CN102131516A - 包含弹性蛋白样肽的治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和治疗性蛋白质的治疗剂和组合物。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是GLP-1受体激动剂、胰岛素或因子VII/VIIa，包括功能类似物。本发明还提供编码多核苷酸，以及制备和使用所述治疗剂的方法。就其用作治疗剂的用途而言，本发明治疗剂具有改进性质，特别包括体内半寿期、清除率和/或持久性、溶解度和生物利用度中的一种或多种改进性质。

Description

包含弹性蛋白样肽的治疗剂
优先权
本申请要求2008年6月27日申请的美国临时申请号61/076,221的优先权，其通过引用其整体结合到本文中。
发明领域
本申请公开了包含弹性蛋白样肽的治疗剂，并与国际申请日为2007年9月6日的PCT/US2007/077767(2008年3月13日以WO 2008/030968公布)有关。本申请还与国际申请日为2006年12月20日的PCT/US2006/048572(2007年6月28以WO 2007/073486公布)有关。WO2008/030968和WO 2007/073486通过引用其整体结合到本文中。
电子提交文本文件的描述
电子提交文本文件的内容通过引用其整体结合到本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：PHAS_010_01US_SeqList_ST25.txt，录入日期：2009年6月26日，文件大小50kb)。
发明背景
天然状态或重组产生的治疗性蛋白质或肽可能是不稳定分子，特别是在机体内具有短周期的血清稳定性、血清半寿期(即循环半寿期)或有限的持久性。在配制时这类分子还可能极不稳定，例如在水溶液中配制时。
在某些情况下，聚乙二醇(PEG)与蛋白质性分子缀合产生疗效较久、活性持续的分子。然而，PEG连接常常可大大降低甚至破坏蛋白质的治疗活性。治疗性蛋白质和/或肽还通过与能够延长血清半寿期的某些蛋白质融合而得以稳定。例如在某些情况下，与非融合状态的治疗性蛋白质相比，与白蛋白、运铁蛋白和抗体片段融合的治疗性蛋白质的血清半寿期延长。参见美国专利号7,238,667(尤其是白蛋白缀合物)、美国专利号7,176,278(尤其是运铁蛋白缀合物)和美国专利号5,766,883，所述专利均通过引用其整体结合到本文中。
本领域仍需要更稳定、更长作用时间和/或有效的蛋白质分子。
发明概述
本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和治疗性蛋白质性成分的治疗剂。ELP成分含有结构性肽单元，其可以是重复单元，其在结构上与弹性蛋白序列有关或来源于弹性蛋白序列。这类ELP成分为治疗剂提供某些治疗优势，例如治疗性蛋白质性成分的相对更好的稳定性、溶解度、生物利用度、半寿期、持久性和/或生物作用。例如可与治疗成分的未融合或未缀合对应物比较来确定这类性质。在一些实施方案中，ELP成分可进行可逆的逆相变，其可提供其它实用优势和/或治疗优势。本发明还提供编码本发明的治疗剂的多核苷酸，以及治疗或预防某些生物学病症的方法。
第一方面，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和治疗性蛋白质性成分的治疗剂，以及含有所述治疗剂的用于递送给有需要的受治疗者或患者的药物组合物。治疗成分可选自表1所列的治疗性蛋白质的活性部分或其功能类似物。在某些实施方案中，治疗成分是GLP-1受体激动剂，例如GLP-1、毒蜥外泌肽-4或其功能类似物。一般来说，这类治疗成分包括但不限于以葡萄糖依赖性方式有效用于增加胰腺的胰岛素分泌。在其它实施方案中，治疗成分是胰岛素或其功能类似物，其一般有效用于促进从血液中摄取葡萄糖并贮存在细胞内。在另一些实施方案中，治疗成分是因子VII/VIIa或其功能类似物，其一般通过激活因子X或因子IX而有效促进凝血。
ELP和治疗成分可以通过不同方法共价偶联，包括化学偶联(例如接合/缀合)和重组融合技术。此外，每分子ELP或治疗成分的数目及其在分子内相应的位置都可按需要改变。治疗剂还可包括一个或多个间隔基或接头部分，其除了提供所需要的ELP与治疗成分的功能独立性以外，还可任选提供其它的功能性，例如蛋白酶敏感特征，从而提供蛋白酶水解性释放或激活的治疗成分。治疗剂还可包括一个或多个寻靶成分，例如使治疗剂靶向特定细胞类型(例如癌细胞)或特定器官的肽或蛋白质。
第二方面，本发明提供多核苷酸，这类多核苷酸包含编码本发明的治疗剂的核苷酸序列。例如核苷酸序列编码具有表1所列的至少一种治疗性蛋白质的功能部分(或其功能类似物)的ELP融合物。在某些实施方案中，治疗成分是GLP-1受体激动剂(包括GLP-1和毒蜥外泌肽-4)、胰岛素、因子VII/VIIa或其功能类似物。这类多核苷酸还可包含与核苷酸序列有效连接的其它调控元件，例如启动子元件和/或其它转录或表达相关信号。可将多核苷酸插入各种载体中，载体可用于在宿主细胞(包括例如细菌和真核宿主细胞)中产生治疗剂。
第三方面，本发明提供用于治疗或预防患者(例如哺乳动物患者，包括人类患者)的疾病、障碍或病症的方法。所述方法包括将有效量的本发明的治疗剂(或含有本发明治疗剂的药物组合物)给予需要它的受治疗者或患者。例如，患者可能需要具有表1所列的生物活性或优选适应症的药剂。在使用GLP-1受体激动剂/ELP化合物或使用胰岛素/ELP化合物的某些实施方案中，本发明提供用于治疗一种或多种障碍的方法，包括1型或2型糖尿病、高血糖症和葡萄糖耐量减低。在使用因子VII/VIIa/ELP化合物的某些其它实施方案中，本发明提供用于治疗一种或多种障碍的方法，包括血友病、手术后出血、抗凝血诱发性出血、血小板减少、因子VII缺乏症、因子XI缺乏症和颅内出血。
根据下面的公开内容和随附权利要求书，本发明的不同的其它方面、特征和实施方案将更清楚明了。
附图简述
图1图示编码具有10单元VPGXG(SEQ ID NO：3)重复基序的ELP成分的质粒pET24d-ELP1-90，其中客体位置(guest position)X为V、G和A，比例为5∶3∶2。该基序重复8次加上最终C端的10单元重复，其中X为V、G、A和W，比例为4∶3∶2∶1。该ELP成分一般表示为[(VPGXG)10]9。
图2A图示质粒pET24d-Ex-4ELP1-90，其编码具有与N端毒蜥外泌肽-4成分符合读框克隆的VPGXG(SEQ ID NO：3)重复基序(见图1)的ELP成分。图2B图示毒蜥外泌肽-4/ELP融合物(SEQ ID NO：23和24)的核苷酸和氨基酸序列。标明了引物序列(SEQ ID NO：35-40)。
图3A图示具有N端Tev(烟草蚀斑病毒半胱氨酸蛋白酶)切割位点的毒蜥外泌肽-4构建体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：25和26)。标明了引物序列(SEQ ID NO：38、41、42)。图3B还显示具有N端Tev切割位点而且Tev切割位点的N端还具有另外的序列以提供更好地靶向蛋白酶的毒蜥外泌肽-4构建体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：27和28)。标明了引物序列(SEQ ID NO：38、43、44)。
图4A图示图1-3中所示毒蜥外泌肽-4/ELP融合物而且还具有DsbA前导序列以指导分泌到周质间隙的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：29和30)。标明了引物序列(SEQ ID NO：38、45、46)。图4B图示编码图4A融合物的质粒pET24d-DsbA-Ex-4ELP1-90。
图5A图示pPB0868，其编码GLP-1(A8G，7-37)ELP1-90。图5B图示该编码融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：53和54)。
图6A图示pPB1022，其编码GLP-1(A8G，7-37)ELP1-120。图6B图示该编码融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：55和56)。
图7A图示pPB0788，其编码因子VII-ELP1-90。图7B图示该编码融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：57和58)。
图8A图示具有符合读框克隆的ELP成分的胰岛素(B链、C链和A链)的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：31和32)。标明了引物序列(SEQ ID NO：47和48)。图8B图示表达图8A的胰岛素/ELP融合物的质粒pET24d胰岛素-ELP1-90。
图9是图示用小鼠抗人FVII单克隆抗体检测的得自瞬时转染的Freestyle HEK293的FVII-ELP1-90的蛋白质印迹。泳道为：(1)培养基；(2)通过相变纯化后的FVII ELP1-90；和FVII对照。
图10是图示重组产生的毒蜥外泌肽-4/ELP4-60融合物的SDS-PAGE。泳道为：(M)蛋白质标记；(1)得自总裂解物的毒蜥外泌肽-4ELP4-60；(2)得自不溶性裂解物的毒蜥外泌肽-4ELP4-60；(3)得自可溶性裂解物的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60；(4)第一次相变的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60(等体积)；(5)得自第二次相变的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60(富集)；(6)得自第三次相变的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60(富集)。
图11图示被因子VIIa-ELP1-90激活的因子X，被因子VIIa激活的因子X作为对照。正如所显示的一样，因子VIIa-ELP保持完全活性。
图12图示因子VIIa-ELP1-90静脉内给予大鼠时具有长的PK。与因子VIIa的T1/2约45-60分钟相比，因子VIIar的T1/2约690分钟。
图13图示与毒蜥外泌肽的活性相比，GLP1-ELP和毒蜥外泌肽-4-ELP的体外活性高。
图14图示当通过静脉内给予大鼠时，GLP1-ELP的T1/2约为12.9小时，当皮下(SQ)给予时，T1/2约为8.6小时。
图15图示当静脉给予兔时，GLP-1ELP具有长的半寿期约20小时，当皮下给予时约24小时。
图16图示GLP-1-ELP在糖尿病小鼠的持续血糖控制。
发明详述
本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)(“ELP成分”)和治疗性成分的治疗剂。治疗成分可选自表1(例如选自表1所列的治疗性蛋白质或其功能部分或功能类似物)。在某些实施方案中，治疗成分是GLP-1受体激动剂，例如GLP-1或毒蜥外泌肽-4，或可以是胰岛素、因子VII/VIIa或其功能类似物。ELP成分含有与弹性蛋白序列有关或来源于弹性蛋白序列的结构单元，其提供某些治疗优势，例如治疗成分相对更好的持续性、稳定性、溶解度、生物利用度、半寿期和/或生物作用。根据例如治疗成分的未融合或未缀合对应物来确定这类性质。本发明还提供编码本发明的治疗剂的多核苷酸，以及治疗或预防某些生物学病症的方法，包括表1所列的优选适应症，并且尤其包括糖尿病(例如I型和II型糖尿病)、高血糖症、流血(bleeding)、血友病和出血(hemorrhage)等。
为了便于接下来的论述，下面给出在论述中出现的某些术语的定义。
本文使用的术语“治疗剂”或“治疗成分”是指能够在体内和/或体外诱导生物效应的药剂或成分。生物效应可用于治疗和/或预防受治疗者或患者的病症、障碍或疾病。
本文使用的术语“偶联”是指特定成分或者彼此直接共价结合(例如通过化学缀合或重组融合技术)，或者通过一个或多个间插部分(例如桥连基、间隔基或接头)彼此间接共价连接(例如通过化学缀合或重组融合技术)。
本文使用的“半寿期”(一般是指体内半寿期或循环半寿期)是活性剂的生物活性减少50％所需要的时间。术语“半寿期”不同于“持续性”，后者是指活性剂在机体内的总的持续时间；其也不同于“清除率”，“清除率”为与半寿期和持续性的数值可能相关或不相关的动力学变量。
术语“功能类似物”是指这样的蛋白质：其是天然蛋白质的活性类似物(例如化学类似物或蛋白质类似物)、衍生物、片段、截短同工型等。例如，功能类似物可以是表1所列的治疗性蛋白质的功能类似物，或者可以是GLP-1受体激动剂(例如GLP-1、毒蜥外泌肽)、胰岛素或因子VII/VIIa的功能类似物。当多肽保持相应的天然多肽的一些或全部生物活性(活性体内或者体外一种或多种指示性的测定法测定)时，该多肽是有活性的。测定活性的、某些治疗性蛋白质的示例性活性测定法见表1。此外，本文其它部分详细描述了GLP-1受体激动剂、胰岛素和因子VII/VIIa的这类生物活性及测定给定分子是否是“功能类似物”的测定法。
本文使用的术语“天然(的)”当用来指氨基酸序列时，是指天然存在的蛋白质的氨基酸序列。
本文使用的术语“间隔基”是指可插入ELP成分和治疗成分之间的任何部分、肽或其它化学实体。例如，间隔基可以是在一端与ELP成分共价结合且在另一端与治疗成分共价结合的二价基团。因此，治疗剂可包括不会妨碍所述药剂的预期目标功效的其它化学结构。例如，间隔基可以是提供控制药剂的药代动力学特征的蛋白酶敏感性间隔基部分，或间隔基可以是蛋白酶抗性部分。
治疗成分和ELP成分可以任何合适的共价方式(包括化学偶联和重组技术)彼此偶联，使得治疗剂有效用于其预期目的，并使得存在的ELP成分在一些功能、治疗或生理方面强化治疗成分。例如，ELP偶联的治疗成分可提高例如其生物利用度、生物不可利用度、治疗有效量、生物作用、制剂相容性、对蛋白酶解或其它降解方式的抗性、溶解度、半寿期或给药后在机体内的持续性的其它测量值、给药后从机体排除的清除率等。例如，可根据相应的未缀合或未融合对应治疗药来测定这类加强作用(例如根据天然GLP-1、毒蜥外泌肽、胰岛素或因子VII/VIIa或表1所列治疗性蛋白质来测定)。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂以可溶性形式在机体内循环或存在，并逃避肾滤过从而以活性形式保持在机体内。在一些实施方案中，本发明治疗剂的分子量小于普遍公认的肾滤过截止值，例如小于约60kD，或者，在一些实施方案中小于约55、50、45、40、30或20kDa，并且在机体内的持续时间比未偶联的(例如未融合的或未缀合的)治疗剂对应物长至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。
每分子的ELP和/或治疗成分的数目及其在分子内的相应位置在本发明的实施方案可以不同。例如，在其中药剂是重组融合物的实施方案中，至少一个ELP成分可位于N端和C端的一端或两端。当ELP成分位于融合物的N端和C端两端时，ELP成分邻接治疗成分。或者，治疗成分可位于N端和C端的任一端或两端。当治疗成分在N端和C端两端时，治疗成分邻接ELP成分。在进一步的实施方案中，不同的治疗成分位于分子的N端和C端。正如本文详细论述的一样，在某些实施方案中，可通过蛋白酶解分隔ELP和治疗成分的间隔基部分而释放这类治疗成分。在某些实施方案中，治疗成分在融合状态下可能是无活性的，而在蛋白酶解由ELP成分释放时变得有活性。或者，治疗成分在融合状态下保持活性，使得不必为了生物活性而对治疗剂进行蛋白酶解处理。
当作为重组融合物制备时，可通过已知的重组表达技术制备治疗剂。例如，为了重组产生治疗剂，将编码嵌合基因的核酸序列与合适的启动子序列有效连接，使得编码这类融合蛋白的核酸序列可以在宿主细胞内转录和/或翻译成所需要的融合蛋白。优选的启动子是用于在大肠杆菌(E.coli)内表达的启动子，例如T7启动子。可以使用任何常用的表达系统，包括真核或原核系统。具体实例包括酵母(例如酵母菌(Saccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.))、杆状病毒、哺乳动物和细菌系统(例如大肠杆菌)和柄杆菌属(Caulobacter)。
在下面各节中将更详尽地描述本发明的各个方面和实施方案。
弹性蛋白样肽(ELP)成分
本发明的治疗剂可包含一种或多种ELP成分。ELP成分包含与弹性蛋白有关或来源于弹性蛋白的结构性肽单元或序列，或者由与弹性蛋白有关或来源于弹性蛋白的结构性肽单元或序列组成。这类序列可用于在以下的一个或多个方面改进治疗性蛋白质例如表1所列的治疗性蛋白质以及GLP-1受体激动剂(例如GLP-1或毒蜥外泌肽-4)、胰岛素和因子VII/VIIa的性质：生物利用度、治疗有效量、生物作用、制剂相容性、对蛋白酶解的抗性、溶解度、半寿期或给药后在机体内的持久性的其它测量值和/或从机体排除的清除率。
ELP成分由3个至约20个氨基酸的结构单元构建，或者在一些实施方案中，由4个至10个氨基酸构建，例如5个或6个氨基酸。在具体的ELP成分中，各个结构单元的长度可以不同或者相同。在某些实施方案中，ELP成分由重复性结构单元的聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽基序构建。示例性结构单元包括由SEQ ID NO：1-12定义的单元(见下文)，其可用作重复性结构单元，包括串联重复单元，或者可用于某些组合以产生有效改进治疗成分的性质的ELP。因此，ELP成分可包含以下单元或者基本由以下单元组成：选自如下定义的SEQ ID NO：1-12的结构单元。
包含这类结构单元的ELP成分可以是不同大小。例如，ELP成分可包含以下单元或者基本由以下单元组成：约10-约500个结构单元，或者在某些实施方案中约15-约150个结构单元，或者在某些实施方案中约20-约100个结构单元，或约50-约90个结构单元，包括由SEQ ID NO：1-12定义的一个单元或单元的组合。因此，ELP成分的长度为约50-约2000个氨基酸残基，或约100-约600个氨基酸残基，或约200-约500个氨基酸残基，或约200-约400个氨基酸残基。
在一些实施方案中，ELP成分(或在某些情况下为治疗剂)的大小小于约65kDa，或小于约60kDa，或小于约55kDa，或小于约50kDa，或小于约40kDa，或小于约30或25kDa。已经开发出延长蛋白质和肽的半寿期以改进治疗用途的三种主要血液蛋白质即人血清白蛋白(HSA)、运铁蛋白(Tf)和IgG或其糖基化形式的IgG的Fc部分。这些分子的长度分别为585、679和480个氨基酸，分子量为约66、77和约75kDa(包括糖基化)。它们各为球状且相对致密。这些分子的半寿期取决于多种因素，包括电荷分布、通过新生Fc受体(FcRn)(HSA和Fc)的分子拯救或通过Tf受体(TfR)的Tf循环及防止经肾小球滤过的分子大小。HSA略低于普遍认可的经肾滤过的截止值(约70kDa)，但其电荷分布有助于防止这一点。可以预期，为了实现与用HSA、Tf和Fc实现的相同数量级的半寿期延长，至少这一分子量范围的蛋白质可能是必需或需要的，即超过550个氨基酸和超过65kDa。然而，与HSA、Tf和Fc相比，氨基酸数目少(例如约300-400的范围)且30-40kDa左右的ELP的半寿期却可具有与HSA、Tf和Fc相当或超过HSA、Tf和Fc的半寿期。
在一些实施方案中，未转变状态下的ELP成分可具有伸展的相对非结构化和非球状的形式，因此，与HSA、Tf和Fc相比，这类分子可具有大的膨胀结构，使得可逃避肾滤过。在这类实施方案中，本发明的治疗剂的分子量小于普遍公认的通过肾滤过截止值，例如小于约60kD，或者在一些实施方案中小于约55、50、45、40、30或25kDa，并且在机体内的持续时间比未偶联的(例如未融合的或未缀合的)治疗剂对应物的长至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。
在某些实施方案中，ELP成分进行可逆的逆相变。也就是说，ELP成分在结构上是无序的，且在转变温度(Tt)以下极溶于水，但当温度升至Tt以上时具有急剧的(2-3℃范围)无序-有序相变，导致ELP成分去溶剂化和聚集。例如，ELP当达到充分大小时形成不溶性聚合物，这可容易地通过离心从溶液中除去和分离。这类相变是可逆的，当温度再次回到ELP的Tt以下时，分离的不溶性ELP可完全再溶于缓冲溶液中。因此，在一些实施方案中，可以采用逆转变循环方法，例如利用治疗剂依赖温度的溶解度，或将盐加入培养基中，从其它污染蛋白质中分离出高纯度的本发明的治疗剂。可采用连续的逆相变循环来实现高纯度。除温度和离子强度以外，用于调节治疗剂逆转变的其它环境变量包括pH、加入无机和有机溶质和溶剂、侧链离子化或化学修饰和压力。
在某些实施方案中，ELP成分不进行可逆的逆相变，或者不在生物学上相关的Tt时进行这类转变，因此，分子的生物性质和/或生理性质的改进(如本文其它部分所述)可以完全独立于或基本上独立于任何相变性质。而且，这类相变性质可提供例如与这类分子的回收和纯化有关的其它实用优势。
在某些实施方案中，ELP成分由包括但不限于以下的结构单元构成：
(a)四肽Val-Pro-Gly-Gly，即VPGG(SEQ ID NO：1)；
(b)四肽Ile-Pro-Gly-Gly，即IPGG(SEQ ID NO：2)；
(c)五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)，即VPGXG，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合或寡聚重复序列中不同；
(d)五肽Ala-Val-Gly-Val-Pro，即AVGVP(SEQ ID NO：4)；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly，即IPGXG(SEQ ID NO：5)，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合或寡聚重复序列中不同；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-Val-Gly，即IPGVG(SEQ ID NO：6)；
(f)五肽Leu-Pro-Gly-X-Gly，即LPGXG(SEQ ID NO：7)，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合或寡聚重复序列中不同；
(g)五肽Leu-Pro-Gly-Val-Gly，即LPGVG(SEQ ID NO：8)；
(h)六肽Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，即VAPGVG(SEQ ID NO：9)；
(I)八肽Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly，即GVGVPGVG(SEQ IDNO：10)；
(J)九肽Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly，即VPGFGVGAG(SEQID NO：11)；和
(K)九肽Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly，即VPGVGVPGG(SEQID NO：12)。
由SEQ ID NO：1-12定义的这类结构单元可形成结构重复单元，或者可组合使用形成本发明的ELP成分。在一些实施方案中，ELP成分完全(或几乎完全)由选自SEQ ID NO：1-12的一个结构单元或其组合(例如2、3或4个)构成。在其它实施方案中，至少75％，或至少80％，或至少90％的ELP成分由选自SEQ ID NO：1-12的一个结构单元或其组合结构单元构成，其可以重复单元出现。
在某些实施方案中，ELP成分含有重复单元，包括五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)的串联重复单元，其中X如上定义，且就整个ELP成分(其可包含VPGXG(SEQ ID NO：3)以外的结构单元)而言，其中Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)五肽单元占整个ELP成分的百分比大于约75％，或大于约85％，或大于约95％。ELP成分可含有具有SEQ IDNO：3五肽的5-15个单元重复(例如约10个单元重复)的基序，其客体残基(guest residue)X可在至少2个或至少3个单元中不同。客体残基可独立选自例如氨基酸V、I、L、A、G和W，并且可以对客体残基进行选择以保持所需要的逆相变性质。重复基序本身可以重复例如约5次-约12次，例如约8-10次，以产生示例性的ELP成分。当然，本段落所描述的ELP成分由SEQ ID NO：1-12定义的结构单元中的任意一种或其组合构建。
在一些实施方案中，ELP成分可包括β转角结构。适于产生β转角结构的示例性肽序列披露于国际专利申请PCT/US96/05186，其通过引用其整体结合到本文中。例如，可以改变弹性蛋白五肽序列VPGXG(SEQ ID NO：3)的第四个残基(X)而不破坏β转角的形成。或者，ELP成分可以没有β转角，或者具有不同的构象和/或折叠性质。
在某些实施方案中，ELP成分包括五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的聚合或寡聚重复序列，其中客体残基X为任何氨基酸。X可以为天然或非天然的氨基酸。在一些实施方案中，X选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，X是脯氨酸或半胱氨酸以外的天然氨基酸。
客体残基X(例如就SEQ ID NO：3而言，或其它ELP结构单元)可以是非典型(非遗传编码)氨基酸。非典型氨基酸的实例包括：常见氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、A-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计的(designer)氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和常用的氨基酸类似物。
X的选择在各ELP结构单元(例如本文定义的具有客体残基X的各结构单元)中是独立的。例如，对于各结构单元，X可独立选取带正电荷侧链的氨基酸、具有带负电荷侧链的氨基酸或具有中性侧链的氨基酸，包括在一些实施方案中为疏水侧链的氨基酸。
在另一些实施方案中，ELP成分可包括五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)、IPGXG(SEQ ID NO：5)或LPGXG(SEQ ID NO：7)或其组合的聚合或寡聚重复序列，其中X如上定义。
在各个实施方案中，ELP序列的结构单元，或在某些情况下为聚合或寡聚重复序列，可被不会破坏分子整体作用的一个或多个氨基酸残基分隔开来，其为所述治疗成分提供某些改进。在某些实施方案中，这样的一个或多个氨基酸也不会破坏或明显影响ELP成分的相变性质(与缺乏这类一个或多个氨基酸相比)。
在各个重复序列中，X是独立选择的。所得ELP成分的结构可用符号ELPk[XiYj-n]表示，其中k是指特定的ELP重复单元，括号内的大写字母是单字母氨基酸代码，其相应的下标是指结构单元中各个客体残基X(适用的话)的相对比，n是指多个结构重复中ELP的总长度。例如，ELP1[V5A2G3-10]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的10个重复单元的ELP成分，其中X为缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸，相对比为5∶2∶3；ELP1[K1V2F1-4]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的4个重复单元的ELP成分，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比为1∶2∶1；ELP1[K1V7F1-9]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的9个重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比为1∶7∶1；ELP1[V-5]是指含有五肽VPGXG(SEQID NO：3)的5个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸；ELP1[V-20]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的20个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸；ELP2[5]是指含有五肽AVGVP(SEQ ID NO：4)的5个重复单元的多肽；ELP3[V-5]是指含有五肽IPGXG(SEQ ID NO：5)的5个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸；ELP4[V-5]是指含有五肽LPGXG(SEQ ID NO：7)的5个重复单元的多肽，其中X全为缬氨酸。本段落描述的这类ELP成分可与本发明联用以增强治疗成分的治疗性质。
此外，Tt随客体残基的疏水性而变化。因此，通过改变客体残基本身(identity)及其克分子数，可以合成在0-100℃范围内能够逆转变的ELP。因此，可通过在ELP序列中掺入较大量的疏水客体残基来降低给定ELP长度的Tt。合适的疏水客体残基的实例包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。还可以使用中等疏水性的酪氨酸。相反，可通过掺入例如选自以下的残基来提高Tt：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；优选选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸。
在一些实施方案中，选择或设计ELP成分以提供Tt范围约10℃-约80℃，例如约35℃-约60℃，或约38℃-约45℃。在一些实施方案中，Tt大于约40℃或大于约42℃，或大于约45℃，或大于约50℃。在一些实施方案中，转变温度超过受治疗者或患者的体温(例如＞37℃)，从而在体内保持可溶性，或者在其它实施方案中，Tt低于体温(例如＜37℃)以提供替代性优势，例如体内药物库形成用于治疗剂的缓释。
可通过改变ELP链长来改变ELP成分的Tt，因为Tt一般随MW降低而提高。对于分子量＞100,000的多肽，由Urry等人开发的疏水标度(PCT/US96/05186，通过引用其整体结合到本文中)优选用于预测特定ELP序列的Tt近似值。然而，在一些实施方案中，可通过在ELP序列中掺入较大量的疏水客体残基(例如具有疏水侧链的氨基酸残基)来保持相对较短的ELP成分长度，而同时保持目标Tt。对于分子量＜100,000的多肽，可通过下列二次方程式预测或确定Tt：Tt＝M0+M1X+M2X2，其中X为融合蛋白的MW，M0＝116.21；M1＝-1.7499；M2＝0.010349。
ELP成分的Tt以及由此与治疗成分偶联的ELP成分的Tt在受客体残基X的本身(identity)和疏水性影响的同时，分子的其它性质也可能会受到影响。这类性质包括但不限于分子的溶解度、生物利用度、持久性和半寿期。
如PCT/US2007/077767(以WO 2008/030968公布)所述(其通过引用其整体结合到本文中)，ELP偶联的治疗成分可保持治疗成分的生物活性。此外，ELP本身可具有长的半寿期。因此，本发明的ELP成分大大延长(例如在具体实施方案中大于10％、20％、30％、50％、100％、200％、500％或以上)与之缀合的治疗成分的半寿期。与治疗成分的游离(未缀合或未融合)形式的半寿期相比较来确定这类半寿期(或者在一些实施方案中为持久性或清除率)。此外，当体内给予时，ELP可靶向高血容量器官，因此，ELP可在机体内分配，从而在身体的不同器官或部位中提供预定的所需要的体内分布，或提供所需要的治疗剂的选择性或靶向性。总之，本发明设计了体内给予或产生延长半寿期(例如循环半寿期)的治疗剂的活性组合物，包括本文所述的其它潜在益处。
因此，本发明提供用于治疗(体内)用途的各种药物，其中治疗成分具有生物活性。这类治疗成分包括表1所列的治疗成分(例如全长或功能部分或其功能类似物)，以及GLP-1受体激动剂(例如GLP-1或毒蜥外泌肽-4)、胰岛素或因子VII/VIIa及其功能类似物。下面将详细描述这类治疗成分的结构和活性。在治疗剂的一些形式中，治疗成分与ELP成分的偶联通过直接共价结合或间接(通过合适的间隔基)结合来实现(如本文其它部分所述)。此外，治疗成分和ELP成分可以任何合适的方式(包括所述彼此直接或间接共价结合)结构性排列。
胰高血糖素样肽(GLP)-1受体激动剂
在本发明的某些实施方案中，治疗剂包含与GLP-1受体激动剂(例如GLP-1、毒蜥外泌肽-4或其功能类似物)融合或缀合的ELP成分。
人GLP-1是37个氨基酸残基的肽，来源于在回肠远端的L细胞、胰腺和脑中合成的前胰高血糖素原(Preproglucagon)。主要在L细胞中加工前胰高血糖素原得到GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2。采用一个简单体系描述该肽的片段和类似物。例如，Gly8-GLP-1(7-37)是指通过缺失第1-6号氨基酸残基并用Gly取代8位的天然氨基酸残基(Ala)而从GLP-1得到GLP-1片段。同样，Lys34(Nε-十四烷酰基)-GLP-1(7-37)是指其中34位Lys残基的ε-氨基被十四烷酰基化的GLP-1(7-37)。当在本文中提及C端延伸的GLP-1类似物时，38位的氨基酸残基为Arg，除非另有说明，39位的任选氨基酸残基同样为Arg，除非另有说明，且40位的任选氨基酸残基为Asp，除非另有说明。同样，如果C端延伸的类似物在41、42、43、44或45位上延伸，则这种延伸的氨基酸序列与人前胰高血糖素原中的相应序列一样，除非另有说明。
GLP-1的母体肽胰高血糖素原(PG)具有产生取决于组织来源的、不同肽产物的若干切割位点，包括胰腺中的胰高血糖素(PG[32-62])和GLP-1[7-36]NH2(PG[72-107])和肠L细胞中的GLP-1[7-37](PG[78-108])和GLP-1[7-36]NH2(PG[78-107])，其中GLP-1[7-36]NH2(78-107PG)是主要产物。本发明的GLP-1成分可以是胰高血糖素原(proglocagon)的任何生物活性产物或衍生物或其功能类似物，包括：GLP-1(1-35)、GLP-1(1-36)、GLP-1(1-36)酰胺、GLP-1(1-37)、GLP-1(1-38)、GLP-1(1-39)、GLP-1(1-40)、GLP-1(1-41)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)和GLP-1(7-41)或上述的类似物。在一些实施方案中，GLP-1成分一般可表示为GLP-1(A-B)，其中A是1-7的整数，而B是38-45的整数，任选具有如下定义的一个或多个氨基酸取代。
综上所述，在肠L细胞中加工后，GLP-1释放到循环中，进餐后最为显著。GLP-1的血浆浓度从约15pmol/L的空腹水平升至40pmol/L的餐后峰值水平。对于特定血浆葡萄糖浓度的上升，口服给予葡萄糖的血浆胰岛素水平与静脉内给予相比升高约3倍(Kreymann等，1987，Lancet 2(8571)：1300-4)。这种胰岛素释放的饮食性提高，称为肠降血糖素效应，主要是体液性的，而且目前认为GLP-1是人最有效的生理肠降血糖素。GLP-1通过与已知在胰β细胞表达的GLP-1受体结合而介导胰岛素产生。除促胰岛素作用以外，GLP-1还抑制胰高血糖素分泌，延缓胃排空(Wettergen等，1993，Dig Dis Sci 38：665-73)，并可促进外周葡萄糖清除(D′Alessio等，1994，J.ClinInvest 93：2293-6)。
综合作用赋予GLP-1优于当前用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的其它药剂的独特的治疗优势。首先，单次皮下剂量的GLP-1可使NIDDM患者的餐后葡萄糖水平完全正常化(Gutniak等，1994，DiabetesCare 17：1039-44)。可通过增加胰岛素释放和通过降低胰高血糖素分泌两者介导这种作用。其次，GLP-1的静脉内输注可延缓NIDDM患者的餐后胃排空(Williams等，1996，J.Clin Endo Metab 81：327-32)。第三，与磺酰脲不同，GLP-1的促胰岛素作用依赖于血浆葡萄糖浓度(Holz等，1993，Nature 361：362-5)。因此，在低血浆葡萄糖浓度时GLP-1介导的胰岛素释放的丧失防止严重低血糖。
当给予健康受试者时，GLP-1有效地影响血糖水平以及胰岛素和胰高血糖素浓度(Orskov，1992，Diabetologia 35：701-11)，这是葡萄糖依赖性的作用(Weir等，1989，Diabetes 38：338-342)。此外，在糖尿病患者中也是有效的(Gutniak，M.，1992，N.Engl J Med 226：1316-22)，能使2型糖尿病患者的血液葡萄糖水平正常化，并改善1型患者的血糖控制(Nauck等，1993，Diabetologia 36：741-4；Creutzfeldt等，1996，Diabetes Care 19：580-6)。
然而，GLP-1是代谢不稳定的，体内血浆半寿期(t1/2)仅1-2分钟。此外，外部给予的GLP-1也快速降解(Deacon等，1995，Diabetes 44：1126-31)。这种代谢不稳定性限制了天然GLP-1的治疗潜力。
GLP-1[7-36]NH2具有下列氨基酸序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO：13)，其可用作本发明的GLP-1成分。或者，GLP-1成分可在第2位含有甘氨酸(G)，例如序列HGEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO：17)。GLP-1成分可以是例如公开于US 2007/0041951的GLP-1的生物活性片段，其通过引用其整体结合到本文中。GLP-1的其它片段和修饰序列是本领域已知的(美国专利号5,614,492、美国专利号5,545,618、欧洲专利申请公布号EP 0658568 A1、WO 93/25579，其均通过引用其整体结合到本文中)。这类片段和修饰序列可与本发明的成分和下面描述的成分联用。
GLP-1的某些结构及功能类似物是从大毒蜥(钝尾毒蜥(Helodermasuspectum)和蛛毒蜥(Heloderma horridum))毒液中分离的，并已显示出临床效用。这类分子可用于本发明。具体地讲，毒蜥外泌肽-4是从钝尾毒蜥毒液分离的39个氨基酸残基肽，与人GLP-1有约52％同源性。毒蜥外泌肽-4是刺激胰岛素释放从而降低血液葡萄糖水平的有效的GLP-1受体激动剂。毒蜥外泌肽-4具有下列氨基酸序列：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：14)。称为艾塞那肽(商品名)的一种毒蜥外泌肽-4的合成形式已获准用于治疗2型糖尿病。虽然艾塞那肽在结构上类似于天然GLP-1，但在注射后具有较长的半寿期。
虽然艾塞那肽本身具有降低血液葡萄糖水平的能力，但是它也可与例如二甲双胍、噻唑烷二酮(thiozolidinedione)、磺酰脲等其它药物和/或胰岛素组合以改善葡萄糖控制。使用预灌装注射笔式装置，一天两次通过皮下注射给予艾塞那肽。人对艾塞那肽的反应通常包括改进最初的内源胰岛素快速释放，增加β细胞生长和复制，抑制胰腺胰高血糖素释放，延缓胃排空和降低食欲--均起到降低血液葡萄糖的作用。与磺酰脲和美格列奈(meglitinides)不同，艾塞那肽仅在葡萄糖存在时增加胰岛素合成和分泌，从而降低低血糖的风险。尽管艾塞那肽有治疗效用，但它具有某些不良特征，包括一天注射两次、胃肠外副作用和类似于天然GLP-1的相对较短的半寿期(即2小时左右)。
GLP-1和毒蜥外泌肽-4的各种功能类似物是已知的，且可用于本发明。这些功能类似物包括利拉鲁肽(liraglutide)(Novo Nordisk，WO98/008871)、R1583/taspoglutide(Roche，WO00/034331)、CJC-1131(ConjuChem，WO00/069911)、ZP-10/AVE0010(Zealand Pharma，Sanofi-Aventis，WO01/004156)和LY548806(Eli Lilly，WO03/018516)。
利拉鲁肽，亦称NN2211，是设计为一天注射一次的GLP-1受体激动剂类似物(Harder等，2004，Diabetes Care 27：1915-21)。在许多研究中，在2型糖尿病患者中测试了利拉鲁肽，已证实具有不同有效持续时间。在一项研究中，在用利拉鲁肽治疗2型糖尿病患者1周后，治疗改善了血糖控制，改进了β细胞功能，并降低了内源葡萄糖释放(Degn等，2004，Diabetes53：1187-94)。在类似研究中，8周0.6mg利拉鲁肽治疗2型糖尿病患者与使用安慰剂的患者相比显著改善了血糖控制又没有增加体重(Harder等，2004，Diabetes Care 27：1915-21)。
因此，在某些实施方案中，本发明的GLP-1受体激动剂与WO98/008871(其通过引用其整体结合到本文中)中披露的一样。除相对于天然GLP-1有1、2或更多个氨基酸取代以外，GLP-1受体激动剂还可具有至少一个亲脂取代基。例如，亲脂取代基可以是选自CH3(CH2)nCO-的酰基，其中n为4-38的整数，例如4-24的整数。亲脂取代基可以是直链或支链烷基或脂肪酸的酰基(例如参见WO98/008871，其通过引用结合到本文中)。
在某些实施方案中，GLP-1成分为Arg26-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)、Arg28，34Lys39-GLP-1(7-39)、Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)、Arg26Lys36-GLP-1(7-37)、Arg34Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26Lys39-GLP-1(7-39)、Arg34Lys40-GLP-1(7-40)、Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)、Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)、Gly8Arg26-GLP-1(7-37)、Gly8Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8Lys38-GLP-1(7-37)、Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)、Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)、Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)、Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)、Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)、Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)、Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)、Gly8Arg28，34Lys36，39-GLP-1(7-39)和Gly8Arg26，34Lys35，40-GLP-1(7-40)，各自任选具有亲脂取代基。例如GLP-1受体激动剂可具有以下序列/结构Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1(7-37)。
Taspoglutide，亦称为R1583或BIM 51077，是在用二甲双胍治疗的2型糖尿病患者中已经证实改善血糖控制和降低体重的GLP-1受体激动剂(摘要编号A-1604，2008年6月7日，68th American Diabetes AssociationMeeting(第68届美国糖尿病协会会议)，San Francisco，CA)。
因此，在某些实施方案中，GLP-1受体激动剂与WO00/034331(其通过引用其整体结合到本文中)中披露的一样。在某些示例性实施方案中，GLP-1受体激动剂具有序列[Aib8，35]hGLP-1(7-36)NH2(例如taspoglutide)，其中Aib是α-氨基异丁酸。
CJC-1131是GLP-1类似物，由GLP-1与反应性化学接头基团连接的DPP-IV抗性形式组成，该接头基团可供GLP-1在皮下注射后与血清白蛋白形成不可逆的共价健(Kim等，2003，Diabetes 52：751-9)。在12周的随机双盲安慰剂对照多中心研究中，CJC-1131和二甲双胍治疗在降低2型糖尿病患者的空腹血液葡萄糖水平中是有效的(Ratner等，摘要编号10-OR，2005年6月10-14日，第65届美国糖尿病协会会议(65th American DiabetesAssociation Meeting)，San Francisco，CA)。
因此，在某些实施方案中，GLP-1受体激动剂与WO00/069911(其通过引用其整体结合到本文中)中披露的一样。在一些实施方案中，GLP-1受体激动剂用反应基团修饰，所述反应基团与血液成分中的氨基、羟基或巯基反应形成稳定的共价键。在某些实施方案中，GLP-1受体激动剂用选自琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基的反应基团修饰。在某些示例性实施方案中，GLP-1受体激动剂具有下列序列/结构：D-Ala8Lys37-(2-(2-(2-马来酰亚胺基丙酰胺基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))-GLP-1(7-37)(例如CJC-1131)。
AVE0010，亦称ZP-10，是可与本发明联用的GLP-1受体激动剂。在最近的双盲研究中，用一天一次剂量的AVE0010治疗的患者显示HbAlc水平显著降低(Ratner等，摘要编号433-P，第68届美国糖尿病协会会议(68thAmerican Diabetes Association Meeting)，San Francisco，CA)。在研究结束时，对于一天一次给药，与安慰剂的32％相比，HbAlc＜7％的患者的百分比范围为47-69％。此外，AVE0010治疗的患者显示体重和餐后血浆葡萄糖呈剂量依赖性降低。
因此，在某些实施方案中，GLP-1受体激动剂与WO01/004156(其通过引用其整体结合到本文中)中披露的一样。例如，GLP-1受体激动剂可具有以下序列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPS SGAPPSKKKKKK-NH2(SEQ ID NO：18)(例如AVE0010)。
LY548806是设计成对二肽酶-肽基IV(DPP-IV)的蛋白酶解有抗性的GLP-1衍生物(Jackson等，摘要编号562，2005年6月10-14日，第65届美国糖尿病协会会议(65th American Diabetes Association Meeting)，SanFrancisco，CA)。研究表明，在高血糖症动物模型中，LY548806在高血糖期引起血液葡萄糖水平显著降低(Saha等，2006，J.Pharm.Exp.Ther.316：1159-64)。此外，LY548806显示引起胰岛素水平显著增加，这与已知的作用机制一致，即在高血糖症存在时刺激胰岛素释放。
因此，在某些实施方案中，GLP-1受体激动剂与WO03/018516(其通过引用其整体结合到本文中)中的披露的一样。在一些实施方案中，本发明的治疗剂包含GLP-1类似物，其中这类类似物或片段的主链在8位含有丙氨酸以外的氨基酸(8位类似物)。主链还可包括L-组氨酸、D-组氨酸或组氨酸的修饰形式，例如脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸或在7位的α-甲基-组氨酸。在一些实施方案中，与天然GLP-1相应的氨基酸相比，这些8位类似物可在12、16、18、19、20、22、25、27、30、33和37位上含有一个或多个其它的变化。在其它实施方案中，与天然GLP-1相应的氨基酸相比，这些8位类似物可在16、18、22、25和33位含有一个或多个其它变化。在某些示例性实施方案中，GLP-1受体激动剂具有以下序列：HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRG-OH(SEQ ID NO：19)(例如LY548806)。
因此，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和GLP-1受体激动剂的治疗剂。例如，在某些实施方案中，GLP-1受体激动剂是GLP-1(SEQ ID NO：13、17或59)或其功能类似物。在其它实施方案中，GLP-1受体激动剂是毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：14)或其功能类似物。GLP-1或毒蜥外泌肽-4的这类功能类似物包括在C端截短1-10个氨基酸(包括1、2、3或多达约5个氨基酸)的功能片段(对应于SEQ ID NO：13、14、17或59)。这类功能类似物相对于天然序列(例如SEQ ID NOS 13、14和59)可含有1-10个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)，并且在每种情况下都保持肽的活性。例如，GLP-1或毒蜥外泌肽-4的功能类似物相对于SEQ ID NO：13、59和14可具有1至约3、4或5个插入、缺失和/或取代(总体上)，并且在每种情况下都保持肽的活性。可采用任何可获得的测定法(包括本文所述方法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，GLP-1受体激动剂成分与天然序列(SEQ ID NO：13、59和14)有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。两个序列之间(例如天然序列和功能类似物之间)序列同一性的测定可采用任何比对工具完成，包括Tatusova等，Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences(Blast 2序列-一种比较蛋白 质和核苷酸序列的新型工具)，FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)。这类功能类似物还可包含其它化学修饰，例如本节描述的修饰和/或本领域已知的其它修饰。
在某些实施方案中，GLP1-ELP融合物具有本文列举的序列SEQ IDNO：54和56。当加工时，这类融合蛋白的成熟形式将以GLP的His7开始。
另一方面，本发明提供用于治疗或预防以下疾病的方法：2型糖尿病、葡萄糖耐量减低、1型糖尿病、高血糖症、肥胖症、暴食症、贪食症、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、非脂肪肝疾病、心肌梗死、冠心病和其它心血管疾病。所述方法包括给予需要这类治疗的患者包含弹性蛋白样肽(ELP)和GLP-1受体激动剂的治疗剂(如上所述)。在这些或其它实施方案中，本发明提供用于减少食物摄取、降低β细胞凋亡、增加β细胞功能和β细胞量和/或用于恢复β细胞的葡萄糖敏感性的方法。患者一般可为人或非人类动物患者(例如狗、猫、牛或马)。优选患者为人。
用本发明的ELP/GLP-1受体激动剂化合物的治疗还可与一种或多种药理活性物质组合，例如选自抗糖尿病药、抗肥胖症药、食欲调节药、抗高血压药、用于治疗和/或预防由糖尿病引起或与糖尿病有关的并发症的药物以及用于治疗和/或预防由肥胖症引起或与肥胖症有关的并发症和障碍的药物。在本文中，表述“抗糖尿病药”包括用于治疗和/或预防胰岛素抵抗和其中胰岛素抵抗是病理生理机制的疾病的化合物。
GLP-1或毒蜥外泌肽-4类似物，或GLP-1受体激动剂/ELP化合物结合GLP-1受体的能力可通过标准方法测定，例如，通过受体结合活性筛选方法，该方法包括提供在其表面表达GLP-1受体的合适细胞，例如胰岛瘤细胞系，例如RINmSF细胞或INS-1细胞。除了使用放射免疫测定方法测定示踪剂与膜的特异性结合以外，还可测定cAMP活性或葡萄糖依赖性的胰岛素产生。在一种方法中，使用编码GLP-1受体的多核苷酸转染细胞，从而表达GLP-1受体蛋白。因此，这些方法还可用于测试或确定疑似GLP-1受体激动剂是否有活性。本文更详细地描述了示例性的测定法。
此外，可采用已知方法测定或预测体内生物活性的GLP-1受体激动剂或GLP-1受体激动剂/ELP的水平(参见例如Siegel等，1999，Regul Pept79(2-3)：93-102)。具体地讲，可以使用各种已知的测定GLP-1活性的方法来评价GLP-1受体激动剂或GLP-1受体激动剂/ELP化合物体内诱导胰岛素产生的能力。例如，可将ELP/GLP-1受体激动剂化合物导入细胞，例如无限增殖化β细胞，并可使所得细胞与葡萄糖接触。如果细胞在响应葡萄糖时产生胰岛素，则一般把修饰的GLP-1视为在体内有生物活性(Fehmann等，1992，Endocrinology 130：159-166)。本文更详细地描述了示例性的测定法。
还可采用已知测定法测定GLP-1受体激动剂/ELP化合物促进β细胞增殖、抑制β细胞凋亡和调节胰岛生长的能力。胰β细胞增殖可通过3H-胸苷或BrdU掺入测定法评价(参见例如Buteau等，2003，Diabetes 52：124-32)，其中使胰β细胞(例如INS(832/13)细胞与ELP/GLP-1受体激动剂化合物接触，并分析3H-胸苷或BrdU掺入的增加。可在培养的胰岛素分泌细胞中和/或在由于β细胞凋亡速率过快而发生糖尿病的动物模型中测定ELP/GLP-1受体激动剂化合物的抗凋亡活性(参见例如Bulotta等，2004，Cell BiochemBiophys 40(增刊3)：65-78)。
除GLP-1以外，该家族的其它肽(例如由胰高血糖素原基因加工得到的肽，例如GLP-2、GIP和泌酸调节肽(oxyntomodulin))也可与ELP成分(如本文所述)缀合或融合以提高其治疗潜力。
胰岛素
在其它实施方案中，本发明提供包含ELP成分与胰岛素偶联(例如通过融合或缀合)的治疗剂。可以使用胰岛素注射剂(例如人胰岛素注射剂)治疗糖尿病。机体的产胰岛素细胞称为β细胞，而且它们存在于胰腺中。这些细胞聚集在一起形成“胰岛”，以描述胰岛的德国医科学生命名。
胰岛素的合成始于胰岛素基因的翻译，该基因位于11号染色体上。在翻译期间，两个内含子从mRNA产物中切割出来，其编码长度为110个氨基酸的蛋白质。这种主要的翻译产物称为前胰岛素原，并且是无活性的。它含有长度为24个氨基酸的信号肽，这是蛋白质跨过细胞膜所必需的。
一旦前胰岛素原到达内质网，蛋白酶便切下信号肽以产生胰岛素原。胰岛素原由3个结构域组成：氨基端B链、羧基端A链和中间称为C肽的连接肽。胰岛素由称为A链(21个氨基酸-GIVEQCCASVCSLYQLENYCN)(SEQ ID NO：15)和B  链(30个氨基酸FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA)(SEQ ID NO：16)的两条氨基酸链组成，两条氨基酸链两个二硫键连接在一起。A链内有第3个二硫键，将A链第6个和第11个残基连接在一起。在大多数物种中，A链和B链的长度和氨基酸组成类似，3个二硫键的位置是极其保守的。由于这个原因，猪胰岛素可代替糖尿病患者的人胰岛素水平不足。如今，猪胰岛素在很大程度上已经被通过细菌大规模生产的人胰岛素原(重组胰岛素)代替。
胰岛素分子具有在溶液中形成二聚体的趋向，而且在锌离子存在时胰岛素二聚体缔合成六聚体。而胰岛素单体容易通过血液扩散并且快速起效，六聚体扩散缓慢且起效延迟。在设计重组胰岛素时，可以降低胰岛素分子形成二聚体和六聚体的趋势但不会中断与胰岛素受体结合的方式对胰岛素的结构进行修饰。这样，制成从短效到长效的各种制剂。
在内质网中，胰岛素原暴露于脱去C肽的若干特异性肽酶，从而产生成熟和活性形式的胰岛素。在高尔基体中，胰岛素和游离的C肽被包装到在β细胞的胞质中蓄积的分泌性颗粒中。分泌颗粒的胞吐作用由葡萄糖进入β细胞触发。胰岛素的分泌对代谢具有广泛的影响。
在响应葡萄糖升高时，胰岛素的释放分两个阶段。第一是胰岛素的立即释放。这可归于贮存在分泌颗粒中的预先形成的胰岛素的释放。在短暂延迟后，便有新合成胰岛素的第二次更持久的释放。
一旦释放，胰岛素只是短暂具有活性，然后被酶降解。胰岛素酶存在于肝和肾中，其分解在血浆中的循环胰岛素，因此，胰岛素的半寿期仅约为6分钟。这种短期作用导致循环中的胰岛素水平快速变化。
已开发出具有改进的治疗性质的胰岛素类似物(Owens等，2001，Lancet358：739-46；Vajo等，2001，Endocr Rev 22：706-17)，且这类类似物可与本发明联用。采用各种策略，包括延长胰岛素B链的COOH端和改造对白蛋白具有相当亲和力的脂肪酸酰化的胰岛素，来产生更长效的胰岛素类似物。然而，用可获得的更长效的胰岛素化合物进行体内治疗仍导致高频率的低血糖和高血糖波动以及HbAlc的一般降低。因此，开发真正长效而稳定的人胰岛素类似物仍是一项重要任务。
可用于本发明的胰岛素的功能类似物包括快速起效的类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素和格鲁辛胰岛素(glulisine)，它们在皮下注射后快速吸收(＜30分钟)，1小时达峰值，而且作用时间相对较短(3-4小时)。此外，已开发出可与本发明联用的两种长效胰岛素类似物：甘精胰岛素和地特胰岛素。长效胰岛素类似物大约2小时开始起效，4-6小时生物作用达到平稳期，并可持续长达24小时。
因此，在一个实施方案中，胰岛素成分可含有赖脯胰岛素(亦称Humalog，Eli Lilly)的A链和/或B链。赖脯胰岛素因28位上的脯氨酸被赖氨酸取代，且胰岛素B链29位上的赖氨酸被脯氨酸取代而不同于人胰岛素。虽然这些修饰不改变受体结合，但它们有助于阻断胰岛素二聚体和六聚体的形成，使得餐后注射可获得较大量活性的单体胰岛素。
在另一个实施方案中，胰岛素可含有门冬胰岛素(亦称Novolog，NovoNordisk)的A链和/或B链。门冬胰岛素被设计成在人胰岛素B链28位上的氨基酸脯氨酸被天冬氨酸单一置换。这种修饰有助于阻断胰岛素六聚体的形成，产生更快速起效的胰岛素。
在又一个实施方案中，胰岛素可含有格鲁辛胰岛素(亦称Apidra，Sanofi-Aventis)的A链和/或B链。格鲁辛胰岛素是短效类似物，由人胰岛素B链3位上的天冬酰胺被赖氨酸取代，且29位的赖氨酸被谷氨酰胺取代而产生。与正常的人胰岛素相比，格鲁辛胰岛素起效更快，作用时间更短。
在另一个实施方案中，胰岛素可含有甘精胰岛素(亦称Lantus，Sanofi-Aventis)的A链和/或B链。甘精胰岛素不同于人胰岛素，因为A链21位的氨基酸天冬酰胺被甘氨酸置换，且将2个精氨酸加至B链C端。与睡前中性低精蛋白锌(NPH)胰岛素(一种中效胰岛素)相比，甘精胰岛素与2型糖尿病患者较少的夜间低血糖有关。
在又一个实施方案中，胰岛素可含有地特胰岛素(亦称Levemir，NovoNordisk)的A链和/或B链。地特胰岛素是可溶性的(中性pH)长效胰岛素类似物，其中去除B30位的氨基酸苏氨酸，且将14-碳肉豆蔻酰脂肪酸乙酰化为LysB29的ε-氨基。在皮下注射后，地特胰岛素解离，从而暴露出能够与白蛋白分子可逆结合的游离脂肪酸。因此在稳定状态下，未结合的游离胰岛素的浓度大大降低，导致稳定的血浆葡萄糖水平。
在一些实施方案中，胰岛素可以是单链胰岛素类似物(SIA)(例如参见6,630,438和WO08/019368，其通过引用其整体结合到本文中)。单链胰岛素类似物包括一组结构上相关的蛋白质，其中A链和B链与多肽接头共价连接。多肽接头将B链的C端连接至A链的N端。接头可以是任何长度，只要接头提供对于SIA具有葡萄糖摄取和胰岛素受体结合作用所必需的结构构象。在一些实施方案中，接头长度约为5-18个氨基酸。在其它实施方案中，接头长度约为9-15个氨基酸。在某些实施方案中，接头长约12个氨基酸。在某些示例性实施方案中，接头具有序列KDDNPNLPRLVR(SEQ ID NO：20)或GAGSSSRRAPQT(SEQ ID NO：21)。然而，应当了解的是，这个序列可能有许多变化(例如氨基酸的长度(添加和缺失两者)和取代)但基本上不损害所产生的SIA在葡萄糖摄取和胰岛素受体结合活性方面的功效。例如，可在任一端添加或脱去若干不同的氨基酸残基但基本上不降低所产生的SIA的活性。
目前处于临床研发中的示例性单链胰岛素类似物是albulin(Duttaroy等，2005，Diabetes 54：251-8)。albulin可在酵母或哺乳动物细胞中产生。它由经十二肽接头连接在一起并与天然人血清白蛋白的NH2端融合的人胰岛素的B链和A链(与天然人胰岛素有100％同一性)组成。为了表达和纯化albulin，Duttaroy等人使用4个重叠引物和PCR扩增，构建了编码含有经十二肽接头连接在一起的成熟人胰岛素的B链和A链的单链胰岛素的合成基因构建体。将所得PCR产物在人血清白蛋白(HSA)的信号肽和成熟HSA的NH2端之间符合读框地连接，装入pSAC35载体中用于在酵母内表达。按照本发明，abulin的HSA成分可用本文所述的ELP成分置换。
因此，一方面，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和胰岛素或其功能类似物的治疗剂。例如，在某些实施方案中，胰岛素是哺乳动物胰岛素，例如人胰岛素或猪胰岛素。按照本发明，ELP成分可与胰岛素A链、或B链、或两条链偶联(例如通过重组融合或化学缀合)。胰岛素可包含A链、B链和C链中的每条链(SEQ ID NO：51和52)，或者可包含仅含有A链和B链的加工形式。在一些实施方案中，A链和B链通过短的连接肽连接产生单链胰岛素。胰岛素可以是人胰岛素的功能类似物，包括在N端和/或C端(A链和B链的任一条或两条)截短1-10个氨基酸(包括1、2、3个或约5个氨基酸)的功能片段。相对于天然序列(例如SEQ ID NO：15和16)，功能类似物可含有1-10个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)，并且在每种情况下都保持肽的活性。例如，相对于天然序列(其可含有A链和B链，或A链、B链和C链)，功能类似物可具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)。可采用任何可获得的测定法(包括本文所述方法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，胰岛素成分与A链和B链的每个天然序列(SEQ ID NO：15和16)有至少约75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性。两个序列之间(例如天然序列和功能类似物之间)序列同一性的测定可采用任何比对工具完成，包括Tatusova等，Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences(Blast 2序列-一种 比较蛋白质和核苷酸序列的新型工具)，FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)。胰岛素成分可含有本领域已知的其它化学修饰。
另一方面，本发明提供用于治疗或预防以下疾病的方法：糖尿病，包括I型和II型糖尿病。所述方法包括给予有其需要的患者有效量的包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和胰岛素(或其功能类似物)成分的治疗剂。患者一般可以是人或非人类动物(例如狗、猫、牛或马)患者。优选患者是人。
为了表征胰岛素类似物或含有ELP的胰岛素类似物的体外结合性质，可以在表达胰岛素受体的各种细胞系中进行竞争结合测定法(Jehle等，1996，Diabetologia 39：421-432)。例如，可以采用使用CHO细胞过量表达人胰岛素受体的竞争结合测定法。胰岛素还可以比胰岛素受体低的亲和力与IGF-1受体结合。为了测定含有ELP的胰岛素类似物的结合亲和力，可以在L6细胞中使用125I标记的IGF-1进行竞争结合测定法。
胰岛素的活性包括刺激外周葡萄糖清除和抑制肝葡萄糖产生。可采用已知方法体外测定含有ELP的胰岛素类似物介导这些生物活性的能力。例如，可以在3T3-L1脂肪细胞中测定含有ELP的类似物对葡萄糖摄取的作用，并与胰岛素的作用进行比较。细胞用生物活性类似物预处理一般可在2-脱氧葡萄糖摄取时产生剂量依赖性的增加。可以在许多细胞类型中测定含有ELP的胰岛素类似物调节葡萄糖产生的能力，例如，H4lle肝细胞瘤细胞。在该测定法中，用生物活性类似物预处理一般将导致剂量依赖性地抑制葡萄糖释放量。
因子VII(VIIa)
在某些实施方案中，本发明提供包含ELP成分与因子VII/VIIa偶联(例如通过融合或缀合)的治疗剂。凝血是血液凝块形成的生物过程，涉及许多不同的丝氨酸蛋白酶及其必需的辅因子和抑制剂。它始于因子VII(FVII)和因子VIIa(FVIIa)暴露于其膜结合的辅因子即组织因子(TF)，导致因子Xa(FXa)和更多FVIIa的产生。该过程之后产生因子IXa(FIXa)和进一步的FXa，其与相应的辅因子FVIIIa和FVa结合时形成血小板结合复合物，最终导致形成凝血酶和血纤蛋白凝块。凝血酶还通过激活辅因子(例如FV和FVII)和酶原(例如因子XI)进一步增强凝血。此外，凝血酶激活血小板导致血小板聚集，这是止血栓子形成所需要的。
因子VII在血液中以酶原形式循环，并通过因子IXa、因子Xa、因子XIIa、或凝血酶通过轻微蛋白酶解转化成其活性形式因子VIIa。因子VIIa为两条链的50千道尔顿(kDa)血浆丝氨酸蛋白酶。酶的活性形式包含重链(254个氨基酸残基)和轻链(152个残基)，重链含有催化结构域，轻链含有2个表皮生长因子(EGF)样结构域。在血浆中循环的成熟因子VII/VIIa由406个氨基酸残基组成(SEQ ID NO：33)。轻链和重链由二硫键连接在一起。
如上所述，因子VIIa由蛋白酶解其单链酶原因子VII的一个肽键而产生，因子VII以约0.5μg/ml存在于血浆中。通过切割内部肽键使酶原因子VII转化成其活化的两条链分子。在人因子VII中，切割位点位于Arg152-Ile153(Hagen等，1986，PNAS USA 83：2412-6)。
本申请使用的“因子VII/VIIa”是指由未活化形式(因子VII)或活化形式(因子VIIa)或其混合物组成的产物。上述定义中的“因子VII/VIIa”包括具有天然人因子VII/VIIa的氨基酸序列的蛋白质。它还包括具有稍加修饰的氨基酸序列的蛋白质，例如，修饰的N末端包括N端氨基酸缺失或添加，只要这些蛋白质基本上保持因子VIIa的活性。上述定义中的“因子VII”还包括可存在和发生在一个个体到另一个个体间的天然等位基因变异。同样，糖基化程度和位置或其它翻译后修饰可以随所选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质而改变。
在钙离子存在时，因子VIIa以高亲和力与TF结合。TF是263个氨基酸残基糖蛋白，由219个残基胞外域、一个跨膜结构域和一个短胞质域组成(Morrissey等，1987，Cell 50：129-35)。TF胞外域由两个各约105个氨基酸的纤连蛋白III型结构域组成。FVIIa的结合完全是由TF胞外域介导的(Muller等，1994，Biochem.33：10864-70)。氨基酸16-26和129-147区域的残基有助于FVIIa的结合以及分子的促凝功能。残基Lys20、Trp45、Asp58、Tyr94和Phe140对FVIIa结合的自由能(ΔG)的贡献较大(1kcal/mol)。
TF在血浆分隔开的细胞和血管内皮上组成型表达。通过暴露于炎性细胞因子或细菌脂多糖诱导其在内皮细胞和单核细胞上表达(Drake等，1989，J.Cell Biol.109：389)。在组织受损时，TF暴露的胞外域与FVII形成高亲和力的钙依赖性复合物。一旦与TF结合，可通过肽键切割产生丝氨酸蛋白酶FVIIa而激活FVII。尚未阐明体内催化这个步骤的酶，但是体外FXa、凝血酶、TF:FVIIa和FIXa可以催化这种切割。FVIIa对其生理底物FX和FIX只有弱的活性，而TF:FVIIa复合物快速激活FX和FIX。
TF:FVIIa复合物构成血液凝固外源途径的初级引发物。复合物通过激活FX成为因子Xa(FXa)、激活FIX成为因子IXa(FIXa)及激活其它FVII成为FVIIa而启动外源途径。TF:FVIIa的作用最终导致凝血酶原转化成可进行许多生物功能的凝血酶。凝血酶最重要的活性是将血纤蛋白原转化为血纤蛋白，而血纤蛋白聚合形成凝块。TF:FVIIa复合物还作为次级因子参与延伸接触激活系统的生理效应。
凝血的初始调节和后续调节是复杂的，因为止血的维持对于生存是决定性的。在止血(正常凝块形成和溶解)和血栓形成(病理凝块形成)之间存在微妙的平稳。涉及凝血异常的严重临床病症包括深静脉血栓形成、心肌梗死、肺栓塞、中风和弥散性血管内凝血(脓毒症中)。还有许多流血性凝血病，其中凝块形成不足。这些包括血友病A(FVIII缺乏症)或血友病B(FIX缺乏症)，其中需要促凝血疗法。这个治疗领域的挑战是在太多凝血和太少凝血之间的窄窗位下操作。
研究表明，用作治疗剂的外源FVIIa在血友病A和血友病B患者中诱导止血(Hedner，2001，Seminars Hematol.38(增刊12)：43-7；Hedner，2004，Seminars Hematol.41(增刊1)：35-9)。它还被用来治疗肝病患者的出血、抗凝血诱发性出血、外科手术、血小板减少、血小板机能不全、Bemard-Soulier综合征、冯威勒布兰特氏病(von Willebrand disease)和其它出血病症(参见例如Roberts等，2004，Blood 104：3858-64)。
人重组FVIIa的市售制剂以NovoSevenTM销售。NovoSevenTM标明用于治疗血友病A或B患者的出血，而且是现行唯一有效用于出血的重组FVIIa。在“Summary Basis for Approval for NovoSevenTM”FDA参考号96-0597中报道了半寿期为2.3小时的循环重组FVIIa。此外，重组FVIIa的半寿期在儿科患者中较短(约1.3小时)，这就表明在这个人群中可能需要较高剂量的重组FVIIa(Roberts等，2004，Blood 104：3858-64)。因此，需要相对较高剂量和频率的给药以达到和维持所需要的治疗或预防效果。因此，难以获得适当的剂量调节，并且频繁的静脉内给药的需要给患者的生活方式带来限制。
具有较长循环半寿期的分子可减少需要的给药次数。考虑到现行可用的FVIIa疗法的频繁注射问题以及为了获得FVIIa的更佳治疗水平以及伴随的治疗效果提高的潜力，显然需要体内半寿期较长的改进的FVII或FVIIa样分子。
已经证实，重组人凝血因子VIIa(rFVIIa，NovoSeven；Novo NordiskA/S，Copenhagen，Denmark)与抑制剂一起有效治疗血友病患者的出血。少部分患者可能对rFVIIa治疗无效，可能获益于具有功效提高的遗传修饰的FVIIa分子。为此，已经对固有活性提高的FVIIa类似物进行了研究，其表现出上好的体外止血特性(参见例如WO02/077218或W005/074975，其通过引用其整体结合到本文中，以及Tranholm等，2003，Blood 102(10)：3615-20，同样通过引用结合)。这些类似物还可以在其中已观察到rFVIIa功效的其它适应症(包括血小板减少和创伤)中用作更有效的止血药。
因此，在一些实施方案中，可用于本发明的因子VIIa类似物与WO02/077218或WO05/074975所描述的一样。例如，FVIIa类似物可具有在298位取代甲硫氨酸的谷氨酰胺(即M298Q-FVIIa)。在某些示例性实施方案中，FVIIa类似物含有两个其它突变，158位的缬氨酸被天冬氨酸置换，296位的谷氨酸被缬氨酸置换(即V158D/E296V/M298Q-FVIIa)。或者，因子VIIa类似物可具有在337位取代赖氨酸的丙氨酸残基(即V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa)。在另一些实施方案中，因子VIIa类似物具有选自Q250C、P406C和407C的取代或插入，其中半胱氨酸也被引入C端序列(参见例如US 7,235,638，其通过引用其整体结合到本文中)。因子VIIa类似物还可包含在247、260、393、396和/或405位的一个或多个位置上的取代或插入。
在这些或其它实施方案中，因子VIIa类似物包含相对于天然因子VIIa序列的选自以下的取代：(a)Lys157被选自Gly、Val、Ser、Thr、Asp和Glu的氨基酸取代；(b)Lys337被选自Ala、Gly、Val、Ser、Thr、Gln、Asp和Glu的氨基酸取代；(c)Asp334被Ala或Asn以外的任何氨基酸取代；和(d)Ser336被Ala或Cys以外的任何氨基酸取代(参见例如US 7,176,288，其通过引用其整体结合到本文中)。或者，因子VIIa类似物包含因子VII 305位上的Leu被选自以下的氨基酸残基取代：Val、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Lys、Arg、His、Asp和Gln(参见例如US 6,905,683，其通过引用其整体结合到本文中)。
因此，一方面，本发明提供包含弹性蛋白样肽(ELP)和因子VII/VIIa或其功能类似物的治疗剂。例如，在某些实施方案中，因子VII/VIIa是人因子VII/VIIa(例如SEQ ID NO：33)。因子VII/VIIa可以是人因子VII/VIIa的功能类似物，包括在N端和/或C端截短达1-10个氨基酸(包括1、2、3或约5个氨基酸)的功能片段。相对于天然序列(例如SEQ ID NO：33)，功能类似物可含有1-10个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)，并且在每种情况下都保持肽的活性。例如，相对于天然全长序列，或相对于重链和轻链之一或两者，这类类似物可具有1个至约5个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)。可采用任何可获得的测定法(包括本文所述方法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，因子VII/VIIa成分与天然序列(SEQ ID NO：33)有至少约75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性。两个序列之间(例如天然序列和功能类似物之间)序列同一性的测定可采用任何比对工具完成，包括Tatusova等，Blast 2 seauences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences(Blast 2序列-一种比较蛋白质和核苷酸序列的新型工 具)，FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)。
在示例性的实施方案中，因子VII-ELP融合物具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列。SEQ ID NO：58在因子VII和ELP序列之间还包含TEV蛋白酶切割位点，这可能对需要时在表达后脱去ELP序列是有益的。然而，按照本发明，可完全脱去tev序列，或用如本文公开的其它连接序列置换。
另一方面，本发明提供用于治疗或预防出血相关疾病的方法。所述方法包括给予有需要的患者有效量的包含弹性蛋白样肽(ELP)和因子VII/VIIa或其功能类似物的治疗剂。在某些实施方案中，出血相关疾病是一种或多种血友病(A或B)、手术后出血、抗凝血诱发性出血、血小板减少、因子VII缺乏症、因子XI缺乏症、肝病患者的出血、血小板机能不全、Bemard-Soulier综合征、冯威勒布兰特氏病和颅内出血。患者一般是人或非人类动物(例如狗、猫、牛或马)患者。优选患者是人。
为了表征疑似因子VII/VIIa类似物或含有ELP的因子VIIa类似物的体外结合性质，如前所述进行TF结合测定(参见例如Chaing等，1994，Blood83(12)：3524-35)。简单地讲，可将重组人TF在碳酸盐抗原缓冲液中于4℃过夜包被于Immulon II板上。同样将BSA包被于板上用作对照。将含有ELP的因子VIIa类似物以不同浓度加入TBS-T缓冲液中。几次洗涤后，加入单特异性多克隆兔抗人FVIIa血清，并于室温温育约1小时。接下来，依次加入与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG和用于检测的碱性磷酸酶底物PNPP。减去背景信号后，读取约405nm下的吸光度，其与因子VIIa结合固定化TF的程度成正比。然后将这些值与含有因子VIIa的对照血浆进行比较。
可以在人FVII缺乏症血浆中测定因子VII/VIIa类似物或含有ELP的因子VIIa类似物的凝血能力。在该测定法中，将稀释成不同浓度的含有ELP的因子VIIa类似物直接加入FVII缺乏症血浆中。在血凝仪中，可将一份血浆±FVIIa类似物与2份InnovinTM(Dade，Miami，Fla)凝血酶原时间试剂(具有磷脂和CaCl2的重组人组织因子)混合。目测凝块形成，测量凝固时间。将凝固时间(秒)与仅FVII缺乏症血浆的平均凝固时间进行比较，按凝固时间相对于FVIIa类似物浓度作图。
治疗性蛋白质
本发明还提供包含选自表1的ELP成分和至少一种治疗性蛋白质的治疗剂。ELP成分和治疗性蛋白质可通过本文所述的重组融合或化学缀合偶联。这类治疗性蛋白质以蛋白质名称和GeneSeq Accession号列于表1中。本领域已知的各治疗性蛋白质的氨基酸序列，通过引用表1所列各治疗性蛋白质结合到本文中。同样列于表1的美国专利或PCT公开文本中进一步描述了这类治疗性蛋白质，且这类美国专利和PCT公开文本，尤其有关这类治疗性蛋白质的结构和所描述的功能类似物通过引用结合到本文中。
表1还记载了所列各种治疗性蛋白质的生物活性，以及测定本发明的功能类似物或药剂(例如与ELP成分的融合物)的活性的示例性测定法。通常，表1所列治疗性蛋白质的功能类似物可包括在N端和/或C端截短1-10个氨基酸(包括1、2、3、4或约5个氨基酸)的功能片段。相对于基础序列(例如表1所列基础序列)，功能类似物可含有1-10个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)，并在每种情况下保持治疗性蛋白质的全部或部分生物活性(如表1所列活性)。例如，与基础序列相比，功能类似物可具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失和/或取代(总体上)。可采用任何可获得的测定法(包括表中所述测定法)证实或测定这类活性。在这些或其它实施方案中，治疗性蛋白质与相应的基础序列有至少约75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性。所述分子还可包含本领域已知的其它化学修饰。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质(例如选自表1的治疗性蛋白质)的大小小于约25kDa，或小于约10kDa，或小于约5kDa，本发明相应的治疗剂(例如包含ELP成分)的分子量小于约60kDa、55kDa、50kDa或40kDa。
表1还列出各治疗性蛋白质优选的适应症，其相应的治疗剂可用于例如有关这类适应症的治疗或预防方法中。
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缀合和偶联
本发明提供包含ELP成分和治疗成分的治疗剂，例如表1所列的治疗性蛋白质以及所述的GLP-1受体激动剂、胰岛素、因子VII/VIIa和功能类似物。这类药剂可用重组技术和/或化学偶联(例如缀合)制备。
按照本发明的某些实施方案，重组产生的ELP融合蛋白包括彼此通过遗传融合而缔合的ELP成分和治疗成分。例如，融合蛋白可通过与ELP成分符合读框克隆的治疗成分(或反过来也一样)的编码多核苷酸的翻译而产生。这类ELP融合蛋白可含有与ELP成分的N端和/或C端连接的治疗成分的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，治疗性蛋白质性成分与ELP成分的N端和C端连接，且融合蛋白可在ELP成分的一端或两端含有一个或多个等同的治疗成分。
在某些实施方案中，ELP成分和治疗成分可用不同长度的接头肽融合以提供较大的物理间隔，并允许在融合部分之间有较大的空间移动性，因此使治疗成分可及性最大化例如用于结合其关联受体。接头肽可由为柔性或更刚性的氨基酸组成。例如，柔性接头可包括具有相对较小的侧链以及可以是亲水的氨基酸。柔性接头可含有而不限于甘氨酸和/或丝氨酸残基序列段。更刚性的接头可含有例如空间位阻较大的氨基酸侧链，例如(而不限于)酪氨酸或组氨酸。接头可以小于约50、40、30、20、10或5个氨基酸残基。接头可与ELP成分和治疗成分共价连接，以及在ELP成分和治疗成分之间共价连接，例如通过重组融合。
接头或肽间隔基可以是蛋白酶可切割或不可切割的。举例来说，可切割的肽间隔基包括而不限于被不同类型的蛋白酶(体外或体内)识别的肽序列，例如Tev、凝血酶、因子Xa、纤维蛋白溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶(例如GFLG等)和存在于其它身体区室的蛋白酶。在使用可切割接头的一些实施方案中，作为融合物的融合蛋白(“治疗剂”)可以是无活性、活性较低或效力较低的，当间隔基体内切除后被激活。或者，作为融合物有足够的活性时，则可使用不可切割的间隔基。不可切割的间隔基可以是任何合适的类型，包括例如具有式[(Gly)n-Ser]m的不可切割间隔基部分(SEQ ID NO：22)，其中n为1-4(包括1和4)，m为1-4(包括1和4)。或者，可以使用不同于主链ELP的短ELP序列而不是接头或间隔基，同时实现所需效果。
在另一些实施方案中，治疗剂是具有治疗成分的重组融合物，在治疗成分两侧连接ELP成分。至少一个所述ELP成分可通过可切割间隔基连接，使得治疗成分是无活性的，但通过体内酶解去除一个ELP成分而被激活。所得具有一个ELP的融合物是有活性的，其体内半寿期(或本文所述其它性质)延长/提高。
在其它实施方案中，本发明提供ELP成分和治疗成分的化学缀合物。可通过本领域众所周知的多种方法将ELP成分与治疗成分化学偶联来制备缀合物(参见例如Nilsson等，2005，Ann Rev Biophys Bio Structure 34：91-118)。在一些实施方案中，可将治疗成分与ELP成分共价连接形成化学缀合物，直接或者通过短的或长的接头部分、通过治疗性蛋白质性成分上的一个或多个官能团(例如胺基、羧基、苯基、巯基或羟基)，形成共价缀合物。可以使用各种常用接头，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、碳二亚胺、二(羟基琥珀酰亚胺)酯、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。
另外，非肽化学间隔基可为任何合适的类型，包括例如BioconjugateTechniques，Greg T.Hermanson，Academic Press，Inc.出版，1995中描述的官能接头，以及Cross-Linking Reagents Technical Handbook(可获自PierceBiotechnology，Inc.(Rockford，Illinois))中介绍的官能接头，所述文献的公开内容通过引用整体结合到本文中。示例性化学间隔基包括可连接Lys的胺基的同双官能接头，以及可在一端连接Cys而在另一端连接Lys的异双官能接头。
在某些实施方案中，将在室温(或人体温，例如Tt＞37℃)不会转变的相对较小的ELP成分(例如小于约30kDa、25kDa、20kDa、15kDa或10kDa的ELP成分)化学偶联或交联。例如，可将具有相同或不同性质的两个相对较小的ELP成分化学偶联。在一些实施方案中，这类偶联可通过在ELP C端或在ELP C端附近加入一个半胱氨酸残基而发生在体内。这类ELP成分可各自与一个或多个治疗成分融合，以便增加对靶标的活性或亲合力。
多核苷酸、载体和宿主细胞
另一方面，本发明提供包含编码本发明的治疗剂的核苷酸序列的多核苷酸。除编码ELP和治疗成分的序列以外，这类多核苷酸还包含一个或多个表达调控元件。例如多核苷酸可包含作为表达调控元件的一个或多个启动子或转录增强子、核糖体结合位点、转录终止信号和聚腺苷酸化信号。可将多核苷酸插入任何合适的载体内，可将所述载体包含在任何合适的宿主细胞中进行表达。
可将包含多核苷酸的载体导入细胞以表达治疗剂。载体可保持附加型或与染色体整合，只要编码治疗剂的插入序列可以转录。载体可通过标准重组DNA技术构建。载体可以为质粒、噬菌体、黏粒、噬菌粒、病毒或本领域已知的用于在原核或真核细胞内进行复制和表达的任何其它类型。本领域技术人员应当了解的是，在这类载体中可包括本领域已知的多种成分(例如表达调控元件)，包括多种转录信号，例如启动子和调节RNA聚合酶结合到启动子上的其它序列。已知载体在将于其中表达的细胞内是有效的任何启动子都可用于启动治疗剂的表达。合适的启动子可以是诱导型或组成型的启动子。合适启动子的实例包括SV40早期启动子区、包含在劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)的3′长末端重复序列的启动子、HSV-1(单纯疱疹病毒-1)胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列等，以及下列具有组织特异性并已被用于转基因动物的动物转录调控区：在胰腺细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；在胰β细胞中有活性的胰岛素基因调控区；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区；在肝中有活性的白蛋白基因调控区；在肝中有活性的甲胎蛋白基因调控区；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区；在类红细胞中有活性的β-珠蛋白基因调控区；在脑内少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因调控区；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区和在丘脑下部有活性的促性腺激素释放激素基因调控区。
药物组合物
本发明还提供包含本发明的治疗剂(如上所述)以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。对于每种治疗性蛋白质，例如表1所列治疗性蛋白质、GLP-1受体激动剂、胰岛素和因子VII/VIIa的实施方案，这类药物组合物可用于如上所述的治疗方法中。
当给药(例如胃肠外)时，本发明的治疗剂可克服肽药剂的某些缺陷，包括在一些实施方案中，这类肽易于被血浆蛋白酶代谢或通过肾滤过从循环中清除的局限性。传统上口服途径给予肽药剂也可能存在问题，因为除了在胃中的蛋白酶解以外，在这类肽药剂达到其预定的靶组织前，胃的强酸度还会将其破坏。由胃酶和胰腺酶的作用产生的肽和肽片段在肠刷状缘膜中被外肽酶和内肽酶切割产生二肽和三肽，即使避免了胰酶的蛋白酶解，多肽也会遭受刷状缘肽酶降解。任何得以通过胃的肽药剂还会在肠粘膜中被代谢，在那里渗透屏障阻止肽药剂进入细胞。在某些实施方案中，本发明的治疗剂可克服这类缺陷，并提供功效、生物利用度、治疗半寿期、持久性、降解益处(degradation assistance)等得到提高的组合形式。本发明的治疗剂因此包括口服剂型和胃肠外剂型以及肽药剂可以高效方式利用的各种不同的其它剂型。例如，在一些实施方案中，这类药物剂可实现高的粘膜吸收，同时能够使用较低剂量获得最佳治疗效果。
与未融合或未缀合的对应物相比，可以较低剂量和/或低频率给予本发明的治疗剂。虽然本领域技术人员可以确定每种情况下所需要的剂量，但是为了达到治疗益处，治疗剂的合适剂量可为例如约1微克(μg)-约100毫克(mg)/kg接受者体重/天，优选约10μg-约50mg/kg体重/天，最优选约10μg-约50mg/kg体重/天。可在一天内以适当的间隔按一剂或两剂或更多剂分剂量给予所需剂量。可以单位剂型给予这些分剂量，例如每单位剂型含有约10μg-约1000mg、优选约50μg-约500mg、最优选约50μg-约250mg的活性成分。或者，如果接受者的情况非常需要，则可以连续输注给予剂量。
给药方式和剂型必然会影响肽活性治疗剂的特定治疗应用需要的有效治疗量。例如，口服给予的剂量可以是用于胃肠外给药方法所用剂量水平的至少2倍，例如2-10倍。
可以给予本发明的治疗剂本身和本发明的治疗剂的各种形式，包括其药学上可接受的酯、盐和其它生理功能衍生物。本发明还包括兽用和人用医学用途的包含本发明的治疗剂的药物制剂。在这类制药学和药物学制剂中，治疗剂可与一种或多种药学上可接受的载体联用，因此任选任何其它的治疗成分。从与制剂的其它成分相容且对其接受者无不当害处的意义来说，载体必需是药学上可接受的。以达到如上所述的需要药理效果的有效量和适于达到需要日剂量的数量提供本发明治疗剂。
治疗剂的剂型包括适于胃肠外以及非胃肠外给药的剂型，具体的给药方式包括口服、直肠、口腔、局部、经鼻、经眼、皮下、肌内、静脉内、经皮、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴、阴道和子宫内给药。优选适于口服和胃肠外给药的剂型。
当治疗剂以包含液体溶液的制剂使用时，所述制剂可有利地口服或胃肠外给予。当治疗剂以液体混悬剂或作为生物相容性载体制剂中的散剂应用时，制剂可利于口服、经直肠或支气管给予。
当治疗剂以粉状固体剂的形式直接使用时，活性剂可利于口服给药。或者，可通过雾化所述粉末在气体载体中形成粉末的气体分散体，其由患者从包括合适雾化装置的呼吸回路吸入而经支气管给药。
包含本发明的治疗剂的制剂可方便地以单位剂型提供，并可通过制药领域众所周知的任何方法制备。这类方法一般包括将治疗剂与构成一种或多种助剂成分的载体混合的步骤。通常将治疗剂与液体载体、微细固体载体或两者充分均匀混合来制备制剂，然后，必要时将产物制成所需制剂的剂型。
适于口服给药的制剂可以独立单位提供，例如胶囊剂、扁囊剂、片剂或糖锭剂，各自含有呈粉末或颗粒的预定量的活性成分；或水性溶液或非水性液体中的混悬剂，例如糖浆剂、酏剂、乳剂或饮剂。
可任选与一种或多种助剂成分通过压制或模制来制备片剂。可以在合适的机器中，压制任选与粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或拔染剂(discharging agent)混合的自由流动形式(例如粉末或颗粒)的治疗剂来制备压制片。可以在合适的机器中模制，来制备包含粉状肽活性治疗剂-ELP构建体与合适载体的混合物的模制片。
可以将肽活性治疗剂-ELP构建体加入浓的糖(例如蔗糖)水溶液中，同时向其中加入任何助剂成分来制备糖浆剂。这类助剂成分可包括矫味剂、合适的防腐剂、延迟糖结晶的成分和增加任何其它成分的溶解度的成分，例如多羟基醇，例如甘油或山梨醇。
适于胃肠外给药的制剂适宜包含治疗剂的无菌含水制剂，其优选与接受者的血液等渗(例如生理盐溶液)。这类制剂可包括悬浮剂和增稠剂或被设计成将肽活性治疗剂靶向血液成分或一个或多个器官的其它微粒系统。制剂可以单位剂量或多剂量形式提供。
鼻用喷雾剂包含治疗剂的纯水溶液与防腐剂和等渗剂。优选调节这类制剂至与鼻黏膜相容的pH和等渗状态。
直肠给药的制剂可以具有合适载体的栓剂提供，例如可可脂、氢化脂或氢化脂肪羧酸。
局部制剂包含溶于或悬浮于一种或多种介质(例如矿物油、石油、多羟基醇)或用于局部药物制剂的其它基料中的治疗剂。
除了前述成分以外，本发明的制剂还可包括选自以下的一种或多种助剂成分：稀释剂、缓冲剂、矫味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。
下列非限制性实施例更全面提供了的本发明的特征和优势。
实施例
实施例1：各种ELP成分构建体的构建
克隆步骤在大肠杆菌菌株XL1-Blue(rec A1、endA1、gyrA96、thi-1、hsdR17(rk -、mk+)、supE44、reIA1、lac[F’、proAB、/αcIqZΔM15、Tn10(Tetr)](Stratagene La Jolla，CA)中进行。pUC19(NEB，Beverly，MA)用作构建ELP的克隆载体(Meyer和Chilkoti，Nat.Biotechnol.，17(11)：1112-5，1999)。pET15b和pET24d载体的修饰形式(Novagen)用于在下列菌株中表达ELP和ELP-融合蛋白：BL21 Star(DE3)菌株(F-、ompT、hsdSB(rB -mB -)、gal、dcm、rne131、(DE3))(Invitrogen Carlsbed，CA)或BLR(DE3)(F-、ompT、hsdSB(rB -mB -)、gal、dcm、Δ(srl-recA)306::Tn10(TcR)(DE3))(Novagen Madison，WI)。合成的DNA寡核苷酸(DNA oligos)购自Integrated DNA Technologies，Coralville，IA。所有载体构建体应用标准分子生物方案制备(例如Current Protocols in Molecular Biology，主编Ausubel等，1995)。
ELP1[V 5 A 2 G 3 ]基因系列的构建
ELP1[V5A2G3]系列表示含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的多个重复单元的多肽，其中X为缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸，相对比为5∶2∶3。
通过使4种5′磷酸化、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有EcoRI和HindIII匹配末端的双链DNA，以产生ELP1[V5A2G3]系列单体ELP1[V5A2G3-10](Meyer和Chilkoti，Nat.Biotechnol.，17(11)：1112-5，1999)。在加热器中，将所述寡核苷酸在1μM 4种寡核苷酸混合物的50μl IX连接酶缓冲液(Invitrogen)中退火至95℃，然后使加热器慢慢冷却至室温。将ELP1[V5A2G3-10]/EcoRI-HindIII DNA区段连接入用EcoRI和HindIII消化的pUC19载体，经CIAP去磷酸化(Invitrogen)形成pUC19-ELP1[V5A2G3-10]。ELP1[V5A2G3]系列文库的构建始于将得自pUC19-ELP1[V5A2G3-10]的ELP1[V5A2G3-10]PflMI/BgII片段插入用PflMI线性化的pUC19-ELP1[V5A2G3-10]中，并用CIAP脱去磷酸以制备pUC19-ELP1[V5A2G3-20]。然后分别将ELP1[V5A2G3-10]或ELP1[V5A2G3-20]PflMI/BgII片段连接入PflMI消化的pUC 19-ELP1[V5A2G3-20]，将pUC19-ELP1[V5A2G3-20]构建成pUC19-ELP1[V5A2G3-30]和pUC19-ELP1[V5A2G3-40]。使用该方法扩增ELP1[V5A2G3]系列以制备pUC19-ELP1[V5A2G3-60]、pUC19-ELP1[V5A2G3-90]和pUC19-ELP1[V5A2G3-180]基因。
ELP1[K 1 V 2 F 1 ]基因系列的构建
ELP1[K1V2F1]系列表示含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的多个重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比为1∶2∶1。
通过将2种5′磷酸化、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有EcoRI和HindIII匹配末端的双链DNA，以产生ELP1[K1V2F1]系列单体ELP1[K1V2F1-4](Meyer和Chilkoti，1999)。在加热器中，将所述寡核苷酸在1μM4种寡核苷酸混合物的50μl 1X连接酶缓冲液(Invitrogen)中退火至95℃，然后使加热器慢慢冷却至室温。将ELP1[K1V2F1-4]/EcoRI-HindIII DNA区段连接入用EcoRI和HindIII消化的pUC19载体，经CIAP去磷酸化(Invitrogen)形成pUC19-ELP1[K1V2F1-4]。ELP1[K1V2F1]系列文库的构建始于将得自pUC19-ELP1[K1V2F1-4]的ELP1[K1V2F1-4]PflM1/BgI1片段插入用PflM1线性化的pUC19-ELP1[K1V2F1-4]，并用CIAP脱去磷酸以产生pUC19-ELP1[K1V2F1-8]。采用相同方法，在每次连接时使ELP1[K1V2F1]系列增倍以形成pUC19-ELP1[K1V2F1-16]、pUC19-ELP1[K1V2F1-32]、pUC19-ELP1[K1V2F1-64]和pUC19-ELP1[K1V2F1-128]。
ELP1[K 1 V 7 F 1 ]基因系列的构建
ELP1[K1V7F1]系列表示含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的多个重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比为1∶7∶1。
通过将4种5′磷酸化、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有PflMI和HindIII匹配末端的双链DNA，以产生ELP1[K1V7F1]系列单体ELP1[K1V7F1-9]。然后将ELP1[K1V7F1-9]DNA区段连接入PflM1/HindIII去磷酸化PUC19-ELP1[V5A2G3-180]载体，从而用ELP1[K1V7F1-9]取代ELP1[V5A2G3-180]以制备pUC19-ELP1[K1V7F1-9]单体。ELP1[K1V7F1]系列按与ELP1[K1V2F1]系列相同的方式扩展以产生pUC19-ELP1[K1V7F1-18]、PUC19-ELP1[K1V7F1-36]、pUC19-ELP1[K1V7F1-72]和pUC19-ELP1[K1V7F1-144]。
ELP1[V]基因系列的构建
ELP1[V]系列表示含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的多个重复单元的多肽，其中X全部为缬氨酸。
通过将2种5′磷酸化的、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有EcoRI和HindIII匹配末端的双链DNA，来产生ELP1[V]系列单体ELP1[V-5]。然后将ELP1[V-5]DNA区段连接入EcoRI/HindIII去磷酸化pUC19载体，以产生pUC19-ELP1[V-5]单体。按与ELP1[V5A2G3]系列相同的方式产生ELP1[V]系列，最终将pUC19-ELP1[V-5]扩展至pUC19-ELP1[V-60]和pUC19-ELP1[V-120]。
ELP2基因系列的构建
ELP2系列表示含有五肽AVGVP的多个重复单元的多肽。
通过将2种5′磷酸化的、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有EcoRI和HindIII匹配末端的双链DNA，以产生ELP2系列单体ELP2[5]。然后将ELP2[5]DNA区段连接入EcoRI/HindIII去磷酸化pUC19载体以产生pUC19-ELP2[5]单体。ELP2系列按与ELP1[K1V2F1]系列相同的方式扩展以产生pUC19-ELP2[10]、pUC19-ELP2[30]、pUC 19-ELP2[60]和pUC19-ELP2[120]。
ELP3[V]基因系列的构建
ELP3[V]系列表示含有五肽IPGXG(SEQ ID NO：5)的多个重复单元的多肽，其中X全部为缬氨酸。
通过将2种5′磷酸化的、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有PfLM1氨基端和GGC羧基端的匹配末端的双链DNA，由于缺乏合适的羧基端限制位点但仍能够无缝加入所述单体，产生ELP3[V]系列单体ELP3[V-5]。然后将ELP3[V-5]DNA区段连接入PflM1/BgII去磷酸化的pUC19-ELP4[V-5]，从而用ELP3[V-5]取代ELP4[V-5]产生pUC19-ELP3[V-5]单体。通过使退火的ELP3寡核苷酸连接入用PflMI消化的pUC19-ELP3[V-5]而使ELP3[V]系列扩展。每次连接扩展5个ELP3[V]系列，以产生ELP3[V-10]、ELP3[V-15]等。
ELP4[V]基因系列的构建
ELP4[V]系列表示含有五肽LPGXG(SEQ ID NO：7)的多个重复单元的多肽，其中X全部为缬氨酸。
通过将2种5′磷酸化的、PAGE纯化的合成寡核苷酸退火形成具有EcoRI和HindIII匹配末端的双链DNA，以产生ELP4[V]系列单体ELP4[V-5]。然后将ELP4[V-5]DNA区段连接入EcoRI/HindIII去磷酸化pUC19载体产生pUC19-ELP4[V-5]单体。ELP4[V]系列按与ELP1[K1V2F1]系列相同的方式扩展以产生pUC19-ELP4[V-10]、pUC19-ELP4[V-30]、pUC19-ELP4[V-60]和pUC19-ELP4[V-120]。
还将ELP基因插入其它载体，例如pET15b-SD0、pET15b-SD3、pET15b-SD5、pET15b-SD6和pET24d-SD21。pET载体系列可获自Novagen，San Diego，CA。
使用含有多克隆限制位点(SacI-NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI)的SD0双链DNA区段修饰pET15b载体形成pET15b-SD0载体。SD0双链DNA区段具有XbaI和BamHI匹配末端，将其连接入XbaI/BamHI线性化、5′-去磷酸化pET15b形成pet15b-SD0载体。
使用含有SfiI限制位点上游的铰链区-凝血酶切割位点接着是多克隆位点(NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI)的SD3双链DNA区段修饰pET15b-SD0载体，形成pET15b-SD3载体。SD3双链DNA区段具有SacI和NdeI匹配末端，将其连接入SacI/NdeI线性化和5′-去磷酸化pET15b-SD0，形成pET15b-SD3载体。
使用含有SfiI限制位点上游的凝血酶切割位点接着铰链区和多克隆位点(NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI)的SD5双链DNA区段修饰pET15b-SD3载体，形成pET15b-SD5载体。SD5双链DNA区段具有SfiI和NdeI匹配末端，将其连接入SfiI/NdeI线性化和5′-去磷酸化pET15b-SD3，形成pET15b-SD5载体。
使用含有SfiI限制位点上游的接头区-TEV切割位点接着多克隆位点(NdeI-NcoI-XhoI-SnaBI-BamHI)的SD6双链DNA区段修饰pET15b-SD3载体，形成pET15b-SD6载体。SD6双链DNA区段具有SfiI和NheI匹配末端，将其连接入SfiI/NdeI线性化和5′-去磷酸化pET15b-SD3，形成pET15b-SD6载体。
使用具有NcoI和NheI匹配末端的SD21双链DNA区段修饰pET24d载体，形成pET24d-SD21载体。将SD21双链DNA区段连接入NcoI/NheI线性化和5′脱去磷酸pET24d，产生pET24d-SD21载体，其含有新的多克隆位点NcoI-SfiI-NheI-BamHI-EcoRI-SacI-SAlI-HindIII-NotI-XhoI，紧接SfiI位点后有两个终止密码子用于具有最小数目的额外氨基酸的ELP插入和表达。
在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[V5A2G3-60]、pUC19-ELP1[V5A2G3-90]和pUC19-ELP1[V5A2G3-180]质粒用PflMI和BgII消化，将含有ELP的片段连接入如上所述的pET15b-SD3表达载体的SfiI位点，分别产生pET15b-SD3-ELP1[V5A2G3-60]、pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-90]和pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-180]。
在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[V5A2G3-90]、pUC19-ELP1[V5A2G3-180]、pUC19-ELP1[V-60]和pUC19-ELP1[V-120]质粒用PflMI和BgII消化，将含有ELP的片段连接入如上所述的pET15b-SD5表达载体的SfiI位点，分别产生pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-90]、pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-180]、pET15b-SD5-ELP1[V-60]和pET15b-SD5-ELP1[V-120]。
在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[V5A2G3-90]质粒用PflMI和BgII消化，将含有ELP的片段连接入所上所述的pET15b-SD6表达载体的SfiI位点，产生pET15b-SD6-ELP1[V5A2G3-90]。
在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[K1V2F1-64]和pUC19-ELP1[K1V2F1-128]质粒用PflMI和BgII消化，将含有ELP的片段连接入如上所述的pET24d-SD21表达载体的SfiI位点，分别产生pET24d-SD21-ELP1[K1V2F1-64]和pET24d-SD21-ELP1[K1V2F1-128]。
在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[K1V7F1-72]和pUC19-ELP1[K1V7F1-144]质粒用PflMI和BgII消化，将含有ELP的片段连接入如上所述的pET24d-SD21表达载体的SfiI位点，分别产生pET24d-SD21-ELP1[K1V7F1-72]、pET24d-SD21-ELP1[K1V7F1-144]。
在XL1-B1ue中产生的pUC19-ELP2[60]和pUC19-ELP2[120]质粒用NcoI和HindIII消化，将含有ELP的片段连接入如上所述的pET24d-SD21表达载体的NcoI和HindIII位点，分别产生pET24d-SD21-ELP2[60]、pET24d-SD21-ELP2[120]。
在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP4[V-60]和pUC19-ELP4[V-120]质粒用NcoI和HindIII消化，将含有ELP的片段连接入如上所述的pET24d-SD21表达载体的NcoI和HindIII位点，分别产生pET24d-SD21-ELP4[V-60]、pET24d-SD21-ELP4[V-120]。
实施例2：含有胰岛素A肽(InsA)的融合蛋白的分离和纯化
ELP-InsA融合蛋白包括：
胰岛素A肽和ELP1[V-60]多肽，其间具有肠激酶蛋白酶切割位点。
胰岛素A肽和ELP1[V5A2G3-90]多肽，其间具有肠激酶蛋白酶切割位点。
胰岛素A肽和ELP1[V-120]多肽，其间具有肠激酶蛋白酶切割位点。
胰岛素A肽和ELP1[V5A2G3-180]多肽，其间具有肠激酶蛋白酶切割位点。
将含有相应ELP-InsA融合蛋白的大肠杆菌菌株BLR(DE3)(Novagen)的单一菌落接种至5ml补充了100μg/ml氨苄西林(Sigma)的CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，以250rpm搅拌的同时于37℃生长5小时。然后将5m1培养物接种到500m1培养基中，使之于25℃生长16小时后，用1mM IPTG于25℃诱导4小时。收获培养物，并悬浮于40ml 20mMTris-HCl pH 7.4、50mM NaCl、1mM DTT和1粒无蛋白酶抑制剂的Complete EDTA(Roche，Indianapolis，IN)中。在冰上用超声破碎3分钟将细胞裂解，包括以35％功率超声脉冲10秒钟，然后间隔30秒使之冷却。以20,000g、4℃离心30分钟除去细胞碎片。
于室温将NaCl加入细胞裂解物中，达到其中1.0M的终浓度来诱导逆相变，接着于室温以20,000g离心15分钟。所得沉淀包含相应ELP-InsA融合蛋白和非特异性NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重新悬浮于40m1冰冷的m120mM Tris-HCl pH 7.4、50mMNaCl、1mM DTT中，以20,000g、4℃再次离心15分钟，除去非特异性NaCl沉淀的蛋白质。逆转变循环再重复两次以提高相应ELP-InsA融合蛋白的纯度，并将最终体积减至0.5ml。
实施例3：ELP1的半寿期
静脉内给予腿/胁带有FaDu异种移植物的裸小鼠(Balb/c nu/nu)[14C]ELP1，在给药后，以不同的时间间隔采集血样，测定ELP1的药代动力学特征。血液药代动力学特征显示许多大分子的特征性分布和清除反应，通过双指数方法进行全面描述。
将血浆浓度时程曲线拟合至二室模型的解析解法以接近清除和分布反应。某些药代动力学参数见下表1。ELP的分布容积(1.338μ1)几乎与假定的血浆容积1.363μl相等(Barbee，R.W.等，Am.J.Physio.263(3)(1992)R728-R733)，这就表明ELP在给药后并不立即快速分布或直接结合特定的器官和组织。AUC是中央室或血浆中ELP的累积暴露量。机体清除率定义为机体的ELP排出与其血浆浓度的比率，是所有器官(包括肾、肝和其它器官)清除率的总和。
表1：[14C]ELP1的药代动力学参数计算值
Figure BPA00001327658001951
传质速率常数得自标准二室模型(k1；从中央室到外周室；k2，从外周室到中央室；ke，自中央室排除)。显示了分布容积(Vd)、中央室浓度时程曲线下面积(AUC)和机体清除率(ClB)。数据用平均值表示(n＝5，只是从n＝3的类似组计算得到Vd和起始血浆浓度(Co))。
实施例4.裸小鼠中ELP的生物分布
14 C标记的ELP1-150和/或 14 C标记的ELP2-160
给予有FaDu肿瘤的裸小鼠14C标记的ELP1-150和/或14C标记的ELP2-160(平均值+/-SD，n＝6)。在给予ELP后将肿瘤于41.5℃水浴中加热。分布最高的是具有最高血液含量的器官：肝、肾、脾和肺。
14 C标记的ELP2-[V 1 A 8 G 7 -160]
给予裸小鼠14C标记的ELP2-[V1A8G7-160](Tt＞60℃)以达15μM的血浆浓度。将位于裸小鼠右后腿的植入FaDu肿瘤加热(41℃)1小时后测定ELP浓度。数据用平均值加95％置信区间表示。N＝6。
在全身给予14C标记的ELP2-[V1A8G7-160]后1.5小时测定ELP浓度。在具有最高血液含量的器官观察到最高分布：肝、肾、脾和肺。
实施例5：毒蜥外泌肽-4 ELP融合物
使用对于大肠杆菌表达最优化的密码子，从氨基酸序列反向翻译毒蜥外泌肽-4(Ex-4)的DNA序列(SEQ ID NO：14)。编码毒蜥外泌肽-4的DNA序列通过与具有与质粒pET24d-ELP1-90中的限制位点NdeI和XhoI相容的5’和3′突出端的合成寡核苷酸一起退火构建(图1)。该质粒用限制酶NdeI和XhoI消化，将退火的DNA序列连接入切割载体。通过限制酶切消化和DNA测序来证实插入。所得质粒称为pET24d-Ex-4ELP1-90(图2A)，所得毒蜥外泌肽-4-ELP融合物的序列见图2B。还标明了用于融合物构建的引物。
使用pET24d-Ex-4ELP 1-90转化大肠杆菌菌株BRL(Invitrogen)，将选出的转化株在摇瓶内的培养基3(1.2％胰胨/蛋白胨(Tryptone Peptone)、2.4％酵母提取物、5g/L酪蛋白氨基酸、2％甘油、2.313g磷酸氢二钾/L、12.541g磷酸二氢钾/L)中生长。将1OD细胞接种至1L培养基3中，使之在未加入诱导物时于37℃继续生长17小时，通过自体诱导继续生产。收集细胞沉淀回收产物，超声处理破坏细胞，通过由ELP部分调节的热和/或盐诱导的转变来回收(Improved Non-chromatographic Purification of a Recombinant Protein by Cationic Elastin-like Polypeptides(通过阳离子弹性蛋白样多肽改 进非层析纯化的重组蛋白质)，Dong Woo Lim，Kimberly Trabbic-Carlson，J.Andrew MacKay和Ashutosh Chilkoti.Biomacromolecules 2007，8，1417-1424)。
该实施例用命名为1-90的ELP。其基础是VPGXG(SEQ ID NO：3)基序，其中在10个单元重复中，X为比率为5∶3∶2的V、G或A，重复8次加上其中X为V、G、A和W，比率4∶3∶2∶1的最终(C端)的10单元重复。
[(VPGXG)10]9，其中重复单元10次连接重复的X残基(下标数字)可表示为[(V1，4，5，6，10G2，7，9A3，8)8(V1，4，5，6G2，7，9A3，8W10)]。
ELP可以是其中X为脯氨酸以外的任何20个天然氨基酸的VPGXG(SEQ ID NO：3)单元的任何组合，可以是任何长度的重复单元的任何组合。此外，对于被工程改造以接受在特定密码子中掺入经工程改造的tRNA的宿主菌株，氨基酸可以是非天然氨基酸(Wang L，Brock A，Herberich B，Schultz PG.Expanding the genetic code of Escherichia coli(大肠杆菌遗传密 码的扩展).[2001]Science 292，498-500)。
该构建体在具有N端甲硫氨酸的细胞溶胶中产生，所述N端甲硫氨酸通常被甲硫氨酸氨基肽酶除去。然而，无法确保完全准确地加工甲硫氨酸；该酶还可除去毒蜥外泌肽-4部分的N端组氨酸。这可能产生未加工的、加工的和非正确加工的产物的混合物。因此，研发出另外的构建体以产生具有正确加工的N端产物。
设计出在N端甲硫氨酸与毒蜥外泌肽-4的N端组氨酸之间加入Tev蛋白酶(烟草蚀斑病毒半胱氨酸蛋白酶)切割位点的引物。这可供除去甲硫氨酸和Tev识别序列，以便得到毒蜥外泌肽-4的成熟N端(组氨酸)。这可在后制备期进行，或者Tev蛋白酶可以在制备期间共表达以切割例如作为内含肽的识别序列(Ge，X.，Yang，D.S.C.，Trabbic-Carlson，K.，Kim，B.，Chilkoti，A.和Filipe，C.D.M.Self-Cleavable Stimulus Responsive Tags for Protein Purification without Chromatography(非层析法的蛋白质纯化自体切割刺激 物反应标签).J.Am.Chem.Soc.127，11228-11229，2005)。Tev毒蜥外泌肽-4序列见图3A。图3B图示额外加入的标为“接头Tev”的序列，提供更好的Tev蛋白酶靶标。
获得Ex-4正确加工的N端的一个替代途径是使用将产物引导至周质的前导序列或信号序列，其在加工中被信号肽酶切割。在这种情况下，提供将转录物引导至信号识别颗粒的信号序列DsbA，用于多肽直接分泌至周质(参见图4A)。质粒pET24d-DsbA-Ex-4ELP1-90见图4B。
虽然该实施例说明了具有毒蜥外泌肽-4序列的治疗剂的制备，但是这类序列可用GLP-1、胰岛素、因子VII/VIIa或表1所列的其它治疗性蛋白质替换，按与毒蜥外泌肽-4所述方式完全一样或类似的方式制备。
实施例6：GLP1-ELP融合蛋白
ELP质粒构建体用于制备两种GLP1-ELP融合蛋白，GLP1(A8G，7-37)ELP1-90和GLP1(A8G，7-37)ELP1-120。质粒构建体、编码融合物的核苷酸序列以及所得融合蛋白的氨基酸序列见图5和图6。
两个构建体均含有N端Tev蛋白酶位点以供加工其中GLP1的His7位于N端的成熟形式。加工的融合蛋白的分子量计算值分别为约39，536和约50，828。
实施例7：FVII ELP融合蛋白
凝血因子VII(FVII)基因从cDNA克隆(Oragene)通过PCR修饰，在5’和3’端加入用于克隆至含有ELP的载体的限制位点。在5’端加入NheI位点，在3’端加入NotI位点。因子VII基因的DNA和氨基酸序列见随附的序列表，分别为SEQ ID NO：34和33。用于PCR扩增因子VII(FVII)基因的5’和3’引物的DNA序列为：
P13：CTAGCTAGCATGGTCTCCCAGGCCCTC(SEQ ID NO：49)
P14：TATTCTTGCGGCCGCGGGAAATGGGGCTCGCAG(SEQ ID NO：50)
所得PCR片段用限制酶NheI和NotI消化，将其连接入之前已用限制酶NheI和NotI消化的质粒pcDNA3.1+ELP1-90(图7A)。
将所得质粒pcDNA3.1+FVII-ELP1-90瞬时转染至HEK293细胞，收获培养基。ELP融合物通过相变纯化(图9和图10)。
因子VII-ELP融合物的核苷酸和氨基酸序列见图7B。正如所显示的一样，因子VII-ELP融合蛋白在因子VII成分和ELP成分之间含有Tev蛋白酶接头。这个接头是任选的。
实施例8：胰岛素ELP融合蛋白
在5’和3’端对人胰岛素基因的cDNA进行修饰以插入pET24d-ELP1-90。5’引物加入用于细菌表达的N端甲硫氨酸和NdeI限制酶位点。3’引物加入XhoI限制酶位点。PCR产物和质粒两者都用限制酶NdeI和XhoI消化并连接在一起。与ELP1融合的胰岛素B链、C链和A链的序列见图8A。
正确的插入通过限制酶切消化和DNA测序来确定。所得质粒命名为pET24d胰岛素-ELP1-90，见图8B。
通过用胰蛋白酶和羧肽酶B处理除去C肽链，从大肠杆菌中回收后，得到天然胰岛素形式。
对于B链N端的正确加工，可进行类似于制备毒蜥外泌肽-4融合物的修饰(蛋白酶切割位点、信号序列)(参见实施例4)。或者，前两个残基可以是Met-Arg，其也可在产生最终产物时通过胰蛋白酶消化除去(R.M.Belagaje，S.G.Reams，S.C.Ly and W.F.Prouty，Increased production of low molecular weight recombinant proteins in Escherichia coli(提高大肠杆菌中低 分子量重组蛋白的产生).Protein Sci.6，1953-1962，1997)。
其它构建体可将胰岛素cDNA置于属于C端融合物的ELP的3’端、在胰岛素和ELP序列之间加入接头、和/或使用无C肽的胰岛素修饰形式(所述单链胰岛素)，避免了额外加工的需要。
实施例9：用于缀合的ELP基因的合成
采用标准分子生物学方案，用化学合成的寡核苷酸构建了编码50个氨基酸序列的基因。50个氨基酸序列含有五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的10次重复，其中选择客体残基(V、G和A，摩尔比率5∶3∶2)以提供40℃的Tt。通过标准分子生物学技术使基因首尾相接寡聚化，产生寡聚ELP基因。或者构建含有10次重复的五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)多肽的1个50个氨基酸的序列，其中客体残基为V、G、A和C，摩尔比率4∶3∶2∶1。该序列可在寡聚过程的任何循环中加入，以将单一半胱氨酸残基在沿构建体区段的选定位点上引入最终构建体中。
在此给出的实施例使用命名为1-90的ELP。这以其中X为V、G或A，比率5∶3∶2，10个单元重复的VPGXG(SEQ ID NO：3)基序为基础，重复8次加上其中X为V、G、A和C，比率4∶3∶2∶1的最终(C端)的10单元重复，即[(VPGXG)10]9(SEQ ID NO：3)。
或者，残基可以是精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸之一。这些氨基酸的目的是提供用于例如胰岛素的化学缀合的反应性侧链。在这种具体情况下，使用ELP可延长治疗性蛋白质(例如胰岛素)的循环半寿期，以提供延长的基础葡萄糖控制。与于体温转变的ELP缀合的胰岛素可按类似于
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(Sanofi Aventis)的方式在注射部位形成沉积贮库，但却不需要在酸性(pH 4.0)条件下使用间甲酚以使注射的耐受性更好。
实施例10：因子VII-ELP的功效和半寿期
图11图示因子VIIa-ELP1-90活化的因子X，因子VIIa活化用作对照。因子VII-ELP在HEK细胞中产生。因子VIIa从人血浆中获得。正如所显示的一样，因子VIIa-ELP保持了完整活性。
当通过静脉内给予大鼠时，因子VII-ELP显示约690分钟的半寿期。相比之下，因子VII显示45-60分钟的半寿期。通过因子VII的夹心ELISA测定该实施例中的半寿期(图12)。
同样相比之下，已报导的NovoSevenTM的半寿期为45分钟，已报导的因子VIIa-白蛋白融合物的半寿期为263分钟，已报导的因子VIIa-PEG的半寿期在小鼠中为300分钟，在狗中为600分钟。
实施例11：GLP-1(或毒蜥外泌肽-4)体外生物测定法
GLP-1受体(GLP1R)的活化导致细胞内cAMP第二信使的产生。因此，可通过GLP-1或毒蜥外泌肽-4类似物和相应的治疗剂激活细胞表面上的GLP1R和产生cAMP的能力来进行测试。
对于该生物测定法，使用用编码GLP1R的cDNA转染的CHO细胞。这些细胞响应GLP-1的刺激，并产生高水平的cAMP。接种对数期生长的细胞，将递增浓度的受试化合物(例如本发明的治疗剂或GLP-1或毒蜥外泌肽-4功能类似物)加入细胞中。在生理缓冲液中于37℃的适当温育期后(通常15-60分钟)，采用得自Molecular Devices(Sunnyvale，CA)的CatchPointcAMP测定盒，测定所产生的cAMP。与GLP-1肽或毒蜥外泌肽-4肽相比(或与本发明治疗剂的未融合或未缀合对应物相比)，各受试化合物的EC50表示由引入肽的特殊修饰引起的活性变化，或由与ELP成分的特定化学的或重组偶联所引起的活性变化。
如图13所示，与只有毒蜥外泌肽相比，GLP1-ELP(PB0868)和毒蜥外泌肽-4-ELP(PB 0859)两者都保持体外高度活性。要注意的是，
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和
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的比活比毒蜥外泌肽的低50-100倍。
实施例12：GLP-1(或毒蜥外泌肽-4)体内生物测定法
可在动物中测定GLP-1或毒蜥外泌肽类似物或相应治疗剂的活性。对于本测定法，可以使用正常动物或糖尿病动物。给血液葡萄糖浓度为300-500mg/dl的糖尿病动物注射不同剂量的GLP-1或毒蜥外泌肽类似物或相应的治疗剂，用血糖计监测血液葡萄糖的变化。将给药后不同时间点葡萄糖的降低与用标准量的GLP-1或毒蜥外泌肽-4肽所得结果相比较，或与本发明治疗剂的未融合或未缀合对应物相比较。或者，将在给予外源葡萄糖后特定时期内正常动物或糖尿病动物的血液葡萄糖波动与GLP-1或毒蜥外泌肽-4(或与治疗剂的未融合或未缀合对应物)的波动情况相比较。这样，可将类似物和融合蛋白的活性与天然肽的活性进行比较。
图14图示静脉内和皮下给予大鼠GLP1-ELP1-120的药代动力学特征。每个时间点使用3只大鼠。剂量约为10mg/kg。当静脉内给药时，T1/2约为12.9小时。当皮下给药时，T1/2约为8.6小时。
图15图示静脉内和皮下给予兔GLP1-ELP1-120的药代动力学特征。每个时间点使用3只兔。剂量约为1mg/kg。当静脉内给药时，T1/2约为20小时。当皮下给药时，T1/2约为24小时。
图16图示用GLP1-ELP1-90的糖尿病小鼠中的持续血糖控制。
本文引用的全部参考文献都通过引用其整体结合到本文中。虽然本文就本发明的具体方面、特征和示例性实施方案对本发明进行了描述，但应当了解的是，本发明的应用并不因此受到限制，相反延伸并包括各种其它的变化、修改和替代性实施方案，正如本发明领域普通技术人员根据本文的公开内容所理解的一样。
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Claims (100)

1.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和治疗成分，当与单独的所述治疗成分相比时，所述治疗成分具有延长的循环半寿期和/或较低的治疗有效量。
2.权利要求1的治疗剂，其中所述治疗成分是表1所列的治疗性蛋白质或其功能部分或功能类似物。
3.权利要求2的治疗剂，其中ELP成分在其N端和/或C端共价结合所述治疗性蛋白质。
4.权利要求1-3中任一项的治疗剂，其中一个治疗成分在所述ELP成分的N端与ELP成分共价结合，而第二治疗成分在所述ELP成分的C端与ELP成分共价结合。
5.权利要求1-4中任一项的治疗剂，其中治疗成分在其N端和/或C端共价结合所述ELP成分。
6.权利要求1-5中任一项的治疗剂，其中第一ELP成分在所述治疗成分的N端与治疗成分共价结合，而第二ELP成分在所述治疗成分的C端与治疗成分共价结合。
7.权利要求1-6中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和治疗成分之间的间隔基部分。
8.权利要求7的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非肽化学部分和蛋白酶切割位点。
9.权利要求8的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子Xa切割位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点和组织蛋白酶切割位点。
10.权利要求9的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO：22)的不可切割部分，其中n为1-4；且m为1-4。
11.权利要求1-10中任一项的治疗剂，其中所述ELP包含至少一个选自SEQ ID NO：1-12的重复单元。
12.权利要求11的治疗剂，其中所述重复单元是VPGXG(SEQID NO：3)。
13.权利要求12的治疗剂，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少两个单元中不同。
14.权利要求13的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
15.权利要求1-14中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约50kDa。
16.权利要求1-15中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37℃。
17.权利要求1-16中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
18.一种多核苷酸，其包含编码权利要求17的治疗剂的核苷酸序列。
19.权利要求18的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
20.权利要求19的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
21.一种载体，其包含权利要求18-20中任一项的多核苷酸。
22.一种分离的宿主细胞，其含有权利要求21的载体或权利要求18-20中任一项的多核苷酸。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项的治疗剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
24.一种治疗或预防患者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-17中任一项的治疗剂或权利要求23的药物组合物给予需要它的患者。
25.权利要求24的方法，其中所述患者患有表1所列的适应症。
26.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和胰高血糖素样肽(GLP)-1受体激动剂。
27.权利要求26的治疗剂，其中所述GLP-1受体激动剂是GLP-1或其功能类似物。
28.权利要求26的治疗剂，其中所述GLP-1受体激动剂是毒蜥外泌肽-4或其功能类似物。
29.权利要求26-28中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分在其N端和/或C端共价结合所述GLP-1受体激动剂。
30.权利要求26-29中任一项的治疗剂，其中第一GLP-1受体激动剂在所述ELP成分的N端与ELP成分共价结合，而第二GLP-1受体激动剂在所述ELP成分的C端与ELP成分共价结合。
31.权利要求26-30中任一项的治疗剂，其中所述GLP-1受体激动剂在其N端和/或C端共价结合所述ELP成分。
32.权利要求26-31中任一项的治疗剂，其中第一ELP成分在所述GLP-1受体激动剂的N端与GLP-1受体激动剂共价结合，而第二ELP成分在所述GLP-1受体激动剂的C端与GLP-1受体激动剂共价结合。
33.权利要求26-32中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和GLP-受体激动剂之间的间隔基部分。
34.权利要求33的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非肽化学部分和蛋白酶切割位点。
35.权利要求34的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子Xa切割位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点和组织蛋白酶切割位点。
36.权利要求34的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO：22)的不可切割部分，其中n为1-4；且m为1-4。
37.权利要求26-36中任一项的治疗剂，其中所述ELP包含至少一个选自SEQ ID NO：1-12的重复单元。
38.权利要求37的治疗剂，其中所述重复单元是VPGXG(SEQID NO：3)。
39.权利要求38的治疗剂，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少两个单元中不同。
40.权利要求38的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
41.权利要求26-40中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约50kDa。
42.权利要求26-40中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37℃。
43.权利要求26-42中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
44.一种多核苷酸，其包含编码权利要求43的治疗剂的核苷酸序列。
45.权利要求44的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
46.权利要求45的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
47.一种载体，其包含权利要求44-46中任一项的多核苷酸。
48.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求47的载体或权利要求44-46中任一项的多核苷酸。
49.一种药物组合物，其包含权利要求26-43中任一项的治疗剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
50.一种治疗或预防患者的生物学病症、障碍或疾病的方法，所述方法包括将有效量的权利要求26-43中任一项的治疗剂或权利要求49的药物组合物给予需要它的患者。
51.权利要求50的方法，其中所述患者患有糖尿病。
52.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和胰岛素或其功能类似物。
53.权利要求52的治疗剂，其中所述ELP成分在其N端和/或C端共价结合所述胰岛素或功能类似物。
54.权利要求52或53的治疗剂，其中第一胰岛素或功能类似物在所述ELP成分的N端与ELP成分共价结合，而第二胰岛素或功能类似物在所述ELP成分的C端与ELP成分共价结合。
55.权利要求52的治疗剂，其中所述胰岛素或功能类似物在其N端和/或C端共价结合所述ELP成分。
56.权利要求52或53的治疗剂，其中第一ELP成分在其N端共价结合所述胰岛素或功能类似物，而第二ELP成分在其C端共价结合所述胰岛素或功能类似物。
57.权利要求52-56中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和所述胰岛素或功能类似物之间的间隔基部分。
58.权利要求57的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非肽化学部分和蛋白酶切割位点。
59.权利要求58的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子Xa切割位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点或组织蛋白酶切割位点。
60.权利要求58的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO：22)的不可切割部分，其中n为1-4；且m为1-4。
61.权利要求52-60中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分包含至少一个选自SEQ ID NO：1-12的重复单元。
62.权利要求61的治疗剂，其中所述重复单元是VGPXG(SEQID NO：3)。
63.权利要求61的治疗剂，其中所述重复单元是Ile-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：5)或Leu-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：7)，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少两个单元中不同。
64.权利要求62或63的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
65.权利要求52-64中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约50kDa。
66.权利要求52-65中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37℃。
67.权利要求52-66中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
68.一种多核苷酸，其包含编码权利要求67的治疗剂的核苷酸序列。
69.权利要求68的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
70.权利要求69的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
71.一种载体，其包含权利要求68-70中任一项的多核苷酸。
72.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求71的载体或权利要求68-70中任一项的多核苷酸。
73.一种药物组合物，其包含权利要求52-67中任一项的治疗剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
74.一种预防或治疗患者的生物学病症、障碍或疾病的方法，所述方法包括将有效量的权利要求52-67中任一项的治疗剂或权利要求73的药物组合物给予需要它的患者。
75.权利要求74的方法，其中所述患者患有糖尿病。
76.一种治疗剂，其包含弹性蛋白样肽(ELP)成分和因子VII/VIIa或其功能类似物。
77.权利要求76的治疗剂，其中所述ELP成分与所述因子VII/VIIa或功能类似物在因子VII/VIIa的N端和/或C端共价结合。
78.权利要求76或77的治疗剂，其中第一因子VII/VIIa或功能类似物在所述ELP成分的N端与ELP共价结合，而第二因子VII/VIIa或功能类似物在所述ELP成分的C端与ELP成分共价结合。
79.权利要求76的治疗剂，其中所述因子VII/VIIa或功能类似物与所述ELP成分在ELP成分的N端和/或C端共价结合。
80.权利要求76或77的治疗剂，其中第一ELP成分在其N端共价结合所述因子VII/VIIa或功能类似物，而第二ELP成分在其C端共价结合所述因子VII/VIIa或功能类似物。
81.权利要求76-80中任一项的治疗剂，其还包含在所述ELP成分和因子VII/VIIa或功能类似物之间的间隔基部分。
82.权利要求81的治疗剂，其中所述间隔基部分包含一个或多个蛋白酶抗性部分、非肽化学部分和蛋白酶切割位点。
83.权利要求82的治疗剂，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点、因子Xa切割位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、Tev切割位点和组织蛋白酶切割位点。
84.权利要求82的治疗剂，其中所述间隔基部分包含具有式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO：22)的不可切割部分，其中n为1-4；且m为1-4。
85.权利要求76-84中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分包含至少一个选自SEQ ID NO：1-12的重复单元。
86.权利要求85的治疗剂，其中所述重复单元是VPGXG(SEQID NO：3)。
87.权利要求86的治疗剂，其中X为任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X在至少两个单元中不同。
88.权利要求86的治疗剂，其中每个X独立选自以下氨基酸残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
89.权利要求76-88中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂的分子量小于约70kDa。
90.权利要求76-89中任一项的治疗剂，其中所述ELP成分的Tt大于37℃。
91.权利要求76-90中任一项的治疗剂，其中所述治疗剂是遗传编码的融合蛋白。
92.一种多核苷酸，其包含编码权利要求91的治疗剂的核苷酸序列。
93.权利要求92的多核苷酸，其还包含与所述核苷酸序列有效连接的表达调控元件。
94.权利要求93的多核苷酸，其中所述表达调控元件包含启动子。
95.一种载体，其包含权利要求92-94中任一项的多核苷酸。
96.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求95的载体或权利要求92-95中任一项的多核苷酸。
97.一种药物组合物，其包含权利要求76-91中任一项的治疗剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
98.一种预防或治疗患者的生物学病症、障碍或疾病的方法，所述方法包括将有效量的权利要求76-91中任一项的治疗剂或权利要求97的药物组合物给予需要它的患者。
99.权利要求98的方法，其中所述患者患有出血症。
100.权利要求98或99的方法，其中所述患者患有血友病。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104023784A (zh) * 2011-08-24 2014-09-03 费斯生物制药公司 供持续释放的活性剂制剂
CN104080473A (zh) * 2011-11-28 2014-10-01 费斯生物制药公司 包含胰岛素氨基酸序列的治疗剂
CN104894196A (zh) * 2015-05-28 2015-09-09 中国药科大学 一种制备重组艾塞那肽或其衍生物的新方法
US9821036B2 (en) 2008-06-27 2017-11-21 Duke University Therapeutic agents comprising a GLP-2 peptide and elastin-like peptides
CN107778361A (zh) * 2016-08-30 2018-03-09 上海交通大学 多肽hl‑39及其制备与应用
CN109310641A (zh) * 2016-05-06 2019-02-05 费斯生物制药公司 用于受控和持续释放的elp融合蛋白
US10258700B2 (en) 2005-12-20 2019-04-16 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN110101868A (zh) * 2019-05-24 2019-08-09 北京大学 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用
CN117398525A (zh) * 2023-12-05 2024-01-16 北京大学人民医院 表达Exendin-4蛋白的间充质干细胞及其用途

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006275799B8 (en) * 2005-07-28 2011-07-14 Carbon Sink, Inc. Removal of carbon dioxide from air
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) * 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
WO2010043566A2 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem insulin und einem glp-1-agonisten
CN102348715B (zh) 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
PT2440228T (pt) 2009-06-08 2018-12-24 Amunix Operating Inc Polipéptidos de regulação da glicose e métodos de preparação e utilização dos mesmos
EP2464370B1 (en) * 2009-08-14 2017-03-29 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
ES2855146T3 (es) 2009-11-13 2021-09-23 Sanofi Aventis Deutschland Composición farmacéutica que comprende un agonista de GLP-1, una insulina y metionina
US9707176B2 (en) 2009-11-13 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist and methionine
WO2011123830A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
US9644197B2 (en) * 2010-06-04 2017-05-09 Sk Chemicals Co., Ltd. Fusion protein having factor VII activity
PT2611458T (pt) 2010-08-30 2016-12-16 Sanofi Aventis Deutschland Utilização de ave0010 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2
US9671410B2 (en) 2011-01-16 2017-06-06 The Procter & Gamble Company Biomarker-based methods for identifying and formulating compositions that improve skin quality and reduce the visible signs of aging in skin
CA2827170A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 David M. Hilbert Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
CA2873553C (en) 2011-06-06 2020-01-28 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
WO2013003449A2 (en) * 2011-06-27 2013-01-03 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment with glp-1 receptor agonists
PT2750699E (pt) 2011-08-29 2015-11-03 Sanofi Aventis Deutschland Acelerómetro pendular
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US9200305B2 (en) * 2011-12-20 2015-12-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Generation of engineered molecular weight standards
CA2875983A1 (en) * 2012-02-08 2013-08-15 Seneb Biosciences, Inc. Treatment of hypoglycemia
CN117462693A (zh) 2012-02-27 2024-01-30 阿穆尼克斯运营公司 Xten缀合组合物和制造其的方法
MX349035B (es) 2012-05-17 2017-07-07 Extend Biosciences Inc Portadores para el suministro mejorado de farmaco.
WO2013181471A2 (en) * 2012-05-30 2013-12-05 The University Of Utah Research Foundation Matrix metalloproteinase cleavable protein polymers for cancer gene therapy
WO2014028776A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Zyngenia, Inc. Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
WO2014081849A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Formulations of active agents for sustained release
ES2688367T3 (es) 2012-12-21 2018-11-02 Sanofi Derivados de exendina-4 como agonistas duales de GLP1/GIP o trigonales de GLP1/GIP/glucagón
EP2945643A4 (en) * 2013-01-15 2017-04-26 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic agents, compositions, and methods for glycemic control
US10364451B2 (en) 2013-05-30 2019-07-30 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US10392611B2 (en) 2013-05-30 2019-08-27 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
EP3785725A1 (en) * 2013-10-01 2021-03-03 University of Mississippi Medical Center Composition and method for therapeutic agent delivery during pregnancy
WO2015086733A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3080152A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
US20170189546A1 (en) * 2014-04-29 2017-07-06 University Of Mississippi Medical Center Ocular Compositions and Methods Thereof
TWI668010B (zh) * 2014-05-07 2019-08-11 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 使用ｇｌｐ－１及抗ｉｌ－２１治療糖尿病
ES2818824T3 (es) 2014-05-08 2021-04-14 Phasebio Pharmaceuticals Inc Composiciones que comprenden una proteína de fusión de VIP-ELP para su uso en el tratamiento de fibrosis quística
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
WO2016005903A2 (en) * 2014-07-08 2016-01-14 Theramyt Novobiologics Private Limited A process for obtaining exendin-4
US10232020B2 (en) 2014-09-24 2019-03-19 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin-insulin conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
US9585934B2 (en) 2014-10-22 2017-03-07 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin D conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
WO2016077325A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 The Procter & Gamble Company Personal care compositions with two benefit phases
US10966916B2 (en) 2014-11-10 2021-04-06 The Procter And Gamble Company Personal care compositions
MX2017006149A (es) 2014-11-10 2017-07-27 Procter & Gamble Composiciones para el cuidado personal con dos fases beneficas.
EP3217947B1 (en) * 2014-11-12 2022-03-09 University of Mississippi Medical Center Kidney-targeted drug delivery systems
WO2016081884A2 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Elp fusion proteins for controlled and sustained release
CN107206058A (zh) 2014-12-12 2017-09-26 赛诺菲-安万特德国有限公司 甘精胰岛素/利西拉来固定比率配制剂
CA2976038A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
US10385115B2 (en) 2015-03-26 2019-08-20 Duke University Fibronectin type III domain-based fusion proteins
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
MX2018001511A (es) 2015-08-04 2018-08-01 Univ Duke Polimeros furtivos desordenados de forma intrinseca codificados geneticamente para suministro y metodos para usar los mismos.
WO2017040344A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Amunix Operating Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
US11752213B2 (en) 2015-12-21 2023-09-12 Duke University Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity
DE102016103843A1 (de) 2016-03-03 2017-09-07 Biotronik Ag Reduktion von paravalvulärer Leckage durch kontrollierten Thrombusaufbau
EP3424948B1 (en) * 2016-04-07 2021-07-28 Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus Vascular endothelial growth factor targeting peptide-elastin fusion polypeptide and self-assembling nanostructure, which are for inhibiting angiogenesis
WO2017210476A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Duke University Nonfouling biosensors
WO2018045872A1 (zh) * 2016-09-06 2018-03-15 中国药科大学 一种多肽及其用途
CN109890833A (zh) 2016-09-14 2019-06-14 杜克大学 用于递送亲水性药物的基于三嵌段多肽的纳米粒子
WO2018053111A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 University Of Utah Research Foundation In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage
US11155584B2 (en) 2016-09-23 2021-10-26 Duke University Unstructured non-repetitive polypeptides having LCST behavior
CN106519040B (zh) * 2016-11-02 2020-03-27 南京大学 一种含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白和其制备方法及由该蛋白自组装的纳米粒
US11648200B2 (en) 2017-01-12 2023-05-16 Duke University Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly
US11554097B2 (en) 2017-05-15 2023-01-17 Duke University Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents
US10849914B2 (en) 2017-06-12 2020-12-01 University Of Utah Research Foundation Methods for producing chemoembolic agents for the delivery of anti-cancer agents
US11680083B2 (en) 2017-06-30 2023-06-20 Duke University Order and disorder as a design principle for stimuli-responsive biopolymer networks
US11173212B2 (en) 2017-09-28 2021-11-16 Indian Institute Of Science Education And Research Supramolecular protein assemblies with advanced functions and synthesis thereof
CN111225652A (zh) 2017-10-20 2020-06-02 宝洁公司 气溶胶泡沫洁肤剂
EP3697375B1 (en) 2017-10-20 2021-12-01 The Procter & Gamble Company Aerosol foam skin cleanser
WO2020028806A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Duke University Dual agonist fusion proteins
WO2020051541A1 (en) * 2018-09-07 2020-03-12 Duke University Nanoparticulate drug delivery systems
CN113015904A (zh) 2018-11-29 2021-06-22 宝洁公司 用于筛选个人护理产品的方法
US20200262887A1 (en) 2018-11-30 2020-08-20 Opko Ireland Global Holdings, Ltd. Oxyntomodulin peptide analog formulations
US11513254B2 (en) 2019-01-10 2022-11-29 Baker Hughes Oilfield Operations Llc Estimation of fracture properties based on borehole fluid data, acoustic shear wave imaging and well bore imaging
CN111939244A (zh) * 2019-05-14 2020-11-17 阿莫生命科学有限公司 用于预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物
US11512314B2 (en) 2019-07-12 2022-11-29 Duke University Amphiphilic polynucleotides
CN113735977A (zh) * 2020-05-28 2021-12-03 江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司 rhFGF21融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其组合物及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070009602A1 (en) * 2005-06-24 2007-01-11 Setton Lori A Direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers

Family Cites Families (181)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4187852A (en) 1976-07-09 1980-02-12 The University Of Alabama Synthetic elastomeric insoluble cross-linked polypentapeptide
US4132746A (en) 1976-07-09 1979-01-02 University Of Alabama, Birmingham Medical & Education Foundation Synthetic elastomeric insoluble cross-linked polypentapeptide
DE2923787A1 (de) * 1979-06-12 1980-12-18 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur selektiven bildung von disulfidbruecken in polypeptiden und die dabei erhaltenen produkte als wirkstoffe enthaltende arzneimittel
US4500700A (en) 1981-10-02 1985-02-19 The Board Of Trustees Of The University Of Alabama For The University Of Alabama In Birmingham Elastomeric composite material comprising a polypentapeptide having an amino acid of opposite chirality in position three
US4474851A (en) 1981-10-02 1984-10-02 The University Of Alabama In Birmingham Elastomeric composite material comprising a polypeptide
US4589882A (en) 1983-09-19 1986-05-20 Urry Dan W Enzymatically crosslinked bioelastomers
US4752638A (en) 1983-11-10 1988-06-21 Genetic Systems Corporation Synthesis and use of polymers containing integral binding-pair members
US4749647A (en) 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
US4605641A (en) 1984-10-09 1986-08-12 Hoffmann-La Roche Inc. Synthetic vasoactive intestinal peptide analogs
US4780409A (en) 1985-05-02 1988-10-25 Genetic Systems Corporation Thermally induced phase separation immunoassay
US4783523A (en) 1986-08-27 1988-11-08 Urry Dan W Temperature correlated force and structure development of elastin polytetrapeptides and polypentapeptides
US4870055A (en) 1986-04-17 1989-09-26 University Of Alabama At Birmingham Segmented polypeptide bioelastomers to modulate elastic modulus
US5614492A (en) 1986-05-05 1997-03-25 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone GLP-1 (7-36) and uses thereof
US7138486B2 (en) 1986-05-05 2006-11-21 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone derivatives and uses thereof
US4898926A (en) 1987-06-15 1990-02-06 The University Of Alabama At Birmingham/Research Foundation Bioelastomer containing tetra/penta-peptide units
US6184348B1 (en) 1986-11-04 2001-02-06 Protein Polymer Technologies Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer
US5514581A (en) 1986-11-04 1996-05-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer
US5773249A (en) 1986-11-04 1998-06-30 Protein Polymer Technologies, Inc. High molecular weight collagen-like protein polymers
US5770697A (en) 1986-11-04 1998-06-23 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US5641648A (en) 1986-11-04 1997-06-24 Protein Polymer Technologies, Inc. Methods for preparing synthetic repetitive DNA
US5830713A (en) 1986-11-04 1998-11-03 Protein Polymer Technologies, Inc. Methods for preparing synthetic repetitive DNA
US5496712A (en) 1990-11-06 1996-03-05 Protein Polymer High molecular weight collagen-like protein polymers
US5243038A (en) 1986-11-04 1993-09-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Construction of synthetic DNA and its use in large polypeptide synthesis
US6018030A (en) 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US5606019A (en) 1987-10-29 1997-02-25 Protien Polymer Technologies, Inc. Synthetic protein as implantables
IL87055A (en) 1988-07-08 1994-06-24 Illana Gozes Conjugates of vasoactive intestinal peptide (vip) and of fragments thereof and pharmaceutical compositions comprising them
US5137711A (en) 1988-07-19 1992-08-11 Mallickrodt Medical, Inc. Paramagnetic dtpa and edta alkoxyalkylamide complexes as mri agents
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5234907A (en) 1989-06-30 1993-08-10 Hoffmann-La Roche Inc. Synthetic vasoactive intestinal peptide analogs
US5236904A (en) 1989-09-18 1993-08-17 Senetek, Plc Erection-inducing methods and compositions
US5447912A (en) 1989-09-18 1995-09-05 Senetek, Plc Erection-inducing methods and compositions
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
DE69105323T2 (de) 1990-03-27 1995-06-01 Bioelastics Res Ltd Bioelastomeres Arzneimittelabgabesystem.
JPH07108232B2 (ja) 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
US5235041A (en) 1990-12-28 1993-08-10 Protein Polymer Technologies, Inc. Purification of structurally ordered recombinant protein polymers
US5646016A (en) 1991-02-06 1997-07-08 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin, thioredoxin-like molecules, and modified thioredoxin-like molecules
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5393602A (en) 1991-04-19 1995-02-28 Bioelastics Research Ltd. Superabsorbent materials and uses thereof
US5958881A (en) 1991-04-25 1999-09-28 Korman; Louis Y. Composition containing VIP for injection and a method of enhancing visualization of tissues during medical procedures
IL99924A (en) 1991-10-31 1995-12-31 Yeda Res & Dev Derivatives of structurally modified vip and pharmaceutical compositions containing them
US5681816A (en) 1992-04-24 1997-10-28 Korman; Louis Y. Method of inducing temporary paralysis of the gastrointestinal tract during medical procedure
SK155694A3 (en) 1992-06-15 1995-05-10 Pfizer Glucagon-like peptide, insulinotropin derivatives, method of their preparation, pharmaceutical agent containing and using these matters
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5972883A (en) 1993-03-16 1999-10-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for the treatment of neurodegenerative diseases by administering VIP, an analogue, fragment or a conjugate thereof
DK38293D0 (da) 1993-03-31 1993-03-31 Novo Nordisk As Fremstilling af proteiner
US5545617A (en) 1993-11-12 1996-08-13 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Therapeutic regulation of abnormal conjunctival goblet cell mucous secretion
US5705483A (en) 1993-12-09 1998-01-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
CA2137206A1 (en) 1993-12-09 1995-06-10 John A. Galloway Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
US5900405A (en) 1994-01-24 1999-05-04 Bioelastics Research, Ltd. Polymers responsive to electrical energy
JPH10502333A (ja) 1994-04-07 1998-03-03 プロティーンニックス カンパニー バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド
US5527610A (en) 1994-05-20 1996-06-18 The Uab Research Foundation Elastomeric polypeptide matrices for preventing adhesion of biological materials
WO1996005310A1 (en) 1994-08-09 1996-02-22 Regents Of The University Of Minnesota Dna encoding turkey hypothalamic vasoactive intestinal peptide
US6004782A (en) 1995-04-14 1999-12-21 Bioelastics Research Ltd. Hyperexpression of bioelastic polypeptides
US5854387A (en) 1995-04-14 1998-12-29 Bioelastics Research, Ltd. Simple method for the purification of a bioelastic polymer
US5972406A (en) 1995-04-14 1999-10-26 Bioelastics Research Ltd. Bioelastomers suitable as food product additives
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US6037321A (en) 1995-05-03 2000-03-14 Biostar Inc. Fusion proteins comprising vasoactive intestinal peptide or PACAP
DE69620898T2 (de) 1995-09-01 2002-11-07 Univ Washington Seattle Interaktive molekulare konjugate
PT1568772E (pt) 1995-09-21 2010-04-14 Genentech Inc Variantes da hormona do crescimento humana
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
SI9720020B (en) 1996-02-09 2001-12-31 Basf Ag Human antibodies that bind human TNF alpha
US6063061A (en) 1996-08-27 2000-05-16 Fusion Medical Technologies, Inc. Fragmented polymeric compositions and methods for their use
BRPI9711437B8 (pt) 1996-08-30 2021-05-25 Novo Nordisk As derivados de glp-1
US5816259A (en) 1997-01-13 1998-10-06 Rose; Samuel Method for the diagnosis and treatment of cancer by the accumulation of radioactive precipitates in targeted cells
FI103540B1 (fi) 1997-04-28 1999-07-15 Nokia Mobile Phones Ltd Menetelmä pakettikytkentäisen datan siirtoon matkapuhelinjärjestelmässä
GB9718463D0 (en) 1997-08-29 1997-11-05 Dynal As Biomolecules
US20020099003A1 (en) 1997-10-28 2002-07-25 Wilson Leland F. Treatment of female sexual dysfunction with vasoactive agents, particularly vasoactive intestinal polypeptide and agonists thereof
CA2284847A1 (en) 1998-01-30 1999-08-05 Suntory Limited Process for producing peptides using a helper peptide
US6703359B1 (en) 1998-02-13 2004-03-09 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1
CA2319558A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Bioelastics Research, Ltd. Injectable implants for tissue augmentation and restoration
US6998387B1 (en) 1998-03-19 2006-02-14 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Human appetite control by glucagon-like peptide receptor binding compounds
FR2776520B1 (fr) 1998-03-25 2000-05-05 Sod Conseils Rech Applic Nouvelles compositions pharmaceutiques destinees a la liberation prolongee de peptides et leur procede de preparation
ES2138561B1 (es) 1998-04-17 2000-07-01 Univ Madrid Complutense Uso de los peptidos vip y pacap en el tratamiento del shock endotoxico en mamiferos.
US20020151458A1 (en) 1998-04-17 2002-10-17 Perez Gomariz Rosa Maria Method for treating and preventing septic shock with VPAC1R, VPAC2R and PAC1R agonists
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6200598B1 (en) 1998-06-18 2001-03-13 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
US6541033B1 (en) 1998-06-30 2003-04-01 Amgen Inc. Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
AU776514B2 (en) 1998-08-10 2004-09-09 General Hospital Corporation, The Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by GLP-1 or exendin-4 and uses thereof
NZ527241A (en) 1998-12-07 2004-12-24 Sod Conseils Rech Applic Analogues of GLP-1
US6630438B1 (en) 1999-03-12 2003-10-07 The Procter & Gamble Company Perfumed detergent tablet
WO2000056774A1 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Duke University Methods of using bioelastomers
US20090175821A1 (en) 1999-05-17 2009-07-09 Bridon Dominique P Modified therapeutic peptides with extended half-lives in vivo
US6329336B1 (en) 1999-05-17 2001-12-11 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6528486B1 (en) * 1999-07-12 2003-03-04 Zealand Pharma A/S Peptide agonists of GLP-1 activity
EP1076066A1 (en) 1999-07-12 2001-02-14 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptides for lowering blood glucose levels
AU2249701A (en) 1999-11-12 2001-06-06 David Bernstein Methods for treating cardiac arrest or pulmonary hypertension and compositions for use therein comprising vasoactive intestinal polypeptide and cardiac device for electrical and chemical regulation and methods of use
US6235264B1 (en) 1999-12-01 2001-05-22 General Electric Company Medical imaging method for characterizing tumor angiogenesis using polymeric contrast agents
US6593394B1 (en) 2000-01-03 2003-07-15 Prosperous Kingdom Limited Bioactive and osteoporotic bone cement
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
AU2000265051A1 (en) 2000-02-18 2001-08-27 Dabur Research Foundation Vasoactive intestinal peptide analogs
US6852834B2 (en) 2000-03-20 2005-02-08 Ashutosh Chilkoti Fusion peptides isolatable by phase transition
US20050255554A1 (en) 2000-03-20 2005-11-17 Ashutosh Chilkoti Fusion peptides isolatable by phase transition
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6905683B2 (en) 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
EA008837B1 (ru) 2000-06-16 2007-08-31 Эли Лилли Энд Компани Аналоги глюкагоноподобного пептида и их применение
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
MXPA03001984A (es) 2000-09-13 2003-08-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Variantes de factor vii de coagulacion humano.
US20020142964A1 (en) 2000-11-02 2002-10-03 Nissen Torben Lauesgaard Single-chain polypeptides
CN1487952A (zh) 2000-11-28 2004-04-07 �ɶ����＼��ʵ���� 具有血管活性肠肽的生物学活性的用于治疗肺动脉和小动脉高压的化合物
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins
AU2002239384B2 (en) 2000-12-13 2007-01-11 Eli Lilly And Company Chronic treatment regimen using glucagon-like insulinotropic peptides
EA006160B1 (ru) * 2001-02-16 2005-10-27 Конджачем, Инк. Долгоживущий глюкагоноподобный пептид 2(glp-2, гпп-2) для лечения желудочно-кишечных заболеваний и расстройств
ES2432967T3 (es) 2001-03-22 2013-12-05 Novo Nordisk Health Care Ag Derivados del Factor VII de coagulación
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
WO2002098348A2 (en) 2001-06-01 2002-12-12 Eli Lilly And Company Glp-1 formulations with protracted time action
IL160493A0 (en) 2001-08-23 2004-07-25 Lilly Co Eli Glucagon-like peptide-1 analogs
MXPA04001560A (es) * 2001-08-28 2004-05-17 Lilly Co Eli Premezclas de glp-1 e insulina basal.
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US7179788B2 (en) * 2001-10-19 2007-02-20 Eli Lilly And Company Biphasic mixtures of GLP-1 and insulin
ATE425762T1 (de) 2001-11-06 2009-04-15 Senju Pharma Co Mittel zur behandlung von augentrockenheit und damit zusammenhangenden erkrankungen
DE10155862A1 (de) 2001-11-14 2003-05-28 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Produktion von rekombinanten Antikörpern mittels Fusion mit Elastin-ähnlichen Peptiden
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
US20030199445A1 (en) 2002-02-07 2003-10-23 Knudsen Lotte Bjerre Use of GLP-1 compound for treatment of critically ill patients
WO2003099835A1 (en) 2002-05-21 2003-12-04 Emory University Multivalent polymers with chain-terminating binding groups
CA2488358A1 (en) 2002-06-10 2003-12-18 Mondobiotech Laboratories Anstalt Use of compounds having the biological activity of vasoactive intestinal peptide for the treatment of sarcoidosis
ES2347144T3 (es) 2002-08-30 2010-10-26 Biorexis Pharmaceutical Corporation Proteinas de fusion de la transferrina modificada que comprenden dominos aino o carboxilo de transferrina duplicados.
CN100381462C (zh) 2002-11-27 2008-04-16 伊藤火腿株式会社 肽及含有所述肽的药物组合物
US20050026826A1 (en) * 2003-01-17 2005-02-03 Margarethe Hoenig Feline proinsulin, insulin and constituent peptides
CA2524707A1 (en) 2003-05-14 2004-12-02 Dow Corning Corporation Repeat sequence protein polymer active agent conjugates, methods and uses
WO2004105790A1 (en) 2003-06-03 2004-12-09 Novo Nordisk A/S Stabilized pharmaceutical peptide compositions
SI1641823T1 (sl) 2003-06-12 2011-12-30 Lilly Co Eli Fuzijski proteini analogni glp-1
US20040266993A1 (en) * 2003-06-30 2004-12-30 Evans Glen A. Non-immunoglobulin binding polypeptides
ES2327640T3 (es) 2003-07-14 2009-11-02 Mondobiotech Ag Sustancias biologicamente activas a partir de un peptido intestinal vasoactivo para el tratamiento de afecciones pulmonares intersticiales.
WO2005014030A1 (en) 2003-07-24 2005-02-17 Lutz-Henning Block Method for treating lung diseases associated with ventilation-perfusion mismatches
JP2007520530A (ja) 2004-02-05 2007-07-26 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 外傷の遅発型合併症の治療のための、ＶＩＩａ因子又はＶＩＩａ因子等価物の使用
US7776815B2 (en) 2004-02-24 2010-08-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Use of neuropeptides for ligament healing
US7928059B2 (en) 2004-02-24 2011-04-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Use of neuropeptides for traumatic cartilage injury
US20050203009A1 (en) 2004-03-12 2005-09-15 Bayer Pharmaceuticals Corporation VPAC1 selective antagonists and their pharmacological methods of use
JP2007530697A (ja) 2004-03-29 2007-11-01 ジ・アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アリゾナ 両親媒性グリコペプチド
CA2573439C (en) 2004-06-11 2014-12-09 Vectus Biosystems Limited Compositions and methods for treating myocardial fibrosis comprising vasoactive intestinal peptide
CN101001639A (zh) 2004-06-12 2007-07-18 拜尔药品公司 血管活性肠肽(vip)/垂体腺苷酸环化酶活化肽(pacap)受体2(vpac2)激动剂的聚乙二醇化和使用方法
WO2006001806A2 (en) 2004-06-15 2006-01-05 Duke University Method for non-invasive thermometry using elastin-like polypeptide conjugates
US7638299B2 (en) * 2004-07-21 2009-12-29 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US20080085860A1 (en) 2004-08-18 2008-04-10 Eli Lilly And Company Selective Vpac2 Receptor Peptide Agonists
WO2006042152A2 (en) 2004-10-08 2006-04-20 Forbes Medi-Tech (Research) Inc. Vasoactive intestinal polypeptide pharmaceuticals
EP1827381A1 (en) 2004-12-03 2007-09-05 Mederio AG A medical product comprising a glucagon-like peptide medicament intended for pulmonary inhalation
SE0402976L (sv) * 2004-12-03 2006-06-04 Mederio Ag Medicinsk produkt
US20080312156A1 (en) 2005-01-18 2008-12-18 Duke University In-Situ Crosslinkable Elastin-Like Polypeptides for Defect Filling in Cartilaginous Tissue Repair
US7723472B2 (en) 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
WO2006110292A2 (en) 2005-03-25 2006-10-19 The Regents Of The University Of California Temperature-triggered immobilization and purification of antibodies
EP1889618A4 (en) 2005-05-27 2010-11-24 Daiichi Sankyo Co Ltd COMBINED MEDICINE FOR THE TREATMENT OF DIABETES
US20070031342A1 (en) 2005-06-22 2007-02-08 Nektar Therapeutics Sustained release microparticles for pulmonary delivery
US20070041934A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
US7542904B2 (en) * 2005-08-19 2009-06-02 Cisco Technology, Inc. System and method for maintaining a speech-recognition grammar
DK1767545T3 (da) * 2005-09-22 2010-03-15 Biocompatibles Uk Ltd GLP-1 (Glucagon-lignende peptid-1)-fusionspolypeptider med forøget peptidaseresistens
EP1942941A1 (en) 2005-10-26 2008-07-16 Eli Lilly And Company Selective vpac2 receptor peptide agonists
AU2006314037B2 (en) 2005-11-18 2010-09-23 Dabur Pharma Limited Targeted fusion proteins for cancer therapy
US8470778B2 (en) 2005-12-09 2013-06-25 Vectus Biosystems Limited VIP fragments and methods of use
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US7709227B2 (en) 2006-01-04 2010-05-04 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Multimeric ELP fusion constructs
EP2471810A1 (en) * 2006-02-22 2012-07-04 Merck Sharp & Dohme Corporation Oxyntomodulin derivatives
SI2402754T2 (sl) 2006-03-06 2023-09-29 Amunix Operating Inc. Nestrukturirani rekombinantni polimeri in njihove uporabe
ES2315081B1 (es) 2006-03-15 2009-12-30 Grup D'afectats D'esclerosi Multiple (Gaem) Nuevo uso del peptido intestinal vasoactivo (vip) y de las celulas aisladas estimuladas con dicho peptido.
WO2008036147A2 (en) 2006-07-24 2008-03-27 Duke University Drug delivery with stimulus responsive biopolymers
EP2054437A2 (en) 2006-08-07 2009-05-06 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
WO2008028117A2 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 Centocor, Inc. Glp-2 mimetibodies, polypeptides, compositions, methods and uses
CN103230598A (zh) 2006-09-06 2013-08-07 费斯生物制药公司 融合肽治疗组合物
EP2152741B1 (en) 2007-05-21 2011-09-21 Res International Sarl Peptides with improved properties having the biological activity of vasoactive intestinal peptide (vip) and their use for the treatment of lung diseases
KR101017862B1 (ko) 2007-06-08 2011-03-04 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 네비라핀의 서방성 제형
CN101970678B (zh) 2007-06-21 2014-08-20 慕尼黑科技大学 具有增加的体内和/或体外稳定性的生物学活性蛋白
CA2695374A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
EP2679597A1 (en) 2007-09-05 2014-01-01 Novo Nordisk A/S Glucagon-like peptide-1 derivatives and their pharmaceutical use
US20090181037A1 (en) 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
WO2009067584A1 (en) 2007-11-20 2009-05-28 Duke University Methods and compositions for modulating drug-polymer architecture, pharmacokinetics and biodistribution
EP3412300A1 (en) 2008-06-27 2018-12-12 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
SG10201501316VA (en) 2008-10-17 2015-05-28 Vectus Biosystems Pty Ltd Compositions and methods for treatment of kidney disorders
US20110288001A1 (en) 2008-12-18 2011-11-24 Homayoun Sadeghi Biologically active proteins activatable by peptidase
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
EP2464370B1 (en) 2009-08-14 2017-03-29 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
TW201138808A (en) * 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
CA2873553C (en) 2011-06-06 2020-01-28 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
US20130084277A1 (en) 2011-08-24 2013-04-04 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Formulations of active agents for sustained release
CA2856967A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic agents comprising insulin amino acid sequences
US9605186B2 (en) 2012-09-19 2017-03-28 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Adhesive compositions of ethylene-based and propylene-based polymers

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070009602A1 (en) * 2005-06-24 2007-01-11 Setton Lori A Direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENE L. BIDWELL III AND DRAZEN RAUCHER: "Application of thermally responsive polypeptides directed against c-Myc transcriptional function for cancer therapy", 《MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS》 *
J.L. ESTALL AND D.J. DRUCKER: "Glucagon and Glucagon-Like Peptide Receptors as Drug Targets", 《CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10258700B2 (en) 2005-12-20 2019-04-16 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US10596230B2 (en) 2008-06-27 2020-03-24 Duke University Methods of increasing nutrient absorption in the intestine using therapeutic agents comprising GLP-2 and elastin-like peptides
US9821036B2 (en) 2008-06-27 2017-11-21 Duke University Therapeutic agents comprising a GLP-2 peptide and elastin-like peptides
US11103558B2 (en) 2008-06-27 2021-08-31 Duke University Therapeutic agents comprising a BMP-9 peptide and eleastin-like peptides
CN104023784B (zh) * 2011-08-24 2018-05-25 费斯生物制药公司 供持续释放的活性剂制剂
CN104023784A (zh) * 2011-08-24 2014-09-03 费斯生物制药公司 供持续释放的活性剂制剂
CN104080473A (zh) * 2011-11-28 2014-10-01 费斯生物制药公司 包含胰岛素氨基酸序列的治疗剂
CN104894196A (zh) * 2015-05-28 2015-09-09 中国药科大学 一种制备重组艾塞那肽或其衍生物的新方法
CN109310641A (zh) * 2016-05-06 2019-02-05 费斯生物制药公司 用于受控和持续释放的elp融合蛋白
CN107778361A (zh) * 2016-08-30 2018-03-09 上海交通大学 多肽hl‑39及其制备与应用
CN110101868A (zh) * 2019-05-24 2019-08-09 北京大学 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用
CN110101868B (zh) * 2019-05-24 2021-03-23 北京大学 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用
CN117398525A (zh) * 2023-12-05 2024-01-16 北京大学人民医院 表达Exendin-4蛋白的间充质干细胞及其用途
CN117398525B (zh) * 2023-12-05 2024-03-12 北京大学人民医院 表达Exendin-4蛋白的间充质干细胞及其用途

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