KR101247665B1

KR101247665B1 - Ｇｌｐ―１ 약학 조성물

Info

Publication number: KR101247665B1
Application number: KR1020097015759A
Authority: KR
Inventors: 젱 신 동; 롤랑 셰리프-셰이크; 리골 호세-안토니오 코르데로; 미라베트 리서렉션 알로자; 프레데릭 라콤베; 마에스트레 마리아 돌로레스 토발리나
Original assignee: 입센 파마 에스.에이.에스
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-31
Publication date: 2013-04-02
Also published as: CN101668535A; CN101668535B; KR20090096739A; EP2109454A1; WO2008082656A1; AU2007340369B2; AU2007340369C1; JP2010523473A; AU2007340369A1; EP2109454A4

Abstract

본 발명은 글루카곤계 펩타이드-1의 펩타이드 유사체, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 이러한 유사체를 포유류 치료에 이용하는 방법, 및 상기 유사체를 포함하는 유용한 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

ＧＬＰ―１ 약학 조성물{GLP-1 PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS}

본 발명은 글루카곤계 펩타이드-1의 펩타이드 유사체 및/또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 개량 방법, 상기 조성물의 제조 방법, 약학 조성물, 및 포유류를 치료하기 위한 상기 조성물의 이용 방법에 관한 것이다.

글루카곤계 펩타이드-1(7-36) 아미드(GLP-1)는 글루카곤의 전구체인 프리프로글루카곤의 조직 특이적인 번역 후 프로세싱에 의하여 장의 L-세포 내에서 합성되며(Varndell, J.M., et al., J. Histochem Cytochem, 1985:33:1080-6), 식사에 대해 반응하여 순환계로 분비된다. GLP-1의 혈장 농도는 공복 시 대략 15 pmol/ℓ의 수준에서 식후 40 pmol/ℓ의 수준으로 높아진다. 혈당 상승에 있어, 글루코스를 정맥내로 투여하는 경우에 비해 경구로 투여하는 경우에, 혈장 인슐린이 대략 3배 증가되는 것으로 입증되었다(Kreymann, B., et al., Lancet 1987:2, 1300-4). 인크레틴 효과(incretin effect)로 알려져 있는 음식물에 의한 인슐린 분비 증가는 주로 체액성이며, GLP-1은 인체에서 가장 강력한 생리학적 인크레틴인 것으로 여겨지고 있다. 인슐린 효과 외에도, GLP-1은 글루카곤 분비를 억제시키고, 공복화를 지연시키며(Wettergren A, et al., Dig Dis Sci 1993:38:665-73), 말초혈관에서의 글루코스 이용율을 증가시킬 수 있다(D'Alessio, D.A. et al., J. Clin Invest 1994:93:2293-6).

1994년에, GLP-1의 1회 피하(s/c) 투약이 인슐린 비의존성 당뇨증(NIDDM) 환자의 식후 글루코스 수준을 완전하게 정상화시킬 수 있다는 사실이 밝혀짐에 따라, GLP-1의 치료학적 이용가능성이 제안되었다(Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994:17:1039-44). 이러한 효과는 인슐린 분비 증가 및 글루카곤 분비 감소 모두에 의해 매개되는 것으로 여겨졌다. 또한, GLP-1의 정맥내 주입으로, NIDDM 환자에게서 식후 공복화가 지연되는 것으로 확인되었다(Williams, B., et al., J. Clin Endo Metab 1996:81:327-32). 설포닐우레아와는 다르게, GLP-1의 인슐린성 작용은 혈당 농도에 의존적이다(Holz, G.G. 4^th, et al., Nature 1993:361:362-5). 따라서, 저혈당 농도에서의 GLP-1 매개성 인슐린 분비 감소는 심각한 저혈당증을 예방한다. 이러한 작용을 종합해 보면 현재 NIDDM 치료에 사용되는 다른 제제들을 능가하는 GLP-1만의 독특하고 유력한 치료 효과가 얻어진다.

여러 가지 연구에서, 건강한 개체에게 GLP-1은 혈당 수준뿐 아니라 인슐린 및 글루카곤 농도에도 강력한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으며(Orskov, C, Diabetologia 35:701-711, 1992; Holst, J.J., et al., Potential of GLP -1 in diabetes management in Glucagon Ⅲ, Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, Springer Verlag, 1996, p. 311-326), 이들 효과는 글루코스 의존적인 것으로 밝혀졌다(Kreymann, B., et al., Lancet ⅱ; 1300-1304, 1987; Weir, G.C., et al., Diabetes 38:338-342, 1989). 게다가, GLP-1은 당뇨병 환자들에게도 효과적이며(Gutniak, M., N. Engl J Med 226:1316-1322, 1992; Nathan, D.M., et al., Diabetes Care 15:270-276, 1992), 보다 구체적으로는 2형 당뇨병 환자의 혈당 수준을 정상화시키며(Nauck, M.A., et al., Diagbetologia 36:741-744, 1993), 1형 당뇨병 환자의 경우에는 혈당 조절을 개선시키며(Creutzfeldt, W.O., et al., Diabetes Care 19:580-586, 1996), 그중에서도 GLP-1의 인슐린 민감성 증가/인슐린 내성 감소 능력이 입증되었다. GLP-1 및 그 유사체는 인슐린 비의존성 당뇨병 발병 위험성이 있는 개체에서의 사용(WO 00/07617)과 임신성 당뇨병의 치료제(미국 특허 공개공보 20040266670)로서 제안되었다.

이외에도, GLP-1 및 그 유사체는 포유류, 예컨대 인간에 대해 수많은 치료적 용도를 가지는데, 그 예로는 학습 향상, 신경 보호 강화 및/또는 예컨대 신경발생 조절을 통한 중추 신경계 질환 또는 장애, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 발작, ADD 및 신경정신학적 증후군의 증상 완화(미국 특허 공개공보 20050009742 및 20020115605); 간 줄기/전구체 세포의 기능적 췌장 세포로의 변환(WO03/033697); 베타 세포의 퇴화 방지(미국 특허 공개공보 20040053819 및 20030220251) 및 베타 세포의 증식 자극(미국 특허 공개공보 20030224983); 비만 치료(미국 특허 공개공보 20040018975; WO98/19698); 식욕 억제 및 만복감 유발(미국 특허 공개공보 20030232754); 과민성 장 증후군 치료(WO 99/64060); 심근 경색으로 인한 질병율 및/또는 사망율 감소(미국 특허 공개공보 20040162241, WO98/08531) 및 발작(WO 00/16797); Q-웨이브 심근 경색이 형성되지 않는 특징을 가진 급성 관상 증후군의 치료(미국 특허 공개공보 20040002454); 수술 후 이화 작용 변화 약화(attenuating)(미국 특허 6,006,753); 휴면 심근(hibernating myocardium) 또는 당뇨병성 심근증 치료(미국 특허 공개공보 20050096276); 노르에피네페린의 혈중 농도 억제(미국 특허 공개공보 20050096276); 뇨를 통한 나트륨 배설 증가, 뇨내 칼륨 농도 감소(미국 특허 공개공보 20050037958); 유해한 혈량과다, 예컨대 신부전, 울혈성 심장 질환, 신증후군, 경화증, 폐부종 및 고혈합과 관련된 상태 또는 장애의 치료(미국 특허 공개공보 20050037958); 근수축성 반응 유도 및 심장 수축성 증가(미국 특허 공개공보 20050037958); 다낭성 난소 증후군 치료(미국 특허 공개공보 20040266678 & 20040029784); 호흡 곤란 치료(미국 특허 공개공보 20040235726); 비-소화기 경로, 즉 정맥내, 피하, 근육내, 복막, 또는 그외 주사나 주입을 통한 영양 공급 개선(미국 특허 공개공보 20040209814); 신장병 치료(미국 특허 공개공보 20040209803); 예컨대 비정상적인 좌심실 구혈률을 보이는 좌심실 수축 부전 치료(미국 특허 공개공보 20040097411); 예컨대 설사, 수술후 급속 덤핑 증후군 및 과민성 장 증후군과 같은 위장 장애의 치료 또는 예방을 위한, 유문-십이지장 운동성 저해, 및 내시경을 통한 수술에서 예비 마취제로 사용(미국 특허 공개공보 20030216292); 중대 질환에서의 다발성 신경병증(CIPN; critical illness polyneuropathy) 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS; systemic inflammatory response syndrome) 치료(미국 특허 공개공보 20030199445); 트리글리세라이드 수준 조절 및 지질대사 이상 치료(미국 특허 공개공보 20030036504 및 20030143183); 허혈증에 따른 혈류 재관류로 인한 장기 조직 손상의 치료(미국 특 허 공개공보 20020147131); 관상동맥 심질환의 위험인자(CHDRF; coronary heart disease risk factor) 증후군의 치료(미국 특허 공개공보 20020045636) 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

그러나, GLP-1은 생체내 혈장 반감기(t₁ _/2)가 겨우 1-2분에 불과하여 대사적으로 불안정하다. 외부에서 투여한 GLP-1도 신속하게 분해된다(Deacon, C. F., et al., Diabetes 44:1126-1131, 1995). 이러한 대사 불안정성은 천연적인 GLP-1의 치료학적 가능성을 제한하고 있다. 제형 형태의 개선을 통해 GLP-1 및 그 유사체의 치료적 가능성을 개선하고자 하는 수많은 시도가 있었다. 예를 들면, 국제 특허 공개공보 WO 01/57084에서는, 결정과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 주사용 약물과 같은 약학 조성물의 제조에 이용가능한 것으로 알려진 GLP-1 유사체의 결정을 제조하는 과정이 언급되어 있다. GLP-1(7- 37)OH의 불균일한 마이크로 결정체 클러스터는 식염수로부터 성장되었으며, 결정을 아연 및/또는 m-크레졸 침지 처리한 후 조사하였다(Kim and Haren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)). 바늘형의 결정과 무정형 침전물이 함유된 GLP(7-36)NH₂의 조결정 현탁액은 아연 또는 프로타민을 포함하는 포스페이트 용액으로부터 제조되었다(Pridal, et. al., International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996)). 유럽 특허 공개공보 EP 0619322A2에는, 염과 저분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 특정 조합을 pH 7-8.5의 완충액에서 단백질 용액과 혼합하는 단계를 포함하는 GLP-1(7-37)OH의 마이크로-결정형의 제조 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 6,566,490에 는, 정제된 펩타이드 산물 제조를 도와주는 GLP-1의 마이크로결정 시딩(seeding) 방법이 개시되어 있다. 6,555,521(US '521)에는, 순도가 향상되었으며 생체내 활성 증가를 보이는, 사각형의 납작한 막대 또는 플레이트형의 모양을 갖는 GLP-1 결정이 개시되어 있다. US '521에서는, 상기한 결정이 비교적 균일하며, 또한 빠르게 침강하여 응집하거나 또는 함께 덩어리져 시린지 바늘을 막아 일반적으로 정해진 투약을 수행할 수 없게 하는 문제점을 가진, 종래의 결정체 클러스터와 무정형의 결정체 현탁액 보다 오랜기간동안 현탁 상태를 유지하는 것으로 설명하고 있다.

생분해성 트리블록 공중합체인 폴리[(dl-락티드-코-글리콜리드)-β-에틸렌 글리콜-β-(-락티드-코-글리콜리드)]는, GLP-1의 조절성 방출 제형에 사용하기 위한 것으로 제시되었다. 그러나, 다른 폴리머 시스템과 마찬가지로, 트리블록 공중합체의 제조 방법의 프로토콜은 복잡하며, 균일한 미립자를 제조하기 어렵다.

이와 유사하게, 생분해성 폴리머, 예컨대 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)도 펩타이드의 서방성 전달 제형에 사용하기 위한 것으로 제시되었다. 그러나, 이러한 생분해성 폴리머는 대개 수용성이 불량하며 수-비혼합성 유기 용매, 예컨대 메틸렌 클로라이드가 요구되며, 및/또는 제조 과정 중에 엄격한 제조 조건이 필요하기 때문에, 당업계에서는 꺼리고 있다. 이러한 유기 용매 및/또는 엄격한 제조 조건은 대상 펩타이드 또는 단백질의 구조 변화를 유도할 위험성을 증가시켜, 구조적 완전성을 감소시키고 생물학적 활성에 해를 주는 것으로 여겨지고 있다(Choi et al., Pharm. Research, Vol. 21 , No. 5, (2004)). 폴록사머도 그와 같은 문제가 있다(Id.).

전술한 GLP-1 조성물은 불순물을 함유하거나/함유하며 재생산 및 투여가 어려운 경향이 있어, 상기 GLP-1 조성물은 GLP의 약학 제형 제조에 이상적이지는 않다. 또한, GLP 유사체는 증가된 농도에서 구역질을 유도하는 것으로 알려져 있어, 초기 혈장 농도가 감소된 서방형 약물 효과가 필요하다(Ritzel et al., Diabetologia, 38: 720-725 (1995); Gutniak et al., Diabetes Care, 17(9): 1039-1044 (1994); Deacon et al., Diabetes, 44: 1126-1131 (1995)). 따라서, 보다 쉽고 확실하게 제조할 수 있으며, 보다 간단하고 재현가능하게 환자에게 투여가능하며, 원하지 않는 부작용을 감소시키거나 없애기 위해 초기 혈장 농도를 낮게 제공할 수 있는, GLP-1 제형이 필요한 실정이다.

발명의 개요

본 발명은 하기 설명들과 청구항으로 요약될 수 있다. 즉, 본 발명은 GLP-1 유사체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특히 식 (I)에 따른 GLP-1 유사체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 바람직하며, 상기 조성물의 제형은 우수한 제조, 투여, 약물 동태학 및 약력학적 특성 뿐만 아니라 부정적인 부작용의 감쇠를 제공한다.

(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂(I)

바람직하기로는, 본 발명의 약학 조성물은 4 mg/㎖의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 및 0.5 mg/㎖의 ZnCl₂이 존재하는, pH4의 투명한 ZnCl₂ 수용액으로 구성되지 않는다.

본 발명의 바람직한 일 예는 약물 방출 프로파일이 향상된, 바람직하기로는 초기 분출(initial burst)이 감쇠된 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 작용 기간이 연장된 식 (I)의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

바람직한 측면으로, 본 발명은 또한 생체내 생리 pH에서 침전되어 장기 방출 약물 프로파일의 인 시츄 디포지트(in situ deposit)를 형성하는 약학 조성물도 제공한다.

본 발명의 다른 예는, 식 (I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과, 약학적으로 허용가능한 담체나 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직하기로는, 상기 담체 또는 희석제는 물이다.

바람직한 측면으로, 본 발명은 GLP-1 펩타이드의 염 또는 상기 펩타이드와 그의 염의 혼합물과 함께 조제된, 화합물 또는 GLP-1 펩타이드 유사체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

바람직하기로는, 상기 약학 조성물내 GLP-1 펩타이드 유사체는, 아세트산, 락트산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 시트르산, 메탄설폰산 또는 톨루엔설폰산과 같은 유기산의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산 또는 인산 등의 무기산의 약학적으로 허용가능한 염 리스트 중에서 선택된다. 염산과 같은 강산의 약학적으로 허용가능한 염이 특히 바람직하다. 강산은 pKA가 4.5 미만인 산으로 정의된다. 상기 약학 조성물내 추가적으로 바람직한 펩타이드 염은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 락트산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산 또는 시트르산 등의 유기산의 염이다.

바람직한 일 예에서, 약학 조성물의 용해도, pH 및 방출 프로파일은, 방출 프로파일을 연장시키고 GLP-1 유사체 농도의 초기 스파이크(initial spike)를 감소시키기 위해 염 형태의 GLP-1 유사체 : 염 형태가 아닌 GLP-1 유사체의 몰 비율을 조정함으로써, 조절할 수 있다.

바람직한 예로, 약학 조성물은 조성물의 수용성을 낮추기 위해 2가 금속을 추가로 포함하며, 그에 따라 혈장 농도에서의 초기 분출 또는 스파이크를 동시에 감소시키면서 방출 프로파일을 연장시킨다. 바람직한 2가 금속으로는 아연과 구리를 포함한다. 2가 금속의 염 형태가 특히 바람직하며, 그 예로는 2가 금속의 염화물 및 아세테이트 염이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. CuAc₂, CuCl₂, ZnAc₂ 및/또는 ZnCl₂가 가장 바람직하다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물내 2가 금속 및/또는 2가 금속염은 약 0.0005 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 보다 더 바람직하기로는, 상기 약학 조성물내 2가 금속 및/또는 2가 금속 염은 0.01 mg/ml 내지 약 0.50 mg/ml의 농도로 존재한다. 더욱 바람직하기로는, 상기 약학 조성물은 희석제를 포함하며, 상기 희석제는 약학적으로 허용가능한 수용액을 포함한다. 희석제는 멸균수를 포함할 수 있다.

다른 예로, 상기 약학 조성물은, GLP-1 유사체 : 2가 금속 및/또는 2가 금속염의 약학 조성물내 몰 비율이 약 6:1 내지 약 1:1로, 2가 금속 및/또는 2가 금속염을 추가적으로 포함한다. 바람직하기로는 상기 비율은 약 5.5:1 내지 약 1:1이다. 더 바람직하기로는, 상기 비율은 약 5.4:1 내지 약 1.5:1이다. 더 더욱 바람직하기로는, 상기 비율은 약 5.4:1, 4.0:1, 또는 1.5:1이다. 가장 바람직하기로는, 상기 비율은 약 1.5:1이다. 본 발명의 이러한 측면에서 약은 각 목표값에 1.5:1 ± 10%이므로, 따라서 예상되는 비율은 예컨대, 1.35-1.65 : 0.85-1.15를 포괄하는 범위이다.

바람직하게는, 약학 조성물은, 식 (I)의 화합물인 GLP-1 유사체, 또는 그의 염이 약 0.5% - 30% (w/w) 농도로 존재하는, 수성 혼합액, 현탁액 또는 용액을 포함한다. 더 바람직하게는, 수성 혼합물, 현탁액 또는 용액에서의 GLP-1 유사체 및/또는 그의 염의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30%(w/w)이다. 더욱 바람직하게는, 상기 수성 용액에서의 GLP-1 유사체 및/또는 그의 염의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 14%, 15%, 16%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 29%, 또는 30% (w/w)이다. 더 더욱 바람직하게는, 상기 수성 용액에서의 GLP-1 유사체 및/또는 그의 염의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 9%, 10%, 11%, 22%, 23%, 24%, 25% 또는 26% (w/w)이다. 보다 더 바람직하기로는, 상기 수성 용액에서의 GLP-1 유사체 및/또는 그의 염의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 22%, 23%, 24%, 25% 또는 26% (w/w)이다. 또한 더 바람직하기로는, 상기 수성 용액에서의 GLP-1 유사체 및/또는 그의 염의 농도는 약 1%, 2%, 5%, 10%, 23% 또는 25% (w/w)이다. "약"은 다음과 같은 의미이다: 약 0.5% 내지 약 4%의 농도에서는, 목표값에 ±0.5%이 바람직한 범위이며(예, 0.5% 내지 1.5%는 약 1%임); 약 5% 및 그 이상의 목표 농도의 경우에는 목표값의 20%가 바람직한 범위이다(예, 8% 내지 12%는 약 10%임).

바람직하기로는, 약학 조성물내 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂, GLP-1 유사체 또는 그의 염의 농도는 약 1%(중량/부피)이며, [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ : 상기 2가 금속 및/또는 2가 금속 염의 몰 비율은 약 1.5:1이다. 더 바람직하기로는, 약학 조성물내 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 2%(중량/부피)이고, [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염 : 2가 금속 및/또는 2가 금속 염의 몰 비율은 약 1.5:1이다. 또한 더 바람직하기로는, 약학 조성물내 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 10% (중량/부피)이고, [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염 : 2가 금속 및/또는 2가 금속 염의 몰 비율은 약 1.5:1이다. 가장 바람직하기로는, 약학 조성물내 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 23% 또는 약 25% (중량/부피)이고, [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염 : 2가 금속 및/또는 2가 금속 염의 몰 비율은 약 1.5:1이다.

바람직한 예에서, 약학 조성물내 GLP-1 유사체, [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 5% (중량/부피)이고, 펩타이드 : 2가 금속 및/또는 2가 금속 염의 몰 비율은 약 5.4:1이다. 더 바람직하기로는, 조성물내 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 5% (중량/부피)이고 상기 몰 비는 약 4.0:1이다. 더 바람직하기로는, 조성물내 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 10% (중량/부피)이고 상기 몰 비는 약 5.4:1이다. 더 더욱 바람직하기로는, 조성물내 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 또는 그의 염의 농도는 약 10% (중량/부피)이고 상기 몰 비는 약 4.0:1이다.

바람직하게는, 상기 2가 금속 및/또는 2가 금속 염은 아연 염화물 또는 아연 아세테이트로 제공된다. 더 바람직하기로는, 상기 아연 아세테이트는 ZnAc₂·2H₂O로 제공된다.

다른 예로, 상기 2가 금속 및/또는 2가 금속 염은 구리 염화물 또는 구리 아세테이트로 제공된다.

일 예로, 상기 약학 조성물의 pH는 염기를 이용하여 상향 조절한다. 더 바람직하기로는, 상기 pH 조절은 NaOH를 이용하여 수행된다. 더 바람직하기로는, 상기 약학 조성물의 pH는, 0.9% NaCl을 이용하여 약 1/2 최초 농도로 희석하였을 때 직접 전위차계 측정시 pH가 약 5.0 - 5.5이 되도록, NaOH로 조절한다.

본 발명의 바람직한 예는, GLP-1의 펩타이드 유사체 또는 그의 염, 식 (I)에 따른 화합물 또는 그의 염이 이를 필요로 하는 개체, 예컨대 포유류, 바람직하기로는 인간에서 장기간 방출되도록 제형화된, 약학 조성물이다. 바람직하기로는, 상기 화합물의 방출은 적어도 1시간 동안, 더 바람직하기로는 적어도 4, 6, 12 또는 24시간 동안 계속된다. 또한, 더 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 36, 48, 60, 72, 84 또는 96시간 동안 개체내에서 방출되도록 제형화된다. 또한, 더 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일간 개체내에서 방출되도록 제형화된다. 더 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 약 2, 3 또는 4주간 개체내에서 방출되도록 제형화된다. 더 더욱 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 약 1, 1.5, 2 또는 3달간, 또는 그 이상 동안 방출되도록 제형화된다.

본 발명의 일 측면에서, 약학 조성물내 GLP-1 펩타이드 유사체의 염 함량을 조절하여 약학 조성물내 GLP-1 펩타이드의 용해성 및 안전성을 개선시키며, 또한 초기 분출을 감소시켜 생체내 방출 프로파일의 개선을 제공한다.

용어 "조절"은 염 형태의 GLP-1 유사체 : 염 형태가 아닌 GLP-1 유사체의 몰 비율을 조절하여 염 함량을 조절하는 것을 의미한다.

보다 더 바람직하게는, 상기 약학 조성물내 펩타이드 염은 상기 식 (I)의 펩타이드의 염산염, 아세트산 염, 염화물 또는 아세테이트이다. 상기 약학 조성물에서, 아세테이트 또는 염화물은 아세테이트 또는 염화물 : 상기 식 (I)의 화합물의 최종 몰 비율은 약 0.5:1 내지 약 10:1이다. 더 바람직하게는, 상기 비율은 약 0.8:1 내지 약 9:1이다. 더 더욱 바람직하게는, 상기 비율은 약 1:1 내지 약 6:1이다. 가장 바람직하게는, 상기 비율은 약 3.0:1, 특히 3.2:1이다.

본 발명의 이러한 측면에서, 아세테이트 또는 염화물 : 펩타이드의 몰 비율은 약학 조성물 내 아세테이트(CH₃COO^-) 또는 염화물(Cl^-)의 몰 비 : 약학 조성물내 펩타이드의 몰 비를 의미한다. 약학 조성물에서 몰 비 3:1에 대한 예에서, 아세테이트는 펩타이드의 몰 함량에 3배 비율이다. 이는 다른 화합물 대비 화합물의 화학량 비이다.

본 발명의 비율 1.5:1에서, 용어 "약"은 각 타겟 수치의 + 10% 이므로, 예상되는 비율은 예컨대, 1.35-1.65 : 0.85-1.15를 포함하는 범위이다.

본 발명의 추가적인 바람직한 측면에서, 약학 조성물의 pH는 조성물의 아세테이트 함량을 조절하여 조정한다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물의 pH 범위는 pH 3 - pH 6이다. 더 바람직하게는, 상기 약학 조성물의 pH 범위는 pH 3.5 - 5.5이다. 가장 바람직하게는, 상기 약학 조성물의 pH 범위는 pH 4.2 - pH 4.6이다.

바람직하게는, 약학 조성물을 산성화하기 위해, 아세트산 첨가에 의해 아세테이트 함량을 높일 수 있다.

일 예에서, 상기 약학 조성물의 pH는 아세테이트의 함량을 조절하여, 아세테이트 함량이 낮거나 없는 GLP-1 유사체의 펩타이드 염으로부터 시작해서 증가시킬 수 있다.

바람직한 예에서, 아세테이트 또는 염화물의 함량 조절에 의한 최종 약학 조성물의 pH 조절로 펩타이드 농도, 아연 농도, 화학적 안정성, 물리적 안정성 및 초기 분출 감소에 의한 생체내 방출 프로파일 등의 파라미터를 조절할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, Zn 또는 Cu 함량은 고정되며, pH는 아세테이트 함량 조절로 조절한다. 아세테이트 함량 증가시, 용해도와 물리적 안정성의 향상이 보이며, 아세테이트 함량 감소시 pH에 대한 작용 증가 및 C_max에 대한 작용 감소가 나타난다.

바람직한 예에서, 상기 약학 조성물은 수성 혼합물, 현탁물 또는 용액을 포함한다.

또한, 본 발명은 GLP-1(7-36)NH₂ 리간드의 수용체를 GLP-1 유사체 또는 그 염과 직접 또는 간접 접촉시키는 단계를 포함하는 GLP-1의 작용제 효과를 없애는 방법을 제공한다.

상기 방법에서, GLP-1(7-36)NH₂ 리간드의 수용체는 동물 개체, 바람직하기로는 영장류, 더 바람직하기로는 인간에게서 존재한다. 따라서, 이러한 예에서, 본 발명은 GLP-1 유사체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 포함하는 본 발명의 조성물을, 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에게서 GLP-1 수용체로부터 작용제 효과를 소거하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 대한 바람직한 측면에 있어서, 상기 개체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 비만, 식욕 과다, 불충분한 포만감, 대사성 장애로부터 선택되는 질환 또는 상태이거나 발병할 위험이 있는 인간이다. 바람직하기로는, 상기 질환은 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병이다.

상기 방법에 대한 또다른 바람직한 예에 있어서, 상기 개체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만, 글루카곤증(glucagonomas), 기도의 분비 장애, 관절염, 골다공증, 중추신경 질환, 재협착증, 신경변성 질환, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 간경변, 폐 부종, 고혈압 및 음식물 섭취 감소가 바람직한 질환, 중추 신경계 질환 또는 장애(예, 신경발생 조절을 통한, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 발작, ADD 및 신경 정신학적 증후군), 과민성 장 증후군, 심근경색(예, 이와 관련된 질병율 및/또는 사망율 감소), 발작, 급성 관상 증후군(예, Q-웨이브 부재가 특징임), 심근 경색, 수술 후 이화 작용 변화, 휴면 심근(hibernating myocardium) 또는 당뇨병성 심근증, 뇨를 통한 나트륨 배출 불량, 뇨내 칼륨 농축 과다, 유해한 과다혈량과 관련있는 상태 또는 장애(예, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 간경변, 폐 부종 및 고혈압), 다낭성 난소 증후군, 호흡 곤란, 신장병, 좌심실 수축 부전(예, 비정상적인 좌심실 구혈률), 설사, 수술 후 덤핑 증후군 및 과민성 장 증후군(즉, 유문-십이지장 운동성 저해를 통한)과 같은 위장 장애, 중대질환에서의 다발성 신경병증(CIPN; critical illness polyneuropathy), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS; systemic inflammatory response syndrome), 지질대사 이상, 허혈증에 따른 혈류 재관류로 인한 장기 조직 손상, 및 관상동맥 심질환의 위험인자(CHDRF; coronary heart disease risk factor) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 걸리거나 질환이 발병할 위험이 있는 인간이다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은, 필요로 하는 개체에서, 간 줄기/전구체 세포를 기능적인 췌장 세포로 변환시키는 방법, 베타 세포의 퇴화를 방지하는 방법, 베타 세포의 증식을 자극하는 방법, 노르에피네페린의 혈중 농도를 억제하는 방법, 근수축 반응 유도 방법, 심장 수축력을 증가시키는 방법, 비-소화기 경로를 통해(예, 정맥내, 피하, 근육내, 복막 또는 그외 주입 또는 주사 경로를 통한) 영양 공급을 개선시키는 방법, 내시경 시술을 수행하기 위해 개체를 전처리하는 방법 및 트리글리세라이드 농도를 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의 식 (I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 본 발명의 제형을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하기로는, 상기 개체는 포유류 동물이며, 더 바람직하기로는 영장류이며, 더 바람직하기로는 인간이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 펩타이드 염으로서 사용할 바람직한 GLP-1 펩타이드는, 다음의 형식, 예컨대 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂으로 표시되며, 첫번째 괄호안에 기재되어 있는 천연 서열이 치환된 아미노산이다(예, Aib⁸ ^,35에서, Aib는 hGLP-1에서 Ala⁸ 및 Gly³⁵를 치환함). Aib는 알파-아미노이소부티르산의 약어이다. 약어 GLP-1은 글루카곤계 펩타이드-1을 의미하며, hGLP-1은 인간 글루카곤계 펩타이드-1을 의미한다. 상기 두번째 괄호 안의 숫자는 펩타이드에 존재하는 아미노산의 번호이다(예, hGLP-1(7-36)은 인간 GLP-1의 펩타이드 서열에서 아미노산 7번부터 36번을 의미함). hGLP-1(7-37) 서열은 Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Res,. 40, 1992, pp. 333-342에 개시되어 있다. hGLP-1(7-36)NH₂에서 "NH₂"는 펩타이드의 C-말단이 아미드화된 것을 의미한다. hGLP-1(7-36)은 C-말단이 유리 산임을 의미한다. hGLP-1(7-36)에서 37번 및 38번의 잔기는 별도의 언급이 없다면 각각 Gly 및 Arg이다.

본 발명에 사용되는 특히 바람직한 GLP-1 펩타이드 유사체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태이다. 이러한 염의 예로는, 유기산(예, 아세트산, 락트산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산 또는 파모산), 무기 산(예, 염산, 황산 또는 인산) 및 폴리머 산(예, 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리락트산-글리콜산의 공중합체)와 형성된 염이 있으나, 이로 한정되는 것을 아니다. 본 발명에 따른 펩타이드의 염을 제조하는 전형적인 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 표준적인 염 치환 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드의 TFA 염(분취용 HPLC를 이용하고 TFA 함유성 완충액으로 용출시켜 펩타이드를 정제함으로써 TFA 염 제조)을, 소량의 0.25 N 아세트산 수용액에 펩타이드를 용해시킴으로써 아세테이트 염과 같은 다른 염으로 변환시킬 수 있다. 제조되는 용액을 세미-분취용 HPLC 컬럼(Zorbax, 300 SB, C-8)에 적용한다. 컬럼은, 유속 4 ㎖/min으로, (1) 0.5 시간 동안 0.1N 암모늄 아세테이트 수용액으로, (2) 0.5시간 동안 0.25N 아세테이트 수용액으로, 그리고 (3) 선형 농도 구배(30분간 용액 B를 20%에서 100%로)(용액 A는 0.25N 아세트산 수용액이고; 용액 B는 아세토니트릴/물, 80:20 중의 0.25N 아세트산임)로 용출시킨다. 펩타이드가 함유된 분획을 모아 동결건조하여 건조시킨다.

당업자들에게 주지된 바와 같이, GLP-1의 알려져 잇는 용도와 잠재적인 용도는 다양하며, 다채롭다(Todd, J. F., et al., Clinical Science, 1998, 95, pp. 325- 329; and Todd, J.F. et al., European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, pp.533- 536). 따라서, 작용제 효과를 소거하기 위한 목적으로의 본 발명의 화합물 투여는 GLP-1 그 자체와 동일한 효과 및 용도를 가질 수 있다. GLP-1의 다양한 용도는 하기와 같은 치료에 대한 것으로 요약될 수 있다: 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만, 글루카곤증, 기도의 분비 장애, 대사 장애, 관절염, 골다공증, 중추 신경계 질환, 재협착증, 신경변성 질환, 신부전, 울혈성 심부전, 신증후군, 간경변, 폐 부종, 고혈압, 음식물 섭취 감소가 바람직한 질환, 그외 본 명세서에 개시된 다양한 상태 및 장애. 따라서, 본 발명은 활성 성분으로서 식 (I)의 화합물을 포함하는 본원의 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 제형에서 활성 성분의 투여량은 바뀔 수 있지만, 활성 성분의 양은 반드시 적정 투여량이 수득되는 양이다. 선택한 투여량은 원하는 치료 효과, 투여 경로 및 치료 기간에 의존적이며, 통상 주치의에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 활성을 위한 유효량은 1 x 10^-7 내지 200 mg/kg/day이고, 바람직하기로는 1 x 10^-4 내지 100 mg/kg/day이며, 이는 단회 투약 또는 다중 투약으로 분할하여 투여할 수 있다.

본 발명의 제형은 바람직하기로는 비경구로, 예컨대 근육내, 복막내, 정맥내, 피하 등으로 투여된다.

본 발명에 따른 비경구 투약 제제는 원하는 생체내 방출 프로파일을 제공하는, 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 겔 또는 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매 또는 비히클의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 오일, 젤라틴 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 이러한 투약 형태는 또한 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 이는, 예컨대 세균 체류 필터를 통한 여과에 의해, 멸균제를 조성물에 혼합함으로써, 조성물에 방사능을 조사함으로써, 또는 조성물을 열처리함으로써 멸균할 수 있다. 또한, 이는 사용 직전에 멸균수나 그외 주사용 멸균 매질에 용해할 수 있는 멸균된 고형 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

펩타이드의 합성

본 발명의 실시에 이용가능한 펩타이드는 표준적인 고상 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있으며, 제조하였다. 예로, Stewart, J. M., et al., Solid Phase Synthesis(Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984)를 참조한다.

하기 구현예는, 본 발명을 이롭게 실시할 수 있는 펩타이드 제조에 이용할 수 있으며, 이용한, 당업자들에게 잘 알려져 있는 합성 방법을 나타낸다. 또한, 당업자들에게 다른 방법들도 공지되어 있다. 구현예는 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

GLP-1 유사체 등의 펩타이드는 펩타이드의 최종 침전, 동결-건조 공정, 진공 건조 또는 그외 당업계에 공지된 건조 공정을 포함할 수 있는 당업계에 공지된 여러가지 합성으로 수득할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피, 완충액의 삼투성 교환 및 디필터레이션(difiltration)은 여러가지 염 형태의 펩타이드를 정제 및 선별하기 위한 본 발명의 적합한 방법일 수 있다.

Boc-βAla-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH 및 Boc-D-Asp(OcHex)를 Nova Biochem, San Diego, California에서 구입하였다. Boc-Aun-OH는 Bachem, King of Prussia, PA에서 구입하였다. Boc-Ava-OH 및 Boc-Ado-OH는 Chem-lmpex International, Wood Dale, IL에서 구입하였다. Boc-2Nal-OH는 Synthetech, Inc. Albany, OR에서 구입하였다.

본원에 사용된 다른 약어의 전체 명칭은 다음과 같다: Boc는 t-부틸옥시카보닐을 의미하고, HF는 플루오르화수소를 의미하고, Fm은 포르밀을 의미하고, Xan은 크산틸을 의미하고, Bzl은 벤질을 의미하고, Tos는 토실을 의미하고, DNP는 2,4-디니트로페닐을 의미하고, DMF는 디메틸포름아미드를 의미하고, DCM은 디클로로메탄을 의미하고, HBTU는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하고, DIEA는 디이소프로필에틸아민을 의미하고, HOAc는 아세트산을 의미하고, TFA는 트리플루오로아세트산을 의미하고, 2ClZ는 2-클로로벤질옥시카보닐을 의미하고, 2BrZ는 2-브로모벤질옥시카보닐을 의미하고, OcHex는 O-사이클로헥실을 의미하고, Fmoc는 9-플루오레닐메톡시카보닐을 의미하고, HOBt는 N-하이드록시벤조트리아졸을 의미하며, PAM 수지는 4-하이드록시메틸페닐아세트아미도메틸 수지를 의미하며; Tris는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 의미하며; Bis-Tris는 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄(즉, 2-비스(2-하이드록시에틸)아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올)을 의미한다. "할로" 또는 "할로겐"이란 용어는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드를 포함한다.

특별히 한정하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자들이 보편적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에 참고로 인용된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

도 1은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 약 1 mg으로 개에게 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 각 경우에서, 펩타이드는 약 1% (wt/vol) 펩타이드를 포함하며 펩타이드:Zn의 몰 비가 약 1.5인 수성 아연 조성물로서 투여하였다. ■ 및 □는 본원에 개시된 바와 같이 NaOH로 pH를 조절한 조성물을 나타내며, ▲은 NaOH로 pH를 조절하지 않은 조성물이며; ●은 AcOH/AcO-로 완충화한 조성물이다.

도 2는 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 약 15 mg으로 개에게 1회 피하(s.c.) 투여 한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 각 경우에서, 펩타이드는 약 10% (wt/vol) 펩타이드를 포함하며 펩타이드:Zn의 몰 비가 약 1.5인 수성 아연 조성물로서 투여하였다. ■ 및 □는 본원에 개시된 바와 같이 NaOH로 pH를 조절한 조성물을 나타내며, ▲은 NaOH로 pH를 조절하지 않은 조성물이며; ●은 AcOH/AcO-로 완충화한 조성물이다.

도 3은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 약 1 mg으로 개에게 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 각 경우에서, 펩타이드는 다음과 같이 반고형 수성 아연 조성물로서 투여하였다: ●는 약 5% (wt/vol) 펩타이드, 펩타이드:Zn 몰 비 약 5.4:1의, pH를 조절하지 않은 것이고; ○은 약 10% (wt/vol) 펩타이드, 펩타이드:Zn 몰 비 약 5.4:1의, pH를 조절하지 않은 것이고; □는 약 10% (wt/vol) 펩타이드, 펩타이드:Zn 몰 비 약 5.4:1의, NaOH로 pH 조절한 것이고; ■는 약 10% (wt/vol) 펩타이드, 펩타이드:Zn 몰 비 약 4:1의, NaOH로 pH 조절한 것이다.

도 4는 본 발명의 특정 제형 제조에 이용가능한 다양한 기구를 개략적으로 도시한 것이다.

도 5는 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 약 1 mg으로 개에게 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 펩타이드는 약 2% (wt/vol) 농도로 펩타이드를 포함하며 펩타이드:Zn의 몰 비가 약 1.5:1인 수성 아연 조성물로서 투여 하였다.

도 6은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 약 15 mg으로 개에게 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 펩타이드는 약 25% (wt/vol) 농도로 펩타이드를 포함하며 펩타이드:Zn의 몰 비가 약 4:1인, 반고형의 아연 조성물로서 투여하였다.

도 7은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 약 15 mg으로 개에게 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 펩타이드는 약 23% (wt/vol) 농도로 펩타이드를 포함하며 펩타이드:Zn의 몰 비가 약 1.5:1인, 반고형의 아연 조성물로서 투여하였다.

도 8은 GLP-1 유사체 HCl 염 테스트 제형의 (10% 용액 3 ㎕의) 0.3 mg을 랫에 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 전체 시간 경과 동안의 혈장 프로파일(중앙값)이다.

(1) CuCl₂와 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 염: (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂/CuCl₂의 몰 비는 1.5:1임. 펩타이드 농도는 수(w/w) 중에서 10% (30 mM), 약 pH5.5이다.

(2) ZnCl₂와 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 염: (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂/ZnCl₂의 몰 비는 1.5:1임. 펩타이드 농도는 수(w/w) 중에서 10% (30 mM), 약 pH5.5이 다.

도 9는 GLP-1 유사체 아세테이트 염 테스트 제형의 (10% 용액 3 ㎕의) 0.3 mg을 랫에 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 전체 시간 경과 동안의 혈장 프로파일(중앙값)이다.

ZnCl₂와 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 아세테이트 염 : (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂/ZnCl₂의 몰 비는 1.5:1임. 펩타이드 농도는 수(w/w) 중에서 10% (30 mM), 약 pH5.5이다.

도 10은 도 8에 나타낸 테스트 제형의 (10% 용액 3 ㎕의) 0.3 mg을 랫에 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 초기 혈장 프로파일(중앙값)이다.

도 11은 도 9에 나타낸 테스트 제형의 (10% 용액 3 ㎕의) 0.3 mg을 랫에 1회 피하(s.c.) 투여한 후 수득한 초기 혈장 프로파일(중앙값)이다.

도 12는 도 8에 나타낸 3가지 테스트 제형의 (10% 용액 3 ㎕의) 0.3 mg을 랫에 1회 피하(s.c.) 투여한 후 랫의 주사 부위에 잔류하는 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 예상 백분율이다.

실시예 1

(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂

[Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂의 구체적인 합성 방법은 국제 특허 공개공보 WO 00/34331(PCT/EP99/09660)에 개시되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 간략하게는, 상기 화합물은 Boc-화학적 고상 펩타이드 합성을 가속화하도록 변형된 Applied Biosystems사(Foster City, CA)의 모델 430A 펩타이드 합성기에서 합성하였다. Schnolzer 등의 Int. J. Peptide Protein Res., 90:180(1992)을 참조한다. 0.91 mmol/g의 치환의 4-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지(Peninsula, Beltmont, CA)를 사용하였다. Boc 아미노산으로는 Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Aib-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH 및 Boc-Trp(Fm)-OH와 같은 측쇄 보호기를 가지는 아미노산(Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA)이 사용되었다. 2 x 1분 동안 100% TFA로 처리하여 Boc기를 제거하였다. 4 ㎖의 DMF 중의 HBTU(2.0 mmol) 및 DIEA(1.0 ㎖)를 사용하여 Boc 아미노산(2.5 mmol)을 미리 활성화시키고, 펩타이드-수지 TFA 염의 사전 중화 없이 커플링시켰다. Boc-Aib-OH 잔기 및 하기 잔기인 Boc-Lys(2ClZ)-OH 및 Boc-His(DNP)-OH의 커플링에 소요된 시간은 2시간이었고, 이들을 제외한 나머지 잔기들에 대한 커 플링 시간은 5분이었다.

펩타이드 사슬 조립의 마지막 단계에서, 2 x 30분 동안 DMF 중의 20% 머캅토에탄올/10% DIEA 용액으로 수지를 처리하여, His 측쇄 상의 DNP기를 제거하였다. 그런 다음, 100% TFA를 2 x 2분 간 처리하여 N-말단의 Boc기를 제거하였다. 10% DMF(1 x 1분) 중의 10% DIEA를 사용하여 펩타이드-수지를 중화한 후, 15% 에탄올아민/15% 물/70% DMF 용액으로 2 x 30분 동안 처리하여 Trp 측쇄 상의 포르밀기를 제거하였다. DMF 및 DCM을 사용하여 펩타이드-수지를 세척하고 감압 하에서 건조하였다. 펩타이드 수지를 0℃ 하에 1 ㎖의 아니솔 및 디티오트레이톨(24 mg)이 포함된 10 ㎖ HF 중에서 75분간 교반하여 최종 절단(cleavage)을 수행하였다. 질소를 유입시켜 HF를 제거하였다. 에테르(6 x 10 ㎖)를 사용하여 잔류물을 세척하고, 4N HOAc(6 x 10 ㎖)를 사용하여 상기 잔류물을 추출하였다.

역상 VYDAC^? C₁₈ 칼럼(Nest Group, Southborough, MA)을 사용하여 분취용 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 상에서 수계 추출물 내의 펩타이드 혼합물을 정제하였다. 직선 농도 구배(105분 동안 B 용액 20% -> 50%)를 사용하여 10 ㎖/분의 유속으로 칼럼을 용리시켰다(A 용액 = 0.1%의 TFA를 함유하는 물; B 용액 = 0.1%의 TFA를 함유하는 아세토니트릴). 분획을 수집하여 분석용 HPLC 상에서 확인하였다. 순수한 산물이 함유된 것을 모아 동결 건조하였다. 본 화합물의 합성 예로, 135 mg의 백색 고체가 수득되었다. 이는 분석용 HPLC 분석을 기준으로 순도가 98.6%이었다. 전기 분무 질량 분광계(MS(ES))S 분석에 의한 분자량은 3339.7였다 (이는 계산 분자량인 3339.7 g과 일치한다).

실시예 2

제형화 공정I

2.1 재료, 스톡 용액, 계산

A) 재료

ZnCl₂, NaOH 펠렛과 염산 35%는 Panreac Quimica, Barcelona, Spain에서 구입하였다. WFI(sterile water for injection/irrigation)은 B. Braun Medical, Barcelona, Spain에서 구입하였다.

B) 스톡 용액

(i) ZnCl ₂ , pH =3:

1. 교반하면서 35% HCl을 WFI에 넣어 pH=3으로 조절한다.

2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 ZnCl₂을 옮긴다. 교반하면서 pH=3 HCl을 투입하여, 최종 농도를 약 1-4 mg ZnCl₂/㎖로 만든다.

( ii ) ZnCl ₂ , pH =2:

1. 교반하면서 35% HCl을 WFI에 넣어 pH=2로 조절한다.

2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 ZnCl₂을 옮긴다. 교반하면서 pH=2 HCl을 투입하여, 최종 농도를 약 4-12 mg ZnCl₂/㎖로 만든다.

( iii ) NaOH , 0.1 - 10 mg /㎖:

1. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 NaOH를 옮긴다. 교반하면서 WFII를 최종 농도 약 0.1-10 mg NaOH/㎖로 첨가한다.

( iv ) 냉동- 건조시킨 20 mg 의 분주물 [ Aib ⁸ ^,35 ]HGLP-1(7-36)NH ₂ / 바이얼 :

1. 0.04% (v/v)의 초산 희석물과 WFI을 준비한다.

2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂(아세테이트 염)을 넣는다. 교반하면서 0.04% 초산을 최종 농도 20 mg [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂/㎖이 되도록 첨가한다. 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과 멸균한 다음, 용액 1 ㎖을 동결건조 바이얼에 넣어 냉동 건조한 다음 건조 산물을 -22℃에 저장하였다.

(v) 냉동-건조한 50 mg 의 분주물 [ Aib ⁸ ^,35 ]HGLP-1(7-36)NH ₂ / 바이얼 :

1. 0.1% (v/v)의 초산 희석물과 WFI을 준비한다.

2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂(아세테이트 염)을 넣는다. 교반하면서 0.1% 초산을 최종 농도 50 mg [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂/㎖이 되도록 첨가한다. 여과 멸균한 다음, 용액 1 ㎖을 동결건조 바이얼에 넣어 냉동 건조시킨다.

C) 계산

(i) 조성물에서 부형제(E)의 총 중량/부피는 하기 식으로 결정한다:

E = (A x 100/T) - (A/P)

상기에서,

E = mg의 부형제

A = 순수 펩타이드의 양(mg);

T = 조성물의 목표 농도; 예, 목표가 2%이면 2; 및

P = 순수 펩타이드의 농도(mg 펩타이드/100 mg 제형)

부형제의 총 부피에서, 1 ㎖ = 1 g으로 가정한다.

(ii) 조성물 용액의 각 ㎖ 또는 g에 첨가되는 ZnCl₂의 부피/중량(W)을 결정하기 위하여:

a) pH 조절하지 않은 조성물의 경우 W=100% E;

b) 펩타이드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 액체 제형인 경우 W=80% E;

c) 펩타이드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=50% E;

d) 펩타이드가 약 25%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=66.66% E;

e) 동결-건조된 제제로부터 펩타이드가 재구성되며 염기로 pH가 조절된 제형의 경우 W=90% E.

(iii) 조성물 용액의 각 ㎖ 또는 g에 첨가되는 NaOH의 부피/중량(W)을 결정하기 위하여:

a) 펩타이드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 제형인 경우 W=20% E;

b) 펩타이드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=50% E;

c) 펩타이드가 약 25%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=33.33% E;

d) 동결-건조된 제제로부터 펩타이드가 재구성되며 염기로 pH가 조절된 제형의 경우 W=10% E.

(iv). 각 조성물에 사용되는 ZnCl₂의 농도(mg/㎖ 또는 mg/g)을 결정하기 위하여:

[ZnCl₂] = (136.29 X A)/(W x 3339.76 x R)

상기에서,

A = 순수 펩타이드의 양(mg).

R = 펩타이드/Zn의 몰 비

R=1.5: 펩타이드가 약 1%, 약 2% 또는 약 10%이거나, 또는 최대 약 23%인 제형;

R=4.0: 펩타이드가 약 25%인 제형; 및

W = 조성물 용액의 각 ㎖ 또는 g에 첨가되는 ZnCl₂의 중량(g) 또는 부피(㎖).

2.2 1-10% 동결-건조한 펩타이드 및 ZnCl ₂ 가 함유된 pH 를 조절하지 않은 조성물의 제조

본원에서, 펩타이드 백분율로 기재된 제형은 조성물의 총 중량 당 펩타이드 중량의 제형이다. 예컨대 1% 펩타이드는 총 조성물 100 g 당 펩타이드 1 g을 포함하는 제형을 의미한다. 약 1%, 약 2%, 또는 최대 10% 펩타이드를 포함하는 제형은 다음과 같이 제조하였다. 기술된 바와 같이 제조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂의 냉동 건조한 샘플을 pH3의 ZnCl₂ 스톡 용액과 총 부형제 부피의 100%로 그리고 펩타이드:Zn = 1.5:1로 완전하게 혼합하였다.

A) 1 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl₂ 용액(0.272 mg/㎖; 상기 2.1 B (i) 참조) 2 ㎖과 혼합하여 제조한다.

B) 2 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl₂ 용액(0.544 mg/㎖; 상기 2.1 B (i) 참조) 1 ㎖과 혼합하여 제조한다.

C) 10 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂50 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl₂ 용액(3.023 mg/㎖; 상기 2.1 B (i) 참조) 0.45 ㎖과 혼합하여 제조한다.

냉동-건조한 펩타이드와 용액은 실온으로 평형화하였다. 명시된 용량의 ZnCl₂ 용액을 상기 냉동 건조한 펩타이드가 있는 바이얼에 주입하고, 1% 또는 2% 펩타이드 조성물의 경우 약 2분간, 10% 펩타이드 조성물의 경우 약 60분간, 또는 냉동-건조한 펩타이드 모두가 전부 수화되어 용액에 펩타이드 덩어리가 없을 때까지, 수화를 진행시켰다. 수화를 실시한 후, 재구성한 펩타이드를 약 1분간 교반하였다.

투여량으로, 용해시킨 펩타이드를 적량 취하였으며, 예컨대 상기 A로서 제조된 1% 펩타이드 100 ul은 1 mg 투여량과 동일하며, 상기 B로서 제조된 2% 펩타이드 50 ul은 1 mg 투여량과 동일하며, 상기 C로서 제조된 10% 펩타이드 150 ul은 15 mg 투여량과 동일하다.

본 발명의 내용으로, 당업자는 펩타이드 및 ZnCl₂의 양을 변경시켜 하기에 상세하게 나타낸 1%, 2% 및 10% 조성물 이외의 조성물 뿐만 아니라 원하는 투여량을 만들 수 있다.

2.3 1-10% 동결-건조한 펩타이드 및 ZnCl ₂ 가 함유된 pH 를 조절한 조성물의 제조

하기와 같이 약 1%, 약 2%, 또는 약 10% 펩타이드를 포함하는 제형을 제조하 였다. 기재된 바와 같이 제조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂의 냉동 건조한 샘플을 pH3의 ZnCl₂ 스톡 용액과 총 부형제 부피의 90%로 완전하게 혼합하였다. 상기 용액의 원하는 pH는 NaOH 희석액을 첨가하여 달성하였다.

A) 1 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl₂ 용액(상기 2.1 B (i) 참조) 1.8 ㎖과 혼합하여 제조한다.

B) 2 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl₂ 용액(상기 2.1 B (i) 참조) 0.9 ㎖과 혼합하여 제조한다.

C) 10 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂50 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl₂ 용액(상기 2.1 B (i) 참조) 0.40 ㎖과 혼합하여 제조한다.

상기 용액에, 필수량의 NaOH 희석 용액(부형제 총 부피의 10%)을 첨가하여, 목표 농도 및 pH를 만든다. 예컨대, 각각의 경우:

1% 조성물: 적절 농도의 NaOH 용액 0.2 ㎖ 첨가

2% 조성물: 적절 농도의 NaOH 용액 0.1 ㎖ 첨가

10% 조성물: 적절 농도의 NaOH 용액 0.05 ㎖ 첨가

본 발명의 내용으로, 당업자는 펩타이드 및 ZnCl₂의 양을 변경시켜 하기에 상세하게 나타낸 1%, 2% 및 10% 조성물 이외의 조성물을 만들 수 있다.

2.4 1-10% 동결-건조한 펩타이드 및 ZnCl ₂ 가 함유된 pH 를 조절하지 않은 액체 조성물의 제조

약 1%, 또는 약 2%, 또는 최대 약 10% 펩타이드를 포함하는 액체 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂을 칭량하여, pH3의 ZnCl₂ 스톡 용액과 혼합하여, 목표 농도 1%, 2%, 또는 최대 10%의 펩타이드를 만들었다. 혼합한 후, 조성물을 여과 멸균하고, 사용전까지 저장하였다.

2.5 1-10% 동결-건조한 펩타이드 및 ZnCl ₂ 가 함유된 pH 를 조절한 액체 조성물의 제조

약 1%, 또는 약 2%, 또는 최대 약 10% 펩타이드를 포함하는 액체 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂을 칭량하여, pH3의 ZnCl₂ 스톡 용액과 총 부형제 부피의 80%로 완전하게 혼합하였다. 아연 용액은 ZnCl₂ 또는 ZnAc₂.2H₂0일 수 있다. 용액의 원하는 pH는 NaOH 희석 용액을 첨가하여 적정하였다. 제제 C5 내지 C13은 이러한 방법으로 제조하였다.

본 발명의 내용으로, 당업자는 펩타이드 및 ZnCl₂의 양을 변경시켜 본원에 나타낸 1%, 2% 및 10% 조성물 이외의 조성물을 만들 수 있다.

2.6 25% 펩타이드 및 ZnCl ₂ 가 함유된 pH 를 조절하지 않은 반고형 /젤 조성물의 제조

약 25% 펩타이드를 포함하는 반고형 또는 젤 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂을 칭량하여, pH2의 ZnCl₂ 스톡 용액과 총 부형제 부피의 66.66%로 완전하게 혼합하였다. 아연 용액은 ZnCl₂ 또는 ZnAc₂·2H₂0일 수 있다. 제제 C1 및 C2를 이러한 방법으로 제조하였다.

보다 상세하게는, 반고형 또는 젤 조성물은 "푸시-풀(push- pull)" 혼합 방법으로 제조하였다:

a) 원하는 양의 펩타이드를 특수 2원식 핸드 밸브 HV(I. D. =0.5 mm)가 미리 장착된 일회용 시린지 S1 통에 칭량하여 넣고, 튜빙을 시린지 Luer 홀 내부로 위치시킨다;

b) 시린지 플런지를 스테인레스 스틸 로드 SR로 고정한다;

c) S1내 HV를 진공원과 연결시키고, HV를 연다. 10분 후에 HV를 닫는다;

d) 아연 용액을 두번째 일회용 시린지 S2에 정확하게 칭량하여 넣는다;

e) S2를 HV의 연결되지 않은 부분과 연결한다;

f) HV를 열고, 진공으로 펩타이드 분말이 있는 통 S1으로 용매가 들어가게 한다;

g) HV를 닫고, 용매 시린지 S2를 제거하여, S1내 펩타이드 분말을 수화시킨다;

h) SR을 빼, 시린저 플런지가 단독으로 있게 한다;

i) HV를 열지 않은 상태에서 시린지 플런지를 이동(밀고 당김)시켜, 분말이 용매으로 완전히 젖게 한다;

j) 시린지 Luer 홀 내부에 관이 있는 2원식 스테인레스 연결기 SC(I.D.=1.0 mm)를 시린지 S에 장착시키고, 그 플런지를 끝쪽으로 민다;

k) S1에서 HV를 열어 진공을 가한 다음 HV를 제거한다. 시린지 플런지를 밀어 시린지 통내 공기를 최소화시킨다; 및

l) S1과 S2를 SC에 의해 연결시키고, 조성물을 S1에서 S2로 SC를 통해 혼합한다.

본 발명의 내용으로, 당업자는 펩타이드 및 ZnCl₂의 양을 변경시켜 본원에 나타낸 25% 조성물 이외의 조성물을 만들 수 있다.

2.7 25% 펩타이드 및 ZnCl ₂ 가 함유된 pH 를 조절한 반고형 /젤 조성물의 제조

약 25% 펩타이드를 포함하는 반고형 또는 젤 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib⁸ ^,35]HGLP-1(7-36)NH₂을 칭량하여, pH2의 ZnCl₂ 스톡 용액과 총 부형제 부피의 66.66%로 완전하게 혼합하였다. 아연 용액은 ZnCl₂ 또는 ZnAc₂·2H₂0일 수 있다. 용액의 원하는 pH는 NaOH 희석 용액을 첨가하여 적정한다. 본 실시예에서, 분말에 첨가되는 액체의 총 부피는 아연 및 NaOH 용액으로 분할되어야 한다. 따라서, 아연 용액의 농도를 조절하여, 필요한 아연 용액의 총 부피를 펩타이드 분말에 첨가된 총 액체 부피의 50%로 감소시켰다(단계 d). 펩타이드 분말에 첨가되는 총 액체 부피의 나머지 50%를 하기와 같이 NaOH 용액으로서 하기에 상세히 기술된 바 와 같이 첨가하였다. 제제 C3 및 C4는 이러한 방법으로 제조하였다.

pH 조절한 반고형 또는 젤 조성물을 "푸쉬-풀(push-pull)" 혼합 방법으로 제조하였다:

a) 원하는 양의 펩타이드를 특수 2원식 핸드 밸브 HV(I. D. =0.5 mm)가 미리 장착된 일회용 시린지 S1 통에 칭량하여 넣고, 시린지 Luer 홀 내부로 관을 위치시킨다;

b) 시린지 플런지를 스테인레스 스틸 로드 SR로 고정한다;

c) S1의 HV를 진공원과 연결시키고, HV를 연다. 10분 후에 HV를 닫는다;

d) 아연 용액을 두번째 일회용 시린지 S2 통에 정확하게 칭량하여 넣는다;

e) S2를 HV의 연결되지 않은 부분과 연결한다;

g) HV를 닫고, 용매 시린지 S2를 제거하여, S1내 펩타이드 분말 수화시킨다;

h) SR를 제거하여 시린저 플런저가 고정되지 않게 한다;

i) HV를 열지 않은 상태에서 시린지 플런지를 이동(밀고 당김)시켜, 분말이 용매로 완전히 젖게 한다;

k) S1의 HV를 열어 진공을 가한 다음 HV를 제거한다. 시린지 플런지를 움직여 시린지 통내 공기를 최소화시킨다;

l) S1과 S2를 SC에 의해 연결시키고, 조성물을 S1에서 S2로 SC를 통해 혼합한다;

m) 균질화(homogenization)를 수행한 후, 혼성 산물의 분액을 취하여 펩타이드 농도를 결정한다;

n) 나머지 중간 벌크 산물을 정확하게 칭량하고, 원하는 pH를 적정하는데 필요한 NaOH 용액의 양을 계산한다;

o) NaOH 용액을 정확하게 칭량하여 세번째 일회용 시린지 S3에 넣는다;

p) 시린지 플런지를 천천히 압축하여 시린지 챔버내 공기를 최소화한다. 시린지 둘개를 SC로 연결시키고, 조성물을 SC를 통해 혼합한다.

표 1

실시예	^*펩타이드 %	용액	^**펩타이드:아연 비	펩타이드 투여량
C1	10	ZnCl₂ 0.846 mg/ml	5.4:1	1 mg
C2	5	0.40 mg ZnCl₂/ml	5.4:1	1 mg
C3	10	50% ZnCl₂ 1.69 mg/ml, 50% NaOH 1 mg/ml	5.4:1	1 mg
C4	10	50% ZnCl₂ 2.28 mg/ml, 50% NaOH 1 mg/ml	4:1	1 mg
C5	5	80% ZnCl₂ 0.674 mg/ml, 20% NaOH 3.81 mg/ml	4:1	1 mg
C6	2	80% ZnCl₂ 0.26 mg/ml, 20% NaOH 2.15 mg/ml	5.4:1	1 mg
C7	10	80% ZnCl₂ 3.81 mg/ml, 20% NaOH 4.47 mg/ml	1.5:1	1 mg
C8	10	80% ZnAc₂.2H₂0 2.3 mg/ml, 20% NaOH 6.1 mg/ml	4:1	1 mg
C9	2	80% ZnCl₂ 0.695 mg/ml, 20% NaOH 1.75 mg/ml	1.5:1	1 mg
C10	2	80% ZnAc₂.2H₂0 1.12 mg/ml, 20% NaOH 1.44 mg/ml	1.5:1	1 mg
C11	2	80% ZnCl₂ 0.695 mg/ml, 20% NaOH 1.75 mg/ml	1.5:1	1 mg
C12	1	80% ZnCl₂ 0.384 mg/ml, 20% NaOH 0.875 mg/ml	1.5:1	1 mg
C13	10	80% ZnCl₂ 3.85 mg/ml, 20% NaOH 4.47 mg/ml	1.5:1	15 mg

^*: 목표 값을 나타낸다. 실제 값은 모든 경우에서 목표치의 5% 내외이다.

^**: 목표 값을 나타낸다. 실제 값은 모든 경우에서 목표치의 10% 내외이다.

3.0 GLP -1 수용체의 친화성 결정

본 발명의 실시에 사용가능한 화합물을 하기 방법으로 GLP-1 수용체에 결합하는 능력에 대해 테스트할 수 있다.

세포 배양:

GLP-1 수용체를 발현하는 RIN 5F 랫 인슐리노마 세포(ATCC-# CRL-2058, American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 10% 소 태아 혈청이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM)에서 배양하였고, 약 37 ℃의 습윤한 5% CO₂/95% 공기하에서 유지시켰다.

방사능 표지된 리간드( Radioligand )에 대한 결합성:

빙냉한 50 mM Tris-HCl 20 ㎖ 중에 RNI 세포를 Brinkman Polytron (Westbury, NY)(6으로 설정, 15초)으로 균질화하여, 방사능 표지된 리간드에 대한 결합성 연구를 위한 막을 준비하였다. 균질물은 원심분리(39,000 g / 10 min)에 의해 2번 세척하고, 최종 펠렛을 2.5 mM MgCl₂, 0.1 mg/㎖ 박시트라신(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 및 0.1% BSA가 함유된 50 mM Tris-HCl에 재현탁하였다. 분석을 위해, 분주물(0.4 ㎖)을 0.05 nM (¹²⁵I)GLP-1(7-36)(~2200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA)과, 비표지된 경쟁 테스트용 펩타이드 0.05 ㎖이 첨 가 및 무첨가한 상태로 인큐베이션하였다. 100분간 인큐베이션(25 ℃)한 다음, 결합된 (¹²⁵I)GLP-1(7-36)은 미리 0.5% 폴리에틸렌이민에 젖셔 둔 GF/C 필터(Brandel, Gaithersburg, MD)로 신속하게 여과하여, 비결합물로부터 분리하였다. 이후, 필터를 빙냉한 50 mM Tris-HCl 5 ㎖로 3번 세정한 다음 필터에 포착된 결합된 방사능을 감마 측정기(Wallac LKB, Gaithersburg, MD)로 계측하였다. 특이적인 결합성은 (¹²⁵I)GLP-1(7-36)의 총 결합에서 1000 nM GLP-1(7-36)(Bachem, Torrence, CA)의 존재하에서의 결합을 제한 것으로 정의되었다.

4. 용해성 대 pH 결정

4.1 인산 완충화된 염수( PBS )에서의 화합물의 용해도 대 pH 의 결정

본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 여러가지 pH 및 온도에서의 PBS 용해도를 결정할 수 있다.

프리-믹스 분말 한 핵(SIGMA, Product No.: P-3813)을 탈이온수 1 L에 용해시켜, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl이 함유된 pH 7.4의 10 mM 포스페이트 완충 염수를 제조함으로써, PBS 스톡 완충액을 준비하였다. 이 스톡 용액의 pH를 인산 및/또는 수산화나트륨으로 조절하여, 다양한 pH의 PBS 완충액을 제조할 수 있다.

테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물 2 mg을 측정하여 유리 바이얼에 넣었다. 각 바이얼에 특정 pH의 PBS 완충액 50 ㎕을 첨가하였다. 이 용액을 볼텍싱하고, 필요에 따라 투명해질 때까지 초음파처리한다. 테스트하는 각 pH에서, 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 완충액의 총 부피를 기록하였고, 용해도 를 계산하였다.

실온(20-25 ℃)에서 투명한 펩타이드 용액을 밤새 냉장고(4 ℃)에 두었고, 이후 4 ℃에서의 용해도를 평가하였다.

4.2 염수에서의 화합물의 용해도 대 pH 결정

본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 여러가지 pH 및 온도에서의 염수내 용해도를 결정할 수 있다.

탈이온수 1 L에 NaCL 9 g을 용해시켜, 스톡 식염수를 제조한다. 이 스톡 용액의 pH를 HCl 및/또는 NaOH로 조절하여, 다양한 pH의 식염수를 제조한다.

테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물 2 mg을 측정하여 유리 바이얼에 넣었다. 각 바이얼에 특정 pH의 식염수 50 ㎕을 첨가하였다. 이 용액을 볼텍싱하고, 필요에 따라 투명해질 때까지 초음파처리한다. 테스트하는 각 pH에서, 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 식염수의 총 부피를 기록하였고, 용해도를 계산하였다.

4.3 pH 7.0의 염수에서의 화합물의 용해성 결정

본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 실온에서 pH7의 식염수에 대한 용해도를 결정할 수 있다.

탈이온수 1 L에 NaCL 9 g을 용해시켜, 스톡 식염수를 제조한다. 테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물을 측정하여 유리 바이얼에 넣고, 염수 1 ㎖을 첨가하여 볼텍싱하고 투명해질 때까지 초음파처리한다. 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 염수의 총 부피를 기록하였고, 용해도를 계산한다.

4.4 다양한 pH 의 염수에 대한 화합물의 용해도 결정

본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 실온에서의 다양한 pH의 식염수에 대한 용해도를 결정할 수 있다.

탈이온수 1 L에 NaCL 9 g을 용해시켜, 스톡 식염수를 제조한다. 이 스톡 용액의 분획에 HCl 및 NaOH를 처리하여, 다양한 pH의 식염수를 제조한다.

테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물을 측정하여 유리 바이얼에 넣는다. 특정 pH의 염수 완충액 50 ㎕을 첨가한다. 이 용액을 볼텍싱하고 투명해질 때까지 초음파처리한다. 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 완충액의 총 부피를 기록하였고, 용해도를 계산한다.

5. 화합물의 용해도 대 아연 농도의 결정

본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 다양한 아연 농도에서의 pH 7의 물에서의 용해도를 결정할 수 있다.

탈이온수에 ZnCl₂를 100 mg/㎖ 농도로 용해시키고, HCl로 pH를 2.7로 조절하여, 아연 스톡 용액을 제조한다. 이 스톡 용액을 적절하게 희석하여, ZnCl₂ 농도가 다양한 용액("Zn 테스트 용액")을 제조한다.

테스트할 화합물 1 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물 1 mg을 각각의 Zn 테스트 용액 250 ㎕에 용해시켜, 화합물 4 mg/㎖이 포함된 용액을 만든다. 그런 후, 이 용액에서 백색 침전물 형성이 관찰될 때까지 0.2 N NaOH를 이용하여 pH를 조절한다. 침전된 용액은 원심분리하였고, HPLC를 이용하여 모 용액(mother liquor)을 분석하였다. 테스트 화합물 피크의 UV 흡광 면적을 계산하고, 상기 모 용액에서의 테스트 화합물의 농도를 보정 곡선(calibration curve)과 비교하여 결정한다.

본 발명의 실시에 이용될 수 있는 대표적인 화합물로서, 실시예 1의 화합물을 상기 분석 방법으로 조사하여, 다음과 같은 결과를 수득하였다(수성 염수, pH 7.0, 실온):

표 2

ZnCl₂ 농도(㎍/㎖)	수용성(mg/㎖)
0	5.788
80	0.0770
500	0.0579
1000	0.0487
1500	0.0668
2500	0.1131

6. IEF 겔을 이용한 pI 결정

인비트로겐사의 Novex IEF pH3-10 겔을 이용하여, GLP-1 펩타이드의 pI를 측정할 수 있다. 테스트할 펩타이드 화합물을 0.5 mg/㎖ 농도로 물에 용해시킨다. 각 화합물에서, 제조되는 용액 5 ㎕을 Novex^? 샘플 완충액 2X(20 mM 아르기닌 프리 염기, 20 mM 라이신 프리 염기 및 15% 글리세롤로 구성됨) 5 ㎕과 혼합하고, 제조되는 10 ㎕의 샘플 용액을 겔에 단백질 표준 샘플과 함께 로딩한다.

전개 완충액 또한 인비트로겐사에서 구입하였고, 제조사의 설명서에 따라 일반적으로 하기와 같이 겔에서 전개시켰다: 1시간 동안 100 V로 일정하게 한 다음 1시간 동안 200 V를 유지하고, 다시 30분 동안 500 V로 유지.

이후, 겔은 3.5% 설포살리사이클산이 함유된 12% TCA에 30분간 고정한 다음, Novex^? 콜로이달 블루 키트에 있는 설명서에 따라 콜로이달 코마시 블루로 2시간 동안 염색한 다음, 밤새 물로 탈염하였다.

겔을 스캐닝하여 단편 분석 1.2 프로그램으로 분석하였다. 알지 못하는 펩타이드들의 pI를 pI 값이 10.7, 9.5, 8.3, 8.0, 7.8, 7.4, 6.9, 6.0, 5.3, 5.2, 4.5, 4.2 및 3.5인 표준 화합물의 pI와 비교하여 계산하였다.

실시예 1의 화합물의 pI 측정값은 7.60이었다.

7. 랫에서의 생체내 분석

본 발명의 화합물은 하기 분석 방법으로 생체내 효과를 촉진 및 강화시키는 능력을 결정하기 위해 테스트할 수 있다.

7.1 실험 과정:

실험하기 전날에, 체중 약 300-35O g의 Sprague-Dawley 수컷 성체 랫(Taconic, Germantown, NY)를 클로로하이드레이트로 마취한 상태에서 우측 심방 경정맥에 캐뉼러를 이식하였다. 이후, 랫은 적절한 테스트 화합물 또는 비히클 대조군을 시간 0에서 주사하기 전까지 18시간 동안 금식시켰다. 랫은 전체 실험을 수행하는 동안 계속적으로 금식시켰다.

pH 2.7의 HCl 수용액 중의 ZnCl₂ 100 mg/㎖ 용액을 물로 희석하여, 0.5 mg/㎖의 ZnCl₂ 용액을 제조하였다. 이 용액의 250 ㎕에 식 (I)의 화합물 [Aib⁸ ^,35]hGLP- 1(7-36)NH₂) 1 mg을 용해시켜, 상기 화합물의 농도가 4 mg/㎖이고 아연이 0.5 mg/㎖인 pH 4의 맑은 용액을 수득하였다.

시간 0에, 랫에 (a) 상기 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂) 용액 또는 (b) 비히클 대조군을 피하(sc) 주사하였다. 둘 다, 주사 부피는 최소량(4-6 ㎕)이며, 개체에 투여되는 GLP-1 화합물의 투여량은 75 ㎍/kg이었다. sc 주사한 후 적당한 시간에, 혈액 500 ㎕을 정맥내(iv) 캐뉼러를 통해 취하고, 랫에 인슐린 분비 강화 현상을 테스트하기 위하여 iv로 글루코스를 주입하였다. 글루코스를 주입한 시간은 화합물 주사 후 0.25, 1, 6, 12 및 24시간 이후이다. 처음 혈액 샘플을 취한 후, 글루코스(1 g/kg)를 정맥내로 주사하고, 500 ㎕의 헤파린 처리한 염수(10 U/㎖)를 흘려주었다(flushed). 그 후, 혈액 샘플 500 ㎕을 글루코스 주사 후 2.5, 5, 10 및 20분 후에 채혈하였다. 이들 각각 이후에, 바로 캐뉼러를 통해 500 ㎕의 헤파린 처리한 염수(10 U/㎖)를 iv 주사하였다. 혈액 샘플은 원심분리하여, 각 샘플에서 혈장을 채집하고, 인슐린 함량을 분석하기 전까지 샘플을 -2O ℃에 보관하였다. 각 샘플에서의 인슐린 함량은 랫의 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 키트(American Laboratory Products Co., Windham, NH)를 이용하여 결정하였다.

7.1.1. 결과:

장기간의 인슐린-강화 활성은 전체 24시간의 실험을 수행하는 동안 글루코스 주사에 의해 유도가능한 것으로 관찰되었다.

8. 개에서의 생체내 분석

활성 화합물의 생체내에서의 장기 분비를 촉진시키는 조성물의 능력을 결정하기 위하여, 당업자가 실시할 수 있는 당업계에 공지된 생체내 분석 방법은 여러가지가 있다.

8.1 1% 펩타이드 조성물:

예로, 식 (I)의 화합물 1% (w/w)를 ZnCl₂ 완충액(펩타이드:Zn 비는 1.5:1.0임) 중에 포함하는 테스트 수성 제형을 준비하였다.

42-78월령의 체중 14-21 kg의 6마리의 수컷 비글종의 개를 자유롭게 물에 접근가능하게 두었으며 하루에 한번 식사(표준적인 건조 음식물(SAFE 125) 약 400 g)를 제공하였다. 개는 테스트 조성물을 투여하기 전에 18시간 동안 금식시켰다.

테스트 화합물은 견갑골 사이 영역에 피하 경로로 투여하였다. 투여 용량(동물 1 마리당 약 20 ㎕)은 0.33-12 mm (BS=30M2913)가 장착된 0.3 ㎖의 Terumo 시린지로 투여하였다. 즉, 이론적인 투여량으로 약 0.2 mg의 펩타이드를 사용하였다.

투여한 후 혈액 샘플을 약 0, 8, 15, 30 및 45분, 1, 2, 4, 8 및 12시간, 및 1, 2, 3, 4, 5 및 6일 후에 주기적으로 채혈하였다. 혈액은 원심분리할 때까지 샘플링한 후 신속하게 냉각시키고, 혈장을 취하여 급속 동결 펜딩 분석(rapidly frozen pending assay)을 수행하였다. 펩타이드 혈장 농도는, 오프라인의 고상 추출과 이후의 LC-MS/MS와 커플링된 온-라인 상 추출 이후에 결정하였고, 수득되는 데이타는 Analyst v1.2 소프트웨어로 관리하였다.

조성물이 적어도 2일 동안 활성 펩타이드를 장기 방출하는 것으로 확인되었다.

8.2 1% [ Aib ⁸ ^,35 ] hGLP -1(7-36)NH ₂ ) 용액:

상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간 동안 대상 펩타이드를 방출시키는 능력에 대해 하기 조성물을 조사하였다. 하기 4개의 조성물 각각에서, 펩타이드 농도는 약 1%(wt/wt)이고, 펩타이드 대 아연의 비는 약 1.5:1이고, 투여되는 펩타이드의 투여량은 약 1 mg이다.

용액 8.2.A: (i) 90% ZnCl₂(0.298 mg/㎖) 및 (ii) 10% NaOH(0.975 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂

용액 8.2.B: ZnCl₂(0.286 mg/㎖) 용액 중의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂

용액 8.2.C: 용액 8.2. B와 실질적으로 유사하며, AcOH/AcO^-로 완충화됨

용액 8.2. D: 용액 8.2.A와 실질적으로 유사함.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 장기간 방출하였다.

8.3. 1% [ Aib ⁸ ^,35 ] hGLP -1(7-36)NH ₂ 용액:

상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하 여, 장기간동안 대상 펩타이드를 방출시키는 능력에 대해 하기 조성물을 조사하였다. 하기 조성물에서, 펩타이드 농도는 약 2%(wt/wt)이고, 펩타이드 대 아연의 비는 약 1.5:1이고, 투여되는 펩타이드의 투여량은 약 1 mg이다.

용액 8.3.: (i) 80% ZnCl₂(0.695 mg/㎖) 및 (ii) 20% NaOH(1.78 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂

도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂을 장기간 방출하였다.

8.4. 10% 펩타이드 용액:

상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩타이드를 방출시키는 능력에 대해 하기 조성물을 조사하였다. 하기 4개의 조성물 각각에서, 펩타이드 농도는 약 10%(wt/wt)이고, 펩타이드 대 아연의 비는 약 1.5:1이고, 투여되는 펩타이드의 투여량은 약 15 mg이다.

용액 8.4.A: (i) 90% ZnCl₂(3.367 mg/㎖) 및 (ii) 10% NaOH(5.01 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂

용액 8.4.B: ZnCl₂(2.993 mg/㎖) 용액 중의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂

용액 8.4.C: 용액 8.4.B와 실질적으로 유사하며, AcOH/AcO^-로 완충화됨

용액 8.4. D: 용액 8.4.A와 실질적으로 유사함.

도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂을 장기간 방출하였다.

8.5. 반고형 조성물:

상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩타이드를 방출시키는 능력에 대해 하기 반고형 조성물을 조사하였다. 조성물 8.5.A.의 펩타이드 농도는 약 5%이지만, 조성물 8.5.B., 8.5.C. 및 8.5.D.의 펩타이드 농도는 약 10%(wt/wt)이다. 8.5.A., 8.5.B. 및 8.5.C. 조성물에서 펩타이드 대 아연의 비는 약 5.4:1이고, 8.5.D. 조성물에서의 비는 약 4.0:1이다. 4개의 조성물 모두, 투여되는 펩타이드의 투여량은 약 1 mg이다.

조성물 8.5.A: WFI 중에 ZnCl₂(0.40 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂

조성물 8.5.B: 실질적으로 조성물 8.5.A.와 동일하며, ZnCl₂의 농도는 펩타이드 대 아연의 비를 약 5.4:1로 유지시키기 위해 상향 조절되었음.

조성물 8.5.C: (i) 50% ZnCl₂(1.69 mg/㎖) 및 (ii) 50% NaOH(1 mg/㎖)를 포함하는 반고형 형태의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂

조성물 8.5. D: (i) 50% ZnCl₂(2.28 mg/㎖) 및 (ii) 50% NaOH(1 mg/㎖)를 포 함하는 반고형 형태의 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂

도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들은 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 장기간 방출하였다.

8.6. 반고형 조성물:

상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩타이드를 방출시키는 능력에 대해 하기 반고형 조성물을 조사하였다. 조성물은 pH 2.0의 5.22 mg/㎖ ZnCl₂ 용액을 이용하여 제형화하였다. 충분한 양의 펩타이드를 사용하여, 펩타이드:아연 비가 약 4:1인 25% 펩타이드 반고형 조성물을 제조하였다. 상기 조성물의 pH를 10 mg/㎖의 NaOH를 이용하여 본원에 기재된 바와 같이 조절하였다. 투여되는 펩타이드의 투여량은 약 15 mg이다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 8.6 조성물은 [Aib⁸ ^,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 장기간 방출하였다.

8.7. 반고형 조성물:

상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩타이드를 방출시키는 능력에 대해 하기 반고형 조성물을 조사하였다. 조성물은 pH 2.0의 8.5 mg/㎖ ZnCl₂ 용액을 이용하여 제형화하였다. 충분한 양의 펩타이드를 사용하여, 펩타이드:아연 비가 약 1.51인 23% 펩타이드 반고 형 조성물을 제조하였다. 조성물은 상기 섹션 2.6에 자세히 나타낸 방법에 따라 제형화하였다. 투여되는 펩타이드의 투여량은 약 15 mg이다(이는 조성물 약 65 ㎕에 해당됨).

도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 8.7 조성물은 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂를 장기간 방출하였다.

개시된 제형의 다양한 치환에 대한 추가적인 분석들을 생체내 분석으로 수행하였으며, 본 발명의 조성물들이 식 (I)의 화합물에 대한 유용한 약물 전달 플랫폼을 제공하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 내용을 이용하여, 당업자는 펩타이드와 ZnCl₂의 양 및 pH를 변경하여, 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다.

실시예 9

1. 10% 펩타이드 용액내 아세테이트 함량에 의한 PK 프로파일 조절

본 실시예는 10% (Aib⁸ ^,35)hGLP1(7-36)NH₂와ZnCl₂[(Aib⁸ ^,35)hGLP1(7-36)NH₂:Zn = 1.5:1]을 포함하는 2가지 즉석 조성물을 15 mg/dog로 1회 피하 주사한 후, 비글종 수컷 개에서의 (Aib^8,35)hGLP1(7-36)NH₂ 의 약물 동태학적 연구를 개시하고 있다.

생체내 분석을 수행하기 위한 방법은 단락 8.1에 기술된 방법과 동일하다.

본 실시예에서는, 약학 조성물내 아세테이트 함량에 의한 PK 프로파일 조절과 그로 인한 약학 조성물의 [아세테이트/펩타이드] 비가 pH에 미치는 영향을 나타 낸다.

pH 조절은 아세테이트 함량을 조절하는 방식으로 이루어지며, 아세테이트 함량 감소는 pH에 대한 영향 증가를 보인다.

또한, 아세테이트 변동은 C_max에도 영향을 미친다. 일반적으로, 아세테이트 함량 감소는 C_max 값을 감소시킨다.

아세테이트의 함량 증가는 용해도 및 물리적 안정성을 개선시키는 것으로 보인다.

선택한 제형에 있어서, 아세테이트/펩타이드의 비율 조절에 의한 용해도 또는 안정성 개선은, 펩타이드/Zn의 예컨대 C_max에 대한 조절로 상쇄된다. 이러한 점은 용해도, 안정성, pH, 또는 C_max를 조절하기 위한 3가지 가능성 있는 변수를 가진 시스템으로서 볼 수 있다.

예로, 약자 SD는 표준 편차를 의미한다. AUC는 혈장 농도-시간 곡선 하 아르테미시닌 면적(Artemisinin area)을 의미한다.

약자 MRT는 평균 잔류 시간(MRT)을 의미하는 것으로, MRT를 약물 피크 농도 시간인 tmax와 비교하기 위해 생체이용율을 추산하는 파라미터이다. MRT는 0 시간에서 마지막 샘플링 기간 전체 데이타를 이용하여 계산하였다.

표 3에는, 여러가지 [아세테이트/펩타이드] 비를 가진 10% 펩타이드 조성물 배치를 비글종 개에 피하 투여한 결과를 취합하여 나타내었다. 혈장 농도에서 약 물 피크 값(C_max)는 [아세테이트/펩타이드] 몰 비가 [3.7:1]인 경우에는 8.10 ng/ml(SD=1.80 ng/ml)이었고, 몰 비가 [3.2:1] 보다 낮은 경우의 C_max 값은 5.65 ng/ml (SD=2.61 ng/ml)이었다.

표 3

제형		10% 15mg		10% 15mg
펩타이드/Zn 비		1.5:1		1.5:1
파라미터	단위	MEAN (n=5)	S.D.	MEAN (n=4)	S.D.
투여량	㎍· kg ^-1	857.7	131.0	694.8	46.5
t_max	d	0.208	0.167	0.111	0.068
C_max	ng · ml ^-1	8.10	1.80	5.65	2.61
t₁ _/2 _app	d	3.32	0.66	6.77	2.04
AUC_t	ng · ml ^-1 ·d	53.5	14.3	38.2	9.2
AUC	ng · ml ^-1 ·d	55.4	15.7	41.6	8.9
AUC_extrap.	%	2.99	1.83	8.44	5.00
MRT_t	d	9.31	2.25	7.48	1.39
MRT	d	9.96	2.60	9.85	2.54
[아세테이트:펩타이드]		3.7:1		3.2:1

10. GLP-1 펩타이드 염/2가 금속 제형

10.1. 방법

(Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 1 mg/mL 물 및 PBS 용액을 제조하고, pH를 7.0으로 조절하였다. CaCl₂, CuCl₂, MgCl₂, 및 ZnCl₂의 10 mg/mL 소톡 용액을 수중에 제조하였다. Cu가 석출되기 때문에, CaCl₂, MgCl₂, 및 ZnCl₂ 용액의 pH는 염기성이 될 수 없었다. 따라서, pH 4.4의 CuCl₂ 용액을 사용하였다.

4 ㎕ 금속 이온수 또는 PBS 용액을 200 ㎕ (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 1 mg/mL 용액에 첨가하여, 최종 금속 이온 농도가 200 ㎍/mL이 되게 하였다. 제조한 용액을 혼합하고, 침전을 체크하였다. 침전이 생기면, 현탁액을 원심분리하였다. 상층액내 (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 농도는 HPLC로 결정하였다.

10.2. 결과

표 4. 2가 금속 이온의 존재 시의 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 용해도

	수용액, mg/mL	PBS 용액, mg/mL
CaCl₂	>1 (pH 7.1)	>1 (pH 6.8)
CuCl₂	0.058 (pH 7.1)	0.039 (pH 6.8)
MgCl₂	>1 (pH 7.2)	>1 (pH 6.9)
ZnCl₂	0.108 (pH 6.9)	0.056 (pH 6.8)

10.3. (Aib ^8,35 )hGLP-1(7-36)NH ₂ /2가 금속 pH 5.5 투명 용액 제형의 약물 동태학적 연구

(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 3가지 상이한 제형을, 하기 방법으로 제조하였다.

(1) (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 염 및 CuCl₂

(2) (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 염 및 ZnCl₂

(3) (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 아세테이트 염 및 ZnCl₂

GLP-1유사체의 TFA 염(TFA 염은 분취용 HPLC를 이용하여 TFA 함유 완충액으로 용리시켜 펩타이드를 정제함으로써 수득함)을, 펩타이드를 소량의 0.25 N 아세 트산 수용액에 용해시킴에의해 수득하는 아세테이트 염과 같은 다른 염으로 변환할 수 있다. 수득되는 용액을 반-분취용 HPLC 컬럼(Zorbax, 300 SB, C-8)에 적용한다. 컬럼은 (1) 0.1N 암모늄 아세테이트 수용액으로 0.5시간, (2) 0.25N 아세트산 수용액으로 0.5시간, 및 (3) 선형 농도 구배(용액 B를 20%에서 100%로 30분간), 유속 4 ml/min(용액 A는 0.25N 아세트산 수용액이고; 용액 B는 아세토니트릴/물 80:20 중의 0.25N 아세트산임)으로 용리한다. 펩타이드가 포함된 분획을 모아, 동결 건조로 건조하였다.

건조 과정에 따라 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 염을 제조하였다. 20 mg (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 아세테이트를 20 mM HCl 수용액 4 mL에 용해하고, 10분간 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 얼리고, 밤새 동결 건조하였다. 동결 건조를 2번 더 수행하였고, 최종 산물의 염화물 함량을 결정하였다. 결정된 염화물 함량은 5.38%였다.

(1) ( Aib ⁸ ^,35 ) hGLP -1(7-36)NH ₂ HCl 염과 CuCl ₂ :

(Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 5.3 mg(펩타이드 함량 95%)을 20 mM CuCl₂ 수용액 50 ㎕에 용해하였다. 약 2 ㎕의 1 N NaOH을 사용하여 pH를 약 5.5로 조정하였다. (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂/CuCl₂ 몰 비는 1.5:1이었다. 수(w/w) 중의 펩타이드 농도는 10% (30 mM)였고, pH는 약 5.5이다.

(2) (Aib ^8,35 )hGLP-1(7-36)NH ₂ HCl 염과 ZnCl ₂ :

(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ HCl 5.3 mg(펩타이드 함량 95%)을 50 ㎕의 20 mM ZnCl₂ 수용액에 용해하였다. 약 2 ㎕의 1 N NaOH을 사용하여 pH를 약 5.5로 조정하였다. (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂/ZnCl₂ 몰 비는 1.5:1이었다. 수(w/w) 중의 펩타이드 농도는 10% (30 mM)였고, pH는 약 5.5이다.

(3) (Aib ^8,35 )hGLP-1(7-36)NH ₂ 아세테이트 염과 ZnCl ₂ :

(Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 아세테이트 5.5 mg(펩타이드 함량 92%)을 50 ㎕의 20 mM ZnCl₂ 수용액에 용해하였다. 수득되는 용액을 밤새 동결 건조한 다음, 물 50 ㎕에 다시 용해하였다. 약 1 ㎕의 1 N NaOH을 사용하여 pH를 약 5.5로 조정하였다. (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂/ZnCl₂ 몰 비는 1.5:1이었다. 수(w/w) 중의 펩타이드 농도는 10% (30 mM)였고, pH는 약 5.5이다.

10.4. 투약 및 혈액 샘플 수집

3가지 (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 제형을 랫에 0.3 mg/rat(10% 용액 3 ㎕)으로 피하 투여하였다. 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2 일, 3일, 4일, 7일 10일에 혈액 샘플을 채혈하였다. 이를 원심분리하여 혈액으로부터 혈장을 수득하여 -80 ℃에 저장하였다. 주사한 부위의 조직도 적출하여, 5x 메탄올로 균질화한 다음 -80 ℃에 저장하였다. 랫 2마리는 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 8시간에 데이타를 취하였다. 다른 랫 한마리는 1, 2, 3, 4, 7, 10시간에 데이타를 취하였다.

10.5. LC - MS / MS 샘플 제조

혈장(200 ㎕)을 10 ㎕ 포름산으로 산성화하고, 아세토니트릴 600 ㎕ 을 이용하여 침전시켰다. 상층액을 원심분리로 수거하고, 진공 농축하여 건조하였다. 잔사를 수 중의 30% 아세토니트릴 150 ㎕에 용해하고, 원심분리하였다. 상층액 50 ㎕를 LC-MS/MS 분석에 투입하였다.

10.6. LC - MS / MS 분석

LC-MS/MS 분석은 Turbo Ionspray probe가 장착된 API4000 질량 분광측정 시스템으로 수행하였다. 분자 이온 검출의 MRM 모드와 이온쌍 668.9 및 136.1을 사용하였다.

Luna C8(2) 2 x 30 mm 3μ 컴럼을 이용하여 유속 0.30 mL/분으로 10분간 10% B -> 90% B로 흘려주어, HPLC 분리를 수행하였다. 완충액 A는 1% 포름산 수용액이고, 완충액 B는 1% 포름산 아세토니트릴 용액이다.

LOQ는 0.5 ng/mL이었다.

10.7. 결과 및 종합

펩타이드의 혈장 농도는 이의 표준 보정 플롯을 이용하여 계산하였다. 0.06 mg/mL (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂(5 mL 메탄올 추출물 중 의0.3 mg/rat)을 100%로 사용하여, 주입 주위에 잔류 %를 계산하였다.

표 5. (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 혈장 농도

시간, h	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂HCl 및 CuCl₂ 투약의 혈장 농도 (ng/mL)	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂HCl 및 ZnCl₂ 투약의 혈장 농도(ng/mL)	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 아세테이트 및 ZnCl₂ 투약의 혈장 농도(ng/mL)
0.083	4.76	5.06±3.85	25.9±14.57
0.17	3.18	13.04±12.81	16.35±5.02
0.25	3.44	13.65±8.14	32.2
0.5	7.95±5.3	13.86±11.8	19.5±3.68
1	11.8	12.4±10.61	11.5
2	11.4±1.27	12.9±0.35	8.64
4	5.9±5.2	6.39±4.62	5.48
8	0.9±0.37	0.72	6.41
24	1.35	1.08	0.94
48	0.68	1.21
72	0.66	0.47	0.77
96	0.15	1.35	0.33
168	0.17	0.74	0.82
240	0.35	0.6	1.09

(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 HCl 염 제형의 약물 동태학적 프로파일의 전체 시간 추이에 따른 그래프를 도 8에 나타낸다. (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 HCl 염 제형의 약물 동태학적 프로파일의 초기 시간 추이 그래프는 도 9에 나타낸다. (Aib^8,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 아세테이트 염 제형의 약물 동태학적 프로파일의 전체 시간 추이에 따른 그래프는 도 10에 나타낸다. (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂의 아세테이트 염 제형의 약물 동태학적 프로파일의 초기 간 추이에 따른 그래프는 도 11에 나타낸다.

표 6. 주사 부위에서의 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 잔류 추정 %

시간, 일	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂HCl 및 CuCl₂ 주사 부위에서의 잔류 추정 %	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂HCl 및 ZnCl₂ 주사 부위에서의 잔류 추정 %	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂아세테이트 및 ZnCl₂ 주사 부위에서의 잔류 추정 %
1	1.58	10.59	6.96
2	24.88	26.94	9.97
3	12	21.87	11.6
4	0.14	0.04	0.23
7	0.47	0.06	0.03
10	0.01	0.02	0.01

주사 부위에서의 (Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 조직 축적 프로파일을 도 12에 추가적으로 나타낸다.

표 7. PK 파라미터

	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂HCl 및 CuCl₂ 투여량의 혈장 농도(ng/mL)	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂HCl 및 ZnCl₂ 투여량의 혈장 농도(ng/mL)	(Aib⁸ ^,35)hGLP-1(7-36)NH₂ 아세테이트 및 ZnCl₂ 투여량의 혈장 농도(ng/mL)
T_max, h	1	0.5	0.25
C_max, ng/ml	11.8	13.8	32.2
AUC ng-hr/ml	204	514	394

결과, GLP-1 유사체의 염 형태는 특히 2가 금속 염과 조합한 형태는, 초기 혈장 농도가 감소된 수용가능한 장기 방출 제형을 제공하며, 이는 원하지 않는 부작용을 경감 또는 없앨 수 있다.

데이타는, 강산 염, 예컨대 GLP-1 유사체의 HCl 염은 초기 혈장 농도의 추가적인 감소를 나타낸다. 이론에 결부되지 않으며, GLP-1 유사체의 HCl 염의 초기 혈장 농도의 탁월한 감소는 생체내 중화 과정(neutralization process)과 관련있는 것으로 생각된다. 상기 pH 5.5의 조성물 (1)과 (2)에서, 산의 100%는 염화물 형태 이며, 유리 산은 없다. 따라서, 피하 주사 후, 체액은 용액을 보다 신속하게 중화하여 보다 빠르게 용액을 침전시킬 수 있다. 이러한 중화 시간 감소로 초기 혈장 농도 또는 스파이크는 보다 낮고 덜 명확하게 된다.

상기에서 인용한 공개물들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 대한 추가적인 예들은 전술한 바로부터 명확해질 것이며, 본원에 충분히 기술되어 있으며 하기 청구항으로 명시된 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

[Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂인 GLP-1 유사체를 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 비만, 식욕 과다, 불충분한 포만감, 및 대사성 장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물로서,

상기 약학 조성물은, 상기 GLP-1 유사체의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 유사체와 그의 염의 혼합물로써 제조되어, 상기 약학 조성물에서 유사체 염 : 펩타이드 유사체의 몰 비를 제공하되, 상기 몰 비는 상기 약학 조성물내 펩타이드의 용해도, pH, 및 생체내 방출 프로파일에 대한 방출 효과를 조절하도록 조정가능하며,

상기 약학 조성물은, 상기 조성물 내에서, 상기 GLP-1 대 2가 금속 및/또는 2가 금속 염의 몰 비가 5.4:1 내지 1.5:1의 범위에 있도록, 상기 2가 금속 및/또는 2가 금속 염을 더 포함하며,

상기 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂ 염 대 GLP-1 펩타이드 유사체의 몰 비가 0.5:1 내지 10:1이며, 상기 GLP-1 유사체가 72 이상 시간 동안 개체 내에서 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 2가 금속이 아연 또는 구리인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 CuAc₂, CuCl₂, ZnAc₂, 및/또는 ZnCl₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 금속 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂의 염이 유기산의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유기산이 아세트산, 트리플루오로아세트산, 락트산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 시트르산, 메탄설폰산, 및 톨루엔설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 산이 아세트산인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂의 염은 무기산의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 무기산이 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 및 인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 산이 염산인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염이 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂·HCl·Zn인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염이 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂·아세테이트·Zn인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염이 [Aib^8,35]hGLP-1(7-36)NH₂·HCl·구리인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.