BRPI0710651A2

BRPI0710651A2 - composições farmacêuticas de hglp-1, expedina-4 e seus análogos e uso das mesmas

Info

Publication number: BRPI0710651A2
Application number: BRPI0710651-3A
Authority: BR
Inventors: Roland Cherif-Cheikh; Zheng Xin Dong; Maria Dolores Tobalina Maestre; Jose Antonio Cordero-Rigol; Frederic Lacombe
Original assignee: Sod Conseils Rech Applic
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2011-08-23
Also published as: IL194638A0; NZ571862A; WO2007120899A3; US20100087365A1; KR20080109092A; JP2009533460A; EP2015769A2; RU2008144696A; KR101089111B1; WO2007120899A2; RU2419452C2; AU2007238574B2; AU2007238574A1; EP2015769A4; CN101466394A; MX2008013168A; CA2648440A1

Abstract

COMPOSIçõES FARMACêUTICAS DE hGLP-1, EXPEDINA-4 E SEUS ANáLOGOS E USO DAS MESMAS A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem uma solução límpida ou uma mistura aquosa, uma suspensão ou um semi-sólido de pelo menos um composto de peptídeo selecionado do grupo que consiste em hGLP-1(7-36)-NH2 e seus análogos e derivados, h- GLP-1 (7-37)-OH e seus análogos e derivados, e/ou exendina-4 e seus00 aná logos e derivados, zinco e um solvente, onde pelo menos 95% do dito composto de peptídeo é dissolvido pelo solvente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES FARMACÊUTICAS DE hGLP-1, EXPEDINA-4 E SEUS ANÁLO-GOS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.

Este pedido de patente reivindica prioridade para o pedido depatente provisório n° US 60/791.701, depositado em 13 de abril de 2006.

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas quecompreendem o peptídeo-1 similar a glucagon humano ou exendina-4 e/ouseus análogos e derivados de hGLP-1 ou exendina, e refere-se a métodospara usar tais composições farmacêuticas para tratar doenças e/ou condi-ções seletas em seres humanos.

GLP-1 natural ou sintético e seus derivados são metabolicamen-te instáveis, tendo uma meia-vida plasmática de apenas um a dois minutosin vivo. Depois de administrados in vivo, é também degradado rapidamente.Esta instabilidade metabólica limita o uso terapêutico de GLP-1. Assim sen-do, existe uma necessidade de se obter uma composição farmacêutica es-pecífica que proporciona um perfil de liberação prolongada.

O objetivo da presente invenção é projetar e fornecer uma for-mulação capaz de manter a atividade biológica durante um período de tem-po prolongado, graças à formação de um depósito no local de injeção logoapós a administração.

Adicionalmente, o perfil de PK obtido a partir de deste depósitodeve ser tão plano quanto possível levando em conta as estreitas janelasterapêuticas do peptídeo.

A presente invenção engloba composições farmacêuticas queproporcionam uma liberação de um dia até mais do que uma semana.

As composições farmacêuticas da presente invenção poderiamser soluções límpidas, suspensões aquosas ou suspensões de misturas a-quosas de soluções, ou semi-sólidas.

A amida do peptídeo-1 (7-36) similar a glucagon (GLP-1 (7-36)-NH2) é sintetizada nas células- L intestinais por processamento pós-traduçãoespecífica de tecido do precursor de glucagon pré-pró-glucagon (Varndell,J.M. et al., J. Histochem. Cytochem. 33:1080-6 (1985)) e é liberada paradentro da circulação em resposta a uma refeição. A concentração plasmáticade GLP-1 aumenta a partir do nível de jejum de aproximadamente 15 pmol/Lpara um nível pico pós-prandial de 40 pmol/L. Foi demonstrado que, parauma dada elevação na concentração plasmática de glicose, o aumento nainsulina plasmática é aproximadamente três vezes maior quando a glicose éadministrada por via oral, em comparação com a via intravenosa (Kreymann,B. et al., Lancet 2:1300-4 (1987). Esta intensificação alimentar da liberaçãode insulina, conhecida como efeito de incretina, é principalmente humoral eacredita-se agora que GLP-1 seja a incretina fisiológica mais potente emseres humanos. Além do efeito insulinotrópico, GLP-1 suprime a secreçãode glucagon, retarda o esvaziamento gástrico (Wettergen, A. et al., Dig. Dis.Sei. 38:65-73 (1933)) e pode intensificar o descarte de glicose periférica(D'Alessio, D.A. et al., J. Clin. Invest. 93:2293-6 (1994)).

Em 1994, o potencial terapêutico de GLP-1 foi sugerido depoisda observação de que uma única dose subeutânea (s/c) de GLP-1 poderianormalizar completamente os níveis pós-prandiais de glicose em pacientescom diabete melito não-dependente de insulina (NIDDM) (Guntniak, M.K. etal., Diabetes Care 17:1039-44 (1994)). Este efeito foi tido como sendo medi-ado pela maior liberação de insulina e por uma redução na secreção de glu-cagon. Além disso, uma infusão intravenosa de GLP-1 demonstrou retardaro esvaziamento gástrico pós-prandial em pacientes com NIDDM (Williams,B. et ai, J. Clin. Endo. Metab. 81:327-32 (1996)). Diferentemente das sulfo-nil-uréias, a ação insulinotrópica de GLP-1 é dependente da concentraçãoplasmática de glicose (Holz, G.G. 4-, et al., Nature 361:362-5 (1993)). Assimsendo, a perda de liberação de insulina mediada por GLP-1 em baixa con-centração plasmática de GLP-1 protege contra hipoglicemia grave. Estacombinação de ações dá a GLP-1 vantagens terapêuticas potenciais singu-lares sobre outros agentes usados atualmente para tratar NIDDM.

Inúmeros estudos demonstraram que, quando dado a indivíduossadios, GLP-1 influencia de forma potente os níveis glicêmicos, bem comoas concentrações de insulina e glucagon (Orskov, C. Diabetologia 35:701-711 (1992); Holst1 J.J. et al., "Potential of GLP-1 in diabetes Management" in"Glucagon III, Handbook of Experimental Pharmacology", Editor Lefevbre,P.J., Berlim, Springer Verlag, 1996, páginas 311-326), efeitos que são de-pendentes de glicose (Kreymann, B. et al., Lartcet ii: 1300-1304 (1987); Weir,G.C. et al., Diabetes 38:338-342 (1989)). Além disso, GLP-1 é também efi-caz em pacientes com diabetes (Gutniak, M., N. Engl. J. Med. 226:1316-1322 (1992); Nathan, d.M. et al., Diabetes Care 15:270-276 (1992)), normali-zando os níveis sangüíneos de glicose em indivíduos com diabetes tipo Il(Nauck, MA),et al., Diabetologia 36:741-744 (1993), e melhorando o controleglicêmico em pacientes com diabetes tipo I (Creutzfeldt, W.O.) etal.,Diabetes Care 19:580-586 (1996)), elevando a possibilidade de seu usocomo um agente terapêutico.

GLP-1 é, entretanto, metabolicamente instável, tendo uma meia-vida plasmática (ti/2) de apenas 1-2 min in vivo. Administrado de forma exó-gena, GLP-1 é também degradado rapidamente (Deacon, C.F.) et al., Diabe-tes 44:1126-1131 (1995)). Esta instabilidade metabólica limita o potencialterapêutico de GLP-1 nativo.

Inúmeras tentativas foram feitas para melhorar o potencial tera-pêutico de GLP-1 e seus análogos através de aperfeiçoamentos na formula-ção. Por exemplo, a publicação de patente internacional n2 WO 01/57084descreve um processo para produzir cristais de análogos de GLP-1 que sãoditos como sendo úteis na preparação de composições farmacêuticas, taiscomo fármacos injetáveis que compreendem os cristais e um veículo farma-cêutico aceitável. Agregados cristalinos homogêneos de GLP-1 (7-37)-OHforam desenvolvidos a partir de soluções salinas e examinados depois detratamento embebendo os cristais com zinco e/ou m-cresol (Kim e Haren,Pharma. Res. Vol. 12 nQ 11 (1995)). Suspensões cristalinas brutas deGLP(7-36)-NH2, contendo cristais similars a agulhas e precipitação amorfaforam preparadas a partir de soluções de fosfato, contendo zinco ou prota-mina (Pridal et al., International Journal of Pharmaceutics vol. 136, páginas53-59 (1996)). A publicação de patente européia n- EP 0619322A2 descrevea preparação de formas microcristalinas de GLP-1 (7-37)-OH misturando so-luções da proteína em tampão de pH 7-8,5 com certas combinações de saise polietilenoglicóis (PEG) de baixo peso molecular. A patente n2 US6.566.490 descreve a semeadura de cristais de, inter alia, GLP-1, que sãoditos como auxiliando na produção de produtos de peptídeos purificados. Apatente n- US 6.555.521 descreve cristais de GLP-1 que têm um formato debastão ou formato de placa plana tetragonal, que são ditos como tendo me-lhor pureza e apresentando atividade prolongada in vivo. A patente n2 US6.555.521 enuncia que tais cristais são relativamente uniformes e permane-cem em suspensão por um período de tempo mais longo do que os agrega-dos cristalinos e suspensões cristalinas amorfas anteriores, que eram ditascomo decantando rapidamente, agregando ou formando grumos entre si,entupindo agulhas de seringas e geralmente e exacerbando dosagens im-previsíveis.

Um co-polímero de três blocos biodegradável de poli[(di-lactídeo-co-glicolídeo)-b-etilenoglicol-b-(lactídeo-co-glicolídeo)] foi sugeridopara uso em uma formulação com liberação controlada de GLP-1. Entretan-to, da mesma forma que outros sistemas poliméricos, a fabricação de co-polímeros com três blocos envolve protocolos complexos e formação incon-sistente de particulados.

Similarmente, polímeros biodegradáveis, por exemplo, poli(ácidolático-co-glicólico) (PLGA), também foram sugeridos para o uso em formula-ções de peptídeos com distribuição prolongada. Entretanto, o uso de taispolímeros biodegradáveis foi desfavorecido nessa técnica, pois estes polí-meros têm genericamente solubilidade deficiente em água e requerem sol-ventes orgânicos imiscíveis com água, por exemplo, cloreto de metileno,e/ou condições de preparação severas durante a fabricação. Tais solventesorgânicos e/ou condições de preparação severas são consideradas comoaumentando o risco de induzir mudança na conformação do peptídeo ou pro-teína de interesse, resultando em menor integridade estrutural e atividadebiológica comprometida (Choi et ai, Pharm. Res. Earch, vol. 21 n9 5 (2004).Os poloxâmeros também falharam (id.).

As composições de GLP-1 descritas nas referências preceden-tes são menos do que ideais para preparar formulações farmacêuticas deGLP pois elas tendem a reter impurezas e/ou são difíceis de outra forma pa-ra reproduzir de forma reprodutível e administrar. Além disso, os análogosde GLP s reconhecidamente induzem náuseas em concentrações elevadas,e assim sendo, há uma necessidade de se obter um efeito prolongado dofármaco com concentrações plasmáticas iniciais reduzidas. Assim sendo, háuma necessidade de se obter formulações de GLP-1 que são fabricadas deforma fácil e confiável, e que são administradas de forma fácil e reprodutívela um paciente, e que proporcionam concentrações plasmáticas iniciais redu-zidas para reduzir ou eliminar efeitos colaterais indesejados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção pode ser resumida nos parágrafos seguintes (1) até(28) abaixo, bem como conforme as reivindicações. Conseqüentemente:(I) Em um aspecto a presente invenção refere-se a uma composi-

ção farmacêutica que compreende uma solução límpida de (a) pelo menosum composto de peptídeo que tem uma solubilidade aquosa maior do que 1mg/mL à temperatura ambiente e um pH neutro, que é selecionado do grupoque consiste em hGLP-1(7-36)-NH2 e seus análogos e derivados, hGLP-1(7-37)-OH e seus análogos e derivados, exendina-4 e seus análgoso e deriva-dos,

<formula>formula see original document page 6</formula>

e seus análogos e derivados,<formula>formula see original document page 7</formula>

e seus análogos e derivados, e H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2, eseus análogos e derivados;

(b) um íon de metal bivalente; e

(c) um solvente,

desde que pelo menos 95% do dito composto de peptídeo esteja dissolvidopelo dito solvente.

1. Uma composição de acordo com o parágrafo (I), em que o ditoíon de metal bivalente é zinco.

2. Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição deacordo com os parágrafos (I) e (1), em que o dito solvente é água.

3. Uma composição de acordo com o parágrafo (I), compreenden-do um meio não-aquoso.

15 4. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (I)

a (3), em que o dito composto de peptídeo está presente em uma concentra-ção de cerca de 0,00001-500 mg/L, de preferência cerca de 0,0001-10mg/mL.

5. Uma composição de acordo com o parágrafo (1), em que o dito20 zinco está presente em uma concentração entre 0,0005 mg/mL e 50 mg/mL.

6. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (I)a (5), compreendendo ainda um conservante.7. Uma composição de acordo com o parágrafo (6), em que o ditoconservante é selecionado do grupo que consiste em m-cresol, fenol, álcoolbenzílico e metil-Paraben.

8. Uma composição de acordo com o parágrafo (7), em que o ditoconservante está presente em uma concentração entre 0,01 mg/mL e 50g/mL.

9. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (I)a (8), compreendendo ainda um agente isotônico.

10. Uma composição de acordo com os parágrafos (I) a (9), em queo dito agente isotônico está presente em uma concentração entre 0,01mg/mL e 50 mg/mL.

11. Uma Composição de acordo com os parágrafos (I) a (10), com-preendendo ainda um estabilizador.

12. Uma composição de acordo com o parágrafo (11), em que o ditoestabilizador é selecionado de grupo que consiste em imidazol, arginina ehistidina.

13. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)a (12), compreendendo ainda um tensoativo.

14. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)a (13), compreendendo ainda um agente quelante.

15. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)a (14), compreendendo ainda um tampão.

16. Uma composição de acordo com o parágrafo (15), em que o ditotampão é selecionado do grupo que consiste em Tris, acetato de amônio,acetato de sódio, glicina, ácido aspártico e Bis-Tris.

17. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)a (16), compreendendo ainda um polipeptídeo básico.

18. Uma composição de acordo com o parágrafo (17), em que o ditopolipeptídeo básico é selecionado do grupo que consiste em polilisina, poli-arginina, poliorinitina, protamina, putrescina, espermina, espermidina e his-tona.

19. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)a (18), compreendendo ainda álcool ou um mono- ou dissacarídeo.

20. Uma composição de acordo com o parágrafo (19), em que o ditoálcool ou mono- ou dissacarídeo é selecionado do grupo que consiste emmetanol, etanol, propanol, glicerina, trealose, manitol, glicose, eritrose, ribo-se, galactose, frutose, maltose, sacarose e lactose.

21. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)a (20), compreendendo ainda sulfato de amônio.

22. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantida-de eficaz de um composto de acordo com qualquer um dos parágrafos (1) a(21) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou dilu-ente farmaceuticamente aceitável do mesmo.

23. Um método para eliciar um efeito agonista de um receptor deGLP-1 em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo adminis-trar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um composto de acordo como parágrafo (1) ou parágrafo (22) ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo.

24. Um método para tratar uma doença selecionada do grupo queconsiste em diabetes tipo I, diabetes tipo II, obesidade, glucagonomas, dis-túrbios secretórios das vias aéreas, distúrbio metabólico, artrite, osteoporo-se, doença do sistema nervoso central, restenose e doença neurodegenera-tiva, em um indivíduo que necessita mesmo, compreendendo administrar aodito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição de acordo com oparágrafo (1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo do mesmo.

25. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um méto-do para eliciar um efeito agonista de um receptor de GLP-1 em um indivíduoque necessita do mesmo, compreendendo administrar ao dito indivíduo umaformulação da presente invenção que compreende uma quantidade eficazde um composto de acordo com o parágrafo (1), como aqui definido acima,ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

26. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método paratratar uma doença selecionada do grupo que consiste em diabetes Tipo I,diabetes Tipo II, obesidade, glucagonomas, distúrbios secretórios das viasaéreas, distúrbios metabólicos, artrite, osteoporose, doença do sistema ner-voso central, restenose, doença neurodegenerativa, insuficiência renal, insu-ficiência cardíaca congestiva, síndrome nefrótica, cirrose, edema pulmonar,hipertensão e distúrbios nos quais a redução da ingestão de alimentos é de-sejada, em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo adminis-trar ao dito indivíduo para uso em uma formulação da presente invenção quecompreende uma quantidade eficaz de um composto do parágrafo (I), comoaqui definido acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

27. Um método preferido do parágrafo (26) no qual a doença queestá sendo tratada é diabetes do Tipo I ou diabetes Tipo II.

(II) Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a umacomposição farmacêutica que compreende uma solução límpida ou umamistura aquosa, uma suspensão ou uma composição farmacêutica semi-sólida de (a) pelo menos um composto de peptídeo que tenha uma solubili-dade maior do que 1 mg/mL à temperatura ambiente e tendo um pH entre3,0 e 8,0, e de preferência um pH entre 4,0 e 6,0, que é selecionado do gru-po que consiste em hGLP-1(7-36)-NH2 e seus análogos e derivados, hGLP-1 (7-37)-OH e seus análogos e derivados, exendina-4 e seus análgoso e de-rivados,

<formula>formula see original document page 10</formula>

e seus análogos e derivados,<formula>formula see original document page 11</formula>

(b) um íon de metal bivalente; e

(c) um solvente,

desde que pelo menos 95% ± 5% do dito composto de peptídeo esteja dis-solvido pelo dito solvente. O número referencial do segundo aspecto da in-venção 1 a 27 são os números sob o parágrafo II.

1. Uma composição de acordo com o parágrafo (II), em que o ditoíon de metal bivalente é zinco.

2. Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição deacordo com os parágrafos (II) e (1), em que o dito solvente é água.

3. Uma composição de acordo com o parágrafo (II), compreenden-do um meio não-aquoso.

4. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (3), em que o dito composto de peptídeo está presente em uma concentra-ção de cerca de 0,00001-500 mg/L, ou 0,00001-500 mg, de preferência decerca de 50-350 mg/mL ou 50-350 mg/L.

5. Uma composição de acordo com o parágrafo (1), em que o ditozinco está presente em uma concentração entre 0,0005 mg/mL e 50 mg/mL.

6. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (5), compreendendo ainda um conservante.

7. Composição de acordo com o parágrafo (6), em que o dito con-servante é selecionado do grupo que consiste em m-cresol, fenol, álcoolbenzílico e metil-Paraben.

8. Composição de acordo com o parágrafo (7), em que o dito con-servante está presente em uma concentração entre 0,01 mg/mL e 50 g/mL.

9. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (8), compreendendo ainda um agente isotônico.

10. Uma composição de acordo com os parágrafos (II) a (9), em queo dito agente isotônico está presente em uma concentração entre 0,01mg/mL e 50 mg/mL.

11. Composição de acordo com os parágrafos (II) a (10), compreen-dendo ainda um estabilizador.

12. Uma composição de acordo com o parágrafo (11), em que o ditoestabilizador é selecionado do grupo que consiste em imidazol, arginina ehistidina.

13. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (12), compreendendo ainda um surfactante.

14. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II) a (13), compreendendo ainda um agente quelante.

15. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (14), compreendendo ainda um tampão.

17. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (16), compreendendo ainda um polipeptídeo básico.

18. Composição de acordo com o parágrafo (17), em que o dito poli-peptídeo básico é selecionado do grupo que consiste em polilisina, poliargi-nina, poliorinitina, protamina, putrescina, espermina, espermidina e histona.

19. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (18), compreendendo ainda álcool ou um mono- ou dissacarídeo.

21. Uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos (II)a (20), compreendendo ainda sulfato de amônio.

22. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantida-de eficaz de um composto de acordo com qualquer um dos parágrafos (II) a(21) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou dilu-ente farmaceuticamente aceitável.

23. Um método para eliciar um efeito agonista de um receptor deGLP-1 em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo adminis-trar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um composto de acordo como parágrafo (II) ou parágrafo (22) ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo do mesmo.

24. Um método para tratar uma doença selecionada do grupo queconsiste em diabetes Tipo I, diabetes Tipo II, obesidade, glucagonomas, dis-túrbios secretórios das vias aéreas, distúrbio metabólico, artrite, osteoporo-se, doença do sistema nervoso central, restenose e doença neurodegenera-tiva, em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo administrarao dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição de acordo como parágrafo (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

25. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um méto-do para eliciar um efeito agonista de um receptor de GLP-1 em um indivíduoque necessita do mesmo, compreendendo administrar ao dito indivíduo umaformulação da presente invenção que compreende uma quantidade eficazde um composto de acordo com o parágrafo (24), como aqui definido acima,ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

26. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método paratratar uma doença selecionada do grupo que consiste em diabetes Tipo I,diabetes Tipo II, obesidade, glucagonomas, distúrbios secretórios das viasaéreas, distúrbios metabólicos, artrite, osteoporose, doença do sistema ner-voso central, restenose, doença neurodegenerativa, insuficiência renal, insu-ficiência cardíaca congestiva, síndrome nefrótica, cirrose, edema pulmonar,hipertensão e distúrbios nos quais a redução da ingestão de alimentos é de-sejada, em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo adminis-trar ao dito indivíduo para uso em uma formulação da presente invenção quecompreende uma quantidade eficaz de um composto do parágrafo (II), comoaqui definido acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra um perfil plasmático de peptídeo, obtido depoisde uma única administração subcutânea a cães de uma composição aquosade 100 mg/g de hGLP-1(7-36)-NH2 com Zn, a D = 15 mg de peptídeo.

Todas abreviaturas (por exemplo, Ala) de aminoácidos nesterelatório descritivo representam a estrutura de -NH-CR1R2-CO-, em que R1e R2 são as cadeias laterais de um aminoácido (por exemplo, R1 = CH3 e R2= H para Ala). Amp, 1-Nal, Nle, Cha, 3-Pal, 4-Pal e Aib são as abreviaturasdos seguintes α-aminoácidos: 4-amino-fenilalanina, β-(1 -naftil)-alanina, β-(2-naftil)-alanina, norleucina, ciclo-hexil-alanina, p-(3-piridil)-alanina, p-(4-piridil)-alanina, e ácido α-amino-isobutírico, respectivamente. Outras definições deaminoácidos são: Ura é ácido urocânico; Pta é ácido (4-piridil-tio)-acético;Paa é ácido trans-3-(3-piridil)-acrílico; Tma-His é N,N-tetrametil-amidino-histidina; N-Me-Ala é N-metil-alanina; N-Me-Gly é N-metil-glicina; N-Me-Glué ácido N-etil-glutâmico; Tle é terc-butil-glicina; Abu é ácido a-amino-butírico;Tba é terc-butil-alanina; Orn é ornitina; Aib é ácido a-amino-isobutírico; β-Alaé β-alanina; Gaba é ácido γ-amino-butírico; Ava é ácido 5-amino-valérico;Ado é ácido 12-amino-dodecanóico; Aic é ácido 2-amino-indano-2-carboxílico; Aun é ácido 11-amino-undecanóico; e Aec é 4-(2-amino-etil)-1-carbóxi-metil-piperazina, representada pela estrutura:

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Acc significa um aminoácido selecionado do grupo de ácido 1-amino-1-ciclo-propanocarboxílico (A3c); ácido 1-amino-1-ciclo-butanocarboxílico (A4c); ácido 1-amino-1-ciclo-pentanocarboxílico (A5c);ácido 1-amino-1-ciclo-hexanocarboxílico (A6c); ácido 1-amino-1-ciclo-heptanocarboxílico (A7c); ácido 1-amino-1-ciclo-octanocarboxílico (A8c); eácido 1-amino-1-ciclo-nonanocarboxílico (A9c). Na fórmula acima, hidróxi-alquila, hidróxi-fenil-alquila e hidróxi-naftil-alquila podem incluir substituintes1-4-hidróxi. COX5 representa -C=O X5. Os exemplos de -C=O X5 incluem,porém sem limitações, acetila e fenil-propionila.

Os nomes completos de outras abreviaturas aqui utilizadas sãoos seguintes: Boc para terc-butóxi-carbonila, HF para fluoreto de hidrogênio,Fm para formila, Xan para xantila, Bzl para benzila, Tos para tosila, DNPpara 2-,4-dinitro-fenila, DMF para dimetil-formamida, DCM pra dicloro-metano, HBTU para hexaflúor-fosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-urônio, DIEA para diisopropil-etil-amina, HOAc para ácido acético,TFA para ácido triflúor-acético, 2CIZ para 2-cloro-benzilóxi-carbonila, 2BrZpara 2-bromo-benzilóxi-carbonila, OcHex para O-ciclo-hexila, Fmoc para 9-fluorenil-metóxi-carbonila, HOBt para N-hidróxi-benzotriazol; resina PAM pa-ra resina 4-hidróxi-metil-fenil-acetamido-metila; Tris para tris-(hidróxi-metil)-amino-metano e Bis-Tris para bis-(2-hidróxi-etil)-amino-tris-(hidróxi-metil)-amino-metano (isto é, 2-bis-(2-hidróxi-etil)-amino-2-(hidróxi-metil)-1,3-propanodiol).

O termo "halo" ou "halogênio" engloba flúor, cloro, bromo e iodo.

Os termos "grupamento hidrocarboneto de C1-C12", "grupamentohidrocarboneto de C1-C30", e similares englobam grupos alquila, aquenila ealquinila com cadeia ramificada e linear, que têm o número indicado de car-bonos, desde que no caso de alquenila e alquinila haja um mínimo de doiscarbonos.

Um peptídeo desta invenção é aqui denotado também por outroformato, por exemplo, (A5c8)hGLP-1(7-36)NH2, com os aminoácidos substi-tuídos a partir da seqüência natural colocada entre o primeiro conjunto deparênteses (por exemplo, A5c8 no lugar de Ala8 em hGLP-1). A abreviaturaGLP-1 significa peptídeo 1 similar a glucagon; hGLP-1 significa peptídeo 1similar a glucagon humano. Os números entre os parênteses referem-se aonúmero de aminoácidos presentes no peptídeo (por exemplo, hGLP-1(7-36)são aminoácidos 7 até 36 da seqüência do peptídeo para GLP-1 humano). Aseqüência de hGLP-1(7-37) está listada em Mojsov, S., Int. J. Peptide Prote-in Res,. 40:333-342 (1992). A designação "NH2" em hGLP-1 (7-36)NH2 indicaque o terminal C do peptídeo é amidado. hGLP-1 (7-36) significa que o termi-nal C é o ácido livre. Em hGLP-1 (7-36), os resíduos nas posições 37 e 38são Gly e Arg, respectivamente, a menos que diferentemente indicado. Aseqüência de exendina-4 está listada em J. W. Neidigh et ai, Biochemistry40:13188-13200(2001).

O termo "solução límpida" significa uma solução que compreen-de um solvente e um ou mais solutos, em que 95% ± 5%, de preferência,99% do soluto estão completamente dissolvidos, de tal modo que a soluçãoseja relativamente transparente. Uma solução límpida pode ter traços desoluto não-dissolvido observável e/ou outras partículas inativas, dependendoda pureza do solvente usado; entretanto, tais partículas não estão em umaquantidade suficiente para criar uma aparência Ieitosa ou turva. Uma solu-ção límpida não se aplica a uma suspensão que é uma mistura heterogêneaconstituída de uma fase diversa e contínua, enquanto que uma solução éuma mistura homogênea de uma única fase de duas ou mais substâncias.

O termo "mistura", "suspensão" ou "semi-sólido" aquoso é umaformulação que compreende um solvente e um ou mais solutos, em que osoluto pode estar parcialmente dissolvido, de tal modo que a formulação nãoseja uma composição transparente que pudesse passar como líquida comouma solução límpida ou mais viscosa, dependendo da concentração do solu-to, mas ainda injetável usando agulhas finas.

Os peptídeos usados nesta invenção podem ser fornecidos van-tajosamente na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplosde tais sais incluem, porém sem limitações, aqueles formados com ácidosorgânicos (por exemplo, ácido acético, lático, maléico, cítrico, málico, ascór-bico, succínico, benzóico, metanossulfônico, toluenossulfônico ou pamóico,ácido triflúor-acético (TFA)), ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídri-co, ácido sulfúrico, ou ácido fosfórico), e ácidos poliméricos (por exemplo,ácido tânico, carbóxi-metil-celulose, ácido polilático, poliglicólico ou co-polímeros de ácidos polilático-glicólico).

Um método típico para fabricar um sal de um peptídeo da pre-sente invenção é bem-conhecido na técnica e pode ser realizado por méto-dos padronizados de troca de sais.

Como é do conhecimento aqueles versados na técnica, os usosconhecidos e potenciais de GLP-1 são variados e numerosos (vide Todd,J.F. et ai, Clinicai Science 95:325-329 (1998); e Todd, J.F. et ai, EuropeanJournal of clinicai Investigation. 27:533-536 (1997)).

Assim sendo, administração de GLP-1 de ocorrência natural (istoé, hGLP-1(7-36)-NH2 e hGLP-1(7-37)-OH, exedin-4, PC-DAC®, Liraglutide®e/ou AVE-0010/ZP-10), de acordo com esta invenção com os propósitos deeliciar um efeito agonista pode avançar muito o tratamento de várias doen-ças e condições debilitantes conhecidas como sendo tratáveis por GLP-1,tais como: diabetes Tipo I, diabetes Tipo II, obesidade, glucagonomas, dis-túrbios secretórios das vias aéreas, distúrbios metabólicos, artrite, osteopo-rose, doença do sistema nervoso central, restenose, doenças neurodegene-rativas, insuficiência renal, insuficiência cardíaca congestiva, síndrome nefró-tica, cirrose, edema pulmonar, hipertensão e distúrbios nos quais a reduçãoda ingestão de alimentos é desejada.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui dentro do seuescopo composições farmacêuticas como aqui definidas, compreendendocomo um ingrediente ativo, pelo menos um dos compostos do parágrafo (I).

A dosagem do ingrediente ativo nas formulações desta invençãopode ser variada; entretanto, é necessário que a quantidade do ingredienteativo seja tal que uma dosagem apropriada seja obtida. A dosagem selecio-nada depende do efeito terapêutico desejado, da via de administração, e daduração do tratamento, e normalmente será determinada pelo médico aten-dente. Genericamente, uma dosagem eficaz para as atividades desta inven-ção fica na faixa de 1 χ 10"7 a 200 mg/kg/dia, de preferência 1 χ 10"4 a 100mg/kg/dia, que pode ser administrada como uma única dose ou dividia emmúltiplas doses.

As formulações desta invenção são, de preferência, administra-das por via parenteral, por exemplo, intramuscular, intraperitoneal, intrave-nosa, subcutânea, e similares.

As preparações de acordo com a invenção para administraçãoparenteral incluem soluções, suspensões, géis ou emulsões aquosas ounão-aquosas estéreis, desde que o perfil de liberação in vivo desejado sejaatingido. Os exemplos de solventes ou veículos não-aquosos são propileno-glicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e óleo de mi-lho, gelatina, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Taisformas de dosagem podem conter também adjuvantes tais como agentesconservantes, umectantes, emulsificantes e dispersantes. Elas podem seresterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro retentor de bac-térias, incorporando agentes esterilizantes nas composições, irradiando ascomposições ou aquecendo as composições. Elas podem ser também fabri-cadas na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidasem água esterilizada, ou em alguma outro meio injetável estéril imediata-mente antes do uso.

A menos que definido de outra forma, todos termos técnicos ecientíficos utilizados aqui têm o mesmo significado que aquele comumenteentendido pelos versados na técnica às quais a invenção pertence. Alémdisso, todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referên-cias aqui mencionadas são incorporadas por referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Síntese de Peptídeos

Os peptídeos úteis para praticar a presente invenção podem sere foram preparados por síntese padronizada de peptídeos em fase sólida.Vide, por exemplo, Stewart, J.M. et aí., "Solid Phase Synthesis" (Pierce che-mical Co., 2- edição, 1984). Os substituintes podem ser anexados à aminalivre dos resíduos de aminoácidos Lys ou outros por métodos padronizadosconhecidos nessa técnica. Por exemplo, um grupo acila pode ser anexadoacoplando o ácido livre à amina livre de um resíduo misturando o peptídeo-resina parcialmente protegido com 3 equivalentes molares do ácido livre etambém da diisopropil-carbodiimida em cloreto de metileno por uma hora.

hGLP-1(7-36)-NH2 foi sintetizado em um sintetizador de peptí-deos modelo 430A da Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA), que foimodificado para fazer síntese de peptídeos em fase sólida acelerada porquímica de Boc. Vide Schnolzer et ai, Int. J. Peptide Protein Res. 90:180(1992). A resina de 4-metil-benzidril-amina (MBHA) (Península, Belmont, CA,EUA) foi usada. Os Boc-aminoácidos (Bachem, CA1 torrance, CA; Nova Bio-chern., La Jolla, CA) foram usados com a seguinte proteção das cadeias Ia-terais: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-lle-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Thr(BzI)-OH, Boc-Ser(BzI)-OH,Boc-Phe-OH, Boc-Glu(ocHex)-OH, e Boc-Trp(Fm)-OH. Os grupos Boc foramremovidos por tratamento com TFA a 100% por 2 X 1 min. Os Boc-aminoácidos foram pré-ativados com HBTU e DIEA em DMF e foram aco-plados sem neutralização prévia do sal de TFA de resina-peptídeo. Os tem-pos de acoplamento foram de 5 min.

No final da montagem da cadeia peptídica, a resina foi tratadacom uma solução de 20% de mercaptoetanol/10% de DIEA em DMF por 2 X30 min. O grupo Boc no terminal N foi então removido por tratamento comTFA a 100% por 2x2 min. Depois da neutralização do peptídeo-resina com10% de DIEA em DMF (1 X 1 min), o grupo formila na cadeia lateral de Trpfoi removido por tratamento com uma solução de 15% de etanol-amina/15%de água/70% de DMF por 2 X 30 min. O peptídeo-resina foi lavado com DMGe DCM e secado sob pressão reduzida. A clivagem final foi feita agitando opeptídeo-resina em HF contendo anisol e ditioeritritol a O 0C por 75 min. OHF foi removido por um fluxo de nitrogênio. O resíduo foi lavado com éter eextraído com HOAc 4 N.

A mistura peptídica no extrato aquoso foi purificada por croma-tografia líquida preparatória em fase reversa sob alta pressão (HPLC) usan-do uma coluna de fase reversa VYDAC® Cie (Nest Group, Southborough1MA). A coluna foi eluída com um gradiente linear (20% a 50% de solução Bdurante 105 min) em uma vazão de 10 mL/min (Solução A = água contendo0,1% de TFA; Solução B = acetonitrila contendo 0,1% de TFA). As fraçõesforam coletadas e verificadas em HPLC analítica. Aquelas que continhamproduto puro foram combinadas e Iiofilizadas até secar. A pureza do peptí-deo final foi verificada por um sistema de HPLC analítica. A análise de es-pectrômetro de massas por eletrospray (EM(ES)) foi usada para verificar opeso molecular do produto final.

Os sais dos peptídeos com TFA da presente invenção resultam da purificação do peptídeo usando HPLC preparatória, eluindo com soluçõesde tampão contendo TFA. Os sais de TFA podem ser convertidos em outrosal, tal como sal acetato dissolvendo o peptídeo em uma pequena quantida-de de solução aquosa 0,25 N de ácido acético. A solução resultante é apli-cada a uma coluna de HPLC semipreparatória (Zorbax, 300 SB, c-8). A co-luna é eluída com (1) solução aquosa de acetato de amônio 0,1 N por 0,5 h;(2) solução aquosa de ácido acético 0,25 N por 0,5 h; e (3) um gradiente li-near (20% até 100 de solução B dirante 30 min) em uma vazão de 4 mLVmin(a solução A é solução aquosa 0,25 N de ácido acético; solução B é ácidoacético 0,25 N em acetonitrila/água 80:20). As frações que contêm o peptí-deo são coletadas e Iiofilizadas até secar.

<formula>formula see original document page 20</formula>

é comercializado sob a denominação comercial PC-DAC® e é propriedadeda Conjuchem, de Montreal, Quebec, Canadá. Peptídeo discutido:<formula>formula see original document page 21</formula>

é comercializado sob a denominação comercial Liraglutide® e é propriedadeda Novo Nordisk, Bagsvroi, dinamarca. Peptídeo discutido:H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2, é referido na técnica anteriorescomo "AVE-001/ZP-10" e é propriedade conjunta de Sanofi-Aventis, Paris,França, e Zealand Pharma1 Glostrup, Dinamarca.

Procedimentos Experimentais

A . Determinação da Afinidade do Receptor de GLP-1

Os compostos úteis para praticar a presente invenção podemser testados quanto à sua capacidade de se ligarem ao receptor de GLP-1usando o procedimento que se segue.

Cultura de Células:

Células de insulinoma de rato RIN 5F (ATCC n- CRL-2058, A-merican Type Culture Collection, Manassas, VA), que expressam o receptorde GLP-1, são cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco(DMEM), contendo 10% de soro fetal vitelínico, e são mantidas a cerca de37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de C02/95% de ar.

Ligação do Radioligante:

As membranas são preparadas para estudos da ligação do ra-dioligante por homogeneização das células RIN em 20 mL de Tris_HCI 50mM gelado com um Polytron Brinkman (Westbury, NY) (ajustando 6, 15 se-gundos). Os homogeneizados são lavados duas vezes por centrifugação(39.000 χ g/10 min), e os péletes finais são recolocados em suspensão emTris-HCI 50 mM, contendo MgCI2 2,5 MM, 0,1 mg/mL de bacitracina (SigmaChemical, St. Louis, MO), e 0,1% de BSA. Para o ensaio, alíquotas (0,4 mL)são incubadas com (125I)GLP-I (7-36) 0,05 nM (-2.200 Ci/mmol, New En-gland Nuclear, Boston, MA), com e sem 0,05 mL de peptídeos em testecompetitivos não-marcados. Depois de uma incubação de 100 min (25 0C), o(125I)GLP-I (7-36) ligado é separado do livre por filtração rápida através defiltros de GF/C (Brandel, Gaithersburg, MD), que são previamente mergulha-dos em polietilenoimina a 0,5%. Os filtros são então lavados três vezes comalíquotas de 5 mL de Tris-HCI 50 mM gelado, e radioatividade ligada captu-rada nos filtros é contada por espectrometria gama (Wallac LKB, Gaithers-burg, MD). A ligação específica é definida como (125I)GLP-I (7-36) total ligadomenos aquele ligado na presença de GLP-1(7-36) 1.000 nM (Bachem, Tor-rence, CA).

B. Determinação da solubilidade Versus pH

Vantajosamente, os compostos para uso na presente invençãosão relativamente solúveis em soluções aquosas em um certo pH e são rela-tivamente insolúveis em soluções aquosas na presença de íons de metaisbivalentes, tal como zinco. Os compostos para uso na presente invençãotêm uma solubilidade aquosa maior do que 1 mg/mL em pH neutro à tempe-ratura ambiente.

Determinação da Solubilidade Aquosa dos Compostos em pH 7:

Os compostos que podem ser usados vantajosamente para pra-ticar a invenção podem ser testados para determinar sua solubilidade à tem-peratura ambiente ou aproximadamente 37 0C em água, usando o procedi-mento que se segue.

Para determinar a solubilidade à temperatura ambiente, 2 mg dehGLP-1(7-36)-NH2 são pesados e depositados dentro de um frasco de vidroe uma alíquota de 200 uL de água desmineralizada é então adicionada aofrasco. O procedimento ocorre em uma sala mantida a aproximadamente 25°C. O pH da solução resultante é medido como sendo aproximadamente 5. Aamostra de peptídeo se dissolve instantaneamente e uma solução límpida éobservada. Um pH neutro (pH 7) é atingido tratando a solução da amostracom uma pequena quantidade de NaOH 0,1 Ν. A solução neutra é observa-da como sendo límpida, indicando assim que a solubilidade de hGLP-1(7-36)-NH2 é maior do que 10 mg/mL à temperatura ambiente em pH neutro.

Para determinar a solubilidade a 37 °C, 2 mg de hGLP-1(7-36)-NH2 são pesados e depositados dentro de um frasco de vidro e uma alíquotade 200 uL de água desmineralizada é então adicionada ao frasco. O proce-dimento ocorre em uma sala mantida a aproximadamente 37 °C. O pH dasolução resultante é medido como sendo aproximadamente 5. A amostra depeptídeo se dissolve instantaneamente e uma solução límpida é observada.Um pH neutro (pH 7) é atingido tratando a solução da amostra com uma pe-quena quantidade de NaOH 0,1 Ν. A solução neutra é observada como sen-do límpida, indicando assim que a solubilidade de hGLP-1(7-36)-NH2 é maiordo que 10 mg/mL a 37 °C.

C. Determinação da Solubilidade Aquosa do Composto Versus Concentra-ção de Zinco

Os compostos que podem ser usados vantajosamente para pra-ticar a invenção podem ser testados para determinar sua solubilidade emágua em pH 7, em diferentes concentrações de zinco, usando o procedimen-to que se segue.

Uma solução de insumo de zinco é preparada dissolvendo ZnCl2em água desmineralizada até uma concentração de 100 mg/mL e ajustandoo pH para 2,7 usando HCl. As soluções com várias concentrações de zinco("Soluções de Teste de Zinco") são preparadas fazendo diluições apropria-das da solução de insumo.

Uma amostra de 1 mg do composto testado é dissolvida em 250μL de cada solução de zinco testada, para produzir uma solução que tem 4mg/mL do composto testado. O pH desta solução é então ajustado usandoNaOH 0,2 N até se formar um precipitado branco. A solução da precipitaçãoé centrifugada e o licor-mãe é analisado usando HPLC. A área de absorçãode UV do pico do composto em teste é medida e a concentração do compos-to testado no licor-mãe é determinada por intermédio de comparação comuma curva de calibração.D. Ensaios In Vivo

As composições da presente invenção podem ser usadas e fo-ram testadas para determinar sua capacidade de promover e intensificar oefeito in vivo usando os ensaios que se seguem.Procedimento Experimental de 24 Horas:

No dia anterior ao experimento, ratos Sprague-Dawley machosadultos (Taconic, Germantown, NY) que pesavam aproximadamente 300-350 g receberam implante de um cânula jugular atrial direita sob o anestési-co cloridrato. Os ratos foram então jejuados por 18 horas antes da injeção dacomposição em teste apropriada ou controle de veículo na hora 0. Os ratoscontinuam a jejuar durante o experimento inteiro.

Na hora zero os ratos receberam injeção subcutânea (1c) doscompostos testados em pH 4,0 ou pH 7,0 como uma solução límpida. Emambos casos o volume da injeção é muito pequeno (4-6 μL) e a dose docomposto de GLP-1 administrada ao indivíduo é de 75 μg/kg. Na hora apro-priada depois das injeções subcutâneas, uma amostra de sangue de 500 μLé retirada por intermédio da cânula intravenosa (iv) e os ratos recebem umainjeção intravenosa de glicose para testar a presença de maior secreção deinsulina. Os tempos do desafio de glicose são 0,25, 1,6, 12 e 24 horas apósa injeção do composto. Depois que a amostra de sangue inicial é retirada,glicose é injetada (1 g/kg) por via intravenosa e lavada com 500 μL de solu-ção salina heparinizada (10 U/mL). Depois disso, 500 μL de amostras desangue são retirados em 2,5, 5, 10 e 20 minutos depois da injeção de glico-se. Cada uma delas é imediatamente acompanhada de uma injeção intrave-nosa de 500 μL de solução salina heparinizada (10 U/mL) através da cânula.As amostras de sangue são centrifugadas, o plasma é coletado de cada a-mostra e as amostras são estocadas a -20 °C até que elas sejam testadasquanto ao teor de insulina. A quantidade de insulina em cada amostra é de-terminada usando um kit de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELI-SA) para insulina do rato (American Laboratory Products Co., Windham,NH).

Resultados:

Uma atividade intensificadora de insulina prolongada é observa-da que é induzível por injeção de glicose durante as 24 horas inteiras do ex-perimento.

Procedimento Experimental - Prazo Prolongado

O procedimento geral é igual àquele descrito anteriormente nes-te caso. Neste caso, um composto testado ou um controle com veículo éinjetado por via subcutânea ("sc") no tempo zero. Os pontos no tempo para odesafio de glicose são 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas depois da injeção. A inje-ção de glicose por intermédio da cânula intravenosa e subseqüente amos-tragem de sangue são realizadas como no experimento descrito anterior-mente. Por causa do período de jejum prolongado, os controles com veículoe apenas glicose são incluídos em cada ponto no tempo.Resultados:

Uma atividade intensificadora de insulina prolongada que é indu-zível por glicose por pelo menos 48 horas depois da injeção subcutânea dacomposição testada é observada. Além disso, como no experimento descritoanteriormente, nenhum nível alto inicial de intensificação de insulina em res-posta à glicose é observada.

E. As composições da presente invenção podem ser e foram testa-das para determinar sua capacidade de promover a liberação prolongada decomposto ativo in vivo, usando os ensaios E.1 - E.4 descritos abaixo.

As composições para uso nos ensaios abaixo foram preparadasde acordo com o seguinte procedimento genérico:

Soluções de insumo de 100 mg/mL de ZnCl2 foram preparadasdissolvendo cloreto de zinco (Merck, Mollet Del Vallès, Barcelona, Espanha)em água estéril para injeção (Braun, Rubi, Espanha) cujo pH foi ajustadopara pH 2,7, usando HCl. As soluções que contêm zinco em várias concen-trações, por exemplo, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 2 mg/mL, etc., foram obtidaspor diluição da solução de insumo. As soluções que contêm zinco em con-centrações mais baixas, por exemplo, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 30 μg/mL, forampreparados de uma maneira análoga por diluição de uma solução de insumoque compreende 1 mg/mL de ZnCI2.

Uma quantidade apropriada de um composto a ser testado foipesada e dissolvida no volume apropriado de cada solução de zinco resul-tante, para produzir uma solução límpida que tem uma concentração dese-jada do composto, por exemplo, 4 mg/mL. As soluções resultantes foramentão microfiltradas e, caso necessário, estocadas em frascos protegidoscontra a luz antes da administração.

A concentração do composto em teste no plasma dos indivíduosem teste pode ser determinada por inúmeros métodos conhecidos nessatécnica. Em um método conveniente, a concentração de um composto é de-terminada por intermédio de radioimunoensaio, empregando um anticorpoderivado do coelho para o composto em teste em competição com umaquantidade conhecida do composto em teste que foi radioiodado com, porexemplo, 125I.

E. 1 Estudo Farmacocinético 1

O efeito do zinco sobre a biodisponibilidade de um compostoativo administrado a um indivíduo usando uma composição de acordo com ainvenção pode ser e foi determinada como se segue.

Depois dos procedimentos descritos acima, quatro composiçõesaquosas foram formuladas para ter 4 mg/mL dos compostos testados em pH= 2,7, e 0,0, 0,1, 0,5 e 2,0 mg/mL de ZnCI2, respectivamente. Cada uma dasquatro composições foi administrada por via subcutânea a 16 ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA). A idade médiados ratos era aproximadamente 8-9 semanas, e o peso médio era aproxima-damente 260-430 g. Os ratos receberam alimento e água à vontade.

E. 2. Estudo Farmacocinético 2

O efeito do volume de injeção sobre a biodisponibilidade de umcomposto bioativo administrado a um indivíduo usando uma composição deacordo com a invenção pode ser e foi determinado como se segue.

Depois dos procedimentos descritos acima, três composiçõesaquosas foram formuladas para ter 3.000, 300 e 75 μg/mL, respectivamente,em um pH de 2,7 e uma concentração de zinco de 0,5 mg/mL. Cada umadas composições foi administrada a 16 ratos Sprague-Dawley (Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA, EUA). A idade média dos ratos era aproxima-damente 8-10 semanas, e o peso médio era aproximadamente 330-460 g.Os ratos jejuaram de um dia para outro antes do começo do estudo. O volu-me de injeção foi selecionado para fornecer a cada rato uma dose de 75μg/kg do composto testado (0,025 mL/kg, 0,25 mL/kg, e 1 mL/kg, respecti-vamente).

E. 3. Estudo Farmacocinético 33

O efeito do zinco sobre a biodisponibilidade de um compostoativo administrado a um indivíduo usando uma composição de acordo com ainvenção pode ser e foi determinado como se segue.

Depois dos procedimentos descritos acima, três composiçõesaquosas foram formuladas para ter 4 g/mL dos compostos testados em pH =2,7, e 10, 20 e 30 μg/mL de zinco, respectivamente. Cada uma das trêscomposições foi administrada por via subcutânea a 16 ratos Sprague-Dawley albinos machos (St. Feliu de codines, Barcelona, Espanha). Estesratos jejuaram de um dia para o outro antes do começo do estudo.

E. 4. Estudo Farmacocinético 4

O efeito do zinco e de concentrações de compostos bioativossobre a biodisponibilidade do composto bioativo quando administrado a umindivíduo usando uma composição de acordo com a invenção pode ser efeito determinado como se segue.

Depois dos procedimentos descritos acima, duas composiçõesaquosas foram formuladas. A primeira solução compreendia 1,45 mg/mL doscompostos testados e 30 μg/mL de zinco, e a segunda compreendia 1,45mg/mL do composto mas sem zinco. Ambas soluções tinham um pH = 2,7.Cada solução foi administrada por via subcutânea a cães Beagle machos(Isoquimen, Barcelona, Espanha) com uma faixa etária entre aproximada-30 mente 54 e 65 meses, e com peso entre aproximadamente 16 e 21 kg. Oscães jejuaram durante a noite inteira antes do começo do estudo. Adicional-mente, a segunda solução que contém apenas composto ativo foi adminis-trada por via intravenosa.

E. 5. Exemplos de Estudo de Farmacocinética

Esta parte descreve a preparação e administração de um com-posto de 100 mg/g de peptídeo-1 similar a glucagon humano natural, formu-lação aquosa do peptídeo hGLP-1(7-36)-NH2 (p/p) com Zn (a partir de umZnCI2), sendo na razão molar de [Peptídeo:Zn] = 1,5:1.

A substância testada é hGLP-1(7-36)-NH2 natural e foi fornecidapor Polypeptide, EUA).E.5. 1 Procedimento de Preparação

O composto de peptídeo foi pesado e misturado com uma quan-tidade pesada de solução de ZnCI2, 1,474 mg de Zn/mL, para ter uma con-centração final do peptídeo de 100 mg/g e uma razão molar final [Peptí-deo:Zn] = 1,5:1.

Seringas com agulha 29G (0,33 mm) foram enchidas com aquantidade da composição necessária para administrar uma dose de 15 mgde peptídeo. Depois da preparação, as amostras foram analisadas e a com-posição foi administrada a cães Beagle machos.

Os seguintes resultados analíticos foram obtidos:Teor de Peptídeo: 10,31 ± 0,03% p/p

Dose Injetada: 15,71 ±0,18 mgPureza por HPLC: 98,5% Ar4,5

O valor da razão molar para a composição foi [Peptídeo:Zn] =1,44:1.

E. 5. 2. Estudo de PK, Bioanálise e Resultados

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil farmacocinético dosoro do hGLP-1(7-36)-NH2 depois de um única administração subcutânea acães Beagle machos de uma formulação de 100 mg/g de acetato de hGLP-1(7-36)-NH2 com ZnCI2, em uma razão molar [Peptídeo:Zn] = 1,5:1, em umadose teórica total de 15 mg de peptídeo puro.

A composição foi administrada no dia da preparação em umadose teórica de 15 mg de peptídeo puro (aproximadamente 150 μΙ_) a cãesBeagle machos.

Um total de 6 cães Beagle machos, com 33 a 84 meses de idadee 12 a 25 kg de peso corporal foram usados. Eles foram mantidos com a-cesso livre a uma dieta seca padrão e água potável, ambos verificados peri-odicamente.

Os animais jejuaram mais 6 horas do que o usual (cerca de 18 hde período de jejum antes da administração), para evitar uma possível inte-ração do alimento.

Seis animais foram selecionados para obter um perfil farmacoci-nético completo.

Os animais receberam administração individualmente por viasubcutânea na área interescapular. As áreas foram desinfetadas com umasolução alcoólica (Diolina®, Braun-Dexon). O nível da dose teórico de hGLP-1(7-36)-NH2 foi de 15 mg (aproximadamente 150 μL de formulação por cão)em seringas Terumo Myjector de 0,3 ml individuais preenchidas com agu-lhas Unimed de 12 χ 0,33 mm.

As amostras de sangue de cerca de 2,0 ml_ foram coletadas a-través das veias cefálicas, antes da injeção (tempo 0) em vários pontos notempo depois da administração ao longo de 35 dias.

O sangue foi depois disso colocado em tubos de polietileno de 4

mL pré-refrigerados, contendo uma solução aquosa de EDTA-K3 a 15% (12μL por ml_ de sangue) como anticoagulante. Os conservantes foram adicio-nados, Trasylol® (50 KIU ou 5 μL por mL de sangue) e inibidor DPP-IV (10μL por mL de sangue). As amostras de sangue permaneceram em um ba-nho de água gelada antes da centrifugação (1.600 χ g por 20 min a 4 0C nacentrífuga Sigma K4-15). Finalmente, o plasma foi decantado para dentro decriotubos de polipropileno e movido rapidamente para um congelador a -80°C antes da análise.

A concentração de hGLP-1(7-36)-NH2 foi determinada em amos-tras de plasma depois de uma extração em fase sólida de 0,3 mL de plasmacanino e em seguida por extração em fase sólida acoplada a LC-EM/EM (A-PI4000), usando um análogo de GLP-1 como padrão interno. Este métodofoi conduzido para a medição de concentrações plasmáticas de hGLP-1(7-36)-NH2 na faixa entre 0,25 ng/mL e 25 ng/mL.

O perfil plasmático do peptídeo obtido depois uma única admi-nistração subcutânea a cães da composição descrita no exemplo no nível dedose de D = 15 mg de peptídeo (906,1 μg/kg), está ilustrado na Figura 1.E. 6. Estudo Farmacocinético Adicional A

A mesma composição descrita em E.5.1 é mantida a 5 0C duran-te pelo menos 1 semana e testada como descrito no exemplo anterior(E.5.2).

E. 7. Estudo Farmacocinético Adicional B

A mesma composição descrita em E.5.1 é testada, em uma dosemais alta do que 15 mg de peptídeo.E. 8. Estudo Farmacocinético Adicional C

Uma composição similar, como preparada em E.5.1, é testada,em uma concentração de peptídeo mais baixa do que 100 mg/g.E. 9. Estudo Farmacocinético Adicional D

Uma composição similar, como preparada em E.5.1, é testada,tendo uma razão molar de Peptídeo/Zn mais alta do que 1,5:1.E. 10. Estudo Farmacocinético Adicional E

Uma composição similar, como preparada em E.5.1, é testada,tendo uma razão molar de Peptídeo/Zn mais alta do que 1,5:1, e uma con-centração de peptídeo mais baixa do que 100 mg/g.

Claims

1. Composição farmacêutica que compreende uma solução lím-pida ou uma mistura aquosa, uma suspensão ou uma composição farmacêu-tica semi-sólida de (a) pelo menos um composto de peptídeo que tem umasolubilidade aquosa maior do que 1 mg/mL à temperatura ambiente e tendoum pH entre 3,0 e 8,0, e de preferência, um pH entre 4,0 e 6,0, que é sele-cionado do grupo que consiste em hGLP-1(7-36)-NH2 e seus análogos e de-rivados, hGLP-1 (7-37)-OH e seus análogos e derivados, exendina-4 e seusanálogos e derivados,<formula>formula see original document page 31</formula>e seus análogos e derivados, e H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2, e seus análogos e derivados;(b) um íon de metal bivalente; e(c) um solvente,desde que pelo menos 95% ± 5% do dito composto de peptídeoestejam dissolvidos pelo dito solvente.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditoíon de metal bivalente é zinco.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditosolvente é água.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditosolvente é um meio não-aquoso.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, que compre-ende ainda um meio não-aquoso.

6. Composição, de acordo com as reivindicações 1-5, em que odito composto de peptídeo está presente em uma concentração de cerca de-0,00001 -500 mg/L, de preferência cerca de 0,0001 -10 mg/mL.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, em que o dito zinco está presente em uma concentração entre 0,0005mg/mL e 50 mg/mL.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, compreendendo ainda um conservante.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, em que o ditoconservante é selecionado do grupo que consiste em m-cresol, fenol, álcoolbenzílico e metil-Paraben.

10.Composição de acordo com as reivindicações 8 ou 9, em queo dito conservante está presente em uma concentração entre 0,01 mg/mL e 50 g/mL.

11.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, compreendendo ainda um agente isotônico.

12.Composição, de acordo com a reivindicação 11, em que o ditoagente isotônico está presente em uma concentração entre 0,01 mg/mL e 50mg/mL.

13.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 12, compreendendo ainda um estabilizador.

14.Composição, de acordo com a reivindicação 13, em que o ditoestabilizador é selecionado do grupo que consiste em imidazol, arginina ehistidina.

15.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 14, compreendendo ainda um surfactante.

16.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 15, compreendendo ainda um agente quelante.

17.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 16, compreendendo ainda um tampão.

18.Composição, de acordo com a reivindicação 17, em que o ditotampão é selecionado do grupo que consiste em Tris, acetato de amônio,acetato de sódio, glicina, ácido aspártico e Bis-Tris.

19.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 18, compreendendo ainda um polipeptídeo básico.

20.Composição de acordo com a reiivindicação 19, em que o ditopolipeptídeo básico é selecionado do grupo que consiste em polilisina, poli-arginina, poliorinitina, protamina, putrescina, espermina, espermidina e his-toria.

21 .Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 20, compreendendo ainda álcool ou um mono- ou dissacarídeo.

22.Composição, de acordo com a reivindicação 21, em que o ditoálcool ou mono- ou dissacarídeo é selecionado do grupo que consiste emmetanol, etanol, propanol, glicerina, trealose, manitol, glicose, eritrose, ribo-se, galactose, frutose, maltose, sacarose e lactose.

23.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 22, compreendendo ainda sulfato de amônio.

24.Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeeficaz de um composto de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a-23, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou dilu-ente farmaceuticamente aceitável.

25.Método para eliciar um efeito agonista de um receptor deGLP-1 em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo adminis-trar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um composto como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo.

26. Método para tratar uma doença selecionada do grupo queconsiste em diabetes Tipo I, diabetes Tipo II, obesidade, glucagonomas, dis-túrbios secretórios das vias aéreas, distúrbio metabólico, artrite, osteoporo-se, doença do sistema nervoso central, restenose e doença neurodegenera-tiva, em um indivíduo que necessita do mesmo, compreendendo administrarao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um composto como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou um sal farmaceuticamente acei-tável do mesmo.

27.Método, de acordo com a reivindicação 26, onde a doençaque é diabetes do Tipo I ou diabetes Tipo II.