TWI794897B - Ｇｌｐ-２衍生物之長效接合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關類升糖素肽-2(GLP-2)衍生物、其接合物及其用途。此外，本發明係有關製備類升糖素肽-2(GLP-2)衍生物及其接合物的方法。

Description

GLP-2衍生物之長效接合物
本發明係有關類升糖素肽-2(GLP-2)衍生物、其接合物及其用途。此外，本發明係有關製備類升糖素肽-2(GLP-2)衍生物及其接合物的方法。
類升糖素肽-2(GLP-2)是33個胺基酸的肽激素，是腸道內分泌L細胞在攝取營養物質時產生的。GLP-2刺激小腸及大腸中的黏膜生長，抑制腸細胞及隱窩細胞的生長促進及凋亡。再者，GLP-2加強營養物質在小腸的吸收及降低腸道通透性。此外，GLP-2抑制胃排空及胃酸分泌，同時增加腸道血流速率並放鬆腸道平滑肌。由於GLP-2具有吸收並保護能量及活化腸道細胞功能的能力，所以在各種腸道疾病及損傷的體內模型中顯示出高治療潛力。
然而，GLP-2在開發成為商業藥物方面仍有局限性。肽類諸如GLP-2，由於低穩定性而很容易變性，且由於在體內經由蛋白酶降解而失去活性，及由於其相對較小的體積而很容易經由腎臟被去除。因此，為了維持肽 類藥物最佳的血中濃度及效價，需要更頻繁地給予肽類藥物。然而，大多數肽類藥物都是以各種類型的注射給予，需要頻繁的注射才能維持肽類藥物的血中濃度，從而導致患者的嚴重疼痛。在這方面，為解決這些問題進行許多嘗試，其中一項開發了一種提高肽類藥物之膜通透性的方法，通過口或鼻經吸入而將肽類藥物遞送到人體。然而，相較於注射肽，該方法受限於對肽類藥物遞送效率較低，因此仍難以維持足夠的肽類藥物生物活性而用於治療用途。
特別是，GLP-2在體內的半衰期極短(7分鐘或更短)，因為二肽基肽酶-IV(DPP IV)將GLP-2的位置2(Ala)及位置3(Asp)的胺基酸之間切斷而使GLP-2失活(Bolette H.et al.,The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism.85(8)：2884-2888,2000)。曾試圖主要經胺基酸取代來提高GLP-2的體內半衰期。
本發明的目的是提供GLP-2衍生物。
本發明的另一個目的是提供編碼GLP-2衍生物的經分離的核酸、包含該核酸的重組表現載體及包含該重組表現載體的轉形體。
本發明的又另一個目的是提供製備GLP-2衍生物的方法。
本發明的又另一個目的是提供GLP-2接合物，其中GLP-2衍生物與能增加其體內半衰期的材料連接。
本發明的又另一個目的是提供製備GLP-2接合物的方法。
本發明的又另一個目的是提供具有增加之體內耐久性及穩定性的GLP-2長效製劑，其中該長效製劑包含GLP-2接合物。
本發明的又另一個目的是提供用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的醫藥組成物，該醫藥組成物包括GLP-2衍生物及/或GLP-2接合物。
本發明的又另一個目的是提供預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的方法，包括將GLP-2衍生物、GLP-2接合物或含有GLP-2衍生物、GLP-2接合物作為活性成分的醫藥組成物給予有此需要的個體。
本發明的又另一個目的是提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物之用於製備藥物的用途。
本發明的又另一個目的是提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物之用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的用途。
在一方面，本發明提供類升糖素肽-2(GLP-2)接合物，其中GLP-2衍生物及免疫球蛋白Fc區通過非肽基聚合物各在非肽基聚合物的兩端共價連接，其中非肽基聚合物係選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-聚丙二醇共 聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合物所構成之群組。
在一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中GLP-2衍生物包括下列通式1之胺基酸序列：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO：9)，
其中，在上述式中，
X1為組胺酸、咪唑并乙醯基去組胺酸、去胺基組胺酸、β-羥基咪唑并丙醯基去組胺酸、N-二甲基組胺酸或β-羧基咪唑并丙醯基去組胺酸；
X2為丙胺酸、甘胺酸或2-胺基異丁酸(Aib)；
X30為離胺酸或精胺酸；
X34從缺，或為離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、6-疊氮基-離胺酸或半胱胺酸；其條件為排除在通式1中與胺基酸序列SEQ ID NO：1相同的任何序列。
在另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中GLP-2衍生物的通式1中，(1)X2為甘胺酸，(2)X30為精胺酸或(3)X2為甘胺酸及X30為精胺酸。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中
(1)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為半胱胺酸；
(2)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為離胺酸；
(3)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為精胺酸，及X34為離胺酸；
(4)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為6-疊氮基-離胺酸；
(5)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為精胺酸，及X34為半胱胺酸；
(6)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為Aib，X30為離胺酸，及X34為半胱胺酸；或
(7)X1為組胺酸，X2為Aib，X30為離胺酸，及X34為半胱胺酸。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中GLP-2衍生物至少有一個殘基是半胱胺酸、離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、組胺酸或6-疊氮基-離胺酸。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中GLP-2衍生物是選自SEQ ID NOS：2至8所構成之群組的胺基酸序列。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中非肽基聚合物的一個端點連接免疫球蛋白Fc區及其另一個端點連接GLP-2衍生物的羥基、硫醇基、胺基或疊氮基。
在又另一個特定具體例中，本發明提供 GLP-2接合物，其中免疫球蛋白Fc區為非糖基化。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中免疫球蛋白Fc區進一步包括鉸鏈區。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2接合物，其中免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
在另一方面，本發明提供包括下列通式1之胺基酸序列的GLP-2衍生物：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO：9)，
其中，在上述式中，
X1為組胺酸、咪唑并乙醯基去組胺酸、去胺基組胺酸、β-羥基咪唑并丙醯基去組胺酸、N-二甲基組胺酸或β-羧基咪唑并丙醯基去組胺酸；
X2為丙胺酸、甘胺酸或2-胺基異丁酸(Aib)；
X30為離胺酸或精胺酸；
X34從缺，或為離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、6-疊氮基-離胺酸或半胱胺酸；其條件為排除在通式1中與胺基酸序列SEQ ID NO：1相同的任何序列。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2衍生物，其中通式1中，(1)X2為甘胺酸，(2)X30為精胺酸或(3)X2為甘胺酸及X30為精胺酸。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2衍生物，其中
(1)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為半胱胺酸；
(2)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為離胺酸；
(3)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為精胺酸，及X34為離胺酸；
(4)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為6-疊氮基-離胺酸；
(5)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為精胺酸，及X34為半胱胺酸；
(6)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為Aib，X30為離胺酸，及X34為半胱胺酸；或
(7)X1為組胺酸，X2為Aib，X30為離胺酸，及X34為半胱胺酸。
在又另一方面，本發明提供編碼GLP-2衍生物的經分離的核酸。
在又另一方面，本發明提供包括上述核酸的重組表現載體。
在又另一方面，本發明提供包括重組表現載體的轉形體。
在又另一方面，本發明提供製備GLP-2衍生物的方法，包括：
(a)培養轉形體，該轉形體包括編碼GLP-2衍生物而表現GLP-2衍生物的核酸；及
(b)分離及純化該經表現的GLP-2衍生物。
在又另一方面，本發明提供製備GLP-2接合物的方法，包括：
(a)經由使具有兩個或更多個末端反應基團的非肽基聚合物與GLP-2衍生物及免疫球蛋白Fc區其中之一反應而製備複合物，以使該複合物具有連接到非肽基聚合物之一個末端的GLP-2衍生物或免疫球蛋白Fc區，以及在另一末端的反應基團；及
(b)經由使步驟(a)中製備的複合物與不連接複合物的免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物其中之一反應而製備接合物，而使GLP-2衍生物及免疫球蛋白Fc區經由非肽基聚合物而連接。
在又另一個特定具體例中，本發明提供製備方法，其中非肽基聚合物包括選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所構成之群組的一種或多種反應基團。
在又另一個特定具體例中，本發明提供製備方法，其中琥珀醯亞胺衍生物為琥珀醯亞胺基羧甲基、琥珀醯亞胺戊酸酯、琥珀醯亞胺甲基丁酸酯、琥珀醯亞胺甲基丙酸酯、琥珀醯亞胺丁酸酯、琥珀醯亞胺丙酸酯、N-羥基琥珀醯亞胺或琥珀醯亞胺碳酸酯。
在又另一方面，本發明提供具有增加之體內耐久性及穩定性的GLP-2長效製劑，其中該長效製劑包括GLP-2接合物。
在又另一方面，本發明提供用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的醫藥組成物，該組成物包括GLP-2接合物或GLP-2衍生物。
在又另一個具體例中，本發明提供醫藥組成物，其中腸道疾病是指短腸症候群、過敏性腸道疾病、炎症性腸道疾病、克隆氏症、結腸炎、大腸炎、胰臟炎、迴腸炎、黏膜炎或腸萎縮。
在又另一個具體例中，本發明提供醫藥組成物，其中胃病是指胃痙攣、胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎或十二指腸潰瘍。
在又另一方面，本發明提供預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的方法，包括將GLP-2接合物、GLP-2衍生物或包括GLP-2接合物、GLP-2衍生物作為活性成分的醫藥組成物給予有此需要的個體。
在又另一方面，本發明提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物用於製備藥物的用途。
在又另一個特定具體例中，本發明提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物的用途，其中該藥物是使用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病。
在又另一方面，本發明提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物的用途，用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病。
由於本發明GLP-2衍生物及其長效接合物具有顯著的高活性及優異的體內持續時間功效，這些可有效地用於預防、改善及治療腸道疾病、腸道損傷及胃病。
第1圖顯示用逆相管柱分析GLP-2衍生物長效接合物之純度的結果。
第2圖是顯示GLP-2衍生物長效接合物在血中濃度變化的圖表。
第3圖是顯示替度魯肽(Teduglutide)及GLP-2衍生物長效接合物在血中濃度變化的圖表。
第4圖是顯示替度魯肽及GLP-2衍生物長效接合物之體內功效的圖表(A：小腸重量，B：小腸絨毛長度)。
將說明本發明的具體細節如下。特別是，本發明所公開的解釋及具體例可分別應用於其他解釋及具體例。亦即，本發明所公開的各種元素的所有組合都屬於本發明的範圍。再者，本發明的範圍不應受到下文所提供之特定公開的限制。
此外，所屬領域熟練的技術人員將能夠根據常規實驗來識別或確認在此申請案中所說明的本發明特定具體例的許多等效項，並且這些等效項確定為包含在本發明中。
在整個說明書中，不僅對自然產生的胺基酸採用常規的一字母或三字母編碼，還使用其他胺基酸通常允許的三字母編碼，諸如Aib(2-胺基異丁酸)、AZK(6-疊氮離胺酸)等。此外，本文縮寫中提到的胺基酸係根據下列IUPAC-IUB規則來描述：
丙胺酸 Ala,A；精胺酸 Arg,R；
天門冬醯胺酸 Asn,N；天門冬胺酸 Asp,D；
半胱胺酸 Cys,C；麩胺酸 Glu,E；
麩醯胺酸 Gln,Q；甘胺酸 Gly,G；
組胺酸 His,H；異白胺酸 Ile,I；
白胺酸 Leu,L；離胺酸 Lys,K；
甲硫胺酸 Met,M；苯丙胺酸 Phe,F；
脯胺酸 Pro,P；絲胺酸 Ser,S；
蘇胺酸 Thr,T；色胺酸 Trp,W；
酪胺酸 Tyr,Y；纈胺酸 Val,V。
在一方面，本發明提供GLP-2衍生物。
本發明中，“GLP-2衍生物”包含與天然GLP-2相比，具有一個或多個胺基酸序列差異的肽；通過對天然GLP-2序列的修飾而修飾的肽；及具有如天然GLP-2之預防、治療及/或改善腸道疾病、腸道損傷及胃病之功能的天然GLP-2模擬物。此外，GLP-2衍生物還包含在體外及/或體內對GLP-2受體具有優異活性的衍生物。
如本文所使用，術語“類升糖素肽-2(GLP- 2)”意指具有預防、治療及/或改善腸道疾病、腸道損傷及胃病之功能的肽，且不僅包含天然形式的GLP-2而且包含其促效劑、片段、變異體、衍生物等。
如本文所使用，術語“GLP-2促效劑”意指能與GLP-2受體結合並誘導與天然GLP-2相同或相似的生理活性的物質，而不考慮其與GLP-2之結構的相似性。
如本文所使用，術語“GLP-2片段”意指從GLP-2的N-端或C-端添加或刪除一個或多個胺基酸的肽，其中所添加的胺基酸可以是非天然存在的胺基酸(如，D-胺基酸)。
如本文所使用，術語“GLP-2變異體”意指與天然GLP-2有一個或多個胺基酸差異的肽。因此，可以誘導非天然存在的胺基酸以及天然存在的胺基酸之取代。
本發明中，製備天然GLP-2的促效劑、片段、變異體及衍生物的修飾可包含所有使用L-型或D-型胺基酸及/或非天然胺基酸的修飾；及/或天然序列的修飾或轉譯後的修飾(即，甲基化、醯化、泛蛋白化、分子內共價鍵合等。)。
這種天然GLP-2的促效劑、片段、變異體及衍生物可具有預防、治療及/或改善腸道疾病、腸道損傷及胃病的功能。
可組合數種用於製備促效劑、片段、變異體及衍生物的方法而製備應用於本發明的天然GLP-2的促效劑、片段、變異體及衍生物。
可經由固相合成法來合成本發明所使用的GLP-2，也可經由重組方法生產。
在特定具體例中，GLP-2衍生物可以是經由天然GLP-2之一些胺基酸的取代、添加、刪除及修飾的任何一種方法，或經由其組合而製備的GLP-2衍生物。
天然GLP-2的胺基酸序列如下：
GLP-2(1-33)
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO：1)
具體地，GLP-2衍生物包括以甘胺酸或Aib(2-胺基異丁酸)取代天然GLP-2之第2個胺基酸的丙胺酸、以精胺酸取代天然GLP-2之第30個胺基酸的離胺酸，或其組合，但不限於此。
具體地，相較於天然GLP-2，GLP-2衍生物可以是在胺基酸序列中顯示至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%之序列同源性(homology)的GLP-2衍生物，及/或是經由化學取代(如，α-甲基化、α-羥基化)、刪除(如，去胺化)或修飾(如，N-甲基化)而改變GLP-2之胺基酸殘基的一些基團的形式，但序列同源性及衍生物的形式並不限於此。
具體地，GLP-2衍生物可以是於其中引入硫醇基、胺基或疊氮基的形式，但不限於此。由於GLP-2衍生物在體外及/或體內對GLP-2受體具有優異活性，且在製備GLP-2衍生物的長效接合物時，在引入的基團中發 生接合，所以這些可用於製備GLP-2接合物，可選擇性地控制其結合位點。
具體地，GLP-2衍生物的羥基、硫醇基、胺基或疊氮基可以與非肽基聚合物的一個端點接合，而能增加體內半衰期的材料(如，免疫球蛋白Fc區)可與非肽基聚合物的另一個端點接合。可經由將胺基酸添加至GLP-2而引入硫醇基、胺基或疊氮基，但不限於此。可經由添加半胱胺酸(C)至GLP-2而引入硫醇基，可經由添加離胺酸(K)、精胺酸(R)、麩醯胺酸(Q)或組胺酸(H)至GLP-2而引入胺基，及可經由添加6-疊氮基-離胺酸(AZK)至GLP-2而引入疊氮基，但這些不限於此。
具體地，GLP-2衍生物中至少有一個殘基可以是半胱胺酸、離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、組胺酸或6-疊氮基-離胺酸，但不限於此。
在另一個特定具體例中，GLP-2衍生物中，可以取代、刪除或修飾N-端胺基，但不限於此。為了避免結合在對GLP-2衍生物的體內活性是重要位點的N-端，在製備長效接合物時，可經由去除N-端組胺酸之α-胺基的方法、用羥基或羧基取代N-端胺基的方法、去除N-端組胺酸的α-碳以及接合α-碳的N-端胺基而使得只留下咪唑并乙醯基的方法及用2個甲基修飾N-端胺基的方法來製備本發明之GLP-2衍生物。
具體地，GLP-2衍生物可以是經由去除組胺酸殘基之α-碳，該組胺酸為GLP-2之N-端的第一個 胺基酸，及去除結合α-碳的N-端胺基而製備的咪唑并乙醯基-去組胺酸基-GLP-2(CA-GLP-2)；經由刪除GLP-2的N-端胺基而製備的去胺基組胺酸基-GLP-2(DA-GLP-2)；經由以羥基取代GLP-2的N-端胺基而製備的β-羥基咪唑并丙醯基-去組胺酸基-GLP-2(HY-GLP-2)；經由以2個二甲基修飾GLP-2的N-端胺基而製備的N-二甲基-組胺酸基-GLP-2(DM-GLP-2)；或經由以羧基取代GLP-2的N-端胺基而製備的β-羧基咪唑并丙醯基-去組胺酸基-GLP-2(CX-GLP-2)；但不限於此。
具體地，本發明的GLP-2衍生物可包括以甘胺酸取代丙胺酸(天然GLP-2之第2個胺基酸)及將硫醇基(例如，半胱胺酸)引入GLP-2的C-端；更具體地，GLP-2衍生物可包括咪唑并乙醯基去組胺酸，其中組胺酸殘基(GLP-2的N-端的第1個胺基酸)的α-碳被去除，以及去除與α-碳結合的N-端胺基(例如，其可具有SEQID NO：2的胺基酸序列)，但不限於此。
具體地，本發明的GLP-2衍生物可包括以甘胺酸取代丙胺酸(天然GLP-2的第2個胺基酸)，以及在C-端引入胺基(如，離胺酸)；更具體地，GLP-2衍生物可包括咪唑并乙醯基去組胺酸，其中組胺酸殘基(GLP-2的N-端的第1個胺基酸)的α-碳被去除，以及去除與α-碳結合的N-端胺基(例如，其可具有SEQID NO：3的胺基酸序列)，但不限於此。
具體地，本發明的GLP-2衍生物可包括以 甘胺酸取代丙胺酸(天然GLP-2的第2個胺基酸)，以精胺酸取代離胺酸(天然GLP-2的第30個胺基酸)，及在C-端引入胺基(如，離胺酸)；及更具體地，GLP-2衍生物可包括咪唑并乙醯基去組胺酸，其中組胺酸殘基(GLP-2的N-端的第1個胺基酸)的α-碳被去除，以及去除與α-碳結合的N-端胺基(例如，它可具有SEQID NO：4的胺基酸序列)，但不限於此。
具體地，本發明的GLP-2衍生物可包括以甘胺酸取代丙胺酸(天然GLP-2的第2個胺基酸)，以及在C-端引入疊氮基(如，6-疊氮基-離胺酸)；及更具體地，GLP-2衍生物可包括咪唑并乙醯基去組胺酸，其中組胺酸殘基(GLP-2的N-端的第1個胺基酸)的α-碳被去除，以及去除與α-碳結合的N-端胺基(例如，其可具有SEQID NO：5的胺基酸序列)，但不限於此。
具體地，本發明的GLP-2衍生物可包括以甘胺酸取代丙胺酸(天然GLP-2的第2個胺基酸)，以精胺酸取代離胺酸(天然GLP-2的第30個胺基酸)，及在C-端引入硫醇基(如，半胱胺酸)；及更具體地，GLP-2衍生物可包括咪唑并乙醯基去組胺酸，其中組胺酸殘基(GLP-2的N-端的第1個胺基酸)的α-碳被去除，以及去除與α-碳結合的N-端胺基(例如，它可具有SEQID NO：6的胺基酸序列)，但不限於此。
具體地，本發明的GLP-2衍生物可包括以甘胺酸取代丙胺酸(天然GLP-2的第2個胺基酸)，以及在 C-端引入硫醇基(如，半胱胺酸)(例如，它可具有SEQID NO：8的胺基酸序列)；及更具體地，GLP-2衍生物可包括咪唑并乙醯基去組胺酸，其中組胺酸殘基(GLP-2的N-端的第1個胺基酸)的α-碳被去除，以及去除與α-碳結合的N-端胺基(例如，它可具有SEQID NO：7的胺基酸序列)，但不限於此。
以下表1顯示SEQ ID NOS：2至8的GLP-2衍生物。
[表1]
Figure 110126453-A0101-12-0017-1
以上表1中， ca H表示以咪唑并乙醯基去組胺酸取代組胺酸者；Aib表示2-胺基異丁酸；及AZK表示6-疊氮基-L-離胺酸。
根據本發明的GLP-2衍生物可以是包括上述特定序列的肽，或可以是(實質上)由上述特定序列所組成的肽，但GLP-2衍生物不限於此。
同時，雖然在本發明中描述為“由特定的 SEQ ID NO組成”的肽或GLP-2衍生物，但這種表達並不排除該肽或GLP-2衍生物中的突變，這些突變可能是由於相應的SEQ ID NO的胺基酸序列上游或下游的無意義的序列添加或其中自然發生的突變，或其中的沉默突變，而發生的，只要具有這種突變的肽或GLP-2衍生物具有與由相應的SEQ ID NO的胺基酸序列所組成的肽或GLP-2衍生物相同或對應的活性。即使存在序列添加或突變，顯然地也屬於本發明的範圍。
在又另一個特定具體例中，GLP-2衍生物可包含下列通式1之胺基酸序列，但不限於此：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO：9)
其中，在上述式中，
X1為組胺酸、咪唑并乙醯基去組胺酸、去胺基組胺酸、β-羥基咪唑并丙醯基去組胺酸、N-二甲基組胺酸或β-羧基咪唑并丙醯基去組胺酸；
X2為丙胺酸、甘胺酸或2-胺基異丁酸(Aib)；
X30為離胺酸或精胺酸；
X34從缺，或為離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、6-疊氮基-離胺酸或半胱胺酸；其條件為排除在通式1中與胺基酸序列SEQ ID NO：1相同的任何序列。
具體地，通式1中，(1)X2可以是甘胺酸，(2)X30可以是精胺酸或(3)X2可以是甘胺酸及X30可以是 精胺酸，但這些不限於此。
具體地，通式1中，
(1)X1可以是咪唑并乙醯基去組胺酸，X2可以是甘胺酸，X30可以是離胺酸，及X34可以是半胱胺酸；
(2)X1可以是咪唑并乙醯基去組胺酸，X2可以是甘胺酸，X30可以是離胺酸，及X34可以是離胺酸；
(3)X1可以是咪唑并乙醯基去組胺酸，X2可以是甘胺酸，X30可以是精胺酸，及X34可以是離胺酸；
(4)X1可以是咪唑并乙醯基去組胺酸，X2可以是甘胺酸，X30可以是離胺酸，及X34可以是6-疊氮基-離胺酸；
(5)X1可以是咪唑并乙醯基去組胺酸，X2可以是甘胺酸，X30可以是精胺酸，及X34可以是半胱胺酸；
(6)X1可以是咪唑并乙醯基去組胺酸，X2可以是Aib，X30可以是離胺酸，及X34可以是半胱胺酸；或
(7)X1可以是組胺酸，X2可以是Aib，X30可以是離胺酸，及X34可以是半胱胺酸，但這些不限於此。
同時，GLP-2衍生物可以包含所有以肽本身的形式存在者、其鹽(如，該肽的藥學上可接受的鹽)或其溶劑合物。
此外，肽或GLP-2衍生物可以是任何藥學上可接受的形式。
鹽的種類沒有特別限定。然而，鹽較佳是對個體，如，哺乳動物，是安全及有效的，但並不特別限定於此。
術語“藥學上可接受的”意指可在藥理醫學決定的範圍內有效地用於預定用途，而不引起過度的毒性、刺激性、過敏反應等的材料。
如本文所使用，術語“藥學上可接受的鹽”意指衍生自藥學上可接受的無機酸、有機酸或鹼的鹽。 適合的鹽的實例可包含鹽酸、硼酸、硫酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自適合之鹼的鹽之實例可包含鹼金屬諸如鈉、鉀等；鹼土金屬諸如鎂；鋁等。
此外，如本文所使用，術語“溶劑合物”意指由根據本發明的肽或其鹽與溶劑分子形成的複合物。
可經由固相合成法來合成本發明的GLP-2衍生物，也可經由重組方法來生產，及可商業化生產。
在另一方面，本發明提供編碼GLP-2衍生物的經分離的核酸、包含該核酸的重組表現載體及包含該重組表現載體的轉形體。
GLP-2衍生物如以上所述。
如本文所使用，術語“核酸”意指去氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，以單股或雙股形式存在，包含基因體DNA、cDNA及從中轉錄的RNA，以及作為基本構成單元的核苷酸，不僅包含天然核苷酸，而且還包含在糖或鹼中具有修飾的類似物(Scheit,Nucleotide Analogs, John Wiley,New York,1980；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90：543-584,1990)。可使用分子生物學中的標準技術來分離或製備本發明的核酸。例如，可使用合適的引子序列，從天然的GLP-2基因序列經由PCR(聚合酶連鎖反應)而擴增核酸，並可使用自動化DNA合成器，用標準的合成技術來製備核酸。
如本文所使用，術語“載體(vector)”意指能夠在適當的宿主細胞中表現目標蛋白的重組載體，它是一種核酸建構，包含操作性地連接基本調節因子以使插入的核酸得以表現。本發明中，可製備包含編碼GLP-2衍生物的核酸之重組載體。此外，可通過重組載體的轉形或轉染至宿主細胞而得到本發明GLP-2衍生物。
根據本發明的重組載體通常可構建為選殖載體或表現載體，也可以使用原核或真核細胞作為宿主細胞來構建。
本發明中，編碼GLP-2衍生物的核酸是操作性地連接至啟動子。
如本文所使用，術語“可操作性地連接”意指核酸表現調控序列(如，啟動子、信號序列、核糖體結合位點、轉錄終結序列等)與不同的核酸序列之間的功能連接，且調控序列可以調節不同核酸序列的轉錄及/或轉譯。
如本文所使用，術語“啟動子”意指位於編碼區上游的未轉譯核酸序列，其包含聚合酶結合位點，且具有啟動位於啟動子下游的基因轉錄到mRNA的活性，即， 與聚合酶結合並啟動基因轉錄的DNA結構域，可以是位於mRNA轉錄起始位點的5'結構域。
例如，當本發明的載體是重組載體且使用原核細胞作為宿主細胞時，應該包含能夠執行轉錄的強啟動子(如，tac啟動子、lac啟動子、lacUV5啟動子、lpp啟動子、pLλ啟動子、pRλ啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子、T7啟動子等)、用於啟動轉譯的核糖體結合位點及轉錄/轉譯終結序列。
此外，可經由操控所屬領域常用的質體(如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌體(如，λgt4．λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)或病毒(如，SV40等)而製備本發明要使用的載體。
同時，當本發明的載體為重組載體且使用真核細胞作為宿主細胞時，可使用衍生自哺乳動物細胞基因體的啟動子(如，金屬硫蛋白啟動子)或衍生自哺乳動物病毒的啟動子(如，腺病毒晚期啟動子、乳頭瘤病毒7.5K啟動子、SV40啟動子、巨細胞病毒啟動子及HSV的tk啟動子)，且通常包含多腺苷酸化序列(如，牛生長激素終止子及從SV40衍生出的多腺苷酸化序列)作為轉錄終結序列。
此外，本發明的重組載體包含在所屬領域中常使用作為篩選標記的抗生素耐藥性基因，可包含，例 如，對安比西林(ampicillin)、正大黴素(gentamicin)、羧苄青黴素(carbenicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、鏈黴素(streptomycin)、康黴素(kanamycin)、遺傳黴素(geneticin)、新黴素(neomycin)及四環素(tetracycline)有耐藥性的基因。
本發明的重組載體可額外包含一個序列，以利於所收集之目標蛋白，即，GLP-2衍生物，的純化。額外包含的序列可以是蛋白質純化的標籤序列，如，麩胱甘肽S-轉移酶(Pharmacia,USA)、麥芽糖結合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)、六組胺酸等，但目標蛋白純化所需序列的種類並不限於此。
重組載體所表現的融合蛋白，包含上述標籤序列，可經親和層析純化。例如，融合麩胱甘肽S-轉移酶時，可使用該酶的基質麩胱甘肽，而當使用六組胺酸標籤時，可經由Ni-NTA管柱很容易地收集目標蛋白。
如本文所使用，術語“轉形”意指將DNA導入宿主細胞並使DNA作為染色體因子而在此複製或完成染色體整合的過程，這是經由將外源DNA導入細胞而人為引起基因改變的現象。
本發明中使用的轉形方法可以是任何轉形方法，並且可以根據所屬領域中使用的傳統方法很容易地執行。常用轉形方法的實例可包含CaCl2沉澱法、在CaCl2沉澱法中使用二甲基亞碸(DMSO)作為還原劑而具改良功效的Hanahan法、電穿孔法、CaPO4沉澱法、原生質體融合法、使用碳化矽纖維的攪拌法、農桿菌介導的轉形法、 使用PEG的轉形法、聚葡萄糖硫酸鹽-、lipofectamine-及dry/suppression-介導的轉形等。
包含編碼根據本發明之GLP-2衍生物的核酸之重組載體的轉形方法不限於這些方法，所屬領域中常用的任何轉形或轉染方法都可以不受限制地使用。
可經由將包含編碼GLP-2衍生物的目標核酸的重組載體引入宿主細胞中而獲得本發明的轉形體。
在本發明中使用的適當宿主可不特別限制，可使用任何能夠表現本發明之核酸的宿主。適當宿主的實例可包含屬於大腸桿菌屬的細菌諸如大腸桿(E.coli)、屬於枯草桿菌屬的細菌諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)、屬於假單胞菌屬的細菌諸如戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、酵母菌諸如嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、昆蟲細胞諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda(SF9))及動物細胞諸如CHO、COS及BSC。具體地，可使用大腸桿菌作為宿主細胞，但不限於此。
在又另一方面，本發明提供使用轉形體製備GLP-2衍生物的方法。
具體地，本發明提供製備GLP-2衍生物的方法，包括：
(a)培養轉形體，該轉形體包含編碼GLP-2衍生物而表現GLP-2衍生物的核酸；及
(b)分離及純化所表現的GLP-2衍生物。
本發明中，用於培養轉形體的培養基必須以適當的方式符合宿主細胞培養的要求。宿主細胞生長的培養基中可能含有的碳源，可由所屬領域熟練的技術人員根據所製備之轉形體的類型而適當地選擇，並可選擇適當的培養條件以便控制培養的期間及數量。
培養基中使用的糖源的實例可包含糖及碳水化合物諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉及纖維素；油及脂肪諸如大豆油、葵花籽油、蓖麻油及椰子油；脂肪酸諸如棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸；醇類諸如甘油及乙醇；及有機酸諸如乙酸。這些材料可單獨或組合使用。
所使用之氮源的實例可包含蛋白腖、酵母抽出物、肉汁、麥芽抽出物、玉米浸液、大豆粉及尿素，或無機化合物諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨。氮源也可單獨或組合使用。
所使用之磷源的實例可包含磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應的含鈉鹽。此外，培養基中可含有生長所必需的金屬鹽諸如硫酸鎂或硫酸鐵。
最後，可使用必需的生長材料諸如胺基酸及維生素。此外，還可使用培養基用的適當前驅物。在培養期間，可以經由批式培養或連續培養而將上述來源適當地添加到培養物中。可以用鹼性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀及氨水，或酸性化合物諸如磷酸或硫酸，適當地調 節培養物的pH值。此外，還可以添加消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯等，以防止泡沫的產生。此外，為了維持培養物的有氧狀態，可以將氧氣或含氧氣體(如，空氣)注入培養物中。
本發明的轉形體可在20℃至45℃培養，具體地是在25℃至40℃培養。此外，繼續培養直至獲得所需GLP-2衍生物的最大產量，就此點而言，培養通常可繼續10小時至160小時。
如以上所述，根據宿主細胞而提供合適的培養條件時，本發明的轉形體可產生GLP-2衍生物，而根據載體構成及宿主細胞的特性而產生的GLP-2衍生物可以在宿主細胞的細胞質內或周質空間內或細胞外分泌。
在宿主細胞內或外表現的蛋白質可以用常規方法來純化。純化方法的實例可包含鹽析(如，硫酸銨沉澱、磷酸鈉沉澱等)、溶劑沉澱(如，使用丙酮或乙醇的蛋白質分餾沉澱等)、透析、凝膠過濾、離子交換或層析諸如逆相管柱層析、超濾等，這些方法可以單獨或組合使用。
在又另一方面，本發明提供增加GLP-2衍生物之半衰期及生物可利用性或持續維持其活性的製劑。具體地，該製劑是指含有直接共價結合GLP-2衍生物之載體的製劑，或即使沒有直接共價鍵而含有能夠增強GLP-2衍生物體內活性之組分的製劑。
此外，在又另一方面，本發明提供GLP-2接合物，其中GLP-2衍生物係與能增加GLP-2衍生物之體內 半衰期的材料連接。此外，本發明GLP-2衍生物具有比天然GLP-2較高的活性，且其長效接合物具有明顯增加的血液半衰期。因此，本發明GLP-2接合物可有效地使用於預防、治療及/或改善腸道疾病、腸道損傷或胃病。
GLP-2衍生物係如以上所述。
在特定具體例中，本發明接合物中，GLP-2衍生物與能夠增加GLP-2衍生物之體內半衰期的材料可經由連接基而連接。
本發明GLP-2接合物中，連接基與引入GLP-2衍生物的硫醇基、胺基或疊氮基之間係形成共價鍵，因而可選擇性地調整GLP-2衍生物及連接基的結合位點。
此外，GLP-2接合物中，GLP-2衍生物之N-端的胺基被取代、刪除或修飾，以便避免連接基結合在對體內活性是重要位點的N-端，因而可選擇性地調整GLP-2衍生物及連接基的結合位點，但不限於此。
如本文所使用，術語“能增加體內半衰期的材料”意指可與GLP-2衍生物連接因而延長GLP-2衍生物之半衰期的物質。如本文所使用，術語“能增加體內半衰期的材料”可以與術語“生物相容性物質”或“載體”相互替代使用。
生物相容性物質或載體可包含任何材料，只要它能夠與GLP-2衍生物連接並延長GLP-2衍生物的半衰期，例如，選自聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白及其片段、結合白蛋白材料、特定胺基酸序列重複單位的 聚合物、抗體、抗體片段、結合FcRN之材料、體內結締組織或其衍生物、核苷酸、纖網蛋白、轉鐵蛋白、醣類及聚合物所構成之群組者，但不限於此。
可經由共價鍵或非共價鍵而將生物相容性材料或載體與GLP-2衍生物連接。此外，連接GLP-2衍生物與生物相容性材料或載體的方法可包含基因重組技術及使用聚合物或低分子量化學品的體外連接，但不限於任何特定的連接方法。
本發明中，使用聚乙二醇作為載體時，也可包含Ambrx,Inc.的Recode技術，該技術能用於特定位置的聚乙二醇連接，也可包含Neose Technologies,Inc.的糖聚乙二醇化技術，該技術能用於聚醣區的特定連接。此外，該方法可以包含可釋放的PEG技術，該技術能夠在體內緩慢釋放聚乙二醇，但方法不限於此，並且還可以包含能夠利用PEG而提高體內生物可利用性的技術。
此外，一種或多種聚合物，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、生物可分解聚合物、脂質聚合物、幾丁質或玻尿酸，也可經由上述技術與GLP-2衍生物連接。
本發明中，使用白蛋白作為載體時，可使用能夠經由白蛋白或白蛋白片段與GLP-2衍生物之間的直接共價鍵結來提高體內穩定性的技術。此外，替代直接將白蛋白與GLP-2衍生物連接，可使用將能夠與白蛋白結合的 材料，如，白蛋白特異性抗體或其抗體片段，與GLP-2衍生物連接而間接地使白蛋白與GLP-2衍生物連接的技術；將具有與白蛋白結合親和力的特定肽/蛋白質(如，通過Affibody AB的Albumod技術而產生的白蛋白結合肽)與GLP-2衍生物連接的技術；及連接對白蛋白具有結合親和力的脂肪酸等的技術等，但方法不限於此，並且可以不受限制地使用任何可以用白蛋白來提高體內穩定性的技術或連接方法。
為了提高體內半衰期，使用抗體或其抗體片段作為載體而結合GLP-2衍生物的技術可以包含在本發明的範圍內。抗體或其抗體片段可為包含結合FcRn區的抗體或其抗體片段，也可以是不包含結合FcRn區諸如Fab等的任何抗體片段。使用催化抗體之CovX Research LLC的CovX-body技術可包含在本發明的範圍內，使用免疫球蛋白Fc區來提高體內半衰期的技術也可以包含在本發明的範圍內。
結合FcRn之材料可以是免疫球蛋白Fc區。
如本文所使用，術語“免疫球蛋白Fc區”意指排除重鏈及輕鏈的可變區、免疫球蛋白的重鏈恆定區1(CH1)及輕鏈恆定區(CL)的部分，還可進一步包含重鏈恆定區的鉸鏈區。特別是，免疫球蛋白Fc區可以是包含一部分或全部免疫球蛋白Fc區的片段，因此可以與術語“免疫球蛋白片段”或“免疫球蛋白恆定區”相互替代使用。
天然的Fc在重鏈恆定區1的Asn 297位置 有一個糖鏈，但大腸桿菌衍生的重組Fc係以非糖基化形式表現。從Fc中去除糖鏈造成Fcγ受體1、2及3和補體(c1q)與重鏈恆定區1的結合親和力降低，而導致抗體依賴細胞介導的細胞毒性或補體依賴的細胞毒性的降低或喪失。
如本文所使用，術語“免疫球蛋白恆定區”意指缺乏輕鏈可變區及重鏈可變區、重鏈恆定區1(CH1)及輕鏈恆定區(CL)的免疫球蛋白片段，即，由重鏈恆定區2及3(CH2及CH3)(或包含重鏈恆定區4(CH4))所組成的Fc區域。視需要，免疫球蛋白Fc區域可進一步包括重鏈恆定區域中的鉸鏈區。此外，本發明的免疫球蛋白恆定區可以是擴展的免疫球蛋白Fc區，包括重鏈恆定區1(CH1)的一部分或全部及/或輕鏈恆定區(CL)(但只有免疫球蛋白重鏈及輕鏈的可變區除外)，只要顯示的效果實質上與天然免疫球蛋白恆定區相同或優於天然免疫球蛋白恆定區。再者，本發明的免疫球蛋白恆定區可能缺少對應於CH2及/或CH3的胺基酸序列的重要部分。因此，本發明的免疫球蛋白恆定區可包括(1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域、(2)CH1結構域及CH2結構域、(3)CH1結構域及CH3結構域、(4)CH2結構域及CH3結構域，(5)一個或多個恆定結構域及免疫球蛋白鉸鏈區(或部分鉸鏈區)的組合，或(6)各重鏈恆定區及輕鏈恆定區的二聚體。包含Fc區的免疫球蛋白恆定區是可在體內代謝的生物可降解多肽，以致可安全地使用作為藥物載體。此外，由於其相 對較低的分子量，就接合物的生產、純化及產率而言，免疫球蛋白Fc區比整個免疫球蛋白分子更有利。再者，由於缺乏Fab，而Fab由於一種抗體與另一種抗體之間的胺基酸序列差異而表現出高非同質性，因此，單用免疫球蛋白Fc提供接合物明顯增強同質性，而降低誘導血液抗原性的可能性。
另一方面，免疫球蛋白恆定區可起源於人類或動物諸如牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等，具體地可以是人類來源。此外，免疫球蛋白恆定區可選自衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的恆定區，或其組合或雜合。具體地，恆定區係衍生自血中最大量的IgG或IgM，最具體地是來自IgG，習知它可以提高配體結合蛋白的半衰期。在本發明中，免疫球蛋白Fc區可以是由同一來源結構域的單鏈免疫球蛋白所組成的二聚體或多聚體。
如本文所使用，術語“組合”意指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白恆定區(較佳為Fc區)的多肽與不同來源的單鏈多肽連接而形成二聚體或多聚體。亦即，可以由選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE Fc的Fc片段所構成的群組之2個或更多個片段來製備二聚體或多聚體。
如本文所使用，術語“雜合”意指編碼不同來源的2個或多個免疫球蛋白恆定區的序列存在於免疫球蛋白恆定區(較佳為Fc區)的單鏈中。在本發明中，各種雜合 形式是可能的。例如，雜合結構域可以由選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc的CH1、CH2、CH3及CH4所構成之群組的1至4個結構域所組成，並且可進一步包含鉸鏈區。
IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞類，本發明可包含其組合或雜合。較佳的是IgG2及IgG4亞類，最佳的是IgG4的Fc區，它很少具有效應子功能諸如補體依賴性的細胞毒性(CDC)。
此外，免疫球蛋白恆定區可具有糖基化形式，其程度與天然形式相同，或是大於或小於天然形式，或可以是去糖基化形式。可經由典型的方法，例如，使用化學法、酵素法或利用微生物的基因工程方法來增加或減少免疫球蛋白恆定區的糖基化或去糖基化。在此，當去糖基化時，與免疫球蛋白恆定區結合的補體(C1q)變得明顯減少，而抗體依賴性的細胞毒性或補體依賴性的細胞毒性降低或去除，因而不會在體內誘導不必要的免疫反應。關於這點，去糖基化或非糖基化免疫球蛋白恆定區更符合藥物載體的目的。據此，免疫球蛋白Fc區可以更具體地說是從人IgG4中衍生而得的非糖基化的Fc區，亦即，人IgG4衍而得的非糖基化Fc區。人源性Fc區比非人源性Fc區為更佳，後者可能作為人體內的抗原，而引起不良的免疫反應諸如產生針對抗原的新抗體。
再者，本發明的免疫球蛋白恆定區不僅包含天然胺基酸序列，而且還包含其序列衍生物(突變體)。 胺基酸序列衍生物意指由於一個或多個胺基酸殘基的刪除、插入、保守或非保守取代或其組合而具有與野生型胺基酸序列不同的胺基酸序列。例如，已知對連接很重要的IgG Fc中位置214至238、297至299、318至322或327至331的胺基酸殘基可使用作為適用於修飾的位點。可以使用各種衍生物，諸如經由去除能夠形成二硫鍵的位點、從天然Fc中去除數個N-端胺基酸或在天然Fc的N-端添加甲硫胺酸而製備的各種衍生物。此外，可消除補體結合位點，如，C1q結合位點或ADCC位點，以去除效應子功能。國際專利公開號WO 97/34631及WO 96/32478揭露製備免疫球蛋白恆定區序列衍生物的技術。
蛋白質或肽分子中不改變分子活性的胺基酸之取代在所屬領域中是眾所周知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見的取代發生在胺基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly之間，係在兩個方向。視需要，可經由磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙醯化、醯胺化等而修飾胺基酸。
上述免疫球蛋白恆定區衍生物可以是具有等同於本發明免疫球蛋白恆定區之生物活性的衍生物，但提高了免疫球蛋白恆定區針對熱、pH等的結構穩定性。再者，免疫球蛋白恆定區可以從人或動物諸如牛、山羊、豬、 小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等分離出的天然型而獲得，也可以是從轉形的動物細胞或微生物中獲得之彼等的重組體或衍生物。在此，可經由從人或動物有機體分離出全部免疫球蛋白，並用蛋白質分解酵素處理而獲得免疫球蛋白恆定區。木瓜酵素將天然免疫球蛋白消化成Fab及Fc區，而胃蛋白酶處理後產生PF'c及F(ab)2片段。例如，可使這些片段進行粒徑排阻層析來分離Fc或PF'c。
具體地，人源免疫球蛋白恆定區可以是從微生物獲得的重組免疫球蛋白恆定區。
本發明中，連接基可結合能夠增加體內半衰期之材料的N-端、C-端、硫醇基(如，半胱胺酸)、胺基(如，離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸或組胺酸)及/或羥基；可結合GLP-2衍生物的N-端、C-端、硫醇基(如，半胱胺酸)、胺基(如，離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸或組胺酸)、疊氮基(如，6-疊氮基-離胺酸)及/或羥基，但不限於此等。
連接基可以是肽基連接基或非肽基連接基。
使用蛋白酶抗性之聚合物作為肽基連接基，GLP-2衍生物可維持與能夠提高GLP-2衍生物之體內半衰期的材料相似的體內半衰期。因此，本發明中可以使用的非肽基連接基只要是體內蛋白酶抗性的非肽基聚合物，就可以不受限制地使用。
如本文所使用，術語“非肽基聚合物”包含生物相容性聚合物，其中兩個或更多個重複單元被接合， 並與術語“非肽基連接基”相互替代使用。重複單位通過任何共價鍵而彼此連接，但並非肽鍵。在本發明中，非肽基聚合物包含其端點的反應基團，因此可經由與構成該接合物的其他組分反應而形成接合物。這種非肽基聚合物可能有兩個或三個端點。
如本文所使用，術語“非肽基聚合物連接部分”意指接合物中的組成元素，它是經由將兩端具有反應基團的非肽基聚合物與免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物通過非肽基聚合物的各反應基團來連接而形成。
在本發明的特定具體例中，GLP-2接合物可以是其中免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物通過非肽基聚合物而連接在一起者，其包含在兩端可與免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物連接的反應基團。
具體地，雖然不特別局限於此，但非肽基聚合物可以是選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物諸如聚乳酸(PLA)及聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、寡核苷酸等或其組合所構成之群組中的一種。在更具體的實例中，非肽基聚合物可以是聚乙二醇，但不限於此。此外，所屬領域中已知的上述材料的衍生物及在所屬領域的技術程度上容易生產的衍生物也屬於本發明的範圍。
經由連接基的鍵結可以是任何化學鍵諸如非共價化學鍵或共價化學鍵，但不限於此。
本發明中可以使用的非肽基聚合物，只要是對體內蛋白酶具有抗性的聚合物，就可以不受限制地使用。具體地，非肽基聚合物的分子量可在0kDa至200kDa的範圍內，具體地在1kDa至100kDa的範圍內，更具體地在1kDa至50kDa的範圍內，再更具體地在1kDa至20kDa的範圍內，又再更具體地在3.4kDa至10kDa的範圍內，及最具體的是約3.4kDa，但不限於此。
此外，與免疫球蛋白Fc區連接的載體，特別是本發明非肽基聚合物，可以是聚合物的一種或是不同種聚合物的組合。
在特定具體例中，非肽基聚合物的兩端可結合免疫球蛋白Fc區的硫醇基、胺基或羥基，及可結合GLP-2衍生物的硫醇基、胺基、疊氮基或羥基。
具體地，非肽基聚合物可包含能夠在兩端各結合免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物的反應基團。具體地，反應基團可結合免疫球蛋白Fc區之半胱胺酸的硫醇基；位於N-端之胺基、離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸及/或組胺酸的胺基；及/或位於C-端的羥基，及可結合GLP-2衍生物的硫醇基；離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸及/或組胺酸的胺基；疊氮基-離胺酸的疊氮基；及/或羥基，但反應基團不限於此。
更具體地，非肽基聚合物的反應基團可以是選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所構成之群組的一種或多種反應基團，但不限於 此。
上述中，醛基的實例可以是丙醛基或丁醛基，但不限於此。
上述中，琥珀醯亞胺衍生物的實例可以是琥珀醯亞胺基羧甲基、琥珀醯亞胺戊酸酯、琥珀醯亞胺甲基丁酸酯、琥珀醯亞胺甲基丙酸酯、琥珀醯亞胺丁酸酯、琥珀醯亞胺丙酸酯、N-羥基琥珀醯亞胺或琥珀醯亞胺碳酸酯，但不限於此。
非肽基聚合物可通過反應基團而連接免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物而轉化成非肽基聚合物連接基部分。
此外，通過醛鍵進行還原烷基化而產生的最終產物比由醯胺鍵連接的產物穩定甚多。醛反應基團在低pH選擇性地與N-末端反應，並可在高pH時，例如pH9.0，與離胺酸殘基形成共價鍵。
本發明非肽基聚合物的末端反應基團可以彼此相同或不同。非肽基聚合物可在兩端都具有醛反應基團。或者，非肽基聚合物可在各末端具有醛基及馬來醯亞胺基，或可在各末端具有醛基及琥珀醯亞胺，但不限於此。
例如，非肽基聚合物可在一個末端具有馬來醯亞胺基並在另一個末端具有醛基、丙醛基或丁醛基。於另一個實例，非肽基聚合物可在一個末端具有琥珀醯亞胺基並在另一個末端具有丙醛基或丁醛基。
當使用在丙醛端具有羥基的聚乙二醇作為 非肽基聚合物時，可經由已知的化學反應通過各種反應基團來活化羥基，或可使用具有市售修飾反應官能基團的聚乙二醇來製備本發明接合物。
在特定具體例中，非肽基聚合物的反應基團可連接GLP-2衍生物之半胱胺酸殘基，特別是連接半胱胺酸的-SH基，但不限於此。
在使用馬來醯亞胺-PEG-醛的情況，馬來醯亞胺基可經由硫醚鍵連接GLP-2衍生物的-SH基，而醛基可通過還原烷基化反應而連接免疫球蛋白Fc的-NH2基團，但本發明不限於此，此對應於一個實例。
經由此種還原烷基化，免疫球蛋白Fc區的N-端胺基經由具有-CH2CH2CH2-結構的連接基官能基團與位於PEG一端的氧原子連接而形成-PEG-O-CH2CH2CH2CH2NH-免疫球蛋白Fc。此外，通過硫醚鍵，可形成其中PEG的一個末端與位於GLP-2衍生物之半胱胺酸中的硫原子連接的結構。上述硫醚鍵可包含結構：
Figure 110126453-A0101-12-0038-2
然而，本發明不特別局限於上述實例，而此對應於一個實例。
此外，接合物中，非肽基聚合物之反應基團可連接位於免疫球蛋白Fc區N-端的胺基，但此對應於一個實例。
此外，接合物中，GLP-2衍生物之反應基團可通過GLP-2衍生物的C-端而連接具有反應基團的非肽基聚合物，而此對應於一個實例。
如本文所使用，術語“C-端”意指肽的羧基端，及意指為了本發明之目的而能夠結合非肽基聚合物的位置。例如，C-端可包含C-端最末端的胺基酸殘基及在C-端附近的胺基酸殘基，具體地，可包含從最末端的第1至第20的胺基酸殘基，然而C-端不限於此。
在特定具體例中，可經由基因重組方法進行能夠延長GLP-2衍生物體內半衰期之材料的連接。
在特定具體例中，本發明GLP-2接合物是其中GLP-2衍生物及免疫球蛋白Fc區通過非肽基聚合物而各自共價連接非肽基聚合物之兩端的GLP-2接合物。
在此，非肽基聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸或其組合物所構成之群組。
具體地，本發明GLP-2衍生物可在非肽基聚合物的連接基與所引入的硫醇基、胺基或疊氮基之間形成共價鍵。因此，當使用本發明GLP-2衍生物時，可得到其中結合位點是選擇性調節的GLP-2接合物。
此外，由於在本發明GLP-2衍生物中，N-端胺基被取代、刪除或修飾，所以可避免非肽基聚合物結合在對體內活性為重要位點的N-端，因而可得到其中結合 位點是選擇性調節的GLP-2接合物。
在又另一方面，本發明提供製備GLP-2接合物的方法，包括連接GLP-2衍生物與能增加GLP-2衍生物之體內半衰期的材料。
GLP-2衍生物、能增加GLP-2衍生物之體內半衰期的材料及GLP-2接合物係如以上所述。
具體地，該方法可包括：
(a)經由使具有兩個或更多個末端反應基團的非肽基聚合物與GLP-2衍生物及載體(例如，免疫球蛋白Fc區)其中之一反應而製備複合物，以便使該複合物具有連接到非肽基聚合物之一個末端的GLP-2衍生物或載體，以及在另一末端的反應末端基團；及
(b)經由使步驟(a)中製備的複合物與不連接複合物的載體及GLP-2衍生物其中之一反應而製備接合物，而使GLP-2衍生物與載體經由非肽基聚合物而連接。
以上說明應用於非肽基聚合物、載體、GLP-2衍生物及其連接構成。
如本文所使用，術語“複合物”意指只有GLP-2衍生物及載體其中之一經由共價鍵而連接非肽基聚合物的中間物。不連接複合物的GLP-2衍生物或載體可以連接到複合物的非肽基聚合物的末端，而該末端未連接到GLP-2衍生物或載體。
在又另一方面，本發明提供具有增加之體內耐久性及穩定性的GLP-2長效製劑，其包括GLP-2接合 物。
同時，可增加生物可利用性或維持長效活性的製劑可包含使用微粒的緩釋製劑及使用PLGA、玻尿酸、幾丁聚糖等的奈米粒子。
此外，可增加生物可利用性或維持長效活性的其他形式製劑的實例可包含植入劑、吸入劑、鼻製劑及貼片。
本發明GLP-2接合物可維持傳統GLP-2的體內活性，且亦可增加GLP-2衍生物的血液半衰期及明顯地增加肽之體內功效的持續時間，因此，GLP-2接合物適用於治療腸道疾病、腸道損傷及胃病。
在又另一方面，本發明提供一種組成物，例如，包括GLP-2衍生物及/或GLP-2接合物的醫藥組成物。
該醫藥組成物是可用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的醫藥組成物。
GLP-2衍生物及GLP-2接合物係如以上所述。
如本文所使用，術語“腸道疾病”可意指短腸症候群、過敏性腸道疾病、炎症性腸道疾病、克隆氏症、結腸炎、大腸炎、胰臟炎、迴腸炎、黏膜炎或腸萎縮、但不限於此。
如本文所使用，術語“胃病”可意指胃痙攣、胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎或十二指腸潰瘍，但不限於此。
如本文所使用，術語“預防”意指經由給予醫 藥組成物來抑制或延緩疾病發作的任何活動。術語“治療”意指經由給予醫藥組成物來改善或有利地改變疾病症狀的所有活動。
根據本發明的醫藥組成物可包含藥學上可接受的載體。
如本文所使用，術語“藥學上可接受的”意指具有足夠的劑量以展現治療效果而不引起不良作用的特性，可由所屬領域熟練之技術人員根據在醫療領域眾所周知的因素，諸如疾病的種類、年齡、體重、健康狀況、性別、患者的藥物敏感性、給藥途徑、給藥方法、給藥頻率、治療時間、混合或同時給予的藥物等因素，而很容易地決定。
藥學上可接受的載體可包含，用於口服給藥之黏合劑、助滑劑、崩解劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、調味劑等；用於注射之緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、助溶劑、等張劑、安定劑等，可組合使用；及用於局部給藥之基質、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等。可多方面地經由組合上述藥學上可接受的載體而製備本發明醫藥組成物的製劑類型。例如，用於口服給藥，可將組成物調配成錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊製劑等。用於注射，可將組成物調配成單劑量安瓿或多劑量容器。此外，亦可將組成物調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑等。
同時，適合之載體、賦形劑及稀釋劑的實例 可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯橡膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。此外，組成物可進一步含有填料、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、調味劑、防腐劑等。
此外，基於本發明組成物之總重量，本發明GLP-2衍生物及/或GLP-2接合物的含量可為0.001wt%至10wt%，但不特別局限於此。
在又另一方面，本發明提供預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的方法，包括將GLP-2衍生物、GLP-2接合物及/或含有GLP-2衍生物、GLP-2接合物作為活性成分的醫藥組成物給予有此需要的個體。
GLP-2衍生物、GLP-2接合物、醫藥組成物、腸道疾病、腸道損傷、胃病、預防及治療，係如以上所述。
如本文所使用，術語“個體”意指懷疑患有腸道疾病、腸道損傷或胃病的個體，而懷疑患有該疾病的個體意指包含人類、大鼠、牛等的哺乳動物，這些哺乳動物患有或有發展該疾病的風險，但可以用本發明GLP-2衍生物、GLP-2接合物或含有GLP-2衍生物、GLP-2接合物之組成物來治療的任何個體均不受限制地包含在內。
如本文所使用，術語“給藥”意指經由任何適當的方法將特定物質引入患者體內，而給藥途徑可以是任 何能夠將藥物遞送到目標組織的常規途徑。這可以是腹膜內給藥、靜脈給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、皮內給藥、口服給藥、局部給藥、鼻腔給藥、肺內給藥、直腸內給藥等，但不限於此。然而，因為肽是在口服給藥時被消化的，所以較佳是將口服給藥用的組成物的活性成分加以塗布或配製，以防止在胃中的降解，具體地，可以用可注射的形式給藥。此外，可使用能夠將活性成分運送到標靶細胞的特定裝置給予醫藥組成物。
此外，本發明的醫藥組成物可以根據使用作為活性成分的藥物種類以及各種因素諸如所要治療的疾病、給藥途徑、年齡、性別及患者體重、疾病的嚴重性等來決定。因為本發明的醫藥組成物具有顯著優異的體內持續時間，所以本發明醫藥組成物的給藥次數及頻率可顯著減少。
本發明組成物的總有效劑量可按單一劑量給予患者，也可以根據分次治療方案按多劑量長期給藥。在本發明的醫藥組成物中，活性成分的含量可取決於疾病的嚴重性而變化。具體地，本發明的GLP-2衍生物或GLP-2接合物的每日總劑量可以是患者每公斤體重約為0.0001mg至500mg。
然而，GLP-2衍生物或GLP-2接合物的有效劑量是除了醫藥組成物的給藥途徑及治療頻率外還考量各種因素包含患者的年齡、體重、健康狀況、性別、疾病嚴重性、飲食及排泄率而決定的。在這方面，所屬領域的 熟練技術人員可以很容易地決定適合於本發明醫藥組成物之特定使用的有效劑量。根據本發明的醫藥組成物，只要顯示本發明的效果，不特別局限於製劑及給藥路線和模式。
在又另一方面，本發明提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物之用於製備藥物的用途。
在一方面，該藥物可使用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病，但不特別局限於此。
在又另一方面，本發明提供GLP-2衍生物或GLP-2接合物之用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病的用途。
GLP-2衍生物、GLP-2接合物、腸道疾病、腸道損傷及胃病，係如以上所述。
本發明經由下列實施例進一步說明。然而，應理解這些實施例僅用於具體闡述本發明，不應理解為使用這些實施例以任何形式限制本發明。
實施例1：製備CA-GLP-2 KC-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc接合物或CA-GLP-2 RC-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc接合物
對CA-GLP-2 KC或CA-GLP-2 RC(CPC,Chinese Peptide Co,China)的第34個半胱胺酸殘基進行10kDa MAL-ALD PEG(具有分子量10kDa的聚乙二醇，其中各末端的氫用3-[(3-N-馬來醯亞胺)丙醯基]胺基丙基基團及丙醛基團修飾；NOF Inc.,Japan)的聚乙二醇化，該反應以CA- GLP-2 KC或CA-GLP-2 RC對PEG的莫耳比為1：1至2，及肽濃度為1mg/mL至3mg/mL，進行1至3小時。在此，該反應在50mM Tris(pH7.5)及異丙醇的混合溶劑中進行。使用利用氯化鉀的濃度梯度及含有乙醇及檸檬酸鈉的緩衝液(pH2.0)的SP Sepharose高性能管柱(GE,U.S.A.)，從反應溶液中純化單-聚乙二醇化CA-GLP-2 KC或單-聚乙二醇化CA-GLP-2 RC。
隨後，以純化的單-聚乙二醇化CA-GLP-2 KC或單-聚乙二醇化CA-GLP-2 RC對免疫球蛋白Fc片段的莫耳比為1：2至1：6，及總蛋白質濃度為30mg/mL至35mg/mL，在2℃至8℃反應12至20小時。在此，在含有20mm氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)作為還原劑的反應溶液中，添加100mm磷酸鉀緩衝液(pH6.0)及異丙醇。
在反應完成後，採用使用bis-Tris緩衝液(pH6.5)及氯化鈉之濃度梯度的Source15Q管柱(GE，U.S.A.)，並採用使用硫酸銨及檸檬酸鈉之濃度梯度(pH5.0至5.2)的Source 15ISO管柱(GE，U.S.A.)，從反應溶液中純化CA-GLP-2RC(10K PEG)衍生物(CA-GLP-2 KC-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)的長效接合物及CA-GLP-2 RC(10K PEG)衍生物(CA-GLP-2 RC-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)的長效接合物，其中CA-GLP-2 KC或CA-GLP-2 RC經由PEG而與免疫球蛋白Fc共價連接。HPLC逆相分析之結果，測定之接合物純度分別為92.9%及95.6%，其結果如第1圖所示。
實施例2：製備CA-GLP-2 RK-PEG(3.4K 或10K)-免疫球蛋白Fc接合物
對CA-GLP-2 RK(CPC，Chinese Peptide Co,China)的第34個半胱胺酸殘基進行3.4kDa或10kDa ALD(2)PEG(具有分子量3.4kDa的聚乙二醇，其中各末端的氫用丙醛基團修飾；NOF Inc.,Japan)的聚乙二醇化，該反應以CA-GLP-2 RK對PEG的莫耳比為1：5至1：20，及肽濃度為5mg/mL至10mg/mL，在2℃至8℃進行4至16小時。在此，該反應在20mM HEPES(pH7.5)及乙醇中進行，並添加作為還原劑的20mM氰基硼氫化鈉而進行。使用利用氯化鉀的濃度梯度及含有乙醇及檸檬酸鈉的緩衝液(pH2.0)的Source 15S管柱(GE,U.S.A.)，從反應溶液中純化單-聚乙二醇化CA-GLP-2 RK。
隨後，根據如實施例1的相同反應及純化條件來製備及純化單-聚乙二醇化CA-GLP-2 RK及免疫球蛋白Fc的接合物。HPLC逆相分析結果，CA-GLP-2 RK(3.4K PEG)衍生物(CA-GLP-2 RK-PEG(3.4K)-免疫球蛋白Fc)的長效接合物及CA GLP-2 RK(10K PEG)衍生物(CA-GLP-2 RK-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)的長效接合物，其中CA-GLP-2 RK經由PEG而共價連接到免疫球蛋白Fc，其純度分別為94.3%及92.6%，其結果如第1圖所示。
實施例3：製備CA-GLP-2 KK-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc接合物及CA-GLP-2 K AZ K-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc接合物
根據實施例2的方法，使用CA-GLP-2 KK及CA-GLP- 2 KAZK製備及純化CA GLP-2 KK(10K PEG)衍生物(CA-GLP-2 KK-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)的長效接合物及CA GLP-2 KAZK(10K PEG)衍生物的長效接合物，其中CA-GLP-2 KK或CA-GLP-2 KAZK經由PEG而共價連接到免疫球蛋白Fc。
實施例4：確認GLP-2衍生物及其長效接合物的體外活性
為了測定已從前面實施例中得到的GLP-2衍生物及GLP-2衍生物之長效接合物的活性，用其中GLP-2受體經轉形的細胞株進行體外細胞活性測定。該細胞株是經轉形而在中國倉鼠卵巢(CHO)-K1中表現人GLP-2受體的細胞株，因此適合於測定GLP-2的活性(DiscoverX，U.S.A.)。
為了測定GLP-2衍生物及其長效接合物的活性，對人GLP-2及替度魯肽(Gattex，Shire)進行166.7nM至0.0028nM的3倍連續稀釋；對GLP-2衍生物進行500nM至0.0085nM的3倍連續稀釋；對GLP-2衍生物的長效接合物進行3000nM至0.0508nM的3倍連續稀釋。從培養的表現人GLP-2受體之CHO-K1細胞中取出培養液，然後分別在細胞中添加5μL的連續稀釋材料。隨後，添加含有cAMP抗體的緩衝液(5μL)，在室溫下進行15分鐘培養。然後，於此添加含有細胞裂解緩衝液的檢測混合物(10μL)來溶解細胞，並在室溫下反應60分鐘。反應完成後，將細胞裂解液施用於LANCE cAMP試劑盒(PerkinElmer，U.S.A.)通過累積的cAMP而計算EC50值，並相互進行比 較。與人GLP-2相比的相對效價如表2所示。
[表2]GLP-2衍生物的相對效價率
Figure 110126453-A0101-12-0049-3
結果證實，如上述製備的新穎GLP-2衍生物及其長效接合物具有活化GLP-2受體的功能，且GLP-2衍生物的相對效力明顯優於人GLP-2。此外，由於證實SEQ ID NO：4的GLP-2衍生物長效接合物(CA GLP-2 RK)及SEQ ID NO：6的GLP-2衍生物長效接合物(CA GLP-2 RC)與SEQ ID NO：2的GLP-2衍生物長效接合物(CA GLP-2 KC)相比具有更高的活性，所以這些可用作治療所期望疾病的材料。
實施例5：確認GLP-2衍生物的長效接合物在SD大鼠中的藥物動力學
在正常大鼠中比較GLP-2衍生物長效接合物的藥物動力學。
將8周齡正常大鼠分為給予CA GLP-2 KC(10K PEG)衍生物的長效接合物(2.52mg/kg)組、給予CA GLP-2 RC(10K PEG)衍生物的長效接合物(2.52mg/kg)組、給予CA GLP-2 RK(10K PEG)衍生物的長效接合物(2.52mg/kg)組及給予CA GLP-2 RK(3.4K PEG)長效接合物(2.52mg/kg)組。每組正常大鼠以試驗材料皮下注射一次(3隻/組)。隨後，在1、4、8、24、48、72、96、120、144及168小時，對給予CA GLP-2 KC(10K PEG)衍生物的長效接合物組，經由尾靜脈採集血液樣品而得到全血。另外，在1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312及336小時，對給予CA GLP-2衍生物的長效接合物的其他組，經由尾靜脈採集血液樣品而得到全血。將全血置於1.5mL微管中，於室溫下以5000rpm離心10分鐘，分離血清並貯存於-20℃。使用ELISA分析法定量各組之貯存血清濃度。對於CA GLP-2衍生物長效接合物，將生物素標記的GLP-2多株抗體(Phoenix Pharmaceuticals，#B-028-14)與塗布鏈黴親和素(Roche，#11645692001)的平板結合，然後與血清反應1小時。洗滌 後，於此添加抗人IgG4-HPR(Alpha Diagonosis，#10124)，並在室溫下反應1小時。隨後，使用TMB試劑對所得物進行呈色反應，在450nm波長處測定吸光度。使用血清濃度計算其藥物動力學參數。
其結果，證實CA GLP-2衍生物的長效接合物全部展現類似的AUC及半衰期。特別是，CA GLP-2 RK(3.4k PEG)衍生物的長效接合物，其半衰期由於短的PEG而實際上縮短，但AUC無顯著差異。其結果如第2圖及表3所示。
[表3]GLP-2衍生物之長效接合物的藥物動力學參數
Figure 110126453-A0101-12-0051-4
- AUClast：PK參數，其代表體內的藥物暴露程度，與 藥物的功效/毒性密切相關(為了使藥物在體內有效，應考慮體內一定程度的藥物暴露；體內過量的藥物暴露程度可能表明有毒性作用)。
- MRTlast：代表藥物的平均停留時間，即直到藥物在體內消失的平均時間。較高的MRT值表明藥物在體內停留長段時間，因此與MRT值較低的藥物相比，可評估為具有較長的持續時間。
實施例6：比較GLP-2衍生物的長效接合物與替度魯肽在大鼠中的藥物動力學
比較替度魯肽與GLP-2衍生物之長效接合物的藥物動力學。將8周齡正常大鼠分為給予替度魯肽(2.5mg/kg)組及給予CA GLP-2 RK(3.4K PEG)長效接合物(0.705mg/kg)組。每組正常大鼠以試驗材料皮下注射一次(3隻/組)。隨後，在0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8及24小時，對給予替度魯肽組，經由尾靜脈採集血液樣品而得到全血；及在4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312及336小時，對給予CA GLP-2 RK衍生物長效接合物組，經由尾靜脈採集血液樣品而得到全血。將全血置於1.5mL微管中，於室溫下以5000rpm離心10分鐘，分離血清並貯存於-20℃。使用ELISA分析法定量各組之貯存血清濃度。對於替度魯肽，使用GLP-2 ELISA試劑盒(Alpco,#48-GP2HU-E01.1)。對於CA GLP-2 RK衍生物，將生物素標記的GLP-2多株抗體(Phoenix Pharmaceuticals，#B-028-14)與塗布鏈黴親和素(Roche，#11645692001)的平板結合，然後與血清反應1小時。洗滌後，於此添加抗人IgG4-HPR(Alpha Diagonosis，#10124)，並在室溫下反應1小時。隨後，使用TMB試劑對所得物進行呈色反應，在450nm波長處測定吸光度。使用血清濃度計算其藥物動力學參數。
其結果，證實CA GLP-2 RK衍生物之長效接合物的AUC及半衰期與替度魯肽相比較，皆顯著增加。其結果如第3圖及表4所示。
[表4]替度魯肽及GLP-2衍生物之長效接合物的藥物動力學參數
Figure 110126453-A0101-12-0053-6
實施例7：確認GLP-2衍生物的長效接合物對增加正常大鼠體內腸重的效果
檢查替度魯肽及GLP-2衍生物的長效接合物對增加正常大鼠體內腸重的效果。
將7周齡C57BL/6小鼠各分為給予載體組、給予替度魯肽(7.5&15 nmol/kg/BID)組及給予CA GLP-2 RK(3.4k PEG)衍生物的長效接合物(4.15、7.5、15、30 nmol/kg/Q2D) 組。每組放置5隻小鼠，給藥13天後進行剖檢。灌注小腸，測量小腸重量及小腸內絨毛長度。
其結果，無論是替度魯肽還是CA GLP-2 RK衍生物的長效接合物，小腸重量都以劑量依賴性的方式增加(第4A圖)，且基於小腸重量的增加與絨毛長度的增加有關的事實，可推斷小腸重量的增加是由於腸絨毛長度的增加所致(第4B圖)。可知展現替度魯肽最大功效的高劑量給藥組(15 nmol/kg/bd)與給予CA GLP-2 RK衍生物長效接合物組之低劑量給藥組(4.15 nmol/kg/q2d)相似，並證實CA GLP-2 RK衍生物長效接合物在劑量依賴性方式上具有超過替度魯肽之最大功效的效果。其結果如第4圖所示。
從以上所述，本發明有關領域之普通熟練人員將能夠理解本發明可以其他特定形式體現，而無需修改本發明的技術概念或基本特徵。在這方面，此處公開的示例性具體例僅用於說明性目的而不應解釋為限制本發明的範圍。反之，本發明的目的不僅含括示例性具體例，而且還含括可包含在如所附權利要求所界定的本發明的精神及範圍內的各種選擇、修飾、等效物及其他具體例。
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<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 110126453-A0101-12-0055-7
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為咪唑并乙醯基去組胺酸
<400> 2
Figure 110126453-A0101-12-0055-8
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為咪唑并乙醯基去組胺酸
<400> 3
Figure 110126453-A0101-12-0056-9
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為咪唑并乙醯基去組胺酸
<400> 4
Figure 110126453-A0101-12-0056-10
<210> 5
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為咪唑并乙醯基去組胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)
<223> Xaa為6-疊氮基離胺酸
<400> 5
Figure 110126453-A0101-12-0057-11
<210> 6
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為咪唑并乙醯基去組胺酸
<400> 6
Figure 110126453-A0101-12-0057-12
<210> 7
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為咪唑并乙醯基去組胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa為Aib(2-胺基異丁酸)
<400> 7
Figure 110126453-A0101-12-0058-13
<210> 8
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa為Aib(2-胺基異丁酸)
<400> 8
Figure 110126453-A0101-12-0058-14
<210> 9
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa=組胺酸、咪唑并乙醯基去組胺酸、去胺基組胺酸、
β-羥基咪唑并丙醯基去組胺酸、N-二甲基組胺酸，或β-羥基咪唑并丙醯 基
去組胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa為丙胺酸、甘胺酸或Aib(2-胺基異丁酸)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa為離胺酸或精胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)
<223> Xaa從缺，或為離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、
6-疊氮基離胺酸或半胱胺酸
<400> 9
Figure 110126453-A0101-12-0059-15
由於本案的圖式均為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (19)

  1. 一種類升糖素肽-2(GLP-2)接合物，其中GLP-2衍生物及免疫球蛋白Fc區係經由非肽基聚合物而各共價連接於非肽基聚合物的兩端，其中非肽基聚合物係選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯基乙基醚及其組合物所構成之群組，以及其中該GLP-2衍生物由下列通式1之胺基酸序列組成：[通式1]X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO：9)，其中，在上述式中，X1為咪唑并乙醯基去組胺酸、去胺基組胺酸、β-羥基咪唑并丙醯基去組胺酸、N-二甲基組胺酸或β-羧基咪唑并丙醯基去組胺酸；X2為甘胺酸；X30為離胺酸；以及X34為離胺酸或6-疊氮基-離胺酸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中(1)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為離胺酸；或(2)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為6-疊氮基-離胺酸。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該 GLP-2衍生物由SEQ ID NO：3或5的胺基酸序列組成。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中非肽基聚合物的一個端點連接免疫球蛋白Fc區及其另一個端點連接GLP-2衍生物的羥基、硫醇基、胺基或疊氮基。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中免疫球蛋白Fc區為非糖基化。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中免疫球蛋白Fc區包括鉸鏈區。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
  8. 一種GLP-2衍生物，係由下列通式1之胺基酸序列組成：[通式1]X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO：9)，其中，在上述式中，X1為咪唑并乙醯基去組胺酸、去胺基組胺酸、β-羥基咪唑并丙醯基去組胺酸、N-二甲基組胺酸或β-羧基咪唑并丙醯基去組胺酸；X2為甘胺酸；X30為離胺酸；X34為離胺酸或6-疊氮基-離胺酸。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之GLP-2衍生物，其中(1)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為離胺酸；或(2)X1為咪唑并乙醯基去組胺酸，X2為甘胺酸，X30為離胺酸，及X34為6-疊氮基-離胺酸。
  10. 一種經分離的核酸，係編碼申請專利範圍第8或9項所述之GLP-2衍生物。
  11. 一種重組表現載體，係包括申請專利範圍第10項所述的核酸。
  12. 一種轉形體，係包括申請專利範圍第11項所述之重組表現載體。
  13. 一種製備申請專利範圍第8或9項所述之GLP-2衍生物的方法，包括：a)培養轉形體，該轉形體包括編碼申請專利範圍第8或9項所述之GLP-2衍生物而表現GLP-2衍生物的核酸；及b)分離及純化該經表現的GLP-2衍生物。
  14. 一種製備GLP-2接合物之方法，包括：(a)經由使具有兩個或更多個末端反應基團的非肽基聚合物與申請專利範圍第8或9項所述之GLP-2衍生物與免疫球蛋白Fc區其中之一反應而製備複合物，而使該複合物具有連接到非肽基聚合物之一個末端的GLP-2衍生物或免疫球蛋白Fc區，以及在另一末端的反應基團；及 (b)經由使步驟(a)中製備的複合物與不連接複合物的免疫球蛋白Fc區及GLP-2衍生物其中之一反應而製備接合物，而使GLP-2衍生物及免疫球蛋白Fc區經由非肽基聚合物而連接，其中非肽基聚合物係選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯基乙基醚及其組合物所構成之群組。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中非肽基聚合物包括選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所構成之群組的一種或多種反應基團。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中琥珀醯亞胺衍生物為琥珀醯亞胺基羧甲基、琥珀醯亞胺戊酸酯、琥珀醯亞胺甲基丁酸酯、琥珀醯亞胺甲基丙酸酯、琥珀醯亞胺丁酸酯、琥珀醯亞胺丙酸酯、N-羥基琥珀醯亞胺或琥珀醯亞胺碳酸酯。
  17. 一種醫藥組成物，係用於預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷及胃病的一種或多種疾病，且係包括申請專利範圍第1至7項中任一項所述之GLP-2接合物或申請專利範圍第8或9項所述之GLP-2衍生物。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥組成物，其中腸道疾病是指短腸症候群、過敏性腸道疾病、炎症性腸道疾病、克隆氏症、結腸炎、大腸炎、胰臟炎、迴腸炎、黏膜炎或腸萎縮。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥組成物，其中胃病是指胃痙攣、胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎或十二指腸潰瘍。
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