CN104894196A - 一种制备重组艾塞那肽或其衍生物的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种通过融合表达艾塞那肽或其衍生物的新方法。该方法以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣,将艾塞那肽或其衍生物拼接于其下游进行融合表达,并在水蛭素融合伴侣与艾塞那肽或其衍生物之间设计一个连接肽,其中包含TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)识别切割序列ENLYFQH。融合蛋白表达后可通过TEV酶切释放出具天然N-末端和生物活性的艾塞那肽或其衍生物。其它优点:(1)水蛭素融合伴侣较小,可有效增加艾塞那肽或其衍生物在融合蛋白中所占比率;(2)水蛭素融合蛋白具抗凝活性,方便进行实时检测与追踪;(3)可采用价廉大孔吸附树脂对融合蛋白进行吸附;(4)水蛭素融合伴侣可增强艾塞那肽或其衍生物稳定性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程制药领域,涉及建立一种制备具有天然N-末端的艾塞那肽或其衍生物的新方法。该方法的技术特征是:以水蛭素为融合伴侣(标签)制备重组艾塞那肽或其衍生物,并在在融合伴侣水蛭素与目的产物艾塞那肽或其衍生物之间设计一个连接肽,该连接肽包含TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)识别切割序列ENLYFQH,这样融合蛋白表达纯化后便可通过TEV酶切释放出N-末端与野生型艾塞那肽完全一致且具有生物活性的目的产物艾塞那肽。
技术背景
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由体内胰岛素分泌不足或合成受阻导致内分泌代谢紊乱而引起血糖升高的一种复杂的代谢疾病,主要分为1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)以及其他类型的糖尿病。据统计,2型糖尿病所占比例较大,约占糖尿病患者总数的90%以上,其发病多发期在35-40岁以后,发病后期会出现较严重的并发症。目前,糖尿病的治疗主要集中在以降低血糖浓度,减少并发症的发生等为目的,主要治疗方法是药物治疗。治疗2型糖尿病的药物主要有磺酰脲类、双胍类、α葡萄糖激酶抑制剂、抗IL-1β抗体和肠促胰岛素类药物,其中肠促胰岛素类药物具有多方面降糖功能而作为新型糖尿病治疗药物备受关注,根据作用机制可分为二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase 4,DPP-4)抑制剂和胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂两类。研究表明,这两类药物除具有降血糖、极少导致低血糖、安全性和耐受性较好等优点外,还对消化、中枢神经、心血管等多系统发挥保护作用。
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide-1,GLP-1)由小肠Langerhans细胞合成分泌,与GLP-1受体结合后能够随着血糖的升高而促进胰岛素的生物合成、刺激胰岛β细胞分泌胰岛素、抑制胰高血糖素的分泌、增强组织对胰岛素的敏感性,从而降低血糖浓度,对糖尿病具有良好的治疗效果,但GLP-1分泌入血后极易被二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase 4,DPP-4)降解,半衰期只有1-2min。DPP-4是一种丝氨酸蛋白酶,可特异性切割GLP-1N端二肽使其失活。
艾塞那肽(Exendin-4)是从北美洲西北部钝尾毒蜥唾液中分离得到的一种GLP-1受体激动剂,由39个氨基酸组成,与GLP-1氨基酸序列具有约53%的同源性,在哺乳动物体内,该多肽的生理功能与GLP-1相似,能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌。Exendin-4是首个上市的GLP-1受体激动剂,在临床上与磺酰脲类药物、二甲双胍或噻唑烷二酮类药物合用,能有效地控制2型糖尿病患者的血糖浓度,且在体内具有良好的安全性和耐受性,极少导致低血糖现象。Exendin-4对二肽基肽酶IV不敏感,体内半衰期长达2-3个小时,对2型糖尿病具有较好的临床治疗效果,因此,成为国内外研究降糖药的热点。然而,从毒蜥唾液中提取天然Exendin-4,产量太少,而且成本很高,无法满足临床需要。目前Exendin-4主要通过化学合成的方法制备,但步骤多、成本高、收率低。因此,采用基因工程技术合成Exendin-4提供了一条新途径。
当采用基因工程技术表达外源性多肽或小分子蛋白时,表达产物往往会由于被宿主细胞内的蛋白酶降解而造成表达量大大降低。为了有效解决这一问题,目前普遍采用融合表达技术。采用融合伴侣(标签)进行融合表达的优点在于:(1)对分子量较小的外源目的小分子蛋白(多肽)进行融合表达可增强表达产物的稳定性,减少或避免宿主细胞蛋白酶对表达产物的降解;(2)某些融合伴侣(标签)可以增强目的蛋白或多肽的可溶性;(3)方便目的蛋白的分离纯化。
目前普遍使用在低等生物或细菌中以可溶性状态高表达的蛋白作为融合伴侣(标签)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表达量、可溶性及稳定性,采用的融合伴侣(标签)有曼氏血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST,28kDa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP,40kDa)、蛋白二硫化物异构酶(NusA,55kDa)、大肠杆菌二硫键异构酶(Dsb A,21kDa)等。
然而,在使用上述这些融合伴侣(标签)对小分子目的蛋白(多肽)进行取融合表达时,虽然融合蛋白容易得到高水平表达,但由于融合伴侣(标签)自身分子量偏大,小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占的比率相对较低(通常仅占到融合蛋白的1/5~1/10甚至更低),这样就势必严重影响了小分子目的蛋白(多肽)的最终收率。
水蛭素是一类从医用水蛭唾液腺中分离得到的抗凝抗栓多肽物质,分子量为7Kd,由65-66个氨基酸残基组成,是目前发现的最强的凝血酶特异性抑制剂,且分子结构非常稳定,我们已在大肠杆菌中获得高分泌表达(J Ind Microbiol Biotechnol,2012,39(10):1487-1494.)。根据水蛭素分子的结构特征,以其为融合标签建立的融合表达系统,具有以下优点:(1)水蛭素融合伴侣分子量(7KD)较小,可以有效增加小分子目的多肽在融合蛋白中的比率;(2)通过分析水蛭素融合蛋白的抗凝活性可以方便快捷地对重组融合蛋白的表达水平进行实时检测和追踪;(3)利用水蛭素融合伴侣N-端的疏水特性,可以采用价格低廉的大孔吸附树脂(如HP20)对融合蛋白进行吸附和纯化;(4)将水蛭素融合伴侣与艾塞那肽融合后可避免宿主细胞蛋白酶对目的产物艾塞那肽的降解,增强目的产物艾塞那肽的稳定性,提高目的产物艾塞那肽的最终表达量。
发明内容
本发明目的在于建立一种融合表达艾塞那肽(Exendin-4)的新方法。
本发明以水蛭素为融合伴侣,将小分子目的多肽Exendin-4拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达,为了能够获得目的多肽,在融合伴侣和目的多肽之间设计一个连接肽,该连接肽包括TEV酶识别序列,这样可以在融合蛋白表达纯化后进行特异性酶切割以释放出N-末端与野生型艾塞那肽完全一致且具生物活性的目的产物艾塞那肽。
本发明以小分子水蛭素(分子量7KD)为融合伴侣对艾塞那肽(分子量4KD)进行融合表达,增加了目的产物在融合蛋白中所占的比率,从而最终提高了目的产物艾塞那肽的产量。
本发明将水蛭素融合伴侣与艾塞那肽融合后仍具有抗凝活性,这样就可通过分析融合蛋白的抗凝活性方便快捷地检测融合蛋白的表达水平,并在纯化过程中对其实时追踪。
本发明将水蛭素融合伴侣与艾塞那肽融合后可避免宿主细胞蛋白酶对目的产物艾塞那肽的降解,增强目的产物艾塞那肽的稳定性,提高目的产物艾塞那肽的最终表达量。
附图说明
图1:融合蛋白rHV3-Exendin-4的编码基因序列。灰色部分为水蛭素III(HV3)融合标签,其后为-GGGGSENLYFQH-连接肽(其中ENLYFQH为TEV酶识别切割序列),箭头所指为TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)切割位点,切割位点之后为目的多肽艾塞那肽序列,*代表终止密码子。
图2:融合蛋白(rHV3-Exendin-4)分泌表达载体pTASHE示意图。Ptac:Tac启动子;AP:氨苄抗性基因,HV3:水蛭素III基因,Exendin-4:艾塞那肽(Exendin-4)基因,Sig:L-门冬酰胺酶II信号肽简并基因,Ori:pUC质粒复制起始点,rrnBT1T2:转录终止子。
图3:Tricine/SDS-PAGE电泳图谱。M:低分子量蛋白Marker;lane 1:发酵液上清;lane2:大孔吸附树脂HP20吸附后洗脱液;lane 3:纯化后的融合蛋白rHV3-Exendin-4;lane 4:融合蛋白在30℃经TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)酶切12h后的酶切液;lane 5:酶切后纯化的Exendin-4。
图4:融合蛋白在30℃经TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)酶切12h后的C18RP-HPLC图。峰1:rHV3;峰2:Exendin-4。
图5:纯化后Exendin-4的MALDI-TOF/TOF质谱图。
图6:表达纯化的Exendin-4对大鼠胰岛瘤INS-1细胞分泌胰岛素的影响。图6-1:不同浓度Exendin-4对大鼠胰岛瘤INS-1细胞基础胰岛素分泌组BIS值的影响;图6-2:不同浓度Exendin-4对大鼠胰岛瘤INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌组GSIS值的影响;图6-3:不同浓度Exendin-4对大鼠胰岛瘤INS-1细胞GSIS/BIS值的影响。注:与正常组比较*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明:
实施例1水蛭素III(HV3)融合标签与目的多肽艾塞那肽(Exendin-4)融合基因的设计与克隆
水蛭素III(HV3)-艾塞那肽(Exendin-4)融合蛋白包括以下部分(从N端至C端):(1)水蛭素III(HV3)66个氨基酸残基;(2)连接肽GGGGSENLYFQ↓H(其中ENLYFQH为TEV酶识别切割序列,箭头所指示为切割位点);(3)TEV酶切割位点(箭头所指示)之后为艾塞那肽(Exendin-4)39个氨基酸残基。在此基础上,根据E.coli偏爱密码子设计并合成上述融合蛋白编码基因(见图1)。
实施例2水蛭素III(HV3)-艾塞那肽(Exendin-4)融合蛋白表达菌株的构建
将实施例1中所述融合基因用Nhe I及Hind III双酶切后亚克隆到表达载体pTASH(Tan S,Wu W,Liu J,Protein Expr Purif2002,25,430-436.)的相应酶切位点,得到的重组表达载体命名为pTASHE(见图2),并测序验证其序列正确性。用CaCl2法将重组表达质粒pTASHE转化E.coli JM109宿主菌,得到rHV3-Exendin-4融合蛋白表达工程菌pTASHE/JM109。
实施例3水蛭素III(HV3)-艾塞那肽(Exendin-4)融合蛋白在7L反应器中的表达
接种pTASHE/JM109工程菌单菌落于200ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中37℃,220rpm,培养12h。按4%的接种量接种于7L生物反应器(Laboratory Fermenter TypeL1523,Bioengineering AG,Switzerland)中的5L发酵培养基(1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,4%谷氨酸钠,1%麦芽粉,0.671%KH2PO4,0.757%Na2HPO412H2O,100μg/ml氨苄青霉素,pH6.5),37℃搅拌培养,发酵液pH用磷酸控制在6.5-7.2,溶氧控制在40%-60%。当发酵液OD600nm达到3.0时以大约30ml h-1l-1流加培养基I(10%麦芽粉,pH6.5),补料时间维持约4h菌体生长达到平台期,饥饿1-2h后以大约20ml h-1l-1流加培养基II(3.33%蛋白胨,1.67%酵母粉,13.3%谷氨酸钠,10%麦芽粉,pH6.5)直至发酵结束。整个发酵过程维持时间约20h。
发酵结束后离心收集发酵液上清,并采用凝血酶滴定法(见Tan S,Wu W,Liu J,Protein ExprPurif2002,25,430-436.)测定其抗凝活性:于酶标板小孔中加入200μl 0.5%人纤维蛋白原溶液(pH7.4,50mM Tris-HCl缓冲液配置),再加入10μl待测溶液,充分混匀。用微量进样器吸取标准凝血酶溶液(100NIH/ml)进行滴定,每次滴定5μl(0.5NIH),时间间隔为1min,若在1min内纤维蛋白原发生凝固,说明已达到终点。由凝血酶的消耗量可以换算出水蛭素抗凝活性单位数,每消耗一个凝血酶单位(NIHU)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。经测定,上清中融合蛋白抗凝血酶活性达到800ATU/ml。
实施例4融合蛋白rHV3-Exendin-4的制备
第一步:HP20大孔吸附树脂吸附。利用重组水蛭素N-末端的疏水特性,采用HP20大孔吸附树脂对发酵液上清中的目的融合蛋白rHV3-Exendin-4进行吸附和初步纯化。具体步骤如下:50mM柠檬酸-NaOH(pH3.5)平衡大孔树脂HP20柱将1L发酵上清以3ml/min上样。样品充分吸附后,依次用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.5)、50mM Tris-HCl(PH8.5)、含10%异丙醇的50mM柠檬酸-NaOH(pH3.5)缓冲液进行洗杂,用含30%异丙醇的50mM柠檬酸-NaOH(pH3.5)缓冲液进行洗脱,凝血酶滴定法测活,收集活性组分。
第二步:SP sepharose Fast Flow阳离子交换柱分离纯化。计算机预测的rHV3-Exendin-4融合蛋白等电点为4.33。为此,用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.5)缓冲液平衡阳离子柱SPsepharose Fast Flow除盐后的发酵液上清以0.5ml/min的速度上样。依次用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.5)缓冲液和20mM HAc-NaOH(pH4.2)缓冲液清洗杂蛋白,然后用20mM HAc-NaOH(pH5.0)缓冲液进行洗脱,收集活性组分。
第三步:Q sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化。用20mM HAc-NaOH(pH5.0)缓冲液平衡阴离子柱Q sepharose Fast Flow将阳离子柱洗脱液以0.5ml/min的速度上样。依次用20mMHAc-NaOH(pH5.0)缓冲液和含有50mMNaCl、100mM NaCl的20mMHAc-NaOH(pH5.0)缓冲液清洗杂蛋白,然后用含有300mM NaCl的20mM HAc-NaOH(pH5.0)缓冲液洗脱,收集活性组分。Tricine/SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白表观分子量为17KD左右(图3)。利用分析型HPLC(SHIMADZU LC-2010,岛津公司)分析融合蛋白纯度,色谱柱为Kromasil C-18柱(4.6×250mm),流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/甲醇,流速为1ml/min,梯度为25%-95%B,检测波长为220nm,分析结果表明融合蛋白纯度达91.55%。
实施例5酶切融合蛋白rHV3-Exendin-4释放目的多肽Exendin-4
将实施例4中Q sepharose Fast Flow柱层析洗脱下来的融合蛋白溶液对TEV酶切缓冲液(50mM Tris-HCl,PH8.0,0.5mM EDTA,1mM DTT)透析,并用TEV酶切缓冲液稀释至1~5mg/ml,再与TEV酶按100∶1(w/w)比例混匀,30℃酶切反应12hr。然后,用制备型液相色谱系统(BioLogic DuoFlow Pathfinder 20,Bio-rad公司)进行分离纯化。色谱柱为Hedera ODS-2C18(10mm×250mm),流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/甲醇,流速为2ml/min,梯度为25%-95%B,60min,检测波长为220nm,收集Exendin-4多肽峰并冻干。
制备的Exendin-4多肽纯度采用分析型HPLC(SHIMADZU LC-2010,岛津公司)分析,色谱柱为Kromasil C-18柱(4.6×250mm),流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/甲醇,流速为1ml/min,梯度为25%-95%B,检测波长为220nm,分析结果表明,目的产物Exendin-4多肽纯度达到99.1%。
Trcine/SDS-PAGE结果(见图3)显示制得的Exendin-4分子量为4KD左右,MALDI-TOF/TOF质谱分析其分子量为4185.1699(见图5),与ExPASy web interface(http://web.expasy.org/compute pi/)预测分子量4185.01Da一致。此外,目的产物Exendin-4采用Edman降解法(PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪,SHIMADZU)对其N端5个氨基酸进行测序,测序结果为NH2-His-Gly-Glu-Gly-Thr,与理论序列一致。由此证明,采用本技术生产的Exendin-4结构正确。
将纯化的Exendin-4冻干粉溶解于PBS缓冲液中,配制成1000nM母液,分装后-80℃长期保存。
实施例6生物学活性测定
以Exendin-4对大鼠胰岛细胞瘤细胞INS-1胰岛素分泌量的影响来评定其生物学活性。INS-1细胞培养至汇合率80%左右,PBS缓冲液洗两次,0.05%胰蛋白酶37℃消化2min,用含10%FBS的RPMI-1640终止消化,800rpm离心5min收集细胞,用细胞培养液重悬后以2×105个/孔接种至24孔细胞培养板,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h,弃原培养基,PBS洗涤一次进行实验。实验分组:1、基础胰岛素分泌组(0,1、10、20、50、100nM Exendin-4药物处理24小时,每个药物浓度设3个复孔);2、葡糖糖刺激胰岛素分泌组(0,1、10、20、50、100nM Exendin-4药物处理24小时,每个药物浓度设3个复孔)。每孔加入200μl含3mM葡萄糖的KRBB缓冲液平衡30min。弃原液后,基础胰岛素分泌组每孔分别加入200μl含3mM葡萄糖的KRBB缓冲液;葡糖糖刺激胰岛素分泌组每孔分别加入200μl含20mM的葡萄糖的KRBB缓冲液。37℃作用20min后,收集上清,用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(上海江莱生物科技技术有限公司,目录号:E-30618)检测胰岛素分泌量。同时,每孔分别加入200μl细胞裂解液,冰上裂解30min,提取总蛋白,BCA法测定每孔细胞总蛋白含量。实验重复三次,
按照下列公式分别计算基础胰岛素分泌组BIS值和葡萄糖刺激胰岛素分泌组GSIS值。
结果显示,在不同浓度Exendin-4干预下,基础胰岛素分泌组BIS值无显著变化(图6-1),而葡萄糖刺激胰岛素分泌组GSIS值有显著变化(图6-2),且GSIS/BIS值呈剂量依赖性增加(图6-3)。由此证明,应用本技术制备的目的产物Exendin-4具有在葡萄糖刺激下增加胰岛素释放的作用。
Claims (3)
1.一种制备重组艾塞那肽或其衍生物的新方法,其特征是:以水蛭素为融合伴侣,将目的多肽艾塞那肽或其衍生物拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。
2.根据权利要求1所述的融合表达方法,其特征是:在融合伴侣水蛭素与目的多肽艾塞那肽或其衍生物之间设计了一个连接肽,该连接肽包含TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)识别切割序列ENLYFQH,这样融合蛋白表达后便可通过TEV酶切割释放出与野生型艾塞那肽N-末端完全一致的目的产物艾塞那肽或其衍生物。
3.根据权利要求1所述的融合表达方法,其融合伴侣水蛭素可以是水蛭素III(HV3),也可以是水蛭素I(HV1)或水蛭素II(HV2),或其它水蛭素变异体。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150909 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |