KR101746686B1 - 면역글로불린 단편을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드―２（ｇｌｐ―２）약물 결합체 - Google Patents

면역글로불린 단편을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드―２（ｇｌｐ―２）약물 결합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GLP-2, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 GLP-2 결합체 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명의 GLP-2 결합체는 펩타이드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 장질환, 장손상 또는 위질환 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

면역글로불린 단편을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드―２（ＧＬＰ―２）약물 결합체{An GLP-2 conjugate using an immunoglobulin fragment}
발명은 글루카곤 유사 펩타이드-2(이하 GLP-2)의 지속형 제형을 위한 GLP-2 결합체에 관한 발명으로서, 구체적으로 GLP-2, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 공유 결합에 의해 상호 연결되어 있으며 특정 아미노산 잔기에 대한 부위 선택적 결합방법과 특정 아미노산 잔기의 변형에 의해 생체 내 효력지속 효과를 보다 획기적으로 증가시킨 변형된 GLP-2 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2)는 섭취된 영양분에 반응하여 소장의 L-세포에서 생성되는 33개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. GLP-2는 소장, 대장에서 점막 성장을 유도하고(D. G. Burrin et al ., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol . 2000 Dec ;279(6): G1249 -1256) 장세포와 crypt 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제한다(Bernardo Yusta et al ., Gastrpenterology . 2009 Sep;137(3):986-996). 또한 GLP-2는 소장에서 영양분의 흡수를 증가시키고( PALLE BJ et al ., Gastrpenterology . 2001;120:806-815) 장 투과성을 감소시킨다(Cameron HL et al ., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol . 2003 Jun ;284(6): G905 -12). 위 배출(Gastric emptying) 및 위산 분비를 억제( Meier JJ et al ., Gastrpenterology. 2006 Jan ;130(1):44-54)하고, 장 혈류 속도를 증가시키고 (Bremholm L et al ., Scand J Gastroenterol . 2009;44(3):314-9), 장평활근을 이완시킨다( Amato A et al ., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol . 2009 Mar;296(3):G678-84).
GLP-2은 에너지 흡수 및 보호, 장 세포 기능의 활성화 등의 특징으로 다양한 장 질환과 장손상의 실험모델에서 치료제로서 유망한 가능성을 보여왔다. 영양 흡수를 조절하는 호르몬으로서 GLP-2는 단장증후군 (short bowel syndrome, 이하SBS)의 치료제로서 잠재력을 지니고 있다. SBS는 선천적 또는 장 절제 수술과 같은 후천적 원인으로 발생하며 소장의 흡수면적 감소로 인하여 영양결핍증을 초래하게 된다. GLP-2는 SBS를 갖는 설치류 실험모델에서 영양 흡수 및 소화관 흡수를 증진시키는 모습을 보였다( Ljungmann K et al ., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001 Sep ;281(3): G779 -85). 또한, 크론병은 입에서 항문까지 소화관 전체에 걸쳐 어느 부위에서든지 발생할 수 있는 만성 염증성 장질환인데, 원인은 아직 정확히 알려져 있지 않지만, 환경적 요인, 유전적 요인과 함께 소화관 내에 정상적으로 존재하는 세균에 대한 우리 몸의 과도한 면역반응 때문에 발병하는 것으로 생각되고 있다. GLP-2는 화학요법에 의해 유도되거나 유전적 요인으로 발생된 점막염, 결장염, 염증성 장 질환에 대하여 점막 상피 손상을 예방하거나 경감시키는 것으로 밝혀졌다( Qiang Xiao et al ., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol . 2000 Apr: 278(4), R1057 - R1063 ).
그러나 이러한 유망한 가능성에도 불구하고 GLP-2를 약물로 상용화하기 위하여 해결해야 할 문제점들이 있다. GLP-2와 같은 펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 펩타이드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되며, 따라서 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사하게 되는데, 이는 환자의 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도가 있어왔다. 그 중 하나로 펩타이드 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드 약물을 체내로 전달하려는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩타이드의 체내 전달 효율이 낮으며, 따라서 아직까지는 펩타이드 약물의 체내 활성을 요구되는 조건으로 유지하는데 어려움이 많다.
특히, GLP-2는 생리 활성 반감기가 7분 이하로 매우 짧다. 이는 디펩티딜 펩티다아제 Ⅳ(이하 DPPⅣ)에 의한 GLP-2의 아미노산 2번(Ala)와 3번(Asp) 사이의 절단에 의한 GLP-2의 역가 상실에 기인한다( Bolette H. et al ., The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism . 2000;85(8)2884-2888). 이러한 GLP-2의 생리 활성 반감기를 증가시키기 위하여 주로 아미노산 치환을 통한 해결 시도가 있어왔다.
미국의 NPS Pharmaceuticals Inc.는 크론병, SBS 및 위장 질환 치료제로 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산 Ala을 Asp로 치환한 GLP-2 유사체, 테두글루타이드를 개발 중이다. 테두글루타이드는 2번째 아미노산 서열을 치환함으로써 DPP4의 절단에 내성을 지니게 되었으며 펩타이드의 안정성 및 효능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나 DPP4 의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리활성의 지속시간을 기대할 수 없으므로, 테두글루타이드 역시 하루 1회 주사를 통해 투여되어야 하며 이는 여전히 환자에게 큰 부담이 아닐 수 없다(WO2005/067368).
덴마크의 질랜드사는 천연형 GLP-2의 아미노산 위치 3, 8, 16, 24, 28, 31, 32 및 33에서의 하나 이상의 치환을 포함한 GLP-2 유사체에 대하여 개발 중이다. 이들 치환은 펩타이드의 안정성 및 효능을 증가시킬 뿐만 아니라 치환 위치에 따라 결장에 비하여 소장에서 우세한 성장 촉진 활성을 지니거나 반대로 소장에 비하여 결장에서 우세한 성장 촉진 활성을 지니게 하여 선택적인 증상 치료를 가능하게 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 유사체 역시 충분한 생리활성의 지속시간을 기대할 수 없어 하루 1회 주사를 통해 투여되어야 하는 문제점이 있다(WO 2006/117565).
폴리에틸렌글리콜(PEG)은 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, US 4,179,337은 칼시토닌에 PEG를 결합하여 생리 활성 지속 및 막의 투과성을 높이는 것에 대해 기술하고 있으며, WO2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며 따라서 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가펩타이드(B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있다. 또한 US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
WO2002/46227는 재조합 유전자 기술을 이용한 GLP-1, 엑센딘-4 및 그 유사체와 인간 혈청 알부민 또는 면역 글로불린 단편(Fc) 과의 융합단백질에 대해 기술하고 있으며, US 6,756,480는 부갑상선 호르몬(PTH) 및 그 유사체와 Fc 융합 단백질에 대해 기술하고 있다. 이러한 방법은 페길화(pegylation)의 낮은 수율 문제와 비특이성을 극복할 수 있는 반면에, 혈중반감기 증가효과가 예상보다 획기적이지 못하고 경우에 따라서는 역가가 낮은 문제점을 지니고 있다. 혈중반감기 증가효과 를 극대화하기 위하여 다양한 종류의 펩타이드 링커가 사용되기도 하지만 면역 반응을 유발할 수 있는 가능성이 있다. 또한 BNP와 같이 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지고 있는 펩타이드를 이용할 경우 미스폴딩(misfolding)의 확률이 높아 적용이 어렵다는 문제점과 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기가 있는 경우 유전자 재조합의 형태로 생산이 불가능하다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 GLP-2 의 혈중반감기 증가 및 생체 내 활성유지를 동시에 극대화 할 수 있는 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 GLP-2 를 공유 결합에 의해 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 부위 선택적으로 상호 연결시키는 제조방법을 사용하여 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인하였으며, 특히 GLP-2 의 N-말단 아민 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐 GLP-2, GLP-2의 N-말단의 아민 그룹을 제거한 데스-아미노-히스티딜 GLP-2, GLP-2의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 이미다조-아세틸-GLP-2 등의 GLP-2 유도체의 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 GLP-2의 생체 내 활성을 유지하면서 혈중 반감기를 연장시켜 월등히 우수한 지속형 GLP-2 결합체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 GLP-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 통하여 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 지속형 GLP-2 결합체에 관한 것이다.
본 발명의 GLP-2는 GLP-2 수용체에 결합하여 장손상, 장질환 및 위 질환 개선의 기능을 보유한 33개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서, 아미노산 서열은 아래와 같다.
GLP-2(1-33)
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (서열번호 1)
본 발명의 GLP-2는 천연형 GLP-2, 아고니스트(agonist), 유도체 (derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants)등을 포함한다.
본 발명에서 GLP-2 아고니스트는 GLP-2의 구조와 상관없이 생체 내 GLP-2 수용체와 결합하여 천연형 GLP-2와 동일한 혹은 유사한 생리활성을 일으키는 물질을 말한다.
본 발명에서 GLP-2 단편은, GLP-2의 N- 말단 또는 C- 말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 펩타이드를 의미하며, 이 때 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산) 도 가능하다.
본 발명에서 GLP-2 변이체는 천연형 GLP-2와 하나 이상의 아미노산이 다른 펩타이드를 의미하며 천연형 아미노산 이외에 비 천연형 아미노산의 치환도 가능하다.
본 발명에서 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2와 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-ethylation)된 형태일 수 있다.
구체적인 일 양태로서 본 발명에서 사용한 GLP-2는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 재조합 방법으로도 생산 가능하다.
본 발명에서 사용된 GLP-2는 다양한 부위에서 비펩타이드성 중합체와 결합될 수 있다. 생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 말레이미드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다. 또한, 생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 있는 아민 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 알데히드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
비펩타이드성 중합체에 알데히드 링커를 사용하면 N-말단과 라이신 잔기에 있는 아민 그룹과 반응하며, 선택적으로 반응 수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 GLP-2를 사용할 수 있다. 예를 들어, N-말단 보호 방법, 라이신 잔기 치환 방법, 카르복시 말단에 아민 그룹을 도입방법 등을 사용하여 반응할 수 있는 아민 그룹을 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 페길화 및 커플링 수율을 향상시킬 수 있다. N-말단의 보호방법은 디메틸화(dimethylation) 외 메틸화(methylation), 탈아미노화(deamination) 또는 아세틸화(acetylation) 방법으로도 가능하며, 이러한 알킬화(alkylation)방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 GLP-2 결합체는 GLP-2의 N-말단 이외의 아민 그룹에 특이적으로 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 GLP-2 결합체이다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 GLP-2 펩타이드의 라이신 잔기에 선택적으로 커플링하기 위한 방법으로, 천연형 GLP-2에 PEG를 결합시킬 때 pH 9.0로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였으며, 다른 방법으로는 N-말단의 제거 또는 보호된 형태의 GLP-2 유도체에 PEG를 결합시킬 때 pH7.5로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였다. N-말단 히스티딘의 알파 아민기를 제거하는 방법, 하이드록실 그룹으로 치환하여 합성하는 방법, 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거하여 이미다조-아세틸(imidazo-acetyl) 그룹만을 남겨두는 방법 등을 사용하여 링커 PEG의 N-말단 결합을 방지하였다.
아민그룹을 제거한 데스-아미노-히스티딜 GLP-2 (des-amino-histidyl GLP-2, 이하, DA-GLP-2 라고도 칭함), GLP-2 의 N-말단 아민 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시-이미다조프로피오닐 GLP-2 (beta-hydroxy-imidazopropionyl GLP-2, 이하, HY-GLP-2 라고도 칭함), 그리고 GLP-2의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-GLP-2 (imidazoacetyl-GLP-2, 이하, CA-GLP-2 라고도 칭함)의 GLP-2 유도체 들은 아미노산 변환에도 불구하고 인 비보 효력시험에서 체중 감소 개선 효과를 보였으며 나타내었으며, GLP-2 유도체의 면역글로불린 Fc 결합체는 인 비보 효력시험에서 월등한 지속성 효과를 보여주었다. 구체적으로, 본 발명에서 제조한 GLP-2 -면역글로불린 Fc 결합체를 비롯하여 DA-GLP-2-면역글로불린 Fc 결합체, CA GLP-2-면역글로불린 Fc 결합체, HY-GLP-2-면역글로불린 Fc 결합체의 생체내 활성은 4일 이상 지속되었음을 확인하였다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분을 제거함으로써 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다. 본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 (CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge)부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH 3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다. 또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역을 사용할 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다. 본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직 하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다. 본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다. 한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준 에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다. 본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 펩타이드 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다.
특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체의 양말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 GLP-2 결합체를 포함하는 GLP-2 지속형 제제를 제공한다. 본 발명의 GLP-2 지속형 제제는 장질환, 장손상 및 위질환에 유용한 바, 이를 투여함으로써 상기 질환의 치료를 도모할 수 있다. 본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속형 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함한 지속형 제제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 지속형 제제의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 지속형 제제는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련에 따라 결정된다. 본 발명의 지속형 제제는 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 GLP-2 유도체의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계; (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 GLP-2 유도체를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 GLP-2 유도체와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 GLP-2 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "연결체"란 비펩타이드성 중합체와 GLP-2 유도체만이 공유결합으로 연결된 중간체로서, 이후 이 연결체에 있는 비펩타이드성 중합체의 GLP-2 유도체가 연결되지 않은 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키게 된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 GLP-2 유도체의 라이신 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계; (2) (1)의 반응 혼합물로부터 라이신잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 GLP-2 유도체를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합 체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 GLP-2 유도체와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 GLP-2 결합체의 제조방법을 제공한다.
더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 GLP-2 유도체의 라이신 잔기는 pH 7.5 이상에서 연결된다.
본 발명의 GLP-2 결합체는 펩타이드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 장질환, 장손상 또는 위질환 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 천연형 GLP-2-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이다.
도 2은 데스-아미노-히스티딜 GLP-2 (DA GLP-2)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이다.
도 3은 이미다조-아세틸 GLP-2(CA GLP-2)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이다.
도 4은 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐 GLP-2(HY GLP-2)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이다.
도 5은 천연형 GLP-2와 비교하여 GLP-2 유도체의 체중 감소 개선 효과를 측정한 In vivo 결과 이다.
도 6은 지속형 GLP-2 유도체의 체중 감소 개선 효과를 측정한 In vivo 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GLP -2 페길화(pegylation)와 위치 이성질체 분리
3.4K PropionALD(2) PEG(프로필알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG)를 천연형 GLP-2 (American peptide, 미국)의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여 GLP-2와 PEG의 몰비를 1 : 12, 펩타이드 농도를 5mg/ml로 하여 4℃에서 4.5 시간 반응시켰다. 이 때 반응은 100mM sodium borate pH9.0/45% EtOH 에서 이루어 졌으며 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 Source S (XK16ml, 아머샴 바이오사이언스) 정제컬럼을 사용하여 이성질체를 분리하였다. N-말단이 페길화된 피크(N-term pegylated 피크)가 가장 앞쪽에 나오고 그 뒤쪽으로 라이신이 페길화된 피크(Lys Pegylated 피크)가 나옴을 알 수 있었다. 용출된 피크는 펩타이드 매핑(mapping) 방법으로 페길화된 위치를 확인할 수 있었다.
실시예 2. 천연형 GLP -2- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 1의 방법을 이용하여 3.4K PropionALD(2) PEG를 GLP-2의 라이신 잔기와 반응시킨 후 라이신 잔기 이성질체만을 정제하여 면역글로불린 Fc 와 커플링시켰다. 펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1 : 10, 전체단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃ 에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc를 제거하기 위하여 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 이용하여 커플링 반응액을 정제하였다. 20mM Tris(pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용츌되고 바로 뒤이어 GLP-2-PEG-면역글로불린 Fc 가 용출된다. HPLC 역상 분석 결과 순도 95.4%를 나타내었다(도 1).
실시예 3. DA GLP -2 페길화(pegylation)와 위치 이성질체 분리
3.4K PropionALD(2) PEG를 데스-아미노-히스티딜 GLP-2의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여 DA GLP-2와 PEG의 몰비를 1 : 30 , 펩타이드 농도를 5mg/ml로 4℃에서 4.5 시간 반응시켰다. 이 때 반응은 100mM sodium phosphate pH7.5 에서 이루어 졌으며 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 정제 방법은 실시예 1과 동일하다.
실시예 4. DA GLP -2- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 3의 방법을 이용하여 3.4K PropionALD(2) PEG를 DA GLP-2의 라이신 잔기와 반응시킨 후 정제하여 면역글로불린 Fc 와 커플링시켰다. 펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1 : 10, 전체단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃ 에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다 정제 방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상 분석 결과 순도 96.6%를 나타내었다(도 2).
실시예 5. CA GLP -2- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 이미다조 아세틸 GLP-2의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여 CA GLP-2와 PEG의 몰비를 1 : 30 , 펩타이드 농도를 5mg/ml로 4℃에서 4.5 시간 반응시켰다. 이 때 반응은 100mM sodium phosphate pH7.5 에서 이루어 졌으며 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. Source S(XK16ml, 아머샴 바이오사이언스) 정제컬럼을 사용하여 분리 한 후 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1 : 10, 전체단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃ 에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 정제 방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상 분석 결과 순도 93.9%를 나타내었다(도 3).
실시예 6. HY GLP -2- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 베타-히드록시-이미다졸-프로피오닐 GLP-2의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여 HY GLP-2와 PEG의 몰비를 1 : 30 , 펩타이드 농도를 5mg/ml로 4℃에서 4.5 시간 반응시켰다. 이 때 반응은 100mM sodium phosphate pH7.5 에서 이루어 졌으며 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. Source S(XK16ml, 아머샴 바이오사이언스) 정제컬럼을 사용하여 분리 한 후 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1 : 10, 전체단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃ 에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 정제 방법은 실시 예 2와 동일하다. HPLC 역상 분석 결과 순도 98%를 나타내었다(도 4).
실시예 7. GLP -2 유도체의 인 비보 효력 실험
천연형 GLP-2 및 GLP-2 유도체들의 인 비보 효력을 측정하기 위하여 장염이 유도된 Balb/c mice 마우스를 이용하여 체중 변화를 확인하였다. 7주령의 수컷 마우스에 5-FU(60mg/kg)를 매일 1회 4일간 복강 투여하여 장염을 유발하였다. 장염이 유도된 마우스에 천연형 GLP-2와 GLP-2 유도체들을 각 20ug씩 투여하였다. 시험물질을 투여한 후 매일 개체의 체중을 측정하였다. 천연형 GLP-2 및 GLP-2 유도체들을 투여한 마우스들은 비히클을 투여한 마우스에 비하여 체중 감소 개선 효과를 보였다. 특히 HY GLP-2 유도체를 투여한 마우스는 천연형 GLP-2를 투여한 마우스와 동등한 체중 감소 개선효과를 보였다(도 5).
실시예8 . 지속형 GLP -2 유도체의 인 비보 효력 실험
천연형 GLP-2 지속형 제제 및 GLP-2 유도체 지속형 제제의 인 비보 효력을 측정하기 위하여 장염이 유도된 CD1 mice를 이용하여 체중 변화를 확인하였다. 6주령의 암컷 마우스에 7% Dextran sulfate을 급수병을 이용하여 자유섭취 시켜 장염을 유발하였다. 장염이 유도된 마우스에 천연형 GLP-2 50ug을 하루에 한 회 10일 동안 투여하였고 GLP-2 유도체 지속형 제제(GLP-2 유도체-PEG-면역글로불린 Fc 결합체)들을 각 50ug씩 단회 투여하였다. 시험물질을 투여한 후 매일 개체의 체중을 측정하였다. 양성대조군으로 5-아미노살리실산(5-ASA) 을 사용하였다. 천연형 GLP-2, 천연형 GLP-2 지속형 제제 및 GLP-2 유도체 지속형 제제를 투여한 마우스들은 비히클을 투여한 마우스에 비하여 체중 감소 개선 효과를 보였다. 특히 DA GLP-2-PEG-면역글로불린 Fc 결합체(LAPS-DA GLP-2), HY GLP-2-PEG-면역글로불린 Fc 결합체(LAPS-HY GLP-2)를 투여한 마우스는 단 회 투여임에도 불구하고 투여 10일 후에도 천연형 GLP-2를 매일 투여한 마우스와 동등한 체중 감소 개선효과를 보였다(도 6).
<110> Hanmi Holdings CO., Ltd <120> An GLP-2 conjugate using an immunoglobulin fragment <130> PA100652/KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp

Claims (23)

  1. 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2) 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체의 링커를 통해 연결되고, 상기 GLP-2의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 상기 비펩타이드성 중합체가 결합된 것인 GLP-2 결합체로서,
    상기 GLP-2는 천연형 GLP-2 또는 천연형 GLP-2의 유도체(derivative)이고,
    상기 유도체는 천연형 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 치환(substitution), 제거(deletion), 또는 수식(modification)된 것인 GLP-2 결합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 유도체(derivative)는 천연형 GLP-2의 N-말단 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 아민 그룹이 제거되거나, 천연형 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 제거되거나, 또는 천연형 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 것인 GLP-2 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 GLP-2의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 GLP-2 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 GLP-2 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 GLP-2 결합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 GLP-2 결합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 GLP-2 결합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 GLP-2 결합체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 당쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 GLP-2 결합체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 GLP-2 결합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 GLP-2 결합체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 알데히드 그룹, 프로피온알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 가지고,
    상기 석시니미드 유도체는 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 하이드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트인 GLP-2 결합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 GLP-2 결합체.
  16. (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 및 석시니미드 유도체 중에서 선택되는 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2)의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합시키는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 GLP-2를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 GLP-2와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 GLP-2 결합체의 제조방법으로서,
    상기 석시니미드 유도체는 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 하이드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트이고;
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 GLP-2는 천연형 GLP-2 또는 천연형 GLP-2의 유도체(derivative)이고;
    상기 유도체는 천연형 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 치환(substitution), 제거(deletion), 또는 수식(modification)된 것인 GLP-2 결합체의 제조방법.
  17. (1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 GLP-2의 라이신 잔기에 pH 7.5 이상에서 공유결합하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 라이신 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 GLP-2를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 GLP-2와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 GLP-2 결합체의 제조방법으로서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 GLP-2는 천연형 GLP-2 또는 천연형 GLP-2의 유도체(derivative)이고;
    상기 유도체는 천연형 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 치환(substitution), 제거(deletion), 또는 수식(modification)된 것인 GLP-2 결합체의 제조방법.
  18. 삭제
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 제거된 데스-아미노-히스티딜(des-amino-histidyl) GLP-2 유도체인 GLP-2 결합체의 제조방법.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 GLP-2의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹(Hydroxyl group)으로 치환된 GLP-2 유도체인 GLP-2 결합체의 제조방법.
  21. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 GLP-2의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹이 제거된 GLP-2 유도체인 GLP-2 결합체의 제조방법.
  22. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 GLP-2 결합체의 제조방법.
  23. 제1항 및 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항의 GLP-2 결합체를 포함하는, 단장증후군, 크론병, 점막염, 결장염, 염증성 장 질환 및 장염 중에서 선택되는 하나 이상의 질환 치료용 약제학적 조성물.
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