JP2010523473A - Ｇｌｐ−１医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、グルカゴン様ペプチド−１のペプチド類似体、その医薬的に許容される塩に、哺乳動物を治療するためにそのような類似体を使用する方法に、及び前記類似体を含んでなる、そのために有用な医薬組成物に関する。

Description

本発明は、グルカゴン様ペプチド−１のペプチド類似体及び／又はその医薬的に許容される塩を含有する組成物、そのような組成物、医薬組成物を製造するための方法、及び哺乳動物を治療するためにそのような組成物を使用する方法における諸改善に関する。

グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１）は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され（Varndell, J. M., et al., J. Histochem Cytochem, 1985: 33: 1080-6）、食事に応答して循環系へ放出される。ＧＬＰ−１の血漿濃度は、絶食レベルのほぼ１５ピコモル／Ｌから食後ピークレベルの４０ピコモル／Ｌへ上昇する。血漿グルコース濃度における所与の上昇に対し、血漿インスリンの増加は、グルコースを経口で投与するとき、静脈内と比較してほぼ３倍高いことが証明されている（Kreymann, B., et al., Lancet 1987:2, 1300-4）。インクレチン（incretin）効果として知られる、このインスリン放出の食事性の亢進は、主として体液性であり、ＧＬＰ−１は、ヒトにおいて最も強力な生理学的インクレチンであると考えられている。この向インスリン効果に加えて、ＧＬＰ−１は、グルカゴン分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ（Wettergren A., et al., Dig Dis Sci 1993: 38: 665-73）、末梢のグルコース処理を高める場合がある（D'Alessio, D. A. et al., J. Clin Invest 1994: 93: 2293-6）。

１９９４年に、ＧＬＰ−１の単回皮下（ｓ／ｃ）投薬によってインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の患者の食後血糖値が完全に正常化され得るという観察に従って、ＧＬＰ−１の治療ポテンシャルが示唆された（Gutniak, M. K., et al., Diabetes Care 1994:17:1039-44）。この効果は、インスリン放出の増加とグルカゴン分泌の低下の両方により媒介されると考えられた。さらに、ＧＬＰ−１の静脈内注入は、ＮＩＤＤＭの患者において食後の胃空洞化を遅らせることが示された（Williams, B., et al., J. Clin Endo Metab 1996:81:327-32）。スルホニル尿素と異なり、ＧＬＰ−１の向インスリン作用は、血漿グルコース濃度に依存する（Holz, G. G. 4th, et al., Nature 1993: 361: 362-5）。従って、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ−１媒介性インスリン放出がないことにより、重篤な低血糖症に抗して保護される。こういった作用の組合せは、ＮＩＤＤＭを治療するために今日使用されている他の薬剤に優る独自の潜在的な療法上の利点をＧＬＰ−１に与える。

数多くの研究により、健常被検者へ与えるとき、ＧＬＰ−１は、インスリン及びグルカゴンの濃度だけでなく、血糖値にも強力に影響を及ぼし（Orskov, C. Diabetologia 35:701-711, 1992；「実験薬理学要覧、グルカゴンＩＩＩ（Glucagon III, Handbook of Experimental Pharmacology）」（Lefevbre PJ 監修、ベルリン、Springer Verlag, 1996）中、Holst, J. J., et al.,「糖尿病管理におけるＧＬＰ−１の潜在可能性（Potential of GLP-1 in diabetes management）」(311-326頁))、この効果がグルコース依存性である（Kreymann, B., et al., Lancet ii: 1300-1304, 1987; Weir, G. C., et al., Diabetes 38:338-342, 1989）ことが示されている。さらに、これは、糖尿病の患者にも有効であり(Gutniak, M., N. Engl J Med 226: 1316-1322, 1992; Nathan, D. M. et al., Diabetes Care 15: 270-276, 1992)、２型糖尿病被検者の血糖値を正常化し（Nauck, M. A., et al., Diagbetologia 36: 741-744, 1993）、１型患者の血糖コントロールを改善し（Creutzfeldt, W. O., et al., Diabetes Care 19: 580-586, 1996）、とりわけ、インスリン感受性を高める／インスリン抵抗性を抑えるその能力を実証している。ＧＬＰ−１とそのアゴニストは、インスリン非依存型糖尿病を発症するリスクのある被検者における使用（ＷＯ００／０７６１７を参照のこと）、並びに妊娠性糖尿病の治療（米国特許公開公報番号：２００４０１６６６７０）に提唱されてきた
上記に加えて、哺乳動物（例えば、ヒト）においてＧＬＰ−１とそのアゴニストが示唆されている数多くの臨床使用があり、限定なしに：学習を向上させること、神経保護を高めること、及び／又は中枢神経系の疾患又は障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神性の症候群）の症状を（例えば、神経組織発生の調節を介して）緩和すること（米国特許公開公報番号：２００５０００９７４２及び２００２０１１５６０５）；肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換すること（ＷＯ０３／０３３６９７）；β細胞の悪化を防ぐこと（米国特許公開公報番号：２００４００５３８１９及び２００３０２２０２５１）とβ細胞増殖の刺激（米国特許公開公報番号２００３０２２４９８３）；肥満を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４００１８９７５；ＷＯ９８／１９６９８）；食欲を抑制して満腹感を誘発すること（米国特許公開公報番号：２００３０２３２７５４）；過敏性腸症候群を治療すること（ＷＯ９９／６４０６０）；心筋梗塞（米国特許公開公報番号：２００４０１６２２４１、ＷＯ９８／０８５３１）及び卒中（ＷＯ００／１６７９７を参照のこと）に関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること；Ｑ波心筋梗塞の非存在を特徴とする急性冠症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０００２４５４）；術後の異化変化を弱めること（米国特許第６，００６，７５３号）；冬眠心筋又は糖尿病性心筋症を治療すること（米国特許公開公報番号：２００５００９６２７６）；ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制すること（米国特許公開公報番号：２００５００９６２７６）；尿ナトリウム排出を増加させること、尿カリウム濃度を減少させること（米国特許公開公報番号２００５００３７９５８）；有毒な血量増加症に関連した状態又は障害（例、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；変力応答を誘発して、心収縮を増加させること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；多房性卵巣症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２６６６７８及び２００４００２９７８４）；呼吸窮迫を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２３５７２６）；非消化管経路を介した、即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入を介した栄養摂取を改善すること（米国特許公開公報番号：２００４０２０９８１４）；腎障害を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２０９８０３）；左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４００９７４１１）；例えば、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群のような胃腸障害の治療又は予防のために、そして内視鏡手技の前投薬として十二指腸洞の運動を阻害すること（米国特許公開公報番号：２００３０２１６２９２）；救急重症多発性神経障害（ＣＩＰＮ）及び全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００３０１９９４４５）；トリグリセリドレベルを調節して、脂質異常症を治療すること（米国特許公開公報番号：２００３００３６５０４及び２００３０１４３１８３）；虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷を治療すること（米国特許公開公報番号：２００２０１４７１３１）；冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００２００４５６３６）、他が含まれる。

しかしながら、ＧＬＰ−１は、代謝的に不安定であり、in vivo では１〜２分の血漿半減期（ｔ_１／２）しか有さない。外因的に投与したＧＬＰ−１も、速やかに分解される（Deacon, C. F., et al., Diabetes 44: 1126-1131, 1995）。この代謝不安定性は、ネイティブＧＬＰ−１の治療ポテンシャルを制限する。ＧＬＰ−１とその類似体の治療ポテンシャルを製剤における改善を通して改善するために、いくつかの試みがなされてきた。例えば、国際特許公開公報番号ＷＯ０１／５７０８４は、結晶と医薬的に許容される担体を含んでなる、注射可能な医薬品のような医薬組成物の調製に有用であると言われるＧＬＰ−１類似体の結晶を生成する方法を記載する。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの不均質な微結晶性クラスターを生理食塩水溶液より成長させて、亜鉛及び／又はｍ−クレゾールでの結晶浸漬処理の後で試験した（Kim and Haren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)）。針状結晶と非結晶性の沈殿を含有するＧＬＰ（７−３６）ＮＨ_２の粗結晶懸濁液が亜鉛又はプロタミンを含有するリン酸溶液より調製された（Pridal, et. al., International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996))。ヨーロッパ特許公開公報番号ＥＰ０６１９３２２Ａ２は、塩類と低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある種の組合せを含むｐＨ７〜８．５の緩衝液において上記タンパク質の溶液を混合することによる、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの微結晶型の調製について記載する。米国特許第６，５６６，４９０号は、精製ペプチド生成物の生成に役立つと言われる、ＧＬＰ−１の種となる微結晶について特に記載する。米国特許第６，５５５，５２１（ＵＳ‘５２１）号は、改善された純度を有して、延長された in vivo 活性を明示すると言われる、正方晶系の平棒又は板状の形を有するＧＬＰ−１結晶を開示する。ＵＳ‘５２１号は、そのような結晶が相対的に均質であり、速やかに固まって、一緒に凝集又は密集し、シリンジ針を詰まらせ、予測不能な投薬を概して悪化させると言われた、先行の結晶性クラスターや無定形の結晶性懸濁液より長い時間帯の間、懸濁状態のままであることを教示する。

生物分解性トリブロック共重合体のポリ［（ｄｌ−ラクチド−コグリコリド）−β−エチレングリコール−β−（−ラクチド−コグリコリド）］がＧＬＰ−１の制御放出製剤における使用を示唆されたことがある。しかしながら、他のポリマー系と同じように、トリブロック共重合体の製造には、複雑なプロトコールと一貫性のない微粒子形成が伴う。

同様に、生物分解性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）も、ペプチドの持続送達製剤における使用を示唆されたことがある。しかしながら、このような生物分解性ポリマーの使用は、一般に、これらのポリマーが水にほとんど溶けず、水と混和不能の有機溶媒（例えば、塩化メチレン）及び／又は製造の間の厳しい調製条件を必要とするので、当該技術分野では好まれていない。そのような有機溶媒及び／又は厳しい調製条件は、目的のペプチド又はタンパク質のコンホメーション変化を誘発するリスクを高めて、構造の完全性の減少と生物学的活性の低下をもたらすとみなされている（Choi et al., Pharm. Research, Vol. 21, No. 5, (2004)）。ポロキサマーも同様に欠点があるとされた（同上）。

前述の参考文献に記載されたＧＬＰ−１組成物は、不純物を捕捉する傾向があり、及び／又は、他にも、再現可能的に製造して投与することが難しいので、ＧＬＰの医薬製剤を調製するのに理想的とは言えない。また、ＧＬＰ類似体は、上昇濃度で嘔吐を誘発することが知られているので、初期の血漿濃度が低下した持続的な医薬効果を提供することへのニーズがある（Ritzel et al., Diabetologia, 38: 720-725 (1995); Gutniak et al., Diabetes Care, 17(9): 1039-1044 (1994); Deacon et al., Diabetes, 44: 1126-1131 (1995)）。従って、より容易にかつ信頼可能的に製造されて、より容易かつ再現可能的に患者へ投与されて、そして望まれない副作用を抑制又は消失させるために、低下した初期血漿濃度を提供するＧＬＰ−１製剤へのニーズが存在する。

本発明は、特許請求項とともに、以下のパラグラフにおいて要約され得る。従って、本発明は、ＧＬＰ−１類似体を含んでなる医薬組成物を提供する。特に好ましいのは、式（Ｉ）：
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２ （Ｉ）
によるＧＬＰ−１類似体又はその医薬的に許容される塩であり、ここで前記組成物の製剤は、より優れた製造、投与、薬物動態、及び薬力学の特性だけでなく、弱められた負の副作用を提供する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、前記［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２が４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在していて、ＺｎＣｌ_２が０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、ｐＨ４を有する澄明なＺｎＣｌ_２水溶液からなるものではない。

本発明の１つの好ましい態様は、好ましくは初期バーストが抑制された、改善された薬物放出プロフィールを有する医薬組成物を提供する。

本発明はまた、延長された作用時間を有する、式（Ｉ）の化合物を含んでなる医薬組成物を提供する。

好ましい特徴において、本発明はまた、持続放出薬物プロフィールのために、in vivo の生理学的なｐＨで沈殿して、その場で沈殿物（deposit）を生成する医薬組成物を提供する。

本発明のさらなる態様は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩と医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでなる医薬組成物を提供する。好ましくは、前記担体又は希釈剤は、水を含む。

好ましい特徴において、本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドの塩で、又はペプチドとその塩の混合物で製造される化合物又はＧＬＰ−１ペプチド類似体を含んでなる医薬組成物を提供する。

好ましくは、前記医薬組成物中のＧＬＰ−１ペプチド類似体の塩は、酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、クエン酸、メタンスルホン酸、又はトルエンスルホン酸の塩のような、有機酸の医薬的に許容される塩、又は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、又はリン酸の塩のような、無機酸の医薬的に許容される塩のリストより選択される。塩酸のような強酸の医薬的に許容される塩が特に好ましい。強酸は、４．５未満のｐＫＡを有する酸として定義される。前記医薬組成物中の追加の好ましいペプチド塩は、酢酸又はトリフルオロ酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、又はクエン酸の塩のような有機酸の塩である。

１つの好ましい態様では、塩型ＧＬＰ−１類似体の非塩型ＧＬＰ−１類似体に対するモル比を調整することによって、医薬組成物の可溶性、ｐＨ、及び放出プロフィールを調節して、放出プロフィールを延長させて、ＧＬＰ−１類似体濃度の初期スパイクを抑えることができる。

好ましい態様において、医薬組成物は、該組成物の水溶性を低下させて、それにより放出プロフィールを延長させると同時に、血漿濃度における初期のバースト又はスパイクを抑えるために、二価金属をさらに含む。好ましい二価金属には、亜鉛と銅が含まれる。二価金属の塩型が特に好ましく、限定されないが、二価金属の塩化物及び酢酸塩（acetate）が含まれる。ＣｕＡｃ_２、ＣｕＣｌ_２、ＺｎＡｃ_２、及び／又はＺｎＣｌ_２が最も好ましい。好ましくは、前記医薬組成物中の二価金属及び／又は二価金属塩は、約０．０００５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。なおより好ましくは、前記医薬組成物中の二価金属及び／又は二価金属塩は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。より好ましくは、前記医薬組成物は希釈剤を含み、ここで前記希釈剤は、医薬的に許容される水溶液を含む。希釈剤は、滅菌水を含んでよい。

さらなる態様において、前記医薬組成物は、二価金属及び／又は二価金属塩をさらに含み、ここで前記医薬組成物における前記ＧＬＰ−１類似体の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、ほぼ６：１〜ほぼ１：１に及ぶ。好ましくは、前記比は、ほぼ５．５：１〜ほぼ１：１に及ぶ。より好ましくは、前記比は、ほぼ５．４：１〜ほぼ１．５：１に及ぶ。さらになおより好ましくは、前記比は、ほぼ５．４：１、４．０：１、又は１．５：１である。最も好ましくは、前記比は、ほぼ１．５：１である。本発明のこの側面において「ほぼ」が意味するのは、１．５：１±１０％の各標的値の比であるので、期待される比には、例えば、１．３５〜１．６５：０．８５〜１．１５を包含する比が含まれる。

好ましくは、前記医薬組成物は、水性の混合物、懸濁液、又は溶液を含み、ここで前記ＧＬＰ−１の前記類似体、式（Ｉ）の化合物、又はその塩は、ほぼ０．５％〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。より好ましくは、前記ＧＬＰ−１類似体及び／又はその塩の前記水性の混合物、懸濁液、又は溶液中の濃度は、ほぼ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、前記ＧＬＰ−１類似体及び／又はその塩の前記水溶液中の濃度は、ほぼ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１４％、１５％、１６％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２９％、又は３０％（ｗ／ｗ）である。なおより好ましくは、ＧＬＰ−１の前記類似体及び／又はその塩の前記水溶液中の濃度は、ほぼ１％、２％、３％、４％、５％、６％、９％、１０％、１１％、２２％、２３％、２４％、２５％、又は２６％（ｗ／ｗ）である。さらになおより好ましくは、ＧＬＰ−１の前記類似体及び／又はその塩の前記水溶液中の濃度は、ほぼ１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、２２％、２３％、２４％、２５％、又は２６％（ｗ／ｗ）である。なおより好ましくは、ＧＬＰ−１の前記類似体及び／又はその塩の前記水溶液中の濃度は、ほぼ１％、２％、５％、１０％、２３％、又は２５％（ｗ／ｗ）である。「ほぼ」は、以下のことを意味する：約０．５％〜約４％の濃度では、標的値の±０．５％が所望の範囲である（例えば、０．５％〜１．５％は、ほぼ１％である）；約５％以上の標的濃度では、標的値の２０％が所望の範囲である（例えば、８％〜１２％は、ほぼ１０％である）。

好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、ＧＬＰ−１の類似体又はその塩の医薬組成物中の濃度は、約１％（重量／容量）であり、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。より好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記医薬組成物中の濃度は、約２％（重量／容量）であり、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。なおより好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記医薬組成物中の濃度は、約１０％（重量／容量）であり、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。最も好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記医薬組成物中の濃度は、約２３％又は約２５％（重量／容量）であり、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。

好ましい態様において、ＧＬＰ−１の類似体、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の医薬組成物中の濃度は、約５％（重量／容量）であり、該ペプチドの二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、ほぼ５．４：１である。より好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記組成物中の濃度は、約５％（重量／容量）であり、前記比は、ほぼ４．０：１である。なおより好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記組成物中の濃度は、約１０％（重量／容量）であり、前記比は、ほぼ５．４：１である。なおさらに好ましくは、［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２又はその塩の前記組成物中の濃度は、約１０％（重量／容量）であり、前記比は、ほぼ４．０：１である。

好ましくは、前記二価金属及び／又は二価金属塩は、塩化亜鉛又は酢酸亜鉛として提供される。より好ましくは、前記酢酸亜鉛は、ＺｎＡｃ_２・２Ｈ_２Ｏとして提供される。

代わりの態様において、前記二価金属及び／又は二価金属塩は、塩化銅又は酢酸銅として提供される。

１つの態様において、前記医薬組成物のｐＨは、塩基を使用して上方へ調整される。より好ましくは、前記ｐＨ調整は、ＮａＯＨを使用してなされる。なおより好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは、０．９％ ＮａＣｌを使用してほぼ１／２の初期濃度へ希釈するとき、直接電位差定量法を使用してほぼ５．０〜５．５のｐＨ値が得られるように、ＮａＯＨで調整する。

本発明の好ましい態様は、医薬組成物を特徴とし、ここで該組成物は、ＧＬＰ−１のペプチド類似体又はその塩、例えば、式（Ｉ）による化合物又はその塩が、その必要な被検者、例えば、哺乳動物、好ましくはヒトの内部で、延長された時間帯の間放出されるように製剤化される。好ましくは、前記化合物の前記放出は、少なくとも１時間延長し、より好ましくは、少なくとも４、６、１２、又は２４時間延長する。なおより好ましくは、前記組成物は、式（Ｉ）による化合物が被検者の内部で少なくとも３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間の間放出されるように製剤化される。なおより好ましくは、前記組成物は、式（Ｉ）による化合物が被検者の内部で少なくともほぼ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間放出されるように製剤化される。なおより好ましくは、前記組成物は、式（Ｉ）による化合物が被検者の内部で少なくともほぼ２、３又は４週の間放出されるように製剤化される。なおより好ましくは、前記組成物は、式（Ｉ）による化合物が被検者の内部で少なくともほぼ１、１．５、２、又は３ヶ月、又はより長い間放出されるように製剤化される。

本発明の１つの側面において、ＧＬＰ−１ペプチド類似体の前記医薬組成物中の塩含量の調節は、ＧＬＰ−１ペプチド類似体の医薬組成物における可溶性及び安定性を改善して、さらに、初期バーストを減少させることによって、in vivo 放出プロフィールに改善を提供する。

語法「調節」は、本発明のこの側面において、塩型ＧＬＰ−１類似体の非塩型ＧＬＰ−１類似体に対するモル比を調整することによる、塩含量の調整を意味する。

なおより好ましくは、前記医薬組成物中のペプチド塩は、塩酸又は酢酸の塩、又は式（Ｉ）の前記ペプチドの塩化物又は酢酸塩である。前記医薬組成物において、酢酸塩又は塩化物は、酢酸塩又は塩化物の式（Ｉ）の前記化合物に対する最終モル比として、ほぼ０．５：１〜ほぼ１０：１の範囲で存在する。より好ましくは、前記比は、ほぼ０．８：１〜ほぼ９：１に及ぶ。なおより好ましくは、前記比は、ほぼ１：１〜ほぼ６：１である。最も好ましくは、前記比は、ほぼ３．０：１、特に３．２：１である。

本発明のこの側面において、酢酸塩又は塩化物のペプチドに対するモル比は、医薬組成物中のペプチドのモル比率に対する、医薬組成物中の酢酸塩（ＣＨ_３ＣＯＯ⁻）又は塩化物（Ｃｌ⁻）のモル比率を意味する。医薬組成物中３：１のモル比の例において、酢酸塩は、比率においてペプチドのモル含量の３倍である。これは、ある化合物の他の化合物に比較した化学量論比である。

語法「ほぼ」は、本発明のこの側面において、１．５：１±１０％の各標的値の比を意味するので、期待される比には、例えば、１．３５〜１．６５：０．８５〜１．１５にを包含する比が含まれる。

本発明の追加の好ましい側面において、医薬組成物のｐＨは、組成物の酢酸塩含量の調節によって調整される。好ましくは、前記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ３〜ｐＨ６である。より好ましくは、前記医薬組成物の前記ｐＨ範囲は、ｐＨ３．５〜５．５である。最も好ましくは、前記医薬組成物の前記ｐＨ範囲は、ｐＨ４．２〜ｐＨ４．６である。

好ましくは、医薬組成物を酸性化するために、酢酸塩含量は、酢酸を加えることによって増加させてよい。

１つの態様において、前記医薬組成物のｐＨは、低い酢酸塩か又は無の酢酸塩の含量を有するＧＬＰ−１の類似体のペプチド塩より始めて、酢酸塩含量の調節により高めてよい。

好ましい態様において、酢酸塩又は塩化物の含量の調節による、最終医薬組成物におけるｐＨの調整は、初期バーストを減少させることによって、ペプチド濃度、亜鉛濃度、化学安定性、物理安定性、及び in vivo 放出プロフィールのような変数の調節を可能にする。

本発明の１つの側面では、Ｚｎ又はＣｕ含量を固定して、酢酸塩含量を調節することによってｐＨを制御する。酢酸塩の含量を増加させると、可溶性や物理安定性の改善を示して、酢酸塩の含量を減少させると、ｐＨに対しては増加効果を、Ｃ_ｍａｘに対しては減少効果を示す。

好ましい態様において、前記医薬組成物は、水性の混合物、懸濁液、又は溶液を含む。

本発明はまた、ＧＬＰ−１アゴニスト効果を引き起こす方法を提供し、前記方法は、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２リガンドの受容体をＧＬＰ−１類似体又はその塩と直接的又は間接的に接触させることを含んでなる。

上述の方法において、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２リガンドの前記受容体は、動物被検者、好ましくは霊長動物、より好ましくはヒトに存在している。従って、この側面において、本発明は、その必要な被検者においてＧＬＰ−１受容体よりアゴニスト効果を引き起こす方法を提供し、該方法は、本発明の組成物を前記被検者へ投与する方法を含み、ここで前記組成物は、ＧＬＰ−１類似体又はその医薬的に許容される塩の有効量を含む。

上述の方法の好ましい側面において、前記被検者は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、肥満、食欲過多、満腹感の不足、及び代謝障害からなる群より選択される疾患又は状態に罹患しているか又はそれらを発症するリスクのあるヒトである。好ましくは、前記疾患は、Ｉ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病である。

上述の方法の別のより好ましい側面において、前記被検者は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、及び摂食の抑制が所望される障害、中枢神経系の疾患又は障害（例えば、神経組織発生の変調による、及び、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神系の症候群）、過敏性腸管症候群、心筋梗塞（例えば、それに関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること）、卒中、急性冠症候群（例えば、Ｑ波の非存在を特徴とする）心筋梗塞、術後の異化変化、冬眠心筋又は糖尿病性心筋症、不十分な尿ナトリウム排出、過度の尿カリウム濃度、有毒な血量増加症に関連した状態又は障害（例、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）、多房性卵巣症候群、呼吸窮迫、腎障害、左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群のような胃腸障害（即ち、十二指腸洞の運動の阻害による）、救急重症多発性神経障害（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、脂質異常症、虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷、及び冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているか又はそれらを発症するリスクのあるヒトである。

本発明の追加の側面において、本発明は、その必要な被検者において、肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換する、β細胞の悪化を防いでβ細胞増殖を刺激する、ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制する、変力応答を誘発して心収縮を増加させる、非消化管経路を介した（即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入経路を介した）栄養摂取を改善する、内視鏡手技を受ける被検者に前処置する、並びにトリグリセリドレベルを調節する方法を特徴とし、前記方法は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩の有効量を含んでなる本発明の製剤を前記被検者へ投与することを含んでなる。好ましくは、前記被検者は、哺乳動物、より好ましくは霊長動物、なおより好ましくはヒトである。

図１は、ほぼ１ｍｇの［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のイヌへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）を図示する。各例において、ペプチドは、ほぼ１％（重量／容量）ペプチドを含んでなり、ほぼ１．５のペプチド：Ｚｎモル比を有する水性の亜鉛組成物として投与した。黒四角印（filled squares）と白四角印（open squares）は、本明細書に記載のようにｐＨをＮａＯＨで調整した組成物を表し；黒三角印（filled triangles）は、ｐＨをＮａＯＨで調整しなかった組成物を表し；黒丸印（filled circles）は、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ⁻で緩衝化した組成物を表す。 図２は、ほぼ１５ｍｇの［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のイヌへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）を図示する。各例において、ペプチドは、ほぼ１０％（重量／容量）ペプチドを含んでなり、ほぼ１．５のペプチド：Ｚｎモル比を有する水性の亜鉛組成物として投与した。黒四角印と白四角印は、本明細書に記載のようにｐＨをＮａＯＨで調整した組成物を表し；黒三角印は、ｐＨをＮａＯＨで調整しなかった組成物を表し；黒丸印は、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ⁻で緩衝化した組成物を表す。 図３は、ほぼ１ｍｇの［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のイヌへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）を図示する。各例において、ペプチドは、以下のような半固体の水性亜鉛組成物として投与した：黒丸印（solid circle）：約５％（重量／容量）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ｐＨ調整せず；白丸印（open circle）：約１０％（重量／容量）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ｐＨ調整せず；白四角印：約１０％（重量／容量）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ＮａＯＨでｐＨ調整；黒四角印（solid square）：約１０％（重量／容量）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約４：１、ＮａＯＨでｐＨ調整。 図４は、本発明のある製剤を調製するのに有用な様々なデバイスの概略図を提供する。 図５は、ほぼ１ｍｇの［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のイヌへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）を図示する。このペプチドは、約２％のペプチド濃度と約１．５：１のペプチド：Ｚｎモル比を有する水性の亜鉛組成物として投与した。 図６は、ほぼ１５ｍｇの［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のイヌへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）を図示する。このペプチドは、約２５％のペプチド濃度と約４：１のペプチド：Ｚｎモル比を有する半固体の亜鉛組成物として投与した。 図７は、ほぼ１５ｍｇの［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のイヌへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）を図示する。このペプチドは、約２３％のペプチド濃度と約１．５：１のペプチド：Ｚｎモル比を有する半固体の亜鉛組成物として投与した。 図８は、０．３ｍｇ（１０％溶液の３μＬ）のＧＬＰ−１類似体ＨＣｌ塩試験製剤： （１）ＣｕＣｌ_２との（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ塩｛（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ＣｕＣｌ_２のモル比は、１．５：１である。ペプチド濃度は、水中１０％（３０ｍＭ）（ｗ／ｗ）であり、ほぼｐＨ５．５である｝； （２）ＺｎＣｌ_２との（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ塩｛（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ＺｎＣｌ_２のモル比は、１．５：１である。ペプチド濃度は、水中１０％（３０ｍＭ）（ｗ／ｗ）であり、ほぼｐＨ５．５である｝のラットへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）の全体経時変化を図示する。 図９は、０．３ｍｇ（１０％溶液の３μＬ）のＧＬＰ−１類似体酢酸塩試験製剤： ＺｎＣｌ_２との（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２酢酸塩｛（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ＺｎＣｌ_２のモル比は、１．５：１である。ペプチド濃度は、水中１０％（３０ｍＭ）（ｗ／ｗ）であり、ほぼｐＨ５．５である｝のラットへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）の全体経時変化を図示する。 図１０は、図８に示す試験製剤の０．３ｍｇ（１０％溶液の３μＬ）のラットへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）の初期経時変化を図示する。 図１１は、図９に示す試験製剤の０．３ｍｇ（１０％溶液の３μＬ）のラットへの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後に入手した血漿プロフィール（メジアン値）の初期経時変化を図示する。 図１２は、図８に示す３つの試験製剤の０．３ｍｇ（１０％溶液の３μＬ）の単回皮下（ｓ．ｃ．）投与後にラットの注射部位に残っている（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の推定百分率を図示する。

本発明のペプチド塩として利用する好ましいＧＬＰ−１ペプチドは、本明細書において、例えば、以下の形式：（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２によって示し、天然の配列より置換されたアミノ酸を第一の括弧のセットの間に置く（例えば、Ａｉｂ^８，３５は、ｈＧＬＰ−１中のＡｌａ^８とＧｌｙ^３５がＡｉｂに置換されていることを示す）。Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸の略語である。略語ＧＬＰ−１は、グルカゴン様ペプチド−１を意味し；ｈＧＬＰ−１は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１を意味する。第二の括弧のセットの間にある数字は、ペプチド中に存在するアミノ酸の番号を意味する（例えば、ｈＧＬＰ−１（７−３６）は、ヒトＧＬＰ−１のペプチド配列のアミノ酸７〜３６を意味する）。ｈＧＬＰ−１（７−３７）の配列は、Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Res,. 40, 1992, pp. 333-342 に収載されている。ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２中の表記：「ＮＨ_２」は、このペプチドのＣ末端がアミド化していることを示す。ｈＧＬＰ−１（７−３６）は、Ｃ末端が遊離酸であることを意味する。ｈＧＬＰ−１（７−３８）において、３７位と３８位の残基は、他に示さなければ、それぞれＧｌｙとＡｒｇである。

本発明に使用する特に好ましいＧＬＰ−１ペプチド類似体は、医薬的に許容される塩の形態である。そのような塩の例には、限定されないが、有機酸（例、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トリエンスルホン酸、又はパモ酸）、無機酸（例、塩酸、硫酸、又はリン酸）、及びポリマー酸（例、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ乳酸−グリコール酸の共重合体）とともに生成されるものが含まれる。本発明のペプチドの塩を作製する典型的な方法は当該技術分野でよく知られていて、塩交換の標準法によって達成することができる。従って、本発明のペプチドのＴＦＡ塩（このＴＦＡ塩は、ＴＦＡ含有緩衝溶液で溶出させる分取用ＨＰＬＣを使用することによるペプチドの精製より生じる）は、該ペプチドを少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液に溶かすことによって、酢酸塩のような別の塩へ変換することができる。生じる溶液を半分取用ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ，３００ＳＢ，Ｃ−８）へ適用する。このカラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）４ｍｌ／分の流速での線形勾配（３０分にわたり２０％〜１００％の溶液Ｂ）（溶液Ａは、０．２５Ｎ酢酸水溶液であり；溶液Ｂは、アセトニトリル／水（８０：２０）中０．２５Ｎ酢酸である）で溶出させる。該ペプチドを含有する分画を採取して、凍結乾燥させる。

当業者によく知られているように、ＧＬＰ−１の既知の使用と潜在的な使用は多様であり、多数ある（Todd, J. F., et al., Clinical Science, 1998, 95, pp. 325-329; 及び Todd, J. F. et al., European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, pp. 533-536 を参照のこと）。従って、アゴニスト効果を引き起こす目的のための本発明の化合物の投与は、ＧＬＰ−１それ自体と同じ効果及び使用を有し得る。これらのＧＬＰ−１の多様な使用は、以下のように要約し得る：Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、代謝障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、摂食の抑制が所望される障害、並びに、本明細書に考察する様々な他の状態及び障害の治療。従って、本発明には、その範囲内に、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含んでなる、本明細書に明示されるような医薬組成物が含まれる。

本発明の製剤における有効成分の投与量は、変動してよいが、有効成分の量は、好適な投与量が得られるようなものであることが必要である。選択される投与量は、所望の療法効果に、投与の経路に、そして治療の期間に依存して、通常は、担当医が決定するものである。一般に、本発明の活性に有効な投与量は、１ｘ１０^−７〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１ｘ１０^−４〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあり、これは、単回用量として投与しても、反復用量へ分割してもよい。

本発明の製剤は、好ましくは、非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、等）投与する。

本発明による非経口投与用の調製物には、所望の in vivo 放出プロフィールが達成されるのならば、無菌の水溶性剤又は非水溶液剤、懸濁液剤、ゲル剤、又は乳剤が含まれる。非水溶媒又は担体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油又はトウモロコシ油のような植物油、ゼラチン、及び、オレイン酸エチルのような注射可能の有機エステルである。そのような剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤のようなアジュバントも含有してよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターに通す濾過によって、滅菌剤を組成物へ取り込むことによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって滅菌してよい。それらはまた、滅菌水や他の無菌の注射可能な媒体に使用の直前に溶かすことができる無菌の固形組成物の形態で製造することができる。

ペプチドの合成
本発明を実施するのに有用なペプチドは、標準の固相ペプチド合成によって製造することができて、製造した。例えば、Stewart, J. M., et al.,「固相合成（Solid Phase Synthesis）」（ピアス・ケミカル社、第２版、1984年）を参照のこと。

以下の実施例は、本発明を有利に実施し得るペプチドを作製するのに使用し得て、使用した合成法について記載し、この合成法は、当業者によく知られている。当業者には他の方法も知られている。実施例は、例示の目的のために提供するのであって、本発明の範囲をいかなるやり方でも限定するものではない。

ＧＬＰ−１類似体のような前記ペプチドは、ペプチドの最終沈殿、凍結乾燥法、真空乾燥、又は当該技術分野で知られた他の乾燥法を含み得る、当業者に知られた異なる合成法で入手することができる。イオン交換クロマトグラフィー、緩衝液の浸透圧交換、及びダイフィルトレーション（difiltration）は、本発明において、異なる塩型の該ペプチドを精製又は選択するのに適した方法であり得る。

Ｂｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、及びＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）は、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。Ｂｏｃ−Ａｕｎ−ＯＨは、Ｂａｃｈｅｍ（ペンシルヴェニア州キング・オブ・プルシア）より購入した。Ｂｏｃ−Ａｖａ−ＯＨとＢｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州ウッドデール）より購入した。Ｂｏｃ−２ＮａＩ−ＯＨは、Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ社（オレゴン州オールバニー）より購入した。

本明細書に使用する他の略語の完全名は、以下の通りである：Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル、ＨＦはフッ化水素、Ｆｍはホルミル、Ｘａｎはキサンチル、Ｂｚｌはベンジル、Ｔｏｓはトシル、ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニル、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸塩、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミン、ＨＯＡｃは酢酸、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、２ＣｌＺは２−クロロベンジルオキシカルボニル、２ＢｒＺは２−ブロモベンジルオキシカルボニル、ＯｃＨｅｘはＯ−シクロヘキシル、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＨＯＢｔはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＰＡＭ樹脂は４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ＴｒｉｓはＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、そしてＢｉｓ−ＴｒｉｓはＢｉｓ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メタン（即ち、２−Ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）を表す。用語「ハロ」又は「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。

他に定義しなければ、本明細書に使用するすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。また、本明細書で言及される出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、いずれも参照により組み込まれる。

実施例１
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の詳細な合成手順は、その内容がその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許公開公報番号ＷＯ００／３４３３１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０９６６０）に提供されている。簡潔には、該化合物は、加速Ｂｏｃ化学固相ペプチド合成を行うように変更したアプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）モデル４３０Ａペプチド合成機で合成した。Schnolzer, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992) を参照のこと。０．９１ミリモル／ｇの置換がある４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ，カリフォルニア州ベルモント）を使用した。Ｂｏｃアミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ，カリフォルニア州トーランス；Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，カリフォルニア州ラホヤ）を以下の側鎖保護とともに使用した：Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、及びＢｏｃ−Ｔｒｐ（Ｆｍ）−ＯＨ。Ｂｏｃ基は、１００％ ＴＦＡ、２ｘ１分間の処理により外した。Ｂｏｃアミノ酸（２．５ミリモル）は、４ｍＬのＤＭＦ中のＨＢＴＵ（２．０ミリモル）及びＤＩＥＡ（１．０ｍＬ）で予め活性化して、ペプチド−樹脂ＴＦＡ塩の中和に先立つことなくカップリングさせた。カップリング時間は５分であったが、但し、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ残基と以下の残基：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）−ＯＨではカップリング時間が２時間であった。

ペプチド鎖の組立ての最後に、樹脂を２０％メルカプトエタノール／１０％ ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液で２ｘ３０分間処理して、Ｈｉｓ側鎖上のＤＮＰ基を外した。次いで、１００％ ＴＦＡで２ｘ２分間の処理によりＮ末端Ｂｏｃ基を外した。ＤＭＦ中１０％ ＤＩＥＡでのペプチド−樹脂の中和（１ｘ１分）の後で、１５％エタノールアミン／１５％水／７０％ ＤＭＦの溶液で２ｘ３０分間の処理によりＴｒｐの側鎖上のホルミル基を外した。このペプチド−樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄し、減圧で乾燥させた。１ｍＬのアニソール及びジチオスレイトール（２４ｍｇ）を含有する１０ｍＬのＨＦにおいてペプチド−樹脂を０℃で７５分間撹拌することによって、最終の切断を行った。窒素のフローによってＨＦを除去した。残渣をエーテル（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、４Ｎ ＨＯＡｃ（６ｘ１０ｍＬ）で抽出した。

水性抽出液中のペプチド混合物を、逆相ＶＹＤＡＣ（登録商標）Ｃ_１８カラム（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ，マサチューセッツ州サウスバラ）を使用する逆相分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。１０ｍｌ／分の流速の線形勾配（１０５分にわたり２０％〜５０％のＢ溶液）（Ａ溶液＝０．１％ ＴＦＡを含有する水；Ｂ溶液＝０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル）でカラムを溶出させた。分画を採取して、分析用ＨＰＬＣで確認した。純粋な生成物を含有する分画を合わせて、凍結乾燥させた。この化合物の合成の１例では、１３５ｍｇの白い固形物を入手した。純度は、分析用ＨＰＬＣ分析に基づけば９８．６％であった。エレクトロスプレー質量分光計（ＭＳ（ＥＳ））Ｓ分析により、分子量を３３３９．７で得た（３３３９．７の計算分子量と一致）。

実施例２
製剤化手順Ｉ
２．１ 材料、ストック溶液、計算
Ａ）材料：ＺｎＣｌ_２、ＮａＯＨペレット、及び塩酸（３５％）をＰａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ（スペイン、バルセロナ）より入手した。ＷＦＩ（注射／灌注用滅菌水）をＢ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（スペイン、バルセロナ）より入手した。

Ｂ）ストック溶液
（ｉ）ＺｎＣｌ _２ ，ｐＨ＝３：
１．撹拌しながら、３５％ ＨＣｌをＷＦＩへ加えて、ｐＨ＝３を達成する。

２．容量フラスコに、秤量した量のＺｎＣｌ_２を移す。撹拌しながら、ｐＨ＝３ ＨＣｌを加えて、ほぼ１〜４ｍｇ ＺｎＣｌ_２／ｍｌの最終濃度を達成する。

（ｉｉ）ＺｎＣｌ _２ ，ｐＨ＝２：
１．撹拌しながら、３５％ＨＣｌをＷＦＩへ加えて、ｐＨ＝２を達成する。

２．容量フラスコに、秤量した量のＺｎＣｌ_２を移す。撹拌しながら、ｐＨ＝２のＨＣｌを加えて、ほぼ４〜１２ｍｇ ＺｎＣｌ_２／ｍｌの最終濃度を達成する。

（ｉｉｉ）ＮａＯＨ，０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ：
１．容量フラスコに、秤量した量のＮａＯＨを移す。撹拌しながら、ＷＦＩを加えて、ほぼ０．１〜１０ｍｇ ＮａＯＨ／ｍｌの最終濃度を達成する。

（ｉｖ）凍結乾燥２０ｍｇアリコート（Ａｉｂ ^８，３５ ）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ ／バイアル：
１．酢酸及びＷＦＩの０．０４％（ｖ／ｖ）希釈液を調製する。

２．容量フラスコに、秤量した量の（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（酢酸塩）を移す。撹拌しながら、十分な０．０４％酢酸を加えて、最終濃度を２０ｍｇ（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ｍｌとする。０．４５ミクロンフィルターを使用する濾過滅菌に続いて、この溶液の１ｍｌアリコートを凍結乾燥バイアルへ移し、凍結乾燥させて、乾燥生成物を−２２℃で保存した。

（ｖ）凍結乾燥５０ｍｇアリコート（Ａｉｂ ^８，３５ ）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ ／バイアル：
１．酢酸及びＷＦＩの０．１％（ｖ／ｖ）希釈液を調製する。

２．容量フラスコに、秤量した量の（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（酢酸塩）を移す。撹拌しながら、十分な０．１％酢酸を加えて、最終濃度を５０ｍｇ（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ｍｌとする。濾過滅菌に続いて、この溶液の１ｍｌアリコートを凍結乾燥バイアルへ移して、凍結乾燥させた。

Ｃ）計算
（ｉ）組成物の全重量／賦形剤の量（Ｅ）を決定するには：
Ｅ＝（Ａｘ１００／Ｔ）−（Ａ／Ｐ）
ここで：
Ｅ＝賦形剤（ｍｇ）
Ａ＝純粋なペプチドの含量（ｍｇ）；
Ｔ＝組成物の標的濃度；例えば、標的が２％であるならば、２；及び
Ｐ＝純粋なペプチドの濃度（ｍｇペプチド／１００ｍｇ製剤）。

賦形剤の全量に関しては、１ｍｌ＝１ｇという前提を適用する。

（ｉｉ）組成物溶液の各ｍｌ又はｇへ加えるべきＺｎＣｌ_２の容量／重量（Ｗ）を決定するには：
ａ）ｐＨ調整をしない組成物では、Ｗ＝１００％ Ｅ；
ｂ）ペプチドが約１％又は約２％又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する液体製剤では、Ｗ＝８０％ Ｅ；
ｃ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル製剤では、Ｗ＝５０％ Ｅ；
ｄ）ペプチドが約２５％であり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル製剤では、Ｗ＝６６．６６％ Ｅ；
ｅ）ペプチドを凍結乾燥調製品より復元して、塩基を使用してｐＨを調整する製剤では、Ｗ＝９０％ Ｅ。

（ｉｉｉ）組成物溶液の各ｍｌ又はｇへ加えるべきＮａＯＨの容量／重量（Ｗ）を決定するには：
ａ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する製剤では、Ｗ＝２０％ Ｅ；
ｂ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル製剤では、Ｗ＝５０％ Ｅ；
ｃ）ペプチドが約２５％であり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル製剤では、Ｗ＝３３．３３％ Ｅ；
ｄ）ペプチドを凍結乾燥調製品より復元して、塩基を使用してｐＨを調整する製剤では、Ｗ＝１０％ Ｅ。

（ｉｖ）各組成物において使用すべきＺｎＣｌ_２の濃度（ｍｇ／ｍｌ又はｍｇ／ｇ）を決定するには：
［ＺｎＣｌ_２］＝（１３６．２９ｘＡ）／（Ｗｘ３３３９．７６ｘＲ）
ここで：
Ａ＝純粋なペプチドの含量（ｍｇ）；
Ｒ＝ペプチド／Ｚｎのモル比
ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％、又は約２３％までである製剤では、Ｒ＝１．５；
ペプチドが約２５％である製剤では、Ｒ＝４．０；及び、
Ｗ＝組成物溶液の各ｇ又はｍｌへ加えるべきＺｎＣｌ_２溶液の重量（ｇ）又は容量（ｍｌ）。

２．２ １〜１０％凍結乾燥ペプチド及びＺｎＣｌ _２ を含む、ｐＨ調整なしの組成物の調製
本明細書に使用するように、ある百分率のペプチドを含んでなる製剤は、組成物の全重量につきある重量のペプチドを含んでなる製剤について記載し、例えば、１％ペプチドは、１００ｇの全組成物につき１ｇのペプチドを含んでなる製剤について記載する。約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含んでなる製剤は、以下のように調製した。記載のように製造した（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の凍結乾燥試料を、１００％の全賦形剤量と［ペプチド：Ｚｎ］＝１．５：１でＺｎＣｌ_２ストック溶液（ｐＨ３）と徹底的に混合した。

Ａ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（上記の２．１Ｂ（ｉｖ）を参照のこと）を２ｍｌのＺｎＣｌ_２溶液（０．２７２ｍｇ／ｍｌ；上記の２．１Ｂ（ｉ）を参照のこと）と混合することによって１％組成物を調製する。

Ｂ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（上記の２．１Ｂ（ｉｖ）を参照のこと）を１ｍｌのＺｎＣｌ_２溶液（０．５４４ｍｇ／ｍｌ；上記の２．１Ｂ（ｉ）を参照のこと）と混合することによって２％組成物を調製する。

Ｃ）５０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（上記の２．１Ｂ（ｖ）を参照のこと）を０．４５ｍｌのＺｎＣｌ_２溶液（３．０２３ｍｇ／ｍｌ；上記の２．１Ｂ（ｉ）を参照のこと）と混合することによって１０％組成物を調製する。

凍結乾燥ペプチドと溶液をそのまま室温へ平衡化した。凍結乾燥ペプチドを含有するバイアルへ指定量のＺｎＣｌ_２溶液を注入して、１％又は２％ペプチド組成物では約２分間、１０％ペプチド組成物では約６０分間、又はすべての凍結乾燥ペプチドが完全に水和して溶液にペプチドの塊がなくなるまで、水和をそのまま進行させた。水和に続き、復元したペプチドをほぼ１分間振り混ぜる。

溶かしたペプチドの適正量を投薬のために取り出すことができて、例えば、上記のＡのように調製した１％ペプチド溶液の１００μｌは、１ｍｇ用量に相当し、上記のＢのように調製した２％ペプチド溶液の５０μｌは、１ｍｇ用量に相当し、上記のＣのように調製した１０％ペプチド溶液の１５０μｌは、１５ｍｇ用量に相当する、等。

本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチドとＺｎＣｌ_２の量を変動させて、下記に詳述する１％、２％、及び１０％組成物以外の組成物、並びに所望の投与量を達成することができよう。

２．３ １〜１０％凍結乾燥ペプチド及びＺｎＣｌ _２ を含む、ｐＨ調整有りの組成物の調製
約１％、又は約２％〜約１０％までのペプチドを含んでなる製剤は、以下のように調製した。記載のように製造した（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の凍結乾燥試料を全賦形剤量の９０％でＺｎＣｌ_２ストック溶液（ｐＨ３）と徹底的に混合した。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の所望のｐＨに達する。

Ａ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（上記の２．１Ｂ（ｉｖ）を参照のこと）を１．８ｍｌのＺｎＣｌ_２溶液（上記の２．１Ｂ（ｉ）を参照のこと）と混合することによって１％組成物を調製する。

Ｂ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（上記の２．１Ｂ（ｉｖ）を参照のこと）を０．９ｍｌのＺｎＣｌ_２溶液（上記の２．１Ｂ（ｉ）を参照のこと）と混合することによって２％組成物を調製する。

Ｃ）５０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（上記の２．１Ｂ（ｖ）を参照のこと）を０．４０ｍｌのＺｎＣｌ_２溶液（上記の２．１Ｂ（ｉ）を参照のこと）と混合することによって１０％組成物を調製する。

希釈ＮａＯＨ溶液の必要量（全賦形剤量の１０％）を上記の溶液へ加えて、標的濃度とｐＨを達成する。例えば：
１％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．２ｍｌを加え、
２％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．１ｍｌを加え、
１０％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．０５ｍｌを加える。

本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ_２の量を変動させて、下記に詳述する１％、２％、及び１０％組成物以外の組成物を達成することができよう。

２．４ １〜１０％ペプチド及びＺｎＣｌ _２ を含む、ｐＨ調整なしの液体組成物の調製
約１％、又は約２％〜約１０％までのペプチドを含んでなる液体製剤は、以下のように調製した。（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の試料を秤量し、ＺｎＣｌ_２ストック溶液（ｐＨ３）と混合して、１％、２％、１０％までのペプチドの標的濃度を達成した。混合に続き、組成物を濾過滅菌して、使用まで保存する。

２．５ １〜１０％ペプチド及びＺｎＣｌ _２ を含む、ｐＨ調整有りの液体組成物の調製
約１％、又は約２％〜約１０％までのペプチドを含んでなる液体製剤は、以下のように調製した。（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の試料を秤量し、（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の試料を秤量して、全賦形剤量の８０％でＺｎＣｌ_２ストック溶液（ｐＨ３）と徹底的に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ_２でもＺｎＡｃ_２・２Ｈ_２Ｏでもよい。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の所望のｐＨに達する。この方法を使用して、調製物：Ｃ５〜Ｃ１３を調製した。

本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ_２の量を変動させて、本明細書に記載する１％、２％、及び１０％以外の組成物を達成することができよう。

２．６ ２５％ペプチド及びＺｎＣｌ _２ を含む、ｐＨ調整なしの半固体／ゲル組成物の調製
約２５％のペプチドを含んでなる半固体又はゲルの製剤は、以下のように調製した。（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の試料を秤量して、全賦形剤量の６６．６６％でＺｎＣｌ_２ストック溶液（ｐＨ２）と徹底的に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ_２でもＺｎＡｃ_２・２Ｈ_２Ｏでもよい。この方法を使用して、調製物：Ｃ１及びＣ２を調製した。

より具体的には、この半固体又はゲル組成物は、「プッシュ−プル」混合法を使用して調製した：
ａ）所望量のペプチドを、特殊な双方向手動バルブ「ＨＶ」（内径＝０．５ｍｍ）をすでに取り付けた使い捨てシリンジ「Ｓ１」の筒へ秤量して、シリンジルアーホール（Luer hole）の内側に管構造（tubing）を入れた；
ｂ）シリンジプランジャーをステンレス鋼ロッド「ＳＲ」で締めた；
ｃ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を真空源へ連結して、「ＨＶ」を開いた。１０分後、ＨＶを閉じた；
ｄ）第二の使い捨てシリンジ「Ｓ２」の筒へ亜鉛溶液を正確に秤量した；
ｅ）次いで、「Ｓ２」を「ＨＶ」の開放部分へ連結した；
ｆ）「ＨＶ」を開いて、ペプチド粉末を含有する筒「Ｓ１」へ真空によって溶媒を引き入れた；
ｇ）「ＨＶ」を閉じて、溶媒シリンジ「Ｓ２」を外し、それにより「Ｓ１」中のペプチド粉末を水和させた；
ｈ）「ＳＲ」を外して、シリンジプランジャーをゆっくり解放した；
ｉ）「ＨＶ」を開けずにシリンジプランジャーを動かし（押して引く）、粉末の塊が溶媒に完全に浸るようにする；
ｊ）双方向ステンレスコネクタ「ＳＣ」（内径＝１．０ｍｍ）を、管構造がシリンジルアーホール（Luer hole）の内側に入ったシリンジ「Ｓ２」に入れて、そのプランジャーを先端まで押した；
ｋ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を開いて真空を抜いてから、「ＨＶ」を外した。シリンジプランジャーを動かして、シリンジ筒中の空気を最少化した；及び
ｌ）「Ｓ１」と「Ｓ２」を「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して「Ｓ１」から「Ｓ２」へ練り込んだ。

本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ_２の量を変動させて、本明細書に記載する２５％以外の組成物を達成することができよう。

２．７ ２５％ペプチド及びＺｎＣｌ _２ を含む、ｐＨ調整有りの半固体／ゲル組成物の調製
約２５％のペプチドを含んでなる半固体又はゲルの製剤は、以下のように調製した。（Ａｉｂ^８，３５）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の試料を秤量して、全賦形剤量の６６．６６％でＺｎＣｌ_２ストック溶液（ｐＨ２）と徹底的に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ_２でもＺｎＡｃ_２・２Ｈ_２Ｏでもよい。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の所望のｐＨに達する。この実施例では、該粉末へ加える液体の全量を亜鉛溶液とＮａＯＨ溶液の間で分割しなければならない。故に、亜鉛溶液の濃度を調整して、必要とされる亜鉛溶液の全量を、ペプチド粉末へ加える全液体量の５０％へ抑えた（工程ｄ）。ペプチド粉末へ加える全液体量の残る５０％は、下記に詳述するように、ＮａＯＨ溶液として加えた。この方法を使用して、調製物：Ｃ３及びＣ４を調製した。

このｐＨ調整した半固体又はゲル組成物は、「プッシュ−プル」混合法を使用して調製した：
ａ）所望量のペプチドを、特殊な双方向手動バルブ「ＨＶ」（内径＝０．５ｍｍ）をすでに取り付けた使い捨てシリンジ「Ｓ１」の筒へ秤量して、シリンジルアーホールの内側に管構造を入れた；
ｂ）シリンジプランジャーをステンレス鋼ロッド「ＳＲ」で締めた；
ｃ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を真空源へ連結して、「ＨＶ」を開いた。１０分後、ＨＶを閉じた；
ｄ）第二の使い捨てシリンジ「Ｓ２」の筒へ亜鉛溶液を正確に秤量した；
ｅ）次いで、「Ｓ２」を「ＨＶ」の開放部分へ連結した；
ｆ）「ＨＶ」を開いて、ペプチド粉末を含有する筒「Ｓ１」へ真空によって溶媒を引き入れた；
ｇ）「ＨＶ」を閉じて、溶媒シリンジ「Ｓ２」を外し、それにより「Ｓ１」中のペプチド粉末を水和させた；
ｈ）「ＳＲ」を外して、シリンジプランジャーをゆっくり解放した；
ｉ）「ＨＶ」を開けずにシリンジプランジャーを動かし（押して引く）、粉末の塊が溶媒に完全に浸るようにする；
ｊ）双方向ステンレスコネクタ「ＳＣ」（内径＝１．０ｍｍ）を、管構造がシリンジルアーホールの内側に入ったシリンジ「Ｓ２」に入れて、そのプランジャーを先端まで押した；
ｋ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を開いて真空を抜いてから、「ＨＶ」を外した。シリンジプランジャーを動かして、シリンジ筒中の空気を最少化した；
ｌ）「Ｓ１」と「Ｓ２」を「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して「Ｓ１」から「Ｓ２」へ練り込んだ；
ｍ）ホモジェナイゼーションの後で、混合した生成物のアリコートを取り出して、ペプチドの濃度を定量した；
ｎ）残る中間バルク生成物を正確に秤量して、所望のｐＨに達するために必要とされるＮａＯＨ溶液の量を計算した；
ｏ）第三の使い捨てシリンジ「Ｓ３」へＮａＯＨ溶液を正確に秤量した；及び
ｐ）シリンジプランジャーをゆっくり圧縮して、シリンジチャンバ中の空気を最少化した。両方のシリンジを「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して練り込んだ。

本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ_２の量を変動させて、本明細書に記載する２５％以外の組成物を達成することができよう。

表１

３．０ ＧＬＰ−１受容体アフィニティーの定量
本発明を実施するのに有用な化合物について、以下の手順を使用して、ＧＬＰ−１受容体へ結合するその能力を試験することができる。

細胞培養：
ＧＬＰ−１受容体を発現しているＲＩＮ ５Ｆラットインスリノーマ細胞（ＡＴＣＣ−＃ＣＲＬ−２０５８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，バージニア州マナッサス）を、１０％胎仔ウシ血清を含有するダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養して、５％ ＣＯ_２／９５％空気の加湿雰囲気中に約３７℃で維持した。

放射リガンド結合：
Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（ニューヨーク州ウェストベリー）（設定６、１５秒）での２０ｍｌの氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおけるＲＩＮ細胞のホモジェナイゼーションによって、放射リガンド結合試験用の膜を調製した。このホモジェネートを遠心分離（３９，０００ｇ／１０分）によって２回洗浄して、最終ペレットを、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１ｍｇ／ｍｌバシトラシン（シグマケミカル、ミズーリ州セントルイス）、及び０．１％ ＢＳＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁させた。アッセイのために、０．０５ｍｌの非標識競合試験ペプチドを含めて、及び含めずに、アリコート（０．４ｍｌ）を０．０５ｎＭ（^１２５Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）（約２２００Ｃｉ／ミリモル、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，マサチューセッツ州ボストン）とともにインキュベートした。１００分のインキュベーション（２５℃）の後で、０．５％ポリエチレンイミンに浸しておいたＧＦ／Ｃフィルター（Ｂｒａｎｄｅｌ，メリーランド州ゲイサースブルグ）を通す迅速濾過によって、結合した（^１２５Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）を遊離型より分離させた。次いで、このフィルターを、氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの５ｍｌアリコートで３回洗浄して、フィルター上に捕捉された結合放射活性をγ線スペクトロメトリー（Ｗａｌｌａｃ ＬＫＢ，メリーランド州ゲイサースブルグ）によって計数した。特異結合は、「結合した（^１２５Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）全量」−「１０００ｎＭ ＧＬＰ−１（７−３６）（Ｂａｃｈｅｍ，カリフォルニア州トーレンス）の存在下に結合した（^１２５Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）」として定義した。

４．ｐＨに対する溶解度の定量
４．１．リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）におけるｐＨに対する化合物溶解度の定量
本発明を実施するのに有利にも使用し得る化合物について、以下の手順を使用して試験して、ＰＢＳ中のその溶解度を異なるｐＨ及び温度で定量することができる。

１パケットの予混合粉末（シグマ、製品番号：Ｐ−３８１３）を１リットルの脱イオン水に溶かしてストックＰＢＳ緩衝化溶液を作製して、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨ７．４である１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水を得た。このストック溶液のｐＨをリン酸及び／又は水酸化ナトリウムで調整することによって、異なるｐＨ値のＰＢＳ緩衝液を作製した。

試験する化合物の２ｍｇ試料、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇをガラスバイアルへ秤量した。各バイアルへある一定のｐＨでＰＢＳ緩衝液の５０μｌアリコートを加えた。この溶液を激しく撹拌して、澄明になるまで、必要ならば音波処理した。試験する各ｐＨについて、２ｍｇの化合物を溶かすのに必要とした緩衝液の全量を記録して、溶解度を計算した。

室温（２０〜２５℃）で澄明であるペプチド溶液を冷蔵庫（４℃）に一晩入れてから、該ペプチドの４℃での溶解度を検査した。

４．２．生理食塩水におけるｐＨに対する化合物溶解度の定量
本発明を実施するのに有利にも使用し得る化合物について、以下の手順を使用して試験して、生理食塩水中のその溶解度を異なるｐＨ値及び温度で定量することができる。

９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによってストック生理食塩水溶液を調製する。このストック溶液のｐＨをＨＣｌ及び／又はＮａＯＨで調整することによって、異なるｐＨ値の生理食塩水溶液を作製する。

試験する化合物の２ｍｇ試料、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇをガラスバイアルへ秤量する。各バイアルへある一定のｐＨで生理食塩水溶液の５０μｌアリコートを加える。このバイアルを激しく撹拌して、澄明になるまで、必要ならば音波処理する。試験する各ｐＨについて、２ｍｇの化合物を溶かすのに必要とする緩衝液の全量を記録して、溶解度を計算する。

室温（２０〜２５℃）で澄明である溶液を冷蔵庫（４℃）に一晩入れてから、４℃での溶解度を検査する。

４．３．生理食塩水中の化合物溶解度のｐＨ７．０での定量
本発明を実施するのに有利にも使用し得る化合物について、以下の手順を使用して試験して、ｐＨ＝７を有する生理食塩水中のその溶解度を室温で定量することができる。

９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによって生理食塩水溶液を調製する。試験する化合物、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇ試料をガラスバイアルへ秤量して、生理食塩水の１ｍｌアリコートを、激しい撹拌と音波処理を伴って、澄明になるまで加える。２ｍｇのペプチドを溶かすのに必要とする生理食塩水の全量を記録して、室温での溶解度を計算する。

４．４．生理食塩水中の化合物溶解度の様々なｐＨでの定量
本発明を実施するのに有利にも使用し得る化合物について、以下の手順を使用して試験して、様々なｐＨ値を有する生理食塩水中のその溶解度を室温で定量することができる。

９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによってストック生理食塩水溶液を調製する。このストック生理食塩水溶液のアリコートをＨＣｌ及びＮａＯＨで処理することによって、様々なｐＨ値を有する生理食塩水溶液を入手する。

試験する化合物、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇ試料をガラスバイアルへ秤量する。生理食塩水緩衝液の５０μｌのアリコートをある一定のｐＨで加える。この溶液を、澄明になるまで激しく撹拌して音波処理する。２ｍｇのペプチドを溶かすのに使用する緩衝液の全量を記録して、溶解度を計算する。

５．亜鉛濃度に対する化合物の水溶解度の定量
本発明を実施するのに有利にも使用し得る化合物について、以下の手順を使用して試験して、ｐＨ７の水中のその溶解度を異なる亜鉛濃度で定量することができる。

ＺｎＣｌ_２を脱イオン水に１００ｍｇ／ｍｌの濃度へ溶かして、ＨＣｌを使用してｐＨを２．７へ調整することによって、ストック亜鉛溶液を調製した。このストック溶液の滴正な希釈液を作製することによって、様々なＺｎＣｌ_２濃度を有する溶液（「Ｚｎ試験溶液」）を調製した。

試験する化合物の１ｍｇ、例えば、実施例１の化合物の１ｍｇを２５０μｌの各Ｚｎ試験溶液に溶かして、４ｍｇ／ｍｌの化合物を有する溶液を得る。次いで、０．２Ｎ ＮａＯＨを使用してこの溶液のｐＨを調整すると、白い沈殿が生成するのを観察した。この沈殿溶液を遠心分離して、ＨＰＬＣを使用して母液について分析した。試験化合物のＵＶ吸収領域を測定して、試験化合物の母液中の濃度を較正曲線との比較により定量した。

本発明を実施するのに使用し得る化合物の代表例として、実施例１の化合物について前述のアッセイで試験して、以下の結果を入手した（水性、ｐＨ７．０、室温）：
表２

６．ＩＥＦゲルを使用する、等電点（ｐＩ）の決定
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＮｏｖｅｘ ＩＥＦ ｐＨ３−１０ゲルを使用して、ＧＬＰ−１ペプチド、例えば実施例１の化合物のｐＩを測定した。試験するペプチジル化合物を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度まで水に溶かした。それぞれのそのような化合物について、生じる溶液の５μｌを５μｌのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２Ｘ（２０ｍＭアルギニン遊離塩基、２０ｍＭリジン遊離塩基、及び１５％グリセロールを含む）と混合して、生じる１０μｌ試料溶液をタンパク標準試料とともにこのゲル上へロードした。

ランニング緩衝液もＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手して、製造業者の製品説明書に従って、概ね以下のようにゲルを泳動した：１００Ｖ一定１時間、続いて２００Ｖ一定１時間、続いて５００Ｖ一定３０分間。

次いで、このゲルを、３．５％スルホサリチル酸を含有する１２％ ＴＣＡ中に３０分間固定してから、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｋｉｔに見出される製品説明書に従ってコロイド状クマッシーブルーで２時間染色してから、水中で一晩脱染色した。

ゲルを走査して、プログラム：Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ １．２によって分析した。１０．７、９．５、８．３、８．０、７．８、７．４、６．９、６．０、５．３、５．２、４．５、４．２、及び３．５のｐＩ値を有する標準化合物のｐＩと比較して、未知ペプチドのｐＩを計算した。

実施例１の化合物の測定ｐＩは、７．６０であった。

７．ラットでの in vivo アッセイ
本発明の組成物について、以下のアッセイを使用して試験して、効果を in vivo で促進及び強化する能力を判定することができる。

７．１．実験手順：
実験の前日、ほぼ３００〜３５０ｇと秤量される成体雄性スプリーグ・ドーリーラット（Ｔａｃｏｎｉｃ，ニューヨーク州ジャーマンタウン）にクロロヒドレート麻酔下で右心房頚静脈カニューレを移植した。次いで、このラットを１８時間絶食させた後で、適正な試験組成物又は担体対照を時点０で注射した。ラットは、実験全体を通して絶食を続けた。

１００ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ_２の溶液のｐＨ２．７を有するＨＣｌ水溶液での希釈によって、０．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ_２溶液を調製した。この溶液の２５０μｌに式（Ｉ）の化合物（（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２）の１ｍｇを溶かして、該化合物の４ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎをｐＨ４で有する澄明な溶液を得た。

時点０で、（ａ）（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２）の直前の溶液又は担体対照のいずれかをラットに皮下（ｓｃ）注射した。両方の場合で注射量はごく少なく（４〜６μＬ）、被検者へ投与したＧＬＰ−１化合物の用量は、７５μｇ／ｋｇであった。ｓｃ注射後の適正な時間に、５００μｌの血液試料を静脈内（ｉｖ）カニューレより吸引して、ラットにｉｖグルコースチャレンジを与えて、亢進したインスリン分泌の存在を試験した。グルコースチャレンジの時間は、化合物注射後０．２５、１、６、１２、及び２４時間であった。最初の血液試料を吸引した後で、グルコース（１ｇ／ｋｇ）をｉｖ注射して、５００μｌヘパリン添加生理食塩水（１０Ｕ／ｍｌ）を流して洗浄した。その後、グルコース注射後２．５、５、１０、及び２０分で５００μｌの血液試料を吸引した。これらのいずれにも、カニューレを介した５００μｌヘパリン添加生理食塩水（１０Ｕ／ｍｌ）のｉｖ注射をすぐに続けた。血液試料は遠心分離させ、各試料より血漿を採取して、インスリン含量をアッセイするまで、その試料を−２０℃に保存した。ラットインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ニューハンプシャー州ウィンダム）を使用して、各試料中のインスリンの量を定量した。

７．１．１．結果：
グルコース注射によって誘導される、持続されたインスリン亢進活性が本実験の全２４時間にわたり観測された。

８．イヌでの in vivo アッセイ
活性化合物の in vivo 延長放出を促進する組成物の能力を当業者が定量することを可能にする、当該技術分野で知られたいくつかの in vivo アッセイがある。

８．１．１％ペプチド組成物：
例示すると、１％（ｗ／ｗ）の式（Ｉ）の化合物をＺｎＣｌ_２の緩衝化溶液に含んでなる（ペプチド：Ｚｎ比＝１．５：１．０）水性試験製剤を調製した。

全６頭のビーグル犬（４２〜７８月齢で、体重１４〜２１ｋｇ）を、水と１日１回の食餌（ほぼ４００ｇの乾燥標準食（ＳＡＦＥ １２５）への自由摂取で維持した。このイヌは、試験組成物の投与前１８時間絶食させた。

試験組成物は、皮下経路によって、肩甲骨間の領域付近で投与した。投与の容量（各動物につきほぼ２０マイクロリットル）は、０．３３〜１２ｍｍの０．３ｍｌテルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）シリンジ（ＢＳ＝３０Ｍ２９１３）によって作製した。このようにして、ほぼ０．２ｍｇペプチドの理論用量を達成した。

血液試料を周期的に、概ね投与後０、８、１５、３０、４５分と１、２、４、８、及び１２時間、並びに１、２、３、４、５、及び６日の時点で採取した。サンプリング後から遠心分離までの間、血液を速やかに冷却し、血漿をデカントして、アッセイまでは速やかに凍結させた。ペプチド血漿濃度の定量は、オフライン固相抽出の後で行って、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに共役したオンライン相抽出を続けて、入手したデータは、Ａｎａｌｙｓｔ ｖ１．２ソフトウェアによって管理した。

上記組成物は、活性ペプチドの少なくとも２日間の延長放出を示した。

８．２．１％（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ 溶液：
上記の８．１節の記載と実質的に同じ in vivo アッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された時間帯にわたり放出するその能力を検証した。以下の４種の組成物のそれぞれで、ペプチドの濃度は、約１％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、ほぼ１ｍｇであった。

溶液８．２．Ａ：（ｉ）９０％ ＺｎＣｌ_２（０．２９８ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）１０％ ＮａＯＨ（０．９７５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
溶液８．２．Ｂ：ＺｎＣｌ_２の溶液（０．２８６ｍｇ／ｍｌ）中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
溶液８．２．Ｃ：溶液８．２．Ｂに実質的に類似して、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ⁻を使用して緩衝化；
溶液８．２．Ｄ：溶液８．２．Ａに実質的に類似。

これらの組成物は、図１に図示するように、（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の延長放出をもたらした。

８．３．１％（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ 溶液：
上記の８．１節の記載と実質的に同じ in vivo アッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された時間帯にわたり放出するその能力を検証した。以下の組成物では、ペプチドの濃度は、約２％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、ほぼ１ｍｇであった。

溶液８．３．Ａ：（ｉ）８０％ ＺｎＣｌ_２（０．６９５ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）２０％ ＮａＯＨ（１．７５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
この組成物は、図５に図示するように、（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の延長放出をもたらした。

８．４．１０％ペプチド溶液：
上記の８．１節の記載と実質的に同じ in vivo アッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された時間帯にわたり放出するその能力を検証した。以下の４種の組成物のそれぞれで、ペプチドの濃度は、約１０％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、ほぼ１５ｍｇであった。

溶液８．４．Ａ：（ｉ）９０％ ＺｎＣｌ_２（３．３６７ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）１０％ ＮａＯＨ（５．０１ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
溶液８．４．Ｂ：ＺｎＣｌ_２の溶液（２．９９３ｍｇ／ｍｌ）中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
溶液８．４．Ｃ：溶液８．４．Ｂに実質的に類似して、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ⁻を使用して緩衝化；
溶液８．４．Ｄ：溶液８．４．Ａに実質的に類似。

これらの組成物は、図２に図示するように、（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の延長放出をもたらした。

８．５．半固体組成物：
上記の８．１節の記載と実質的に同じ in vivo アッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された時間帯にわたり放出するその能力を検証した。組成物８．５．Ａでは、ペプチドの濃度は約５％であり、一方、組成物８．５．Ｂ、８．４．Ｃ、及び８．５．Ｄでは、ペプチドの濃度は、約１０％（重量／重量）であった。ペプチドの亜鉛に対する比は、組成物８．５．Ａ、８．５．Ｂ、及び８．５．Ｃで約５．４：１であり、一方、組成物８．５．Ｄでは、その比は約４．０：１であった。４種の組成物すべてで、投与したペプチドの用量は、ほぼ１ｍｇであった。

組成物８．５．Ａ：ＷＦＩにＺｎＣｌ_２（０．４０ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固体組成物中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
組成物８．５．Ｂ：組成物８．５．Ａに実質的に類似、ここではＺｎＣｌ_２濃度を上方へ調整して、約５．４：１のペプチド：Ｚｎ比を維持した。

組成物８．５．Ｃ：（ｉ）５０％ ＺｎＣｌ_２（１．６９ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）５０％ ＮａＯＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固形物中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２；
組成物８．５．Ｄ：（ｉ）５０％ ＺｎＣｌ_２（２．２８ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）５０％ ＮａＯＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固形物中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２。

これらの組成物は、図３に図示するように、（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の延長放出をもたらした。

８．６．半固体組成物：
上記の８．１節の記載と実質的に同じ in vivo アッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された時間帯にわたり放出するその能力を検証した。この組成物は、５．２２ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ_２溶液をｐＨ＝２．０で使用して製剤化した。十分なペプチドを提供して、約４：１のペプチド対亜鉛比を有する２５％ペプチド半固体組成物を得た。この組成物のｐＨを、１０ｍｇ／ｍｌ ＮａＯＨを使用して本明細書に提供するように調整した。投与したペプチドの用量は、ほぼ１５ｍｇであった。

組成物８．６は、図６に図示するように、（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の延長放出をもたらした。

８．７．半固体組成物：
上記の８．１節の記載と実質的に同じ in vivo アッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された時間帯にわたり放出するその能力を検証した。この組成物は、８．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ_２溶液をｐＨ＝２．０で使用して製剤化した。十分なペプチドを提供して、約１．５：１のペプチド対亜鉛比を有する２３％ペプチド半固体組成物を得た。上記の２．６節に詳述した方法に従って、この組成物を製剤化した。投与したペプチドの用量は、ほぼ１５ｍｇ（組成物の約６５マイクロリットルに相当する）であった。

組成物８．６は、図７に図示するように、（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の延長放出をもたらした。

開示した製剤の様々な置換物（permutations）を用いたさらなるアッセイを同様に in vivo アッセイへ処して、本発明の組成物が式（Ｉ）の化合物に有用な医薬送達プラットフォームを提供することを確かめた。本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド、ＺｎＣｌ_２の量とｐＨを変動させて、本明細書に記載のような本発明の組成物を調製することができよう。

実施例９
１．１０％ペプチド溶液中の酢酸塩含量によるＰＫプロフィール調節
本実施例は、１０％（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２及び塩化亜鉛を含有する２種の即製組成物［（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２：Ｚｎ＝１．５：１］の１５ｍｇ／イヌの用量レベルでの単回皮下投与に続く、雄性ビーグル犬における（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の薬物動態試験を開示する。

この in vivo アッセイを行う方法は、パラグラフ８．１で開示したものと同じである。

本実施例は、医薬組成物中の酢酸塩含量によるＰＫプロフィール調節、従って、医薬組成物中の［酢酸塩／ペプチド］比のｐＨに対する影響を明らかにする。

このｐＨ調節は、酢酸塩含量の調節により制御されて、酢酸塩含量の減少は、ｐＨに対する増加効果を示す。

酢酸塩の変動はまた、Ｃ_ｍａｘに対する効果を示す。一般に、酢酸塩含量の減少は、Ｃ_ｍａｘ値を減少させる。

酢酸塩含量の増加は、可溶性と物理安定性の改善を示す。

選択した製剤によれば、酢酸塩／ペプチド比の調節による可溶性又は安定性に対する改善は、ペプチド／Ｚｎ比の例えばＣ_ｍａｘに対する調節によって補償される。このことは、安定性、可溶性、ｐＨ又はＣｍａｘを調整する３つの可能な変数のシステムとして見ることができる。

本実施例では、略語「ＳＤ」は、標準偏差を意味する。「ＡＵＣ」は、血漿濃度−時間曲線下のアルテミシニン（Artemisinin）面積を意味する。

略語「ＭＲＴ」の意味は、平均滞留時間（ＭＲＴ）であり、ピーク薬物濃度の時間であるｔｍａｘとＭＲＴを比較するバイオアベイラビリティ率を推定するための変数である。時点０より最終サンプリング時間までのデータを使用して、ＭＲＴを計算した。

表３には、異なる［酢酸塩／ペプチド］比を有する１０％ペプチド組成物バッチとビーグル犬における皮下投与の結果をまとめてある。血中薬物濃度のピーク値、（Ｃ_ｍａｘ）は、［３．７：１］の［酢酸塩／ペプチド］モル比では８．１０ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ＝１．８０ｎｇ／ｍｌ）であり、一方、より低い比［３．２：１］を有するバッチは、５．６５ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ＝２．６１ｎｇ／ｍｌ）のＣ_ｍａｘ値をもたらした。

表３

１０．ＧＬＰ−１ペプチド塩／二価金属製剤
１０．１．方法
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２ １ｍｇ／ｍＬ水の溶液とＰＢＳ溶液を調製して、ｐＨを７．０へ調整した。ＣａＣｌ_２、ＣｕＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、及びＺｎＣｌ_２の１０ｍｇ／ｍＬストック水溶液を調製した．ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、及びＺｎＣｌ_２溶液のｐＨは、７．０へ調整した。ＣｕＣｌ_２溶液のｐＨは、Ｃｕが析出したので、塩基性にすることができなかった。故に、ｐＨ４．４のＣｕＣｌ_２溶液を使用した。

２００μＬの（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（１ｍｇ／ｍＬ）溶液へ４μＬの金属イオン水溶液又はＰＢＳ溶液を加えて、２００μｇ／ｍＬの最終金属イオン濃度とした。生じる溶液を混合して、沈殿を検査した。沈殿が生成したならば、懸濁液を遠心分離させた。上清中の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２濃度をＨＰＬＣによって定量した。

１０．２．結果
表４．二価金属イオンの存在下での（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の溶解度

１０．３．（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ ／二価金属（ｐＨ５．５）澄明溶液製剤の薬物動態試験
以下の手順を使用することによって、（Ａｉｂ^８，３５））ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の３種の異なる製剤を調製した：
（１）ＣｕＣｌ_２を含む（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ塩
（２）ＺｎＣｌ_２を含む（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ塩
（３）ＺｎＣｌ_２を含む（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２酢酸塩
ＧＬＰ−１類似体のＴＦＡ塩（このＴＦＡ塩は、ＴＦＡ含有緩衝溶液で溶出させる分取用ＨＰＬＣを使用することによるペプチドの精製より生じる）は、該ペプチドを少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液に溶かすことによって、酢酸塩のような別の塩へ変換することができる。生じる溶液を半分取用ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ，３００ＳＢ，Ｃ−８）へ適用する。このカラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）４ｍｌ／分の流速の線形勾配（３０分にわたり２０％〜１００％の溶液Ｂ）（溶液Ａは、０．２５Ｎ酢酸水溶液であり；溶液Ｂは、アセトニトリル／水（８０：２０）中０．２５Ｎ酢酸である）で溶出させる。該ペプチドを含有する分画を採取して、凍結乾燥させる。

（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ塩は、凍結乾燥法によって製造した。２０ｍｇの（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２酢酸塩を４ｍＬの２０ｍＭ ＨＣｌ水溶液に溶かして、室温で１０分間インキュベートした。この試料を凍結させて、一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥をさらに２回実施して、最終生成物の塩化物含量を定量した。定量した塩化物含量は、５．３８％であった。

（１）ＣｕＣｌ _２ を含む（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ ・ＨＣｌ塩：
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ（５．３ｍｇ；ペプチド含量は９５％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＣｕＣｌ_２水溶液に溶かした。ｐＨをほぼ２μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ＣｕＣｌ_２のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、ほぼ５．５のｐＨであった。

（２）ＺｎＣｌ _２ を含む（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ ・ＨＣｌ塩：
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ（５．３ｍｇ；ペプチド含量は９５％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＺｎＣｌ_２水溶液に溶かした。ｐＨをほぼ２μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ＺｎＣｌ_２のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、ほぼ５．５のｐＨであった。

（３）ＺｎＣｌ _２ を含む（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ 酢酸塩：
（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２酢酸塩（５．５ｍｇ；ペプチド含量は９２％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＺｎＣｌ_２水溶液に溶かした。生じる溶液を一晩凍結乾燥させて、５０μＬの水に再び溶かした。ｐＨをほぼ１μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２／ＺｎＣｌ_２のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、ほぼ５．５のｐＨであった。

１０．４．投薬と血液試料採取
ラットに上記３種の（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２製剤を０．３ｍｇ／ラット（１０％溶液の３μＬ）で皮下に投薬した。５、１０、１５、３０分、１、２、４、８時間、及び１、２、３、４、７、１０日で血液試料を採取した。この血液より遠心分離により血漿を採取して、−８０℃で保存した。注射部位での組織も採取し、５ｘメタノール中でホモジェナイズして、−８０℃で保存した。

２匹のラットを５、１０、１５、３０分と１、２、４、８時間のデータ点のために使用した。１匹のラットを１、２、３、４、７、１０日のデータ点のために使用した。

１０．５．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ試料調製
血漿（２００μＬ）を１０μＬのギ酸で酸性化して、６００μＬのアセトニトリルで沈殿させた。遠心分離により上清を採取して、真空で濃縮乾固させた。残渣を１５０μＬの水中３０％アセトニトリルに溶かして、遠心分離させた。５０μＬの上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に注入した。

組織メタノール抽出物（１０μＬ）を１ｍＬの水中３０％アセトニトリルへ希釈して、５０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に注入した。

１０．６．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｔｕｒｂｏイオンスプレープローブを取り付けたＡＰＩ４０００質量分析計システムで行った。分子イオン検出のＭＲＭモードを６６８．９及び１３６．１のイオン対とともに使用した。

ＨＰＬＣ分離は、０．３０ｍＬ／分の流速で１０分のうちに１０％ Ｂ〜９０％ Ｂへ駆動されるＬｕｎａ Ｃ８（２） ２ｘ３０ｍｍ ３μカラムで実施した。緩衝液Ａは、水中１％ギ酸であり、緩衝液Ｂは、アセトニトリル中１％ギ酸である。ＬＯＱは、０．５ｎｇ／ｍＬであった。

１０．７．結果と要約
ペプチドの血漿濃度は、その標準較正プロットを用いて計算した。０．０６ｍｇ／ｍＬの（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（５ｍＬメタノール抽出物中０．３ｍｇ／ラット）を１００％として使用して、注射部位に残った百分率を計算した。

表５．（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ の血漿濃度

（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のＨＣｌ塩製剤の薬物動態プロフィールの全体経時変化プロットを図８に示す。（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２のＨＣｌ塩製剤の薬物動態プロフィールの初期経時変化プロットを図９に示す。（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の酢酸塩製剤の薬物動態プロフィールの全体経時変化プロットを図１０に示す。（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の酢酸塩製剤の薬物動態プロフィールの初期経時変化プロットを図１１に示す。

表６．注射部位に残った（Ａｉｂ ^８，３５ ）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ _２ の推定百分率

（Ａｉｂ^８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の注射部位での組織蓄積プロフィールを図１２にさらに示す。

表７．ＰＫ変数

この結果は、ＧＬＰ−１類似体の、特に二価金属塩と組み合わせた塩型が、初期血漿濃度が抑えられた（このことは、望まれない副作用を抑制又は消失させる可能性がある）許容される持続放出製剤を提供することを示す。

このデータは、ＧＬＰ−１類似体の強酸塩、例えば、ＨＣｌ塩が初期血漿濃度においてさらなる低下を示すことを示す。この理論に束縛されることなく、ＧＬＰ−１類似体のＨＣｌ塩の初期血漿濃度における優れた低下は、in vivo での中和プロセスに関連すると考えられている。上記の組成物（１）及び（２）では、ｐＨ５．５で酸の１００％が塩化物の形態であり、遊離酸はない。従って、皮下注射の後で、体液はこの溶液剤をより速やかに中和して、この溶液剤をより速やかに沈殿させることができる。中和時間におけるこれらの減少は、より少なく、より顕著でない初期血漿濃度又はスパイクをもたらす。

上記に引用した出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の開示より本発明の追加の態様が明らかであろう。それらは、本明細書に十分記載されて、以下の特許請求項において明示されるような本発明に含まれると企図される。

Claims (17)

1. ＧＬＰ−１の類似体を含んでなり、前記類似体の医薬的に許容される塩、又は前記類似体の塩と該類似体の混合物で調製される医薬組成物であって、それにより前記医薬組成物において類似体塩のペプチド類似体に対するモル比を提供し、ここでモル比は、前記医薬組成物中の該ペプチドの可溶性、ｐＨ、及び in vivo 放出プロフィールに対する放出効果を調節するように調整することができる、前記医薬組成物。
2. 前記ＧＬＰ−１類似体が［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 二価金属及び／又は二価金属塩をさらに含んでなる、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記選択される二価金属が亜鉛又は銅である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. ＣｕＡｃ_２、ＣｕＣｌ_２、ＺｎＡｃ_２、及び／又はＺｎＣｌ_２からなる群より選択される二価金属塩を含有する、請求項３に記載の医薬組成物。
6. ［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の前記塩が有機酸の医薬的に許容される塩である、請求項２又は５に記載の医薬組成物。
7. 前記有機酸が、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、クエン酸、メタンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記酸が酢酸である、請求項７に記載の医薬組成物。
9. ［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２の前記塩が無機酸の医薬的に許容される塩である、請求項２又は５に記載の医薬組成物。
10. 前記無機酸が、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記酸が塩酸である、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２塩のＧＬＰ−１ペプチド類似体に対するモル比の範囲がほぼ０．５：１〜ほぼ１０：１である、請求項３に記載の医薬組成物。
13. 請求項３に記載の医薬組成物であって、ここで前記医薬組成物における前記［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２塩の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、ほぼ６：１〜ほぼ１：１に及ぶ、前記医薬組成物。
14. 請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物における前記［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２塩の前記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、ほぼ５．４：１〜ほぼ１．５：１に及ぶ、前記医薬組成物。
15. 前記医薬的に許容される塩が［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ・Ｚｎである、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記医薬的に許容される塩が［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・酢酸Ｚｎである、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 前記医薬的に許容される塩が［Ａｉｂ^８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２・ＨＣｌ・銅である、請求項１４に記載の医薬組成物。

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