列为AAGAAGGAGA，SD序列可以有多个选择，但本发明中的SD序列中的AAGGAG是最强的核糖体结合位点，有利于多个核糖体与mRNA的结合。SD序列是细菌mRNA起始密码子AUG上游5～10个碱基左右处的一段富含嘌呤的碱基序列，它能与细菌16SrRNA3′端识别，帮助从起始AUG处开始翻译，它是1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现的，故此而命名。由于市售表达载体都设计有SD序列，故在本发明中，第一个融合蛋白基因前面没有特别设计SD序列，而是直接利用质粒的SD序列。这是因为考虑到多数载体的多克隆位点设计在SD序列之后，因而这种设计思路更利于串联基因与表达载体的重组工作。 

每个融合蛋白基因都有自己的起始密码子ATG，因而在多个核糖体同时结合到mRNA后，可同时分别独立进行多个融合蛋白分子的翻译，提高融合蛋白的表达效率。 

本发明将多个融合蛋白基因进行串联，串联后的多个基因受同一启动子调控，转录出的mRNA具有多个核糖体结合位点和起始密码子，可以同时结合多个核糖体并同时进行多个融合蛋白分子的翻译，使得融合蛋白的可溶性表达效率得到显著提高。融合蛋白经层析、水解等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽氨基酸序列完全相同。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明重组艾塞那肽的制备方法进行详细描述。所用的所有实验试剂和仪器设备，如无特别说明均为普通市售。 

设计多个融合蛋白基因进行串联表达，串联后的多个基因受同一启动子调控，其串联表达方案设计为： 

(M—H—B—C—D—E—F)—(L—S—M—H—B—C—D—E—F)_n

其中M为起始密码子ATG，H为编码his标签(例如his标签)的核酸序列；B为编码伴体蛋白的核酸序列；C为编码连接肽的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点(即DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；n为正整数。F为终止密码子。 

在上述串联序列两端引入相应的粘性末端，全部序列可以通过人工合成的方式获得，众多基因公司从事该类服务。 

合成后上述串联基因与质粒进行重组，重组质粒可通过市售获得。将重组后的质粒转化到感受态细胞中，通过细胞培养、发酵和诱导表达，通过电泳等技术手段，可以检查融合蛋白表达率。 

所表达的融合蛋白的特征为：每一个融合蛋白分子由一个起始氨基酸(即蛋氨酸)、一个his标签、一个伴体蛋白分子、一个连接肽、一个肠激酶位点、一个艾塞那肽分子6个部分组成。 

因为设计融合蛋白是可溶性表达，且所表达的融合蛋白位于细胞内。所以，通过离心处理，收集细胞，通过将细胞破碎使融合蛋白从细胞中释放出来，再经澄清处理，得到含融合蛋白澄清液体。 

采用金属离子亲和层析，超滤、肠激酶水解、去除伴体蛋白、反相层析、去除有机溶剂等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽具有完全相同的氨基酸序列。 

将多个融合蛋白基因进行串联，串联后的多个基因受同一启动子调控，转录出的mRNA具有多个核糖体结合位点和起始密码子，可以同时结合多个核糖体并同时进行多个融合蛋白分子的翻译，使得融合蛋白的可溶性表达效率得到显著提高。融合蛋白经层析、水解等工艺步骤，可纯化出高纯度艾塞那肽，与天然艾塞那肽氨基酸序列完全相同。 

pet系列质粒、大肠杆菌BL21(DE3)购自MERCK公司，基因合成及质粒的测序委托生工生物工程(上海)有限公司合成，T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶Nde I和Xho I购自生工生物工程(上海)有限公司，胶回收试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。 

【实施例1】二个融合蛋白基因串联表达载体的构建

1、设计方案 

本实施例设计方案为下式: 

(M—H—B—C—D—E—F)—(L—S—M—H—B—C—D—E—F) 

其中M为起始密码子ATG，H为编码his标签(6个组氨酸组成)的核酸序列；B为编码伴体蛋白(硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽(5肽，GSGSG)的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点(DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。 

2、方法 

(1)融合蛋白串联表达基因 

人工合成如上述方案所示的两个融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和Xho I酶切位点(分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和终止密码子，两个基因之间有间隔序列，第二个基因含有自己的SD序列，而第一个基因则利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO.1所示。 

(2)重组质粒的构建 

将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出两个融合蛋白串联表达质粒。 

(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。 

(4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。 

(5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。 

【实施例2】三个融合蛋白基因串联表达载体的构建

1、设计方案 

本实施例设计方案为下式: 

(M—H—B—C—D—E—F)—(L—S—M—H—B—C—D—E—F)₂

其中M为起始密码子ATG，H为编码his标签(8个组氨酸组成)的核酸序列；B为编码伴体蛋白(硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽(10肽，GSGSGSGSGS)的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点(DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。序列如SEQ ID NO.2所示。 

2、方法 

(1)融合蛋白串联表达基因 

人工合成如上述方案所示的三个融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和Xho I酶切位点(分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和终止密码子，两个相邻基因之间有间隔序列，第2、第3个基因含有自己的SD序列，而第一个基因则利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO.2所示。 

(2)重组质粒的构建 

将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出3个融合蛋白的串联表达质粒。 

(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。 

(4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。 

(5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。 

【实施例3】四个融合蛋白基因串联表达载体的构建

1、设计方案 

本实施例设计方案为下式: 

(M—H—B—C—D—E—F)—(L—S—M—H—B—C—D—E—F)₃

其中M为起始密码子ATG，H为编码his标签(8个组氨酸组成)的核酸序列；B为编码伴体蛋白(硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽(10肽，GSGSGSGSGS)的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点(DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。 

2、方法 

(1)融合蛋白串联表达基因 

人工合成如上述方案所示的四个融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和Xho I酶切位点(分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和终止密码子，两个相邻基因之间有间隔序列，第2、第3、第4个基因含有自己的SD序列，而第一个基因则利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO.3所示。 

(2)重组质粒的构建 

将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出4个融合蛋白的串联表达质粒。 

(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。 

(4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。 

(5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。 

【实施例4】单个融合蛋白基因表达载体的构建(非串联表达)

1、设计方案 

本实施例设计方案为下式: 

(M—H—B—C—D—E—F) 

其中M为起始密码子ATG，H为编码his标签(6个组氨酸组成)的核酸序列；B为编码伴体蛋白(硫氧还蛋白，TRX)的核酸序列；C为编码连接肽(5肽，GSGSG)的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点(DDDDK)的核酸序列； E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。 

2、方法 

(1)融合蛋白基因 

人工合成如上述方案所示的融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和Xho I酶切位点(分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端。序列如SEQ ID NO.4所示。 

(2)重组质粒的构建 

将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出单个融合蛋白表达质粒。 

(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。 

(4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。 

(5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。 

【实施例5】两个艾塞那肽基因串联，每个基因有自己的SD序列，艾塞那肽基因没有和伴体蛋白基因融合

1、设计方案 

本实施例设计方案为下式: 

(M—H—C—D—E—F)—(L—S—M—H—C—D—E—F) 

其中M为起始密码子ATG，H为编码his标签(6个组氨酸组成)的核酸序列；C为编码连接肽(5肽，GSGSG)的核酸序列；D为编码肠激酶识别位点(DDDDK)的核酸序列；E为编码艾塞那肽的核酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核酸序列；S为SD序列；F为终止密码子。 

2、方法 

(1)融合蛋白串联表达基因 

人工合成如上述方案所示的两个融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和 Xho I酶切位点(分别为CATATG和CTCGAG)作为粘性末端，每个基因都含有自己的起始密码子和终止密码子，两个基因之间有间隔序列，第二个基因含有自己的SD序列，而第一个基因则利用质粒所带的SD序列。序列如SEQ ID NO.5所示。 

(2)重组质粒的构建 

将合成的上述序列的基因用Nde I和Xho I双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和Xho I双酶切的pet-22b(+)质粒连接，构建出两个融合蛋白串联表达质粒。 

(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。 

(4)将重组质粒测序，结果表明所构建的表达载体正确。 

(5)保存菌种，建立种子库，获得生产重组艾塞那肽的工程菌。 

【实施例6】不同基因设计方案表达效果比较 

可以看出，采用融合蛋白基因的串联表达方式，表达率明显高于单个融合蛋白基因的表达。而单独对艾塞那肽基因进行串联表达，表达率为零。 

【实施例7】发酵工艺(40升) 

1、培养基： 

1)一级种子用LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g。 

2)发酵罐发酵基础培养基(22L)：蛋白胨20g，酵母粉110g，NaCl77g。 

3)完全M9培养基(2L)：5*M9盐溶液(500ml),葡萄糖88g，七水硫酸镁10.824g，两水氯化钙0.323g， 

4)5*M9盐溶液(500ml)：无水磷酸氢二钠141.96g，磷酸二氢钾66g，氯化钠11g，氯化铵：22g 

5)补碳液：七水硫酸镁30g，葡萄糖800克，甘油360ml 

6)补氮液:酵母粉400g，蛋白胨400g，硫酸铵400g 

2、种子菌培养： 

取菌种划平板，37℃培养约16hr，挑单克隆接种于含50～100ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的锥形瓶中，37℃，250rpm培养8小时左右。 

3、高密度发酵培养： 

40L发酵罐中加入22L发酵用基础培养基，加入活化种子菌50～100ml，另加入适量消泡剂，于37℃，pH7.0的条件下发酵。发酵早期可控制通气在10L/min，转速150rpm，进入对数生长期控制溶解氧浓度在30％～50％，溶解氧浓度不足时，最大转速可达750rpm。pH使用自动流加2N的HCl或氨水调节至7.0。发酵过程中取样测定OD600和菌体密度，当溶解氧增加、PH值逐渐升高时开始加入补碳液，半个小时后开始加入补氮液。当菌体生长至对数生长后期时一次性加入IPTG进行诱导，IPTG终浓度为0.5～1mM，37℃诱导后4hr结束，诱导前和诱导后每小时取样，SDS-PAGE分析融合蛋白表达率。发酵结束后于4℃，5000rpm离心10min收集菌体。 

【实施例8】重组艾塞那肽的制备 

1、菌体处理：将发酵后收集的菌体，用10倍重量的50mM Tris-HCl(pH8.0)，重新悬浮菌体，用低温超高压连续流细胞破碎机破碎2次，利用离心或中空纤维滤膜过滤的方式进行澄清处理，去除菌体碎片，收集澄清液。 

2、精纯：纯化中所用层析介质chelating sepharose FF，sephadex G-10为美国GE公司产品，反相C₁₈柱和prep LC300型液相系统为美国waters公司产品，超滤系统和超滤膜为美国millipore公司产品，source反相填料为GE公司产品。 

第一步，Ni²⁺—chelating sepharose亲和层析：先用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡亲和层析柱，将过滤后收集的澄清液体上柱，弃去穿透液，继之以20mM Tris-HCl(pH7.0)，150mM咪唑，缓冲液洗脱，收集融合蛋白峰流出液。 

第二步，肠激酶水解融合蛋白：将第一步收集的融合蛋白峰流出液，先以截留分子量为10KD的超滤膜超滤除去咪唑，紫外法测定超滤处理后蛋白溶液浓度，加入肠激酶，于15℃水解16小时。按每1单位肠激酶切割0.5mg融合蛋白的比例酶切。 

第三步：Ni²⁺—chelating sepharose亲和层析：将融合蛋白水解液上柱，除去伴体蛋白，穿透液为艾塞那肽溶液，收集穿头峰。 

第四步：sephadex G-10分子筛层析：将第三步收集的穿透液上柱，注射用水洗脱，以脱去无机盐，收集艾塞那肽锋。 

第五步：反相制备采用C₁₈硅胶反相填料或source RPC反相填料：流动相A(乙腈)，流动相B(0.01M KH₂PO₄)，按流动相5％流动相A到50％流动相A进行梯度洗脱，洗脱时间为30分钟，收集艾塞那肽峰，分析(C₁₈—HPLC柱)分析其纯度，测定其含量。 

第六步：除去有机溶剂： 

1、制备成艾塞那肽溶液：利用sephadex G-10分子筛层析，将第五步收集的艾塞那肽峰上柱，注射用水或缓冲液洗脱，以脱去乙腈。 

2、转换为醋酸艾塞那肽：将第五步收集的艾塞那肽经阴离子交换层析，以1.5～2.5％醋酸为流动相进行洗脱，收集多肽峰，冷冻干燥，得醋酸艾塞那肽。 

序列说明： 

SEQ ID NO.1(两个融合蛋白基因串联) 

CACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGA ATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCGCATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT

SEQ ID NO.2(三个融合蛋白基因串联) 

CACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTG ATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT

SEQ ID NO.3(四个融合蛋白基因串联) 

CACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCATCACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTAT CCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT

SEQ ID NO.4(单个融合蛋白基因，非串联) 

CACCACCACCATCACCATTCTGCGGGCAGCGACAAGATTATCCACCTGACCGATGACAGCTTTGATACCGATGTGCTGAAGGCAGACGGCGCCATCCTGGTTGATTTTTGGGCAGAATGGTGTGGCCCGTGCAAAATGATTGCGCCGATTCTGGACGAAATCGCTGACGAATACCAAGGTAAGCTGACCGTTGCGAAACTGAATATCGACCAGAACCCGGGCACTGCGCCTAAATATGGTATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCTGCTACCAAAGTCGGTGCGCTGTCCAAAGGTCAGCTGAAAGAATTCCTGGACGCTAACCTGGCG CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT 

SEQ ID NO.5(两个艾塞那肽基因串联，无伴体蛋白) 

CACCACCACCATCACCAT CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT TATAATGCACCACCACCATCACCAT CATGGCGAAGGCACCTTTACCTCTGATCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAATGGCGGCCCGTCTTCTGGCGCGCCGCCGCCGTCT

上述基因序列中： 

1、灰色背景字母为两端用于重组目的的限制性内切酶位点 

2、有下划线的ATG为起始密码子； 

3、双下划线+灰色背景为终止密码子 

4、双下划线为SD序列 

5、点断下划虚线为两个基因之间的间隔序列 

6、下划虚线为甘氨酸和丝氨酸交替构成的连接肽序列 

7、下划波浪线为肠激酶位点 

8、下划粗实线为his标签 

9、His标签和连接肽之间序列为伴体蛋白序列 

10、肠激酶位点和终止密码子之间的序列为艾塞那肽序列。 

Claims (10)

1.一种表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，具有由下述表达元件串联组成的表达序列：

(M—H—B—C—D—E—F)—(L—S—M—H—B—C—D—E—F)_n

其中M为起始密码子；H为编码his标签的核苷酸序列；B为编码伴体蛋白的核苷酸序列；C为编码连接肽的核苷酸序列；D为编码肠激酶识别位点的核苷酸序列；E为编码艾塞那肽的核苷酸序列；L为两个相邻融合蛋白基因之间的间隔核苷酸序列；S为SD序列；n为正整数；F为终止密码子；

所述基因所表达的融合蛋白的特征为：每一个融合蛋白分子由一个起始氨基酸、一个his标签、一个伴体蛋白分子、一个连接肽、一个肠激酶位点和一个艾塞那肽分子组成。

2.权利要求1所述表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，其特征在于，所述表达序列中：M为ATG；H为编码6～10个组氨酸的核苷酸序列；B为编码细菌硫氧还蛋白的核苷酸序列；C为编码5～10个甘氨酸和丝氨酸交替相连的核苷酸序列；D为编码DDDDK的核苷酸序列；n为1-3的正整数。

3.权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因，其具有SEQ IDNO.1～3所述的核苷酸序列。

4.含有权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因的表达载体。

5.权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为质粒载体。

6.权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述质粒载体为pet-22b(+)质粒。

7.含有权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因的宿主。

8.权利要求7所述的宿主，其特征在于所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

9.一种表达重组艾塞那肽融合蛋白的工程菌，其为由含有权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因的质粒载体转化的大肠杆菌。

10.一种制备重组艾塞那肽的方法，包括下述步骤：

1)构建权利要求1所述的表达重组艾塞那肽融合蛋白的基因；

2)将上述基因与质粒重组，形成串联表达载体；

3)将所述表达载体转化到宿主细胞中，通过发酵或细胞培养，产生融合蛋白；

4)分离并纯化获得的融合蛋白，获得重组艾塞那肽。