EA006160B1 - Долгоживущий глюкагоноподобный пептид 2(glp-2, гпп-2) для лечения желудочно-кишечных заболеваний и расстройств - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к производным глюкагоноподобного пептида 2 (ГПП-2). В частности, данное изобретение относится к производным пептида ГПП-2, имеющим продолжительное время полужизни in vivo, для лечения или предупреждения желудочно-кишечных расстройств или заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника и других желудочно-кишечных функций любого участка желудочно-кишечного тракта, от пищевода до ануса.

Description

Данное изобретение относится к производным глюкагоноподобного пептида 2 (ГНИ 2). В частности, данное изобретение относится к производным пептида ПП1-2, имеющим продолжительный период полужизни ίη νίνο, для лечения или предупреждения желудочно-кишечных расстройств или заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника, и нарушений других желудочно-кишечных функций любого сегмента желудочно-кишечного тракта от пищевода до ануса.

Предпосылки создания изобретения

ГНН-2 представляет собой пептид, содержащий 33 аминокислоты, тканеспецифически экспрессирующийся при использовании плейотропного гена проглюкагона, и, следовательно, принадлежит к пептидньм гормонам суперсемейства глюкагона. Альтернативный посттрансляционный процессинг проглюкагона происходит в поджелудочной железе, кишечнике и тканях мозга. Ферментативное расщепление проглюкагона даёт многочисленные полифункциональные пептидные гормоны, участвующие в процессе обмена питательных веществ. Основные биоактивные гормоны, образующиеся из проглюкагона, находятся в панкреатических α-клетках, а ГИИ-1 и ГНН-2 находятся в интестинальных Ь-клетках и клетках мозга. Пшсйет е1 а1. (см. Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8ск, 1996, 93, (115), 7911-7916) первые открыли, что он оказывает сильное трофическое действие на кишечник. Ноказано, что ГНН-2, будучи натуральным образующимся в кишечнике пептидом, обладает значительной репаративной активностью в отношении эпителия слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника. Ноказано также, что он повышает способность кишечника гидролизовать и всасывать питательные вещества, что предполагает возможное участие в терапии кишечной недостаточности. Действительно, в некоторых исследованиях недавно подтверждено, что введение ГГШ-2 уменьшает вероятность или предупреждает поражение кишечника при колите, энтерите, полном парентеральном питании и обширной резекции на моделях грызунов. Также совсем недавно появились сообщения о 2 фазе клинических испытаний ГНН-2, в которых было показано, что у пациентов с синдромом укороченной тонкой кишки повышается способность всасывать питательные вещества в тонком кишечнике после 30-дневного применения ГИН-2 при видимом отсутствии вредных побочных явлений.

Основным путём метаболического клиренса ГИИ-2 является ферментативный гидролиз (расщепление). Иоказано, что ГНН-2 быстро распадается при удалении двух его Ν-концевых аминокислот с помощью дипептидилпептидазы-ΐν (ИРР-ΐν), что является главным ограничением, так как это ведёт к полной инактивации пептида. В результате период полужизни ГНН-2 чрезвычайно короток, и в настоящее время при терапии ГНН-2 требуется вливание или частые инъекции. Было также показано, что в клиренсе ГНН2 принимает участие почечный клиренс. Основное действие ГНН-2 включает стимуляцию роста клеток, а механизм, прямо или косвенно связывающий активацию рецептора ГНН-2 с пролиферацией клеток, не изучен.

Было показано, что пептидные аналоги нативного ГНН-2 обладают повышенной трофической активностью в тонком кишечнике в качестве антагонистов рецептора ГНН-2 (см., например, патент США 5990077).

Будучи очень полезными, ГНН-2 пептиды и аналоги, как указано выше, имеют важный недостаток, - очень короткое время полужизни ίη νίνο, как правило, не более 2 мин.

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК, ΙΒΌ) представляют собой группу хронических расстройств, которые вызывают воспаление или образование язв в тонком и толстом кишечнике. Они могут даже угрожать жизни, и в настоящее время неизвестен способ их лечения. Нонятие ВЗК, как правило, относится к язвенным колитам (ИС), ограниченным толстой кишкой, и к болезни Крона (СИ), которая может включать весь желудочно-кишечный тракт, вызывая хронические циклы, состоящие из ремиссий и обострений. Известны многие фармацевтические продукты для лечения ВЗК, например для ослабления воспаления, для предупреждения внезапного обострения болезни, для регуляции симптомов, таких как боль или диарея, или для замены основных питательных веществ, или в качестве дополнения к основным питательным веществам, которые плохо всасываются вследствие обширного заболевания или в результате хирургической операции. Современные варианты лечения включают большое разнообразие фармацевтических продуктов, таких как аминосалицилаты, кортикостероиды, иммуномодуляторы и агент против ΤΝΡ-α, и предназначенных, помимо замены утраченных жидкостей и питательных веществ, для ослабления воспаления и облегчения симптомов. Однако большая часть этих продуктов имеет ограниченное применение для ВЗК из-за их нежелательного побочного действия в целом на организм.

Около одного миллиона больных лечится каждый год от ВЗК в Соединённых Штатах и в Европе, большинство из них, как правило, страдает либо болезнью Крона, либо язвенным колитом. На самом деле, для страдающих ВЗК не является необычной радикальная хирургическая операция, включающая удаление основных отделов кишечника. Нрямые затраты на лечение ВЗК составляют около 700 миллионов $И8, а общие экономические последствия как прямых, так и косвенных затрат во всём мире составляют примерно 2-3 миллиарда $ в год. Существующее лечение, несмотря на то что часто приносит облегчение, оказывает кратковременное действие.

- 1 006160

Патентом США 5789379 охватываются аналоги ГПП-2, среди которых один получен как соединение пролонгированного действия (АЬХ-600™) и в настоящее время проходит клинические испытания. Однако, даже если удастся предотвратить расщепление ГПП-2 с помощью ΌΡΡ-ΐν, его период полужизни по-прежнему ограничен почечным клиренсом и не превышает 2 мин, как говорится выше.

Химерное антитело (Веткабе™) получено с целью специфического связывания с человеческим фактором некроза опухолевых клеток (ΤΝΡ-α) для краткосрочного лечения болезни Крона. Это антитело показано для уменьшения симптомов болезни Крона, в форме от умеренной до тяжёлой, у больных, проявляющих неадекватную реакцию на обычную терапию кортикостероидами, другими иммунодепрессантами и/или антибиотиками. Тем не менее, при таком лечении наблюдаются опасные побочные эффекты. Например, его связывают с реакцией сверхчувствительности, опасными инфекциями, включая сепсис, а также с летальными инфекциями. Его применение может в дальнейшем вызвать предрасположение больного к инфекциям вследствие блокирования ΤΝΡ.

В связи с увеличением в последние годы распространённости ВЗК было бы желательно получить производные или аналоги пептида ГПП-2, способные практически сохранять такой же уровень активности, низкую токсичность и терапевтические преимущества ГПП-2, но со значительно более продолжительным ίη νίνο периодом полужизни, тем самым позволяя избегать длительного их введения при лечении различных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника, при этом болезнь Крона и язвенный колит представляют собой два основных воспалительных заболевания кишечника.

Сущность изобретения

Согласно данному изобретению предлагается производное ГПП-2 стимулятора роста желудочнокишечных тканей с продолжительным ίη νίνο временем полужизни по сравнению с соответствующим немодифицированным ГНП-2 стимулятором роста желудочно-кишечных тканей. Более конкретно, производное ГПП-2 содержит реакционноспособную группу, соединённую с ним и способную реагировать с функциональными группами компонента крови ίη νίνο или ех νίνο, с образованием прочной ковалентной связи. Связывание производного ГПП-2 и компонента крови ковалентной связью предотвращает нежелательное расщепление ГПП-2 ферментами, такими как дипептидилпептидаза ΐν, тем самым продлевается его ίη νίνο период полужизни и активность. Реакционноспособная группа может быть на Ν- конце ГНП-2 пептида, на С-конце ГПП-2 пептида или в любом другом доступном сайте вдоль пептидной цепи.

Предпочтительные компоненты крови включают белки, такие как иммуноглобулины, включая 1дО и 1дМ, сывороточный альбумин, ферритин, стероид-связывающие белки, трансферрин, тироксинсвязывающий белок, α-2-макроглобулин, галтоглобин и т.д., причём более предпочтительными являются сывороточный альбумин и 1дО, а наиболее предпочтительным является сывороточный альбумин.

Предпочтительные реакционноспособные группы способны образовывать ковалентную связь с компонентами крови, реагируя с находящимися в них аминогруппами, гидроксильными группами или тиольньми группами либо ίη νίνο, либо ίη νίίτο (или ех νίνο). В наиболее предпочтительном варианте изобретения функциональная группа белка может представлять собой тиольную группу, а реакционноспособный фрагмент может являться акцептором Михаэля, таким как акролеиновые производные, галогенацетаты, галогенацетамиды, α,β-ненасыщенные кетоны, α,β-ненасыщенные сложные эфиры, α,βненасыщенные амиды, α,β-ненасыщенные тиоэфиры и т.п., малеинимид или малеинимидсодержащая группа, такая как γ-малеинимидбутириламид (ОМВА) или малеинимидпропионовая кислота (МРА), причём МРА является наиболее предпочтительной.

В другом аспекте изобретения охватывается фармацевтическая композиция, содержащая производное ГПП-2 стимулятора роста желудочно-кишечной ткани по данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Такая композиция применима для лечения или предупреждения кишечных расстройств или заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника и нарушение других желудочно-кишечных функций. Композицию можно также использовать в генной терапии для того, чтобы стимулировать эндогенное продуцирование клетками пептидного производного стимулятора роста желудочно-кишечных тканей, которое затем можно имплантировать в субъекта с целью вызвать желаемый биологический эффект. Наконец, композицию можно также применять для промышленного получения фармацевтических или ветеринарных композиций, улучшающих рост тканей толстого кишечника.

В другом варианте данного изобретения предлагается способ лечения или предупреждения расстройств или заболеваний кишечника, таких как воспалительное заболевание кишечника и нарушение желудочно-кишечных функций. Способ заключается во введении субъекту, предпочтительно млекопитающему, животному или человеку, эффективного количества производного ГПП-2 стимулятора роста желудочно-кишечных тканей или его конъюгата, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

В другом аспекте данного изобретения предлагается конъюгат, содержащий производное ГПП-2 стимулятора роста желудочно-кишечных тканей, ковалентно связанное с компонентом крови.

Ещё в одном аспекте настоящего изобретения создан способ продления ίη νίνο периода полужизни производного ГПП-2 стимулятора роста желудочно-кишечных тканей в организме субъекта, причём спо- 2 006160 соб включает связывание производного ГПП-2 стимулятора роста желудочно-кишечных тканей с компонентом крови ковалентной связью. Связывание ковалентной связью может осуществляться ίη νίνο и ίη νίίτο.

Предпочтительными соединениями - стимуляторами роста желудочно-кишечных тканей - являются пептиды, такие как ГПП-2 и аналоги Г1П1-2, фрагменты Г1П1-2, при условии, что такой аналог или фрагмент обладает активностью стимуляции роста желудочно-кишечных тканей. Детали последовательностей этих пептидов, аналогов и фрагментов иллюстрируются ниже.

Ещё одним применением соединения по данному изобретению может быть применение для определения трофической активности гормона в кишечнике при использовании его (гормона) вместе с производным соединением по данному изобретению и, в частности, когда это соединение представляет собой Г1П1-2 и аналог ПП1-2 или фрагмент ГПП-2. Такие методы включают стадии: (1) совместное введение испытуемому субъекту гормона с обладающим трофической активностью в кишечнике количеством производного ГПП-2; (2) оценка последующего роста тканей тонкого и толстого кишечника у испытуемого субъекта и (3) определение, действительно ли увеличивается рост тканей тонкого и/или толстого кишечника по сравнению с контрольным субъектом, получавшим немодифицированные ГПП-2, аналог ГПП-2 или производное ГПП-2.

Если присутствует связывающая группа, она предпочтительно определяется, но без ограничения, как линейный или разветвлённый алкил С_1-10; частично или полностью (пер)фторированный линейный или разветвлённый алкил С_1-10; Сыо-алкил или фторалкил, в котором один или более атомов углерода замещены на О, N или 8 с образованием простого эфира или тиоэфира; о-, м- или п-дизамещённый фенил, заместители в котором одинаковы или различны и представляют собой СН₂, О, 8, N4, ΝΚ.. где Я обозначает Н, Сы^алкил или Сы₀-ацил; или дизамещённые гетероциклы, такие как фуран, тиофен, пиран, оксазол или тиазол.

Описание фигур

Фиг. 1 иллюстрирует изменения сырого веса тонкого кишечника у мышей, получавших физиологический раствор или 5 мкг соединений из примеров 1-8 дважды в день в течение 10 дней (η = 10/группа). Результаты выражаются как средняя разница (дельта) в весе по сравнению с контрольным ± 8ЕМ.

Фиг. 2 иллюстрирует изменения сырого веса тонкого и толстого кишечника у мышей, получавших физиологический раствор или 5, 25 или 50 мкг соединений из примеров 5, 7 и 8 дважды в день в течение 10 дней (η = 10/группа). Результаты выражаются как средний вес ± 8ЕМ.

Фиг. 3 иллюстрирует средние концентрации соединений из примеров 5 и 8 у крыс 8ртадие-ОаМеу после однократной внутривенной или подкожной дозы 500 нмоль/кг (η = 4/группа).

Фиг. 4 иллюстрирует обнаружение соединения из примера 8, конъюгированного с белками плазмы крыс, с применением поликлонального антитела к антителу против ГПП-2 и сравнением со структурой, полученной с антителом к альбумину крыс.

Подробное описание изобретения

Ιη νίνο биоконъюгация обозначает процесс ковалентного связывания в организме молекулы, такой как молекула производного стимулятора роста желудочно-кишечных тканей по данному изобретению, с нацеленными компонентами крови, предпочтительно с белками, таким образом, что становится возможным в значительной степени сохранить или в некоторых случаях повысить биологическую активность исходного немодифицированного ГПП-2 пептидного стимулятора роста желудочно-кишечных тканей, в то же время достигается продолжительная биологическая активность за счёт придания производному ГПП-2 биофизических характеристик нацеленного компонента крови.

Для целей настоящего изобретения предполагается, что термины аналог или фрагмент включают аминокислотные последовательности, содержащие пептиды с различными аминокислотными последовательностями нативной последовательности, такой как последовательность ГПП-2, но со сходной или сравнимой активностью. Такие аналоги, предпочтительно, имеют аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичной либо последовательности ГПП-2, либо последовательности фрагмента ГПП-2, содержащей такое же число аминокислотных остатков.

В более предпочтительном варианте изобретения производное пептидного стимулятора роста желудочно-кишечных тканей содержит ГПП-2 пептидный стимулятор роста желудочно-кишечных тканей, который модифицирован за счёт связывания с реакционноспособной группой либо непосредственно, либо через связывающую группу (мостик), причём реакционноспособная группа способна образовывать ковалентную связь с компонентом крови, предпочтительно с белками крови. Реакционноспособная группа должна быть устойчивой в водной среде, а её предпочтительные варианты включают карбоксильную группу, фосфорильную группу, имидатную группу или ацильную группу либо в виде сложного эфира, либо в виде смешанного ангидрида. Ковалентная связь обычно образуется между реакционноспособной группой и аминогруппой, гидроксигруппой или тиольной группой компонента крови. Аминогруппа, предпочтительно, образует ковалентную связь с реакционноспособными группами, такими как карбоксигруппа, фосфорильная или ацильная группа; гидроксигруппа, предпочтительно, образует ковалентную связь с реакционноспособными соединениями, такими как активированные сложные эфиры; а тиольная

- 3 006160 группа, предпочтительно, образует ковалентную связь с реакционноспособными соединениями, такими как сложные эфиры или смешанные ангидриды. Предпочтительный компонент крови представляет подвижный компонент крови, такой как сывороточный альбумин, иммуноглобулины или их комбинация, а предпочтительные реакционноспособные группы представляют собой аналогичные ангидридным малеинимидные группы. В наиболее предпочтительном варианте изобретения компонент крови представляет собой сывороточный альбумин.

Компоненты крови, предпочтительно, являются подвижными, это означает, что они не имеют фиксированного положения в любой продолжительный период времени, обычно не превышающий 5 мин и, более обычно, одну минуту. Эти компоненты крови не являются мембрано-связанными и присутствуют в крови в течение продолжительного времени в минимальной концентрации, по меньшей мере 0,1 мкг/мл. Предпочтительные подвижные компоненты крови включают сывороточный альбумин, трансферрин, ферритин и иммуноглобулины, такие как 1дМ и 1дС. Период полужизни подвижных (несвязанных) компонентов крови составляет по меньшей мере около 12 ч.

Так как производное стимулятора роста желудочно-кишечных тканей по данному изобретению представляет собой Г1П1-2 пептид, то в процессе синтеза производного Г1П1-2 могут потребоваться защитные группы. Эти защитные группы являются обычными в области пептидного синтеза и в целом могут быть описаны как химические группы, способные защитить пептидное производное от реакции с другими функциональными группами. Соединения, содержащие различные защитные группы, выпускаются промышленностью, и их примеры можно найти в патенте США 5493007. Типичные примеры подходящих защитных групп включают ацетил, фторфенилметилоксикарбонил (РМОС), трет.бутилоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (ΟΒΖ) и т.д. В табл. 1 приводятся как трёхбуквенные, так и однобуквенные аббревиатуры для аминокислот.

Таблица 1

Природные аминокислоты и их аббревиатуры
Название	Зх-буквенная аббревиатура	1 -буквенная аббревиатура
Аланин	А1а	А
Аргинин	Аг§	К
Аспарагин	Азп	N
Аспарагиновая кислота	Азр	ϋ
Цистеин	Суз	С
Г лутаминовая кислота	О1и	Е
Глутамин	О1п _

Глицин	О1у	Θ
Г истидин	ΗΪ8	Н
Изолейцин	Не	I
Лейцин	Ьеи	Ь
Лизин	Ьуз	К
Метионин	Ме1	м
Фенилаланин	РЬе	г
Пролин	Рго	Р
Серин	Зег	8
Треонин	ТЬг	Т
Триптофан	Тгр	\ν
Тирозин	Туг	Υ
Валин	Уа1	V

Производное ГПП-2 по данному изобретению после конъюгации с компонентом крови образует пептид, стабилизированный в отношении пептидазы. Также рассматривается, что перед присоединением реакционноспособного фрагмента к пептиду можно добавлять одну или более аминокислот, чтобы облегчить присоединение фрагмента к пептиду. Такое добавление или замену можно делать на Ν-конце, С-конце, или между ними. Полученное таким образом пептидное производное можно вводить субъекту, животному или человеку таким образом, что конъюгация с компонентами крови происходит ίη νίνο, или сначала может происходить конъюгация пептида с компонентами крови субъекта, человека или животного ίη νίΐτο, и образующийся конъюгат или стабилизированное в отношении пептидазы пептидное производное по определению ниже вводят субъекту.

Аминокислота, присутствующая, заменяемая или добавляемая к последовательности ГПП-2, может быть Ό-аминокислотой, или Ь-аминокислотой, или их комбинацией. Обычно предпочтительными явля- 4 006160 ются Ь-аминокислоты. Замена глицина в положении 2 последовательности нативного ГПП-2 даёт предпочтительный вариант изобретения, так как эта замена придаёт аналогу большую устойчивость к ферменту ΌΡ-ΐν. Глицин может быть также заменён на Ό-аланин или пролин для той же самой цели.

Кроме того, замена Ν-α-метиласпарагиновой кислоты в положении 3 последовательности нативного ГНП-2 может дать такой же результат, так же как другие пептидные миметики, такие как метиламино, гидроксиэтил, гидразино, этилен или сульфонамид, в качестве изотерической замены амидной связи.

Изобретение также включает фрагменты ГНП-2, в которых, хотя они и содержат последовательность, практически гомологичную последовательности природного пептида ГПП-2, может на амино и/или карбоксильном конце отсутствовать одна или более дополнительная аминокислота, которая имеется в природе в нативном пептиде ГНП-2. Следовательно, изобретение относится к полипептидным фрагментам ГПП-2, в которых может отсутствовать одна или более аминокислот, которые обычно имеются в природной последовательности ГПП-2, при условии, что такие полипептиды имеют активность, стимулирующую рост желудочно-кишечных тканей, которая предпочтительно, по меньшей мере, практически равна активности ГПП-2.

Изобретение также охватывает очевидные или тривиальные варианты вышеописанных аналогов или фрагментов, которые содержат незначительные аминокислотные замены (и, следовательно, имеют аминокислотные последовательности, которые отличаются от природной последовательности), при условии, что такие варианты имеют активность, стимулирующую рост желудочно-кишечных тканей, которая практически равна активности ГПП-2. Примеры очевидных или тривиальных замен включают замену одного основного остатка на другой (т.е. Агд на Ьу8), замену одного гидрофобного остатка на другой (т.е. Ьеи на 11е) или замену одного ароматического остатка на другой (т.е. Рйе на Туг) и т.д. Далее, другие тривиальные варианты включают аналоги, в случае которых получают консервативные замены, приводящие к значительной структурной аналогии с первоначальной последовательностью. Примеры таких консервативных замен, без ограничения, включают замену глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту и наоборот; глутамина на аспарагин и наоборот; серина на треонин и наоборот; лизина на аргинин и наоборот; или любого остатка из группы изолейцин, валин или лейцин друг на друга.

Стабилизированное в отношении пептидазы ГПП-2 производное более устойчиво в присутствии пептидаз ίη νίνο, чем соответствующий нестабилизированный ГНП-2 аналог. Устойчивость в отношении пептидаз определяется сравнением периода полужизни нативного ГПП-2 аналога в сыворотке или крови с периодом полужизни соответствующего производного, содержащего реакционноспособную группу, в сыворотке или в крови. Период полужизни определяют, отбирая образцы сыворотки или крови после введения производного или немодифицированного пептида и определяя активность каждого компонента.

Более подробно, настоящее изобретение направлено на модификацию ГПП-2 и его аналогов и фрагментов с целью повышения их биодоступности, продления ίη νίνο их периода полужизни и распределения за счёт селективной конъюгации с компонентом крови при практическом сохранении или улучшении их отличительных терапевтических свойств.

Известно, что человеческий ГПП-2 имеет следующую последовательность: Н15-А1а-А5р-С1у-8егРйе-8ег-А8р-С1и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Теи-А8р-А8п-Теи-А1а-А1а-Агд-А8р-Рйе-11е-А8п-Тгр-Теи-11е-С1п-Тйг-Ту8Пе-Тйг-Акр.

Данное изобретение относится к терапевтической и родственным областям применения производных ГПП-2, имеющих продолжительный период полужизни, в частности к применению для стимулирования роста тканей тонкого и/или толстого кишечника;

повышения уровней производного ГПП-2 в крови;

восстановления или сохранения желудочно-кишечной функции;

стимулирования заживления и возобновления роста поражённой или изъязвлённой/воспалённой слизистой кишечника;

снижения риска заболевания тонкого кишечника;

повышения состояния питания;

лечения или предупреждения пищевых или желудочно-кишечных расстройств или заболеваний; уменьшения потери веса;

уменьшения экспрессии интерлейкина-1;

увеличения длины толстой кишки, поверхности слизистой и целостности толстой кишки и глубины крипты;

стимулирования роста кишечных ворсинок у субъектов, страдающих такими заболеваниями, как глютеновая болезнь, синдром послеинфекционной атрофии кишечных ворсинок и синдром укороченной тонкой кишки;

стимулирования пролиферации тонкого и толстого кишечника у здоровых субъектов, например для увеличения всасывания питательных веществ у крупного рогатого скота, что позволяет раньше отлучать детёнышей от матерей или повышать количество получаемого молока или мяса и т.д.

Влияние, оказываемое производными ГПП-2 на рост, проявляется как увеличение веса тонкого кишечника по сравнению с псевдопролеченным (псевдообработанным) контролем. В частности, полагают, что производные ГПП-2 по данному изобретению обладают интестинотрофической активностью (ак- 5 006160 тивностью в отношении интестинальных тканей), если при оценке приведённой в данном описании мышиной модели аналог опосредует увеличение веса тонкого кишечника по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольным животным, получающим один носитель. Особенно пригодны для терапевтического применения такие производные, которые опосредуют увеличение веса тонкого кишечника по меньшей мере на 20%, тогда как наиболее предпочтительные производные обусловливают увеличение веса тонкого кишечника на 50% или более. Отмечают, что интестинотрофическая активность наиболее высока в отношении тощей кишки, включая дистальную тощую кишку и, в особенности, проксимальную тощую кишку, и также в отношении подвздошной кишки.

Помимо интестинотрофической активности, производные ГПП-2 по данному изобретению включают аминокислотную замену в одном или более сайтов остова пептида ГПП-2, который представляет собой либо непосредственно ГПП-2 млекопитающих, либо является вариантом ГПП-2 млекопитающих, в котором С-конец и/или Ν-изменён добавлением одного или двух основных остатков или модифицирован за счёт введения блокирующей группы того типа, который обычно применяют в технике химии пептидов для защиты пептидных концов от нежелательной биохимической атаки и расщепления ίη νίνο. Следовательно, пептидные производные по данному изобретению вводят аминокислотную замену в контекст ГПП-2 любого вида млекопитающих, включая, но без ограничения, ГПП-2 человека, ГПП-2 коровы, ГПП-2 крысы, ГПП-2 собаки, ГПП-2 буйвола, ГПП-2 свиньи, ГПП-2 морской свинки и ГПП-2 хомяка, последовательности которых описаны многими авторами, включая ВиЫ с1 а1., 1. ΒίοΙ. С'йст.. 1988, 263(18):8621. В более предпочтительном варианте изобретения на С-конце ГПП-2 пептидной последовательности добавляют остаток лизина.

В одном аспекте изобретения интестинотрофические аналоги ГПП-2, пригодные для дериватизации по данному изобретению, имеют следующую последовательность:

В1^-(У1⁾т^-Х1^-Х2^-Хз^-Х4^-Х5^-РЙеб^-8еГ7^-А5р8^-(Р1^)-Х14^-А8Р15^-Х1б^-Х17^-А1^а18^-Х19^-Х20^-Х21^-РЙе22^-(Р2^)-Тгр25 Ье^и26^-Х27^-Х28^-ТЙГ29^-Ьу8зо^-Рз^-(Х2⁾п^-^2 где

Х₁ обозначает Н1к или Туг;

Х₂ обозначает А1а, С1у, Б-А1а, Рго, 11е, ΝοΓ-ΥαΙ, α-аминомасляную кислоту или А1а-замещающую аминокислоту, придающую указанному аналогу устойчивость к ферменту БРР-1У;

Х₃ обозначает Акр, С1и, Рго, НРго; или Х₂-Х₃ обозначают Х₂ДСН(ОН)СН₂)Х₃, Х_2ψ(СН₂NН₂)Х₃ или Х₂у(СНСН)Х₃, где Х₂ и Х₃ по определению выше;

Х₄ обозначает С1у или А1а;

Х₅ обозначает §ет или А1а;

Р₁ обозначает С1и-Х₁₀-Акп-Тйт-11е, С1у-Х₁₀-Акп-Тйт-Уа1 или Туг-§ег-Ьук-Тут,

Х₁₀ обозначает Ме!, Ьеи, 11е или устойчивую к окислению МеСзамещающую аминокислоту;

Х₁₄ обозначает Ьеи или Ьук;

Х₁₆ обозначает Акп, Ьук или А1а;

Х₁₇ обозначает Ьеи или Ьук;

Х₁₉ обозначает А1а или Тйт;

Х₂₀ обозначает Агд, Ьук, Н1к или А1а;

Х₂₁ обозначает Акр или Ьук;

Х₂₇ обозначает 11е или Ьеи;

Х₂₈ обозначает С1п или Н1к;

Р₂ обозначает 11е-Акр, 11е-А1а или Уа1-С1п;

Р₃ обозначает ковалентную связь или 11е, 11е-Тйг, Пе-ТПг-Акр или 11е-Тйг-Акп;

Р| обозначает ΝΗ₂ или Ν-концевую блокирующую группу;

Р₂ обозначает СООН, ί.ΌΝΗ₂ или С- концевую блокирующую группу;

Υ₁ обозначает один или два остатка из Агд, Ьук и Н1к;

Υ₂ обозначает один или два остатка из Агд, Ьук и Н1к; апб т и п независимо обозначают 0 или 1.

В предпочтительном варианте изобретения Х₁ обозначает Н1к; Х₂ обозначает А1а или С1у; Х₃ обозначает Акр; Х₄ обозначает С1у; Х₅ обозначает §ет; Р₁ обозначает С1и-Х₁₀-Акп -ТНг-Пе; Х₁₀ обозначает Ме1; Х₁₆ обозначает Акп или Ьук; Х₁₉ обозначает А1а; Х₂₀ обозначает Агд; Х₂₇ обозначает 11е; Х₂₈ обозначает С1п; Р₂ обозначает 11е-Акп; Р₃ обозначает Пе-ТПг-Акр; Р₂ обозначает ΓΟΝ^ и т обозначает 0. Ещё в одном предпочтительном варианте изобретения п обозначает 1 и Υ₂ обозначает Ьук.

В предпочтительном варианте изобретения функциональной группой в молекуле белка является тиольная группа, а реакционноспособной группой является малеинимид или малеинимидосодержащая группа, такая как γ-малеинимидбутириламид (СМВА), малеинимидопропионовая кислота (МРА), (2амино) этоксиуксусная кислота (АЕА)-МРА, этилендиамин (ЕБА)-МРА или 2-[2-(2-амино)этокси)] этоксиуксусная кислота (АЕЕА)-МРА и их комбинации. Примеры комбинаций включают, но без ограничения, (АЕЕА-ЕБА)-МРА, (АЕЕА-АЕЕА)-МРА, (АЕА-АЕЕА)-МРА и т.п.

Малеинимидные группы являются наиболее селективными для сульфгидрильных групп в пептидах, когда выдерживаются значения рН реакционной смеси 6,5-7,4. При рН 7,0 скорость реакции малеиними- 6 006160 догрупп с сульфгидрильными группами в 1000 раз быстрее, чем с аминогруппами. При реакции между малеинимидной и сульфгидрильной группами образуется устойчивая тиоэфирная связь, которая не расщепляется в физиологических условиях.

Производные стимулятора роста желудочно-кишечных тканей по изобретению обеспечивают специфическое мечение компонентов крови. Такое специфическое мечение, в частности, малеинимидом, даёт ряд преимуществ. Свободные тиольные группы менее распространены ίη νίνο, чем аминогруппы, и в результате, малеинимидные производные связываются ковалентной связью с меньшим количеством белков. Например, на одну молекулу сывороточного альбумина приходится только одна свободная тиольная группа. Поэтому молярное соотношение пептида и альбумина в конъюгате Г1П1-2 - малеинимид альбумин стремится к 1:1. Помимо альбумина свободные тиольные группы содержатся также в молекулах 1дС (класс II). Так как молекулы 1дС и сывороточного альбумина составляют основную часть растворимых белков в крови, т.е 99%, они также содержат основную часть тиольных групп, способных связываться ковалентной связью с малеинимидо-замещёнными ГПП-2.

Далее, даже среди содержащих свободные тиольные группы белков крови специфическое мечение малеинимидом приводит к преимущественному образованию конъюгатов пептидмалеинимид - альбумин вследствие уникальных особенностей самого альбумина. Единственная свободная тиольная группа альбумина, высококонсервативная среди этих групп, расположена в аминокислотном остатке Сук₃₄. Недавно было показано, что Сук₃₄ альбумина обладает повышенной реакционной способностью по сравнению со свободными тиолами других тиолсодержащих белков. Это частично объясняется необычным значением рК для Сук₃₄ альбумина, равным 5,5. Эта величина значительно ниже, чем типичные значения рК для цистеиновых остатков в целом, равные, как правило, примерно, 8. Из-за низкого значения рК Сук₃₄ альбумина в обычных физиологических условиях находится преимущественно в анионной форме, что резко повышает её реакционную способность. Помимо низкого значения рК Сук₃₄ другим фактором, который повышает реакционную способность Сук₃₄, является его локализация в кармане около поверхности одной петли области V альбумина. Это местоположение делает Сук₃₄ очень доступным для лигандов всех видов и является важным фактором, определяющим биологическую роль Сук₃₄ в качестве ловушки свободных радикалов и скавенджера свободных тиольных групп. В результате скорость реакции может увеличиваться в 1000 раз по сравнению со скоростью реакции пептид - малеинимидов с другими белками, содержащими свободные тиольные группы.

Другим преимуществом конъюгатов пептид - малеинимид - альбумин является воспроизводимость, обусловленная соотношением пептида к альбумину 1:1 специфически по остатку Сук₃₄. Обычные методы активации, например, с помощью глутаральдегида, ИСС, БОС и других химических активаторов, например свободных аминов, не дают возможности достичь такой селективности. Например, альбумин содержит 52 остатка лизина, 25-30 из которых локализовано на поверхности альбумина и доступно для конъюгирования. Активирование этих остатков лизина или же модификация пептида в пару за счёт этих остатков лизина приводит к гетерогенной популяции конъюгатов. Даже если применяется эквимолярное соотношение пептид: альбумин (т.е. 1:1), конечный результат - это случайные продукты конъюгации, причём некоторые из них содержат неопределённое число пептидов, связанных с каждой молекулой альбумина, и каждый конъюгат содержит пептиды, произвольно соединённые по любому из 25-30 подходящих сайтов лизина. Соответственно, точная характеристика композиции фактически невозможна, не говоря об отсутствии воспроизводимости. Кроме того, хотя может показаться, что конъюгация за счёт лизиновых остатков альбумина даёт, по меньшей мере, преимущество при доставке большего количества терапевтического агента на молекулу альбумина, исследования показали, что предпочтительным является соотношение терапевтического агента и альбумина, равное 1:1. В статье 31еЫе, е1 а1. в Апйсапсег Эгидк, 1997, 8, 677-685 сообщается, что отношение противоракового метотрексата к альбумину, конъюгированному через глутаральдегид, даёт наиболее обещающие результаты. Эти конъюгаты поглощаются опухолевыми клетками, тогда как конъюгаты, несущие молекулы метотрексата от 5:1 до 20:1, изменяют ВЭЖХхроматограмму и быстро поглощаются в печени ίη νίνο. Следовательно, по-видимому, при более высоких соотношениях эффективность альбумина в качестве носителя терапевтического агента уменьшается.

С помощью регулируемого введения производного пептида ГПП-2 по данному изобретению, и в особенности пептида ГПП-2, содержащего реакционноспособный малеинимидный фрагмент, можно регулировать специфическое ίη νίνο мечение или связывание альбумина и 1дС. Показано, что при типичном введении 80-90% вводимого пептидного производного связывается с альбумином и менее 5% связывается с 1дС. Также имеются следовые количества связывания свободных тиолов, таких как глутатион. Такое специфическое связывание предпочтительно для применения ίη νίνο, так как оно позволяет точно рассчитывать оцениваемый период полужизни вводимого терапевтического агента.

Малеинимид - замещённые пептиды ГПП-2, как правило, совершенно устойчивы в водных растворах и в присутствии свободных аминов. Так как малеинимид - замещённые пептиды ГПП-2 реагируют со свободными тиолами, для предотвращения их реакции с самими собой не нужны защитные группы.

Нужные конъюгаты производных ГИП-2 с компонентами крови можно получать ίη νίνο, вводя производные непосредственно субъекту, который может быть животным или человеком. Введение можно

- 7 006160 осуществлять в виде болюса или можно вводить медленно во времени с помощью инфузии с определённой скоростью тока и т.п.

Или же конъюгат можно получать также ех νίνο, объединяя кровь или продажные очищенные компоненты крови с производным ГИИ-2 по данному изобретению, что даёт возможность ковалентного связывания производного ГИИ-2 по функциональным группам компонентов крови, а затем возвращение или введение конъюгированной крови или конъюгированного очищенного компонента крови хозяину. Кроме того, вышеописанное можно выполнять, сначала очищая индивидуальный компонент или ограниченное число компонентов, таких как эритроциты, иммуноглобулины, сывороточный альбумин и т.п., и объединяя этот компонент или эти компоненты с соединением по данному изобретению ех νίνο. Меченая кровь или меченый компонент крови можно затем возвратить субъекту, чтобы в условиях ίη νίνο иметь терапевтически эффективные конъюгаты. Кровь можно также обработать, чтобы предотвратить коагуляцию во время операций ех νίνο.

Пептидный синтез

Иептиды ГИИ-2 можно синтезировать стандартными методами твёрдофазного пептидного синтеза, хорошо известными любому рядовому специалисту в данной области техники. Например, пептид можно синтезировать методами твердофазного пептидного синтеза, описанными 31е\уагб с1 а1. в δοϊίά Рйаке Рерббе 8уп1йек1к, 2'¹ Еб., Р1егсе Сйеш1са1 ί,’οιηραην. Ροο1<Γογ6. III., (1984), используя синтезатор Кшшп РТ1 Зутр^пу. Аналогично пептидные фрагменты можно синтезировать, а затем объединить или связать вместе с образованием более протяжённого пептида (сегментная конденсация). Эти синтетические пептидные фрагменты также можно получать с аминокислотными заменами в специфических положениях.

Обзор многих методов твердофазного пептидного синтеза можно найти в §1е^атб е1 а1. в 8ο1ί6 Рйаке Рерббе 8упШек1к, XV. Н. Ртеетап Сц. (Зап Επιπά^ο), 1963 и Μе^еη11οΓе^. Ηο^тοηа1 РгоЮшк апб Рерббек, 1973, 2 46. О классическом синтезе в растворе см., например, Зсйгобет е1 а1., в ТНе Рерббек, νο1ите 1, Лсабепйс Ргекк (№\ν Υογ1<). Как правило, такие методы включают последовательное присоединение одной или более аминокислот или защищённых соответствующим образом аминокислот к наращиваемой пептидной цепи полимера. Обычно либо аминогруппу, либо карбоксильную группу первой аминокислоты защищают с помощью соответствующей защитной группы. Защищённую и/или дериватизированную аминокислоту затем либо иммобилизуют на инертном твёрдом носителе, либо используют в растворе, добавляя следующую аминокислоту в последовательности, содержащую комплементарную (амино или карбоксильную) группу, соответствующим образом защищённую и в условиях, подходящих для образования амидной связи. Затем защитную группу удаляют с этого вновь образованного остатка добавляемой аминокислоты и добавляют следующую аминокислоту (соответствующим образом защищённую) и т.д.

Иосле того как все нужные аминокислоты соединены в соответствующей последовательности, последовательно или одновременно удаляют все оставшиеся защитные группы (и весь твёрдый носитель) и получают конечный полипептид. Иростой модификацией этой общей методики можно добавлять к наращиваемой цепи более одной аминокислоты за определённое время, например, соединяя (в условиях, в которых хиральные центры не рацемизируются) защищённый трипептид с защищённым соответствующим образом дипептидом, при этом образуется после депротекции пенталептид (сегментная конденсация).

Особенно предпочтительный способ получения производных ГИИ-2 по данному изобретению включает твёрдофазный пептидный синтез, причём аминокислотный α-Ν-конец защищён группой, чувствительной к кислоте или к основанию. Такие защитные группы должны быть устойчивыми к условиям образования пептидной связи, в то же время они должны легко сниматься без нарушения растущей пептидной цепи или рацемизации какого-либо хирального центра, содержащегося в ней. Иримеры Νзащитных групп и карбокси-защитных групп приведены в монографии Сгеепе, Рго1есбуе Огоирк 1п Огдашс 8уп1йек1к, (Ιο1ιπ ΧνίΕν & δοιτ^ №\ν Υογ1< рр. 152-186 (1981)), которая вводится в данное описание в качестве ссылки. Примеры Ν-защитных групп включают, без ограничения, низшие алканоильные группы, такие как формил, ацетил (Ас), пропионил, пивалоил, трет.-бутилацетил и т.п.; другие ацильные группы включают 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, о-нитрофеноксиацетил, -хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4-нитробензоил и т.п.; сульфонильные группы, такие как бензолсульфонил, п-толуолсульфонил, о-нитрофенилсульфонил, 2,2,5,7,8пентаметилхроман-6-сульфонил (ртс) и т.п.; группы, образующие карбаматы, такие как третамилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, пнитробензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-этоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1-(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил, а,а-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил φοΑ диизопропилметоксикарбонил, изопропил-оксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, фторфенил-9-метоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил и т.п.; арилалкильные

- 8 006160 группы, такие как бензил, бифенилизопропилоксикарбонил, трифенилметил, бензилоксиметил, 9-флуоренилметилоксикарбонил (Втос) и т.п., и силильные группы, такие как триметилсилил и т.п. Предпочтительными α-Ν-защитными группами являются о-нитрофенилсульфенил; 9-флуоренилметилоксикарбонил; трет-бутоксикарбонил (Ьос), изоборнилоксикарбонил; 3,5-диметоксибензилоксикарбонил; трет-амилоксикарбонил; 2-циано-трет-бутилоксикарбонил и т.п., более предпочтительной группой является 9-фторфенилметилоксикарбонил (Ртос), тогда как предпочтительными Ν-защитными группами боковой цепи являются 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (ртс), нитро, п-толуолсульфонил, 4метоксибензолсульфонил, СЬх. Вос и адамантилоксикарбонил - для аминогрупп боковых цепей, таких как лизин и аргинин; бензил, о-бромбензилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензил, изопропил, трет-бутил (трет-Ви), циклогексил, циклопентил и ацетил (Ас) для тирозина; трет-бутил, бензил и тетрагидропиранил для серина; тритил, бензил, СЬх, п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил для гистидина; формил для триптофана; бензил и трет-бутил для аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и трифенилметил (тритил) для цистеина.

Выражение защитная группа для карбоксильной группы обычно относится к защитной сложноэфирной или амидной группе. Такие карбокси-защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники, они широко применяются для защиты карбоксильных групп в химии пенициллина и цефалоспоринов, как описано в патентах США 3840556 и 3719667. Репрезентативные карбоксизащитные группы включают, без ограничения, низший алкил С₁-С₈; арилалкил, такой как фенетил или бензил, и их замещённые производные, такие как алкоксибензильная или нитробензильная группы; арилалкенил, такой как фенилэтенил; арил и его замещённые производные, такие как 5-инданил; диалкиламиноалкил, такой как диметиламиноэтил; алканоилоксиалкильные группы, такие как ацетоксиметил, бутирилоксиметил, валерилоксиметил, изобутирилоксиметил, изовалерилоксиметил, 1-(пропионилокси)1-этил, 1-(пивалоилоксил)-1-этил, 1-метил-1-(пропионилокси)-1-этил, пивалоилоксиметил, пропионилоксиметил; циклоалканоилоксиалкильные группы, такие как циклопропилкарбонилоксиметил, циклобутилкарбонилоксиметил, циклопентилкарбонилоксиметил циклогексилкарбонилоксиметил; ароилоксиалкил, такие как бензоилоксиметил, бензоилоксиэтил; арилалкилкарбонилоксиалкил, такой как бензилкарбонилоксиалкил, 2-бензилкарбонилоксиэтил; алкоксикарбонилалкил или циклоалкилоксикарбонилалкил, такой как метоксикарбонилметил, циклогексилоксикарбонилметил, 1-метоксикарбонил-1-этил; алкоксикарбонилоксиалкил или циклоалкилоксикарбонилоксиалкил, такой как метоксикарбонилоксиметил, трет-бутилоксикарбонилоксиметил, 1-этоксикарбонил-1-этил, 1-циклогексилоксикарбонилокси-1-этил; арилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(феноксикарбонил-окси)этил, 2-(5-инданилоксикарбонилокси) этил; алкоксиалкилкарбонилоксиалкил, такой как 2-(1-метокси-2-метилпропан-2-оилокси)этил; арилалкилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(бензилоксикарбонилокси)этил; арилалкенилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(3-фенилпропен-2-илоксикарбонилокси)этил; алкоксикарбониламиноалкил, такой как трет-бутоксикарбониламинометил; алкиламинокарбониламиноалкил, такой как метиламинокарбониламинометил; алканоиламиноалкил, такой как ацетиламинометил; гетероциклилкарбонилоксиалкил, такой как 4-метилпиперазинилкарбонилоксиметил; диалкиламинокарбонилалкил, такой как диметиламинокарбонилметил, диэтиламинокарбонилметил; (5-(низший алкил)-2-оксо-1,3-диоксолен-ил)алкил, такой как (5-трет-бутил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)метил; и (5-фенил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)алкил, такой как (5-фенил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)метил. Репрезентативные амидные карбоксизащитные группы включают, без ограничения, аминокарбонильные и низшие алкиламинокарбонильные группы. Из вышеприведённых карбокси-защитных групп предпочтительными являются сложноэфирные группы, низшие алкиловые, циклоалкиловые или арилалкиловые, например метиловый эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, изопропиловый эфир, бутиловый эфир, вт-бутиловый эфир, изобутиловый эфир, амиловый эфир, изоамиловый эфир, октиловый эфир, циклогексиловый эфир, фенилэтиловый эфир и т.п., или алканоилоксиалкиловый эфир, циклоалканоилоксиалкиловый эфир, ароилоксиалкиловый эфир или арилалкилкарбонилоксиалкиловый эфир. Предпочтительными амидными карбокси-защитными группами являются (низший алкил)аминокарбонильные группы.

По методу твердофазного пептидного синтеза α-С-концевую аминокислоту прикрепляют (иммобилизуют) к соответствующему твёрдому носителю или полимеру. Подходящие твёрдые носители, применимые для вышеуказанного синтеза, представляют собой материалы, инертные в отношении реагентов и условий постадийного проведения реакций конденсации - снятия защиты, а также нерастворимые в применяемых средах. Предпочтительным твёрдым носителем (подложкой) для синтеза α-С-концевых карбоксипептидов является сополимер 4-гидроксиметилфеноксиметила с 4'-метилбензгидриламином (полимер НМР). Предпочтительным твёрдым носителем (подложкой) для синтеза α-С-концевых амидопептидов является полимер Етос-защищённый полимер Ватаде.

Если твёрдым носителем является полимер 4-(2',4'-диметоксифенил-Ртос-аминометил)феноксиацетамидоэтила, Ртос-группа отщепляется вторичным амином, предпочтительно, пиперидином, прежде, чем полимер соединится с α-С-концевой аминокислотой, как описано выше. Предпочтительным методом присоединения к полимеру 4-(2',4'-диметоксифенил-Ртос-аминометил)феноксиацетамидоэтила после снятия защиты является реакция в присутствии О-бензотриазол-1-ил-^^№,№-тетраметилуроний- 9 006160 гексафторфосфата (ΗΒΤϋ, 1 экв.), диизопропилэтиламина (ΌΙΕΑ, 1 экв.) и, необязательно, 1-гидроксибензотриазола (НОВТ, 1 эквив.), в ДМФА. Присоединение последовательно защищаемых аминокислот можно проводить в автоматическом синтезаторе полипептидов обычным методом, хорошо известным в технике.

Снятие Гтое-защитной группы с α-Ν-концевой стороны наращиваемого пептида выполняют обычным способом, например обработкой вторичным амином, предпочтительно пиперидином. Каждую защищённую аминокислоту затем вводят примерно в 3^х-кратном молярном избытке и присоединение предпочтительно проводят в ДМФА. Конденсирующим агентом обычно является О-бензотриазол-1-илΝ,Ν,Ν',Ν'-тетраметилуронийгексафторфосфат (ΗΒΤυ, 1 экв.), диизопропилэтиламин (ΌΙΕΑ, 1 экв.) и, необязательно, 1-гидроксибензотриазол (НОВТ, 1 экв.).

В конце твердофазного синтеза пептид снимают с полимера и снимают защиту либо последовательно, либо одновременно. Удаление полипептида и снятие защиты можно осуществлять обычным способом в виде одной операции обработкой связанного с полимером полипептида расщепляющим реагентом, содержащим тиоанизол, триизопропилсилан, фенол и трифторуксусную кислоту. В случаях, когда α-С-конец полипептида представляет собой алкиламид, смолу отщепляют аминолизом алкиламином. Или же пептид можно удалять переэтерификацией, например, метанолом с последующим аминолизом или прямым переамидированием. Защищённый пептид можно очищать на этой стадии или непосредственно брать в следующую стадию. Удаление защитных групп боковой цепи выполняют, используя описанную выше смесь для отщепления. Полностью защищённый пептид можно очищать с помощью последовательных хроматографических операций, используя все приведённые ниже виды хроматографии или любой из них: ионообменную хроматографию на слабоосновных смолах (ацетатная форма); гидрофобную адсорбционную хроматографию на недериватизированном сополимере полистирола с дивинилбензолом (таком как АтЬегШс ΧΑΌ™); адсорбционную хроматографию на силикагеле; ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе; распределительную хроматографию, например, на 8ерйабех С-25™, ЬН-2-™ или противоточное распределение; высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), в особенности обращённо-фазовую ВЭЖХ на колонке с октил- или октадецилсилил силикагелем в качестве наполнителя. Любой рядовой специалист в данной области техники способен легко определить, какие предпочтительные хроматографические стадии или последовательности требуются для получения приемлемой степени очистки ГИИ-2 пептида.

Молекулярные веса этих пептидов определяют квадрупольной масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением.

Процесс синтеза производных ГПП-2 по данному изобретению меняется в широких пределах в зависимости от природы различных элементов, т.е. последовательности ГПП-2, связывающей группы и реакционноспособной группы, имеющейся в производном ГПП-2. Методики синтеза выбирают так, чтобы обеспечить простоту, высокий выход и воспроизводимость, а также получить продукт высокой степени чистоты. Обычно присоединение за счёт химически реакционноспособной группы происходит на последней стадии синтеза, например в случае карбоксильной группы осуществляют этерификацию с образованием активного сложного эфира. Конкретные методы получения производных ГПП-2 по данному изобретению приводятся ниже.

Требованием является то, что химически реакционноспособная группа должна быть расположена в таком сайте, который даёт возможность пептиду связываться ковалентной связью с компонентом крови, сохраняя при этом основную часть активности и/или полезного действия, если не всю активность и не все полезные свойства, нативного ГПП-2 пептида.

В более предпочтительном варианте каждое производное ГПП-2 синтезируют в соответствии со следующими критериями: если концевая карбоксильная группа пептида доступна и не является важной для сохранения фармакологической активности и никакой другой чувствительной функциональной группы в пептиде не имеется, тогда в качестве места прикрепления модификации связывающая группа реакционноспособная группа выбирают карбоксильную группу. Если концевая карбоксильная группа связана с фармакологической активностью или ни одна из карбоновых кислот не доступна, тогда в качестве места прикрепления модификации связывающая группа - реакционноспособная группа выбирают любую другую чувствительную функциональную группу, не являющуюся важной для сохранения фармакологической активности. Если в пептиде доступными являются несколько чувствительных функциональных групп, используют сочетание защитных групп таким образом, чтобы после соединения связывающей группы/реакционноспособной группы и депротекции всех чувствительных функциональных групп по-прежнему сохранялась фармакологическая активность. Если в пептиде отсутствуют доступные чувствительные функциональные группы, то применяют синтетические методы для такой модификации исходного пептида, которая бы позволила сохранить биологическую активность исходного пептида и рецепторную специфичность и специфичность в отношении мишени. В этом случае модификацию, предпочтительно, осуществляют на противоположном конце пептида.

В соответствии с данным изобретением производные ГПП-2 можно вводить больным, которым помогает рост тканей верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Кроме того, больных, которым помо- 10 006160 гает улучшение функции верхних отделов желудочно-кишечного тракта в результате повышения роста тканей или по другой причине, также можно лечить методами по данному изобретению. Как правило, больные, которым помогает повышенная масса верхних отделов желудочно-кишечного тракта и/или повышенная функция слизистой верхних отделов желудочно-кишечного тракта, являются кандидатами на лечение производными ГПП-2 пептида ГПП-2. Конкретные состояния, которые можно лечить с помощью производных пептида ГПП-2 по данному изобретению, включают различные формы воспалительных заболеваний желудка или пищевода, а также можно лечить больных, перенесших частичную или неполную резекцию верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Неполный список состояний верхних отделов желудочно-кишечного тракта, включающих желудок и пищевод, которые можно лечить производными ГПП-2 по данному изобретению или их смесями, содержит заболевания желудка, такие как острый гастрит, острый геморрагический гастрит, острый гастрит при стрессе, вирусный гастрит, гастрит при паразитарных инфекциях, грибковый гастрит, гастропатия (острая), геморрагическая гастропатия, острый геликобактерный гастрит (вызванный Не11соЬас1ег ρνίοπ). гастрит типа А, В и С, гиперсекреторный гастрит, неспецифический гастрит, вторичный по отношению к геликобактерному (НейсоЬас1сг ρνίοπ), химический гастрит, реактивный гастрит, рефлюкс-гастрит, желчный гастрит, метапластический атрофический гастрит, метапластический атрофический гастрит под влиянием окружающей среды, идиопатический пангастрит, диффузный гастрит тела желудка, аутоиммунный хронический гастрит, аутоиммунно-связанный гастрит, бактериальный гастрит, иной нежели геликобактерный (Оазгозрш11ит Ιιοιηίπίδ, флегмонозный, вызванный микобактериальной инфекцией, сифилитический), атрофический гастрит после антрэктомии, эозинофилический гастрит и любые другие острые инфекционные гастриты; болезнь Крона, саркоидоз, отдельный гранулёматозный гастрит, лимфоцитарный гастрит, болезнь Менетрие и т. д., и болезни пищевода, такие как инфекционный эзофагит, вызванный грибками, такими как СапФба зрес1ез (в особенности, а1Ь1сапз), АзрагадШиз зр., Н1з1ор1азта сарзи1а1ит, В1аз1отусез бегтаДйбез, или вирусами, такими как вирус простого герпеса (типа 1), цитомегало-вирус, вирус УапсеИа-ховКг, или бактериями, такими как М1соЬас1егшт 1иЬегси1оз1з, АсДпотусез 1згае1и, 8!гер1ососсиз утбапз, Ьас1оЬасШиз ааборЫ1из, и Тгеропета ра11абшт. Другие нарушения пищевода включают, без ограничения, неинфекционный эзофагит, рефлюкс кислоты, рефлюкс желчи, химическое поражение (вызванное лекарственными препаратами, токсинами, кислотами, щелочами и т.д.), саркоидоз, болезнь Крона, болезнь Бехчета, гомологичная болезнь, инфекции, родственные СПИД (СпрШзропбшт зр., Мюгозропбшт зр., 1зозрога ЬеШ, С1агШа ЬатЬйа, 8а1топе11а зр., Сатру1оЬас1ег зр., МусоЬас1егшт 1иЬегси1оз1з, МусоЬас1егшт аущт сот1ех, С1оз1пбшт ЩГПсПе, цитомегаловирус и вирус простого герпеса).

Другие заболевания или состояния, которые можно лечить производными пептида ГПП-2 по данному изобретению, включают нарушения слизистой тонкого кишечника, которые охватывают язвы и воспаления; нарушения врождённого или приобретённого переваривания и всасывания пищи, включая синдромы мальабсорбции; и заболевания и состояния, вызванные утратой функции слизистой тонкого кишечника, в частности у больных, которых в течение длительного времени кормили парентерально, или у больных, у которых с помощью хирургической операции проведена резекция тонкого кишечника и которые страдают синдромом укороченного тонкого кишечника и синдромом слепого мешка. Как правило, больные, которым становится лучше при любом увеличении интестинальной массы и последующем повышении функции слизистой тонкого кишечника, являются кандидатами на лечение с помощью производных пептида ГПП-2. Конкретные состояния, которые можно лечить производными ГПП-2 по данному изобретению, включают различные формы мальабсорбции, включая брюшную мальабсорбцию, которая является результатом токсической реакции на глиадин пшеницы и отличается значительной потерей ворсинок в тонком кишечнике; тропический синдром мальабсорбции, являющийся результатом инфекции и отличающийся частичным сглаживанием ворсинок; спру (мальабсорбцию), которую обычно наблюдают у больных с общим изменчивым иммунодефицитом или с агаммаглобулинемией и которая отличается значительным уменьшением высоты кишечной ворсинки. Другие состояния, которые можно лечить производными по данному изобретению или для профилактики которых эти производные могут применяться, включают радиационный энтерит, инфекционный или послеинфекционный энтерит, регионарный энтерит (болезнь Крона), поражение тонкого кишечника в результате действия токсических или других химиотерапевтических агентов, а также синдром укороченного тонкого кишечника.

В другом аспекте больными, которых можно лечить производными ГПП-2 пептида по данному изобретению, являются такие больные, которым становится лучше в результате роста панкреатических островков и, в частности, в результате пролиферации или регенерации панкреатических островков. Такие пациенты включают больных, страдающих заболеваниями или состояниями, отмеченными отсутствием или уменьшением панкреатических островков или пониженной функцией панкреатических островков. Особую группу кандидатов на такое лечение представляют собой больные, страдающие диабетом типа 1 или типа 2, а также больные со вторичными формами диабета вследствие инфильтрации, воспаления или разрушения поджелудочной железы.

Производные ГПП-2 по данному изобретению можно применять индивидуально или в комбинации для оптимизации их терапевтического действия. Их можно вводить в физиологически приемлемой среде, например в деионизированной воде, физиологическом растворе с фосфатньм буфером (РВ8), физиологи- 11 006160 ческом растворе, водном этаноле или водном растворе другого спирта, плазме, белковых растворах, манните, водной глюкозе, спирте, растительном масле и т.п. Другие добавки, которые могут быть включены, содержат буферы, рН среды которых обычно забуферивают таким образом, чтобы значения их рН были в примерном интервале от 5 до 10, в которых концентрация буфера составляет около 50-250 мМ, а концентрация соли обычно находится в интервале около 5-500 мМ, физиологически приемлемые стабилизаторы и т.п. Композиции могут быть лиофилизированы для удобства хранения и транспортировки.

Пептидные производные по данному изобретению можно вводить перорально, парентерально, например интраваскулярно (внутрисосудистая инъекция, IV, ВС), внутриартериально (ΙΑ, ВА), внутримышечно (ΙΜ, ВМ), подкожно (8С) и т.п. В соответствующих ситуациях можно вводить в виде вливания. В некоторых случаях, когда функциональная группа реагирует довольно медленно, можно применять пероральное, назальное, ректальное, трансдермальное введение, введение в виде аэрозолей, если природа конъюгата позволяет перенос в сосудистую систему. Обычно применяют единичную инъекцию, хотя, в случае необходимости, можно делать более одной инъекции. Пептидное производное можно вводить обычными средствами, включая шприц, троакар, катетер и т.п. Конкретный способ введения меняется в зависимости от вводимого количества, от того, нужна ли единичная болюсная инъекция или продолжительное введение и т.п. Предпочтительно, введение является внутрисосудистым, если место введения не является важным для данного изобретения, предпочтительно в место, где быстрый ток крови, например, внутривенно, в периферическую или центральную вену. Могут найти применение другие способы, при которых используют пролонгированное введение или защитную матрицу. Целью является эффективное распределение пептидов в крови так, чтобы они могли реагировать с компонентами крови. Концентрация конъюгата изменяется в очень широких пределах, как правило, около 1 пг/мл - 50 мг/мл. При внутрисосудистом введении общее количество вводимого пептида составляет, как правило, около 0,1 мг/мл - 10 мг/мл, более часто около 1 мг/мл - 5 мг/мл.

Связывание с долгоживущими компонентами крови, такими как иммуноглобулин, сывороточный альбумин, эритроциты и тромбоциты, обеспечивает ряд преимуществ. Активность ГПП-2 производных по данному изобретению пролонгируется до дней и, возможно, до недель. В течение этого времени требуется лишь однократное введение. Можно достичь более высокой специфичности, так как активное соединение сначала связывается с большой молекулой, которая с меньшей вероятностью поглощается клеткой, чтобы помешать другим физиологическим процессам.

Кровь хозяина - млекопитающего можно проверять на активность ГПП-2 и/или присутствие производных ГПП-2. Беря часть или пробу крови хозяина в разное время, можно определить, связался ли ГИП2 с долгоживущими компонентами крови в достаточном количестве, чтобы быть терапевтически активным, а затем, уровень ГПП-2 в крови. Если требуется, можно также определить, с каким из компонентов крови ковалентно связан ГПП-2 пептид. Для конкретных малеинимидзамещённых пептидов значительно проще вычислить период полужизни сывороточного альбумина и 1дО. Мониторинг также можно осуществлять, применяя анализы пептидной активности, ВЭЖХ - масс-спектрометрию (Μ8) или антитела к пептидам.

Другой аспект данного изобретения относится к способам определения концентрации ГПП-2 пептида или его конъюгата в биологических образцах (таких как кровь) с применением антител, специфических в отношении ГПП-2 пептидов, и к применению таких антител для преодоления токсичности, вероятно, обусловленной такими ГПП-2 пептидами или конъюгатами. Это является преимуществом, так как повышенная устойчивость и продолжительное существование производных ГПП-2 ίη νίνο в организме больного может вызвать новые проблемы в процессе лечения, включая повышенную вероятность токсичности. Применение антител против ГПП-2, моноклональных или поликлональных, специфических в отношении ГПП-2, может помочь решить любую подобную проблему. Антитело может быть генерировано или получено от хозяина, иммунизированного конкретным производным ГПП-2, или иммуногенным фрагментом агента, или синтезированным иммуногеном, соответствующим антигенной детерминанте агента. Предпочтительные антитела обладают высокой специфичностью и сродством (аффинностью) к нативной, дериватизированной и конъюгированной формам ГПП-2 пептидного производного. Такие антитела можно также метить ферментами, флуорохромами или радиоактивными метками.

Антитела, специфические в отношении производных ГПП-2, можно получать, используя очищенные пептиды для индукции антител, специфических в отношении дериватизированных ГПП-2. Под индукцией антител понимается не только стимуляция иммунного ответа с помощью инъекции животному, но аналогичные стадии при получении синтетических антител или других специфических связывающих молекул, например скрининг библиотек рекомбинантных иммуноглобулинов. Как моноклональные, так и поликлональные антитела можно получать по методикам, хорошо известным в технике.

Антитела могут также использоваться для мониторинга присутствия ГПП-2 пептида в кровотоке.

Образцы крови и/или сыворотки можно анализировать методом 8Ό8-ΡΑΟΕ и вестерн-блоттингом. Такие методы позволяют анализировать кровь или сыворотку для определения связывания производного ГПП2 с компонентами крови.

Антитела к антитерапевтическому агенту можно также использовать для лечения токсичности, вызванной введением производного ГПП-2, их можно вводить ех νίνο или ίη νίνο. Методы ех νίνο включа- 12 006160 ют иммунно-диализное лечение токсичности с применением антител к антитерапевтическому агенту, иммобилизованных на твёрдом носителе. Методы ίη νίνο включают введение антител к антитерапевтическому агенту в количествах, эффективных для индукции клиренса комплексов антитело-агент.

Антитела можно использовать для удаления производных ГПП-2 и их конъюгатов из крови больных ех νίνο при контактировании крови с антителами в стерильных условиях. Например, антитела можно прикреплять или иным образом иммобилизовать на носителе в колонке, и у больного можно взять кровь и пропустить через колонку. Производные ГПП-2 свяжутся с антителами, и кровь, содержащую небольшую концентрацию производного ГПП-2, можно затем снова ввести в кровоток больного.

Количество отбираемого производного ГПП-2 можно контролировать, регулируя давление и скорость тока. Предпочтительного удаления производного ГПП-2 из компонента плазмы крови больного можно достигнуть, например, используя полупроницаемую мембрану или, иначе, сначала отделяя компонент плазмы от клеточного компонента способами, известными в технике, перед тем как пропускать компонент плазмы через колонку с носителем, содержащим антитела к терапевтическим агентам. Или же предпочтительного удаления производного ГПП-2, конъюгированного с клетками крови, включая эритроциты, можно достичь, собирая и концентрируя клетки крови больного и затем осуществляя контактирование этих клеток с фиксированными антителами против пептида для исключения компонента сыворотки крови больного.

Антитела против ГПП-2 можно вводить ίη νίνο, парентерально, больному, который получал в качестве лечения ГПП-2 производное или конъюгат. Антитела связываются с ГПП-2 производным или конъюгатами. Связывание ГПП-2 производного препятствует его активности, если не полностью блокирует её, тем самым уменьшая биологически активную концентрацию производного ГПП-2 в кровотоке больного и сводя к минимуму побочные эффекты. Кроме того, связанный комплекс антитело -ГПП-2 облегчает клиренс производного ГПП-2 и конъюгатов из кровотока больного.

Следующие примеры приводятся для иллюстрации предпочтительных вариантов изобретения, и их ни в коей мере нельзя рассматривать как ограничивающие его объём. Если не указано иначе, используют оптически активные защищённые аминокислоты в Ь-конфигурации.

Синтез

Синтез пептидов ГПП-2 и их производных осуществляют по методике автоматизированной твердофазной реакции в синтезаторе пептидов Зутрйопу™ с ручным вмешательством при получении производных ГПП-2. Синтез проводят на Ешое-защищённой Яатаде™ амидной линкерной смоле, используя Ешое-защищённые аминокислоты. Присоединение осуществляют с помощью О-бензотриазол-1-илΝ,Ν,Ν',Ν'-тетраметилуронийгексафторфосфата (ΗΒΤϋ) в качестве активатора в растворе Ν, Νдиметилформамида (ДМФА) и диизопропилэтиламина (Э1ЕА) в качестве основания. Защитную группу Етос удаляют с помощью 20% раствора пиперидина в ДМФА. При необходимости, для получения свободного Νο,-конца после отщепления пептида от полимера на Ν конце используют Вос-защищённую аминокислоту. Если не указано иначе, все используемые в синтезе аминокислоты имеют Ьконфигурацию. Для синтеза используют стеклянные реакционные сосуды, которые покрывают раствором для силиконизирования (81§тасо1еб™).

Пример 1.

Н18-А1а-А8р-С1у-8ег-Рйе-8ег-А8р-61и-Ме1-А8п-Тйг-Пе-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А8р-Рйе-ПеА8п-Тгр-Ьеи-11е-С1п-Тйт-Ьу8-11е-Тйг-А8р-СОПН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты: Етос Авр(1Ви)-ОН, Етос-Тйт(1Ви)-ОН, Етос11е-ОН, Етос-Ьу8(Вос)-ОН, Етос-Тйт(1Ви)-ОН, Етос-С1п(Тй)-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-Ьеи-ОН, ЕтосТгр(Вос)-ОН, Етос-Азп(Тг1)-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-Рйе-ОН, Етос-Авр(1Ви)-ОН, Етос-Агд(РЫ)-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос А1а-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Азп(Тг1)-ОН, Етос-Л8р(1-Ви)-ОН. Етос-Ьеи-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-Тйт(1Ви)-ОН, Етос-Авп(Тт1)-ОН, Етос-Ме1-ОН, Етос-С1и(1Ви)-ОН, Етос-Авр(1Ви)ОН, Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-Рйе-ОН, Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-С1у-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-А1аОН, Вос-Н18(Вос)-ОН. Их растворяют в Ν,Ν-диметилформамиде (ДМФА) и в, соответствии с последовательностью, активируют, используя О-бензотриазол-1-ил-Л^,№,№-тетраметилуроний-гексафторфосфат (НВТИ) или диизопропилэтиламин (Э1ЕА). Удаление Етос защитной группы осуществляют с помощью 20 об.% раствора пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде (ДМФА) в течение 20 мин.

Стадия 2. Пептид снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% Т18/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением охлаждаемым сухим льдом (0-4°С) ЕьО. Сырой пептид собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый в процессе очистки.

Пример 2.

МРА -Н|5-А1а-А5р-С1у-8ег-Р11е-8ег-А5р-С1и-Ме1-А5р-Т11г-11е-Ьеи-А5р-А5п-Ьеи-А1а-А1а-Аг8-А5р-Р11е11е-А8п-Тгр-Ьеи-11е-С1п-Тйг-Ьу8-11е-Тйг-А8р-СОПН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты: Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-Тйт(1Ви)-ОН, Етос- 13 006160

11е-ОН, Ртос-Ьу8(Вос)-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос-С1п(Тг1)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, РтосТгр(Вос)-ОН, Ртос-Л§п(Тг1)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Лгд(РЫ)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос А§р(1Ви)-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос11е-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-Ме1-ОН, Ртос-С1и(1Ви)-ОН, Ртос-А§р(1Ви)-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-А§р(1Ви)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Вос -Нщ(Вос)-ОН, МРА-ОН.

Стадия 2. Эту стадию осуществляют аналогично стадии 2 из примера 1.

Пример 3.

Н18-А1а-А8р-С1у-8ег-Рйе-8ег-А8р-С1и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А5р-Рйе-11еА8п-Тгр-Ьеи-11е-С1п -Тйг-Ьу8-11е-Тйг-А8р-Ьу8(МРА)-СОИН₂

Стадия 1. Эту стадию осуществляют так же как стадию 1 примера 1, см. выше, за исключением того, что первая кислота, добавляемая к полимерному носителю, представляет собой Ртос-Ьу§(А1ос)-ОН.

Стадия 2. Селективную депротекпию Ьу§ (А1ос) группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая полимер раствором 3 экв. Рб(РРй₃)₄ в 5 мл С₆Н₆:СНС1₃ (1:1): 2,5 об.% ИММ: 5 об.% АсОН в течение 2 ч. Затем полимер промывают СНС1₃ (6 х 5 мл), 20% АсОН в ЬСМ (в хлористом метилене, 6х5 мл) ЬСМ (6х5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл).

Стадия 3. Синтез снова автоматизируют для прибавления 3-малеинимидо-пропионовой кислоты (МРА). Между прибавлениями (присоединениями) смолу три раза промывают Ν,Ν-диметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом.

Стадия 4. Производное снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% Т18/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением охлаждаемым сухим льдом (0-4°С) ЕьО. Сырой продукт - производное - собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки.

Пример 4.

Н18-А1а-А8р-С1у-8ег-Рйе-8ег-А8р-С1и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-Ьу8(МРА)-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А8р-Рйе11е-А8п-Тгр-Ьеи-11е-С1п -Тйг-Ьук-Пе-Тйг-Акр- ОИН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты в соответствии с методикой, описанной на стадии 1 примера 1: Ртос-А§р(1Ви)-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьу§(Вос)-ОН, РтосТйг(1Ви)-ОН, Ртос-С1п(Тй)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-Тгр(Вос)-ОН, Ртос-А§п(Тп)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-А§р(1Ви)-ОН, Ртос-Агд(РЫ)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос А1а-ОН, РтосЬеи-ОН, Ртос-Ьу§(А1ос)-ОН, Ртос-А8р(1-Ви)-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, РтосА§п(Тп)-ОН, Ртос-Ме1-ОН. Ртос-С1и(1Ви)-ОН, Ртос-А§р(1Ви)-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос- 8ег(1Ви)-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Вос-Н18(Вос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят как описано в примере 3, стадии 2-4.

Пример 5. Н18-С1у-А8р-С1у-8ег-Рйе-8ег-А8р-С1и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А8рРйе-11е-А8п-Тгр-Ьеи-11е-С1п -Тйг-Ьу8-11е-Тйг-А8р-СОИН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты в соответствии с методикой, описанной на стадии 1 примера 1: Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьу§(Вос)-ОН, РтосТйг(1Ви)-ОН, Ртос-61п(Тй)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-Тгр(Вос)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Агд(РЫ)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос А1а-ОН, РтосЬеи-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-А8р(1-Ви)-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, РтосА§п(Тг1)-ОН, Ртос-Ме1-ОН, Ртос-С1и(1Ви)-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос- 8ег(1Ви)-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос-С1у-ОН, Вос-Нщ(Вос)-ОН.

Стадия 2. Эту стадию осуществляют аналогично стадии 2 из примера 1.

Пример 6.

МРА-Н18-С1у-А8р-С1у-8ег-Рйе-8ег-А8р-С1и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А5р-Рйе11е-А8п-Тгр-Ьеи-Не-С1п-Тйг -Ьу8-11е-Тйг-А8р-СОИН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 2, за исключением того, что остаток аланина в положении 2 заменяют на глицин.

Стадия 2. Эту стадию осуществляют аналогично стадии 2 из примера 1.

Пример 7.

Н18-С1у-А8р-С1у-8ег-Рйе-8ег-А8р-С1и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-Ьу8(МРА)-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А8р-Рйе11е-А8п-Тгр-Ьеи-11е-С1п-Тйг-Ьу8-11е- Тйг-А§р-СОИН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты в соответствии с методикой, описанной на стадии 1 примера 1: Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьу§(Вос)-ОН, РтосТйг(1Ви)-ОН, Ртос-61п(Тй)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-Тгр(Вос)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН,

Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Агд(РЫ)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос А1а-ОН, РтосЬеи-ОН, Ртос-Ьу8(А1ос)-ОН, Ртос-А8р(1-Ви)-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос- 14 006160

А5п(Тг1)-0Н. Ртос-Ме1-ОН, Ртос-С1и(1Ви)-ОН, Ртос-Л8р(1Ви)-ОН, Ртос-8ег(кВи)-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-8ег(кВи)-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-Л8р(1Ви)-ОН, Ртос-С1у-ОН, Вос-Н18(Вос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят как описано в примере 3, стадии 2-4.

Пример 8.

Н^8-С1у-Α8р-С1у-8е^-Рйе-8е^-Α8р-С1и-Меΐ-Α8η-Τй^-I1е-^еи-Α8р-Α8η-^еи-Α1а-Α1а-Α^д-Α8р-Рйе-I1еΛ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-СIη-Τй^-^у8-Не-Τй^-Λ8ρ-^у8(ΜРΛ)-СΟNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же как стадию 1 из примера 5, см. выше, за исключением того, что первая кислота, добавляемая к полимерному носителю, представляет собой Ртос-Ьу8(Л1ос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 3.

Пример 9.

Н^8-С1у-Л8р-С1у-8е^-Рйе-8е^-Л8р-С1и-Меΐ-Л8η-Τй^-I1е-^еи-Л8р-^у8(ЛЕЕЛ-МРЛ)-^еи -Л1а- Л1а -ЛгдЛкр -Рйе-Пе-Лыч-Трэ -Ьеи -11е -С1п-Тйг -Ьук -11е -ΤΡτ-Λδρ^ΟΝ^

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 7.

Стадия 2. Селективную депротекцию Ьу§ (Л1ос) группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая полимер раствором 3 экв. Рб(РРй₃)₄ в 5 мл С₆Н₆:СНС1₃ (1:1): 2,5 об.% ΝΜΜ: 5 об.% АсОН в течение 2 ч. Затем полимер промывают СНС1₃ (6 х 5 мл), 20% АсОН в ЭСМ (в хлористом метилене, 6х5 мл) ЭСМ (6х5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл).

Стадия 3. Синтез снова автоматизируют для прибавления Ртос-ЛЕЕЛ-ОН (Ртос-аминоэтоксиэтоксиуксусной кислотой). Между прибавлениями (присоединениями) смолу три раза промывают Ν,Νдиметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом. После соответствующей депротекции к спейсеру прикрепляют МРА (3-малеинимидопропионовую кислоту) и смолу снова три раза промывают Ν,Νдиметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом.

Стадия 4. Пептид снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% ΤΙ8/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением охлаждаемым сухим льдом (0-4°С) ЕРО. Сырой пептид собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки.

Пример 10.

Н^8-С1у-Λ8ρ-С1у-8е^-Рйе-8е^-Λ8ρ-С1и-Μеΐ-Λ8η-Τй^-I1е -Беи-Лкр -Λδη-Ееи -Л1а-Л1а-Лгд-Л8р-Рйе-11еΛ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-С1η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-Λ8ρ-^у8(ΛЕЕΛ-ΜРΛ)-СΟNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же как стадию 1 из примера 5, см. выше, за исключением того, что первая кислота, добавляемая к полимерному носителю, представляет собой Ртос-Еу§(Л1ос)-ОН.

Стадии 2-4: Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 9.

Пример 11. МРА-ΑЕЕΛ-Н^8-С1у-Λ8ρ-С1у-8е^-Рйе-8е^-Λ8ρ-С1и-Μеΐ-Λ8η-Τй^-I1е-^еи-Λ8ρ-Λ8η-^еиΛ1а-Λ1а-Λ^д-Λ8ρ-Рйе-I1е-Λ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-С1η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-Λ8ρ-СΟNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же как стадию 1 из примера 6, за исключением того, что в конце синтеза перед добавлением МРА-ОН к полимеру добавляют Ртос-ЛЕЕЛ-ОН.

Стадия 2. Эту стадию осуществляют аналогично стадии 2 из примера 1.

Пример 12.

МРА -ΑЕЕΛ-Н^8-Λ1а-Λ8ρ-С1у-8е^-Рйе-8е^-Λ8ρ-С1и-Μеΐ-Λ8η-Τй^-I1е -Ееи-А^р-Ащ-Ееи -Л1а-Л1а-ЛгдΛ8ρ-Рйе-I1е-Λ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-С1η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-Λ8ρ-СΟNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 1, за исключением того, что в конце синтеза перед добавлением МРА-ОН к полимеру добавляют Ртос-ЛЕЕЛ-ОН.

Стадия 2. Эту стадию осуществляют аналогично стадии 2 из примера 1.

Пример 13.

Н^8-Λ1а-Λ8ρ-С1у-8е^-Рйе-8е^-Λ8ρ-С1и-Μеΐ-Λ8η-Τй^-I1е-^еи-Λ8ρ-Λ8η-^еи-Λ1а-Λ1а-Λ^д-Λ8ρ-Рйе-I1еΛ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-С1η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-Λ8ρ-^у8(ΑЕЕΛ-ΜРΛ)-СΟNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 1, см. выше, за исключением того, что первая кислота, добавляемая к полимерному носителю, представляет собой Ртос-Еу§(Л1ос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 9.

Пример 14.

Н^8-Λ1а-Λ8ρ-С1у-8е^-Рйе-8е^-Λ8ρ-С1и-Μеΐ-Λ8η-Τй^-I1е-^еи-Λ8ρ-^у8(ΑЕЕΛ-МРА)-^еи-Λ1а-Λ1а-Λ^дΛ8ρ-Рйе-I1е-Λ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-С1η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-Λ8ρ-СΟNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 4.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 9.

Пример 15.

Н^8-Λ1а-Λ8ρ-С1у-8е^-Рйе-8е^-Λ8ρ-С1и-Μеΐ-Λ8η-Τй^-I1е-^еи-Λ8ρ-Λ8η-^у8(ΜРΛ)-Λ1а-Λ1а-Λ^д-Λ8ρ-РйеI1е-Λ8η-Τ^ρ-^еи-I1е-С1η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-Λ8ρ-СΟNН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К полимерной подложке (смоле) последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты в соответствии с методикой, описанной на стадии 1 примера 1: Ртос-Л8р(1Ви)-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос -11е-ОН, РтосЕу§(Вос)-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос-С1н(Тг1)-ОН. Ртос-11е-ОН, Ртос-Беи-ОН, Ртос-Тгр(Вос)-ОН,

Ршос-А5п(Тг1)-ОН. Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН. Ртос-Л8р(1Ви)-ОН, Ртос-Лгд(РЫ)-ОН, Рто-Л1а-ОН,

- 15 006160

Ртос А1а-ОН, Ртос-Ьу8(А1ос)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Етос-А5р(1-Вп)-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-А§п(Тт1)-ОН, Етос-Ме1-ОН, Ртос-61и(1Ви)-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос8ег(1Ви)-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-61у-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-А1а-ОН, ВосН18(Вос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят как описано в примере 3, стадии 2-4.

Пример 16.

Н15-А1а-А8р-61у-8ег-Рйе-8ег-А8р-61и-Ме1-А8п-Тйг-Пе-Ьу8(МРА)-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-А8р-РйеI1е-А5η-Т^р-^еи-I1е-^Iη-Т11^-^У5-I1е-Т11^-А5р-СОNН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К полимерной подложке (смоле) последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты в соответствии с методикой, описанной на стадии 1 примера 1: Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-11е-ОН, РтосЬу§(Вос)-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-61п(Тй)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-Тгр(Вос)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Агд(РЫ)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос А1а-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-А8р(1-Ви)-ОН, Ртос -Ьу§(А1ос)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-МеЬОН, Ртос-61и(1Ви)-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос8ег(1Ви)-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-61у-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-А1а-ОН, ВосН18(Вос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят как описано в примере 3, стадии 2-4.

Пример 17.

Н18-А1а-А8р-61у-8ег-Рйе-8ег-А8р-61и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-Ьу8(МРА)-РйеПе-Акп-Тгр -^еи-I1е-^1η-Т11^-^у5-I1е-Т11^-А5р-СОNН₂

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К полимерной подложке (смоле) последовательно добавляют следующие защищённые аминокислоты в соответствии с методикой, описанной на стадии 1 примера 1: Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-11е-ОН, РтосЬу§(Вос)-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-61п(Тг1)-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тгр(Вос)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Рйе-ОН, Ртос-Ьу8(А1ос)-ОН, Ртос-Агд(РЫ)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос А1а-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Ртос-А§р(1-Ви)-ОН, Ртос-Ьеи-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-Тйт(1Ви)-ОН, Ртос-А§п(Тг1)-ОН, Етос-МеЬОН, Ртос-61и(1Ви)-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-РйеОН, Ртос-8ег(1Ви)-ОН, Ртос-61у-ОН, Ртос-А8р(1Ви)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Вос-Н18(Вос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят как описано в примере 3, стадии 2-4.

Пример 18.

Н|5-А1а-А5р-С1у-8ег-Р11е-8ег-А5р-С1и-Ме1-А5п-Т11г-11е-Ьеи-А5р-А5п-Ьу5(АЕЕА-МРА)-А1а-А1а-АгдА5р-Р11е-I1е-А5η-Т^р-^еи-I1е-^1η-Т11^-^у5-I1е-Т11^-А5р-СОNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 15.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 9.

Пример 19.

Н18-А1а-А8р-61у-8ег-Рйе-8ег-А8р-61и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьу8(АЕЕА-МРА)-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-АгдАкр-Рйе-Пе-Акп-Тгр-Ьеи -I1е-61η-Тй^-^у8-I1е-Тй^-А8р-СОNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 16.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 9.

Пример 20.

Н18-А1а-А8р-61у-8ег-Рйе-8ег-А8р-61и-Ме1-А8п-Тйг-11е-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи-А1а-А1а-Агд-Ьу8(АЕЕАМРА)-Рйе-I1е-А8η-Т^р-^еи-I1е-61η-Тй^-^у8-I1е-Тй^-А8р-СОNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят так же, как стадию 1 из примера 17.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят аналогично стадиям 2-4 из примера 9.

Методика очистки

Каждое соединение очищают препаративной обращённо-фазовой ВЭЖХ, используя систему препаративной бинарной ВЭЖХ Уапап (купатах). Очистку производят на колонке Рйепотепех Ьипа 10 мк фенил - гексил, 50 мм х 250 мм (частицы 10 мк), уравновешенной смесью вода/ТФК (0,1% ТФК в Н₂О (растворитель А)) и ацетонитрил/ТФК (0,1% ТФК в №^Ν (растворитель В)). Элюирование проводят, пропуская смесь в градиенте 28-38% растворителя В со скоростью 50 мл/мин в течение 180 мин. Фракции, содержащие пептид, определяют УФ спектроскопией по поглощению при 214 и 254 нм (Уапап Ьупатах ИУЭ II).

Фракции собирают в виде аликвот по 25 мл. Фракции, содержащие нужный продукт, идентифицируют, определяя массу с помощью непосредственной инъекции в ЬС/М8. Отобранные фракции последовательно анализируют методом аналитической ВЭЖХ (20-60% В в течение 20 мин; колонка Рйепотепех Ьипа 5 мк фенил - гексил, 10 мм х 250 мм, 0,5 мл/мин), идентифицируют фракции с чистотой >90% и объединяют эти фракции. Пул замораживают в жидком азоте и сушат, а затем лиофилизируют по меньшей мере в течение 2 дней, получая белый порошок.

Результаты ΐη νίνο

Активность соединений из примеров 1-8 в отношении кишечника (интестинотрофическую активность) оценивают на нормальной мышиной модели. Самцам мышей Ск-1 в возрасте пять недель (20-25

- 16 006160

г) дважды в день в течение 10 дней подряд вводят дозу 5 мг каждого соединения в виде раствора в 0,9% водном растворе №1СТ Соединения вводят в виде подкожных инъекций в дорсальный - латеральный участок поясничной области. Контрольным животным вводят дозу 0,25 мл 0,9% №1СТ

На 11 день мышей не кормят в течение 4 ч и анестезируют с помощью СО₂. Тонкие кишечники удаляют, чистят и взвешивают. У животных, получавших соединения из примеров 1, 3, 5, 7 и 8, наблюдается значительное увеличение веса тонкого кишечника. Результаты показаны на фиг. 1. Как можно видеть, более явно выраженное действие на кишечник получено при использовании соединений из примеров 5, 7 и 8, стабилизированных остатком глицина в положении 2, по сравнению с нативными пептидами Г1П1-2 из примеров 1 и 3.

Эффект дозы выбранных С1у²-ГПП-2 аналогов.

Самки мышей СЭ-1 в возрасте шесть недель (20-25 г) дважды в день в течение 10 дней подряд получают дозу 5, 25 или 50 мкг соединений из примеров 5, 7 и 8. Соединения растворяют в 0,083 натрийфосфатном буфере, рН 6,8, и вводят в виде подкожных инъекций в дорсальный - латеральный участок поясничной области. Контрольным животным вводят дозу 0,25 мл натрий-фосфатного буфера.

На 11 день накормленных мышей анестезируют с помощью На1о!йапе™ и после лапаротомии отбирают тонкий кишечник, толстый кишечник и желудок каждой мыши. Затем ткани чистят и взвешивают.

Статистически значимое увеличение веса тонкого кишечника по сравнению с контрольными мышами (от 53 до 88%) демонстрируют все группы (см. фиг. 2). Однако никакого эффекта дозы не наблюдается при использовании соединений из примеров 5 и 7, хотя возможный эффект дозы наблюдается для соединения из примера 8.

Вес толстого кишечника увеличивается на 27-48% во всех пролеченных группах. Опять же в случае соединений из примеров 5 и 7 не наблюдается никакого эффекта дозы, тогда как в случае соединения из примера 8 (см. фиг. 2) отмечается возможный эффект дозы.

Эти результаты показывают, что производные ГПП-2 из примеров 7 и 8 проявляют интестинотрофическую активность, сходную с активностью соответствующего свободного пептида из примера 5.

Фармакокинетический профиль у крыс

Фармакокинетические характеристики соединений из примеров 5 и 8 изучают на нормальных крысах после однократной внутривенной или подкожной инъекции. Концентрации в плазме определяют радиоиммунноанализом с продажным антителом к ГПП-2 человека.

Эксперименты на животных

Анализируемые органы растворяют в 0,083 М натрий - фосфатном буфере, рН 6,8, и вводят самцам крыс 8ргадие - Эа\\'1еу в возрасте восьми - одиннадцати недель в виде однократной внутривенной или подкожной инъекции при уровне дозы 500 нмоль/кг. Серийные пробы крови (150-200 мкл) отбирают в пробирки, содержащие ΕΌΤΆ ингибитор ΌΡΡ-ΐν, в следующих временных точках: перед введением дозы, через 5 и 30 мин и через 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения испытуемого агента. Цельную кровь центрифугируют, а затем отбирают образцы плазмы и хранят до момента анализа при -80°С.

Анализ плазмы

Концентрацию соединений из примеров 5 и 8 в плазме определяют радиоиммуноанализом, используя кроличье поликлональное антитело к ГШ1-2 человека (Решп8и1а ЬаЬогаЮпек, ВСС7176) и йодированный человеческий ГПП-2 в качестве метки.

Фармакокинетический анализ

Дескриптивные фармакокинетические параметры определяют стандартными независимыми от модели методами (С1Ьа1й1 апй Ретег, 1982), основанными на анализе данных концентрации в плазме во времени. Фармакокинетический анализ осуществляют, используя макросы, написанные для Мюгокой Ехсе1 97. Рассчитываются следующие параметры:

С_тах обозначает максимальную концентрацию в плазме;

Т_тах обозначает время, когда наблюдается С_тах;

Т_1/2 обозначает конечное время полужизни;

АиС(0 - бесконечность) обозначает площадь под кривой концентрация в плазме - время от времени 0 до времени бесконечность;

Е обозначает абсолютную биодоступность;

СЬ обозначает системный клиренс;

МВТ обозначает среднее время пребывания (в организме) и ν§8 обозначает объём распределения препарата в стационарном состоянии.

Кривые концентрации в плазме показаны на фиг. 3, а соответствующие фармакокинетические параметры представлены в табл. 2, см. ниже. Эти результаты показывают, что ГПП-2, дериватизированный по данному изобретению, эффективно уменьшает элиминирование и распределение соответствующего свободного пептида С1у²-СЬР (ГПП)-2, тем самым продуцируя более высокую концентрацию в плазме и более продолжительное время полужизни в большом круге кровообращения.

- 17 006160

Таблица 2. Сравнение средних фармакокинетических параметров соединений из примеров 5 и 8 у крыс 8ргадие-1)а\\'1еу после однократной дозы 500 нмоль/кг

Параметр	Соединение из Примера 5	Соединение из Примера 8
Доза (нмоль/кг)	500	500	500	500
Способ введения	ВВ (IV)	8С	ВВ (IV)	8С
Сщах (нМ)	15633,44	159,35	10108,42	650,93
Ттах (час)	Ν/Α	0,50	Ν/Α	0,50
АиС(О-беск) (нМ/час)	626,03	205,43	89354,35	13543,56
СЬ (мл/мин/кг)	13,89	Ν/Α	0,0942	Ν/Α
У88 (л/кг)	0,2500	Ν/Α	0,0953	Ν/Α
МКТ (час)	0,3	Ν/Α	16,9	Ν/Α
Т1/2 (час)”	1,5	0,9	16,2	23,8
Г(%)	Ν/Α	32,8	Ν/Α	15,2

выражается как среднее ^ь выражается как гармоническое среднее

Иммуноблоттинг

Образцы плазмы для фармакокинетических исследований на крысах анализируют методом иммуноблоттинга. Белки плазмы разделяют в невосстанавливающих условиях, применяя электрофорез в акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Ώ8 - РАСЕ) по Ьаетт! (1970). Образцы плазмы сначала разводят 1:10 дистиллированной водой и 20 мкл смешивают с 10 мкл 3Х буфера Ьаетт1 (30 мМ ТгЕС1, 3 мМ ΕΏΤΑ, 15% δϋδ, рН 6,8) и 2 мкл раствора бромфенолового синего (0,1% бромфенолового синего, 50 % глицерина). Смеси помещают в кипящую водяную баню на 3 мин и наносят на гель. Белки сначала концентрируются в 3% концентрирующем геле, а затем мигрируют в 8% разделяющем геле, при этом используется мини-гель система с 10-луночными гребёнками (1,5 х 4,8 мм). Электрофорез проводят при постоянном токе 15 мА/гель для концентрирования белков в концентрирующем геле и при 20 мА/гель в разделяющем геле примерно в течение 1,5 ч.

Белки последовательно переносят на нитроцеллюлозную мембрану с помощью устройства для переноса полужидких веществ на 1 ч при 100 мА/гель. Эффективность переноса проверяют с помощью обратимого окрашивания мембраны 1%-ным раствором Ропсеаи™.

Иммунохимическое обнаружение

Мембраны в течение ночи насыщают при 4°С физиологическим раствором, забуференным трисом (ΤγΕ) (ΤΒ8), содержащим 5% нежирного молока. Иосле трёх отмываний ΤΒδ-0,5% Тмееп 20™ в течение 5 мин блоты инкубируют 90 мин при комнатной температуре с кроличьим поликлональным антителом против ГИИ-2 (Решпзи1а ГаЬога1опез, ΚΘΘ7176), разведённым 1:2500 в ΤΒ8- 0,5% Тмееп 20™, содержащем 1% плазмы крыс. Блоты отмывают 3 раза в течение 10 мин ΤΒ8- 0,05% Тмееп 20™ и затем инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре с меченым пероксидазой антителом осла к кроличьему Ι§Θ (1аскзоп, 711-036-152), разведённым 1:100000 в ΤΒ8- 0,05% Тмееп 20™. Иосле 3 отмываний осуществляют проявление, используя хемилюминесцентный субстрат пероксидазы (набор ЕСЕ™ АтегзЕат РЕагтас1а Β^οΐесЕ). Илёнки экспонируют в течение 5-10 мин.

Или же мембраны в течение 1 ч инкубируют с антителом кролика к альбумину крыс (Ассига1е СЕет1са1, ΥΝ - ΚΕаΑ^ΒР), разведённым 1:400000 в ΤΒ8- 0,05% 'Гмееп 20™. Иосле 3 отмываний ΤΒ80,05% 'Гмееп 20™ проявление осуществляют как описано выше.

Результаты

Иредварительный скрининг показывает, что продажное антитело против ГИИ-2 недостаточно чувствительно для того, чтобы обнаруживать соединение из примера 7, конъюгированное с белками, методом вестерн-блоттинга. Иоэтому этим методом анализируют только образцы плазмы крыс, инъецируемые с соединением из примера 8.

Результаты, проиллюстрированные на фиг. 4, показывают, что соединение из примера 8 эффективно связывается (образует конъюгаты) с альбумином крыс после внутривенного введения. Слабый сигнал также наблюдается после подкожного (зс) введения альбумина (не показан). Сравнение с антителом к альбумину крыс показывает, что большинство полос, обнаруживаемых с помощью антитела против ГИИ-2, за исключением одной, можно отнести к различным видам альбумина (мономеры, димеры и полимеры).

Claims (18)

1. Стимулятор роста желудочно-кишечных тканей, способный связываться ковалентной связью ίη νί\·Ό с функциональной группой компонента крови, содержащий пептид, имеющий последовательность

- 18 006160 ^Р4^-(Х\⁾т^-Х1^-Х2^-Х3^-Х4^-Х5^-РИ'^е6^-БеГ7^-Акр8^-(Р1^)-Х14^-Акр15^-Х16^-Х17^-А1а18^-Х19^-Х20^-Х21^-РИе22^-(Р2^)-Тгр25 Ε^26^-Χ27^-Χ28^-Τ^Γ29^-ΡΥ830^-Ρ3^-(Υ2⁾η^-Ρ-2 где Х₁ обозначает Ηίκ или Туг;

Х₂ обозначает А1а, 61у, Ω-ΛΙα. Рго, 11е, ΝοΓ-ναΙ. α-аминомасляную кислоту или А1а-замещающую аминокислоту, придающую указанному аналогу устойчивость к ферменту ЭРР-ΐν;

Х₃ обозначает Акр, 61и, Рго, НРго; или Х₂-Х₃ обозначают Х₂₁/СН(ОН)СН₂)Х₃, Χ_2ψφΗ₂ΝΗ₂)Χ₃ или Х₂ДСНСН)Х₃, где Х₂ и Х₃ имеют значение по определению выше;

Х₄ обозначает 61у или А1а;

Х₅ обозначает Бег или А1а;

Р₁ обозначает 61и-Хю-Акп-ТЬг-11е, бЕ-Х^-Аот-ТИг^а! или Туг-Бег-Бук-Туг,

Х₁₀ обозначает Ме1, Беи, 11е или устойчивую к окислению МеЕзамещающую аминокислоту;

Х₁₄ обозначает Беи или Бук;

Х₁₆ обозначает Акп, Бук или А1а;

Х₁₇ обозначает Беи или Бук;

Х₁₉ обозначает А1а или ТИг;

Х₂₀ обозначает Агд, Бук, Н1к или А1а;

Х₂₁ обозначает Акр или Бук;

Х₂₇ обозначает 11е или Беи;

Х₂₈ обозначает 61η или Н1к;

Р₂ обозначает 11е-Акр, 11е-А1а или νη1-61η;

Р₃ обозначает ковалентную связь или 11е, 11е-ТИг, Пе-ТИг-Акр или Пе-ТИг-Акн;

Βι обозначает ΝΗ₂ или Ν-концевую блокирующую группу;

В₂ обозначает СООН, ί,’ΘΝΗ или С- концевую блокирующую группу;

Υ₁ обозначает один или два остатка из Агд, Бук и Н1к;

Υ₂ обозначает один или два остатка из Агд, Бук и Н1к и т и η независимо обозначают 0 или 1;

или его аналог, или его фрагмент, обладающий активностью, стимулирующей рост желудочно-кишечных тканей; и реакционноспособную группу, связанную с пептидом.

2. Стимулятор по п.1, у которого реакционноспособной группой является малеинимидная или малеинимидосодержащая группа.

3. Стимулятор по п.1, у которого Х₁ обозначает Н1к; Х₂ обозначает А1а или 61у; Х₃ обозначает Акр; Х₄ обозначает 61у; Х₅ обозначает Бег; Р₁ обозначает бк-Х^-Акн-ТИг-Пе; Х₁₀ обозначает Ме1; Х₁₆ обозначает Акп или Бук; Х₁₉ обозначает А1а; Х₂₀ обозначает Агд; Х₂₇ обозначает 11е; Х₂₈ обозначает 61η; Р₂ обозначает Пе-Акщ Р₃ обозначает Пе-ТИг-Акр и В₂ обозначает ί,’ΘΝ^.

4. Стимулятор по п.3, у которого пептид выбирают из группы, состоящей из

Н1Б -А1а-Азр-Су1у-8ег-Р11е-8ег-А8р -С1и-Ме1-Азп- ТЬг-Пе-Ьеи-Азр -Азп-Ьеи-А1аА1а- Агу-Азр -РЪе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-11е-61п-ТНг-Ьуз-1]е-ТИг-Лзр-СО\Н2;

Н15-А1а-А5р-О1у-8ег-Р11е-8ег-А5р-61и-МеЬА5П-ТЬг-11е-Ьеи-А8р -Азп-Ьеи-А1а-А1а-Аг§-Азр-РЬе--Пе-Азп- Тгр- Ьеч1-Пе-С1п-Т1и-ЬуБ-Пе-ТНг-А5р-ЬуБ-С(ЖН<

ΗΪ3 -А1а-Азр-С1у-8ег-Р11е-8ег-А8р-Сг1и -Ме! -Абп-ТНг-Пс -Ьеи -Азр -Ьуз-Ьеи-А1аА1а- Агд-Азр-РЬе-Пе -Азп-Тгр -Ьеи-11е-О1п -ТНг-Ьуз-Пе-ТНг-Азр-СОЫЬ;

1Т1Б-С;1у-Азр-61у-8ег-РИе-8сг-А5р-Ст1и-Ме1Азп -ТЬг-ВсЬеи -Азр -Азп-Ьеи-А1аА1а- Агд-Азр -РЬе-Пе-АБП-Тгр-Ьси-Пе-С|1п- ГИг-Ьуз-11е-Т11г-.Азр-СОУН?;

Н13-О1у-Азр-(л1у-8ег-Р11е-8ег-Азр-О1и-МеЬА5п-Тйг-11е-Ьеи-А8р -Азп -Ьеи-А1а-А1аАгд-Азр -РЬ.е-11е -А8П-Тгр-Ееи-11е-Сг1п -ТЬг-Ьуз-Пе-ТЬг-Азр-Ьуб-СОМНг;

Н18-Сг1у-А8р-С1у-Зег-Р11е-8ег-А8р-Сг1и -Мег-Азп-ТЬг-Пе -Ьеи -Азр -Ьуз-Ьеи-А1а А1аАгд-Азр-РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-Пе-О^-ТЪг-Ьуз-Пе-Тйг-Азр-СОКНг;

Н18-А1а-Азр-О1у-8ег-Р11е-8ег-А8р -СНи-МеЬАзп-ТЪг-Пе-Ьеи-Азр -Азп -Еуз-А1а-А1аАгд-Азр-РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-Пе-О1п-ТЬг-Ьуз -Пе-ТЪг-Азр-СОЫНг;

Н15-А1а-А8р-С1у-8ег-Рке-8ег-Азр-О1и-МеТАзп-ТЬг-11е -Ьуз -Азр -А5п-Ьеи-А1а-А1аАгд-Азр -РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-Пе-СЬ-ТЪг-Ьуз-Пе-Бк-Азр-СОЕЯЬ; и Н18-А1а-А8р-О1у-8ег-Р11е-8ег-Азр-О1и-Ме!-А8п-Т11г-11е-Ьеи -Азр -Азп -Ьеи -А1а-А1аАгд-Ьуз-РЬе-Пе Азп-Тгр -Ьеи-Пе-СИп-ТЬг-Ьуз -Пс-ТЬг-Азр-СОКН-.

5. Стимулятор по п.1, у которого пептид выбирают из группы, состоящей из

- 19 006160

МРА-Н13 -А1а-Азр-С1у-8ег-РЬе-8ег-А8р-О1и-МеЬА5п-ТЬг-11е -Ьеи -Азр-Азп-ЬеиА1а- А1а- Аг§-Азр -РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи -11е-О1п-ТЬг-Ьуз-11е-ТЬг-Азр-СОКЕ[₂;

Н1з-А1а -Азр -О1у-8ег -Р11е-8ег-Азр -О1и -МеЬАзп -ТЬг-Пе -Ьеи-Азр -Азп -Ьеи-А1аА1а- Аг^-Азр-РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-11е-Сг1п-ТЬг-Ьу8-11е -ТЪг-Азп-Ьуз-МРА-СОКНг;

Н18-А1а-Азр-О1у-8ег-РЬе-8ег-Азр-О1и-МеЬА5П-Т11г-11е-Ьеи -Азр -Ьуз(МРА)-ЬеиА1а- А1а-Аг§-Азр РЬе-Пе-Азп -Тгр -Ьеи-Пе-ОЬ-ТЬг-Ьуз-Пе-ТЬг-Азр-СОЬПЕ;

МРА-Н1з-О1у-Азр-(л1у-8ег-РЬе-8ег-Л8р-Сг1и-МеЬА8п-ТЬг-11е-Ьеи-А8р-А8п-Ьеи А1аА1а-Аг§-Азр -РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-Пе-ОЬ-ТЬг-Ьуз-Ие-ТЬт-Азр-СОЬПЬ;

Н18-Сг1у-Азр-С1у-8ег-Р11е-8ег-А8р-61и -МеЬАзп-ТЬг-Пе -Ьеи -Азр -Ьуз(МРА)-Ьеи

А1а- А1а-Аг§ -Азр-РЬе-11е-Азп-Тгр -Ьеи-11е -О1п -ТЬг -Ьуз-Пе -ТЬг -Азр СОЫН₂;

Н18-Сг1у-Азр-С1у-8ег-Рйе-8ег-Азр-Сг1и-МеЬА8п-ТЬг-11е-Ьеи -Азр -Азп-Ьеи -А1а-А1аАг§-А8р-РЬе-11е-Азп-Тгр-Ьеи-11е-Сг1п -ТЬг-Ьуз-Пе-ТЬг-Азр -Ьуз(МРА)-СО1ЧН₂;

Н1з-О1у-Азр-О1у-8ег-РЬе-8ег-Азр-О1и -МеЬАзп-ТЬг-11е-Ьеи-Азр-Ьуз(АЕЕА-МРА)Ьеи-А1а-А1а -Аг§-Азр-РЬе-11е -Азп-Тгр-Ьеи-11е-О1п-ТЬг-Ьуз-11е-ТЬг-Азр-СОЫН₂;

Н1з-Сг1у-Азр-Сг1у-8ег-РЬе-8ег-А8р-С1и-МеЬА8п-ТЬг-11е-Ьеи -Азр -Азп -Ьеи -А1аА1а- Аг§-Азр -РИе-Пе-Азп-Тгр-Ьеи-Пе-СИп -ТЬг-Ьуз-Пе -ТЬг-Азр-Ьуз(АЕЕА-МРА)СОИН₂;

МРА-АЕЕА -Н1з-Ст1у- Азр-Ст1у-8ег-РЬе-8ег -Азр-О1и-МеЬАзп-ТЬг-11е-Ьеи -Азр Азп- Ьеи-А1а-А1а -Аг§-Азр -РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-Пе-СЫ-ТЬг-Ьуз-Пе-Ткг-Азр-СОТЧЕЬ;

МРА-АЕЕА -Ндз-Ак-Азр-СИу-Зег-РЬе-Зег-Азр-СИи-МеЬАзп-ТЬг-Ие-Ьеи -Азр -АзпЬеи-А1а-А1а-Аг§-Азр-РЬе-11е-Азп -Тгр-Ьеи-Пе-ОЫ-ТЬг-Ьуз-Ие-ТЬг-Азр-СОЫНг;

Н1з-А1а-Азр-О1у-8ег-РЬе-8ег-Азр -О1и-МеЬАзп-ТЬг-11е-Ьеи -Азр -Азп-Ьеи-А1а-А1аАг§ -Азр -РЬе-Пе-Азп -Тгр-Ьеи-Пе -ΘΙη-ТЬг-Ьуз-Пе -ТЬг-Азр -Ьуз(АЕЕА-МРА)-СОМН₂;

Н1з-А1а-Азр-С1у-8ег-РЬе-8ег-Азр-С1и-Ме! -Азп-ТЬг-Пе-Ьеи-Азр-Ьуз(АЕЕА-МРА)Ьеи -А1а-А1а-Аг§-Азр-РЬе-11е-Азп-Тгр -Ьеи-Пе-СИп-ТЬг-Ьуз-Пе-ТЬг-Азр-СОЫНг;

Н18-А1а-А8р-О1у-8ег-РЬе-8ег-Азр-О1и-Ме1-А8П-ТЬг-11е-Ееи -Азр -Азп-Ьуз(МРА)А1а- А1а -Аг§-Азр-РЬе-11е -Азп-Тгр -Ьеи-11е-О1п-ТЪг-Ьу8-11е-ТЬг-Азр-СОКН₂;

Н1з-А1а-Азр -О1у-8ег-РЬе-8ег-Азр-О1и-Ме!-Азп-ТЬг-11е-Ьуз(МРА) -Азр -Азп-ЬеиА1а- А1а-Аг§-Азр-РЬе-11е-Азп-Тгр-Ьеи-11е-С1п-ТЬг-Ьуз -Пе -ТЬг-Азр-СОЬШ₂;

Н1з-А1а -Азр-О1у-8ег-РЬе-8ег-А8р-Сг1и -МеЬАзп-ТЬг-11е-Ьеи -Азр -Азп -Ьеи-А1аА1а- Аг§-Ьуз(МРА) -РЬе-Пе-Азп -Тгр-Ьеи-Пе-ОЬа-ТЬг-Ьуз-Пе-ТЬг-Азр-СОЯНг;

Н1з-А1а-Азр-С1у-8ег-РЬе-8ег-Азр-О1и -МеЬАзп -ТЬг-11е-Ьеи -Азр -Азп-Ьуз (АЕЕАМРА) -А1а-А1а -Аг§ -Азр -РЬе-11е -Азп -Тгр-Ьеи-11е-61п-ТЬг -Ьуз-11е -ТЬг-Азр-СОМЬ;

Н1з-А1а -Азр-С1у-8ег-РЬе-8ег -Азр-О1и-МеЬАзп-ТЬг-11е-Ьуз(АЕЕА-МРА)-Азр Азп- Ьеи-А1а -АРа-АпуАзр -РЬе-Ие -Азп-Тгр-Ьеи-Пе-ОЫ-ТЬг-Ьуз-Пе-ТИг-Азр-СОННз; и Η13-Α1 а-Азр-Сг1у-8ег-РЬе-8ег-Азр~С1и-Ме1-Азп-Ткг-Пе-Ьеи-Азр-Азп-Ьеи-А1а-А I аАге-Ьуз(АЕЕА-МРА)-РЬе-Пе-Азп-Тгр -Ьеи-11е-С1п-ТЪг-Ьу5-Пе-ТЬг-А5р-СОКН₂.

6. Стимулятор по п.1, способный связываться с компонентом крови, представляющим собой белки крови.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая стимулятор роста желудочно-кишечных тканей по п.1 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

8. Композиция по п.7, предназначенная для лечения или предупреждения желудочно-кишечных расстройств или заболеваний.

9. Способ лечения или предупреждения желудочно-кишечных расстройств или заболеваний у субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества стимулятора роста желудочнокишечных тканей по п.1, индивидуально или в комбинации с фармацевтически приемлемьм носителем.

10. Способ стимулирования роста желудочно-кишечных тканей у субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества стимулятора роста желудочно-кишечных тканей по п.1, индивидуально или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

11. Конъюгат, содержащий стимулятор роста желудочно-кишечных тканей по п.1, связанный ковалентной связью с компонентом крови.

12. Конъюгат по п.11, отличающийся тем, что реакционноспособная группа представляет собой малеинимидную группу или малеинимидосодержащую группу, а компонент крови представляет собой белок крови.

- 20 006160

13. Конъюгат по п.12, отличающийся тем, что белок крови представляет собой сывороточный альбумин.

14. Конъюгат по п.11, отличающийся тем, что стимулятор роста желудочно-кишечных тканей представляет собой стимулятор по п.5.

15. Способ увеличения ΐη νίνο времени полужизни глюканоподобного пептида 2, обладающего активностью, стимулирующей рост желудочно-кишечных тканей, заключающийся в связывании ковалентной связью пептида с компонентом крови.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что пептид представляет собой аналог или фрагмент глюканоподобного пептида 2, обладающий активностью, стимулирующей рост желудочно-кишечных тканей.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что пептид представляет собой пептид по п.4.

18. Способ лечения или предупреждения желудочно-кишечных расстройств или заболеваний у субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.11, индивидуально или в комбинации с фармацевтическим носителем.