ES2307718T3 - Peptido 2 similar al flucagon (glp-2) de duracion prolongada para el tratamiento de enfermedades y trastornos gastrointestinales. - Google Patents
Peptido 2 similar al flucagon (glp-2) de duracion prolongada para el tratamiento de enfermedades y trastornos gastrointestinales. Download PDFInfo
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Abstract
Un derivado estimulador del crecimiento del tejido gastrointestinal seleccionado del grupo compuesto por: His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp- Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2; y His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp- Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-NPA)-CONH2 en la que MPA es ácido maleimidopropiónico y AEEA es ácido 2-[2-(2-amino)etoxi]etoxi acético.
Description
Péptido 2 similar al glucagón
(GLP-2) de duración prolongada para el tratamiento
de enfermedades y trastornos gastrointestinales.
La presente invención se refiere a derivados del
péptido 2 similar al glucagón (GLP-2). En
particular, esta invención se refiere a derivados del péptido que
tienen una semivida in vivo extendida, para el tratamiento o
la prevención de trastornos o enfermedades gastrointestinales, tales
como la enfermedad intestinal inflamatoria y otras funciones
gastrointestinales, de cualquier segmento del tracto
gastrointestinal, desde el esófago hasta el ano.
El GLP-2 es un péptido de 33
aminoácidos que se expresa de una forma específica de tejido a
partir del gen pleiotrópico proglucagón y, por tanto, parte de la
superfamilia del glucagón de hormonas peptídicas. El procesamiento
alternativo postraduccional del proglucagón se produce en el
páncreas, el intestino y el cerebro. Las escisiones enzimáticas en
el proglucagón producen numerosas hormonas peptídicas
multifuncionales implicadas en el metabolismo de los nutrientes.
Las principales hormonas bioactivas derivadas del proglucagón se
encuentras en las células \alpha del páncreas y el
GLP-1 y el GLP-2 en las células L
intestinales y el cerebro. Drucker y col. (véase Proc. Natl. Acad.
Sci., 1996, 93 (115), 7911-7916) descubrieron por
primera vez que poseía potentes propiedades intestinotróficas. Se
ha demostrado que el GLP-2, como péptido natural
derivado del intestino, posee una significativa actividad
reparadora del epitelio de la mucosa del intestino delgado y grueso.
También se ha demostrado que incrementa la capacidad del intestino
para digerir y absorber nutrientes, lo que sugiere un potencial
papel terapéutico en el tratamiento de la insuficiencia intestinal.
De hecho, en la actualidad varios estudios han confirmado que la
administración de GLP-2 reduce o previene los daños
intestinales en modelos de roedores con colitis, enteritis,
nutrición parenteral total y resección masiva. Muy recientemente
también se han comunicado estudios clínicos de fase 2 con
GLP-2, en los que se demostró que los pacientes con
síndrome del intestino corto exhibían una mayor capacidad para
absorber los nutrientes enterales 30 días después de la
administración de GLP-2, aparentemente sin efectos
secundarios indeseados.
La principal vía metabólica para la eliminación
del GLP-2 es a través de la degradación enzimática.
Se ha demostrado que el GLP-2 se degrada
rápidamente mediante la eliminación de sus dos aminoácidos
N-terminales por la
dipeptidilpeptidasa-IV (DPP-IV), que
representa una gran limitación porque produce la inactivación
completa del péptido. Como resultado, la semivida del
GLP-2 es, de este modo, bastante corta, y el
tratamiento actual con GLP-2 necesita la infusión
de inyecciones frecuentes. También se ha mostrado que el
aclaramiento renal está implicado en el aclaramiento del
GLP-2. La acción principal del GLP-2
implica la estimulación del crecimiento celular y el mecanismo de
acoplamiento de la activación del receptor del
GLP-2, directa o indirectamente, a la proliferación
celular todavía no se ha estudiado.
Se ha demostrado que análogos peptídicos del
GLP-2 nativo poseen una actividad trófica potenciada
en el intestino delgado como agonistas del receptor de
GLP-2 (véase, por ejemplo, el documento US
5.990.077).
Aunque muy útil, una desventaja crucial de los
péptidos y análogos del GLP-2, como se ha indicado
antes, es sus semividas muy cortas in vivo, que normalmente
no son superiores a 2 minutos.
La enfermedad intestinal inflamatoria (EII) es
un grupo de trastornos crónicos que causan inflamación o ulceración
en los intestinos delgado y grueso. Incuso pueden ser potencialmente
letales y, actualmente, no se conoce ninguna cura. La EII
normalmente se denomina colitis ulcerosa (CU), limitada al colon y a
la enfermedad de Crohn (EC), que puede afectar a todo el tracto
gastrointestinal, que tiene como resultado un ciclo crónico de
remisiones y brotes. Se conocen muchos productos farmacéuticos para
tratar la EII, por ejemplo para suprimir la inflamación, para
prevenir los brotes, para controlar los síntomas tales como dolor o
diarrea, o para reemplazar o complementar los nutrientes esenciales
mal absorbidos a causa de una enfermedad extensa o cirugía. Entre
las opciones terapéuticas actuales se incluyen una amplia variedad
de productos farmacéuticos como aminosalicilatos, corticosteroides,
moduladores inmunitarios y agente anti-TNF\alpha,
y están diseñados para reducir la inflamación y aliviar los
síntomas además de reemplazar los fluidos y los nutrientes perdidos.
No obstante, la mayoría de estos productos tienen un uso limitado
en la EII por sus efectos secundarios indeseados sobre el cuerpo en
general.
Aproximadamente se trata a un millón de
pacientes con EII al año en Estados Unidos y Europa, la mayoría de
ellos normalmente con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. De
hecho, no es infrecuente para sujetos con EII que se sometan a
cirugía radical que implica la eliminación de grandes porciones del
intestino. Los costes sanitarios anuales directos de la EII son de
aproximadamente 700 millones de dólares americanos y el impacto
económico total de los costes tanto directos como indirectos se
acercan a de 2 a 3 billones de dólares americanos al año en todo el
mundo. Los tratamientos existentes, aunque a menudo proporcionan
alivio, tienen algunos inconvenientes.
El documento 5.789.379 instruye sobre análogos
de GLP-2 entre los que uno se ha desarrollado como
compuesto de larga duración (ALX-600^{TM}) y en
la actualidad se encuentra en estudios clínicos. No obstante, aunque
la degradación del GLP-2 por la
DPP-IV parece evitarse algo, su semivida permanece
limitada por el aclaramiento renal y no supera los 2 minutos, como
se ha indicado antes.
Se ha desarrollado un anticuerpo quimérico
(Remicade^{TM}) de modo que se una específicamente al factor de
necrosis tumoral alfa humano (TNF-\alpha) para El
tratamiento a corto plazo de la enfermedad de Crohn. Este
anticuerpo está indicado para la reducción de los síntomas de la
enfermedad de Cronin de leve a grave en pacientes que ha
experimentado una respuesta inadecuada a la terapia convencional con
corticosteroides, otro inmunosupresores y/o antibióticos. No
obstante, se han observado efectos secundarios graves con dicho
tratamiento. Por ejemplo, se ha asociado con reacción de
hipersensibilidad, infecciones graves incluida la sepsis, además de
infecciones mortales. Su administración podría además predisponer a
pacientes con infecciones hasta el bloqueo del TNF.
Por tanto, con la creciente prevalencia de la
EII en los últimos años, sería muy deseable desarrollar derivados o
análogos del péptido GLP-2 capaces de mantener
sustancialmente el mismo nivel de actividad, baja toxicidad y
ventajas terapéuticas como GLP-2, pero con una
semivida in vivo mucho más prolongada, de modo que se evita
la necesidad de su administración continua en el tratamiento de
varias enfermedades, tal como enfermedad intestinal inflamatoria,
enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, que constituyen las dos
enfermedades intestinales inflamatorias principales.
El documento 00/69900 describe la protección de
péptidos terapéuticos endógenos mediante la actividad peptidasa a
través de la conjugación con componentes de la sangre.
De acuerdo con la presente invención, ahora se
proporciona un derivado de GLP-2 estimulador del
crecimiento del tejido gastrointestinal que tiene una semivida
in vivo extendida, en comparación con el correspondiente
estimulador del crecimiento gastrointestinal de
GLP-2 sin modificar. La presente invención
proporciona un derivado estimulador del crecimiento del tejido
gastrointestinal seleccionado del grupo compuesto por:
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH_{2};
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cmHis-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-
CONH_{2}
donde MPA es ácido maleimidopropiónico y AEEA es
-ácido 2-[2-(2-amino)etoxi] etoxi acético. El
derivado de GLP-2 comprende una entidad reactiva
(MPA) acoplada al mismo y capaz de reactivar con funcionalidades
disponibles en un componente de la sangre, bien in vivo o
ex vivo, para formar un enlace covalente estable. El enlace
covalente formado entre el derivado de GLP-2 y el
componente de la sangre previene la escisión no deseada del
GLP-2 por enzimas tales como la dipeptidilpeptidasa
IV, de modo que se extiende su semivida in vivo y su
activi-
dad.
dad.
Componentes preferidos de la sangre comprenden
proteínas tales como inmunoglobulinas, incluidas IgG e IgM,
albúmina sérica, ferritina, proteínas de unión a esterotes,
transferrina, proteína de unión a tiroxina,
\alpha-2-macroglobulina,
haptoglobina, etc., de las que la albúmina sérica y la IgG son más
preferidas y, de éstas, la albúmina sérica es la más preferida.
La entidad reactiva, ácido maleimidopropiónico
(MPA), es capaz de formar un enlace covalente con el componente de
la sangre mediante la reacción con los grupos tiol presentes en el
mismo, bien in vivo o in vitro (o ex
vivo).
En otro aspecto de la invención se proporciona
una composición farmacéutica que comprende el presente derivado de
GLP-2 estimulador del crecimiento de tejido
gastrointestinal en combinación con un transportador
farmacéuticamente aceptable. Tal composición es útil para el
tratamiento o la prevención de trastornos o enfermedades
intestinales, tales como enfermedad intestinal inflamatoria u otras
funciones gastrointestinales. La composición también se puede usar
para terapia génica con el fin de inducir en las células la
producción endógena del derivado peptídico estimulador del
crecimiento del tejido gastrointestinal que, después, puede
implantarse en un sujeto para producir el efecto biológico deseado.
Por último, la composición también se puede usar para fabricar
composiciones farmacéuticas o veterinarias para la potenciación del
crecimiento del tejido del intestino grueso.
En otra forma de realización de la presente
invención se proporciona el presente derivado de
GLP-2 estimulador del crecimiento del tejido
gastrointestinal o un conjugado del mismo para usar en el
tratamiento o la prevención de trastornos o enfermedades
intestinales, tales como enfermedad intestinal inflamatoria, y
funciones gastrointestinales en un sujeto, preferentemente un
mamífero, animal o ser humano.
En otro aspecto más de la presente invención, se
proporciona un conjugado que comprende el presente derivado de
GLP-2 estimulador del crecimiento del tejido
gastrointestinal está unido covalentemente a un componente de la
sangre.
Se describe un procedimiento para extender la
semivida in vivo de un estimulador GLP-2 del
crecimiento del tejido gastrointestinal en un sujeto, en el que el
procedimiento comprende la unión covalente del derivado de
GLP-2 estimulador del crecimiento del tejido
gastrointestinal a un componente de la sangre. El enlace covalente
puede tener lugar in vivo o in vitro.
Los compuestos estimuladores del crecimiento del
tejido gastrointestinal son péptidos que son análogos de
GLP-2 que poseen actividad estimuladora del
crecimiento del tejido gastrointestinal. Los detalles de las
secuencias de estos análogos se ilustran más adelante.
Otro uso del presente compuesto derivado puede
ser la determinación de la actividad intestinotrófica de una
hormona, cuando se usa en combinación con el presente compuesto
derivado y, en particular, cuando el compuesto es un análogo de
GLP-2 o un fragmento de GLP-2. Tal
procedimiento comprende las etapas de: (a) coadministrar la hormona
con una cantidad intestinotrófica del derivado de
GLP-2 a un sujeto de prueba; (2) valorar el
posterior crecimiento de un tejido del intestino grueso o delgado
en el sujeto de prueba; y (3) determinar si el crecimiento del
tejido del intestino delgado y/o grueso en el sujeto de prueba está
potenciado con respecto a los sujetos control tratados con un
análogo de GLP-2 o un derivado de
GLP-2 sin modificar.
Si está presente un grupo de unión, es ácido
2-[2-(2-amino)etoxi]etoxi acético,
AEEA.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 ilustra los cambios en el peso
húmedo del intestino delgado en ratones tratados con solución salina
o con 5 \mug de los compuestos de los ejemplos
1-8 dos veces al día, durante 10 días (n= 10/grupo).
Los resultados se expresan en forma de peso delta medio frente al
control \pm SEM.
La figura 2 ilustra los cambios en el peso
húmedo del intestino delgado en ratones tratados con solución salina
o con 5, 25 ó 50 \mug de los compuestos de los ejemplos 5, 7 y 8
dos veces al día, durante 10 días (n= 10/grupo). Los resultados se
expresan en forma de peso delta medio frente al control \pm
SEM.
La figura 3 ilustra las concentraciones
plasmáticas medias para los compuestos de los ejemplos 5 y 8 en
ratas Sprague-Dawley tras una única dosis
subcutánea o intravenosa de 500 nmol/kg (n= 4/grupo).
La figura 4 ilustra la detección del compuesto
del ejemplo 8 conjugado con proteínas plasmáticas de rata utilizando
un anticuerpo policlonal, anticuerpo
anti-GLP-2, y la comparación con el
patrón obtenido con una albúmina anti-rata.
\vskip1.000000\baselineskip
La bioconjugación in vivo es el
procedimiento de unir covalentemente una molécula, tal como el
presente compuesto derivado estimulador del crecimiento de tejido
gastrointestinal, dentro del cuerpo, a componentes sanguíneos
diana, preferentemente proteínas, de un modo que permita la
considerable retención, o incrementar en algunos casos, la
actividad biológica del péptido original GLP-2
estimulador del crecimiento del tejido gastrointestinal sin
modificar, al tiempo que proporciona una mayor duración de la
actividad biológica proporcionando al derivado de
GLP-2 los parámetros biofísicos del componente
sanguíneo diana.
Para los fines de la presente invención, con los
términos "análogo" o "fragmento" se pretende incluir
secuencias aminoacídicas que comprenden péptidos con diferentes
secuencias de aminoácidos con respecto a la secuencia nativa, tal
como la secuencia de GLP-2, pero con una actividad
similar o comparable. Preferentemente, dichos análogos tienen una
secuencia aminoacídica al menos 60%, y más preferentemente al menos
80%, y más preferentemente al menos 95%, igual a la de
GLP-2 o un fragmento de GLP-2 que
tenga el mismo número de residuos aminoací-
dicos.
dicos.
El presente derivado peptídico estimulador del
crecimiento del tejido gastrointestinal comprende un péptido
estimulador del crecimiento del tejido gastrointestinal que se ha
modificado mediante su acoplamiento a una entidad reactiva, bien
directamente o bien a través de un grupo de enlace, en la que la
entidad reactiva es capaz de formar un enlace covalente con un
componente de la sangre, preferentemente proteínas de la sangre. La
entidad reactiva es estable en un entorno acuoso y es MPA. El enlace
covalente se forma entre la entidad reactiva y un grupo tiol sobre
el componente de la sangre. El componente de la sangre preferido
comprende componentes móviles de la sangre, como albúmina sérica,
inmunoglobulinas o combinaciones de los mismos. En una forma de
realización más preferida, el componente de la sangre es albúmina
sérica.
Preferentemente, los componentes de la sangre
son móviles, lo que significa que no tienen un sitio fijo para
ningún periodo de tiempo extendido, generalmente no superior a 5
minutos, y, más normalmente, un minuto. Estos componentes de la
sangre no están asociados a la membrana y están presentes en la
sangre durante periodos prolongados de tiempo en una concentración
mínima de al menos 0,1 \mug/ml. Entre los componentes de la sangre
móviles preferidos se incluyen albúmina sérica, transferrina,
ferritina e inmunoglobulinas, tales como IGM e IgG. La semivida de
los componentes móviles de la sangre es de, al menos,
aproximadamente 12 horas.
El presente derivado estimulador del crecimiento
del tejido gastrointestinal es un péptido de GLP-2,
y, por tanto, pueden ser necesarios grupos protectores durante el
proceso de síntesis del derivado de GLP-2. Estos
grupos protectores son convencionales en el campo de la síntesis
peptídica y, genéricamente, pueden describirse como restos químicos
capaces de proteger al derivado peptídico de la reacción con otros
grupos funcionales. Comercialmente existen varios grupos
protectores, ejemplos de los cuales se pueden encontrar en el
documento US 5.493.007, que se incorpora en la presente memoria
descriptiva por referencia. Entre los ejemplos típicos de grupos
protectores adecuados se incluyen acetilo,
fluorenilmetiloilcarbonilo (FMOC),
t-butiloxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo
(CBZ), etc. La Tabla 1 proporciona las abreviaturas con tres letras
y con una letra de los aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El derivado de GLP-2 forma un
péptido estabilizado frente a peptidasa tras la conjugación con un
componente de la sangre, una albúmina. También se contempla que uno
o más aminoácidos adicionales se pueden añadir, o sustituir, al
péptido antes de la adición de la entidad reactiva, para facilitar
su acoplamiento al péptido. Tal adición o sustitución se puede
realizar en el extremo N, el extremo C, o entre ellos. El derivado
peptídico obtenido de este modo se puede administrar a un sujeto,
animal o ser humano, de modo que la conjugación con los componentes
de la sangre se produce in vivo, o pueden conjugarse primero
con los componentes de la sangre del sujeto, animal o ser humano,
in vitro, y el conjugado resultante, o péptido estabilizado
frente a peptidasa como se define más adelante, se administra al
sujeto.
Todos los aminoácidos presentes, sustituidos
con, o añadidos a, la secuencia de GLP-2, pueden ser
D-aminoácidos o L-aminoácidos, o
combinaciones de ambos. Normalmente se prefieren
L-aminoácidos. Los derivados de la presente
invención tienen una sustitución de glicina en la posición 2 de la
secuencia del GLP-2 nativo porque confiere al
análogo mayor resistencia a la enzima DPP-IV.
\newpage
Un derivado de GLP-2
estabilizado frente a peptidasa es más estable en presencia de
peptidasas in vivo que su correspondiente análogo de
GLP-2 no estabilizado. La estabilidad a la peptidasa
se determina mediante la comparación de la semivida del análogo del
GLP-2 nativo en suero o sangre con la semivida del
correspondiente derivado que contiene la entidad reactiva en suero
o sangre. La semivida se determina obteniendo muestras de suero o
sangre tras la administración del derivado y del péptido no
modificado y determinando la actividad de cada
compuesto.
compuesto.
Con mayor detalle, la presente invención está
dirigida a la modificación de GLP-2 y de los
análogos y fragmentos del mismo para mejorar su biodisponibilidad,
prolongar la semivida in vivo y la distribución a través de
la conjugación selectiva en un componente de la sangre a la vez que
se mantiene o mejora considerablemente sus notables propiedades
terapéuticas.
Se sabe que el GLP-2 humano
tiene la secuencia siguiente:
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Tbr-Lys-Ile-Thr-Asp.
La invención se refiere a usos terapéuticos y
relacionados de derivados de GLP-2 que tienen una
semivida in vivo extendida, particularmente a
- -
- estimular el crecimiento del tejido delgado y/o grueso;
- -
- elevar los niveles en sangre del derivado de GLP-2;
- -
- restablecer o mantener la función gastrointestinal;
- -
- estimular la cicatrización y el recrecimiento de la mucosa intestinal dañada o ulcerada/inflamada;
- -
- reducir el riesgo de enfermedad entérica;
- -
- potenciar el estado nutricional;
- -
- tratar o prevenir los trastornos o enfermedades gastrointestinales o nutricionales;
- -
- reducir la pérdida de peso:
- -
- reducir la expresión de interleucina-1;
- -
- incrementar la longitud del colon, tanto del área mucosa como de la integridad del colon, y la profundidad de las criptas;
- -
- estimular el crecimiento de las vellosidades en sujetos que sufren una enfermedad, tal como enfermedad celíaca, atrofia postinfecciosa de las vellosidades y síndromes del intestino corto;
- -
- estimular la proliferación del intestino delgado y grueso en un sujeto sano, por ejemplo para permitir el incremento de la absorción de nutrientes en ganado vacuno, lo que permite un destete más temprano o el incremento de la producción de leche y carne; etc.
El efecto sobre el crecimiento provocado por los
presentes derivados del GLP-2 se manifiesta en forma
de un incremento del peso del intestino delgado, con respecto a un
control tratado de forma simulada. En particular, se considera que
los presentes derivados de GLP-2 poseen actividad
"intestinotrófica" si, cuando se evalúan en el modelo murino
ejemplo en la presente memoria descriptiva, el análogo media en un
incremento del peso del intestino delgado de al menos un 10% en
relación con un animal control que ha recibido vehículo solo.
Particularmente adecuados para el uso terapéutico son los derivados
que median en un incremento de al menos un 20% en el peso del
intestino delgado, mientras que los más preferidos median en un
incremento en el peso del intestino delgado del 50% o superior. La
actividad intestinotrófica se observa más significativamente en
relación con el yeyuno, incluido el yeyuno distal y, en particular,
el yeyuno proximal, y también se observa en el íleon.
Además de exhibir actividad intestinotrófica,
los presentes derivados de GLP-2 incorporan una
sustitución aminoacídica dentro de una "estructura" peptídica
del GLP-2, que es una variante de una especie de
GLP-2 de mamífero en la que el extremo C se ha
alterado mediante la adición de un residuo básico. Por tanto, los
presentes derivados peptídicos incorporan un residuo de lisina
añadido al extremo C de la secuencia peptídica de
GLP-2.
La funcionalidad en la proteína será un grupo
tiol y la entidad reactiva serán el grupo que contiene maleimida,
ácido maleimidopropiónico (MPA) o ácido
2-[2-(2-amino)etoxi)]epoxi acético
(AEEA)-MPA.
Los grupos maleimida son más selectivos por los
grupos sulfhidrilo sobre péptidos, en los que el pH de la mezcla de
reacción se mantiene entre 6,5 y 7,4. A pH 7,0, la velocidad de la
reacción de los grupos maleimido con sulfhidrilos es 1000 veces más
rápida que con las amidas. Se forma un enlace tioéter estable entre
el grupo maleimido y el sulfhidrilo que no se puede escindir en
condiciones fisiológicas.
Los derivados estimuladores del crecimiento del
tejido gastrointestinal de la invención proporcionan un marcaje
específico de los componentes de la sangre. Tal marcaje específico,
en particular con una maleimida, ofrece varias ventajas. Los grupos
tioles libres son menos abundantes in vivo que los grupos
amino, y, como resultado, los derivados de maleimida se unen
covalentemente a menos proteínas. Por ejemplo, en la albúmina
sérica, sólo hay un grupo tiol por molécula. Por tanto, un
conjugado
GLP-2-maleimida-albúmina
tenderá a comprender una proporción molar de 1:1 entre el péptido y
la albúmina. Además de la albúmina, las moléculas de IgG (clase II)
también poseen tioles libres. Dado que las moléculas de IgG y la
albúmina sérica constituyen la mayoría de las proteínas solubles en
la sangre, es decir el 99%, también constituyen la mayoría de los
grupos tiol libres disponibles para unirse covalentemente a un
GLP-2 sustituido con maleimida.
Además, incluso entre las proteínas de la sangre
que contienen tioles libres, el marcaje específico con una
maleimida da lugar a la formación preferencial de conjugados
péptido-maleimida-albúmina, debido a
las exclusivas características de la propia albúmina. El grupo tiol
libre único, altamente conservado entre especies, se localiza en el
residuo aminoacídico Cys_{34}. Recientemente se ha demostrado que
la Cys_{34} de la albúmina tiene una reactividad mayor en
relación con los tioles libres sobre otras proteínas que contienen
tiol libre. Esto se debe, en parte, al inusual valor de la pK de
5,5 para la Cys_{34} de la albúmina. Este es muy inferior a los
valores de pK típicos para los residuos de cisteína en general, que
normalmente son de aproximadamente 8. Debido a esta baja pK, en
condiciones fisiológicas normales, la Cys_{34} de la albúmina
está, predominantemente, en forma aniónica, lo que incrementa de
forma espectacular su reactividad. Además del bajo valor de pK de
la Cys_{34}, otro factor que potencia la reactividad de Cys_{34}
es su localización, que está en un bolsillo hidrofóbico cercano a
la superficie de un bucle de la región V de la albúmina. Esta
localización hace que la Cys_{34} sea accesible a ligandos de
todos los tipos y es un importante facto en el papel biológico de
la Cys_{34} como atrapamiento de radicales libres y secuestrante
de tiol libre. Como resultado, la aceleración de la velocidad de la
reacción puede ser de hasta 1000 veces mayor en relación con las
velocidades de la reacción del péptido-maleimidas
con otras proteínas que contienen tiol libre.
Otra ventaja de los conjugados
péptido-maleimida-albúmina es la
reproducibilidad asociada con la carda de 1:1 del péptido y la
albúmina, específicamente en Cys_{34}. Las técnicas de activación
convencionales, tales como con glutaraldehído, DCC, EDC y otros
activadores químicos de, por ejemplo, aminas libres, carecen de
esta selectividad. Por ejemplo, la albúmina contiene 52 residuos de
lisina, 25-30 de los cuales se localizan en la
superficie de la albúmina y son accesibles para la conjugación. Al
activar estos residuos de lisina, o, como alternativa, al modificar
un péptido para que se acople a través de estos residuos de lisina,
se obtiene como resultado una población heterogénea de conjugados.
Aunque se emplee una proporción equimolar de péptido:albúmina (es
decir 1:1), el resultado final es la producción de productos de
conjugación aleatorios, de los que algunos contienen un número
indefinido de péptidos unidos a cada molécula de albúmina y cada
conjugado tiene péptidos acoplados de forma aleatoria a uno
cualquiera de los sitios de lisina disponibles
25-30. En consecuencia, la caracterización de la
composición exacta es prácticamente imposible, sin mencionar la
ausencia de reproducibilidad. Además, aunque parecería que la
conjugación a través de residuos de lisina de albúmina tendría, como
mínimo, la ventaja de liberar más agente terapéutico por molécula
de albúmina, los estudios han mostrado que se prefiere una
proporción 1:1 entre el agente terapéutico y la albúmina. En un
artículos de Stehle, y col. en Anti-Cancer Drugs,
1997, 8-677-685, se comunica que una
proporción de 1:1 del metotrexato anticanceroso y la albúmina
conjugados a través de glutaraldehído dio los resultados más
prometedores. Estos conjugados fueron captados por las células
tumorales, mientras que los conjugados que portan las moléculas de
metotrexato en una proporción de 5:1 a 20:1 tenían perfiles
alterados en la HPLC y eran captados rápidamente por el hígado in
vivo. Por tanto, parecería que a proporciones superiores, la
eficacia de la albúmina como portador de un agente terapéutico
disminuye.
Mediante la administración controlada del
presente derivado peptídico de GLP-2, y
particularmente un péptido de GLP-2 que comprende
una entidad reactiva de maleimida, se puede controlar el marcaje o
la unión in vivo específicas de la albúmina y la IgG. En
administraciones típicas, se ha mostrado que el
80-90% de los derivados peptídicos administrados se
une a la albúmina y que menos del 5% se une a la IgG. También se
produce la unión mínima de los tioles libres presentes, tal como
glutatión. Dicha unión específica se prefiere para usar in
vivo, ya que permite el cálculo preciso de la semivida estimada
del agente terapéutico administrado.
Normalmente, los péptidos de
GLP-2 sustituidos con maleimida son bastante
estables en presencia de soluciones acuosas y en presencia de
aminas libres. Dado que los péptidos de GLP-2
sustituidos con maleimida reaccionan con tioles libres, los grupos
protectores no son necesarios para impedir que reacciones con ellos
mismos.
Como se ha indicado antes, los conjugados
deseados de los derivados de GLP-2 con componentes
de la sangre se pueden preparar in vivo mediante la
administración de los derivados directamente al sujeto, que puede
ser un animal o un ser humano. La administración puede realizarse en
forma de bolo o introducirse lentamente en el tiempo mediante
infusión utilizando flujo dosificado o similares.
Como alternativa, el conjugado puede también
prepararse ex vivo mediante la combinación de sangre o
componentes de la sangre purificados disponibles comercialmente con
el presente derivado de GLP-2, lo que permite la
unión covalente del derivado de GLP-2 con las
funcionalidades de los componentes de la sangre y, después, el
retorno o administración al huésped de la sangre conjugada o del
componente de sangre purificado conjugado. Además, esto también se
puede conseguir, en primer lugar, purificando un componente
individual de la sangre o un número limitado de componentes, como
eritrocitos, inmunoglobulinas, albúmina sérica o similares, y
combinando el componente o componentes ex vivo con el
presente derivado del compuesto. La sangre o componente de la
sangre marcado puede devolverse al sujeto para proporcionar in
vivo los conjugados terapéuticamente eficaces. Asimismo, la
sangre se puede tratar para prevenir la coagulación durante su
manipulación ex vivo.
Los péptidos de GLP-2 se pueden
sintetizar mediante procedimientos estándar de química peptídica de
fase sólida bien conocidos para cualquier experto en la técnica.
Por ejemplo, el péptido puede sintetizase mediante técnicas de
química de fase sólida siguiendo los procedimientos descritos por
Steward y col., en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce
Chemical Company, Rockford III., (1984) con un sintetizador Rainin
PTI Symphony^{TM}. De igual forma, los fragmentos peptídicos se
pueden sintetizar y, posteriormente, combinar o unir para formar un
péptido más grande (condensación de segmentos). Estos fragmentos
peptídicos sintéticos también se pueden hacer con sustituciones y/o
deleciones de aminoácidos en lugares específicos.
Para la síntesis de péptidos en fase sólida, se
puede encontrar un resumen de las muchas técnica en Stewart y col.,
en "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co. (San
Francisco), 1963 y Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides 1973,
2 46. Para la síntesis en solución clásica, véase, por ejemplo.
Schroeder y col., en "The Peptides", volumen 1, Academic Press
(Nueva York). En general, tal procedimiento comprende la adición
secuencia de uno o más aminoácidos o aminoácidos protegidos
adecuadamente a una cadena peptídica en crecimiento sobre un
polímero. Normalmente, bien el grupo amino o el grupo carboxilo del
primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. A
continuación, el aminoácido protegido y/o derivado se fija a un
soporte sólido inerte o se utiliza en solución añadiendo el
siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo
complementario (amino o carboxilo) protegido adecuadamente y en
condiciones adecuadas para formar el enlace amida. Después, el
grupo protector se elimina de este residuo aminoácido recién añadido
y se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así
sucesivamente.
Después de que todos los aminoácidos deseados se
han unido en la secuencia adecuada, cualquier grupo protector
restante (y cualquier soporte sólido) se escinden secuencialmente o
simultáneamente para dar el péptido final. Mediante simple
modificación de este procedimiento general, es posible añadir más de
un aminoácido a la vez a la cadena en crecimiento mediante, por
ejemplo, acoplamiento (en condiciones que no racemizan los centros
quirales) de un tripéptido protegido con un dipéptido protegido
adecuadamente para formar, tras la desprotección, un pentapéptido
(condensación de segmentos).
Un procedimiento particularmente preferido de
preparar los presentes derivados de GLP-2 implica la
síntesis peptídica en fase sólida, en la que el extremo
\alpha-N del aminoácido está protegido por un
grupo sensible a ácido o a base. Tales grupos protectores deberán
tener las propiedades de ser estables a las condiciones de la
formación de enlaces peptídicos al tiempo que se pueden eliminar
fácilmente sin destruir la cadena peptídica en crecimiento ni
producir racemización de cualquiera de los centros quirales
contenidos en la misma. En Green, "Protective Groups in Organic
Synthesis" (John Wiley and Sons, Nueva York, pág.
152-186 (1981)) se describen ejemplos de grupos
N-protectores y carboxi-protectores.
Ejemplos de grupos N-protectores comprenden, sin
limitaciones, grupos de alcanoílo inferior tales como formilo,
acetilo ("Ac"), propionilo, pivaloílo,
t-butilacetilo y similares; otros grupos acilo
incluyen 2-cloroacetilo,
2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo,
ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, -clorobutirilo,
benzoílo, 4-clorobenzoílo,
4-bromobenzoílo, 4-nitrobenzoílo y
similares; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo,
p-toluenosulfonilo,
o-nitrofenilsulfonilo,
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(pmc) y similares; grupos formadores de carbamato tales como
t-amiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo,
p-clorobenciloxicarbonilo,
p-metoxibenciloxicarbonilo,
p-nitrobenciloxicarbonilo,
2-nitrobenciloxicarbonilo,
p-bromobenciloxicarbonilo,
3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo,
3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo,
2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo,
4-etoxibenciloxicarbonilo,
2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo,
3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo,
1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo,
\alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo,
bencihidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (boc),
diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo,
metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2,-tricloroetoxicarbonilo,
fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo,
fluorenil-9-metoxicarbonilo,
isoborniloxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo,
adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y
similares; grupos arilalquilo tales como bencilo,
bifenilisopropiloxicarbonilo, trifenilmetilo, benciloximetilo,
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y similares, y
grupos sililo tales como trimetilsililo y similares. Grupos
\alpha-N-protectores preferidos
son o-nitrofenilsulfenilo;
9-fluorenimetiloxicarbonilo;
t-butiloxicarbonilo (boc), isoborniloxicarbonilo;
3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo;
t-amiloxicarbonilo;
2-ciano-t-butiloxicarbonilo,
y similares, de los que el más preferido es
9-fluorenil-metiloxicarbonilo
(Fmoc), mientras que los grupos N-protectores
preferidos de la cadena comprenden
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(pmc), nitro, p-toluenosulfonilo,
4-metoxibenceno-sulfonilo, Cbz, Boc,
y adamantiloxicarbonilo para los grupos amino de la cadena lateral,
tal como lisina y arginina; bencilo,
o-bromobenciloxicarbonilo,
2,6-diclorobencilo, isopropilo,
t-butilo (t-Bu), ciclohexilo,
ciclopentilo y acetilo (Ac) para tirosina; t-butilo,
bencilo y tetrahidropianilo para serina; tritilo, bencilo, Cbz,
p-toluenosulfonilo y
2,4-dinitrofenilo para histidina; formilo para
triptófano; bencilo y t-butilo para ácido aspártico
y ácido glutámico; y trifenilmetilo (tritilo) para cisteína.
Por convención, un grupo
carboxi-protector se refiere a un grupo éster o
amida protector de ácido carboxílico. Tales grupos
carboxi-protectores son bien conocidos para los
expertos en la técnica y se han utilizado ampliamente en la
protección de grupos carboxilo en los campos de penicilina y
cefalosporina como se describe en los documentos US 3.840.556 y
3.719-667. Grupos
carboxi-protectores representativos comprenden, sin
limitaciones, alquilo inferior C_{1}-C_{8};
arialquilo tal como fenetilo o bencilo, y sus derivados sustituidos
tales como grupos alcoxibencilo o nitrobencilo; arilalquenilo tal
como feniletenilo; arilo y sus derivados sustituidos tales como
5-indanilo; dialquilaminoalquilo tales como
dimetilaminoetilo; grupos alcanoiloxialquilo tales como
acetoximetilo, butiriloximetilo, vateriloximetilo,
isobutiriloximetilo, isovaleriloximetilo,
1-(propioniloxi)-1-etilo,
1-(pivaloiloxil)-1-etilo,
1-metil-1-(propioniloxi)-1-etilo,
pivaloiloximetilo, propioniloximetilo; grupos
cicloalcanoiloxiallcilo tales como ciclopropilcarbaniloximetilo,
ciclobutilcarboniloximetilo, ciclopentilcarboniloximetilo,
ciclohexilcarboniloximetilo; aroiloxialquilo tal como
benzoiloximetilo, benzoiloxietilo; arilalquilcarboniloxialquilo tal
como bencilcarboniloximetilo,
2-bencilcarboniloxietilo; alcoxicarbonilalquilo o
cicloalquiloxicarbonilalquilo tales como metoxicarbonilmetilo,
ciclohexiloxicarbonilmetilo,
1-metoxicarbonil-1-etilo;
alcoxicarboniloxialquilo o cicloalquiloxicarboniloxialquilo tal
como metoxicarboniloximetilo,
t-butiloxicarboniloximetilo,
1-etoxicarboniloxi-1-etilo,
1-ciclohexiloxicarboniloxi-1-etilo;
ariloxicarboniloxialquilo tal como
2-(fenoxicarboniloxi)etilo,
2-(5-indaniloxicarboniloxi)-etilo;
alcoxialquilcarboniloxialquilo tal como
2-(1-metoxi-2-metilpropan-2-oiloxi)-etilo;
arilalquiloxicarboniloxialquilo tal como
2-(benciloxicarboniloxi)etilo;
arilalqueniloxicarboniloxialquilo tal como
2-(3-fenilpropen-2-iloxicarboniloxi)etilo;
alcoxicarbonilaminoalquilo tal como
t-butiloxicarbonilaminometilo;
alquilaminocarbonilaminoalquilo tal como
metilaminocarbonilaminometilo; alcanoilaminoalquilo tal como
acetilaminometilo; carboniloxialquilo heterocíclico tal como
4-metilpiperazinilcarboniloximetilo;
dialquilaminocarbonilalquilo tal como dimetilaminocarbonilmetilo,
dietilaminocarbonilmetilo; (5-(alquilo
inferior)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo
tal como
(5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo;
y
(5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo
tal como
(5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo.
Grupos carboxi-protectores de amida representativos
comprenden, sin limitaciones, grupos aminocarbonilo y
aminocarbonilalquilo inferior. De los grupos
carboxi-protectores anteriores se prefieren alquilo
inferior, éster de cicloalquilo o de arilalquilo, por ejemplo,
éster metílico, éster etílico, éster propílico, éster isopropílico,
éster butílico, éster sec-butílico, éster
isobutílico, éster amílico, éster isoamílico, éster octílico, éster
ciclohexílico, éster feniletílico y similares, o un éster de
alcanoiloxialquilo, de cicloalcanoiloxialquilo, aroiloxialquilo o de
arilalquilcarboniloxialquilo. Grupos
carboxi-protectores de amida preferidos son los
grupos aminocarbonilalquilo inferior.
En el procedimiento de síntesis peptídica de
fase sólida, el aminoácido
\alpha-C-terminal está unido a un
soporte o resina sólido adecuado. Soportes sólidos adecuados útiles
para la síntesis anterior son los materiales que son inertes para
los reactivos y condiciones de reacción de las reacciones
escalonadas condensación-desprotección, además de
ser insolubles en el medio usado. El soporte sólido preferido para
la síntesis de péptidos carboxi
\alpha-C-terminal es resina
4-hidroximetilfenoxiacetil-4'-metilbencihidrilamina
(resina HMP). El soporte sólido preferido para péptidos
\alpha-C-terminal protegidos por
Fmoc es resina Ramage.
Cuando el soporte sólido es resina
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxi-acetamidoetilo,
el grupo Fmoc se escinde con una amina secundaria, preferentemente
piperidina, antes del acoplamiento con el aminoácido
\alpha-C-terminal tal como se ha
descrito antes. El procedimiento preferido para el acoplamiento a la
resina
4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxi-acetamidoetilo
desprotegida es
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluroniohexafluorofosfato
(HBTU, 1 equiv.), diisopropiletilamina (DIEA, 1 equiv.) y,
opcionalmente, 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1
equiv.) en DMF. El acoplamiento de sucesivos aminoácidos protegidos
se puede llevar a cabo en un sintetizador de polipéptidos
automático de un modo convencional, como es bien conocido en la
técnica.
La eliminación del grupo protector Fmoc del
lateral \alpha-N terminal del péptido en
crecimiento se consigue convencionalmente, por ejemplo, mediante el
tratamiento con una amina secundaria, preferentemente piperidina.
Cada aminoácido protegido se introduce después en un exceso de
aproximadamente 2 molar y el acoplamiento se lleva a cabo,
preferentemente, en DMF. El agente de acoplamiento es, normalmente,
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluroniohexafluorofosfato
(HBTU, 1 equiv.), diisopropiletilamina (DIEA, 1 equiv.),
diisopropiletilamina (DIEA, 1 equiv.) y, opcionalmente,
1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1 equiv.).
Al final de la síntesis en fase sólida, el
péptido se extrae de la resina y se desprotege, bien en operaciones
sucesivas o en una única operación. La eliminación del polipéptido y
la desprotección se pueden conseguir cómodamente en una única
operación mediante el tratamiento del polipéptido unido a la resina
con un reactivo de escisión que comprende tioanisol,
triisopropilsilano, fenol y ácido teifluoroacético. En los casos en
los que el \alpha-C-terminal del
polipéptido es una alquilamida, la resina se escinde mediante
aminolisis con una alquilamina. Como alternativa, el péptido puede
eliminarse mediante transesterificación, por ejemplo con metanol,
seguida por aminolis o por transamidación directa. El péptido
protegido puede purificarse en este punto o pasarse a la siguiente
etapa directamente. La eliminación de los grupos protectores de la
cadena lateral se consigue usando la mezcla de escisión descrita
antes. El péptido completamente desprotegido se puede purificar
mediante una secuencia de etapas cromatográficas que emplean
cualquiera o todos los tipos siguientes: intercambio de iones en
una resina débilmente básica (forma de acetato); cromatografía de
absorción hidrofóbica en poliestireno no
derivado-divinilbenceno (tal como Amberlite
XAD^{TM}); cromatografía de absorción en gel de sílice;
cromatografía de intercambio iónico sobre carboximetilcelulosa;
cromatografía de reparto, por ejemplo en Sephadex
G-25^{TM}, LH-20^{TM} o
distribución contracorriente; cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC), especialmente HPLC de fase inversa en columna
de fase de sílice unida a octilo u octadecilsililo. Cualquier
experto en la técnica podrá determinar con facilidad cuáles serían
las etapas o secuencias cromatográficas preferidas necesarias para
obtener una purificación aceptable del péptido
GLP-2.
GLP-2.
Los pesos moleculares de estos péptidos se
determinan usando espectroscopia de masas Quadrupole Electro
Spray.
El procedimiento de síntesis para la producción
de los derivados de GLP-2 de la presente invención
variará ampliamente en función de la naturaleza de los diversos
elementos, es decir la secuencia de GLP-2, el grupo
de unión y la entidad reactiva, que comprenden el derivado de
GLP-2. Los procedimientos sintéticos se seleccionan
para garantizar la simplicidad, altos rendimientos y la
repetitividad, así como para permitir la obtención de un producto
altamente purificado. Normalmente, la entidad químicamente reactiva
se acoplará en la última etapa de la síntesis con, por ejemplo, un
grupo carboxilo, esterificación para formar un éster activo. Más
adelante se describen procedimientos específicos para la producción
de los presentes derivados de GLP-2.
Es imperativo que la entidad químicamente
reactiva se coloque en un sitio que permita que el péptido se una
covalentemente al componente de la sangre a la vez que conserva una
proporción considerable, si no toda, de actividad y/o efectos
beneficiosos del correspondiente péptido de GLP-2
nativo.
Los derivados de GLP-2 se pueden
administrar a pacientes que se beneficiarían del crecimiento del
tejido del tracto gastrointestinal superior. Además, los pacientes
que se beneficiarían de un incremento de la función del tejido del
tracto gastrointestinal superior, sea como resultado de un
incremento del crecimiento del tejido o no, son candidatos para el
tratamiento de la invención. En general, los pacientes que se
beneficiarían de un incremento de la masa del tejido del tracto
gastrointestinal superior y/o de un incremento de la función de la
mucosa del tracto gastrointestinal superior son candidatos para el
tratamiento con los presentes derivados del péptido
GLP-2. entre las afecciones concretas que pueden
tratarse con los presentes derivados de GLP-2 se
incluyen las diversas formas de enfermedades inflamatorias del
estómago o el esófago, así como los pacientes que se han sometido a
una resección parcial o subtotal del tracto gastrointestinal
superior. Una lista no exhaustiva de afecciones del tracto
gastrointestinal superior, incluido el estómago y el esófago, que
pueden tratarse mediante los presentes derivados de
GLP-2 o mezclas de los mismos, comprenden trastornos
del estómago como gastritis aguda, gastritis hemorrágica aguda,
gastritis aguda por Helicobacter pylori, gastritis de tipo
A, B o C, gastritis hipersecretora, gastritis inespecífica
secundaria a Helicobacter pylori, gastritis asociada con
Helicobacter pylori, gastritis química, gastritis reactiva,
gastritis por reflujo, gastritis biliar, gastritis atrófica
metaplásica y gastritis atrófica metaplásica ambiental, pangastritis
idiopática, gastritis corporal difusa, gastritis crónica
autoinmunitaria y gastritis asociada con enfermedades
autoinmunitarias, gastritis bacteriana distinta a las relacionadas
con Helicobacter pylori (Gastrospirillum hominis,
flemonosa, micobacteriana, sifilítica), gastritis atrófica
postantrectomía, gastritis eosinofílica y otras gastritis
infecciosas agudas; enfermedad de Crohn, sarcoidosis, gastritis
granulomatosa aislada, gastritis linfocítica, enfermedad de
Menetriere, etc., y trastornos del esófago como esofagitis
infecciosa de hongos como especies de Candida (esp.
albicans), Aspergillus sp., Histoplasma capsulatwn,
Blastomyces dermatitides, o de virus como el virus del herpes
simple (de tipo 1), citomegalovirus, virus de
Varicela-zoster, o de bacterias como
Mycobacterium tuberculosis, Actinomyces israelii, Streptococcus
viridans, Lactobacillus acidophilus y Treponema
pallidum. Otros trastornos del esófago incluyen, sin
limitaciones, esofagitis no infecciosa, reflujo de ácido, reflujo
de bilis, lesiones químicas (causadas por medicamentos, toxinas,
ácidos, álcalis, etc.), sarcoidosis, enfermedad de Crohn,
enfermedad de Behcet, enfermedad del injerto contra el huésped,
infecciones relacionadas con el SIDA (Cryptosporidium sp.,
Microsporidium sp., Isospora beill, Giardia Lamblia, Salmonella
sp., Shigella sp., Campylobacter sp., Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium avium complex, Clostridium difficile,
citomegalovirus y herpes simple).
Otras enfermedades o afecciones que se pueden
tratar con los presentes derivados peptídicos de GLP2- incluyen
anomalías en la mucosa del intestino delgado, que incluyen úlceras y
trastornos inflamatorios; trastornos congénitos o adquiridos de la
digestión y la absorción, incluidos los síndromes de malabasorción;
y enfermedades y afecciones causadas por pérdida de la función en
la mucosa del intestino delgado, particularmente en pacientes
sometidos a alimentación parenteral prolongada o que, como resultado
de cirugía, han sufrido resección del intestino delgado y sufren el
síndrome del intestino corto y el síndrome del
cul-de-sac. En general, los
pacientes que se beneficiarían de un incremento de la masa del
intestino delgado y del consiguiente incremento de la función de la
mucosa del intestino delgado son candidatos para el tratamiento con
derivados peptídicos de GLP-2. Afecciones concretas
que se pueden tratar con los presentes derivados de
GLP-2 incluyen las diversas formas de esprúe,
incluido el esprúe celíaco que es el resultado de una reacción
tóxica a la gliadina del trigo y que está marcado por una tremenda
pérdida de vellosidades del intestino delgado; el esprúe tropical
que es el resultado de una infección y que está marcador por un
aplanamiento parcial de las vellosidades; el esprúe
hipogammaglobulinémico que normalmente se observa en pacientes con
inmunodeficiencia o hipogammaglobulinemia variable común y que está
marcado por una disminución significativa de la altura de las
vellosidades. Otras afecciones que se pueden tratar con los
presentes derivados, o para los que pueden ser útiles
profilácticamente, incluyen enteritis por radiación, enteritis
infecciosa o enteritis postinfecciosa, enteritis regional
(enfermedad de Crohn), daños en el intestino delgado debido a
agentes tóxicos u otros quimioterapéuticos, y los pacientes con
síndrome del intestino corto.
En otro aspecto, los pacientes candidatos para
el tratamiento con los presentes derivados peptídicos de
GLP-2 son aquéllos que se beneficiarían del
crecimiento de los islotes pancreáticos, y, particularmente, de la
proliferación o regeneración de los islotes pancreáticos. Dichos
pacientes incluyen los que sufren enfermedades o afecciones
marcadas por la ausencia o la reducción de los islotes pancreáticos
o por la reducción de la función de los islotes pancreáticos.
Pacientes candidatos concretos son los que sufren diabetes de tipo 1
o de tipo 2, asó como pacientes con formas secundarias de diabetes
debido a infiltración, inflamación o destrucción del páncreas.
Los presentes derivados de GLP-2
se pueden usar solos o en combinación para optimizar sus efectos
terapéuticos. Se pueden administrar en un medio fisiológicamente
aceptable, por ejemplo agua desionizada, solución salina tamponada
con fosfato (PBS), solución salina, etanol acuoso u otro alcohol,
plasma, soluciones proteináceas, manitol, glucosa acuosa, alcohol,
aceite vegetal o similares. Otros aditivos que se pueden incluir
incluyen tampones, en los que los medios se tamponan, en general, a
un pH dentro de los límites de 5 a 10, en los que la concentración
del tampón normalmente variará de aproximadamente 50 a 250 mM, sal,
en la que la concentración de sal normalmente oscilará de
aproximadamente 5 a 500 mM, estabilizantes fisiológicamente
aceptables, y similares. Las composiciones pueden liofilizarse para
su almacenamiento y transporte cómodo.
Los presentes derivados peptídicos se pueden
administrar por vía oral, por vía parenteral, tal como por vía
intravascular (IV), intraarterial (IA), intramuscular (IM),
subcutánea (SC) o similares. La administración puede, en
situaciones adecuadas, ser mediante transfusión. En algunos casos,
en los que la reacción del grupo funcional es relativamente lento,
la administración puede ser oral, nasal, rectal, transdérmica o en
aerosol, en las que la naturaleza del conjugado permite la
transferencia al sistema vascular. Normalmente se empleará una
única inyección aunque se puede usar más de una inyección, si se
desea. El derivado peptídico puede administrarse por cualquier
medio conveniente, incluidos jeringuilla, trócar, catéter o
similares. El modo concreto de administración variará en función de
la cantidad a administrar, sea un bolo único o administración
continua, o similares. Preferentemente, la administración será
intravascular, en la que el sitio de la introducción no es crítico
para esta invención, preferentemente en un sitio en el que exista un
flujo rápido de sangre, por ejemplo por vía intravenosa, en vena
periférica o central. Otras vías pueden encontrar utilidad cuando la
administración se acopla con técnicas de liberación lenta o una
matriz protectora. La intención es que los péptidos se puedan
distribuir con eficacia en la sangre, de modo que puedan reaccionar
con los componentes de la sangre. La concentración del conjugado
variará ampliamente, en general de aproximadamente 1 pg/ml a 50
mg/ml. Normalmente, el total administrado intravascularmente puede
estar, en general, en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a
aproximadamente 10 mg/ml, más normalmente de aproximadamente 1
mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml.
Mediante la unión a componentes de la sangre de
vida prolongada, tales como inmunoglobulina, albúmina sérica,
eritrocitos y plaquetas, se produce una serie de ventajas. La
actividad de los presentes derivados de GLP-2 se
extiende durante días y, potencialmente, hasta semanas. Durante este
periodo de tiempo sólo se necesita una administración. Se puede
conseguir mayor especificidad, dado que el compuesto activo se unirá
principalmente a moléculas grandes, que tienen menor probabilidad
de ser captadas intracelularmente y de que interfieran con otros
procesos
fisiológicos.
fisiológicos.
La sangre del huésped mamífero se puede
monitorizar para detectar la actividad de GLP-2 y/o
la presencia de derivados de GLP-2. Tomando una
muestra de sangre del huésped a tiempos diferentes, se puede
determinar si el péptido GLP-2 se ha unido a los
componentes de la sangre de vida prolongada en cantidades
suficientes para ser terapéuticamente activos y, después, el nivel
de GLP-2 en la sangre. Si se desea, también se puede
determinar a cual de los componentes de la sangre está unido
covalentemente el péptido GLP-2. Para péptidos
específicos sustituidos con maleimida, es mucho más sencillo
calcular la semivida de la albúmina en suero y la IgG. La
monitorización también puede tener lugar usando ensayos de la
actividad peptídica, HPLC-EM o anticuerpos dirigidos
a los
péptidos.
péptidos.
Se han descrito procedimientos para determinar
la concentración del péptido GLP-2 o su conjugado en
las muestras biológicas (tal como sangre) usando anticuerpos
específicos del péptido GLP-2 y del uso de tales
anticuerpos como tratamiento de la toxicidad potencialmente
asociada con tal péptido GLP-2 o el conjugado. Esto
es ventajoso por el incremento de la estabilidad y la vida del
péptido GLP-2 in vivo en el paciente podría
producir problemas nuevos durante el tratamiento, incluido el
incremento de la posibilidad de toxicidad. El uso de anticuerpos
anti-GLP-2, bien monoclonales o
policlonales, con especificidad específica por
GLP-2, puede ayudar a mediar en cualquier problema
de este tipo. El anticuerpos se puede generar o derivar de un
huésped inmunizado con el derivado concreto de
GLP-2 o con un fragmento inmuno génico del agente o
un inmunógeno sintetizado correspondiente a un determinante
antigénico del agente. Los anticuerpos preferidos tendrán una
especificada y afinidad elevadas por las formas nativa, derivada y
conjugada del derivado peptídico de GLP-2. Dichos
anticuerpos también se pueden marcar con enzimas, fluorocromos o
radiomarcadores.
Se pueden producir anticuerpos específicos para
los derivados de GLP-2 usando péptidos de
GLP-2 purificados para la inducción de anticuerpos
específicos de GLP-2 derivados. Mediante la
inducción de anticuerpos, se pretende no sólo la estimulación de
una respuesta inmunitaria mediante la inyección en animales, sino
etapas análogas en la producción de anticuerpos sintéticos u otras
moléculas de unión específicas, tales como la detección selectiva
de bibliotecas de inmunoglobulina recombinante. Mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica se pueden producir
anticuerpos tanto monoclonales como policlonales.
Los anticuerpos también se pueden usar para
monitorizar la presencia del péptido GLP-2 en la
corriente sanguínea. Sangre y/o muestras de suero se pueden
analizar mediante SDS-PAGE y transferencia de tipo
western. Dichas técnicas permiten el análisis de sangre o suero
para determinar la unión del derivado de GLP-2 a los
componentes de la sangre.
Los anticuerpos anti-agente
terapéutico también se pueden usar para tratar la toxicidad inducida
mediante la administración del derivado de GLP-2 y
pueden usarse ex vivo o in vivo. Los procedimientos
ex vivo incluirían tratamiento mediante inmunodiálisis para
la toxicidad empleando anticuerpos anti-agente
terapéutico fijados a soportes sólidos. Los procedimientos in
vivo incluyen la administración de anticuerpos
anti-agente terapéutico en cantidades eficaces para
inducir el aclaramiento de los complejos
anticuerpo-agente.
Los anticuerpos se pueden usar para eliminar
ex vivo los derivados de GLP-2 y conjugados
de los mismos, de la sangre de un paciente poniendo en contacto la
sangre con los anticuerpos en condiciones estériles. Por ejemplo,
los anticuerpos se pueden fijar o, de otro modo, inmovilizarse sobre
una matriz de columna y la sangre del paciente se puede extraer del
paciente y pasarse sobre la matriz. Los derivados de
GLP-2 se unirán a los anticuerpos y, a
continuación, la sangre que contiene una concentración baja de
GLP-2 se devolverá al sistema circulatorio del
paciente. La cantidad del derivado de GLP-2
eliminado se puede controlar mediante ajuste de la presión y del
caudal. La eliminación preferencial del derivado de
GLP-2 del componente suero de la sangre de un
paciente se puede efectuar, por ejemplo, mediante el uso de una
membrana semipermeable o, de otro modo, separando primero el
componente suero del componente celular a través de modos conocidos
en la técnica anterior a pasar el componente suero sobre una matriz
que contiene los anticuerpos anti-agente
terapéutico. Como alternativa, la eliminación preferencial de las
células de sangre conjugadas con GLP-2, incluidos
los eritrocitos, se puede efectuar mediante la recolección y la
concentración de las células de la sangre en la sangre del paciente
y el contacto de dichas células con anticuerpos
anti-GLP-2 fijados con la exclusión
del componente suero de la sangre del paciente.
Los anticuerpos anti-GLP2 se
pueden administrar in vivo, por vía parenteral, a un paciente
que ha recibido el derivado de GLP-2 o sus
conjugados para tratamiento. Los anticuerpos se unirán al derivado
de GLP-2 y a sus conjugados. Una vez unidos, la
actividad de GLP-2 se obstaculizará, si no se
bloquea por completo, de modo que se reduce la concentración
biológicamente eficaz del derivado de GLP-2 en la
circulación sanguínea del paciente y se minimizan los efectos
secundarios dañinos. Además, el complejo anticuerpo
unido-GLP-2 facilitará el
aclaramiento del derivado de GLP-2 y los conjugados
de la circulación sanguínea del paciente.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar formas de realización preferidas de la invención y, de
ningún modo, se interpretarán como limitantes de su alcance. A menos
que se indique lo contrario, se usaron aminoácidos protegidos
ópticamente activos en la configuración L.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de los péptidos de
GLP-2 y derivados de los mismos se realizó usando un
procedimiento automático de fase sólida en un sintetizador
peptídico Symphony^{TM} con intervención manual durante la
generación de los derivados de GLP-2. La síntesis
se realizó en resina ligante de amida protegida con Fmoc
Ramage^{TM} usando aminoácidos protegidos con Fmoc. El
acoplamiento se consiguió usando
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio
hexafluorofosfato (HBTU) como activador en solución de
N,N-dimetilformamida (DMF) y diisopropiletilamida
(DIEA) como base. El grupo protector Fmoc se eliminó usando
piperidina al 20%/DMF. Cuando fue necesario se usó un aminoácido
protegido con Boc en el extremo N con el fin de generar el extremo
N_{\alpha} libre una vez escindido el péptido de la resina. Todos
los aminoácidos usados durante la síntesis poseían estereoquímica L
a menos que se indique otra cosa. Los vasos de reacción de vidrio
fueron Sigmacoted^{TM} y se usaron durante la síntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-De-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-
Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial:
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OR,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Boc-His(Boc)-OH. Se
disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, de
acuerdo con la secuencia, se activaron usando
O-benzotriazol-1-il-
N,N,N',N'-tetrametiluroniohexafluorofosfato (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se consiguió usando una solución de piperidina al 20% (V/V) en N,N-dimetilfomamida (DMF) durante 20
minutos.
N,N,N',N'-tetrametiluroniohexafluorofosfato (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se consiguió usando una solución de piperidina al 20% (V/V) en N,N-dimetilfomamida (DMF) durante 20
minutos.
Etapa 2: El péptido se escindió de la resina
usando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisol al 5% y fenol al 5%, seguido
por precipitación mediante Et_{2}O frío en hielo seco
(0-4ºC). El péptido bruto se recogió en un embudo
fritado de polipropileno, se secó, redisolvió en una mezcla al 40%
de acetonitrilo en agua (TFA al 0-1%) y se
liofilizó para generar el material bruto correspondiente usado en el
procedimiento de purificación.
\newpage
Ejemplo
2
(No de la invención
reivindicada)
MPA-His-Ala-Asp-Gly-Set-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Pbe-Ile-Asn-
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial:
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Emoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmov-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-His(Trt)-OH,
MPA-OH.
Etapa 2: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 2 del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 1 anterior, a excepción de que el primer
aminoácido añadido a la resina fue
Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo
Lys (Aloc) se realizó manualmente y se obtuvo tratando la resina
con una solución de 3 equiv. de Pd(PPh_{3})_{4}
disuelta en 5 ml de C_{6}H_{6};CHCl_{3} (1:1); 2,5% de NMM
(v:v): 5% de AcOH (v:v) durante 2 horas. A continuación, la resina
se lavó con CHCl_{3} (6 x 5 ml), 20% de AcOH en DCM (6 x 5 ml),
DCM (6 x 5 ml) y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: Después, la síntesis se reautomatizó
para la adición de ácido 3-maleimidopropiónico.
Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con
N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol.
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina
usando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisoles al 5% y fenol al 5%,
seguido por precipitación mediante Et_{2}O fío en hielo seco
(0-4ºC). El péptido bruto se recogió en un embudo
fritado de polipropileno, se secó, redisolvió en una mezcla al 40%
de acetonitrilo en agua (TFA al 0,1%) y se liofilizó para generar
el material bruto correspondiente usado en el procedimiento de
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial
siguiendo el procedimiento que se describe en la etapa 1 del
Ejemplo 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH-OH,
Fmoc-Ala-OH-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys(Aloc)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ala-OH-OH,
Boc-His(Boc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 3.
\newpage
Ejemplo
5
(No de la invención
reivindicada)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Sez-Phe-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial
siguiendo el procedimiento que se describe en la etapa 1 del
Ejemplo 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Boc-
His(Boc)-OH.
Etapa 2: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 2 del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
(No de la invención
reivindicada)
MPA-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 2, a excepción de que el residuo de
alanina en la posición 2 se ha sustituido por una glicina.
Etapa 2: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 2 del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
(No de la invención
reivindicada)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-
Trp-Leu-De-Gln-Thr-Lys-ne-Tbr-Asp-CONH_{2}
Trp-Leu-De-Gln-Thr-Lys-ne-Tbr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial
siguiendo el procedimiento que se describe en la etapa 1 del
Ejemplo 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Pmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (AlocrOH),
Fuaoc-Asp(tBu)-OK
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(TTt)-OH
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Sef(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoe-Gly-OK
Boc-His(Boc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 5, a excepción de que el primer
aminoácido añadido a la resina fue
Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 3.
\newpage
Ejemplo
9
(No de la invención
reivindicada)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(AEEA-MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 7.
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo
Lys(Aloc) se realizó manualmente y se consiguió tratando la
resina con una solución de 3 eq. de
Pd(PPh_{3})_{4} disuelto en 5 ml de
C_{6}H_{6};CHCl_{3} (1:1); 2,5% de NMM (v:v): 5% de AcOH
(v:v) durante 2 horas. A continuación, la resina se lavó con
CHCl_{3} (6 x 5 ml), 20% de AcOH en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5
ml) y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: Después, la síntesis se reautomatizó
para la adición de Fmoc-AEEA-OH
(ácido Fmoc-aminoetoxietoxiacético). Entre cada
acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con
N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol.
Después de la desprotección adecuada, el MPA (ácido
3-maleimidopropiónico) se ancló al espaciador y, de
nuevo, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida
(DMF) y 3 veces con isopropanol.
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina
usando TFA al 85%/TIS al 5%/tioanisoles al 5% y fenol al 5%,
seguido por precipitación mediante Et_{2}O fío en hielo seco
(0-4ºC). El péptido bruto se recogió en un embudo
fritado de polipropileno, se secó, redisolvió en una mezcla al 40%
de acetonitrilo en agua (TFA al 0,1%) y se liofilizó para generar
el material bruto correspondiente usado en el procedimiento de
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asu-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-
Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH_{2}
Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 5, a excepción de que el primer
aminoácido añadido a la resina fue
Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
(No de la invención
reivindicada)
MPA-AEEA-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Tht-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 6, a excepción de que se añade
Fmoc-AEEA-OH a la resina antes de
MPA-OH al final de la síntesis.
Etapa 2: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 2 del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
(No de la invención
reivindicada)
MPA-AEEA-His-Ala-Asp-Cly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 1, a excepción de que se añade
Fmoc-AEEA-OH a la resina antes de
MPA-OH al final de la síntesis.
Etapa 2: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 2 del ejemplo 1.
\newpage
Ejemplo
13
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-
Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH_{2}
Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 1, a excepción de que el primer
aminoácido añadido a la resina fue
Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(AEEA-MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 4.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Lys(MPA)-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial
siguiendo el procedimiento que se describe en la etapa 1 del
Ejemplo 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Lys(Aloc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tlBu)-OK
Fmoc-Ala-OH,
Boc-His(Boc)-OH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Lys(MPA)-Asp-Asn-Leu-,Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial
siguiendo el procedimiento que se describe en la etapa 1 del
Ejemplo 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Aloc)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Boc-His(Boc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 3.
\newpage
Ejemplo
17
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Lys(MPA)-Phe-Ile-Asn-
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: La síntesis peptídica en fase sólida se
llevó a cabo en una escala de 100 \mumoles. Los aminoácidos
protegidos siguientes se añadieron a la resina de forma secuencial
siguiendo el procedimiento que se describe en la etapa 1 del
Ejemplo 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Lys(Aloc)-OH,
Fmoc-Arg(Pbf)-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Thr(tBu)-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Ser(tBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp(tBu)-OH,
Fmoc-Ala-OH, Boc-
His(Boc)-OH.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Lys-(AEEA-MPA)-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 15.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Lys(AEEA-MPA)-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 16.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
(No de la invención
reivindicada)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-MetAsn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Lys(AEEA-MPA)-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH_{2}
Etapa 1: Esta etapa se realizó del mismo modo
que la etapa 1 del ejemplo 17.
Etapas 2-4: Estas etapas se
realizaron del mismo modo que en las etapas 2-4 del
Ejemplo 9.
Cada compuesto se purificó mediante HPLC
preparativa de fase inversa usando un sistema de HPLC preparativa
binario Varian (Dynamax). La purificación se realizó usando un
Phenomenex Luna 10 \mu de fenilo-hexilo, columna
de 50 mm x 250 mm (partículas de 10 \mu) equilibrada con una
mezcla de agua/TFA (0,1% de TFA en H_{2}O (disolvente A) y
acetonitrilo/TFA (0,1% de TFA en CH_{3}CN (disolvente B). La
elución se consiguió a 50 ml/min mediante gradiente de
28-38% B en 180 minutos. Las fracciones que
contenían el péptido se detectaron mediante absorbancia UV (Varian
Dynamax UVD II) a 214 y 254 nm.
Las fracciones se recogieron en alícuotas de 25
ml. Las que contenían el producto deseado se identificaron mediante
detección de masa tras inyección directa en CL/EM. Las fracciones
seleccionadas se analizaron después mediante HPLC analítica
(20-60% B en 20 min; Phenomenex Luna 5 \mu
fenilo-hexilo, columna de 10 mm x 250 mm, 0,5
ml/min) para identificar las fracciones con una pureza \geq 90%
para agrupar. El grupo se secó en congelación usando nitrógeno
líquido y, posteriormente, se liofilizó durante al menos 2 días,
para dar un polvo blanco.
La actividad intestinotrófica de los compuestos
de los Ejemplos 1-8 se han evaluado en un modelo de
ratones normales. Cinco ratones macho CD-1 de cinco
semanas de edad (20-25 g) se trataron dos veces al
día durante 10 días consecutivos con 5 \mug/dosis de cada
compuesto disueltos en solución acuosa de NaCl al 0,9%. Los
compuestos se administraron mediante inyecciones subcutáneas en el
área dorso-lateral de la región lumbar. Los
animales control recibieron 0,25 ml/dosis de NaCl 0,9%.
El día 11, se dejó a los ratones en ayunas
durante 4 horas y se anestesiaron con CO_{2}. Se extrajeron los
intestinos delgados, se limpiaron y pesaron. Se observaron
incrementos significativos en el peso del intestino delgado en
animales tratados con los compuestos de los ejemplos 1, 3, 5, 7 y 8.
Los resultados se muestran en la Figura 1. Como se puede observar,
se obtuvieron efectos intestinotróficos más pronunciados con los
compuestos de los ejemplos 5, 7 y 8, estabilizados con un residuo
de glicina en la posición 2, cuando se compararon con los péptidos
de GLP-2 nativo de los ejemplos 1 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Seis ratones hembra CD-1 de seis
semanas de edad (20-25 g) se trataron dos veces al
día con 5, 25 ó 50 \mug/dosis de los compuestos de los Ejemplos
5, 7 y 8. Los compuestos se disolvieron en tampón fosfato sódico
0,083M, a pH 6,8 y se administraron mediante inyecciones
subcutáneas en el área dorsolateral de la región lumbar. Los
animales control recibieron 0,25 ml/dosis de tampón fosfato
sódico.
El día 11, los ratones alimentados se
anestesiaron con Halotano^{TM} y se recogieron el intestino
delgado, el intestino grueso y el estómago de cada ratón tras
laparotomía. Los tejidos se limpiaron y pesaron.
Incrementos estadísticamente significativos (del
53% al 88%) en el peso del intestino delgado se demostraron en
todos los grupos de tratamiento en comparación con los ratones
control (véase la Figura 2). No obstante no se observó respuesta a
la dosis con los compuestos de los ejemplos 5 y 7, aunque se observó
una posible respuesta a la dosis para el compuesto del Ejemplo
8.
El peso del intestino delgado se incremento en
27-48% para todos los grupos de tratamiento. De
nuevo, no se observó respuesta a la dosis para los compuestos de
los ejemplos 5 y 7, aunque se observó una posible respuesta a la
dosis para el compuesto del Ejemplo 8 (véase la Figura 2).
Estos resultados demuestran que los derivados de
GLP-2 de los Ejemplos 7 y 8 exhiben actividades
intestinotróficas similares al correspondiente péptido libre del
ejemplo 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Los perfiles farmacocinéticos de los compuestos
de los Ejemplos 5 y 8 se estudiaron en ratas normales después de
una única inyección intravenosa o subcutánea. Las concentraciones
plasmáticas se determinaron mediante radioinmunoensayo con un
anticuerpo comercial anti-GLP-2
humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Los artículos problema se disolvieron en tampón
fosfato sódico 0,083M, a pH 6,8 y se administraron a ratas macho
Sprague-Dawley de once semanas de edad mediante una
única inyección intravenosa o subcutánea a un nivel de dosis de 500
nmol/kg. Muestras de sangre seriadas (150-200
\mul) se recogieron en tubos que contienen EDTA e inhibidor de la
DPP-IV en los siguientes puntos de tiempo: antes de
la dosis, 5 y 30 min y 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de
la administración del agente problema. Se centrifugó la sangre
entera y se recogieron posteriores muestras de plasma y se
almacenaron a -80ºC hasta su análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones plasmáticas de los
compuestos de los Ejemplos 5 y 8 se determinaron mediante
radioinmunoensayo usando un anticuerpo policlonal de conejo
anti-GLP-2 humano (Peninsula
Laboratories, RGG7167) y GLP-2 humano yodado como
marcador.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros farmacocinéticas descriptivos se
determinaron mediante procedimientos estándar independientes del
modelo (Gibaldi y Perrier, 1982) basados en el análisis de los datos
de concentración plasmática-tiempo. Los análisis
farmacocinéticas se realizaron usando macros escritos para Microsoft
Excel 97. Se calcularon los parámetros siguientes:
- -
- C_{máx} es la concentración plasmática máxima;
- -
- T_{máx} es el tiempo al que se observa la C_{máx};
- -
- T_{1/2} es la semivida terminal;
- -
- AUC(0-inf) es el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el tiempo cero al tiempo infinito;
- -
- F es la biodisponibilidad absoluta;
- -
- CL es el aclaramiento sistémico;
- -
- TRM es el tiempo de residencia medio; y
- -
- Vss es el volumen de distribución en el equilibrio.
Los perfiles de concentración plasmática se
muestran en la Figura 3 y los parámetros farmacocinéticas
correspondientes se presentan en la Tabla 2, más adelante. Estos
resultados muestran que el GLP-2 derivado de acuerdo
con la presente invención reduce eficazmente la eliminación y
distribución del correspondiente péptido
Gly^{2}-GLP-2 libre, de modo que
se produce una mayor concentración en plasma y una semivida más
prolongada en la circulación sistémica.
Las muestras de plasma obtenidas del estudio
farmacocinético de ratas se analizaron mediante inmunotransferencia.
Las proteínas plasmáticas se separaron en condiciones no reductoras
usando electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato
sódico (SDS-PAGE) de acuerdo con Laemmli (1970).
Primero, las muestras de plasma se diluyeron a 1:10 con agua
destilada y 20 \mul se mezclaron con 10 \mul de tampón 3X
Laemmli (TrisCl 30 mM, EDTA 3 mM, SDS 15%, pH 6,8) y 2 \mul de
solución de azul bromofenol (0,1% de azul bromofenol, 50% d e
glicerol). Las mezclas se introdujeron en un baño de agua hirviendo
durante 3 min y se cargaron en gel. Las proteínas se concentraron
primero en un gel de compactación al 3% y, después, migraron a
través de un gel separador al 9% usando un sistema de minigel con
peines de 10 pocillos (1,5 x 4,8 mm). La electroforesis se realizó
en corriente constante a 15 mA/gel para concentrar las proteínas en
el gel de compactación y a 20 mA/gel en gel separador durante
aproximadamente 1,5 h.
Posteriormente, las proteínas se transfirieron a
una membrana de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia
semiseco, durante 1 hora a 100 mA/gel. La eficacia de la
transferencia se comprobó mediante tinción reversible de la
membrana con solución al 1% de rojo Ponceau^{TM}.
Las membranas se saturaron durante la noche a
4ºC con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 5% de
leche desnatada. Después de 3 lavados con TBS-0,05%
de Tween 20^{TM} durante 5 minutos, las manchas se incubaron
durante 90 min a temperatura ambiente con anticuerpo policlonal de
conejo anti-GLP-2 (Peninsula Lab.
RGG7167) diluido 1:2, 500 en TBS-0,5% Tween
20^{TM} que contiene 1% de plasma de rata. Las manchas se lavaron
3 veces durante 10 min con TBS-0,05% Tween 20^{TM}
y, después, se incubaron durante una hora a temperatura ambiente
con una IgG anti-conejo de burro marcada con
peroxidasa (Jackson, 711-036-152)
diluida 1:100.000 en TBS-0,05% Tween 20^{TM}.
Después de 3 lavados, se realizó la revelación usando un sustrato
quimioluminiscente de peroxidasa (kit ECL^{TM} Amersham Pharmacia
Biotech). Las películas se expusieron durante de 5 a 10 min.
Las membranas se incubaron alternativamente con
albúmina anti-rata de conejo marcada con peroxidasa
(Accurate Chemical, YN-RRaALBP) diluida a 1:400.000
en TBS-0,05% Tween 20^{TM} durante 1 hora. Tras 3
lavados con TBS-0,05% Tween 20^{TM}, se realizó
la revelación como se ha descrito antes.
Una detección selectiva preliminar demostró que
el anticuerpo comercial anti-GLP-2
no era lo bastante sensible para detectar el compuesto del ejemplo
7 conjugado con proteínas mediante transferencia de tipo western. En
consecuencia, sólo se analizaron mediante este procedimiento las
muestras de plasma de ratas a las que se inyectó el compuesto del
Ejemplo 8.
Los resultados ilustrados en la Figura 4
demuestran que el compuesto del ejemplo 8 se conjuga eficazmente
con la albúmina de rata tras la administración iv. También se
observó una señal débil sobre la albúmina tras la administración sc
(no se muestra). La comparación con un anticuerpo
anti-albúmina de rata indica que la mayoría de las
bandas detectadas mediante el anticuerpo
anti-GLP-2, excepto una, son
atribuibles a varias especies de albúmina (monómeros, dímeros y
polímeros).
<110> BRIDON, Dominique P.
\hskip1cmBOUDJELLAB, Nissab
\hskip1cmROBITAILLE, Martin;
\hskip1cmLÉGER, Roger;
\hskip1cmTHIBAUDEAU, Karen
\hskip1cmCARETTE, Julie
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptido 2 similar al glucagón
(GLP-2) de larga duración para el tratamiento de
enfermedades y trastornos gastrointestinales
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2310
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 601269,276
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-02-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo intestinotrófico de
GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= ausente o uno o dos Arg, Lys e
His, con un grupo amino terminal o un grupo bloqueante en el amino
terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= His o Tyr, con un grupo amino
terminal o un grupo bloqueante en el amino terminal cuando Xaa de
la posición 1 está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= es Ala, Gly,
D-Ala, Pro, Ile, Nor-Val, ácido
alfa-aminobutírico o un aminoácido de sustitución
Ala que confiere a dicho ferring análogo resistencia a la enzina
DPP-IV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Asp, Glu, ProHPro; o
Xaa-Xaa en las posiciones 3 y 4, juntos son Xaa
(psi) (CH(OH)CH2) Xaa; Xaa(psi) (CH2NH2) Xaa
o Xaa(psi) (CHCH)xAA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<229> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa =
Glu-Xaa10-Asn-Thr-Ile,
Gly-Xaa10-Asn-Thr-Val
o Tyr-Ser-Lys-Tyr,
donde Xaa10 es Met, Leu, Ile o un aminoácido de reemplazo Met
oxidativamente estable
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Leu o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Asn, Lys o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Leu o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<729> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Arg, Lys, His o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo intestinotrófico de
GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= ausente o uno o dos Arg, Lys e
His, con un grupo amino terminal o un grupo bloqueante en el amino
terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= His o Tyr, con un grupo amino
terminal o un grupo bloqueante en el amino terminal cuando Xaa a de
la posición 1 está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= es Ala, Gly,
D-Ala, Pro, Ile, Nor-Val, ácido
alfa-aminobutírico o un aminoácido de sustitución
Ala que confiere a dicho ferring análogo resistencia a la enzima
DPP-IV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Asp, Glu, PrOHPro; o
Xaa-Xaa en las posiciones 3 y 4, juntos son Xaa
(psi) (CH(OH)CH2) Xaa; Xaa(psi)
(CH2NH2)Xaa o Xaa(psi) (CHCH)xAA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa =
Glu-Xaa10-Asn-Thr-Ile,
Gly-Xaa
10-Asn-Thr-Val o
Tyr-Ser-Lys-Tyr,
donde Xaa 10 es Met, Leu, Ile o un aminoácido de reemplazo Met
oxidativamente estable
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Leu o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Asn, Lys o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Leu o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Arg, Lys, His o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Asp o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Ile-Asn,
Ile-Ala o Val-Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)...(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Ile o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= Gln o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= un enlace covalente, o Ile,
Ile-Thr, Ile-Thr-Asp
o Ile-Thr-Asn, con un COOH, CONH2 o
un grupo bloqueante en C terminal cuando Xaa en la posición 28 está
ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa= ausente o uno o dos de Arg, Lys
e His, con un COON, CONH2 o un grupo bloqueante en C terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de His
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AEEA-MPA unidos al
residuo de Lys
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AEE-MPA unido al
residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IMPA-AEEA unido al
residuo de His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA-AEEA unido al
residuo de His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AEEA-MPA unidos al
residuo de Lys
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AEEA-MPA unidos al
residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MPA unido al residuo de Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AEEA-MPA unidos al
residuo de Lys
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de GLP-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (14)...(0)
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<223> AEEA-MPA unidos al
residuo de Lys
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<221> AMIDACIÓN
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<212> PRT
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<220>
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<223> análogo de GLP-2
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<221> VARIANTE
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<222> (21)...(0)
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<223> AEEA-MPA unidos al
residuo de Lys
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<221> AMIDACIÓN
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<222> (33)...(0)
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<220>
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<400> 28
Claims (10)
1. Un derivado estimulador del crecimiento del
tejido gastrointestinal seleccionado del grupo compuesto por:
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH_{2};
y
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-NPA)-CONH_{2}
en la que MPA es ácido maleimidopropiónico y
AEEA es ácido
2-[2-(2-amino)etoxi]etoxi acético.
2. Una composición farmacéutica que comprende un
derivado según la reivindicación 1 en combinación con un
transportador farmacéuticamente aceptable.
3. Una composición según la reivindicación 2,
para el tratamiento o prevención de trastornos o enfermedades
gastrointestinales
4. Un derivado según la reivindicación 1, para
usar en el tratamiento o prevención de trastornos o enfermedades
gastrointestinales en un sujeto.
5. Un derivado según la reivindicación 1, para
usar en la estimulación del crecimiento del tejido gastrointestinal
en un sujeto.
6. Un conjugado que comprende un derivado según
la reivindicación 1 unido covalentemente a un componente de la
sangre.
7. Un conjugado según la reivindicación 6, en el
que el componente de la sangre es una proteína de la sangre.
8. Un conjugado según la reivindicación 7, en el
que la proteína de la sangre es albúmina sérica.
9. Un conjugado que comprende un derivado según
la reivindicación 1 unido covalentemente a una albúmina.
10. Un conjugado tal y como se define en una
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 para usar en el tratamiento
o prevención de trastornos o enfermedades gastrointestinales en un
sujeto.
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