KR20230038187A - 아프라글루타이드의 제조, 제형화 및 투여 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 GLP-2 유사체를 제조, 제형화 및 투여하는 방법에 관한 것이다.

Description

아프라글루타이드의 제조, 제형화 및 투여
관련 출원
본 출원은 2020년 6월 9일자로 출원된 미국 가출원 제63/036,507호, 2020년 9월 3일자로 출원된 미국 가출원 제63/074,119호, 및 2021년 3월 5일자로 출원된 미국 가출원 제63/157,083호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장한다. 상기 언급된 특허 출원들 각각의 내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 6월 7일에 생성된 상기 ASCII 사본은 "VECT-002_001WO_SeqList.txt"로 명명되고 크기가 약 2 KB이다.
기술분야
본 개시내용은 아프라글루타이드의 제조, 제형화 및 투여에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드 2(GLP-2)는 장의 장내분비 L 세포에서 프로글루카곤의 번역후 가공으로부터 방출된 33개 아미노산 펩티드이다.
장 장애 또는 기능장애를 치료하기 위해 아프라글루타이드를 사용하는 것을 고려한다. 하나의 구현예에서, 본 발명자들은 단장 증후군의 치료를 고려한다. 단장 증후군은, 다른 병인이 또한 존재하지만, 가장 흔히 장간막 허혈 또는 염증성 장 질환(IBD)으로 인한 외과적 절제의 결과로서 기능적 장 길이의 극한 감소를 특징으로 하는 흡수장애 병태이다. 장 부전이 있는 SBS(SBS-IF)는 장 기능이 다량 영양소 및/또는 체액 및 전해질의 흡수에 필요한 최소 수준 아래로 감소하여 건강 및/또는 성장을 유지하기 위해 정맥 보충이 필요한 것으로 정의된다. SBS-IF 환자에서는 중심 정맥 카테터를 통해 전달되는 비경구 지원(PS)이 적절한 체액, 에너지, 전해질, 미량 원소, 비타민 및 영양소 균형을 유지하는 데 필요하다. SBS-IF 환자의 범위는, 많은 PS 부피가 필요한, 소공이 있고 연속성 결장(colon-in-continuity, CIC)이 없는 환자부터 낮은 PS 부피가 필요한 CIC 환자까지 다양하다. 이 스펙트럼의 결과로, PS에 대한 의존성 감소는 PS 부피 감소, PS 쉬는 날 또는 장관 자율성 달성을 포함하여, 해부학에 따라, 다양한 결과에서 입증될 수 있다. 외과적 절제 후 남아있는 장은 감소된 길이를 보상하기 위해 흡수 능력을 증가시키는 장 적응이라는 과정을 거친다. 이러한 장 적응 과정은 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 또는 테두글루타이드 및 아프라글루타이드와 같이 반감기가 연장된 보다 안정적인 유사체를 투여함으로써 향상될 수 있음이 입증되었다. 결장의 생리학적 역할로 인해 CIC 환자는 기능적 결장이 없는 환자보다 체액 균형을 훨씬 더 잘 관리할 수 있으며 소공 환자에 비해 기준선에서 비경구 지지 부피가 더 낮다. PS는 유체와 전해질을 포함하는 임의의 정맥 내 주입으로 정의되며 비경구 영양(PN)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 비경구 영양은 단백질, 탄수화물, 지방, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함하는 PS로 정의된다. 양성 질환으로 인한 만성 장 부전 환자는 PS에서 장기 생존 가능성이 높다.
GLP-2는 점막 상피 증식의 강력한 자극제로 식별된 이후 장 손상 치료제로서 상당한 관심을 끌었다. 단장 증후군 환자를 대상으로 한 예비 시험에서 유체와 영양소의 장내 흡수가 개선되었다. GLP-2는 소장 점막 상피의 상당한 성장을 유도한다. 또한 장 이동을 늦춘다. 그러나 자연 발생 GLP-2는 펩티다제(예를 들어, DPP IV)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 적합한 약물 후보가 아니다. 그 결과, GLP-2는 반감기가 매우 짧고(인간에서 t1/2 = 10분) 신속하게 제거(CL)된다.
개선된 약동학적 특성을 갖는 고수율 및 실질적으로 순수한 GLP-2 유사체 펩티드를 생성하기 위한 방법이 필요하다. 또한, 실질적으로 순수한, 예를 들어, 실질적으로 불순물이 없는, GLP-2 유사체 펩티드 조성물이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키는 것에 관한 것이다.
일 양태에서, 고순도의 GLP-2 유사체의 신규한 합성이 개시된다. 또 다른 양태에서, GLP-2 유사체의 신규한 나트륨염이 개시된다. 방법은 수지 상에서 고상 펩티드 합성(SPPS)을 수행하는 단계, 수지로부터 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 절단하고 트리플루오로아세트산(TFA), 물, 및 아니솔을 포함하는 용액으로 수지를 처리함으로써 펩티드의 측쇄를 탈보호하는 단계, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 2회의 정제를 수행하는 단계, 실질적으로 순수한 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 정제된 펩티드 분말을 동결 건조 및 포장하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 95% 이상의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 97% 이상의 순도를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태는 순도가 적어도 97%인 GLP-2 유사체 펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드와 같은 GLP-2 유사체 펩티드는 1% 미만의 Des-Gly4 아프라글루타이드 불순물; 및/또는 3% 미만의 아스파르티미드(Aspartimide)3 아프라글루타이드, Asp33-OH 아프라글루타이드 및 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물 합계; 및/또는 1% 미만의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 순도가 적어도 97%인 GLP-2 유사체 펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드와 같은 GLP-2 유사체 펩티드는 1% 이하의 Des-Gly4 아프라글루타이드 불순물; 및/또는 3% 이하의 아스파르티미드(Aspartimide)3 아프라글루타이드, Asp33-OH 아프라글루타이드 및 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물 합계; 및/또는 1% 이하만의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 순도가 적어도 97%인 GLP-2 유사체 펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드와 같은 GLP-2 유사체 펩티드는 1% 미만의 Des-Gly4 아프라글루타이드 및 아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물 합계, 1% 미만의 D-아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물, 1% 미만의 Asp33-OH 아프라글루타이드 불순물, 1% 미만의 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물, 및/또는 1% 미만의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 순도가 적어도 97%인 GLP-2 유사체 펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드와 같은 GLP-2 유사체 펩티드는 1% 이하의 Des-Gly4 아프라글루타이드 및 아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물 합계, 1% 이하의 D-아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물, 1% 이하의 Asp33-OH 아프라글루타이드 불순물, 1% 이하의 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물, 및/또는 1% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함한다.
본 발명자들은 다음을 인지하였다:
i) Fmoc 탈보호 및 커플링 주기 동안 Fmoc-보호된 아미노산: Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 Fmoc-Gly-OH의 Fmoc-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-OH 및 Fmoc-Tmb-Gly-OH로의 대체는 커플링 효율을 개선하고 아스파르티미드 형성을 감소시킨다;
ii) Fmoc 탈보호 및 커플링 주기 동안 커플링 첨가제로서 HOBt 대신 옥시마를 사용하면 펩티드 산화 및 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물 형성이 최소화된다; 및
iii) 분취용 RP-HPLC에 의한 나트륨염 전환 동안, 이동상 조성물에 아세토니트릴(ACN) 사용, pH 조정 단계 도입 및 적정 단계 제거는 아프라글루타이드 나트륨염 전환 및 정제된 아프라글루타이드 품질을 개선한다. 또 다른 양태에서, 아프라글루타이드의 신규한 제형 및 염이 개시된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 GLP-2 유사체 펩티드는 다음의 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00001
또 다른 양태에서, 필요로 하는 환자에게 유효량의 아프라글루타이드를 투여하는 신규한 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 유효량은 1 내지 10 mg의 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용되는 염은 체중이 50 ㎏ 미만인 환자에게 매주 1회 2.5 mg으로 투여된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용되는 염은 체중이 50 ㎏ 이상인 환자에게 매주 1회 5.0 mg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용되는 염을 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용되는 염을 피하 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염을 1일 2회 내지 1개월 2회, 바람직하게는 매주 1회 빈도로 투여하는 단계를 포함한다.
1일 1회 미만, 바람직하게는 매주 1회 투여될 수 있는 아프라글루타이드와 같이 더 긴 반감기를 갖는 GLP-2 유사체가 필요하다.
도 1은 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 GLP-2 작용제(아프라글루타이드)에 대한 펩티드 서열 및 구조를 나타낸다. 도 1에 도시된 서열은 서열번호 1 내지 4에 해당한다.
도 2a는 아프라글루타이드와 같은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 개선된 방법(이하 공정 B라고 함)에 관한 본 개시내용의 제1 양태에서 단계 1~2의 흐름도 개략도이다.
도 2b는 아프라글루타이드와 같은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 개선된 방법(이하 공정 B라고 함)에 관한 본 개시내용의 제1 양태에서 단계 3~6의 흐름도 개략도이다.
도 3은 아프라글루타이드를 포함하는 제약 조성물의 생산에 관한 본 개시내용의 제조 공정의 흐름도 개략도이다.
도 4는 본 개시내용의 시험 설계의 개략도이다.
도 5는 소변 배출량(mL/일)의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 파선은 평균을 나타내고 Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 6은 조정된 평균(점) 및 95% CI(검은색 선)가 분석 파트 A+B로부터 나온 소변 배출량(mL/일)의 기준선으로부터의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 소변 나트륨 배설(mmol/일)의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 파선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 8은 기준선으로부터 1차 주사 직후까지의 소변 배출량의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 파선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 9는 기준선으로부터 1차 치료 직후까지의 소변 나트륨 배설의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 파선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 10a는 위약 치료를 받은 환자에서 유체 복합 효과의 개별 변화 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 소변 생산 증가(27~29일), PS 부피 감소 및 자발적 구강 유체 섭취 감소(20~22일)의 합계로 정의되는 유체 복합 효과.
도 10b는 5 mg 아프라글루타이드를 받은 환자에서 유체 복합 효과의 개별 변화 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 소변 생산 증가(27~29일), PS 부피 감소 및 자발적 구강 유체 섭취 감소(20~22일)의 합계로 정의되는 유체 복합 효과.
도 10c는 10 mg 아프라글루타이드를 받은 환자에서 유체 복합 효과의 개별 변화 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 소변 생산 증가(27~29일), PS 부피 감소 및 자발적 구강 유체 섭취 감소(20~22일)의 합계로 정의되는 유체 복합 효과.
도 11은 혈장 L-시트룰린의 절대 농도의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 파선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 12는 CONSORT(Consolidated Standards of Reporting Trials)의 개략도이다.
도 13은 CONSORT(Consolidated Standards of Reporting Trials)의 개략도이다.
도 14는 습윤 중량 식이 섭취, 대변 배출, 장 흡수 및 소변 생산의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 굵은 선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 파선은 SBS-II 환자를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 15는 칼륨, 나트륨, 마그네슘 및 칼슘 흡수의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 굵은 선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 파선은 SBS-II 환자를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 16은 에너지 식이 섭취, 대변 배출 및 흡수의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 굵은 선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 파선은 SBS-II 환자를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 17은 다량영양소의 흡수의 기준선으로부터 치료 종료까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 굵은 선은 평균을 나타내고, B는 기준선을 나타내고, T는 치료를 나타내고, Δ는 기준선으로부터의 평균 변화(표준편차)를 나타낸다. 파선은 SBS-II 환자를 나타낸다. 회색의 차이는 개별 환자를 나타낸다.
도 18은 아프라글루타이드의 제1 투여 후 시간(일)의 함수로서 혈장 시트룰린 농도(ug/mL)를 나타내는 그래프이다. SD = 표준편차; SC = 피하. 데이터는 산술 평균(± SD)이다. 1, 5 또는 10 mg 아프라글루타이드의 매주 SC 투여는 1, 8, 15, 22, 29 및 36일에 예정되었다.
도 19는 아프라글루타이드의 제1 투여 후 시간(일)의 함수로서 혈장 시트룰린 농도(ug/mL)에 대한 기준선으로부터의 변화에 대한 상응하는 최소 제곱(LS) 평균 플롯을 나타내는 그래프이다. CI = 신뢰 구간; SC = 피하. 데이터는 추정 최소 제곱 평균(95% CI)이다. 1, 5 또는 10 mg 아프라글루타이드의 매주 SC 투여는 1, 8, 15, 22, 29 및 36일에 예정되었다.
도 20a는 아프라글루타이드의 제1 투여 후 시간(일)의 함수로서 혈장 아프라글루타이드 농도(ng/mL)를 나타내는 그래프이다. SC = 피하; SD = 표준편차. 1, 5 또는 10 mg 아프라글루타이드의 매주 SC 투여는 1, 8, 15, 22, 29 및 36일에 예정되었다. 정량 한계(<1 ng/mL) 미만의 값은 0으로 설정되었다. 용량 수준당 데이터는 선형 척도에서 산술 평균 ± SD로 표시된다.
도 20b는 아프라글루타이드의 제1 투여 후 시간(일)의 함수로서 혈장 아프라글루타이드 농도(ng/mL)를 나타내는 그래프이다. SC = 피하; SD = 표준편차. 1, 5 또는 10 mg 아프라글루타이드의 매주 SC 투여는 1, 8, 15, 22, 29 및 36일에 예정되었다. 정량 한계(<1 ng/mL) 미만의 값은 0으로 설정되었다. 용량 수준당 데이터는 로그 척도에서 산술 평균 ± SD로 표시된다.
도 21은 6주째의 용량 수준에 따른 개별 아프라글루타이드 Cmax 값 및 상응하는 시트룰린 Rmax 값(ug/mL)을 나타내는 그래프이다. Cmax 아프라글루타이드(ng/mL); Cmax = 최대 농도; Rmax = 최대 반응. 회귀의 경우 회귀선, 식, 기울기의 p-값 및 R 제곱 값이 표시된다.
도 22은 6주째의 용량 수준에 따른 개별 아프라글루타이드 AUCtau 값 및 상응하는 시트룰린 Rmax 값(ug/mL)을 나타내는 그래프이다. AUCtau = 상응하는 투여량의 치료 기간의 종료까지의 혈장 농도-시간 곡선 아래 면적; Rmax = 최대 반응. 회귀의 경우 회귀선, 식, 기울기의 p-값 및 R 제곱 값이 표시된다.
도 23은 6주째의 용량 수준에 따른 개별 아프라글루타이드 AUCtau 값 및 상응하는 시트룰린 Rmax 값의 상관관계 플롯이다. 검은색 점은 마지막 용량 전 평가를 나타내고 선은 마지막 용량 후 최대 2주까지의 후속 평가를 연결한다.
도 24는 6주째에 1 mg을 투여한 각 대상체에 대한 모든 아프라글루타이드 농도 및 상응하는 시트룰린 농도의 상관관계 플롯이다. 검은색 점은 마지막 용량 전 평가를 나타내고 선은 마지막 용량 후 최대 2주까지의 후속 평가를 연결한다.
도 25는 6주째에 5 mg을 투여한 각 대상체에 대한 모든 아프라글루타이드 농도 및 상응하는 시트룰린 농도의 상관관계 플롯이다. 검은색 점은 마지막 용량 전 평가를 나타내고 선은 마지막 용량 후 최대 2주까지의 후속 평가를 연결한다.
도 26a는 매주 2.5, 5, 또는 10 mg의 아프라글루타이드를 피하 투여받는 70 ㎏ 개체에 대한 예상 혈장 아프라글루타이드 농도(ng/mL)를 나타내는 그래프이다.
도 26b는 매주 2.5, 5, 또는 10 mg의 아프라글루타이드를 피하 투여받는 70 ㎏ 개체에 대한 예상 혈장 시트룰린 농도(ug/mL)를 나타내는 그래프이다.
도 27은 혈장 L-시트룰린의 농도의 기준선으로부터 치료 후까지의 개별 및 평균 변화를 나타내는 그래프이다. 기준선으로부터의 평균 변화는 짝비교 t-검정을 사용하여 분석되었다. *p<0.05 검은색 실선은 평균 변화를 나타내고, 채색된 선은 개별 환자를 나타낸다. 점선=SBS-II(장 기능저하), 실선=SBS-IF(장 부전). Δ는 기준선으로부터의 평균 변화를 나타낸다.
도 28은 아프라글루타이드의 3회의 매주 용량 후 시트룰린 혈장 농도(ug/mL)를 나타내는 그래프이다. 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)가 표시된다.
도 29는 아프라글루타이드의 단일 피하 5 mg 용량 후 시간(시간)의 함수로서 혈장 아프라글루타이드 농도(ng/mL)를 나타내는 그래프이다.
단장 증후군(SBS)은 광범위한 수술적 장 절제에 의해 야기되는 장애를 초래하는 흡수성 장애이다. 광범위한 장 절제 환자는 유체 및 영양소 흡수를 조절하는 위장 신경내분비 피드백에서 장애를 겪을 수 있다. 교란은 정상적으로 말단 회장 및 결장에서 L-세포에 의해 생성되는 GLP-2의 손상된 식후 분비를 포함한다. GLP-2가 부족하면 위장관 비우기 가속화, 위장관 과분비, 장 혈류 감소, 면역 및 장벽 기능 장애 및 점막 성장 장애가 발생할 수 있다. 결과적으로 장 적응의 부족은 빈번한 설사 또는 소공 비우기, 영양실조, 탈수, 전해질 불균형 및 체중 감소를 포함하는 SBS의 병태생리학적 특징에 기여한다. SBS는 또한 상당한 이환율 및 사망률, 그리고 손상된 삶의 질과 관련이 있다. SBS 및 장 부전(SBS-IF) 환자에서, 정맥 내 유체 및/또는 비경구 영양의 임의의 조합을 포함하는 비경구 지원(PS)은 건강 및/또는 성장을 유지하는 데 필요하다.
장기 PS 제공은 카테터 관련 혈류 감염(CRBSI) 및 장 부전 관련 간 질환(IFALD)과 같은 심각한 합병증을 초래할 수 있다. SBS-IF 환자와 달리 SBS 장 기능부전(SBS-II) 환자는 과식증, 대사 조정 및/또는 약물 치료로 흡수 장애를 보상할 수 있는 능력 때문에 PS 없이 지낸다. 그러나 SBS-II 환자는 유체 및 전해질 불균형의 위험이 있어 PS 투여를 위해 반복적으로 병원에 입원해야 할 수 있다. 종합적으로, SBS 환자는 손상된 삶의 질, 상당한 이환율 및 사망률을 가지며, 건강 관리비가 비싸다. 전 세계적으로 SBS-IF는 치료 가능성이 제한된 방치된 장기 부전이다. 따라서 새로운 치료법을 확인하면 질병 인식, 이환율 및 사망률을 개선하고 쇠약 증상을 완화하며 환자 치료 부담을 줄일 수 있다.
외과적 절제 후, 잔여 장은 이의 흡수 용량을 증가시키기 위해 구조적 및 기능적 변화(일반적으로 장 적응으로 지칭됨)를 겪을 수 있다. 위장관 전체에 걸친 신경내분비 펩티드의 분비는 이러한 적응에 기여한다. SBS의 병리생리학적 특성은 종종 신경내분비 피드백 기전 방해 및 장 적응의 결여에 의해 유발된다. 이는 말단 회장 및 근위 결장에 주로 위치한 장 L-세포에 의해 생성되는 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2)의 식후 분비 손상을 포함한다.
천연 GLP-2는 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP4)에 의한 절단으로 인해 짧은 순환 반감기를 갖는다. 아프라글루타이드는 인간 GLP-2 및 다른 GLP-2 유사체와 비교하여 적어도 30시간까지 오래 지속되는 일정한 노출 및 증가된 반감기를 제공하도록 설계된 분자 구조를 갖는 차세대 합성 제조된 GLP-2 유사체이다. 아프라글루타이드는 인간 GLP-2와 4개의 아미노산 치환만큰 상이하고, [Gly2 ] hGLP-2 (1-33)의 위치 11 및 16에서 친유성 아미노산 치환의 화학 구조-활성 관계 연구를 통해 확인되었다. 동물 모델에서 아프라글루타이드는 장의 길이와 중량, 융모 높이 및 선와 깊이의 증가를 촉진했다. 동물에서의 약동학적(PK) 및 약력학적 연구는, 아프라글루타이드가 다른 GLP-2 유사체와 비교하여 낮은 제거율, 긴 제거 반감기 및 높은 혈장 단백질 결합을 가질 수 있음을 시사하였다. 따라서, 아프라글루타이드는 주 1회 투약 요법에 대한 후보일 수 있다. 아프라글루타이드 치료는 잠재적으로 환자가 장 자율성을 회복하거나 PS 요구량을 줄이고, 흡수 장애 증상을 개선하고, II 및 IF에 이차적인 장기 부전을 완화하고, SBS-II 환자가 간헐적 또는 만성 IF 상황으로 악화되는 것을 예방하는 데 도움이 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 둘 모두를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산은 L-아미노산이다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대조군"은 단독으로 또는 양 또는 수준과 관련하여 사용될 때 대조군 대상체 또는 대상체 집단(이력적으로 관찰된 수준 포함)에서 관찰된 수준인, 치료제(예를 들어, GLP-2 작용제의 유효 용량) 투여 전에 대상체에서 관찰된 수준을 지칭할 수 있다. 대상체와 관련하여 사용될 때, "대조군"은 주어진 치료제(예를 들어, GLP-2 작용제의 유효 용량)를 받기 전의 동일한 대상체, 주어진 조건에 대한 임의의 치료를 받지 않은 유사한 대상체, 또는 주어진 치료(예를 들어, GLP-2 작용제의 유효 용량의 투여)를 포함하지 않는 치료(예를 들어, 수술, 상처 관리 및/또는 영양 지원)를 받은 유사한 대상체를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "GLP-2 작용제"는 자연 발생 GLP-2와 유사하거나 비슷한 활성을 유도하지만, 적어도 하나의 아미노산 부가, 결실, 치환, 변형 및/또는 하나 이상의 아미노산(들)의 차단기 혼입에 의해 주어진 척추동물 GLP-2에 비해 구조적으로 변경된 척추동물에서의 자연 발생 GLP-2의 유사체를 총칭한다. 이러한 작용제는 바람직하게는, 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖는 GLP-2 또는 GLP-2의 단편과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환적으로 사용되며 치료법이 요망되는 임의의 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류, 예를 들어 인간 또는 비-인간 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 비경구 지원의 필요성을 부분적으로 또는 완전히 감소시키는 치료적 개체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 치료 화합물 또는 조성물)의 임의의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순도"는 크로마토그래피 방법에 의해, 보다 구체적으로는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 방법 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 의해 결정된 순도를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 물질(예를 들어 옥시마)의 "당량"이라는 용어는 물질의 몰비, 보다 구체적으로는 1몰의 다른 물질과 반응될 물질의 몰수를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 기재된 구현예 및/또는 양태 중 임의의 하나는 본원에 기재된 임의의 다른 구현예 및/또는 양태와 조합될 수 있고, 임의의 수의 구현예 및/또는 양태가 조합될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 GLP-2 작용제는, 예를 들어, 국제 특허 출원 제W02006/1 l 7565호 및 미국 특허 제8,589,918호에 개시된 것들을 포함하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. GLP-작용제 아프라글루타이드 및 관련 화합물(예를 들어, 미국 특허 제8,589,918호 참조)은 우수한 약동학적 특성을 갖고, 본 방법에 사용하기에 바람직하다.
서열번호: 아미노산 서열
서열번호 1(GLP2) His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH
서열번호 2(아프라글루타이드) His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-D-Phe-Thr-Ile-Leu-Asp-Leu-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
바람직한 구현예에서, GLP-2 작용제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 아프라글루타이드이고, Nle는 노르류신이고 D-Phe는 D-아미노산 페닐알라닌이다.
합성
아프라글루타이드를 제조하는 방법은 당업계에 기재되어 있고, 고상 펩티드 합성 방법을 포함한다. 예를 들어, 아프라글루타이드를 포함하는 GLP-2 작용제를 제조하는 방법을 기술하는 미국 특허 제8,580,918호를 참조한다. 겨우 93%의 순도를 달성할 수 있는 이전의 아프라글루타이드 합성 방법(예를 들어, 미국 특허 제8,580,918호에 개시된 방법)과는 대조적으로, 본 개시내용은 실질적으로, 예를 들어, 95% 이상 또는 97% 이상의 순수한 아프라글루타이드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 상업적 제조 공정에서 사용되기에 충분히 높은 수율을 여전히 제공한다. 또한, 미국 특허 제8,580,918호는 아프라글루타이드의 암모늄염을 개시한다. 아프라글루타이드의 바람직한 염인 나트륨염의 합성이 본원에 개시된다.
아프라글루타이드 생산 공정은 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 전략을 사용하는 고상 펩티드 합성(SPPS)을 기반으로 한다. 아미노산 서열은 Fmoc 탈보호 및 다음 Fmoc 아미노산의 커플링의 연속적인 주기에 의해 C-말단으로부터 단계적으로 구축된다. 아프라글루타이드의 신규한 합성 방법은 하기에 기재된 다수의 개선을 갖는다. Fmoc-링크-아미드-MBHA(메틸벤즈하이드릴 아민)-수지를 사용하며, 펩티드와 수지 사이의 연결은 Knorr 링커를 통해 수행된다. Fmoc 탈보호 후, 산화 불순물의 수준을 감소시키기 위해 옥시마(에틸 [하이드록시아미노] 시아노아세테이트)를 사용하여 피페리딘/DMF(N, N 디메틸포름아미드) 세척을 수행한다. 커플링 시간을 감소시키기 위해 2개의 DIC(디이소프로필카르보디이미드) 첨가가 구현된다. 각각의 아미노산 커플링 반응 후, 미반응 아민을 드러내는 것에 기초하여 반정량적 Kaiser 테스트에 의해 완전성이 제어된다. 조립 및 마지막 Fmoc기 탈보호 후, 펩티드 수지를 IPA(이소프로판올)로 세척하고 진공 하에서 건조시킨다. 신규한 합성 공정을 사용하면, 전체 커플링 시간은 초기 조건에 비해 약 25%만큼 감소되며, 미정제 펩티드 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 순도 및 공정 수율에 영향을 미치지 않는다.
펩티드 합성의 완료 후, 수지로부터 펩티드의 절단은 실온에서 질소 하에 TFA(트리플루오로아세트산)/H2O/아니솔 혼합물로 처리하여 수행된다. 절단된 펩티드는 여과에 의해 수지로부터 분리되고, 97% 이상의 HPLC 순도를 갖는 아프라글루타이드의 나트륨염을 생성하기 위해 개선된 하류 정제 단계에서 추가로 처리된다.
아프라글루타이드 합성 공정의 개선된 버전(공정 B; 도 2a 및 2b에 도시됨)은 TFA 기반 이동상(H2O/아세토니트릴)에서 RP-HPLC(C18) 크로마토그래피에 의한 90% 이상의 순도로의 1차 정제 및 중탄산나트륨(NaHCO3)을 사용하여 분획의 pH를 조정한 후, NaHCO3 이동상(H2O/아세토니트릴)에서 RP-HPLC(C18)에 의한 97% 이상의 순도로의 2차 정제에 이어, 아세트산나트륨(NaOAc)/H2O/아세토니트릴 이동상에서 RP-HPLC(C18)에 의한 탈염/완충액 교환을 포함한다. 생성물 함유 분획을 통합하고 동결건조시켜 97% 이상의 순도를 갖는 아프라글루타이드의 나트륨염을 생성한다. 본원에 기재된 아프라글루타이드 합성 공정의 개선된 버전은 고도로 순수한 아프라글루타이드(예를 들어, 95% 이상 또는 97% 이상 순수)를 제공할 수 있으며, 이는 아프라글루타이드의 대규모 상업적 제조에 적합한 수율을 여전히 유지한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 초순수 화합물을 제조하는 방법은 전형적으로 저수율을 겪어, 상업적 제조에서 이들의 사용이 실현 불가능하게 된다. 놀랍게도, 본원에 기재된 아프라글루타이드 합성 방법은 고도로 순수한 아프라글루타이드를 제공할 뿐만 아니라 상업적 제조 상황에서 사용하기에 적합한 수율을 나타낸다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은
a) 고상 펩티드 합성(SPPS)을 수행하여 수지 상의 GLP-2 유사체 펩티드를 합성하는 단계;
b) 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 수지로부터 절단하고, 트리플루오로아세트산(TFA), 물 및 아니솔을 포함하는 용액으로 수지를 처리함으로써 합성된 GLP-2 유사체 펩티드의 측쇄를 탈보호하는 단계;
c) 분취용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 정제하는 단계;
d) 제2 분취용 RP-HPLC를 사용하여 단계 (c)로부터의 생성물을 추가로 정제하여 정제된 펩티드 용액을 생성하는 단계(및 선택적으로 탈염 및 완충액 교환이 일어나는 제3 분취용 RP-HPLC);
e) 정제된 펩티드 용액을 동결 건조시켜 정제된 펩티드 분말을 생성하는 단계; 및
f) 정제된 펩티드 분말을 아르곤 하에 포장하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 SPPS를 수행하여 수지 상의 GLP-2 유사체 펩티드를 합성하는 단계를 포함하고, 수지는 4-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지이다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 SPPS를 수행하여 수지 상의 GLP-2 유사체 펩티드를 합성하는 단계를 포함하고, SPPS는 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 수지를 세척하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 SPPS를 수행하여 수지 상의 GLP-2 유사체 펩티드를 합성하는 단계를 포함하고, SPPS는 수지를 DIC 및 옥시마를 포함하는 용액 2가지 양과 접촉시킴으로써 수행되는 커플링 단계를 포함하고, 이러한 양은 30분 간격으로 접촉된다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 절단된 펩티드 수지 혼합물로부터 미정제 펩티드를 추출하고 후속 산성화 단계를 생략하기 위해 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 물, 아세토니트릴(ACN), 및 수산화암모늄(NH4OH)을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써, 펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 0.05% TFA, 물, 및 아세토니트릴을 포함하는 용액을 용리액으로서 사용하여 RP-HPLC에 의해 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 정제하고, 물 중 0.1% (아세트산) AcOH를 사용하여 정제된 펩티드 분획의 pH를 약 pH 7.9로 조정하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 0.05 M 중탄산나트륨(NaHCO3), 물, 및 아세토니트릴을 포함하는 용액을 용리액으로서 사용하여 RP-HPLC에 의한 제2 정제로 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 1.5 mM NaOAc/H2O/ACN 용액을 이동상으로 사용하는 HPLC 정제를 수행하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (a)는
i) SPPS가 수행될 수지를 제조하는 단계;
ii) 초기 Fmoc 탈보호를 수행한 후, 제1 Fmoc-보호된 아미노산을 수지에 첨가하여 커플링 반응을 수행하여, 수지에 보호된 펩티드를 형성하는 단계;
iii) Fmoc 탈보호 반응을 수행한 후, 커플링 반응을 수행하여, 보호된 펩티드에 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산을 부가하는 단계;
iv) GLP-2 유사체 펩티드가 수지에 합성될 때까지 단계 iii을 반복하는 단계(Fmoc-보호된 및 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드는 수지에 연결되고, 펩티드는 아미노산 서열: L-히스티딜-글리실-L-아스파르틸-글리실-L-세릴-L-페닐알라닐-L-세릴-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-노르류실-D-페닐알라닐-L-트레오닐-이소류실-L-류실-L-아스파르틸-L-류실-L-류실-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-아스파르틸-L-페닐알라닐-L-이소류실-L-아스파라기닐-L트립토파닐-L-류실-L-이소류실-L-글루타미닐-L-트레오닐-L-리실-L-이소류실-L-트레오닐-아스파르트산 아미드를 포함함).
v) Fmoc 탈보호 반응을 수행하여 수지에 연결된 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 생성하는 단계; 및
vi) 수지에 연결된 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 건조시키는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (a)(i)은
(a1) 수지를 디메틸포름아미드(DMF) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하는 용액으로 N2 분위기 하에서 수지 그램당 5 mL의 용액으로 세척하는 단계;
(b1) DMF 중 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄(HBTU), DIEA 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 포함하는 용액에서 링크 아미드 링커를 수지에 커플링시키는 단계;
(c1) 단계 (b1)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계
(d1) DMF 중 아세트산 무수물(Ac2O) 및 DIEA를 포함하는 용액과 수지를 접촉시켜 환원 반응을 수행하는 단계; 및
(e1) 단계 (d1)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 수지는 메틸벤즈하이드릴아민 수지이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (a)(i)(a1) 내지 (a)(i)(e1)의 생성물은 Fmoc-링크-아미드-MBHA 수지이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c1) 및/또는 단계 (e1)은 생성물을 5 밀리리터의 DMF 대 각각의 수지 그램의 비로 3회 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (d1)과 단계 (e1) 사이에서 커플링 테스트가 수행될 수 있다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 커플링의 완료가 달성되었는지를 결정하기 위해 Kaiser 테스트가 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (a)(i)(e1)의 완료 시 생성물은 Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-TmbGly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Nle-DPhe-Thr(tBu)-Ile- Leu-Asp(OtBu)-Leu-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-링크-아미드-MBHA-수지이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, Fmoc 탈보호 반응을 수행하고, 이어서 커플링 반응을 수행하는 단계는
(a2) 수지를 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 처리하는 단계;
(b2) 수지를 DMF로 세척하는 단계;
(c2) 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및 DMF 중 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 에틸 시아노하이드록시이미노아세테이트(옥시마)를 포함하는 용액을 수지와 접촉시켜, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산을 커플링시키는 단계; 및
(d2) 단계 (c2)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액은 DMF 중 35% 피페리딘 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 수지를 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 처리하는 단계는 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 수지를 3분 세척한 후, DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 수지를 제2의 3분 세척한 후, DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 수지를 10분 세척하여 수행한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액은 DMF 중 20% 피페리딘 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 수지를 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 처리하는 것은 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 수지를 15분 세척한 후, DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 수지를 제2의 15분 세척하여 수행한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 세척은 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액 5 밀리리터 대 각각의 수지 그램의 비로 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (b2)에서 수지를 세척하는 단계는 15 밀리리터의 DMF 대 각각의 수지 그램의 비로 제1 DMF 세척을 수행한 후, 5 밀리리터의 DMF 대 각각의 수지 그램의 비로 제2 DMF 세척을 수행하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (b2)에서 수지를 세척하는 단계는
i) 수지를 DMF로 세척하는 단계; 및
ii) 수지를 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 및 옥시마를 포함하는 용액은 2 당량의 옥시마를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 잔기 Asp3의 Fmoc 탈보호 반응을 수행하는 단계는 수지를 DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액으로 처리하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액은 DMF 중 10% 피페리딘 및 2% 옥시마 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액은 DMF 중 5% 피페리딘 및 1% 옥시마 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액은 DMF 중 15% 피페리딘 및 3% 옥시마 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액은 DMF 중 20% 피페리딘 및 4% 옥시마 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액은 DMF 중 25% 피페리딘 및 5% 옥시마 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액은 DMF 중 30% 피페리딘 및 6% 옥시마 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 수지를 DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액으로 처리하는 것은 DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액으로 수지를 15분 세척한 후, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액으로 수지를 제2의 30분 세척하여 수행한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c2)는
i) 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및 DMF 중 DIC 및 옥시마를 포함하는 용액을 수지와 접촉시키는 단계; 및
ii) 수지를 제2 양의, DIC를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 수지는 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산과 접촉한 후 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50분 동안 제2 양의, DIC를 포함하는 용액과 접촉된다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 보호된 아미노산은 Boc-His(Trt)-Gly-OH를 포함하는 디-펩티드이다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 보호된 아미노산은 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH를 포함하는 디-펩티드이다.
일부 양태에서, 디펩티드를 커플링하기 전에 디펩티드는 10분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 3시간 또는 4시간 동안 예비활성화된다.
일부 양태에서, 디펩티드를 커플링하기 전에 디펩티드는 5℃ ± 2℃, 10℃ ± 2℃, 15℃ ± 2℃, 20℃ ± 2℃, 25℃ ± 2℃, 30℃ ± 2℃ 또는 35℃ ± 2℃에서 예비활성화된다.
일부 양태에서, 디펩티드는 디펩티드를 커플링하기 전에 7 mL DMF 중 Boc-His (Trt)-Gly-OH/옥시마/DIC 2.5 mmol/2.5 mmol/ 2.5 mmol를 포함하는 용액에서 예비활성화된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c2)는
i) 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및 DMF 중 DIC 및 옥시마를 포함하는 용액을 수지와 접촉시키는 단계; 및
ii) 수지를 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액은 수지를 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산과 접촉시킨 후 약 30분 후에 수지와 접촉된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c2)에서, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산은 1, 2, 3, 4 또는 5 당량의 농도로 제공된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c2)에서, DIC는 1, 2, 3, 4 또는 5 당량의 농도로 제공되고 옥시마는 1, 2, 3, 4 또는 5 당량의 농도로 제공된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c2)에서, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산은 Fmoc-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-OH이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c2)에서, Fmoc-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-OH는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 당량의 농도로 제공된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 방법은 단계 (b2) 및 단계 (c2) 사이에 피페리딘의 양을 측정함으로써 잔류 피페리딘에 대한 테스트를 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 측정된 피페리딘의 양이 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 ppm 초과인 경우, 수지는 DMF 및/또는 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 다시 세척된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c)와 단계 (d) 사이에서 커플링 테스트가 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 커플링 테스트는 닌하이드린 분석법이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 a(v)는
(a3) 수지를 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 처리하는 단계;
(b3) 수지를 DMF로 세척하는 단계;
(c3) 수지를 이소프로판올로 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (b3)에서 수지를 세척하는 단계는
i) 수지를 DMF로 세척하는 단계; 및
ii) 수지를 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c3)에서 수지를 이소프로판올로 세척하는 단계는 수지를 이소프로판올로 5회 세척하는 단계를 포함하고, 각각의 세척은 각각의 수지 그램에 대한 5 밀리리터의 이소프로판올의 비로 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (a)(v)의 완료 시 생성물은 H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-TmbGly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Nle-DPhe-Thr(tBu)-Ile-Leu- Asp(OtBu)-Leu-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-링크-아미드-MBHA-수지를 포함하는, 수지 상 보호된 펩티드이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, TFA, 물 및 아니솔을 포함하는 용액은 TFA, 물 및 아니솔을 95:2.5:2.5의 TFA:물:아니솔의 비로 포함하는 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, TFA, 물 및 아니솔을 포함하는 용액은 TFA, 물 및 아니솔을 90:5:5의 TFA:물:아니솔의 비로 포함하는 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, TFA, 물 및 아니솔을 포함하는 용액은 TFA, 물 및 아니솔을 80:10:10의 TFA:물:아니솔의 비로 포함하는 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, TFA, 물 및 아니솔을 포함하는 용액은 TFA, 물 및 아니솔을 70:15:15의 TFA:물:아니솔의 비로 포함하는 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (b)는 tert-부틸 메틸 에테르(MTBE)를 사용하여 절단된 및 탈보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 침전 및 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (b)의 완료 시 생성물은 H-His-Gly-Asp-Gly-Ser5-Phe-Ser-Asp-Glu-NLe10-DPhe-Thr-Ile-Leu-Asp15-Leu-Leu-Ala-Ala-Arg20-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp25-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys30-Ile-Thr-Asp-NH2이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c)는
(i) 단계 (b)의 생성물을 물, 아세토니트릴 및 NH4OH를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
(ii) 분취용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, (i) 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 암모니아 완충액 중 80:20 비의 H2O/ACN의 혼합물을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 암모니아 완충액 중 70:30 비의 H2O/ACN의 혼합물을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 암모니아 완충액 중 90:10 비, 80:20 비, 70:30 비, 60:40 비, 50:50 비, 또는 40:60 비의 H2O/ACN의 혼합물을 포함한다.
일부 양태에서, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 pH 7, pH 8, pH 9, pH 10, 또는 pH 11을 목표로 하도록 조정된다.
일부 양태에서, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 pH 7 이상을 목표로 하도록 조정된다.
일부 양태에서, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 pH 8.0 ± 0.1을 목표로 하도록 조정된다.
일부 양태에서, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 pH 8.0 ± 0.1, ± 0.2, ± 0.3, ± 0.4, ± 0.5, ± 0.6, ± 0.7, ± 0.8, 또는 ± 0.9를 목표로 조정된다.
일부 양태에서, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 단계 (c)(i)의 용액은 약 pH 10까지 조정된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, pH는 25% 아세트산을 사용하여 조정된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, pH는 H2O 중 25% NH4OH를 사용하여 조정된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 0℃, 10℃, 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 50℃에서 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 실온℃에서 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 본원에 개시된 온도에서 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 90분, 100분, 110분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 10시간, 20시간, 24시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60시간 또는 72시간 동안 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 본원에 개시된 온도에서 65분 동안 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 본원에 개시된 온도에서 24시간 동안 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 50℃에서 65분 동안 유지된다.
일부 양태에서, 단계 (c)(i)의 용액은 실온℃에서 24시간 동안 유지된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, RP-HPLC는 C18 컬럼을 사용하여 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, RP-HPLC는 NaHCO3, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액을 용리액으로서 사용하여 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, NaHCO3, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액은 0.01M, 0.05M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 또는 0.5M NaHCO3을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, RP-HPLC는 TFA, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액을 용리액으로서 사용하여 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, TFA, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5% TFA를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, RP-HPLC는 정제된 펩티드 분획의 pH를 조정하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (d)에서, 합성된 GLP-2 유사체 펩티드는 이의 나트륨 양이온 형태로 전환된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (d)는 물 중 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1% 또는 2% AcOH를 사용하여 정제된 펩티드 용액의 pH를 약 pH 7.9까지 조정하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (d)는 물 중 0.1% AcOH를 사용하여 정제된 펩티드 용액의 pH를 약 pH 7.9까지 조정하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 단계 (c)로부터의 생성물은 HPLC를 사용하여 정제되어, 추가의 정제된 펩티드 용액을 생성한다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, HPLC는 AcOH, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액을 사용하여 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, AcOH, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% AcOH 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, HPLC는 아세트산나트륨(NaOAc), 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액을 사용하여 수행된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, NaOAc, 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액은 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM 또는 3 mM NaOAc 용액이다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, HPLC 정제 후, 추가의 정제된 펩티드 용액의 pH는 물 중 0.1% AcOH를 사용하여 약 pH 7.9까지 조정된다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, HPLC 정제 후, 추가로 정제된 펩티드 용액의 pH는 물 중 0.1% AcOH를 사용하여 약 pH 5, 약 pH 6, 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 7.9, 약 pH 8, 약 pH 8.5 또는 약 pH 9까지 조정된다.
일부 양태에서, 표 1에 제시된 출발 물질은 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 표 1에 제시된 출발 물질은 표 1의 "순도"컬럼에 제시된 순도를 가질 수 있다:
[표 1]
Figure pct00002
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 아프라글루타이드는 95% 이하의 순도를 갖는다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 아프라글루타이드는 97% 이하의 순도를 갖는다.
일부 양태에서, Des-Gly4 아프라글루타이드, 아스파르티미드3, Asp33-OH, Des-Ser7 아프라글루타이드, 및 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)]의 농도 및/또는 존재는 RP-HPLC를 사용하여 결정할 수 있다. 표 2a는 상기 기재된 합성의 2개의 변이체에서의 순도 및 주요 불순물을 나타낸다. 표 2b는 본원에 기재된 아프라글루타이드 합성 공정의 3개의 변이체에서의 순도 및 수율을 나타낸다.
[표 2a]
Figure pct00003
[표 2b]
Figure pct00004
일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 초과 농도의 어떠한 비특정 불순물도 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 1% 초과 농도의 어떠한 비특정 불순물도 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 3% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7-GLP-2의 합계를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 2% 초과 농도의 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7-GLP-2의 합계를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 정제된 펩티드 풀은 2% 초과 농도의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, RP-HPLC에 의해 측정된 GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염의 순도는 95%, 97% 또는 99% 초과이다. 일부 구현예에서, RP-HPLC에 의해 측정된 정제된 펩티드 풀의 순도는 95% 초과이다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염의 순도는 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 초과 농도의 어떠한 비특정 불순물도 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 1% 초과 농도의 어떠한 비특정 불순물도 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 3% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7-GLP-2의 합계를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 2% 초과 농도의 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7-GLP-2의 합계를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 나트륨염은 2% 초과 농도의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 방법은 펩티드의 나트륨염 형태로의 전환 후 공정 중 제어를 추가로 포함할 수 있으며, 공정 중 제어는 RP-HPLC에 의해 수행되고, 허용 기준은 펩티드가 95.0% 이상의 순도를 갖고 다음의 불순물 이하인 것이다: Des-Gly4 아프라글루타이드는 3.0% 이하, 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7 아프라글루타이드의 합계는 2.0% 이하, [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드는 2.0% 이하이고, 임의의 기타 비특정 불순물은 1.0% 이하이다.
이론에 구속됨을 바라지 않고, 일부 구현예에서, Fmoc 탈보호 및 커플링 주기 동안 Fmoc-Gln(Trt)-Thr(ψMe,MePro)-OH 및 Fmoc-Tmb-Gly-OH의 사용은 커플링 효율을 개선하고 아스파르티미드 형성을 감소시킨다.
이론에 구속됨을 바라지 않고, 일부 구현예에서, Fmoc 탈보호 및 커플링 주기 동안 커플링 첨가제로서 옥시마를 사용하면 산화 및 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체 불순물의 형성이 최소화된다.
이론에 구속됨을 바라지 않고, 일부 구현예에서, 분취용 RP-HPLC에 의한 나트륨염 전환 동안 이동상 조성물에 대한 ACN의 사용은 GLP-2 유사체 펩티드 조성물 나트륨염 전환을 개선한다. 일부 구현예에서, 그리고 분취용 RP-HPLC에 의한 나트륨염 전환 동안 적정 단계의 제거는 GLP-2 유사체 펩티드 조성물 나트륨염 전환을 개선한다. 일부 구현예에서, 그리고 분취용 RP-HPLC에 의한 나트륨염 전환 동안 pH 조정의 도입은 GLP-2 유사체 펩티드 조성물 나트륨염 전환을 개선한다.
Des-Gly4 GLP-2 유사체 불순물은 펩티드에서 Gly4 누락을 포함한다. 아스파르티미드3 GLP-2 유사체 불순물은 Asp3 커플링 동안 아스파르티미드 형성을 포함한다. Asp33-OH GLP-2 유사체 불순물은 펩티드의 C-말단 아미드 가수분해를 포함한다. Des-Ser7 GLP-2 유사체 불순물은 펩티드에서 Ser7 누락을 포함한다. [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체 불순물은 절단 과정 동안 Fmoc-Gly(Tmb)-OH 형성을 포함한다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 또는 4% 초과 농도의 임의의 개별 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1.5% 초과 농도의 임의의 개별 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 3% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 β-Asp3 GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1.5% 초과 농도의 β-Asp3 GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1% 초과 농도의 β-Asp3 GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 D-His GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1.5% 초과의 농도로 D-His GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1% 초과 농도의 D-His GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7-GLP-2의 합계를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 2% 초과 농도의 아스파르티미드3, Asp33-OH 및 Des-Ser7-GLP-2의 합계를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 2% 초과 농도의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드는 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체, 아스파르티미드3 GLP-2 유사체, Asp33-OH GLP-2 유사체, Des-Ser7 GLP-2 유사체, 또는 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드는 0.5% 초과 농도의 Des-Gly4 GLP-2 유사체 펩티드, 아스파르티미드3 GLP-2 유사체 펩티드, Asp33-OH GLP-2 유사체 펩티드, Des-Ser7 GLP-2 유사체 펩티드, 또는 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1%, 3%, 5% 또는 7% 초과 농도의 불순물의 총량을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 또는 5% 초과 농도의 불순물의 총량을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 초과 농도의 아세트산염을 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 5% 초과 농도의 아세트산염을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.01%, 0.03%, 0.05%, 0.07%, 0.1%, 0.2%, 0.5% 또는 1% 초과 농도의 트리플루오로아세트산을 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.1% 초과 농도의 트리플루오로아세트산을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 5,000, 4,000, 3,000, 2,000, 1,000, 500, 400, 300, 200, 또는 100 ppm 미만의 아세토니트릴을 포함하는 불순물을 함유한다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 450 ppm 미만의 아세토니트릴을 함유한다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 EU/mg 초과 농도의 박테리아 내독소를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 5.0 EU/mg 초과 농도의 박테리아 내독소를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 1, 10, 50, 100, 150, 또는 200 CFU/0.1g 초과 농도의 호기성 미생물을 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 100 CFU/0.1 g 초과 농도의 호기성 미생물을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 0.1, 1, 5, 10, 15, 또는 20 CFU/0.1 g 초과의 조합 농도의 효모 및 곰팡이를 포함하는 불순물을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 10 CFU/0.1 g 초과의 조합 농도의 효모 및 곰팡이를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 아세트산염, 트리플루오로아세트산, 아세토니트릴, 박테리아 내독소, 호기성 미생물, 효모, 곰팡이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 불순물을 함유하지 않는다.
합성 후, 아프라글루타이드 활성 제약 성분("API") 을 동결건조시키고, 그 후 약물 제품으로 제형화한다.
제형
본 개시내용의 GLP-2 작용제는 단독으로 약제로서 또는 활성 성분(들)으로서 하나 이상의 GLP-2 작용제 및 제약상 허용 가능한 보조제, 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물에 사용될 수 있다. 제약 조성물은 또한 다른 활성 성분을 포함할 수 있다.
적합한 제약상 허용 가능한 담체는, 전형적으로 펩티드계 약물과 함께 사용되는 것들을 포함한다. 예를 들어, 약물 제형에 대한 일반적인 지침에 대해서는 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 22nd ed., Pharmaceutical Press, Philadelphia, PA, 2012를 참조한다. 적합한 부형제의 비제한적인 예는 글리신, L-히스티딘, 만니톨 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
바람직한 제형은 완충제로서 글리신을 사용한다. L-히스티딘은 물리적 안정화제로서 이 제형에서 사용된다. L-히스티딘은 또한 표적 pH를 유지하는 완충액으로서의 역할을 한다. 만니톨은 이러한 제형에서 동결건조 공정 단계에서 벌킹제로서 사용된다. 주사용 물은 이러한 제형의 용매이고; 주사용 물은 동결건조 단계 동안 제거된다. pH 조정을 위해 수산화나트륨을 사용한다. pH는 측정되고 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 8.30 ± 0.10까지 조정될 수 있다.
본 개시내용은 약물 제품의 제조를 위한 강력하고 재현 가능한 동결건조 주기를 제공한다. 임상 배치의 제조에 사용되도록 의도된 동일한 용기 마개를 사용하여, 2개의 축소된 개발 배치가 충전되었다. 동결건조 주기는 약물 제품의 임상 제조에서 구현될 공정을 정의하기 위해 1차 건조(1차 건조 주기)에 최적화되었다. 최적화된 동결건조 주기는 예상된 품질 속성(즉, 분석법, 순도 및 불순물 수준, 재구성 시간 및 수분 함량)을 갖는 약물 제품을 초래하였고, 약물 제품의 임상 배치에 적절한 것으로 간주되었다. 제2 축소된 개발 배치에 대해 수행된 안정성 연구는 약물 제품이 최대 3개월 동안 의도된 저장 온도(2 내지 8℃)에서 변하지 않은 채로 유지되었음을 입증하였다.
일부 양태에서, 표 3에 제시된 주사 및 재구성된 용액에 대한 아프라글루타이드의 조성물은 본 개시내용의 방법을 사용하여 제조될 수 있는 예시적인 조성물이다.
[표 3]
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일부 구현예에서, 아프라글루타이드 조성물은 글리신, L-히스티딘, 만니톨, 주사용 물(WFI), 주사용 멸균수(sWFI), 수산화나트륨, 수크로스, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 부형제를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 물에 용해된 본 개시내용의 아프라글루타이드, 글리신, L-히스티딘 및 만니톨을 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 아프라글루타이드의 농도는 25 mg/mL이고, 글리신의 농도는 3.75 mg/mL이고, L-히스티딘의 농도는 7.75 mg/mL의 물이고, 만니톨의 농도는 115.0 mg/mL이다. 일부 양태에서, 물의 부피는 0.5 mL일 수 있다. 일부 양태에서, 선행하는 제약 조성물은 용액의 pH가 약 pH 8.3이 되도록 하는 양으로 수산화나트륨을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 삼투질농도는 290 내지 780 mOsmol/㎏이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 삼투질농도는 약 780 mOsmol/㎏이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 삼투질농도는 약 780 ± 160 mOsmol/㎏이다.
주사용 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 주사 용액에 대한 무균 제조된 동결건조된 분말일 수 있다. 이는 동결건조 멸균 제품에 적합한 무색 유리 바이알에 담아 고무 스토퍼로 밀봉하고 알루미늄 캡으로 밀봉하여 제시될 수 있다. 투여 전에, 주사용 GLP-2 유사체 펩티드는 0.5 mL의 멸균 주사용수(sWFI)에 용해될 수 있다. 재구성된 용액은 피하 투여될 수 있다.
투여
일부 구현예에서, GLP-2 작용제, 예를 들어, 아프라글루타이드는 비경구적으로, 예를 들어 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여에 적합한 제형은 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액을 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형을 의도된 수혜자의 혈액과 등장성으로 만들기 위한 용질과, 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 주사 가능한 용액에 대한 액체 담체는 예로서 그리고 제한 없이 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 글리콜을 포함한다.
일부 양태에서, 아프라글루타이드는 2개의 챔버 주사기 또는 이중 카트리지 주입기를 통해 전달된다. 이러한 주사기의 한 예는 PCT/EP2012/000787호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
투약
유효 용량을 구성하는 양은 환자의 질환 및 임상 상태(예를 들어, 체중) 및 투여 경로와 같은 다양한 인자에 의존할 수 있다. 용량은 예를 들어 1일 2회, 1일 1회, 1주 2회, 매주, 격주, 월 1회 또는 2회 등의 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 일반적으로 약 1주 내지 약 100주의 기간 동안 주당 약 1 mg 내지 약 10 mg의 범위이다. 일부 구현예에서, 매주 용량은 약 1 mg 내지 10 mg이다. 일부 구현예에서, 대상체는 약 1주 내지 약 100주, 약 1주 내지 약 80주, 약 1주 내지 약 60주, 약 1주 내지 약 48주, 약 2주 내지 약 24주, 약 2주 내지 약 20주, 또는 약 2주 내지 약 16주의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 약 1주 1회 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 약 2주에 약 1회 또는 약 월 2회 용량으로 투여된다. 약 2주에 1회 또는 약 월 2회.
아프라글루타이드는 용량 의존적 방식으로 시트룰린 수준을 증가시킨다. 시트룰린은 소장 장세포 질량의 마커이다. 1 mg, 5 mg 및 10 mg의 아프라글루타이드의 투약은 환자에서 시트룰린 농도의 오래 지속되는 증가를 유도한다.
일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 비경구(예를 들어, 피하, 정맥 내, 근육 내 또는 경구) 투여된다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 정맥 내 투여된다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 피하 투여된다.
체중이 감소함에 따라 노출(AUC 및 Cmax)이 비선형적으로 증가하기 때문에, 높은 노출을 방지하기 위해 체중 50 ㎏ 미만인 환자는 2.5 mg의 용량이 요망된다. 50 ㎏ 이상의 환자는 5 mg 또는 더 높은 용량을 받을 수 있다.
표시
일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받았던 대상체는 대조군에 비해 더 적은 영양 지원을 필요로 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받았던 대상체는 대조군에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 더 적은 영양 지원을 필요로 한다. 일 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받았던 대상체는 대조군(즉, 장관 자율성)에 비해 100% 더 적은 영양 지원을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받았던 대상체는 대조군에 비해 더 적은 날 동안 총 비경구 지원을 필요로 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제의 투여는 대조군에 비해 총 비경구 지원이 필요한 시간의 길이를 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 감소시킬 수 있다. 일 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제의 투여는 대조군(즉, 장관 자율성)에 비해 총 비경구 지원이 필요한 시간의 길이를 100% 감소시킨다. 일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받은 대상체는 연간 85일 미만, 연간 80일 미만, 연간 75일 미만, 연간 70일 미만, 연간 65일 미만, 연간 60일 미만, 연간 55일 미만, 연간 50일 미만, 연간 45일 미만, 연간 40일 미만, 연간 35일 미만, 연간 30일 미만, 연간 25일 미만, 연간 20일 미만, 연간 15일 미만, 연간 10일 미만, 또는 연간 5일 미만 동안 총 비경구 지원을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받은 대상체는 치료 후 총 비경구 영양을 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 아프라글루타이드를 받은 환자는 다음 중 하나에 해당하는 소장의 외과적 절제에 대해 이차적으로 비경구 지원을 받는 단장 증후군 관련 장 부전("SBS-IF")을 앓는 남성 및 여성 대상체를 포함한다:
a. 스크리닝 전 적어도 12개월 전의 가장 최근의 장 절제와 함께, 연속성 결장("CIC")이 남아 있고 소공 없음(소장은 이용 가능한 의료/수술 기록을 기준으로 십이지장-공장 굴곡부로부터 200 cm 미만) 또는
b. 스크리닝 전 적어도 6개월 전의 가장 최근의 장 절제와 함께, 공장조루술 또는 회장루 형성술(이용 가능한 의료/수술 기록을 기준으로 십이지장-공장 굴곡부로부터 200 cm 미만).
일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제의 투여는 대조군에 비해 입원 기간을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제의 투여는 대조군에 비해 입원 기간을 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제를 투여받은 대상체는 50일 미만, 45일 미만, 40일 미만, 35일 미만, 30일 미만, 25일 미만, 20일 미만, 15일 미만, 10일 미만, 또는 5일 미만 동안 입원한다.
일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제의 대상체 집단에 대한 투여는 유효 용량의 GLP-2 작용제의 투여를 포함하지 않는 표준 치료(예를 들어, 수술 치료, 영양 지원 및 상처 관리)를 받는 대상체 집단과 비교하여 사망률을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사망률은 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 8% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만으로 감소된다. SC 주사는 전형적으로 복부 영역 또는 대퇴로 투여될 것이다. 주사 부위는 마지막 주사가 투여된 곳에서 적어도 5 cm 떨어져 주사가 투여되도록 교대되어야 한다.
아프라글루타이드는 1주 1회 투약의 24주 후에 CIC 또는 소공이 있는 SBS-IF 대상체에서 임상 효능(PS 부피의 감소)을 입증할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 일 구현예에서, 단일 2.5 mg 용량(가장 최근의 시험 방문에서 50 ㎏ 미만의 체중의 대상체의 경우) 또는 5 mg 용량(가장 최근의 시험 방문에서 체중 50 ㎏ 이상의 대상체의 경우)의 프라글루타이드 또는 위약이 24주(소공) 또는 48주(CIC)의 치료 기간 동안 주 1회 피하("SC") 주사에 의해 투여될 것이다.
아프라글루타이드는 다른 GLP-2 유사체와 비교하여 덜 빈번한 투약(즉, 주 1회)에 의해 에너지 흡수에 대한 우수한 효과를 입증하였다. 주 1회 5 mg을 투여했을 때, 아프라글루타이드는 소변 유입량의 기준선 증가로부터 140.1%(+ 15.8)의 변화, 760.4 g/일(+ 236.1)의 습윤 중량 흡수의 기준선의 변화, 1,074 kj/일(+ 377)의 에너지 흡수의 기준선의 변화를 초래하였다.
아프라글루타이드는 표 9에 제시된 바와 같이 위약에 비해 711 mL/일(95% CI 132~1,289; P=.021)의 조정된 평균만큼 절대 소변 배출량의 증가를 촉진했는데, 이는 일일 48%(95% CI 12~84; P=.014) 증가에 해당한다. 아프라글루타이드는 표 10에 제시된 바와 같이 714 mL/일(95% CI 490~939; P=.002)의 조정된 평균만큼 절대 소변 배출량의 증가를 촉진했는데, 이는 일일 49%(95% CI 4~94; P=.041) 증가에 해당한다. 10 mg 아프라글루타이드 치료는 위약에 비해 795 mL/일(95% CI 195~1,394; P=.014)의 조정된 평균만큼 절대 소변 배출량의 증가를 촉진했다. 이에 상응하는 상대 소변 생산량의 변화는 34%(95% CI -4~71; P=.072)였다.
아프라글루타이드는 표 9에 제시된 바와 같이 위약에 비해 56 mmol/일(95% CI -10~123; P=.087)의 조정된 평균만큼 소변 나트륨 배설을 증가시켰다. 5 mg 아프라글루타이드는 표 10에 제시된 바와 같이 위약에 비해 66 mmol/일(95% CI -69~201; P=.171)의 조정된 평균만큼 소변 나트륨 배설을 증가시켰다. 10 mg 용량군에서, 절대 소변 나트륨 배설은 표 9에 제시된 바와 같이 위약에 비해 88 mmol/일(95% CI 20~156; P=.017)의 조정된 평균만큼 증가되었다.
아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 에너지의 장 흡수를 1,095 kJ/일(95% CI 196~1,994; P=.024)만큼 증가시켰다.
대조적으로, 1일 1회 투여된 테두글루타이드는 문헌[Jeppesen, Gut, 54, pp. 1224-1231 (2005)]에 보고된 바와 같이, 소변 유입량의 기준선 증가로부터 139.3%의 변화, 743 g/일(+ 119.25)의 습윤 중량 흡수의 기준선의 변화, 792 kj/일(+ 570)의 에너지 흡수의 기준선의 변화를 초래하였다.
유사하게, 대조적으로, 1일 1회 투여된 글레파글루티드는 문헌[Maimi, Lancet Gastroenterol Hepatol, 4, pp. 354-363 (2019)]에 보고된 바와 같이, 소변 배출의 기준선 증가로부터 111%(0.1 mg 용량), 140%(1.0 mg 용량) 또는 132%(10 mg 용량)의 변화, -211 g/일(0.1 mg 용량), 650 g/일(1.0 mg 용량) 또는 786 g/일(10 mg 용량)의 습윤 중량 흡수의 기준선의 변화 및 -377 kj/일(0.1 mg 용량), 435 kj/일(1.0 mg 용량) 또는 588 kj/일(10 mg 용량)의 에너지 흡수의 기준선의 변화를 초래하였다.
조사 중인 IMP 이외의 천연 GLP-2, GLP-1 또는 GLP-2, GLP-1 유사체와 같은 성장 호르몬, 글루타민 또는 성장 인자의 임의의 사용은 아프라글루타이드 투여 전 12개월(CIC 대상체) 및 6개월(소공 대상체) 동안 중단되어야 한다.
일부 구현예에서, 유효 용량의 GLP-2 작용제의 대상체 집단에 대한 투여는 유효 용량의 GLP-2 작용제의 투여를 포함하지 않는 표준 치료(예를 들어, 수술 치료, 영양 지원 및 상처 관리)를 받는 대상체 집단과 비교하여 이환율을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이환율은 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만으로 감소된다.
일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 수술후 장관 자율성 회복에 사용되거나, 또는 장피 누공의 치료를 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 아프라글루타이드는 문합부 누출, 기능적 장 부전, 장 기능저하, 괴사성 장염, 이식편 대 숙주질환, 크론병 또는 복강병의 치료에 사용된다.
본 개시내용은 대상체에서 단장 증후군을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 대상체에서 단장 증후군의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
본 개시내용은 대상체에서 단장 증후군을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 습윤 중량의 장 흡수를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 습윤 중량의 장 흡수를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 습윤 중량의 장 흡수를 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 습윤 중량의 장 흡수의 증가는 적어도 약 100 g/일, 또는 적어도 약 200 g/일, 또는 적어도 약 300 g/일, 또는 적어도 약 400 g/일, 또는 적어도 약 500 g/일, 또는 적어도 약 600 g/일, 또는 적어도 약 700 g/일, 또는 적어도 약 800 g/일, 또는 적어도 약 900 g/일, 또는 적어도 약 1000 g/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 대변 배출을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소공 배출을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 대변 배출을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 대변 배출을 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 대변 배출의 감소는 적어도 약 100 g/일, 또는 적어도 약 200 g/일, 또는 적어도 약 300 g/일, 또는 적어도 약 400 g/일, 또는 적어도 약 500 g/일, 또는 적어도 약 600 g/일, 또는 적어도 약 700 g/일, 또는 적어도 약 800 g/일, 또는 적어도 약 900 g/일, 또는 적어도 약 1000 g/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 생산을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 생산을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 생산을 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 소변 생산의 증가는 적어도 약 100 g/일, 또는 적어도 약 200 g/일, 또는 적어도 약 300 g/일, 또는 적어도 약 400 g/일, 또는 적어도 약 500 g/일, 또는 적어도 약 600 g/일, 또는 적어도 약 700 g/일, 또는 적어도 약 800 g/일, 또는 적어도 약 900 g/일, 또는 적어도 약 1000 g/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 나트륨 및/또는 칼륨의 흡수를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 나트륨 및/또는 칼륨의 흡수를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 나트륨 및/또는 칼륨의 흡수를 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 나트륨 및/또는 칼륨의 흡수의 증가는 적어도 약 5 mmol/일, 또는 적어도 약 10 mmol/일, 또는 적어도 약 15 mmol/일, 또는 적어도 약 20 mmol/일, 또는 적어도 약 25 mmol/일, 또는 적어도 약 30 mmol/일, 또는 적어도 약 35 mmol/일, 또는 적어도 약 40 mmol/일, 또는 적어도 약 45 mmol/일, 또는 적어도 약 50 mmol/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 나트륨 및/또는 칼륨 배설을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 나트륨 및/또는 칼륨 배설을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 나트륨 및/또는 칼륨 배설을 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 소변 나트륨 및/또는 칼륨 배설의 증가는 적어도 약 5 mmol/일, 또는 적어도 약 10 mmol/일, 또는 적어도 약 15 mmol/일, 또는 적어도 약 20 mmol/일, 또는 적어도 약 25 mmol/일, 또는 적어도 약 30 mmol/일, 또는 적어도 약 35 mmol/일, 또는 적어도 약 40 mmol/일, 또는 적어도 약 45 mmol/일, 또는 적어도 약 50 mmol/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 에너지의 장 흡수를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 에너지의 장 흡수를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 에너지의 장 흡수를 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 에너지의 장 흡수 증가는 적어도 약 500 kJ/일, 또는 적어도 약 600 kJ/일, 또는 적어도 약 700 kJ/일, 또는 적어도 약 800 kJ/일, 또는 적어도 약 900 kJ/일, 또는 적어도 약 1000 kJ/일, 또는 적어도 약 1100 kJ/일 또는 적어도 약 1200 kJ/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 대변 배출의 에너지 함량을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 대변 배출의 에너지 함량을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 대변 배출의 에너지 함량을 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 대변 배출의 에너지 함량의 감소는 적어도 약 500 kJ/일, 또는 적어도 약 600 kJ/일, 또는 적어도 약 700 kJ/일, 또는 적어도 약 800 kJ/일, 또는 적어도 약 900 kJ/일, 또는 적어도 약 1000 kJ/일, 또는 적어도 약 1100 kJ/일 또는 적어도 약 1200 kJ/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 탄수화물 및/또는 지질 흡수를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 탄수화물 및/또는 지질 흡수를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 탄수화물 및/또는 지질 흡수를 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 탄수화물 및/또는 지질 흡수의 증가는 적어도 약 100 kJ/일, 또는 적어도 약 200 kJ/일, 또는 적어도 약 300 kJ/일, 또는 적어도 약 400 kJ/일, 또는 적어도 약 500 kJ/일, 또는 적어도 약 600 kJ/일, 또는 적어도 약 700 kJ/일, 또는 적어도 약 800 kJ/일, 또는 적어도 약 900 kJ/일, 또는 적어도 약 1000 kJ/일, 또는 적어도 약 1100 kJ/일 또는 적어도 약 1200 kJ/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 단백질 흡수를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 단백질 흡수를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 단백질 흡수를 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 단백질 흡수의 증가는 적어도 약 100 kJ/일, 또는 적어도 약 200 kJ/일, 또는 적어도 약 300 kJ/일, 또는 적어도 약 400 kJ/일, 또는 적어도 약 500 kJ/일, 또는 적어도 약 600 kJ/일, 또는 적어도 약 700 kJ/일, 또는 적어도 약 800 kJ/일, 또는 적어도 약 900 kJ/일, 또는 적어도 약 1000 kJ/일, 또는 적어도 약 1100 kJ/일 또는 적어도 약 1200 kJ/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 체중을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 체중을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 체중을 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 체중의 증가는 적어도 약 0.5 ㎏, 또는 적어도 약 1.0 ㎏, 또는 적어도 약 1.5 ㎏, 또는 적어도 약 2.0 ㎏, 또는 적어도 약 2.5 ㎏, 또는 적어도 약 3.0 ㎏, 또는 적어도 약 3.5 ㎏, 또는 적어도 약 4.0 ㎏, 또는 적어도 약 4.5 ㎏, 또는 적어도 약 5.0 ㎏일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 탈지방 체중을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 탈지방 체중을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 탈지방 체중을 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 탈지방 체중의 증가는 적어도 약 0.5 ㎏, 또는 적어도 약 1.0 ㎏, 또는 적어도 약 1.5 ㎏, 또는 적어도 약 2.0 ㎏, 또는 적어도 약 2.5 ㎏, 또는 적어도 약 3.0 ㎏, 또는 적어도 약 3.5 ㎏, 또는 적어도 약 4.0 ㎏, 또는 적어도 약 4.5 ㎏, 또는 적어도 약 5.0 ㎏일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 지방량을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 지방량을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 지방량을 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 지방량의 감소는 적어도 약 0.5 ㎏, 또는 적어도 약 1.0 ㎏, 또는 적어도 약 1.5 ㎏, 또는 적어도 약 2.0 ㎏, 또는 적어도 약 2.5 ㎏, 또는 적어도 약 3.0 ㎏, 또는 적어도 약 3.5 ㎏, 또는 적어도 약 4.0 ㎏, 또는 적어도 약 4.5 ㎏, 또는 적어도 약 5.0 ㎏일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 혈장 내 L-시트룰린의 농도를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 혈장 내 L-시트룰린의 농도를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 혈장 내 L-시트룰린의 농도를 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 혈장 내 L-시트룰린의 농도 증가는 적어도 약 5 μmol/L, 또는 적어도 약 10 μmol/L, 또는 적어도 약 15 μmol/L, 또는 적어도 약 20 μmol/L일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 배출량을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 배출량을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 소변 배출량을 증가시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 소변 배출량의 증가는 적어도 약 400 mL/일, 또는 적어도 약 500 mL/일, 또는 적어도 약 600 mL/일, 또는 적어도 약 700 mL/일, 또는 적어도 약 800 mL/일, 또는 적어도 약 900 mL/일, 또는 적어도 약 1000 mL/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 구강 유체 섭취를 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 구강 유체 섭취를 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 구강 유체 섭취를 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 구강 유체 섭취의 감소는 적어도 약 400 mL/일, 또는 적어도 약 500 mL/일, 또는 적어도 약 600 mL/일, 또는 적어도 약 700 mL/일, 또는 적어도 약 800 mL/일, 또는 적어도 약 900 mL/일, 또는 적어도 약 1000 mL/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 비경구 지원 부피를 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 비경구 지원 부피를 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 비경구 지원 부피를 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 비경구 지원 부피의 감소는 적어도 약 400 mL/일, 또는 적어도 약 500 mL/일, 또는 적어도 약 600 mL/일, 또는 적어도 약 700 mL/일, 또는 적어도 약 800 mL/일, 또는 적어도 약 900 mL/일, 또는 적어도 약 1000 mL/일일 수 있다.
본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 혈장 알도스테론 농도를 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 적어도 하나의 치료적 유효량의 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 혈장 알도스테론 농도를 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 개시내용은 단장 증후군 대상체에서 혈장 알도스테론 농도를 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 제공하며, 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물은 적어도 하나의 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 혈장 알도스테론 농도의 감소는 적어도 약 500 pmol/L, 또는 적어도 약 750 pmol/L, 또는 적어도 약 1000 pmol/L, 또는 적어도 약 1250 pmol/L, 또는 적어도 약 1500 pmol/L, 또는 적어도 약 1750 pmol/L, 또는 적어도 약 2000 pmol/L, 또는 적어도 약 2250 pmol/L, 또는 적어도 약 2500 pmol/L, 또는 적어도 약 2750 pmol/L, 또는 적어도 약 3000 pmol/L일 수 있다.
선행하는 방법의 일부 양태에서, 증가는 대조군 수준과 비교하여 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 증가일 수 있다. 일부 양태에서, 대조군 수준은 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물의 투여 전의 양이다.
선행하는 방법의 일부 양태에서, 감소는 대조군 수준과 비교하여 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 감소일 수 있다. 일부 양태에서, 대조군 수준은 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물의 투여 전의 양이다.
일부 양태에서, 선행하는 방법에 의해 언급되는 증가 또는 감소는 본 개시내용의 GLP-2 유사체 펩티드 조성물을 이용한 적어도 약 4주의 치료 후이다.
일부 양태에서, 단장 증후군은 단장 증후군 장 기능저하(SBS-II)일 수 있다. 일부 양태에서, 단장 증후군은 단장 증후군 장 부전일 수 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
예시적인 구현예
구현예 1. 아프라글루타이드의 나트륨염을 포함하는 조성물로서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 95% 이상의 순도를 갖고, 아프라글루타이드는 하기 구조를 갖는, 조성물:
Figure pct00006
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 97% 이상의 순도를 갖는, 조성물.
구현예 3. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 3% 이하의 Des-Gly4 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 조성물.
구현예 4. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 조성물 내 아스파르티미드3 아프라글루타이드, Asp33-OH 아프라글루타이드 및 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물의 합계는 2% 이하인, 조성물.
구현예 5. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 2% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 조성물.
구현예 6. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 1.5% 이하의 β-Asp3 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 조성물.
구현예 7. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 1% 이하의 β-Asp3 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 조성물.
구현예 8. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 1% 이하의 D-His 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 조성물.
구현예 9. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서,
1% 이하의 Asp33-OH 아프라글루타이드 불순물,
1% 이하의 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물,
1% 이하의 D-아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물,
1% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함하고,
조성물 내 Des-Gly4 아프라글루타이드 및 아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물의 합계는 1% 이하인, 조성물.
구현예 10. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 동결건조된 분말로서 제공되는, 조성물.
구현예 11. 선행하는 구현예 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 제약 조성물.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 글리신, L-히스티딘 및 만니톨 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 제약 조성물.
구현예 13. 구현예 10에 있어서,
약 12.5 mg의 아프라글루타이드(나트륨염);
약 1.88 mg의 글리신;
약 3.88 mg의 L-히스티딘;
약 57.5 mg의 만니톨을 포함하는, 제약 조성물.
구현예 14. 구현예 12에 있어서, 동결건조된 분말로서 제공되는, 제약 조성물.
구현예 15. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 조성물 또는 구현예 11 내지 14 중 어느 하나의 제약 조성물을 포함하는, 2-챔버 분말 주사기.
구현예 16. GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법으로서,
a) 고상 펩티드 합성(SPPS)을 수행하여 Fmoc-링크-아미드-메틸벤즈하이드릴 아민(MBHA)-수지 상의 GLP-2 유사체 펩티드를 합성하는 단계;
b) 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 수지로부터 절단하고, 트리플루오로아세트산(TFA), 물 및 아니솔을 포함하는 용액으로 수지를 처리함으로써 합성된 GLP-2 유사체 펩티드의 측쇄를 탈보호하는 단계;
c) TFA 기반 이동상을 사용하여 제1 분취용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 정제를 수행함으로써 단계 (b)로부터 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 정제하여, 90% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 용액을 생성하는 단계;
d) NaHCO3 기반 이동상을 사용하여 제2 RP-HPLC 정제를 수행함으로써 단계 (c)의 생성물을 정제하여, 97% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 용액을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 17. 구현예 16에 있어서,
e) NaOAc 기반 이동상을 사용하여 제3 RP-HPLC 정제를 수행함으로써 단계 (d)로부터의 생성물을 추가로 정제하여, 97% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드의 나트륨염을 포함하는 용액을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 18. 구현예 17에 있어서,
f) 물 중 0.1% AcOH를 사용하여 GLP-2 유사체 펩티드의 나트륨염을 포함하는 pH 용액을 약 pH 7.9까지 조정하는 단계;
g) 공극 크기가 0.2 μm인 필터에 단계 (f)의 생성물을 통과시키는 단계;
h) 단계 (g)의 생성물을 동결건조시켜, 97% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드의 동결건조된 나트륨염을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 19. 구현예 16에 있어서,
c)(i) 암모니아 완충액 중 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액에 펩티드를 가용화함으로써 합성된 GLP-2 유사체 펩티드의 탈카르복실화를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 암모니아 완충액 중 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액의 pH가 약 pH 8.0까지 조정되는, 방법.
구현예 21. 구현예 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)는
i) SPPS가 수행될 MBHA-수지를 제조하는 단계
ii) 초기 Fmoc 탈보호 반응을 수행한 후, 제1 Fmoc-보호된 아미노산을 수지에 첨가하여 커플링 반응을 수행하여, 수지에 보호된 펩티드를 형성하는 단계;
iii) Fmoc 탈보호 반응을 수행한 후, 커플링 반응을 수행하여, 보호된 펩티드에 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산을 부가하는 단계;
iv) GLP-2 유사체 펩티드가 수지 상에서 합성되어, 수지에 연결된 Fmoc-보호된 및 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 생성할 때까지 단계 iii을 반복하는 단계;
v) Fmoc 탈보호 반응을 수행하여 수지에 연결된 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 생성하는 단계; 및
vi) 수지에 연결된 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 건조시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, 단계 (a)(i)은
(a1) 수지를 디메틸포름아미드(DMF) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하는 용액으로 N2 분위기 하에서 수지 그램당 5 mL의 용액으로 세척하는 단계;
(b1) DMF 중 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄(HBTU), DIEA 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 포함하는 용액에서 링크 아미드 링커를 수지에 커플링시키는 단계;
(c1) 단계 (b1)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계
(d1) DMF 중 아세트산 무수물(Ac2O) 및 DIEA를 포함하는 용액과 수지를 접촉시켜 환원 반응을 수행하는 단계; 및
(e1) 단계 (d1)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 23. 구현예 21 또는 구현예 22에 있어서, Fmoc 탈보호 반응을 수행하고, 이어서 커플링 반응을 수행하는 단계는
(a2) 수지를 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 처리하는 단계;
(b2) 수지를 DMF로 세척하는 단계;
(c2) 수지를 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 세척하는 단계;
(d2) 수지를 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및, 제1 양의, 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 에틸 시아노하이드록시이미노아세테이트(옥시마)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
(e2) 수지를 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
(f2) 단계 (e2)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 수지는, 수지를 제1 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시킨 후 약 30분 후에 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉되는, 방법.
구현예 25. 구현예 21 또는 구현예 22에 있어서, Fmoc 탈보호 반응을 수행하고, 이어서 커플링 반응을 수행하는 단계는
(a2) 수지를 DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액으로 처리하는 단계;
(b2) 수지를 DMF로 세척하는 단계;
(c2) 수지를 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 세척하는 단계;
(d2) 수지를 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및, 제1 양의, 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 에틸 시아노하이드록시이미노아세테이트(옥시마)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
(e2) 수지를 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
(f2) 단계 (e2)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, 수지는 제1 양의, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액과 15분 동안 접촉되고, 이어서 수지를 제2 양의, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액과 30분 동안 접촉시키는, 방법.
구현예 27. 구현예 23 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산은 Fmoc-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-OH인, 방법.
구현예 28. 구현예 23 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산은 Fmoc-Gly(Tmb)-OH인, 방법.
구현예 29. 구현예 23 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 보호된 아미노산은 Boc-His(Trt)-Gly-OH인, 방법.
구현예 30. 구현예 23 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 단계 (e2) 및 단계 (f2) 사이에 커플링 테스트를 수행하는 단계를 추가로 포함하고, 커플링 테스트는 Kaiser 테스트인, 방법.
구현예 31. 구현예 16 내지 30 중 어느 하나에 있어서, GLP-2 유사체 펩티드는 아프라글루타이드인, 방법.
구현예 32. 구현예 16 내지 31 중 어느 한 구현예의 방법을 사용하여 생성된 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 조성물.
구현예 33. 대상체에서 단장 증후군 관련 장 부전(SBS-IF) 또는 단장 증후군 관련 장 기능저하(SBS-II)를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며,
대상체가 50 ㎏ 미만의 체중을 가질 경우, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염은 약 2.5 mg/주의 용량으로 투여되거나, 또는
대상체가 50 ㎏ 이상의 체중을 가질 경우, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염은 약 5 mg/주의 용량으로 투여되는, 방법.
구현예 34. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염은 피하 주사에 의해 투여되는, 방법.
구현예 35. 구현예 33 또는 구현예 34에 있어서, 대상체는 연속성 결장을 가지며, 아프라글루타이드 또는 제약상 허용 가능한 염은 약 48주 동안 투여되는, 방법.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 대상체는 50% 초과의 연속성 결장을 갖는, 방법.
구현예 37. 구현예 33 또는 구현예 34에 있어서, 대상체는 적어도 하나의 소공을 갖고, 아프라글루타이드는 약 24주 동안 투여되는, 방법.
구현예 38. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 식이 섭취 습윤 중량의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
구현예 39. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료된 대상체에 비해 대상체에서 대변 배출을 감소시키는, 방법.
구현예 40. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 절대 소변 배출량을 증가시키는, 방법.
구현예 41. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 나트륨 및 칼륨의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
구현예 42. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 나트륨 및 칼륨 소변 배설을 증가시키는, 방법.
구현예 43. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 에너지의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
구현예 44. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료된 대상체에 비해 대상체에서 대변 배출의 에너지 함량을 감소시키는, 방법.
구현예 45. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 탄수화물, 단백질 및 지질의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
구현예 46. 구현예 33에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료된 대상체에 비해 대상체에서 시트룰린 농도를 증가시키는, 방법.
구현예 47. 95% 이상의 순도를 갖는 아프라글루타이드의 나트륨염으로서, 아프라글루타이드는 하기 구조를 갖는 것인, 아프라글루타이드의 나트륨염:
Figure pct00007
구현예 48. 구현예 47에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 97% 이상의 순도를 갖는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 49. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 3% 이하의 Des-Gly4 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 50. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염 내 아스파르티미드3 아프라글루타이드, Asp33-OH 아프라글루타이드 및 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물의 합계는 2% 이하인, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 51. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 조성물 아프라글루타이드의 나트륨염 2% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물인, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 52. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 1.5% 이하의 β-Asp3 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 53. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 1% 이하의 β-Asp3 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 54. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 1% 이하의 D-His 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 55. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은
1% 이하의 Asp33-OH 아프라글루타이드 불순물,
1% 이하의 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물,
1% 이하의 D-아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물,
1% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함하고,
아프라글루타이드의 나트륨염 내 Des-Gly4 아프라글루타이드 및 아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물의 합계는 1% 이하인, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 56. 선행하는 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 동결건조된 분말로서 제공되는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
구현예 57. 선행하는 구현예 중 어느 하나의 아프라글루타이드의 나트륨염을 포함하는 제약 조성물.
구현예 58. 구현예 57에 있어서, 글리신, L-히스티딘 및 만니톨 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 제약 조성물.
구현예 59. 구현예 58에 있어서,
약 12.5 mg의 아프라글루타이드(나트륨염);
약 1.88 mg의 글리신;
약 3.88 mg의 L-히스티딘;
약 57.5 mg의 만니톨을 포함하는, 제약 조성물.
구현예 60. 구현예 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 동결건조된 분말로서 제공되는, 제약 조성물.
구현예 61. 구현예 47 내지 56 중 어느 하나의 조성물 또는 구현예 57 내지 60 중 어느 하나의 제약 조성물을 포함하는, 2-챔버 분말 주사기.
실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 조성물 및 방법이 사용되고, 제조되고, 평가될 수 있는 방법에 대한 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 순수하게 예시적인 것으로 의도되고, 본 발명으로 간주되는 것의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1: 아프라글루타이드 제조 공정 (I)
고상 펩티드 합성(단계 1)
하기는 이전에 기재된 합성 경로(예를 들어, 미국 특허 제8,580,918호)에 비해 개선된 순도 수준의 아프라글루타이드의 제조를 위한 본 개시내용의 예시적인 방법이다. SPPS는 하기 단계를 포함하는 주기의 반복에 의해 고체 지지체 상에 고정된 펩티드 사슬의 순차적 합성이다:
1. 펩티드 수지의 N-말단 Fmoc 보호기의 제거
2. DMF 세척
3. Fmoc-AA-OH의 커플링
4. 커플링 테스트
5. DMF 세척
이러한 주기는 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복된다.
아미노산의 α-아미노기는 염기-민감성 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기로 보호되고; 측쇄 관능기는 산-불안정기로 보호된다. 공정에 사용된 모든 아미노산 유도체는 상업적으로 입수 가능하다.
SPPS는 고체 지지체 상에 고정된 펩티드 사슬의 순차적 합성이다. 합성에서, MBHA 수지는 펩티드 서열을 조립하는 데 사용될 수 있다. 질소 분위기 하에서 수지를 팽윤시키고 DMF에 이어 DMF/DIEA로 세척한 후, Fmoc-링크-아미드 링커가 DMF 중 HBTU/DIPEA/HOBt를 사용하여 커플링될 수 있다. 커플링 후, 수지를 DMF로 세척한 다음 Ac2O/DIPEA를 사용하여 아세틸화할 수 있다. Kaiser 테스트가 커플링의 완료를 확인하기 위해 수행될 수 있다.
수지를 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호된 아미노산은 하기 주기에 따라 수지-결합 펩티드에 각각 커플링된다:
1. Fmoc-보호기를 DMF 중 피페리딘으로 제거하고 수지를 DMF로 철저히 세척한다.
2. 활성화를 위해 DIC/옥시마를 사용하여 가변 아미노산 당량을 갖는 DMF에서 커플링을 수행한다.
3. 아미노산의 커플링은 각각의 합성 주기 동안 수행되는 닌히드린 분석법을 사용하여 모니터링한다.
조립 종료 시, 마지막 아미노산이 커플링되고 탈보호된 후, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 세척하고, 진공 하에서 건조시킨다.
수지로부터 펩티드의 절단 및 탈보호(단계 2)
보호된 펩티드는 수지로부터 동시에 절단되고 TFA/물/아니솔 혼합물로 처리함으로써 탈보호될 수 있다. 이어서, MTBE를 펩티드/TFA 슬러리에 첨가하여, 절단된 수지의 존재 하에 조 펩티드를 침전시킨다. 수득된 조 펩티드를 여과하고, MTBE로 세척하고, 진공 하에서 일정한 중량까지 건조시킨다.
탈카르복실화 반응(단계 3a)
조 펩티드를 암모니아 완충액 중 H2O/ACN(80:20 비)의 혼합물에 용해시킨다. H2O 중 25% NH4OH를 사용하여 7 이상의 pH를 목표로 하여 용액을 조정한다. 탈카르복실화 반응은 24시간 동안 실온에서 유지된다. 조 펩티드를 약 pH 10의 암모니아 완충액 중 H2O/ACN(80:20 비)의 용액으로 세척하고 실온에 저장한다.
분취용 RP-HPLC에 의한 정제(단계 3b)
조 펩티드를 물/아세토니트릴/NH4OH의 혼합물에 용해시킨다. 이 용액을 아세트산으로 희석한 다음 여과한다.
1차 정제는 용리액으로서 NaHCO3/H2O/CH3CN으로 분취용 RP-HPLC에서 수행된다. 컬럼으로부터의 용리를 UV에 의해 모니터링하고 수득된 분획을 RP-HPLC로 분석한다. 모니터링 기준을 충족하는 분획을 조합된 풀에서 혼합한다. 모니터링 기준을 충족하지 않는 분획은 정제 단계를 반복함으로써 재순환될 수 있다. 풀의 순도는 분석용 RP-HPLC에 의해 제어된다.
분취용 RP-HPLC에 의한 나트륨염 전환(단계 4)
이 단계는 pH 변화를 통해 TFA 음이온으로부터 나트륨 양이온으로의 펩티드의 반대 이온을 교환하고 펩티드를 추가로 정제하기 위해 수행될 수 있다. 단계 3으로부터의 조합된 풀을 물에 희석하고 NaOAc 용리액을 사용하여 분취용 RP-HPLC에 의해 재정제한다.
이어서, 정제된 펩티드 용액을 진공 하에서 증발시켜 용액 중 아세토니트릴을 감소시킨다. 이어서, 정제된 펩티드 용액을 0.1% AcOH를 사용하여 pH 7.9를 목표로 하여 조정한다.
순수한 풀은 농축되고 동결 건조될 수 있다. 풀의 순도를 RP-HPLC로 분석한다.
동결 건조 및 포장(단계 5)
동결건조 전에, 용액 중의 정제된 펩티드를 0.2 μm 막을 통해 여과한다. 동결건조는 저압에서 수행된다. 생성된 동결건조된 최종 펩티드를 아르곤 하에 포장한다. 동결건조된 아프라글루타이드는 아프라글루타이드 사양에 따라 제어된다.
재처리
아프라글루타이드 사양에서 확립된 기준을 충족하지 않는 동결건조된 아프라글루타이드는 재정제를 거칠 수 있다.
재정제는 상기 기재된 바와 같이 정제 단계(들) 및 반대 이온 전환 단계를 반복함으로써 펩티드의 재구성 후에 수행될 수 있다.
재정제 후, 물질을 상기 기재된 절차에 따라 동결건조시킨다.
아프라글루타이드 사양에서 확립된 기준을 충족하지 않는 동결건조된 아프라글루타이드는 재동결건조를 거칠 수 있다.
재동결건조는 상기 기재된 바와 같이 동결건조 단계를 반복함으로써 펩티드의 재구성 후에 수행될 수 있다.
불순물
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 아프라글루타이드는 제조 공정에 사용되는 시약 및 믈질(부산물 포함)의 잔류물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유기 불순물이 실질적으로 없다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 아프라글루타이드는 비-펩티드 불순물이 실질적으로 없다.
본 개시내용의 방법의 일부 양태에서, 아프라글루타이드는 잔류 용매가 실질적으로 없다.
Des-Gly4 아프라글루타이드, 아스파르티미드3 아프라글루타이드, Asp33-OH 아프라글루타이드, Des-Ser7 아프라글루타이드, 및 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드를 포함하나 이에 제한되지 않는 펩티드 불순물이 아프라글루타이드 조성물에서 관찰될 수 있다.
주사용 아프라글루타이드는 장기간 저장 조건(5° ±3℃)에서 저장된 동결건조된 분말일 수 있다. 본 명세서에 제공된 안정성 결과(표 5)는 장기간 저장 조건에서 분해가 관찰되지 않았음을 입증한다.
박테리아 내독소의 테스트는 비경구 아프라글루타이드 조성물에 필요한 바와 같이, 아프라글루타이드 조성물의 제조, 포장, 저장 및 배포 후 미생물학적 품질을 보장하는 데 바람직할 수 있다. 테스트는 Ph. Eur. 2.6.14/ USP <85>에 따라 수행된다.
생성물의 화학적 특징
본 개시내용의 화합물은 천연 GLP-2에 필적하는 효능 및 선택성을 갖는 GLP-2 수용체의 선택적인 완전 작용제로서 작용하는 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2)의 33개 아미노산 합성 펩티드 유사체이다.
본 개시내용의 펩티드는 선형 펩티드이다. 펩티드의 서열은 하나의 D 입체이성질체 아미노산(D-페닐알라닌), 하나의 비천연 아미노산(노르류신) 및 2개의 아키랄 아미노산(글리신)을 함유하고; 모든 다른 아미노산은 L-배열이다. 본 개시내용의 펩티드는 정의된 키랄성의 모든 입체-중심을 갖는 단일 거울상 이성질체로서 합성된다. 이는 천연 구성성분으로서 일부 잔류하는 물과 함께 나트륨염 형태로 단리될 수 있다.
개시된 펩티드의 외관은 백색 내지 회백색의 균질한 분말이다. 이는 역상 크로마토그래피 정제에 의해 단리되고 이후에 동결건조될 수 있다; 결정질 또는 다형성 형태는 알려져 있지 않다.
정제수에서 개시된 펩티드의 용해도는 100 mg/mL 초과이다.
100 mg/mL의 물 중 개시된 펩티드의 용액의 pH는 7.6 내지 8.4이다. 계산된 등전점은 4.3a이다.
아프라글루타이드의 최적의 용해도 및 화학적 안정성은 pH 8.0 내지 8.5에서 관찰되었다.
공정 중 제어
일부 구현예에서, RP-HPLC에 의해 측정된 정제된 펩티드 풀의 순도는 95%, 97% 또는 99% 초과이다. 일부 구현예에서, RP-HPLC에 의해 측정된 정제된 펩티드 풀의 순도는 95% 초과이다.
일부 양태에서, 표 4에 제시된 공정 중 대조군은 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 표 4에 제시된 공정 중 대조군은 표 4의 "허용 기준" 컬럼에 제시된 순도를 가질 수 있다:
[표 4]
Figure pct00008
본 실시예에 기재된 제조 공정은 본 명세서에서 공정 A로 지칭된다. 표 2a는 공정 A를 사용하여 생성된 아프라글루타이드 생성물의 순도뿐만 아니라 주요 오염물질의 수준을 나타낸다. 표 2a 및 표 2b에 제시된 바와 같이, 공정 A는 95% 이상의 순도 및 낮은 수준의 오염물질을 갖는 아프라글루타이드를 산출할 수 있다. 더욱이, 공정 A는 15% 내지 22% 범위의 생성물 수율을 나타낸다.
실시예 2: GLP-2 작용제 활성의 시험관 내 측정
hGLP-2 수용체에 대한 본 개시내용의 GLP-2 작용제의 활성을 결정하기 위해, 전사 리포터 유전자 분석을 사용한다. 2개의 작제물을 인간 배아 신장 세포주(HEK-293)로 일시적으로 형질감염시킨다: hGLP-2 수용체 발현 DNA 작제물 및 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 조절하는 세포내 cAMP 반응성 프로모터 요소를 함유하는 리포터 DNA 작제물. (이 분석법에 대한 추가 지침에 대해서는 예를 들어, 문헌[HimmLer et al., J. Recept. Res., (1993), 13, 79-74] 참조).
세포를 용량당 하프-로그(half-log)로 희석된 화합물의 연속 희석물에 5시간 동안 노출시킨다. 화합물 노출 후, 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 활성을 결정하고, 화합물 효능 및 EC50 값을 비선형 회귀 분석에 의해 결정한다. hGLP-2, 자연 발생 33개 아미노산 펩티드 리간드를 각각의 실험에서 내부 대조군으로 사용한다.
실시예 3: 제형화
피하 주사에 적합한 제형을 생성하기 위해, 아프라글루타이드를 무균 제조하고, 제약 부형제 글리신, L-히스티딘 및 만니톨과 함께 분말로 동결 건조한다. 동결 건조된 분말을 멸균수 또는 주사용 완충액으로 재구성한다.
동결건조된 제형을 개발하기 위해, 액상에서 아프라글루타이드의 원하는 물리적 안정성을 달성하기 위해 최적의 벌킹제 및 부형제를 평가하는 스크리닝 연구를 수행하였다. 벌킹제 수크로스 및 만니톨의 초기 테스트는 둘 모두가 동결건조 공정에 적합하고 동결건조된 생성물의 재구성 시간, 수분 함량 및 시각적 검사의 측면에서 적합함을 입증하였다. 2개의 벌킹제 수크로스 및 만니톨과 함께 안정화제의 농도 및 조합의 효과를 조사하였다. 글리신 및 Tris를 20 Mm(글리신의 경우 1.50 mg/mL 및 Tris의 경우 2.4 mg/mL) 및 40 mM(글리신의 경우 3.0 mg/mL 및 Tris의 경우 4.8 mg/mL)의 농도, pH 8.2 내지 8.5의 완충제로서 테스트하였다. 모든 제형을 20 mM(3.10 mg/mL) 농도에서 L-히스티딘의 존재 또는 부재 하에, 벌킹제로서 만니톨 또는 수크로스를 사용하여 테스트하였다. 요인 설계를 사용하여 총 11개의 제형을 제조하였다. 제형을 궤도화 테이블 상에, 40℃의 가속 온도에 3일 동안 배치하여 물리적으로 시험하였다. 제형의 물리적 안정성을 크기 배제 크로마토그래피, 광학 밀도 및 점도에 의해 평가하였다; 아프라글루타이드의 화학적 안정성을 역상 액체 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 평가하였다. 히스티딘과 조합된 글리신을 함유하는 제형의 화학적 및 물리적 안정성은 Tris-완충액을 함유하는 제형보다 우수하였다. 만니톨 및 수크로스는 둘 모두 벌킹제로서 적합하였으나; 동결건조 동안 더 양호한 가공성으로 인해 만니톨이 선택되었다.
글리신 농도의 효과는 스크리닝 연구에서 결론을 내릴 수 없었기 때문에, 실험실 규모의 안정성 연구를 각각 20 Mm(1.50 mg/mL) 및 40 Mm(3.0 mg/mL)의 농도의 글리신을 함유하는 두 제형으로 설정하였다. 두 제형 모두 l-히스티딘, 만니톨, 아프라글루타이드이드를 함유하였고, pH는 8.3으로 조정되었다. 제형을 동결 건조시키고, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 3개월 동안 추적하였다. 결론은 -20℃, 5℃ 및 25℃에서, 두 제형이 3개월의 테스트 기간 전체에 걸쳐 화학적으로 및 물리적으로 안정하였다는 것이다. 40℃에서, 두 제형은 3개월에서 감소된 물리적 안정성의 징후를 나타냈다. 더 낮은 농도의 20 mM 글리신을 함유하는 제형은 X-선 분말 회절에 의해 평가 시, 바람직한 더 높은 결정도의 만니톨을 가졌다. 따라서, 제형을 위해 20 mM 글리신을 선택하였다.
실시예 4: 아프라글루타이드 효과에 대한 마커로서의 시트룰린
혈장 시트룰린을 아프라글루타이드의 효과를 설명하기 위해 약력학("PD") 마커로서 사용하였다. 약동학("PK") 모델 개발과 유사하게, PK/PD 모델은 연구 GLY-101-2015 및 T 799-002의 건강한 개체에 대해서만 개발되었다. PD 모델의 개발을 위해, PD 관찰은 구조와의 최종 PK 모델, 잔류 오차-모델, 공변량-모델 및 무작위 효과-모델을 사용하여 PK 관찰과 함께 피팅되었다. 시작 모델은 혈장 시트룰린이 지속적으로 합성되고 합성 속도 ksyn 및 분해 속도 kdeg로 분해되는 턴오버(turnover) 모델이었다. 혈장 아프라글루타이드는 기준선 시트룰린 수준 R0, 농도에서의 절반 최대 효과 EC50, 최대 효과 Emax 및 Hill 계수 감마와 함께 시그모이드 Emax 관계를 통해 시트룰린 합성을 자극하였다. 시트룰린 합성이 시트룰린 기준선 및 분해에 의해서만 결정되도록 시트룰린 턴오버가 정상 상태에 있다고 가정하였다. 혈장 아프라글루타이드의 집단 PK/PD는 건강한 지원자에서의 두 연구 및 2.5 내지 50 mg SC의 용량을 시험한 SBS 환자를 이용한 2개의 연구로부터의 데이터와 함께 확립되었다. 아프라글루타이드의 농도는 2-구획 및 용량-비선형 동역학을 따랐다. 아프라글루타이드 제거율은 16.8 L/일로 추정되었고, 5 mg SC 용량을 받는 70 ㎏ 개체의 경우 중심 분포 부피는 31.5 L로 추정되었다. 반감기는 1.3일로 추정되었다. 분포 부피 및 제거율은 계수 βV1/F,BW = 1.94 및 βCl/F,BW = 1.8로 체중에 따라 달라졌다. 이들 계수는 강한 체중 의존성을 나타냈다. 0차 흡수 지속시간은 βTk0,용량 = 0.249의 계수로 용량에 따라 달라졌다.
혈장 시트룰린에 대한 혈장 아프라글루타이드의 효과는 시트룰린 포화도가 5 mg의 용량에서 나타나는 S자형인 것으로 밝혀졌다. 이 현상은 아프라글루타이드에 의해 Emax 모델에 따라 합성이 자극된 시트룰린 턴오버 모델로 설명되었다. 시트룰린 기준선은 5.12 ㎍/mL인 것으로 밝혀졌으며, 최대 효과는 0.626이었고, 절반 최대 유효 아프라글루타이드 농도는 13.7 ng/mL였다.
집단 PK/PD 모델을 사용하여, 2.5, 5, 또는 10 mg SC의 매주 용량을 받은 40 내지 120 ㎏ 체중의 개체에 대해 개체간 변동성을 포함하거나 포함하지 않고 혈장 아프라글루타이드 노출 및 혈장 시트룰린 최저 농도-시간 프로파일을 예측하였다. 개체간 변동성 불포함 예측은 시트룰린에 대한 아프라글루타이드의 효과가 매주 5 mg의 아프라글루타이드 SC를 투여받는 40 ㎏ 개체의 경우 포화되기 시작함, 즉, 체중이 감소함에 따라 동일한 아프라글루타이드 용량이 시트룰린에 대한 효과를 감소시킴을 보여주었다. 이러한 포화 효과는 매주 10 mg의 아프라글루타이드 SC를 받는 개체의 경우 훨씬 더 두드러지는 것으로 밝혀졌다. 개체간 변동성 포함 예측은 혈장 시트룰린 농도-시간 프로파일 및 혈장 시트룰린 최저 수준에서 큰 변동성을 나타냈다. 40 내지 120 ㎏의 체중 및 2.5, 5 또는 10 mg의 아프라글루타이드 SC 용량에 대한 아프라글루타이드 노출을 SBS 환자의 사후 노출 추정치와 비교하였다. 2.5 내지 5 mg의 용량 사이에서 50 ㎏의 체중에서 브라케팅을 시뮬레이션하였다. 이 브라케팅 변형은 매주 5 mg 아프라글루타이드 SC를 받는 SBS 환자의 사후 AUC 추정치 범위 내에서 아프라글루타이드 노출을 초래했다. 임상 바이오마커로서, 소변 배출은 SBS 환자에서 혈장 아프라글루타이드 노출 및 혈장 시트룰린 최저 수준의 사후 추정치와 상관관계가 있었다. 아프라글루타이드 노출 및 시트룰린 최저 수준은 소변 배출과 약하게만 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
장세포 질량에 대한 바이오마커인 혈장 시트룰린은 인간 임상 시험에서 GLP-2 유사체 투여 후 증가된다.
단장 증후군에 대해 개발 중인 신규한 장기 작용성 GLP-2 유사체인 아프라글루타이드 및 시트룰린 사이의 약동학/약력학(PK/PD) 관계를 무작위화, 이중 맹검, 병렬 암, 위약-대조, 다중 용량 연구에서 평가하였다. 23명의 건강한 성인 지원자가 6주간 아프라글루타이드(1, 5, 또는 10 mg) 또는 위약을 피하 투여받았고, 마지막 용량 후 추가로 6주 동안 추적 관찰되었다. 혈액 수집을 식이, 생활 방식 및 주간 효과에 대해 제어하였다. L-시트룰린을 검증된 LC-MS 방법을 사용하여 정량화하였다. PK 데이터는 비-구획 분석을 거쳤고 PD 데이터는 ANCOVA에 의해 분석되었다.
PK 매개변수는 72시간의 반감기를 나타냈다. 최초 아프라글루타이드 용량 후 2일 후에 시트룰린의 증가가 관찰되었고, 대부분의 대상체에서 4일 또는 7일 후에 최대 효과가 달성되었다. 평균 시트룰린 수준은 모든 아프라글루타이드 암(arm)에서 기준선으로부터 상승되었고, 6주 치료 기간 동안 상승된 채로 유지되었다. 시트룰린 증가는 위약 대비 아프라글루타이드 1 mg보다 아프라글루타이드 5 mg 및 10 mg에서 유의하게 더 컸다(표 5). 5 내지 10 mg의 아프라글루타이드 용량 수준에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 혈장 시트룰린 수준은 마지막 아프라글루타이드 용량 후 10 내지 17일 동안 상승된 채로 유지되었다. 아프라글루타이드는 안전하고 중대한 AE 없이 내약성이 우수하였다.
[표 5]
Figure pct00009
아프라글루타이드는 안전하고 내약성이 우수하였으며, 혈장 노출보다 더 긴 PD 반응을 나타냈다. 이들 PK 및 PD 데이터는 아프라글루타이드의 매주 1회 피하 투약에 대한 잠재력을 확인시켜 준다.
실시예 5: 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물 투여의 2상 인간 임상 시험 결과
하기 비제한적인 실시예는 SBS-IF를 갖는 대상체가 본 개시내용의 아프라글루타이드 제형으로 치료된 2상 임상 시험으로부터의 결과를 기재한다. 이 2상 시험은 SBS-IF를 앓는 환자에서 5 및 10 mg의 아프라글루타이드의 안전성 및 효능을 조사하였다.
이론에 구속됨을 바라지 않고, SBS 환자에서 GLP-2 유사체의 유익한 효과는 체액 항상성의 동적 변화를 포함할 수 있으며, 이는 치료 결과를 평가할 때 고려될 수 있다. 개선된 장 흡수는 감소된 대변 배출을 초래한다. 장내 흡수된 물 및 나트륨의 많은 양은 전신 순환을 통해 신장에 의해 배설되기 때문에, SBS 환자에서 증가된 흡수는 소변 부피 생성 및 나트륨 배설의 증가로 이어질 수 있다. 따라서, 일반적으로, SBS 환자의 수화 상태는 소변 부피 및 소변 나트륨을 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
SBS-IF를 갖는 8명의 성인 환자를 표 6에 따라 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물로 치료하였다. 간략하게는, SBS-IF를 갖는 환자는 5 mg의 본 개시내용의 아프라글루타이드 또는 위약을 4주 동안 주 1회 투여받았다. 이어서, 환자는 10 mg의 본 개시내용의 아프라글루타이드를 4주 동안 주 1회 투여받았다. 또한, 치료 사이에 6 내지 10주의 세척 기간이 있었다.
[표 6]
Figure pct00010
결과
시험의 일부로서, 총 12명의 환자가 스크리닝되었고, 이들 중 8명이 치료에 대해 무작위화되었다. 모든 8명의 환자는 10 mg의 아프라글루타이드(파트 B)의 개방 표지 요법에서 추가 치료 기간에 계속되었다. 1명의 환자는 시험 절차로부터의 탈진 및 인지된 효과 부족으로 인해 파트 B 치료 기간에서 최초 약물 투여 후 시험을 중단하였다. 환자는 즉각적인 측정에 대한 데이터를 제공하였지만, 치료 후에 대해서는 그렇지 않았다. 8명의 환자는 안전성 분석 세트 및 완전 분석 세트를 포함하였다. 환자의 인구 통계 및 기준선 특징은 표 7에 요약되어 있다. 표 7의 데이터는 평균 (SD) 또는 N (%)이고, 비경구 지원(PS)은 주간 평균에 기초하여 시험 참가 시 예정된 PS였다.
3명의 환자는 임상 시험에서 GLP-2 유사체로 이전에 치료받았다(6개월 이상 전). 개별 환자 플롯은 세척 기간 후 모든 효과가 기준선으로 되돌아가는 것을 예시하였다; 따라서 이월 효과가 관찰되지 않았다.
[표 7]
Figure pct00011
안전성 결과
일반적인 관련 유해 사건은 표 8에 보고되어 있다(데이터는 N 또는 N (%)이다). 유해 사건은 2명 초과의 환자에서 발생하였고, 다뇨증(n=7), 소공 합병증(n=6), 위장관 소공 합병증(n=5), 위장관 소공 배출 감소(n=6), 위장관 소공 배출 비정상(n=5), 갈증 감소(n=5), 부종(n=4), 체중 증가(n=3) 및 식욕 감소(n=3)를 포함하였다. 3명의 환자는 주사 부위 반응을 경험하였다. 모든 주사 부위 반응은 활성 치료로 발생하였다; 1명의 환자는 5 mg 용량군에서 주사 부위 반응을 가졌고, 3명의 환자는 10 mg 용량군에서 주사 부위 반응을 가졌다. 총 8건의 중대한 유해 사건이 5명의 환자에 의해 보고되었다. 이들 중 어느 것도 시험 약물과 관련된 것으로 간주되지 않았다. 2건의 중대한 유해 사건은 PS 투여를 위해 환자에 의해 사용된 터널링된 중심 정맥 카테터와 관련된 기계적 합병증을 포함하였고, 둘 다 카테터 교체를 위해 입원을 필요로 하였다. 6건의 중대한 유해 사건은 카테터 관련 혈류 감염(CRBSI)이었다. 1명의 환자는 CRBSI의 4건의 재발성 사건을 가졌다. 중대한 유해 사건은 위약 및 치료 기간 사이에 동일하게 분포되었다. 대부분의 환자는 적어도 하나의 치료 관련 유해 사건을 가졌으며, 이들 모두는 활성 용량 수준 사이에 명백한 차이가 없이 경증 내지 중등도였다.
[표 8]
Figure pct00012
관련 유해 사건으로 인한 시험 중단이나 감소는 없었다. 1명의 환자는 말초 부종으로 인해 위약 기간 동안 제3 용량의 아프라글루타이드를 생략하였다. 활력 징후, 혈액 샘플, ECG, 딥스틱 소변검사 또는 체중에서 안전성 문제가 발생되지 않았다. 사망은 없었다.
3명의 환자는 시험 동안 항-아프라글루타이드 항체를 발달시켰다. 2명의 환자는 5 mg 치료 기간의 종료 시 항-아프라글루타이드 항체에 대해 양성 테스트 결과를 나타냈고, 1명의 환자는 10 mg 치료 기간의 종료 시 양성이었다. 5 mg 치료 기간의 종료 시 양성 항체를 가진 1명의 환자는 또한 10 mg 치료 기간의 종료 시 양성 항체를 가졌다. 5 mg 치료 기간 동안 양성 항체를 발달시킨 2명의 환자의 경우, 이들은 6~10주 세척 기간 후에 음성이었다. 10 mg 치료의 종료 시 양성 항체를 갖는 2명의 환자의 경우, 둘 모두 4~6주 세척 기간 후에 여전히 양성이었지만, 역가는 10 mg 치료 기간의 종료 시보다 더 낮았다. PK 프로파일, 아프라글루타이드에 대한 약력학 반응, 또는 유해 사건의 수 또는 기간에 대한 항-아프라글루타이드 항체의 효과가 검출되지 않았다.
소변 배출량 및 소변 나트륨 배설: 기준선으로부터 치료 종료까지의 변화(27~29일)
절대 소변 배출량의 기준선으로부터 각 치료 종료까지의 개별 변화는 각 치료에 대한 평균 변화를 포함하여 도 5에 플롯팅되어 있다. 평균 변화는, 위약과 치료를 비교하는 통계 분석에서 계산된 조정된 평균과 상이하였다. 파트 A+B의 통계 분석의 경우, 5 mg 아프라글루타이드는 표 9에 제시된 바와 같이 위약에 비해 711 mL/일(95% CI 132~1,289; P=.021)의 조정된 평균만큼 절대 소변 배출량의 증가를 촉진했는데, 이는 일일 48%(95% CI 12~84; P=.014) 증가에 해당한다. 파트 A의 통계 분석의 경우, 5 mg 아프라글루타이드는 표 10에 제시된 바와 같이 714 mL/일(95% CI 490~939; P=.002)의 조정된 평균만큼 절대 소변 배출량의 증가를 촉진했는데, 이는 일일 49%(95% CI 4~94; P=.041) 증가에 해당한다. 10 mg 아프라글루타이드 치료는 위약에 비해 795 mL/일(95% CI 195~1,394; P=.014)의 조정된 평균만큼 절대 소변 배출량의 증가를 촉진했다. 이에 상응하는 상대 소변 생산량의 변화는 34%(95% CI -4~71; P=.072)였다. 표 9에 나타낸 바와 같이 5 mg 및 10 mg 용량군 사이에는 차이가 관찰되지 않았다. 표 9에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 개별 용량군의 기준선으로부터 치료 종료 또는 치료 종료 근처까지의 변화에 기초하고, N은 완전 분석 세트의 환자의 수를 나타낸다. 파트 A+B의 통계 분석으로부터의 결과는 도 6에 그래프로 제시된다.
[표 9]
Figure pct00013
절대 소변 나트륨 배설의 기준선으로부터 각 치료 종료까지의 개별 변화는 도 7에 플롯팅되어 있다. 파트 A+B의 통계 분석의 경우, 5 mg 아프라글루타이드는 표 9에 제시된 바와 같이 위약에 비해 56 mmol/일(95% CI -10~123; P=.087)의 조정된 평균만큼 소변 나트륨 배설을 증가시켰다. 파트 A의 통계 분석의 경우, 5 mg 아프라글루타이드는 표 10에 제시된 바와 같이 위약에 비해 66 mmol/일(95% CI -69~201; P=.171)의 조정된 평균만큼 소변 나트륨 배설을 증가시켰다. 표 10에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 개별 용량군의 기준선으로부터 치료 종료까지의 변화에 기초하고, N은 완전 분석 세트의 환자의 수를 나타낸다. 10 mg 용량군에서, 절대 소변 나트륨 배설은 표 9에 제시된 바와 같이 위약에 비해 88 mmol/일(95% CI 20~156; P=.017)의 조정된 평균만큼 증가되었다. 표 9 및 10에 제시된 바와 같이, 상대 소변 나트륨 배설은 아프라글루타이드 치료 후 변화되지 않았다. 표 9에 추가로 제시된 바와 같이, 5 mg 및 10 mg 용량군 사이에는 차이가 발견되지 않았다.
[표 10]
Figure pct00014
소변 배출량 및 소변 나트륨 배설: 기준선으로부터 최초 치료 주사 직후까지까지의 변화(1~3일)
절대 소변 배출 및 소변 나트륨 배설의 기준선으로부터 최초 치료 주사 직후까지의 개별 변화는 각각 도 8 및 도 9에 플로팅되어 도시되어 있다. 위약과 비교하여 5 mg 또는 10 mg 용량군에 대해 즉각적인 변화는 관찰되지 않았고, 표 11에 제시된 바와 같이 활성 용량군 사이에 차이가 없었다. 표 11에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 개별 용량군의 기준선으로부터 최초 치료 주사 직후까지의 변화에 기초하고, N은 완전 분석 세트의 환자의 수를 나타낸다.
[표 11]
Figure pct00015
경구 유체 섭취: 기준선으로부터 치료 종료 근처까지의 변화(20~22일)
20~22일에, 10 mg 아프라글루타이드 치료는 절대 및 상대 구강 유체 섭취를 각각 363 mL/일(95% CI -641~-86; P=.015) 및 -15%(95% CI -25~-5; P=.006)의 조정된 평균만큼 감소시켰다. 파트 A+B의 분석의 경우, 표 9에 제시된 바와 같이 244 mL/일(95% CI -512~23; P=.070)의 조정된 평균 감소를 갖는 5 mg 용량군에 대해, 그리고 표 10에 제시된 바와 같이 242 mL/일(95% CI -560~76; P=.103)의 평균 감소를 갖는 파트 A의 분석에 대해 유사한 경향이 관찰되었다. 또한, 표 9에 나타낸 바와 같이, 활성 용량군 사이에는 차이가 발견되지 않았다.
PS 부피: 기준선으로부터 치료 종료 근처까지의 변화(20~22일)
20~22일에, 10 mg 아프라글루타이드는 위약에 비해 -28%(-51~-4; P=.025)만큼 상대 일일 PS 부피를 감소시켰다. 유사한 경향이 일일 PS 부피의 절대 변화에 대해 관찰되었는데, 이는 표 9에 제시된 바와 같이 469 mL/일(-941~4; P=.052)만큼 감소되었다. 표 9 및 표 10에 제시된 바와 같이 5 mg 용량군에 대해 PS 부피의 변화가 관찰되지 않았고, 표 9에 제시된 바와 같이 5 mg 및 10 mg 용량군 사이에는 차이가 관찰되지 않았다.
유체 복합 효과: 기준선으로부터 치료 종료 근처까지의 변화(20~22일)
파트 A+B에 대한 사후 분석을 수행하여 소변 생산 증가(27~29일), PS 부피 감소 및 자발적 구강 유체 섭취 감소(20~22일)의 합계로 정의되는 유체 복합 효과를 계산하였다. 자발적 구강 유체 섭취 및 PS 부피 감소는 치료 기간 종료 근처에서 평가하였는데, 이들은 소변 수집 동안 변하지 않고 유지되었기 때문이다. 5 mg 및 10 mg 아프라글루타이드의 투여는 위약과 비교하여 유체 복합 효과를 각각 1,036 mL/일(95% CI 262~1,810; P=.014) 및 1,630 mL/일(95% CI 827~2,433; P=.001)만큼 증가시켰다. 두 용량 사이에는 차이가 없었다; 추정된 차이는 594(95% CI -207~1,396; P=.129)였다. 치료 종료 시 소변 배출량과 함께 유체 복합 효과의 개별 플롯이 도 10a 내지 도 10c에 도시되어 있다.
수화 상태 파라미터
파트 A+B 아프라글루타이드의 사후 분석에서, 5 mg 및 10 mg은 혈장 알도스테론을 각각 2,894 pmol/L(95% CI -6247~458; P=.083) 및 3,045 pmol/L(95% CI -6,460~370; P=.075)만큼 감소시켰다. 아프라글루타이드는 표 12에 나타낸 바와 같이, 크레아티닌, 요소, 헤마토크릿, 알부민, 단백질 및 총 CO2를 포함한 다른 수화 매개변수를 변화시키지 않았다. 표 12에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 개별 용량군의 기준선으로부터 치료 종료까지의 변화에 기초하고, N은 완전 분석 세트의 환자의 수를 나타낸다.
[표 12]
Figure pct00016
혈장 L-시트룰린
파트 A+B의 통계 분석에서, 5 mg 아프라글루타이드는 17.6 μmol/L(95% CI 2.0~33.2; P=.031)의 조정된 평균만큼 절대 혈장 L-시트룰린을 증가시켰는데, 이는 65%(95% CI 15~115; P=.015)의 증가에 해당한다. 파트 A의 통계 분석에서, 5 mg 아프라글루타이드는 17.7 μmol/L(95% CI -6.3~41.7; P=.100)의 조정된 평균만큼 절대 혈장 L-시트룰린을 증가시켰는데, 이는 66%(95% CI -13~145; P=.077)의 상대 증가에 해당한다. 위약 대비 10 mg 용량에 대한 기준선으로부터의 변화 차이는 표 13에 나타낸 바와 같이 더 적었다. 표 13에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 개별 용량군의 기준선으로부터 치료 종료까지의 변화에 기초하고, N은 완전 분석 세트의 환자의 수를 나타낸다. 혈장 L-시트룰린의 절대 농도의 기준선으로부터의 개별 변화가 도 11에 플롯팅되어 있다. 기준선으로부터의 평균 변화 및 개별 환자 혈장 L-시트룰린 변화는 도 27에 플롯팅되어 있다. 혈장 시트룰린 수준의 용량-의존적 증가는 아프라글루타이드로 관찰되었는데, 첫 번째 용량 후 2일에 시작하였다. 도 28에 도시된 바와 같이, 위약과 비교하여 아프라글루타이드의 3가지의 매주 용량 후에 시트룰린 수준은 유의하게 증가하였다.
[표 13]
Figure pct00017
체중 및 신체 조성
파트 A+B의 분석의 경우, 5 mg 아프라글루타이드는 절대 및 상대 지방량을 각각 1.77 ㎏(95% CI 0.29~3.24; P=.024) 및 10%(95% 1~18; P=0.035)만큼 유의하게 증가시켰다. 지방량의 증가와 상응하여, 5 mg 아프라글루타이드는 체중을 1.9 ㎏(95% CI 0.1~3.7; P=.043)만큼 증가시켰다. 위약과 비교하여 임의의 용량군에 대한 탈지방 체중 또는 골 무기질 함량에서 변화가 발견되지 않았다. 파트 A의 통계 분석에서, 표 14에 제시된 바와 같이, 5 mg의 아프라글루타이드에 대해 증가된 지방량 및 체중의 경향이 관찰되었다. 표 14에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 개별 용량군의 기준선으로부터 치료 종료까지의 변화에 기초하고, N은 완전 분석 세트의 환자의 수를 나타낸다.
[표 14]
Figure pct00018
약동학
아프라글루타이드의 혈장 농도는 투약 후 증가하였으며, 최대 평균 농도는 투약 후 72시간에 측정되었다. 두 번째 용량 전의 아프라글루타이드의 평균 혈장 농도(Ctrough)는 5 mg 및 10 mg 치료 기간에서 각각 4.5 ng/mL 및 8.9 ng/mL이었다.
실시예 5의 요약
실시예 5에 기재된 결과는 대상체에 대한 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물의 투여가 안전하고, 내약성이 우수하며, 소변 부피의 증가를 포함하나 이에 제한되지 않는 장 유체 흡수의 유익한 변화를 유도하였음을 입증한다.
치료 관련 유해 사건은 경증 내지 중등도였고, GLP-2의 생리학적 효과에 상응하였다. 유해 사건에 대한 용량-의존성은 없었다. 주 1회만 투약 요법을 반영하여 주사 부위 반응이 거의 없었다. 치료 관련 복통 또는 복부 팽창의 사건은 없었다.
주 1회 및 5 mg 및 10 mg의 아프라글루타이드 용량 치료는 위약과 비교할 때 소변 배출량을 증가시켰다. 10 mg의 아프라글루타이드는 치료 종료 시 소변 나트륨 배설을 유의하게 증가시켰고, PS 부피(치료 종료 근처에서 평가됨)뿐만 아니라 구강 유체 섭취를 감소시켰다. 소변 나트륨 배설 및 구강 유체 섭취에 대해 5 mg 용량의 경우 유사한 경향이 관찰되었다.
종합적으로, 소변 부피의 이러한 증가는 증가된 장액 및 나트륨 흡수를 반영한다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이는 탈수, 나트륨 고갈 및 신장 장애 위험이 높은 SBS를 갖는 환자의 경우 중요한 효과이다. 유체 및 전해질 이상은 또한 이환율 및 입원의 원인일 수 있다.
4주의 비교적 짧은 치료 기간으로 인해, 체액 정체의 임상 징후가 존재할 경우 PS 부피의 감소가 이루어졌다. 장기간 아프라글루타이드 처리 동안, 소변 배출의 증가는 더 큰 유체 복합 효과에 의해 또한 입증되는 바와 같이 PS 부피의 추가 감소를 가능하게 할 수 있음이 고려된다. 5 mg의 아프라글루타이드 처리는 위약과 비교하여 8명의 환자 중 6명에서 상대 소변 배출량을 증가시켰고, PS 부피의 감소를 촉발하는 10% 증가를 능가하였다.
L-시트룰린의 혈장 농도는 두 활성 치료 기간 동안 증가하였다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이는 증가된 장세포 질량을 나타내고, 장 상피에 대한 아프라글루타이드의 장 성장촉진(intestinotrophic) 효과와 일치한다. 5 mg 치료 기간에서 소변 배출(27~29일 평가됨)에서 임상적으로 유의한 증가를 갖는 2명의 환자에서, 10 mg의 감소된 효과가 관찰되었다. 그러나 이러한 환자는 10 mg 치료 기간 동안 PS 부피 및 구강 유체 섭취(20~22일 평가됨)의 동반 감소를 가졌으며, 이는 소변 생산의 증가, PS 부피의 필요성 감소 및 구강 유체 섭취의 감소를 포함한 유익한 효과의 합계로 정의되는 양성 유체 복합 효과로 이어졌다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, SBS를 갖는 환자는 과도한 대변 나트륨 손실 및 만성 나트륨 고갈로 인해 2차 고알도스테론증을 겪을 수 있다. 실시예 5에 기재된 시험에서, 아프라글루타이드의 투여는 위약과 비교하여 두 용량군에서 알도스테론 수준을 감소시키는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이는 아프라글루타이드가 개선된 유체 및 나트륨 흡수로 인해 2차 고알도스테론증을 완화시킴을 나타낸다.
5 mg 아프라글루타이드 치료는 증가된 지방량 및 체중과 관련이 있었다. GLP-2 또는 GLP-2 유사체 t로 치료한 후 대상체에서 지방량 증가가 관찰된 것은 이번이 처음이다. 체중 증가는 지방량 및/또는 탈지방 체중의 상응하는 변화와 밀접한 관련이 있다.
실시예 5에 기재된 통계 분석을 2개의 버전으로 수행하였는데, 파트 A에서 5 mg과 위약을 비교하였고, 파트 A+B는 위약, 5 mg 및 10 mg을 포함하여 3가지 처리 사이의 대비를 추정하였다. 파트 A 및 파트 A+B 분석의 결과는 일반적으로 동일하였다.
요약하면, 실시예 5에 기재된 결과는 4주 동안 주 1회 5 및 10 mg의 아프라글루타이드 투약이 내약성이 우수하고 안전함을 입증한다. 결과는 또한 매주 투약과 함께 GLP-2 유사체의 임상 효과를 입증하였다. 아프라글루타이드의 주 1회 치료는 소변 배출량을 증가시키고, 테스트한 용량(5 및 10 mg) 둘 다에서 SBS 환자에서 장 재활의 다른 마커를 개선하였으나, 반응의 차이는 관찰되지 않았다. 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물은 매일 투여와 대조적으로, 주 1회 투여를 가능하게 함으로써 환자 관리 및 순응도에 기여할 수 있으며, 이는 결국 삶의 질을 개선할 수 있다. 감소된 주사 빈도는 환자 수용성을 증가시키고 주사 부위 반응의 위험을 감소시킬 수 있다. 이러한 결과는 아프라글루타이드 치료가 장 적응을 통해 장 흡수를 증가시킴을 나타낸다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이러한 결과는 생체 내 아프라글루타이드 치료는 SBS-IF 환자에서 장 습윤 중량 흡수를 개선할 수 있고, 따라서 치료 환경에서 구현될 수 있음을 나타낸다.
방법
시험 설계 및 참가자
실시예 5에 기재된 시험은 이중 맹검, 교차, 무작위화, 위약-대조, 2상 시험이었고, 개방 표지 요법에서 추가 치료 기간이 이어졌다. SBS-IF를 갖는 8명의 성인 환자(18세 이상 80세 이하)가 시험에 등록되었다. 환자 적격성은 스크리닝 방문 동안 평가되었다. 주요 포함 기준은 다음과 같았다: 공장조루술 또는 회장루 형성술에 의한 소장의 외과적 절제에 대해 이차적으로 SBS를 갖는 환자, 마지막 장 절제 후 적어도 6개월, 마지막 18개월 이내에 기록된 바와 같이 적어도 1500 g/일의 대변 배출 및 환자의 의료 기록에 따라 12개월 이상 동안 주당 3배 이상의 PS-주입. 이들이 염증성 장 질환에서 활성의 임상 징후, 5년 이내의 암 이력 또는 부적절한 간, 신장 또는 심장 기능이 있는 경우 환자는 제외되었다. 마지막 3개월 이내에 천연 GLP-2 또는 GLP-2 유사체를 받은 경우의 환자도 제외되었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 시험은 두 부분으로 구성되었다: 파트 A 및 B. 파트 A는 이중 맹검, 교차, 무작위화, 위약-대조 시험이었다. 파트 A에서, 환자는 4주 동안 주 1회 5 mg의 아프라글루타이드 또는 위약으로 처리되었다. 6 내지 10주의 세척 기간 후, 교대 치료가 주어졌다. 파트 A 다음에는 환자가 파트 B에 들어가기 전에 6 내지 10주의 제2 세척 기간이 이어졌다. 파트 B는 4주 동안 주 1회 주어진 10 mg의 아프라글루타이드의 개방 표지 투약 요법이었다. 10 mg 투약의 안전성 및 내약성을 조사하기 위해 추가의 개방 표지 치료 기간(파트 B)을 포함시켰다. 각 치료 기간 동안 절차는 일관되었다. 시험 약물은 재구성을 위한 동결 건조된 분말로서 제공되었고, 복부 영역에 피하 주사로서 투여되었다.
절차
안전성 평가는 각 치료 기간에 대해 수행되었고 주사 부위 반응, 활력 징후, 혈액 샘플, 심전도(ECG), 딥스틱 소변검사, 체중 및 간 효소에 대한 관찰을 포함하였다. 이들은 표 15에 제시된 바와 같이, 기준선, 시험 약물의 각 주사 동안(용량 전 및 순차적 시점), 최초 치료 주사 후 4일, 각 치료 기간의 종료 시 및 시험 종료 시 마지막 투약 후 4~6주에서 수행되었다. 또한, 간 효소를 각 약물 투여 전에 측정하였다.
[표 15]
Figure pct00019
효능 평가를 29일의 각 치료 기간에 대해 수행하였다. 환자는 특정 시점에서의 PS 부피 투여, 소변 수집 및 구강 유체 섭취를 기록하기 위한 종이 일지를 받았다. 환자는 기준선(-2일 내지 1일), 최초 치료 주사 직후(1일 내지 3일) 및 치료 기간 종료 시(27~29일, 시험 약물의 네 번째 투여 후 5일 후)에 가정 48시간 소변 수집을 수행하였다. 부피 마킹이 있는 소변 용기 내에 환자가 소변을 수집하였고, 48시간 소변 부피를 일지에 기록하였다. 48시간 수집을 완료한 후, 환자는 대략 100 mL의 소변을 용기에서 샘플로 옮겼고, 이를 다음 환자 방문 시 전달하였다. 이어서, 샘플 중 나트륨의 농도에 수집된 소변의 총 부피를 곱하여 48시간당 배설된 나트륨의 양을 계산하였다. 각 소변 수집 동안, 매주 PS 부피와 함량 및 매일의 구강 유체 섭취가 일정하게 유지되었다. 이들이 일정하게 유지되었기 때문에, 소변 부피의 증가는 증가된 유체 흡수의 징후였다. 기준선 방문(-3일)에서의 습관적 구강 유체 섭취에 기초하여 24시간 음용 메뉴를 생성하도록 환자에게 알렸다. 환자는 각각의 소변 수집 동안 이들의 음용 메뉴를 준수해야 했고, 수반되는 48시간 구강 유체 섭취를 각각의 소변 수집 동안 일지에 기록했다.
20 내지 22일에, 환자에게 48시간 동안 자발적인 구강 유체 섭취를 기록하도록 알렸다. 이 측정은 증가된 장 흡수가 자발적인 구강 유체 섭취의 감소와 관련이 있는지를 조사하기 위해 포함되었다.
4일 내지 24일에, 조사관에 의해 임상적으로 필요한 것으로 간주되는 경우 PS 부피 감소가 허용되었다. 4주의 비교적 짧은 치료 기간으로 인해, 환자가 체액 정체의 임상 징후(예컨대, 부종 및 과도한 의도하지 않은 체중 증가와 같음)가 있는 경우에는 PS 부피가 감소되었다. PS 부피 감소는 20~22일 동안 평가되었다. 환자는 치료 소변 수집 종료 동안 기준선 PS 부피 및 함량으로 복귀하였다(27~29일). 양성자-펌프 억제제, 로페라미드 및 오피에이트를 포함하는 병용 약제는 변하지 않고 시험 전반에 걸쳐 안정하게 유지되었다. 필요한 경우, 환자와 조사자 사이의 논의에 기초하여 치료 기간 사이에 음용 메뉴 및 처방된 PS 부피 및 함량의 조정이 이루어질 수 있었다.
체중은 수평 플랫폼 저울을 사용하여 측정하였다. 신체 조성은 기준선 및 치료 종료 시 이중 에너지 x-선 흡광분석법(Norland XR-36 DXA 농도계, 미국 위스콘신 주 포드 애킨슨 소재)에 의해 측정하였다.
아프라글루타이드의 혈장 농도 및 장세포 질량의 마커인 공복 혈장 L-시트룰린의 분석을 위한 혈액 샘플은 기준선, 제1 치료 주사 및 제2 치료 주사 동안, 제1 치료 주사 4일 후 및 치료 종료 시 수집되었다. 공복 혈장 L-시트룰린을 위한 혈액 샘플은 또한 시험 종료 시 마지막 투약 후 4 내지 6주 후에 수집되었다. 항-아프라글루타이드 항체에 대한 혈액 샘플은 기준선, 치료 종료 시 및 시험 종료 시 마지막 투약 후 4 내지 6주 후에 수집되었다.
소변 나트륨 농도의 분석
소변 나트륨을 10 mmol/리터의 정량 하한의 이온-특이적 전극 시스템(Roche Diagnostics, 미국 인디애나 주 인디애나폴리스 소재)을 사용하여 COBAS 8000 모듈식 분석기 시리즈를 사용하여 측정하였다. 소변 나트륨이 정량 하한 미만인 경우, 샘플을 불꽃 광도법에 의해 분석하였다.
아프라글루타이드 혈장 농도 및 L-시트룰린의 분석
아프라글루타이드 및 L-시트룰린을 검증된 LC-MS 기반 방법을 사용하여 정량화하였다. 아프라글루타이드의 경우, 분석 방법은 온전한 아프라글루타이드 분자 및 이의 내부 표준물의 고상 추출 정제를 사용하였다. AB Sciex API 5000 사중극자 질량 분석기를 사용하여 MS/MS 검출을 구비한 역상 HPLC를 사용하여 화합물을 확인하고 정량화하였다. 5.00 ng/mL의 정량 한계 미만의 샘플의 경우, AB Sciex API 5500 사중극자 질량 분석기를 사용하여 MS/MS 검출을 구비한 역상 UHPLC를 사용하여 화합물을 확인하고 정량화하였다. L-시트룰린의 경우, 분석 방법은 L-시트룰린 및 이의 내부 표준물의 단백질 침전 추출을 사용하였다. AB Sciex API 5000 사중극자 질량 분석기를 사용하여 MS/MS 검출을 구비한 Hilic HPLC를 사용하여 화합물을 확인하고 정량화하였다.
항-아프라글루타이드 항체의 분석
완전히 검증된 ELISA 방법을 3단계 분석 접근법에 따라 혈청 내 항-아프라글루타이드 항체의 검출에 사용하였다. 제1 단계에서, 샘플 및 대조군에 존재하는 항-아프라글루타이드 항체는 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 아프라글루타이드에 결합되었다. 이어서, 결합된 항-아프라글루타이드 항체를 단백질 A/G 및 단백질 L로 검출하였다. 검증된 스크리닝 컷-포인트 초과의 신호를 갖는 샘플을 잠재적으로 양성으로 간주하고, 제2 단계에서 확인 분석법으로 테스트하였다. 이를 위해, 샘플을 상기 기재된 분석법에서 테스트하기 전에 과량의 아프라글루타이드로 전처리하였다. 검증된 확인 컷-포인트 이상의 신호의 억제는 항체의 존재를 확인시켜 주었다. 그러면, 샘플을 항-아프라글루타이드 항체 양성으로 기록하였다. 다음으로, 확인된 모든 양성 샘플의 연속 희석에 의해 역가를 결정하였다.
통계 분석
각 환자가 대상체간 변동성을 제거하고 혼란스러운 공변량의 영향을 줄이기 위해 자체 제어 역할을 하는 교차 설계가 적용되었다.
안전성은 적어도 1회 용량의 시험 약물(활성 또는 위약)을 받은 모든 환자에서 평가되었다. 효능은 적어도 하나의 유효한 기준선 후 효능 측정을 갖는 모든 무작위화 환자를 포함하여 변형된 치료 의도 원리에 따라 평가되었다(완전 분석 세트).
2개의 상이한 통계 분석을 수행하였다: 파트 A 단독 버전 및 파트 A+B 전체 버전. 파트 A 버전은 2×2 교차 설계에 기초한 반면, 파트 A+B 버전은 3개의 상이한 처리(위약, 5 mg 및 10 mg) 사이의 대조를 추정하기 위해 기간 효과를 가정하지 않았다. 통계 분석의 파트 A 및 파트 A+B 버전 둘 모두가 결과에 포함되었다. 파트 A의 분석을 무작위화하고 맹검 처리하였다. 파트 A+B의 분석을 포함시켜 위약, 5 mg 및 10 mg 사이의 비교를 수행하였다. 공분산의 분석을 사용하여 아프라글루타이드의 효과를 평가하였다. 결과 변수, 구강 유체 섭취 및 PS 부피의 기간-특이적 기준선 측정을 분석에 포함시켰다. 모든 통계 시험은 5% 유의성 수준에서 양측 검정을 사용하여 수행되었다. 대략 95% 신뢰 구간과 p-값으로 추정치를 제시하였다. SAS 버전 9.4를 분석에 사용하였다.
실시예 6: 2상 대사 균형 시험
하기 비제한적인 실시예는 단장 증후군 장 부전 및 단장 증후군 장 부전를 앓는 대상체가 본 개시내용의 아프라글루타이드 제형을 사용하여 치료된 2상 임상 시험으로부터의 결과를 기재한다. 이 2상 시험은 본 개시내용의 아프라글루타이드 제형의 안전성 및 효능을 조사하였다.
글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2) 유사체를 사용한 치료는 단장 증후군(SBS) 환자에서 장 적응을 촉진한다. 아프라글루타이드는 주 1회 투약을 가능하게 하도록 설계된 신규한 장기-작용성 GLP-2 유사체이다. 이 2상 시험은 SBS 장 부전(SBS-IF) 및 SBS 장 기능저하(SBS-II)를 앓는 환자에서 주 1회 5 mg의 아프라글루타이드의 안전성 및 효능을 조사하였다. 이러한 개방 표지 시험에서, SBS-IF(n=4) 또는 SBS-II(n=4) 및 ≥1500 g/일의 대변 습윤 중량을 갖는 8명의 성인 환자를 4주 동안 주 1회 피하 5 mg의 아프라글루타이드로 치료하였다. 안전성은 1차 종점이었다. 2차 종점으로, 습윤 중량의 장 흡수, 에너지(폭탄 열량측정법에 의해 측정) 및 72시간 대사 균형 연구를 사용한 대변 습윤 중량 및 소변 생성뿐만 아니라 전해질의 기준선으로부터의 변화를 조사하였다. 일반적인 치료-관련 유해 사건은 GLP-2의 생리학적 효과와 일치하였고, 감소된 소공 배출(n=6), 소공 합병증(n=6), 구역(n=5), 고창(n=4), 다뇨증(n=3) 및 복통 (n=3)을 포함하였다. 주 1회 아프라글루타이드는 에너지, 습윤 중량 및 전해질 흡수를 유의하게 증가시켰고, 대변 습윤 중량은 감소시켰으며, 소변 생산을 증가시켰다(표 16).
[표 16]
Figure pct00020
결과
9명의 환자를 스크리닝하였다. 1명의 환자는 대변 배출 ≥1,500 g/일 및 소변 부피 < 2,000 mL/일의 포함 기준을 충족시키지 않았다(기준선 대사 균형 연구 동안 평가됨). 8명의 환자가 시험에서 투약되었다. 모든 8명의 환자는 시험을 완료하였고, 도 13에 제시된 바와 같이, 안전성 및 완전 분석 세트를 구성하였다. 환자의 인구 통계 및 기준선 특징은 표 17에 요약되어 있다. 표 17의 데이터는 평균 (SD) 또는 N (%)이고, 비경구 지원(PS)은 주간 평균에 기초하여 시험 참가 시 예정된 PS였다.
[표 17]
Figure pct00021
안전성 결과
모든 환자는 적어도 하나의 치료 관련 유해 사건을 경험하였다. 유해 사건은 경증 내지 중등도였다. 일반적인 유해 사건은 표 18에 요약되어 있다(데이터는 N 또는 N (%)이다). 유해 사건은 2명 초과의 환자에서 발생하였고, 감소된 위장관 소공 배출(n=6), 소공 합병증(n=6), 위장관 소공 합병증(n=5), 구역(n=5), 비정상적인 위장관 소공 배출(n=4), 고창(n=4), 다뇨증(n=3) 및 복통(n=3)을 포함하였다. 1명의 환자는 1회 주사 후 일시적 주사 부위 반응(국소적 홍반 및 소양증)을 경험하였는데, 이는 항-아프라글루타이드 항체의 존재와 관련이 없었다. 3명의 환자는 임상 시험에서 천연 GLP-2 또는 또 다른 GLP-2 유사체를 받았다(시험 포함 전 최소 16개월). 총 3건의 중대한 유해 사건(SAE)이 두 명의 환자에서 발생하였다. 1건의 SAE는 입원을 요하는 복통 사건으로, 시험 약물과 관련된 것으로 평가되었다. 복통은 보존적 치료를 받았고 환자는 24시간 미만 이내에 퇴원하였다. 일시 중단 및 감소된 용량으로의 재도전으로 환자는 시험을 완료할 수 있었다. 나머지 2건의 SAE는 아프라글루타이드와 관련된 것으로 간주되지 않았다. 이들은 SBS-II 환자에서의 탈수로 인한 급성 신장 손상의 1건 및 SBS-IF 환자에서의 CRBSI의 1건을 포함하였다. 2명의 추가 환자는 시험을 완료하기 위해 용량 감소를 필요로 하였다. 1명의 SBS-II 환자는 제1 약물 투여 후 체액 정체의 징후를 가졌고, 따라서 제2 및 제3 투여는 감소된 용량으로 주어졌다. 제4/마지막 투여는 추가 합병증 없이 완전 용량(5 mg)으로 제공되었다. 1명의 환자는 제1 약물 투여 후 변비를 경험하였고, 결과적으로, 제2 투여는 감소된 용량으로 제공되었다. 완전 용량은 추가 합병증 없이 제3 및 제4/마지막 투여 동안 재도입되었다.
[표 18]
Figure pct00022
활력 징후, 혈액 샘플, ECG, 딥스틱 소변검사 또는 체중에서 안전성 문제가 발생되지 않았다. 1명의 SBS-IF 환자는 시험 동안 항-아프라글루타이드 항체를 발달시켰다. 항체는 4~6주 세척 후 음성이었다. 환자는 2016년에 임상 시험 환경에서 GLP-2 유사체로 이전에 치료받았다. 약동학 프로파일, 아프라글루타이드에 대한 약력학 반응, 또는 유해 사건의 수 또는 기간에 대한 항-아프라글루타이드 항체의 효과가 검출되지 않았다. 어떠한 환자도 유해 사건으로 인해 시험을 중단하지 않았고 사망은 발생하지 않았다.
효능 종점
습윤 중량
식이 섭취, 대변 배출, 소변 및 흡수의 습윤 중량의 아프라글루타이드로 치료 후 기준선으로부터의 개별 변화가 도 14에 도시되어 있다. 아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 식이 섭취의 습윤 중량을 변화시키지 않았다. 표 19에서, 데이터는 조정된 평균 (95% CI)으로 표시되어 있고, 계산은 기준선으로부터 치료 종료까지의 변화에 기초한다. 아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 습윤 중량의 장 흡수를 741 g/일(95% CI 194~1287; P=.015)만큼 증가시켰다. 아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 대변 배출을 680 g/일(95% CI -1200~-159; P=.018)만큼 감소시키고, 소변 생산을 560 g/일(95% CI 72~1048; P=.030)만큼 증가시켰다.
[표 19]
Figure pct00023
전해질
아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 나트륨 및 칼륨의 흡수를 각각 38 mmol/일(95% CI 3~74; P=.039) 및 18 mmol/일(95% CI 4~32; P=.020)만큼 증가시켰다. 소변 나트륨 및 칼륨 배설은 표 19에 제시된 바와 같이 각각 27 mmol/일(5~49; P=.024) 및 13 mmol/일(95% CI 6~20; P=.003)만큼 증가하였다. 표 19에 제시된 바와 같이 마그네슘 및 칼슘의 흡수 또는 소변 배설에는 변화가 없었다. 표 19에 제시된 바와 같이 식이 섭취 및 대변 배출의 전해질 함량은 변하지 않았다. 전해질 흡수의 기준선으로부터의 개별 변화가 도 15에 도시되어 있다.
에너지 및 다량영양소
도 16은 식이 섭취, 대변 배출 및 흡수의 에너지 함량의 기준선으로부터의 개별 변화를 보여준다. 아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 총 식이 에너지 섭취 또는 임의의 개별 다량영양소를 변화시키지 않았다. 기준선과 비교하여, 아프라글루타이드는 표 19에 제시된 바와 같이 에너지의 장 흡수를 1,095 kJ/일(95% CI 196~1,994; P=.024)만큼 증가시켰다. 에너지 흡수의 개선을 시사하며, 대변 배출의 에너지 함량은 표 19에 제시된 바와 같이, 941 kJ/일(95% CI -2,438~556 P=.181)만큼 감소하였다. 탄수화물 및 지질 흡수는 표 19에 제시된 바와 같이 각각 518 kJ/일(95% CI 112~924; P=.019) 및 376 kJ/일(95% CI 61~691; P=.026)만큼 유의하게 증가하였다. 단백질 흡수는 표 19에 제시된 바와 같이 104 kJ/일(95% CI -205~412; P=.453)만큼 증가하였다. 다량영양소 흡수의 개별 변화가 도 17에 플롯팅되어 있다.
체중 및 신체 조성
체중은 아프라글루타이드 치료의 4주 후에 1.8 ㎏(95% CI 0.4~3.1; P=.016)만큼 증가하였다. 탈지방 체중은 1.7 ㎏(95% CI 0.8~2.6; P=.003)만큼 유의하게 증가하였고, 지방량은 1.1 ㎏(95% CI -2.1~-0.0; P=.044)만큼 감소하였다. 골 무기질 함량에는 유의한 차이가 없었는데, 이는 -20 g(95% CI -58~19; P=.268)만큼 변하였다.
시트룰린
기준선과 비교하여, 아프라글루타이드는 L-시트룰린의 절대 및 상대 혈장 농도를 각각 15.2 μmol/L(95% CI 3.3~27.1; P=.019) 및 66%(95% CI 3~128; P=.043)만큼 증가시켰다.
약동학
아프라글루타이드의 혈장 농도는 투약 후 빠르게 증가하였으며, 최대 평균 농도는 평균 29.5시간 후 118.0 ng/mL에 도달하였다. 평균 제거 반감기는 27.0시간이었고 평균 제거율은 0.9 L/h였다.
실시예 6의 요약
실시예 6에 기재된 결과는 주 1회 투여된 5 mg의 아프라글루타이드가 4주 치료 후 SBS-II 및 SBS-IF를 갖는 환자에서 안전하고 내약성이 우수하며, 임상 환경에서, PS에 대한 필요성을 제거하거나 감소시킬 수 있는, 장 흡수에 긍정적인 효과를 나타냈음을 입증한다.
유해 사건은 GLP-2의 공지된 생리학적 효과와 일치하였다. 빈번하게 보고된 관련 유해 사건은 위장관 기원의 것이었지만, 일반적으로 경미하고 일시적이었다.
아프라글루타이드는 습윤 중량, 에너지 및 전해질(나트륨 및 칼륨)의 장 흡수를 유의하게 증가시켰다. 흡수의 개선은 배설물 습윤 중량의 유의한 감소 및 소변 생산 및 소변 전해질 배설(나트륨 및 칼륨)의 증가를 동반하였다. 이 시험에서 발견된 소변 생산의 변화는 PS 감소를 가능하게 하거나, SBS-IF 환자에서 장관 자율성을 회복시키는 데 도움이 되는 것으로 임상적으로 관련된 것으로 간주된다. 또한, 이러한 개선은 결국 SBS-II 환자에서 간헐적 또는 만성 IF가 발생할 위험을 감소시키고, 흡수 장애의 증상 부담을 완화시킬 수 있다고 고려된다.
아프라글루타이드의 약동학 프로파일은 주 1회 투약 요법을 뒷받침하였다.
아프라글루타이드는 장 에너지 흡수를 정량화하기 위한 최적 표준 실험실 방법으로 간주되는 폭탄 열량측정법에 의해 측정 시 SBS 집단에서 전체 환자 스펙트럼에 걸친 에너지의 흡수를 개선하기 위한 최초의 GLP-2 유사체이다. 개별 다량영양소의 경우, 아프라글루타이드는 탄수화물 및 지질의 흡수를 증가시킨 반면, 단백질 흡수는 변하지 않았다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임상 개발의 나중 단계에서, 에너지 요구 사항이 감소함에 따라 PS를 그만두게 하는 것은 개선된 에너지 흡수의 증거로 간주된다.
아프라글루타이드의 PK 프로파일은 에너지 흡수에 대한 개선된 효과를 설명할 수 있는 일관된 노출을 허용하였다.
아프라글루타이드는 체중과 탈지방 체중을 유의하게 증가시키고, 지방량을 감소시켰는데, 이는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 수화 상태에서의 가능한 개선을 나타낸다.
아프라글루타이드는 식이 섭취의 습윤 중량 또는 에너지 함량을 변화시키지 않았다. 구강 유체 섭취는 고정되었지만, 고체의 식이 섭취는 제한되지 않았다. GLP-2는 건강한 인간에서 식욕 또는 식후 포만감에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 감소된 식이 섭취는 장 손실을 보상하기 위해 과식증에 의존하는 SBS 환자에서 바람직하지 않은 부작용일 수 있었다. 장기간 GLP-2 치료는 동일한 흡수도를 유지하면서 환자가 식이 섭취를 감소시키는 것을 허용하였다. 따라서, 아프라글루타이드의 투여는 특히 중증 SBS-II 환자에서 주요 증상인 심각한 과식증에 대한 필요성을 완화시킬 수 있는 것으로 예상된다.
아프라글루타이드는 장세포 질량의 마커인 혈장 L-시트룰린을 유의하게 증가시켜, 이의 예상된 적응촉진 효과를 뒷받침한다. GLP-2는 또한 위장 운동성을 억제하고 위산 분비를 감소시켜 장세포의 내강 내용물에 대한 노출을 증가시킬 수 있다. 장간막 혈류는 또한 GLP-2에 의해 자극될 수 있으며, 이는 영양소 흡수를 증가시킬 수 있다. GLP-2는 또한 동물 연구에서 제시된 바와 같이 수송 단백질을 상향조절할 수 있다.
실시예 6에 기재된 결과는 4주 동안 매주 투여된 5 mg의 아프라글루타이드 치료가 안전하고 SBS-IF 및 SBS-II 환자에서 내약성이 우수함을 나타낸다. 이러한 결과는 처음으로 주 1회 GLP-2 유사체가 습윤 중량, 에너지, 전해질의 흡수를 유의하게 개선하고 소변 생산을 증가시켰음을 입증한다. 아프라글루타이드는 주사 부담을 줄이고 환자 관리 및 순응도에 기여할 수 있는 매주 주사만을 필요로 한다. 감소된 주사 빈도는 또한 환자 수용성을 증가시키고 주사 부위 반응의 위험을 감소시킬 수 있다.
아프라글루타이드에 의한 주 1회 치료는 유체, 전해질 및 에너지의 장 흡수를 증가시켰다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이러한 결과는 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물을 이용한 환자의 치료가 SBS-IF 환자에서 장 습윤 중량 흡수 및 에너지를 개선할 수 있고, 따라서 치료 환경에서 구현될 수 있음을 나타낸다.
방법
시험 설계 및 참가자
SBS를 갖는 총 9명의 성인 환자(18세 이상 80세 이하)를 스크리닝하였고, 그 중 8명이 시험에 등록하였다: 4명의 환자가 SBS-II를 가졌고 4명의 환자가 SBS-IF를 가졌다. 질환 스펙트럼에 걸친 아프라글루타이드의 안전성 및 효능을 조사하기 위해 환자의 두 하위군을 포함시켰다. 환자 적격성은 스크리닝 방문 동안 평가되었다. 주요 포함 기준은 결장이 있거나 없는 소장의 외과적 절제에 이차적인 SBS; 마지막 수술적 장 절제 이후 적어도 6개월; 및 대변 습윤 중량 배출 ≥1,500 g/일 및 소변 부피 생산 < 2000 mL/일로 정의되는 심각한 정도의 흡수 장애였다. 기준선 검사 동안 대변 배출 및 소변 부피 생산을 확인하였다. 염증성 장 질환에서 활성의 임상 징후, 5년 이내의 암 이력 또는 부적절한 간, 신장 또는 심장 기능이 있는 경우 환자는 제외되었다. 환자는 또한 임신부 또는 수유부, 양성 HIV, B형 또는 C형 간염 테스트 결과가 있는 경우, 스크리닝 방문 전 1개월 이내에 입원하였거나, 마지막 3개월 이내에 천연 GLP-2 또는 GLP-2 유사체를 받은 경우 제외되었다.
절차
환자는 4주 동안 주 1회 5 mg의 아프라글루타이드로 치료되었다. 아프라글루타이드는 주사 전에 멸균수에서 재구성을 위한 동결 건조된 분말로서 제공되었고, 치료는 복부 영역에 피하 주사로서 투여되었다. 72시간 대사 균형 연구를 기준선 및 치료 기간의 종료 시(제4 및 마지막 아프라글루타이드 주사 1일 후에 시작)에 수행하였다. 각각의 72시간 대사 균형 연구는 5일의 병원 입원 동안 수행되었다. 입원 당일, 습관적 구강 유체 섭취에 기초하여 24시간 음용 메뉴를 생성하도록 환자에게 지시하였다. 각 균형 연구 동안 음용 메뉴를 따라야 했다. 입원 둘째 날, 환자가 소변을 비우고 소공 백을 비우거나 배변한 직후에, 균형 연구가 개시되었다. 환자는 24시간 후에 교체된 각각의 양동이에 대변 배출, 소변 및 식이 섭취의 정확한 복본(유체와 고체 분리)을 수집하도록 지시받았다. 환자는 음식에 자유롭게 접근할 수 있었지만 기준선 및 치료 후 대사 균형 연구 기간 동안 일일 PS(부피 및 함량) 및 구강 유체 섭취는 일정하게 유지되었다. 일일 PS 및 구강 유체 섭취는 기준선 및 치료 후 측정이 치료 효과를 측정하는 것과 관련하여 비슷함을 보장하기 위해 일정하게 유지되었다. 일일 PS 및 미리 정의된 음용 메뉴 준수는 입원 동안 문서화되었다. 양성자 펌프 억제제, 로페라미드 및 오피에이트를 포함하는 병용 약제는 시험 전반에 걸쳐 변하지 않았다.
양동이의 내용물을 칭량하고, 건조 물질로 처리하고, 전술한 바와 같이 분석하였다: 폭탄 열량계에 의한 에너지, Kjeldahl 방법에 의한 질소, 수정된 Van de Kamer 적정 기술에 의한 지질, Englyst 방법에 의한 탄수화물, 불꽃 광도계에 의한 나트륨 및 칼륨 및 원자 흡수 분광법에 의한 칼슘 및 마그네슘. 24시간 평균은 세 차례의 24시간 기간을 기준으로 계산되었다. 절대 변화는 기준선과 치료 후 값 사이의 차이로서 계산되었다. 기준선 값으로 나눈 절대 변화에 100을 곱하여 상대 변화를 계산하였다.
체중은 수평 플랫폼 저울을 사용하여 측정하였다. 신체 조성은 기준선 및 치료 후에 이중 에너지 x-선 흡광분석법(Norland XR-36 DXA 농도계, Norland, 미국 위스콘신 주 포드 애킨슨 소재)에 의해 측정하였다.
제1, 제2 및 제4 아프라글루타이드 주사가 병원에서 수행되었다. 안전성 평가는 주사 부위 반응, 활력 징후, 혈액 샘플, 심전도(ECG), 소변검사 및 체중에 대한 관찰을 포함하였다. 이들은 표 20에 제시된 바와 같이, 기준선, 시험 약물의 각 주사 동안, 제1 주사 후 4일, 치료 종료 시 및 시험 종료 시 마지막 투약 후 4~6주 후에 수행되었다. 간 효소를 각 약물 투여 전에 측정하였다.
[표 20]
Figure pct00024
아프라글루타이드의 혈장 농도 및 장세포 질량의 마커인 공복 L-시트룰린의 혈장 농도의 분석을 위한 혈액 샘플은 기준선, 제1 및 제2 주사 동안(용량 전 및 순차적 시점), 제1 주사 4일 후 및 치료 종료 시 수집되었다. 아프라글루타이드 약동학을 위한 혈액 샘플링도 96시간에 걸쳐 제4 및 마지막 주사 후에 수행되었다. 공복 혈장 L-시트룰린을 위한 혈액 샘플은 또한 시험 종료 시 마지막 투약 후 4 내지 6주 후에 수집되었다. 항-아프라글루타이드 항체에 대한 혈액 샘플을 기준선, 치료 종료 시 및 4~6주의 추적조사 방문 시 수집하였다. 모든 8명의 환자는 기준선에서 항-아프라글루타이드 항체에 대해 음성으로 테스트되었다.
결과
이 시험의 1차 종점은 안전성이었다. 2차 종점은 식이 섭취, 대변 배설 및 습윤 중량의 흡수, 에너지, 다량영양소 및 전해질, 소변 생산, 소변 전해질 배설, 체중, 신체 조성, 골 무기질 함량, 혈장 L-시트룰린의 기준선으로부터의 절대 및 상대 변화 및 약동학 프로파일이었다. 혈장 L-시트룰린의 기준선으로부터의 변화를 제외하고, 본 개시내용의 범위에서 절대 변화만 제시되었다.
아프라글루타이드 및 L-시트룰린의 혈장 농도 분석
아프라글루타이드 및 L-시트룰린을 검증된 LC-MS 기반 방법을 사용하여 정량화하였다. 아프라글루타이드의 경우, 분석 방법은 온전한 아프라글루타이드 분자 및 이의 내부 표준물의 고상 추출 정제를 사용하였다. AB Sciex API 5000 사중극자 질량 분석기를 사용하여 MS/MS 검출을 구비한 역상 HPLC를 사용하여 화합물을 확인하고 정량화하였다. 5.00 ng/mL의 정량 한계 미만의 샘플의 경우, AB Sciex API 5500 사중극자 질량 분석기를 사용하여 MS/MS 검출을 구비한 역상 UHPLC를 사용하여 화합물을 확인하고 정량화하였다. L-시트룰린의 경우, 분석 방법은 L-시트룰린 및 이의 내부 표준물의 단백질 침전 추출을 사용하였다. AB Sciex API 5000 사중극자 질량 분석기를 사용하여 MS/MS 검출을 구비한 Hilic HPLC를 사용하여 화합물을 확인하고 정량화하였다.
항-아프라글루타이드 항체의 분석
완전히 검증된 ELISA 방법을 3단계 분석 접근법에 따라 혈청 내 항-아프라글루타이드 항체의 검출에 사용하였다. 제1 단계에서, 샘플 및 대조군에 존재하는 항-아프라글루타이드 항체는 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 아프라글루타이드에 결합되었다. 이어서, 결합된 항-아프라글루타이드 항체를 단백질 A/G 및 단백질 L로 검출하였다. 검증된 스크리닝 컷-포인트 초과의 신호를 갖는 샘플을 잠재적으로 양성으로 간주하고, 제2 단계에서 확인 분석법으로 테스트하였다. 이를 위해, 샘플을 상기 기재된 분석법에서 테스트하기 전에 과량의 아프라글루타이드로 전처리하였다. 검증된 확인 컷-포인트 이상의 신호의 억제는 항체의 존재를 확인시켜 주었다. 그러면, 샘플을 항-아프라글루타이드 항체 양성으로 기록하였다. 다음으로, 확인된 모든 양성 샘플의 연속 희석에 의해 역가를 결정하였다.
통계 분석
기준선으로부터 치료 종료까지의 조정된 평균 변화의 통계 시험을 짝비교 t-검정을 사용하여 분석하였다. 모든 통계 시험은 5% 유의성 수준에서 양측 검정을 사용하여 수행되었다. 대략 95% 신뢰 구간과 p-값으로 추정치를 제시하였다. SAS 버전 9.4를 분석에 사용하였다.
실시예 7: 약동학/약력학 평가
인구 통계 및 기타 기준선 특징
연구에는 11명의 여성 및 13명의 남성이 포함되었다. 인구 통계 및 기준선 데이터는 표 21에 요약되어 있다. 관련 의학 이력은 보고되지 않았다. 가장 빈번하게 보고된 이전 병용 약제는 피임에 관한 것이었다. 첫 번째 투약 후, 가장 빈번하게 보고된 병용 약제는 파라세타몰이었다. 치료군 사이에 병용 약제의 관련 차이가 나타나지 않았다.
[표 21]
Figure pct00025
치료 순응도 측정
치료는 임상 직원의 구성원에 의해 대상체에게 피하(SC) 투여되었으며, 완전한 치료 순응도가 존재하였다.
약력학 및 효능 결과
용량 수준당 아프라글루타이드의 첫 번째 용량 후 시간에 대한 혈장 시트룰린 농도는 도 18에 제시되어 있다. 기준선으로부터의 변화에 대한 상응하는 최소 제곱(LS) 평균 플롯이 도 19에 제공되어 있다. 시트룰린의 약동학적 매개변수의 요약은 표 22에 제공되어 있다.
아프라글루타이드의 약력학 효과를 평가하기 위해 내인성 마커 시트룰린을 선택하였다. 시트룰린은 모든 기준선 및 용량-후 샘플에서 검출되었다. 3개의 기준선 시트룰린 샘플은 스크리닝과 제1 투약일 사이의 2회의 기준선 방문 동안 및 제1 투약일의 투약 전에 수득되었다. 24명의 대상체 중 13명은 3개의 기준선 샘플에 대해 <0.5 ㎍/mL의 차이를 보였고 가장 작은 차이는 10 mg을 투여한 대상체에서 관찰된 0.061 ㎍/mL였다. 다른 5명 및 4명의 대상체는 각각 기준선 평가에 걸쳐 0.5~1 내지 1~2 ㎍/mL의 차이를 보였다. 나머지 2명의 대상체는 차이가 >2 ㎍/mL였으며 가장 큰 차이는 1 mg을 투여한 대상체에서 관찰된 2.762 ㎍/mL였다. 기준선에서, 평균 시트룰린 범위는 위약에 대해 5.3825~5.6207 ㎍/mL, 1 mg의 아프라글루타이드에 대해 5.3900~6.2028 ㎍/mL, 5 mg의 아프라글루타이드에 대해 4.8983~5.3023 ㎍/mL 및 10 mg의 아프라글루타이드에 대해 5.0730~5.4690 ㎍/mL였다. 위약군에서, 평균 시트룰린 농도는 4.9735 내지 5.8253 ㎍/mL 범위로, 시험에 걸쳐 비교적 안정적으로 유지되었다.
아프라글루타이드의 첫 주 SC 투여 후, 시트룰린은 용량 의존적으로 증가하여, 최고 시트룰린 수준이 4일 또는 7일 후에 측정되었는데, 1 mg 군에서 2일 후에 최대 시트룰린 농도에 도달한 1명의 대상체는 예외였다. 가장 높은 평균 시트룰린 값은 1, 5, 10 mg에서 각각 6.3920 ㎍/mL(4일 후), 7.1933 ㎍/mL(4일 후) 및 7.8487 ㎍/mL(7일 후)인 반면, 위약의 경우 5.8325 ㎍/mL(1일 후)였다.
각 투약 간격의 끝에서의 농도인 R용량 전을 각 용량에 대해 평가하였고, 이는 일반적으로 시트룰린 수준이 전체 치료 기간에 걸쳐 유사하다는 것을 보여주었다(표 22).
아프라글루타이드의 6번째 및 마지막 주간 SC 투여 후, 모든 용량 수준, 특히 최고 용량에서 증가가 관찰되었다. 평균 Rmax는 각각 1, 5 및 10 mg의 마지막 용량 후 2.0, 3.9 및 3.9일에 도달한 7.1702, 8.1577 및 8.7254 ㎍/mL이었다(표 22). 상응하는 위약 수준은 마지막 용량 후 16.9일에 6.3707 ㎍/mL이었다. 이러한 Rmax 값은 전체 시험에서 평가된 평균 Rmax보다 약간 낮았으며 차이는 각각 10, 5 및 1 mg에 대해 0.0362, 0.0973 및 0.1016 ㎍/mL이었다. 위약의 경우 차이는 0.2586 ㎍/mL이었다. 평균 Rmax는 모든 아프라글루타이드군에서 거의 같은 시간에 발생했으며, 각각 1 mg 및 5 mg의 첫 번째 용량 후 35.9일에서 38.9일의 범위였으며, 위약은 첫 번째 용량 후 50.4일에 최고조에 달했다.
마지막 용량 후 관찰된 평균 시트룰린 증가는 10 mg과 비교하여 가장 낮은 용량에서 더 빠르게 감소하는 것으로 나타났다. 시트룰린은 77일까지 평가되었다. 마지막 용량 후 가장 낮은 평균 시트룰린 수준은 1 mg과 10 mg 모두 17일 후에 도달했다. 5 mg의 경우 최저 평균 시트룰린 수준은 추가 1주일 후에 도달했다. Rt1/2는 둘 다 10 mg으로 투약된 2명의 대상체에 대해 평가되었고, 6.5일 및 11.0일이었다(표 22).
[표 22]
Figure pct00026
변동 계수(%CV)로 표현된 R용량 전 및 Rmax에 걸친 변동성(마지막 용량 이후 및 시험 전반에 걸침)은 위약에 대해 16.0 내지 31.9% 범위였다(표 22). 이것은 18.1 내지 29.2%의 1 및 5 mg에 대해 관찰된 %CV 범위와 일치하였다. 10 mg에 대한 %CV는 32.4~44.0%로 약간 더 높았다.
용량 수준당 통계적 정상 상태 분석은 Helmert 접근법을 사용하여 수행되었다. 요컨대, 테스트된 첫 번째 대조는 첫 번째 시점(1주)의 평균 R용량 전을 나머지 모든 시점(2주에서 6주)에 걸친 통합 평균 R용량 전과 비교하였다. 두 번째 대조는 2주의 평균을 3주에서 6주 등까지의 통합 평균과 비교했다. 대조가 통계적으로 유의하지 않을 때까지 테스트를 계속했다. 5주에 걸친 평균 R용량 전에 비해 6주의 10 mg에 대한 평균 R용량 전(0.8720, 95% CI: 0.1590; 1.5850 및 p=0.0172)은 통계적으로 유의했다. 데이터의 시각적 검사는 모든 조사된 용량 수준에서 제1 투약 후 정상 상태 농도가 도달되었음을 시사한다.
시트룰린 데이터는 분산의 혼합 모델 분석을 사용하여 분석하였다. 분석 결과의 요약은 표 23에 제공된다. 통계적 분석은 시트룰린에 대한 아프라글루타이드의 유의한 전체 치료 효과를 명확하게 나타냈다(p = 0.0007). 모든 용량군은 위약과 비교하여 증가를 나타내었지만, 위약과 1 mg 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 위약과 비교하여 증가는 용량 증가에 따라 더욱 두드러지고 유의미해졌다. 즉, 5 mg 용량의 경우 1.2574 ㎍/mL(p=0.0025) 및 10 mg 용량의 경우 1.6343 ㎍/mL(p=0.0002)의 증가였다(표 23). 또한, 용량 수준을 서로 비교할 때, 5 및 10 mg 용량은 1 mg 용량과 비교하여 유의하게 더 높은 시트룰린 수준을 유도하였다(각각 0.9429 ㎍/mL 더 높고[p = 0.0186] 1.3198 ㎍/mL 더 높음[p = 0.0018]). 5 mg 및 10 mg 용량 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았지만, 10 mg 후의 효과는 5 mg 후보다 약간 더 높은 것으로 나타났다.
[표 23]
Figure pct00027
시트룰린 외에도, 브리스톨 대변 척도 및 체중을 약력학 종점으로서 평가하였다. 시트룰린 및 중량과 대조적으로, 브리스톨 대변 척도는 별개의 변수이다. 대상체는 변비(유형 1)부터 설사(유형 7)까지 범위의 브리스톨 대변 척도를 사용하여 지난 24시간 동안 대변을 평가하였다. 지난 24시간 동안 대변 없음은 0으로 기록되었다. 두 대상체(1 또는 5 mg에 할당됨)가 제1 용량 전에 대변을 보고하지 않았기 때문에, 스크리닝 브리스톨 대변 척도 점수를 또한 기준선 브리스톨 대변 척도 점수를 결정할 때 고려하였다.
브리스톨 대변 척도에 대한 아프라글루타이드의 유의한 전체 치료 효과가 관찰되었으며, 0.0189의 p-값이다(표 23). 특정 위약 대 용량 수준 대조는 위약과 비교하여 1 및 5 mg 군에서 유의한 감소를 나타내었다(-0.9, p = 0.0092 및 -1.0, p = 0.0046); 위약과 비교하여 10 mg 군의 감소는 통계적으로 유의하지 않았다. 이 패턴은 가끔 대변이 없는것으로 보고된 몇몇 대상체에 의해 주도되는 것으로 나타났다. 첫 번째 용량 후, 브리스톨 대변 척도의 평가를 11회의 방문 및 시험 퇴원 시 예정하였다. 이러한 방문 중에서, 지난 24시간 동안 대변은 1 mg, 5 mg, 10 mg 군에서 각각 6회(2명의 대상체), 13회(4명의 대상체) 및 1회(1명의 대상체)로 보고되었다. 위약군에서, 모든 대상체는 각각의 방문에서 지난 24시간 동안 대변을 보고하였다. 대변 없음은 6주 투약 동안 9회 및 후속 6주에서 11회 보고되었으며, 이는 투약과 관련이 없음을 나타낸다.
대상체가 24시간마다 정상적으로 배변을 하지 않았을 때 대변 없음 점수를 0으로 기록하는 잠재적 영향을 고려하여(24명의 대상체 중 2명이 첫 번째 용량 전에 0을 보고했다는 관찰에 의해 뒷받침됨), 분석을 민감도 분석으로 반복하였고, 대변 없음은 누락으로 설정하였다. 이러한 조정된 분석으로, 전반적으로 또는 임의의 특정 치료 대조에 대해 유의미한 치료 효과가 발견되지 않았다(표 23).
체중은 전체 시행 기간에 걸쳐 오히려 일정한 것으로 나타났으며, 전반적으로 또는 임의의 특정 치료 대조에 대해 체중에 대한 아프라글루타이드의 통계적으로 유의한 치료 효과는 없었다(표 23). 개별 체중 값을 고려할 때, 위약 대상체 1007은 스크리닝 시 92.90 ㎏에서 시험 퇴원 방문 시 99.30 ㎏으로 체중 증가를 보였다.
시트룰린, BSS 및 체중 데이터는 고정 요인인 치료, 시간 및 시간별 치료, 임의 요인 대상체 및 공변량으로 평균 사전값을 사용하여 분산의 혼합 모델 분석으로 분석된다. 평균 사전값은 스크리닝 후 및 투약 전의 모든 사전값으로부터 계산되었지만, BSS는 예외였는데, 이 경우 스크리닝 값이 평균 기준선을 계산하는 데에도 사용되었다.
MCP-MOD 분석
MCP-MOD 절차가 적용되었다. 이 통계 방법론은 다중 비교 단계 및 모델링 단계의 2 단계로 구성되었다. 절차의 첫 번째 단계(MCP)는 미리 지정된 후보 모델을 평가하여 유의한 용량 반응을 테스트하는 데 사용된다. 용량 반응이 확립되면 두 번째 단계(MOD)를 사용하여 용량 반응 곡선을 추정하고 관심 목표 용량을 추정한다. 다섯 가지 후보 모델이 지정되었다:
- 10 mg 용량에 대해 최대 효과를 갖는 선형 모델
- 10 mg 용량에 대해 최대 효과를 갖는 로그 선형 모델
- 5 mg의 ED50으로 최대 효과(Emax) 모델을 유도하는 용량
- ED50이 1 mg이고 힐 계수(HILL)가 2인 S형 Emax 모델
- ED50이 5 mg이고 HILL이 5인 S형 Emax 모델
MCP 단계의 결과는 모든 5개의 후보 용량 반응 모델이 <0.0001의 p-값으로 상당한 대조를 생성함을 보여주었다(표 24). 차이의 추정치는 약간 독특했으며 더 나은 적합도를 가진 모델 세트와 약간 더 나쁜 적합도를 가진 세트가 생성되었다. 차이의 가장 큰 추정치를 산출하는 후보 용량 반응 모델은 1) ED50 =5 mg인 Emax 모델, 2) 로그 선형 모델 및 3) ED50이 1 mg이고 HILL이 2인 S형 Emax 모델이었다(표 24). 이러한 차이 추정치가 매우 유사했기 때문에 3개 모델 모두 MOD 부분에 사용되었다. 모델은 각각 1) Emax, 2) LogLin 및 3) S형 Emax 모델이라고 한다.
[표 24]
Figure pct00028
시트룰린 데이터의 서브세트는 평균 사전값 및 35 내지 42일 = 6주 데이터로 이루어졌다. 계수는 고정 요인인 치료, 시간 및 시간별 치료, 임의 요인 대상체 및 공변량으로 평균 사전값을 사용하여 분산의 혼합 모델 분석으로 구현되었다. 평균 사전값은 스크리닝 후 및 투약 전의 모든 사전값으로부터 계산되었다.
모델 내에서 다음 대조가 계산된다:
- 계수가 -0.508 -0.381 0.127 0.762인 선형
- 계수가 -0.654 -0.283 0.306 0.631인 LinLog
- 계수가 -0.632 -0.316 0.316 0.632인 Emax
- 계수가 -0.759 -0.140 0.432 0.467인 S형 Emax Hill=2 ED50=1
- 계수가 -0.456 -0.455 0.164 0.747인 S형 Emax Hill=5 ED50=5
MOD 단계는 1, 5 및 10 mg의 용량에 대해 위약으로부터의 예측된 시트룰린 변화가 모든 3개의 모델에 대해 오히려 유사하였음을 보여주었다(표 25). 1 mg의 용량으로, 3개 모델에 걸쳐 시트룰린에서 예측된 위약 및 기준선 보정된 변화는 0.7125 내지 0.8712 ㎍/mL 범위였으며, Emax(p=0.0184) 및 로그 선형(p=0.0238) 모델에 대한 유의미한 결과가 있었다. S형 Emax 모델의 경우, p-값은 0.0645였다. 용량을 5 mg까지 증가시킬 때, 위약으로부터의 예측된 변화는 2.1652 내지 2.3327 ㎍/mL의 범위로 증가하였다. 10 mg의 용량의 경우, 위약으로부터의 예측된 변화는 약간 더 높았고, 2.6946 내지 2.8604 ㎍/mL 범위였다. 5 mg 및 10 mg 둘 모두에 대한 위약에 대한 예측된 반응은 모든 모델에 대해 통계적으로 유의하였으며, p-값은 < 0.0001이었다.
1, 2 및 3 ㎍/mL의 기준선 및 위약 보정된 시트룰린 증가에 필요한 아프라글루타이드 용량 수준을 예측하였다(표 25). S형 Emax 모델의 Emax는 <3 ㎍/mL이므로 이 모델의 경우 2.5 ㎍/mL의 변화가 가장 큰 반응으로 선택되었다. 1 ㎍/mL의 시트룰린 증가에 대해 예측된 아프라글루타이드 용량은 Emax, LogLin 및 S형 Emax 모델에서 각각 1.2333 mg, 1.2249 mg 및 1.3606 mg이었다. 2 ㎍/mL의 시트룰린 증가를 유발하기 위해 예측된 아프라글루타이드 용량은 Emax, LogLin 및 S형 Emax 모델에 대해 각각 3.8471 mg, 4.2011 mg 및 3.4042 mg이었다. 마지막으로, 2.5 또는 3 ㎍/mL의 위약으로부터의 변화에 대한 예측된 아프라글루타이드 용량은 Emax, LogLin 및 S형 Emax 모델을 사용하여 각각 13.1053 mg, 11.4325 mg 및 6.4619 mg이었다. 예측된 아프라글루타이드 용량에서의 불확실성은 다소 크고, 특히 2.5 또는 3 ㎍/mL의 효과를 달성하는 것에 유의해야 한다.
[표 25]
Figure pct00029
공변량에 대한 조정
모든 약력학 종점(시트룰린, 브리스톨 대변 척도 및 체중)에 대해, 사전값은 공변량으로 사용되었다. 평균 사전값은 스크리닝 후 및 투약 전의 모든 사전값으로부터 계산되었지만, 브리스톨 대변 척도는 예외였는데, 이 경우 스크리닝 값이 평균 기준선을 계산하는 데에도 사용되었다. 시트룰린의 평균 사전값은 S형 Emax 모델을 제외하고 MCP-MOD에서 공변량으로도 사용되었다. 이것은 6주의 값으로부터 MCP 부분의 선형 모델의 기울기 곱하기 사전값을 차감함으로써 해결되었다.
약물 용량, 약물 농도 및 반응과의 관계
용량 수준에 의한 아프라글루타이드의 첫 번째 용량 후 시간에 대한 혈장 아프라글루타이드 농도는 도 20a 및 도 20b에 제시되어 있다. 아프라글루타이드의 약동학적 매개변수의 요약은 표 26에 제공되어 있다.
평균 겉보기 총 제거율(CL/F)은 3가지 용량 수준에 걸쳐 일정한 것으로 나타났으며 16.480(5 mg) 내지 20.747 L/d(10 mg) 범위였다(표 26). 최종 투약 후 말기 제거 단계(Vz/F) 동안 분포의 평균 겉보기 부피는 5 mg 및 10 mg에 대해 각각 55.426 및 105.021 L의 값으로 용량 의존적인 것으로 나타났다. 1 mg 용량군에 대한 Vz/F를 결정하기 위해 이용 가능한 데이터 포인트는 불충분했다(마지막 투약 후 샘플링 기간 동안 정량화의 하한을 초과한 샘플 수가 불충분함).
아프라글루타이드의 첫 주 SC 투여 후, 혈장 아프라글루타이드 농도는 모든 대상체에서 명백한 지체 시간 없이 증가했다(다음 용량까지 검출 가능한 농도가 없는 1 mg의 대상체 1002 제외). Cmax는 각각 1 mg, 5 mg 및 10 mg 아프라글루타이드에 대해 4명, 4명 및 1명의 대상체가 1일에 도달했다(도 20). 나머지 대상체는 2일에 Cmax에 도달했다. 1 mg을 받은 대상체는 4일 또는 7일에 정량 한계(LOQ) 아래로 감소한 반면, 5 mg 및 10 mg을 받은 대상체는 다음 용량까지 LOQ 초과를 유지했다. 첫 번째 용량 후 노출은 1, 5 및 10 mg 용량군에 대해 각각 13.918 ± 11.2, 94.088 ± 50.5 및 136.855 ± 55.0 ng/mL의 평균 Cmax 및 각각 35.214, 300.269 및 476.937 d*ng/mL의 AUCtau 값으로 용량 의존적이었다(표 26). 5 mg 용량군에서 용량 #6 이후 측정된 반감기(h)는 72.7 ± 23.0으로 측정되었고, 10 mg 용량군에서 용량 #6 이후 측정된 반감기는 76.3 ± 27.6으로 측정되었다.
다음 5회 용량의 Ctrough에서, 5명의 대상체(모두 1 mg이 투약됨)는 아프라글루타이드에 대해 검출할 수 없는 하나 또는 다수의 샘플을 가졌다. 다른 모든 대상체는 측정 가능한 아프라글루타이드 농도를 보였다. 6회 용량에 대한 평균 Ctrough는 1 mg 아프라글루타이드의 경우 0.000(1주)~0.873 ng/mL(4주), 5 mg 아프라글루타이드의 경우 7.605(5주)~10.163 ng/mL(4주), 10 mg 아프라글루타이드의 경우 13.710(6주)~18.460 ng/mL(2주)의 범위였다(표 26).
아프라글루타이드의 6번째 및 마지막 주간 SC 투여 후, 모든 대상체(대상체 3004는 투약 중단으로 인해 제외됨)가 명백한 지체 시간 없이 증가된 아프라글루타이드 농도를 나타냈다. 2일 후 Cmax에 도달한 각각 5 mg 및 10 mg의 2명 및 3명의 대상체를 제외하고, 대상체는 마지막 용량 후 1일에 Cmax에 도달했다. 약동학 매개변수는 마지막 용량 후 최대 2주까지 평가하였다. 1 mg의 모든 대상체와 5 mg의 1명의 대상체는 마지막 2개 또는 3개의 샘플에서 정량화할 수 없는 농도를 보였다. 10 mg의 모든 대상체를 포함한 나머지 대상체는 마지막 약동학 샘플에서 최대 4.46 ng/mL까지 여전히 정량 가능한 농도를 가졌다.
[표 26]
Figure pct00030
Figure pct00031
6번째 용량 후 관찰된 농도 프로파일은 노출이 약간 더 높았지만 첫 번째 용량과 유사한 것으로 나타났다(도 20). 노출은 1, 5 및 10 mg 용량군의 경우 각각 0.02424, 0.02496 및 0.01824 ng/mL/㎍의 평균 Cmax/용량 및 0.05944, 0.07153 및 0.05824 d*ng/mL/㎍의 AUCtau/용량으로 용량 비례성을 나타냈다(표 26).
1 mg이 투약된 6명의 대상체 중 3명에서, 말단 제거 속도 상수를 결정하기 위해 이용 가능한 데이터 포인트는 불충분했다(마지막 투약 후 샘플링 기간 동안 정량화의 하한을 초과한 샘플 수가 불충분함). 후속적으로, 평균 반감기는 5 및 10 mg 용량군에 대해서만 결정되었고, 2개 군 사이에서 유사하였다(각각 3.04 및 3.18일).
Cmax 및 AUCtau의 변동성은 1 mg의 첫 번째 용량 후에 눈에 띄었는데, 각각 %CV가 145.5 및 145.3%였다(표 26). 1 mg의 마지막 용량 및 5 및 10 mg 용량 수준의 최초 및 마지막 용량 후, 변동성은 더 낮았다: Cmax에 대한 %CV는 39.9 내지 64.6%의 범위였고, AUCtau에 대한 %CV에 대한 상응하는 범위는 23.1 내지 52.4%였다.
용량-정규화된 약동학 매개변수 Cmax 및 AUCtau 값의 시각적 검사는 1 내지 10 mg 용량 범위에 걸쳐, 아프라글루타이드가 선형 속도론을 따른다는 것을 시사하였다. 이는 동반된 상수 CL/F와 일치한다.
시트룰린과 마찬가지로, 아프라글루타이드에 대한 용량 수준당 통계적 정상 상태 분석은 Helmert 접근법을 사용하여 수행되었다. 이 정상 상태 분석은 2주에서의 평균 Ctrough에 대한 10 mg의 3주에서 6주에 걸친 평균 Ctrough를 제외하고 통계적으로 유의한 대조가 없음을 보여주었다(-3.616, 95% CI: -5.893; -1.399 및 p= 0.0023). 데이터의 시각적 검사는 모든 조사된 용량 수준에서 제1 투약 후 정상 상태가 도달되었음을 시사한다.
그래프 분석을 수행하여, 아프라글루타이드 농도-시트룰린 효과 관계를 평가하였다. 여러 개별 시트룰린 매개변수(Rmax 및 R용량 전)를 아프라글루타이드 약동학 매개변수(Cmax, Ctrough 및 AUCtau)에 대해 플롯팅했다. 용량 6에서 평가된 매개변수에 대해, 회귀선이 생성되었다. 기울기의 p-값은 0.0608의 값으로 Rmax에 대한 Cmax의 유의성에 거의 도달했다(도 21). AUCtau는 0.0377의 p-값으로 Rmax와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다(도 22). 회귀선에 따르면 6주에 AUCtau가 100 d*ng/mL 증가할 때마다, 상응하는 최대 시트룰린 반응이 0.39 ㎍/mL 증가했다. R 제곱 값은 Rmax의 변동성의 26%가 AUCtau에 의해 설명되었음을 보여주었다. 도 23, 도 24 및 도 25에 도시된 바와 같이, 6주에 용량 수준별로 평가한 모든 아프라글루타이드 및 시트룰린 농도의 상관관계 플롯은 측정된 아프라글루타이드 농도와 시트룰린 효과 사이에 시간 지체가 있었기 때문에 반시계 방향의 히스테리시스를 나타냈다.
약동학
평균 CL/F는 3 용량 수준에 걸쳐 일정하였고, 16.480(5 mg) 내지 20.747 L/d(10 mg) 범위였다. 평균 Vz/F는 5 및 10 mg 용량군에 대해서만 결정되었고, 5 및 10 mg의 경우 55.426 및 105.021 L의 값으로 각각 용량 의존적이었다. 평균 t½은 5 및 10 mg의 아프라글루타이드 용량군에 대해서만 결정될 수 있었고, 이들 군에 대해 유사하였다(각각 3.04 및 3.18일).
아프라글루타이드의 첫 번째 매주 SC 용량 후 노출은 1, 5 및 10 mg 용량군에 대해 각각 13.918, 94.088 및 136.855 ng/mL의 평균 Cmax 및 각각 35.214, 300.269 및 476.937 d*ng/mL의 AUCtau 값으로 용량 비례성을 나타냈다. 6번째 용량 후 관찰된 농도 프로파일은 노출이 수치상 더 높았지만 첫 번째 용량과 유사하였다. 노출은 1, 5 및 10 mg 용량군의 경우 각각 0.02424, 0.02496 및 0.01824 ng/mL/㎍의 평균 Cmax/용량 및 0.05944, 0.07153 및 0.05824 d*ng/mL/㎍의 AUCtau/용량으로 용량 비례성을 나타냈다. 용량 1 및 6에서, tmax는 1 mg 및 5 mg의 아프라글루타이드 용량의 경우 대략 1일이고, 10 mg 용량의 경우 2일이었다.
용량-정규화된 약동학 매개변수 Cmax 및 AUCtau 값의 시각적 검사는 1 내지 10 mg 용량 범위에 걸쳐, 아프라글루타이드가 선형 속도론을 따른다는 것을 시사한다. 데이터의 시각적 검사는 모든 조사된 용량 수준에서 제1 투약 후 정상 상태가 도달되었음을 시사한다.
약력학
아프라글루타이드를 사용한 첫 번째 및 마지막 투약 후, 시트룰린 농도는 용량-의존적으로 증가하였다. 마지막 용량 후 관찰된 평균 시트룰린 증가는 10 mg 용량과 비교하여 1 mg 및 5 mg 용량의 경우 더 빠르게 감소하는 것으로 나타났다. Rt1/2는 단지 2명의 대상체에 대해 평가될 수 있었는데, 두 명 모두 10 mg으로 투약되었고, 6.5 및 11.0일인 것으로 밝혀졌다.
용량 6에서, 평균 Rmax는 1, 5 및 10 mg의 마지막 용량 후 각각 7.1702, 8.1577 및 8.7254 ㎍/mL이었고, 2.0, 3.9 및 3.9일에 도달했다. 상응하는 위약 값은 마지막 용량 후 16.9일에 6.3707 ㎍/mL이었다. 이러한 Rmax 값은 전체 시험 기간에 걸쳐 평균 Rmax와 비슷하였다. 데이터의 시각적 검사는 모든 조사된 용량 수준에서 제1 투약 후 정상 상태가 도달되었음을 시사한다.
아프라글루타이드의 유의한 치료 효과가 시트룰린에 대해 관찰되었다(p = 0.0007). 아프라글루타이드는 시트룰린의 증가를 유도하였다. 이 반응은 위약과 비교하여 5 mg의 아프라글루타이드의 경우 1.2574 ㎍/mL(95% CI: 0.5037; 2.0112; p=0.0025) 및 10 mg 아프라글루타이드의 경우 1.6343 ㎍/mL(95% CI: 0.8809; 2.3878; p=0.0002)의 증가로 통계적으로 유의하였다; 1 mg의 아프라글루타이드의 경우, 증가는 위약과 비교하여 통계적으로 유의하지 않았다(0.3146 ㎍/mL, 95% CI: -0.4371; 1.0663; p=0.3910)). 용량군 간의 대조는 5 mg과 10 mg 용량이 1 mg 용량과 비교하여 유의하게 더 높은 시트룰린 수준을 유도했음을 나타냈다(각각 0.9429 ㎍/mL, 95% CI: 0.1768; 1.7089; p=0.0186 및 1.3198 ㎍/mL, 95% CI: 0.5586, 2.0810, p=0.0018). 중요하게는, 5 mg 내지 10 mg의 아프라글루타이드 간의 차이는 통계적으로 유의하지 않았지만, 10 mg 후의 효과는 5 mg 후보다 약간 더 높은 것으로 나타났다.
브리스톨 대변 척도에 대한 아프라글루타이드의 유의한 치료 효과는 0.0189(위약과 비교하여 모든 용량군)의 p-값으로 관찰되었다. 이 효과는 용량 의존적이 아니었는데, 위약과 비교하여 유의한 감소만이 1 및 5 mg 용량군에 대해 관찰되었기 때문이다(각각 -0.9, 95% CI: -1.6; -0.3; p=0.0092 및 -1.0, 95% CI -1.7; -0.4; p=0.0046).
탐색적 그래프 분석은 용량 6에서 Rmax에 대한 Cmax의 회귀선의 기울기가 p-값 0.0608로 거의 유의미한 수준에 도달했음을 보여주었다. AUCtau는 0.0377의 p-값으로 Rmax와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 회귀선에 따르면 6주에 AUCtau가 100 d*ng/mL 증가할 때마다, 상응하는 최대 시트룰린 반응이 0.39 ㎍/mL 증가했다. R 제곱 값은 Rmax의 변동성의 26%가 AUCtau에 의해 설명되었음을 보여주었다. 6주에 평가된 모든 아프라글루타이드 및 시트룰린 농도의 상관 플롯은 반시계 방향의 히스테리시스를 나타냈다.
MCP-MOD 절차는 미리 지정된 3개의 후보 모델이 MCP 부분에서 용량 반응에 가장 잘 맞는 유사한 결과를 산출함을 보여주었다: 1) Emax, 2) LogLin 및 3) S형 Emax 모델. 이 3가지 모델은 모두 MOD 부분에 적용되었으며 1, 5 및 10 mg 아프라글루타이드 용량에 대해 위약으로부터 유사한 시트룰린 변화를 예측했다. 1 mg의 용량으로, 3개 모델에 걸쳐 시트룰린에서 예측된 위약 및 기준선 보정된 변화는 0.7125 내지 0.8712 ㎍/mL 범위였으며, Emax(p=0.0184) 및 LogLin(p=0.0238) 모델에 대한 유의미한 결과가 있었다. S형 Emax 모델의 경우, p-값은 0.0645였다. 5 mg의 용량의 경우, 반응은 2.1652 내지 2.3327 ㎍/mL의 범위였다. 10 mg 용량의 경우, 2.6946 내지 2.8604 ㎍/mL 범위의 약간 더 강한 반응이 수득되었다. 5 mg 및 10 mg 둘 모두에 대한 위약에 대한 예측된 반응은 모든 모델에 대해 통계적으로 유의하였으며, p-값은 < 0.0001이었다.
1, 2 및 3 ㎍/mL의 기준선 및 위약 보정된 시트룰린 증가에 필요한 아프라글루타이드 용량 수준을 예측하였다. S형 Emax 모델의 Emax는 <3 ㎍/mL이므로 이 모델의 경우 2.5 ㎍/mL의 변화가 가장 큰 반응으로 설정되었다. 1 ㎍/mL의 시트룰린 증가에 대해 예측된 아프라글루타이드 용량은 Emax, LogLin 및 S형 Emax 모델에서 각각 1.2333 mg(95% CI: -0.04246; 2.5091), 1.2249 mg(95% CI: -0.2169; 2.6667) 및 1.3606 mg(95% CI: 0.2680; 2.4532)이었다. 2 ㎍/mL의 시트룰린 증가를 유발하기 위해 예측된 아프라글루타이드 용량은 Emax, LogLin 및 S형 Emax 모델에 대해 각각 3.8471 mg(95% CI: 0.3534; 7.3409), 4.2011 mg(95% CI: 0.6406; 7.7617) 및 3.4042 mg(95% CI: -0.1290; 6.9374)이었다. 2.5 또는 3 ㎍/mL의 위약으로부터의 변화에 대한 예측된 아프라글루타이드 용량은 Emax, LogLin 및 S형 Emax 모델을 사용하여 각각 13.1053 mg(95% CI: -6.3068; 32.5173), 11.4325 mg(95% CI: 1.5808; 21.2843) 및 6.4619 mg(95% CI: -0.5521; 13.4759)이었다.
PD/PK 모델
임상 약동학 관찰은 V1/F와 Cl/F 사이의 상관관계 및 흡수 지속시간에 대한 용량 공변량 및 V1/F와 Cl/F에 대한 체중 공변량이 있는 모델에 의해 가장 잘 매치되었다. PK/PD 모델을 생성하기 위해 이 모델에 약력학 관찰을 추가했다. 혈장 시트룰린은 턴오버 모델과 최대 PD 효과 모델로 설명되었다.
집단 PK/PD 모델은 아프라글루타이드 5 mg 피하 주사를 받은 70 ㎏의 개체가 1.39일에 31.3L의 분포 부피와 최고 혈장 농도(Cmax)를 달성할 것으로 추정했다. 아프라글루타이드 2.5, 5, 또는 10 mg의 매주 피하 주사로 시뮬레이션된 아프라글루타이드 및 시트룰린 혈장 농도 프로파일이 도 26에 도시되어 있다.
PK/PD 모델은 시간 경과에 따른 아프라글루타이드의 임의의 축적을 나타내지 않았다. 치료 첫 3주 동안 시트룰린의 축적이 명백했지만, 그 후 정상 상태 농도에 도달했다. 체중에 의한 시뮬레이션된 아프라글루타이드 농도-시간 프로파일은 체중이 증가함에 따라 정상 상태에서 더 낮은 곡선 아래 면적(AUC) 및 Cmax를 나타냈다.
실시예 8: 아프라글루타이드 제조 공정 - (II)
하기는 이전에 기재된 합성 경로(예를 들어, 미국 특허 제8,580,918호)에 비해 개선된 순도 수준의 아프라글루타이드의 제조를 위한 본 개시내용의 예시적인 방법이다.
고상 펩티드 합성(단계 1)
SPPS는 하기 단계를 포함하는 주기의 반복에 의해 고체 지지체 상에 고정된 펩티드 사슬의 순차적 합성이다:
1. 펩티드 수지의 N-말단 Fmoc 보호기의 제거
1a. 일부 양태에서, 잔기 Asp3의 Fmoc 탈보호 반응은 수지를 DMF 중 10% 피페리딘 및 2% 옥시마의 용액으로 처리하는 단계를 포함한다. 탈보호 반응은 2회 주기로 수행되고, 첫 번째 주기는 15분 동안, 그리고 두 번째 주기는 30분 동안 수행된다.
2. DMF 세척
3. Fmoc-AA-OH의 커플링
4. 커플링 테스트
5. DMF 세척
이러한 주기는 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복된다.
아미노산의 α-아미노기는 염기-민감성 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기로 보호되고; 측쇄 관능기는 산-불안정기로 보호된다. 공정에 사용된 모든 아미노산 유도체는 상업적으로 입수 가능하다.
SPPS는 고체 지지체 상에 고정된 펩티드 사슬의 순차적 합성이다. 합성에서, MBHA 수지는 펩티드 서열을 조립하는 데 사용될 수 있다. 질소 분위기 하에서 수지를 팽윤시키고 DMF에 이어 DMF/DIEA로 세척한 후, Fmoc-링크-아미드 링커가 DMF 중 HBTU/DIPEA/HOBt를 사용하여 커플링될 수 있다. 커플링 후, 수지를 DMF로 세척한 다음 Ac2O/DIPEA를 사용하여 아세틸화할 수 있다. Kaiser 테스트가 커플링의 완료를 확인하기 위해 수행될 수 있다.
수지를 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호된 아미노산은 하기 주기에 따라 수지-결합 펩티드에 각각 커플링된다:
1. Fmoc-보호기를 DMF 중 피페리딘으로 제거하고 수지를 DMF로 철저히 세척한다.
2. 활성화를 위해 DIC/옥시마를 사용하여 가변 아미노산 당량을 갖는 DMF에서 커플링을 수행한다.
2a. 일부 양태에서, Gly 및 His 아미노산의 순차적 조립 대신에 디-펩티드 Boc-His(Trt)-Gly-OH가 수지에 커플링된다. 디펩티드를 커플링 반응에 첨가하기 전에, 7 mL DMF 중 Boc-His (Trt)-Gly-OH/옥시마/DIC(2.5 mmol/2.5 mmol/ 2.5 mmol)를 사용하여, 20℃ ± 2℃에서 1시간 동안 예비활성화시킨다. Kaiser 테스트가 커플링의 완료를 확인하기 위해 수행될 수 있다.
3. 아미노산의 커플링은 각각의 합성 주기 동안 수행되는 닌히드린 분석법을 사용하여 모니터링한다.
조립 종료 시, 마지막 아미노산이 커플링되고 탈보호된 후, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 세척하고, 진공 하에서 건조시킨다.
수지로부터 펩티드의 절단 및 탈보호(단계 2)
보호된 펩티드는 수지로부터 동시에 절단되고 TFA/물/아니솔 혼합물로 처리함으로써 탈보호될 수 있다. 이어서, MTBE를 펩티드/TFA 슬러리에 첨가하여, 절단된 수지의 존재 하에 조 펩티드를 침전시킨다. 수득된 조 펩티드를 여과하고, MTBE로 세척하고, 진공 하에서 일정한 중량까지 건조시킨다.
탈카르복실화 반응(단계 3a)
조 펩티드를 암모니아 완충액 중 H2O/ACN(70:30 비)의 혼합물에 용해시킨다. H2O 중 25% 아세트산 또는 25% NH4OH를 사용하여 pH 8.0 ± 0.1을 목표로 하여 용액을 조정한다. 탈카르복실화 반응은 50℃에서 65분 동안 유지된다. 조 펩티드를 pH 8.0 ± 0.1의 암모니아 완충액 중 H2O/ACN(70:30 비)의 용액으로 세척하고 5° ± 3℃에 저장한다.
분취용 RP-HPLC에 의한 정제(단계 3b)
조 펩티드를 물/아세토니트릴/NH4OH의 혼합물에 용해시킨다. 이 용액을 아세트산으로 희석한 다음 여과한다.
1차 정제는 용리액으로서 NaHCO3/H2O/CH3CN으로 분취용 RP-HPLC에서 수행된다. 컬럼으로부터의 용리를 UV에 의해 모니터링하고 수득된 분획을 RP-HPLC로 분석한다. 모니터링 기준을 충족하는 분획을 조합된 풀에서 혼합한다. 모니터링 기준을 충족하지 않는 분획은 정제 단계를 반복함으로써 재순환될 수 있다. 풀의 순도는 분석용 RP-HPLC에 의해 제어된다.
분취용 RP-HPLC에 의한 나트륨염 전환(단계 4)
이 단계는 pH 변화를 통해 TFA 음이온으로부터 나트륨 양이온으로의 펩티드의 반대 이온을 교환하고 펩티드를 추가로 정제하기 위해 수행될 수 있다. 단계 3으로부터의 조합된 풀을 물에 희석하고 NaOAc 용리액을 사용하여 분취용 RP-HPLC에 의해 재정제한다.
이어서, 정제된 펩티드 용액을 진공 하에서 증발시켜 용액 중 아세토니트릴을 감소시킨다. 이어서, 정제된 펩티드 용액을 0.1% AcOH를 사용하여 pH 7.9를 목표로 하여 조정한다.
순수한 풀은 농축되고 동결 건조될 수 있다. 풀의 순도를 RP-HPLC로 분석한다.
동결 건조 및 포장(단계 5)
동결건조 전에, 용액 중의 정제된 펩티드를 0.2 μm 막을 통해 여과한다. 동결건조는 저압에서 수행된다. 생성된 동결건조된 최종 펩티드를 아르곤 하에 포장한다. 동결건조된 아프라글루타이드는 아프라글루타이드 사양에 따라 제어된다.
재처리
아프라글루타이드 사양에서 확립된 기준을 충족하지 않는 동결건조된 아프라글루타이드는 재정제를 거칠 수 있다.
재정제는 상기 기재된 바와 같이 정제 단계(들) 및 반대 이온 전환 단계를 반복함으로써 펩티드의 재구성 후에 수행될 수 있다.
재정제 후, 물질을 상기 기재된 절차에 따라 동결건조시킨다.
아프라글루타이드 사양에서 확립된 기준을 충족하지 않는 동결건조된 아프라글루타이드는 재동결건조를 거칠 수 있다.
재동결건조는 상기 기재된 바와 같이 동결건조 단계를 반복함으로써 펩티드의 재구성 후에 수행될 수 있다.
불순물
실시예 8에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정을 수행하여 아프라글루타이드 내 β-Asp3 펩티드 이성질체 불순물의 수준을 1.5% 미만으로 감소시켰다. 일부 구현예에서, 실시예 8에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 아프라글루타이드 내 β-Asp3 펩티드 이성질체 불순물의 수준을 1% 미만으로 감소시켰다.
β-Asp3 불순물의 형성은 높은 pH 및 서열 Asp3-Gly4의 존재에 의해 선호된다. Asp-Gly 서열은 고리 폐쇄(β-카르복시 측쇄 상의 α-카르복시 아미드 결합으로부터의 질소 공격)로 인해 특히 아스파르티미드가 형성되기 쉽다. 아스파르티미드는 염기-촉매화된 에피머화에 민감하고, 고리 개방 반응을 겪을 수 있으며, 이는 다수의 부산물의 형성으로 이어질 수 있다. 물에 의한 공격은 β-아스파르틸 펩티드를 생성할 수 있다.
수지에서 펩티드 절단 시 탈카르복실화/추출 단계(단계 3a) 동안 β-Asp3 불순물의 형성은 1% 초과의 수준에 도달할 수 있으며, 극한 pH, 특히 H2O/ACN 80:20 중 암모니아의 강염기 용액, 실온에서 pH 약 10에 장기간 노출될 때 촉진된다. 실시예 8에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 pH를 10에서 8로 감소시키고, 탈카르복실화 반응 시간을 24시간에서 65분으로 단축하고, 반응 온도를 실온에서 50℃로 변경하고, 저장 온도를 실온에서 5℃로 감소시켰다. 이러한 변화는 1.5% 미만 수준의 β-Asp3 불순물을 초래했다. 일부 구현예에서, 이러한 변화는 1% 미만 수준의 β-Asp3 불순물을 초래했다.
실시예 8에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 탈보호의 2주기(첫 번째 주기는 15분 동안, 그리고 두 번째 주기는 30분 동안)와 함께 DMF 중 10% 피페리딘 및 2% 옥시마의 용액을 사용하도록 잔기 Asp3의 Fmoc 탈보호 반응을 수정하였다. 이러한 더 온화한 염기 조건은 Asp3의 완전한 탈보호를 가능하게 하였고 아스파르티미드 및 후속 β-Asp3 부산물 형성을 감소시킨다.
DIC/옥시마를 이용한 커플링 반응 동안 아미노산의 라세미화로 인해 D-His 불순물이 형성이 일어날 수 있다. 개별 Gly 및 His 아미노산의 순차적 조립 공정은, 때때로 불완전한 커플링과 함께, 0.3% 내지 1.2% 사이의 D-His 불순물의 수준의 변동성을 나타내었다. 커플링 시약 DIC/옥시마를 사용한 Fmoc-His(Trt)-OH 혼입은 His의 D 형태로의 라세미화를 선호할 수 있다.
실시예 8에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 Gly 및 His 아미노산의 순차적 조립 대신 이 반응에 대한 출발 물질로서 디-펩티드 Boc-His(Trt)-Gly-OH를 사용하였다. 이를 통해 His의 라세미화 수준을 1%(한 번의 수행된 배치에서 0.3%) 미만으로 감소시키고 최종 D-His 수준을 디펩티드의 사양(Boc-D-His(Trt)-Gly-OH)에 통합한다. 이는 또한 탈보호 단계의 수를 감소시켜 전술한 바와 같이 탈보호 조건(높은 pH)이 β-Asp3 불순물 형성에 미치는 영향을 최소화한다.
실시예 9: 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물의 투여의 3상 인간 임상 시험
하기 비제한적인 실시예는 SBS-IF를 갖는 대상체가 본 개시내용의 아프라글루타이드 제형으로 치료되는 3상 임상 시험을 기재한다. 이 2상 임상 시험은 SBS-IF 환자에서 비경구 지원 의존성을 감소시키는 데 있어서 매주 피하 아프라글루타이드의 효능을 조사한다.
SBS-IF를 갖는 144명의 성인 환자는 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물 또는 위약으로 치료될 것이다. SBS-IF 환자는 대상체의 체중이 50 ㎏ 미만인 경우 본 개시내용의 2.5 mg 아프라글루타이드, 또는 대상체의 체중이 50 ㎏ 이상인 경우 본 개시내용의 아프라글루타이드 5 mg, 또는 위약을 48주 동안 주 1회 투여받게 될 것이다.
시험은 다중기관, 이중 맹검, 무작위화, 위약-대조, 3상 시험이다. 참가자의 무작위화는 소공 및 연속성 결장의 해부학 특이적 무작위화를 포함한다.
1차 종점 효능 평가는 24주에 수행될 것이다. 1차 종점은 실제 매주 PS 부피의 기준선으로부터의 상대 변화를 평가할 것이다. 2차 종점 효능 평가는 24주 및 48주에서 수행될 것이다. 모든 환자에 걸쳐 일반적인 2차 종점뿐만 아니라 해부학 특이적 2차 종점이 평가될 것이다.
평가될 2차 종점은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
1. 24/48주에 PS의 주당 적어도 1일의 감소를 달성하는 대상체.
2. 12/24/48주에서의 실제 매주 PS 부피의 기준선으로부터의 상대 변화.
3. 24/48주에 장관 자율성에 도달하는 SBS-IF 환자.
4. 20/24주에서의 기준선으로부터 PS 부피의 적어도 20% 감소.
5. 24주에서의 비경구 영양(PN)의 칼로리 감소.
6. 중증도에 대한 환자의 전반적인 인상(PGIS)에 대한 기준선으로부터의 변화
7. 피츠버그 수면 질 척도(PSQI)의 기준선으로부터의 변화
8. 변화에 대한 환자의 전반적인 인상(PGIC)에 대한 기준선으로부터의 변화
9. 집단 PK 데이터 분석을 통한 아프라글루타이드의 흡수 속도 상수(ka)
10. 집단 PK 데이터 분석을 통한 아프라글루타이드의 겉보기 제거율(CL/F)
11. 집단 PK 데이터 분석을 통한 아프라글루타이드의 겉보기 분포 부피(Vz/F)
실시예 10: 본 개시내용의 아프라글루타이드 조성물의 투여의 1상 인간 임상 시험
하기 비제한적인 실시예는 정상 및 손상된 신장 기능을 갖는 대상체가 본 개시내용의 아프라글루타이드 제형으로 치료되는 1상 임상 시험을 기재한다. 이 1상 임상 시험은 다양한 정도의 신장 기능을 갖는 대상체에서 5 mg의 아프라글루타이드의 단일 피하 용량의 약동학 및 안전성을 조사한다. 신장 기능은 만성 신장 질환 역학(CKD-EPI) 크레아티닌 방정식에 따라 추정 사구체 여과율(eGFR)에 의해 계산된다.
시험은 2단계, 개방 표지, 다기관, 비무작위화, 1상 시험이다. 시험의 파트 1에서, 중증 신장 손상 대상체 8명(코호트 1) 및 정상 신장 기능의 대상체 6명(코호트 2)에게 본 개시내용의 단일 용량 5 mg의 아프라글루타이드가 투여될 것이다. 시험의 파트 2에서, 중등도 신장 손상 대상체 8명(코호트 3) 및 경미한 신장 손상 대상체 8명(코호트 4)에게 본 개시내용의 단일 용량 5 mg의 아프라글루타이드가 투여될 것이다. 대조군과 비교하여 중증 신장 손상군에 대한 AUCinf 또는 AUClast의 기하 평균 비율(GMR)이 2 이상인 경우 대상체가 등록된다.
환자 적격성은 스크리닝 방문 동안 평가된다. 주요 포함 기준은 다음과 같다:
1. 모든 참가자
a. 18 내지 75세 사이의 연령
b. 연구 절차를 준수할 의지와 능력이 있는 대상체
c. 정보에 입각한 동의서를 이해하고 서명할 의사가 있는 대상체
d. 17.5 이상 40 ㎏/m2 이하의 체질량 지수(BMI); 및 50 ㎏(110 lb) 초과의 총 체중.
e. 시험 기간 동안 및 시험 종료(EOT) 방문 후 1개월 동안 매우 효과적인 피임 방법을 수행 중인 가임기 여성(WOCBP). 불임 시술을 했거나 또는 생식력이 없거나 폐경후의 여성.
f. 가임 여성 파트너가 있는 남성 대상체: 매우 효과적인 피임 방법 및 시험 기간 동안 및 (EOT) 방문 후 1개월 동안 정자 기증 없음.
2. 건강한 참가자
a. 임상적으로 관련된 이상(병력, 활력 징후, ECG, 안전성 실험실)이 없음
b. 2회의 스크리닝 방문에서 CKD-EPI로 측정한 eGFR ≥90 mL/min/1.73 m2
c. 신장 기능이 손상된 대상체군과 인구 통계적으로 비슷함
3. 손상된 신장 기능을 갖는 참가자
a. 중증 신장 손상: eGFR <30 mL/min/1.73 m2, 혈액투석을 필요로 하지 않음
b. 중등도 신장 손상: eGFR ≥30 mL/min/1.73 m2 및 <60 mL/min/1.73 m2
c. 경증 신장 손상: eGFR ≥60 및 <90 mL/min/1.73 m2
1차 종점 효능 평가는 단일 용량 후 240시간에 수행될 것이다. 1차 종점은 최대 혈장(Cmax), 0에서 무한대(AUCinf)까지의 농도-시간 곡선 아래 면적 및 시간 0에서 240시간까지의, 마지막 측정 가능한 농도까지의 농도-시간 곡선 아래 면적(AUClast) 2차 종점 효능 평가는 240시간, 7일, 14일 및 28일에 수행될 것이다. 1차 및 2차 종점은 모든 대상체에 걸쳐 평가될 것이다.
평가될 2차 종점은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
1. 시간 0에서 7일까지의 마지막 측정 가능한 농도까지의 농도-시간 곡선 아래 면적(AUC0-7일). 단일 용량 후 168시간에 걸쳐 수집된 샘플
2. 최대 농도까지의 시간(Tmax). 단일 용량 후 240시간에 걸쳐 수집된 샘플
3. 말단 제거 속도 상수. 단일 용량 후 240시간에 걸쳐 수집된 샘플
4. 말단 제거 반감기. 단일 용량 후 240시간에 걸쳐 수집된 샘플
5. 혈관외 투여 후 겉보기 제거율(CL/F). 단일 용량 후 240시간에 걸쳐 수집된 샘플
6. 혈관외 투여 후 겉보기 분포 부피(Vz/F). 단일 용량 후 240시간에 걸쳐 수집된 샘플
7. 14일 내지 28일의 유해 사건 또는 특별한 관심의 유해 사건을 갖는 참가자의 수
8. 14일 내지 28일의 활력 징후의 기준선으로부터 임상적으로 유의한 변화
9. 14일 내지 28일의 기록된 3중 12-리드 ECG의 기준선으로부터 임상적으로 유의한 변화
10. 14일 내지 28일의 임상 실험실 평가에서 기준선으로부터 임상적으로 유의한 변화를 경험하는 참가자의 수
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 신장 손상을 갖는 환자는 일반적으로 신장 손상이 간/장 약물 대사의 일부 경로에 악영향을 줄 수 있고 또한 흡수, 혈장 단백질 결합, 수송 및 조직 분포의 변화와 같은 다른 변화와 관련이 있기 때문에 약물 투약 조정을 필요로 한다. 약동학 데이터에서 신장 배설이 아프라글루타이드의 주요 제거 경로가 아님을 나타내더라도 다른 GLP-2 유사체(즉, 테두글루타이드)는 중등도 및 중증 신장 손상 및 말기 신장 질환 환자에서 용량 감소가 필요하다. 실시예 10에 기재된 시험에서, 아프라글루타이드 5 mg으로 중증 CKD 환자에게 투약하는 것은 이 집단에서 과용량의 위험 없이 안전한 것으로 밝혀졌다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이는 아프라글루타이드가 용량 적응 없이 신장 손상된 환자에게 투여될 잠재력을 갖는다는 것을 나타낸다.
약동학
5 mg의 아프라글루타이드의 단일 피하 용량의 투여 후 아프라글루타이드의 혈장 농도를 건강한 대상체(코호트 2) 및 중증 CKD 대상체(코호트 1)에서 240시간에 걸쳐 모니터링하였고, 이를 도 29에 제시하였다.
아프라글루타이드의 약동학적 매개변수의 요약은 표 27에 제공되어 있다. 개별 아프라글루타이드 혈장 농도 곡선을 분석할 때 2개의 이상점을 확인하였다(각각의 코호트에서 하나씩). 코호트 1의 이상점은 군에서 최고 체중(BW) 및 체질량 지수(BMI)를 가졌지만, 코호트 2의 이상점은 군에서 가장 낮은 BW 및 BMI를 가졌다. 기하 평균량은 이상점 대상체를 포함하여 그리고 포함하지 않고 계산되었다.
[표 27]
Figure pct00032
전체 대상체 집단에 대해, Cmax에 대한 기하 평균 비율은 90% CI 0.37~0.885의 0.572였고, AUCinf의 경우 90% CI 0.388~0.972의 0.614였다. 반면에, 이상점 대상체로부터 데이터를 제거할 때, Cmax에 대한 기하 평균 비율은 90% CI 0.556~1.077의 0.774였고, AUCinf의 경우 90% CI 0.657~1.098의 0.849였다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 중증 신장 장애 환자는 건강한 대상체보다 더 높은 체중 및 체질량 지수를 갖는다. 이론에 구속됨을 바라지 않고, 이는 코호트 1의 대상체가 더 낮은 혈장 농도로 인해 아프라글루타이드에 대한 더 낮은 노출을 갖는다는 것을 나타낼 수 있다.
실시예 11: 아프라글루타이드 제조 공정 - (III)
도 2a 및 도 2b는 이전에 기재된 합성 경로(예를 들어, 미국 특허 제8,580,918호)에 비해 개선된 순도 수준의 아프라글루타이드의 제조를 위한 본 개시내용의 예시적인 방법을 개략적으로 도시한 것이다. 도 2a 및 도 2b에 기재된 제조 공정은 본원에서 공정 B로 지칭되고, TFA 기반 이동상(H2O/아세토니트릴)에서 RP-HPLC(C18) 크로마토그래피에 의한 90% 이상의 순도로의 1차 정제 및 중탄산나트륨(NaHCO3)을 사용하여 분획의 pH를 조정한 후, NaHCO3 이동상(H2O/아세토니트릴)에서 RP-HPLC(C18)에 의한 97% 이상의 순도로의 2차 정제에 이어, 아세트산나트륨(NaOAc)/H2O/아세토니트릴 이동상에서 RP-HPLC(C18)에 의한 탈염/완충액 교환을 포함한다. 표 2a는 공정 B를 사용하여 생성된 아프라글루타이드 생성물의 순도뿐만 아니라 주요 오염물질의 수준을 나타낸다. 표 2a는 공정 B를 사용하여 생성된 아프라글루타이드 생성물의 순도뿐만 아니라, 공정에 대한 전체 생성물 수율을 나타낸다. 표 2a 및 표 2b에 제시된 바와 같이, 공정 B는 97% 이상의 순도 및 낮은 수준의 오염물질을 갖는 아프라글루타이드를 산출할 수 있다. 더욱이, 공정 B는 약 20%의 생성물 수율을 나타낸다.
불순물
도 2a 및 도 2b에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 아프라글루타이드 내 β-Asp3 펩티드 이성질체 불순물의 수준을 1.5% 미만으로 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 실시예 8에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 아프라글루타이드 내 β-Asp3 펩티드 이성질체 불순물의 수준을 1% 미만으로 감소시켰다.
β-Asp3 불순물의 형성은 높은 pH 및 서열 Asp3-Gly4의 존재에 의해 선호된다. Asp-Gly 서열은 고리 폐쇄(β-카르복시 측쇄 상의 α-카르복시 아미드 결합으로부터의 질소 공격)로 인해 특히 아스파르티미드가 형성되기 쉽다. 아스파르티미드는 염기-촉매화된 에피머화에 민감하고, 고리 개방 반응을 겪을 수 있으며, 이는 다수의 부산물의 형성으로 이어질 수 있다. 물에 의한 공격은 β-아스파르틸 펩티드를 생성할 수 있다.
수지에서 펩티드 절단 시 탈카르복실화/추출 단계(단계 3(1), 도 2b) 동안 β-Asp3 불순물의 형성은 1% 초과의 수준에 도달할 수 있으며, 극한 pH, 특히 H2O/ACN 80:20 중 암모니아의 강염기 용액, 실온에서 pH 약 10에 장기간 노출될 때 촉진된다. 도 2a 및 도 2b에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 pH를 10에서 8로 감소시키고, 탈카르복실화 반응 시간을 24시간에서 65분으로 단축하고, 반응 온도를 실온에서 50℃로 변경하고, 저장 온도를 실온에서 5℃로 감소시키도록 변형될 수 있다. 이러한 변화는 1.5% 미만 수준의 β-Asp3 불순물을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변화는 1% 미만 수준의 β-Asp3 불순물을 초래했다.
도 2a 및 도 2b에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 또한 잔기 Asp3의 Fmoc 탈보호 반응이 탈보호의 2주기(첫 번째 주기는 15분 동안, 그리고 두 번째 주기는 30분 동안)와 함께 DMF 중 10% 피페리딘 및 2% 옥시마의 용액을 사용하도록 변형될 수 있다. 이러한 더 온화한 염기 조건은 Asp3의 완전한 탈보호를 가능하게 하고 아스파르티미드 및 후속 β-Asp3 부산물 형성을 감소시킨다.
DIC/옥시마를 이용한 커플링 반응 동안 아미노산의 라세미화로 인해 D-His 불순물이 형성될 수 있다. 개별 Gly 및 His 아미노산의 순차적 조립 공정은, 때때로 불완전한 커플링과 함께, 0.3% 내지 1.2% 사이의 D-His 불순물의 수준의 변동성을 나타내었다. 커플링 시약 DIC/옥시마를 사용한 Fmoc-His(Trt)-OH 혼입은 His의 D 형태로의 라세미화를 선호할 수 있다.
도 2a 및 도 2b에 기재된 바와 같은 아프라글루타이드 제조 공정은 Gly 및 His 아미노산의 순차적 조립 대신 이 반응에 대한 출발 물질로서 디-펩티드 Boc-His(Trt)-Gly-OH를 사용하도록 변형될 수 있다. 이를 통해 His의 라세미화 수준을 1%(한 번의 수행된 배치에서 0.3%) 미만으로 감소시키고 최종 D-His 수준을 디펩티드의 사양(Boc-D-His(Trt)-Gly-OH)에 통합한다. 이는 또한 탈보호 단계의 수를 감소시켜 전술한 바와 같이 탈보호 조건(높은 pH)이 β-Asp3 불순물 형성에 미치는 영향을 최소화한다.
도 2a 및 도 2b에 기재된 바와 같고, 상기 기재된 바와 같이 변형된 아프라글루타이드 제조 공정은 본원에서 "공정 C"로 지칭된다. 표 2b에 제시된 바와 같이, 공정 C는 97% 이상의 순도를 갖는 아프라글루타이드를 산출할 수 있고 약 22%의 생성물 수율을 나타낸다.
등가물
전술한 설명은 단지 예시의 목적으로 제시되었으며, 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니다. 본 개시내용의 하나 이상의 구현예 및/또는 양태의 세부사항은 상기 첨부된 설명에 기재된다. 본원에 기재된 구현예 및/또는 양태 중 임의의 하나는 본원에 기재된 임의의 다른 구현예 및/또는 양태와 조합될 수 있고, 임의의 수의 구현예 및/또는 양태가 조합될 수 있다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 설명된다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> VectivBio AG <120> MANUFACTURE, FORMULATION AND DOSING OF APRAGLUTIDE <130> VECT-002/001WO (338004-2011) <150> US 63/036,507 <151> 2020-06-09 <150> US 63/074,119 <151> 2020-09-03 <150> US 63/157,083 <151> 2021-03-05 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APRAGLUTIDE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> D-Phe <400> 2 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Phe Thr Ile Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teduglutide <400> 3 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glepaglutide <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35

Claims (46)

  1. 95% 이상의 순도를 갖는 아프라글루타이드의 나트륨염으로서, 아프라글루타이드는 하기 구조를 갖는 것인, 아프라글루타이드의 나트륨염:
    Figure pct00033
  2. 제1항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 97% 이상의 순도를 갖는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 3% 이하의 Des-Gly4 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염 내 아스파르티미드3 아프라글루타이드, Asp33-OH 아프라글루타이드 및 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물의 합계는 2% 이하인, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 2% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 1.5% 이하의 β-Asp3 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 1% 이하의 β-Asp3 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 1% 이하의 D-His 아프라글루타이드 불순물을 포함하는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은
    1% 이하의 Asp33-OH 아프라글루타이드 불순물,
    1% 이하의 Des-Ser7 아프라글루타이드 불순물,
    1% 이하의 D-아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물,
    1% 이하의 [Trp25, 2-(2,4,6-트리메톡시페닐)] 아프라글루타이드 불순물을 포함하고,
    아프라글루타이드의 나트륨염 내 Des-Gly4 아프라글루타이드 및 아스파르티미드3 아프라글루타이드 불순물의 합계는 1% 이하인, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 아프라글루타이드의 나트륨염은 동결건조된 분말로서 제공되는, 아프라글루타이드의 나트륨염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 아프라글루타이드의 나트륨염을 포함하는 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 글리신, L-히스티딘 및 만니톨 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    약 12.5 mg의 아프라글루타이드(나트륨염);
    약 1.88 mg의 글리신;
    약 3.88 mg의 L-히스티딘;
    약 57.5 mg의 만니톨을 포함하는, 제약 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 동결건조된 분말로서 제공되는, 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 아프라글루타이드의 나트륨염 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 포함하는, 2-챔버 분말 주사기.
  16. GLP-2 유사체 펩티드를 제조하는 방법으로서,
    a) 고상 펩티드 합성(SPPS)을 수행하여 Fmoc-링크-아미드-메틸벤즈하이드릴 아민(MBHA)-수지 상의 GLP-2 유사체 펩티드를 합성하는 단계;
    b) 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 수지로부터 절단하고, 트리플루오로아세트산(TFA), 물 및 아니솔을 포함하는 용액으로 수지를 처리함으로써 합성된 GLP-2 유사체 펩티드의 측쇄를 탈보호하는 단계;
    c) TFA 기반 이동상을 사용하여 제1 분취용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 정제를 수행함으로써 단계 (b)로부터 합성된 GLP-2 유사체 펩티드를 정제하여, 90% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 용액을 생성하는 단계;
    d) NaHCO3 기반 이동상을 사용하여 제2 RP-HPLC 정제를 수행함으로써 단계 (c)의 생성물을 정제하여, 97% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 용액을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    e) NaOAc 기반 이동상을 사용하여 제3 RP-HPLC 정제를 수행함으로써 단계 (d)로부터의 생성물을 추가로 정제하여, 97% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드의 나트륨염을 포함하는 용액을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    f) 물 중 0.1% AcOH를 사용하여 GLP-2 유사체 펩티드의 나트륨염을 포함하는 pH 용액을 약 pH 7.9까지 조정하는 단계;
    g) 공극 크기가 0.2 μm인 필터에 단계 (f)의 생성물을 통과시키는 단계;
    h) 단계 (g)의 생성물을 동결건조시켜, 97% 이상의 순도를 갖는 GLP-2 유사체 펩티드의 동결건조된 나트륨염을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    c)(i) 암모니아 완충액 중 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액에 펩티드를 가용화함으로써 합성된 GLP-2 유사체 펩티드의 탈카르복실화를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 암모니아 완충액 중 물 및 아세토니트릴을 포함하는 용액의 pH가 약 pH 8.0까지 조정되는, 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는
    i) SPPS가 수행될 MBHA-수지를 제조하는 단계
    ii) 초기 Fmoc 탈보호 반응을 수행한 후, 제1 Fmoc-보호된 아미노산을 수지에 첨가하여 커플링 반응을 수행하여, 수지에 보호된 펩티드를 형성하는 단계;
    iii) Fmoc 탈보호 반응을 수행한 후, 커플링 반응을 수행하여, 보호된 펩티드에 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산을 부가하는 단계;
    iv) GLP-2 유사체 펩티드가 수지 상에서 합성되어, 수지에 연결된 Fmoc-보호된 및 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 생성할 때까지 단계 iii을 반복하는 단계;
    v) Fmoc 탈보호 반응을 수행하여 수지에 연결된 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 생성하는 단계; 및
    vi) 수지에 연결된 측쇄 보호된 GLP-2 유사체 펩티드를 건조시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (a)(i)은
    (a1) 수지를 디메틸포름아미드(DMF) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)을 포함하는 용액으로 N2 분위기 하에서 수지 그램당 5 mL의 용액으로 세척하는 단계;
    (b1) DMF 중 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄(HBTU), DIEA 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 포함하는 용액에서 링크 아미드 링커를 수지에 커플링시키는 단계;
    (c1) 단계 (b1)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계;
    (d1) DMF 중 아세트산 무수물(Ac2O) 및 DIEA를 포함하는 용액과 수지를 접촉시켜 환원 반응을 수행하는 단계; 및
    (e1) 단계 (d1)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, Fmoc 탈보호 반응을 수행하고, 이어서 커플링 반응을 수행하는 단계는
    (a2) 수지를 DMF 중 피페리딘을 포함하는 용액으로 처리하는 단계;
    (b2) 수지를 DMF로 세척하는 단계;
    (c2) 수지를 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 세척하는 단계;
    (d2) 수지를 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및, 제1 양의, 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 에틸 시아노하이드록시이미노아세테이트(옥시마)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
    (e2) 수지를 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
    (f2) 단계 (e2)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 수지는, 수지를 제1 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시킨 후 약 30분 후에 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉되는, 방법.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, Fmoc 탈보호 반응을 수행하고, 이어서 커플링 반응을 수행하는 단계는
    (a2) 수지를 DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액으로 처리하는 단계;
    (b2) 수지를 DMF로 세척하는 단계;
    (c2) 수지를 DMF 및 옥시마를 포함하는 용액으로 세척하는 단계;
    (d2) 수지를 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산 및, 제1 양의, 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 에틸 시아노하이드록시이미노아세테이트(옥시마)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계;
    (e2) 수지를 제2 양의, DIC 및 옥시마를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
    (f2) 단계 (e2)에서 형성된 생성물을 DMF로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 수지는 제1 양의, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액과 15분 동안 접촉되고, 이어서 수지를 제2 양의, DMF 중 피페리딘 및 옥시마를 포함하는 용액과 30분 동안 접촉시키는, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산은 Fmoc-Gln(Trt)-Thr(ψMe,Mepro)-OH인, 방법.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Fmoc-보호된 아미노산은 Fmoc-Gly(Tmb)-OH인, 방법.
  29. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 보호된 아미노산은 Boc-His(Trt)-Gly-OH인, 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e2) 및 단계 (f2) 사이에 커플링 테스트를 수행하는 단계를 추가로 포함하고, 커플링 테스트는 Kaiser 테스트인, 방법.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-2 유사체 펩티드는 아프라글루타이드인, 방법.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생성된 GLP-2 유사체 펩티드를 포함하는 조성물.
  33. 대상체에서 단장 증후군 관련 장 부전(SBS-IF) 또는 단장 증후군 관련 장 기능저하(SBS-II)를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며,
    대상체가 50 ㎏ 미만의 체중을 가질 경우, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염은 약 2.5 mg/주의 용량으로 투여되거나, 또는
    대상체가 50 ㎏ 이상의 체중을 가질 경우, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염은 약 5 mg/주의 용량으로 투여되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염은 피하 주사에 의해 투여되는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 대상체는 연속성 결장을 가지며, 아프라글루타이드 또는 제약상 허용 가능한 염은 약 48주 동안 투여되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 대상체는 50% 초과의 연속성 결장을 갖는, 방법.
  37. 제33항 또는 제34항에 있어서, 대상체는 적어도 하나의 소공을 갖고, 아프라글루타이드는 약 24주 동안 투여되는, 방법.
  38. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 식이 섭취 습윤 중량의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
  39. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료된 대상체에 비해 대상체에서 대변 배출을 감소시키는, 방법.
  40. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 절대 소변 배출량을 증가시키는, 방법.
  41. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 나트륨 및 칼륨의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
  42. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 나트륨 및 칼륨 소변 배설을 증가시키는, 방법.
  43. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 에너지의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
  44. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료된 대상체에 비해 대상체에서 대변 배출의 에너지 함량을 감소시키는, 방법.
  45. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료 대상체에 비해 대상체에서 탄수화물, 단백질 및 지질의 장 흡수를 증가시키는, 방법.
  46. 제33항에 있어서, 아프라글루타이드 또는 이의 제약상 허용 가능한 염의 투여는 미치료 또는 위약 치료된 대상체에 비해 대상체에서 시트룰린 농도를 증가시키는, 방법.
KR1020237000702A 2020-06-09 2021-06-09 아프라글루타이드의 제조, 제형화 및 투여 KR20230038187A (ko)

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