KR101390589B1

KR101390589B1 - 다이아민을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101390589B1
Application number: KR1020120057369A
Authority: KR
Inventors: 김재영; 박효은
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2014-04-30
Also published as: KR20130134096A

Abstract

본 발명은 다이아민(diamines)을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 에틸렌디아민, 트리메틸렌디아민, 퓨트레신, 카다베린 또는 헥사메틸렌다이아민을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다이아민을 포함하는 조성물은 인슐린의 분비 기능을 촉진하여 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

다이아민을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating diabetes comprising diamines}

본 발명은 다이아민(diamines)을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 에틸렌디아민, 트리메틸렌디아민, 퓨트레신, 카다베린 또는 헥사메틸렌다이아민을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

인체에 필요한 에너지의 대부분은 포도당을 이용해 만들어진다. 포도당이 체내로 흡수되면 혈당이 증가되고, 이로 인해 췌장에서 인슐린이 분비된다. 분비된 인슐린에 의해 포도당이 여러 조직으로 흡수되어 혈당을 낮추고, 일정한 수준을 유지한다. 이러한 인슐린은 체내 고혈당 상황에서 혈당 조절로 대사 항상성을 유지하는데 중요한 호르몬이다. 이런 인슐린 분비 세포의 이상이 생기거나 인슐린 작용에 이상이 생겨 혈당 조절이 제대로 이루어지지 않아 고혈당이 유지되며 나타나는 질병이 당뇨병이다.

당뇨병은 그 원인에 따라 크게 두 가지 유형으로 분류된다. 첫째는 인슐린 의존적인 제 1형 당뇨병(insulin dependent diabetes mellitus; IDDM)이며, 유전적인 요인이나 다양한 환경인자로 인해 자가면역 반응을 일으켜 특이적으로 췌도의 베타세포가 파괴되면서 인슐린 분비의 기능적인 손상으로 당뇨병이 된다. 두번째는 인슐린 비의존적인 제 2형 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus; NIDDM)이며, 인슐린 분비는 되지만 인슐린 작용에 문제가 있는 것으로 인슐린 저항성(insulin resistance)과 인슐린 분비의 결함으로 당뇨병이 된다.

현재 당뇨병 치료를 위해서는 제 1형 당뇨병에서 인슐린 주사법이나 췌도 세포 이식법을 이용하여 치료하고 있고, 제 2형 당뇨병에서는 인슐린 분비능 향상과 인슐린 저항성 개선에 효과 있는 치료제들이 개발되고 있다. 그 치료제들로 사용되는 물질로는 바이구아나이드(biguanides) 계열인 메트포민(metformin)은 인슐린 저항성을 개선시키고 간에서 포도당 생합성을 줄여주고, 따이아졸리딘다이온(thiazolidinedions) 계열의 피오글리타존(pioglitazone)과 로지글리타존(rosiglitazone)은 인슐린의 반응을 증강시키는 효과가 있다. 또한 인슐린 분비 촉진제로서 사용되는 썰폰요소제(sulfonylurea)는 췌장의 베타세포에 인슐린분비를 자극하여 혈당감소 효과를 나타내며 널리 사용되고 있다.

그러나 이런 치료제들에는 각각의 부작용이 있어 부작용이 없으며 혈당조절에 사용할 수 있는 약물에 대한 개발이 필요하다.

국내 출원번호 제1984-0003189호

본 발명은 인슐린 분비기능을 촉진하는 다이아민을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 다이아민(diamines) 즉, (ethylenediamine), 트리메틸렌디아민(trimethylenediamine), 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine) 또는 헥사메틸렌다이아민(hexamethylendiamine)을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료/개선용 약학 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 다이아민을 포함하는 조성물은 인슐린의 분비 기능을 촉진하여 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 각각의 다이아민을 0.1 μM 내지 100 μM의 농도로 24시간 동안 처리 시 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 마우스 췌도 세포주에 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민을 20분 동안 처리한 후 인슐린 분비량을 나타낸 것이다.
도 3은 도 2와 동일한 조건에서 퓨트레신과 카다베린을 20분 동안 처리한 후 인슐린 분비량을 나타낸 것이다.
도 4는 마우스 췌도 세포주에 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민을 24시간 전 처리하고 포도당 자극을 준 후 인슐린 분비량을 조사한 것이다.
도 5는 도 4와 동일한 조건에서 퓨트레신과 카다베린을 24시간 전 처리하고 포도당 자극을 준 후 인슐린 분비량을 조사한 것이다.
도 6은 각 다이아민을 16시간 처리 한 후 발현된 mRNA에 관한 것이다.
도 7(A)는 마우스 베타세포에 퓨트레신과 카다베린을 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도별 처리 후 16시간 후에 세포 내 MafA 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 7(B)는 대조군과 비교하여 퓨트레신과 카다베린 처리 군에서 MafA를 강하게 발현하는 세포들의 수에 관한 것이다.
도 8은 대조군과 에틸렌디아민 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것이다.
도 9는 대조군과 트리메틸렌디아민 처리 군으로 나누어 2mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것이다.
도 10은 대조군과 퓨트레신 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것이다.
도 11은 대조군과 카다베린 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것이다.
도 12는 당뇨 마우스에서 다이아민 처리가 혈당조절에 미치는 영향을 확인하기 위해 STZ(150 mg/kg)로 유도된 ICR 마우스를 대조군, 에틸렌디아민 처리군, 트리메틸렌디아민 처리군으로 나누고 2일 간격으로 각 다이아민을 복강투여로 3주간의 혈당 변화에 관한 것이다.

본 발명은 다이아민(diamines)을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 아민(amine)은 암모니아(NH₂)의 수소를 알킬기 또는 페닐기로 치환한 화합물을 총칭한다. 아미노기가 2개 이상인 화합물을 폴리아민이라 칭하고, 다이아민은 폴리아민의 한 분류이다. 아미노기를 2개 갖는 화합물을 다이아민이라 말한다. 특히 다이아민은 화학구조에 탄소가 2개부터 6개까지의 개수에 따라 5가지 아민이 있으며, 에틸렌디아민(ethylenediamine), 트리메틸렌디아민 (trimethylenediamine), 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 헥사메틸렌다이아민(hexamethylendiamine)이 존재한다. 각 5가지 디아민의 화학구조는 다음과 같다.

본 발명에서의 다이아민은 에틸렌디아민(ethylenediamine), 트리메틸렌디아민(trimethylenediamine), 퓨트레신(putrescine), 카다베린 (cadaverine) 또는 헥사메틸렌다이아민(hexamethylendiamine) 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 다이아민이 마우스의 췌장 베타세포에서 포도당 자극 여부와 상관없이 인슐린 분비기능을 촉진함을 알 수 있었으며, 또한, 인슐린 분비 촉진기능뿐만 아니라 전사인자의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.

본 발명의 조성물은 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 제1형 당뇨병의 치료에 사용되는 경우 췌도 세포이식법 이용시에 세포에 처리되거나 투여될 수 있으며, 다이아민은 인슐린 분비능을 향상시킬 수 있는바, 인슐린 작용에 문제가 있는 제2형 당뇨병을 치료할 수도 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 상기 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 조성물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 다이아민을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 유기산, 인산염, 항산화제, 유당 카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕 및 솔비톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 유기산은 이에 제한되는 것은 아니지만 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 또는 사과산일 수 있으며, 인산염은 이에 제한되는 것은 아니지만 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염 또는 폴리인산염(중합인산염)일 수 있으며, 항산화제는 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산 또는 피틴산 등의 천연 항산화제일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 에틸렌디아민(ethylenediamine), 트리메틸렌디아민 (trimethylenediamine), 퓨트레신(putrescine), 카다베린 (cadaverine) 및 헥사메틸렌다이아민(hexamethylendiamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물 이외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 일실시예에 따른 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 이에 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 20 중량부, 5 내지 20 중량부, 또는 5 내지 15중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

발명의 일실시예에 따르면, 상기 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니지만 고형, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태일 수 있다.

또한 상기 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 이에 제한되는 것은 아니지만 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 유가공품, 식육제품, 어육제품, 두부류 또는 묵류, 식용유지류, 면류, 다류, 음료류, 특수영양식품, 건강보조식품, 조미식품, 얼음, 인삼제품류, 김치절임식품, 건포류, 과일, 야채, 과일 또는 야채의 건조제품, 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스, 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등의 식품의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 에틸렌디아민(ethylenediamine), 트리메틸렌디아민 (trimethylenediamine), 퓨트레신(putrescine), 카다베린 (cadaverine) 및 헥사메틸렌다이아민(hexamethylendiamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 식품 조성물을 건강기능식품의 제조에 사용할 경우에는 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 또는 0.1 내지 10 중량%로 사용할 수 있으며, 음료의 제조에 사용할 경우에는 전체 음료 중량의 0.02 내지 10 중량%, 또는 0.3 내지 1 중량%로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 세포배양

마우스 췌도 세포주 MIN6를 분양 받아 실험에 사용하였다. DMEM (Welgene) 배지에 10% 열불활성화된 우태아혈청 (FBS, Lonza Walkersville, Inc.) 및 1% 항생제용액 (Gibco)을 첨가하여 배양하였다. 배양 조건은 37 ℃, 95 % 공기와 5 % CO₂ 상태로 유지하였으며, 실험에는 계대 (passage) 18 내지 23의 세포를 이용하였다.

< 실시예 2> 다이아민의 처리 및 안전성 확인

에틸렌디아민 dihydrochloride, 트리메틸렌디아민 (1,3-diaminopropane), 퓨트레신, 카다베린 모두 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, DW로 녹여 200 mM stock을 만든 후 -20℃에 보관하였다. 실험하기 직전 0.1 μM에서 100 μM까지 농도를 희석하여 사용하였다.

2-1: 마우스 췌도 세포주의 세포 생존율 조사

다이아민 농도에 따른 세포 생존율을 조사하기 위하여 MIN-6 베타 세포를 96 well plate에 well당 2.5x10⁴ 개로 분주하고 48 시간 배양하였다. 각 다이아민을 0.1 μM에서 100 μM까지 농도로 20분 또는 24시간 처리하였다. 각 농도별 세포 생존율은 EZ cytox 용액을 4시간 동안 처리한 후 ELISA reader(μ Quant, Bio-Tek instruments, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

농도별 처리 후 세포 생존율을 측정한 결과 유의적인 차이점은 없었으므로 세포에 독성이 없음을 알 수 있었다(도 1).

< 실시예 3> 다이아민 처리에 따른 인슐린 분비 증가 효과

다이아민 농도별 처리 시 10 μM 농도에서 20분 동안 처리 되었을 때 대조군의 인슐린 분비량보다 유의적으로 증가하였다. 구체적으로 마우스 췌도 세포주에 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민을 20분 동안 처리한 경우 2.8 mM(저농도) 포도당 조건에서 에틸렌디아민은 1 μM 부터 100 μM까지 대조군에 비해 최대 4.6배 증가하였고, 트리메틸렌디아민은 1, 50, 100 μM에서 최대 3배 유의적으로 증가하였다. 또한, 퓨트레신과 카다베린을 2.8 mM(저농도) 포도당 조건에서 20분 동안 처리하였을 때 퓨트레신은 10, 50, 100 μM에서 최대 2.5배 증가하였고, 카다베린도 동일한 농도에서 2.5배 유의적으로 증가하였다(도 2, 3참조).

또한, 마우스 췌도 세포주에 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민을 24시간 전 처리하고 포도당 자극을 준 후 인슐린 분비량을 조사하였다. 2.8 mM 포도당 조건에서 에틸렌디아민 의 경우 50 μM부터 100 μM까지 대조군과 비교하여 최대 2.8배 증가하였고, 트리메틸렌디아민은 10 μM부터 100 μM까지 농도에서 최대 3.6배 증가하였다. 16.8 mM 포도당 조건에서도 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민의 고농도 처리 시 인슐린 분비량이 증가되었고, 최대 약 4배까지 증가하였다(도 4).

상기와 동일한 조건에서 퓨트레신과 카다베린을 24시간 전 처리하고 포도당 자극을 준 후 인슐린 분비량을 조사하였다. 퓨트레신의 경우 2.8 mM 포도당 조건에서 1 μM부터 최대 5.6배까지 인슐린 분비량이 증가하였고, 카다베린은 10 μM부터 최대 3.9배까지 증가하였으며, 50 μM 농도에서 가장 높은 인슐린 분비량을 보였다. 반면 16.8 mM 포도당 조건에서는 퓨트레신은 약 4.4배, 카다베린은 약 2.8배로 2.8 mM 포도당 조건보다 낮은 인슐린 분비량을 보였으나 다이아민의 고농도 처리에서 증가 됨은 동일했다(도 5).

즉, 24시간 동안 다이아민 처리 시 에틸렌디아민을 제외한 모든 다이아민에서 포도당 자극에 의한 인슐린 분비량이 10 μM 농도 이상에서 대조군 보다 증가함을 확인하였다(도 4, 5). 24시간 동안 다이아민의 처리가 20분 동안 처리했을 때보다 인슐린 분비가 약 1.5배 높았으며, 대조군에 비해 인슐린 분비능이 최대 3.5배 ~ 5배 이상 높았다(도 2, 3, 4, 5).

3-1: . 마우스 췌도 세포주의 인슐린 분비 조사

MIN-6 베타 세포를 96 well plate에 well당 2.5 x 10⁴ 개로 분주하고 48 시간 배양하였다. 각 다이아민을 0.1 μM에서 100 μM까지 농도로 20분 또는 24시간 처리한 후 인슐린 분비량을 조사하였다. 20분 처리 군은 2.8 mM 포도당이 첨가된 KRBB 용액 (118.5 mmol/L NaCl, 2.54 mmol/L CaCl₂, 1.19 mmol/L NaHCO₃, 1.19 mmol/L MgSO₄, 10mmol/L 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 0.1% BSA(bovine serum albumin)으로 1시간 동안 전 배양을 수행한 후, 2.8 mM 포도당과 16.8 mM 포도당이 첨가된 KRBB 용액에 다이아민을 농도별로 각각 200 μL씩 처리하였다. 20분 동안 배양이 끝난 뒤, 각 상등 액을 모두 모았다. 24시간 처리 군은 새로운 일반 배양 배지에 다이아민을 농도별로 각각 200 μL씩 처리하였다. 24시간 배양이 끝난 후 2.8 mM 포도당이 첨가된 KRBB 용액으로 1시간 동안 전 배양을 수행한 후, 2.8 mM 포도당과 16.8 mM 포도당이 첨가된 KRBB 용액을 200 μL씩 처리하였다. 20분 동안 배양이 끝난 후 상등 액을 모두 모았다. 모아진 상등액은 mouse insulin ELISA kit를 이용하였고, ELISA reader (μ Qant, Bio-Tek instruments, Winooski, VT, USA)로 450 nm (Ref. 650nm)에서 흡광도를 측정하였다.

3-2: 인슐린 분비 관련 분자의 mRNA 발현 조사

MIN-6 베타세포에 각 다이아민을 상기 인슐린 분비 조사 시와 동일한 조건에서 각 다이아민의 최고 농도 50 μM 또는 100 μM 에서 처리한 세포에서 인슐린 분비를 촉진하는데 관여한다고 알려진 전사인자인 들의 발현을 조사하였다 (도 6). 처리된 췌도세포에서 RNA 분리 킷트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 RNA를 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM dithiothreitol, 0.5 mM spermidine, 20 U RNasin, 1 mM dNTP, 0.5 μg의 oligo dT, 및 10 U MMLV 역전사효소(Beamsbio)를 포함하는 반응용액과 혼합한 후 37 ℃에서 1시간 동안 역전사 하였다. 역전사해서 얻은 3 ㎍의 cDNA를 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1.75 mM MgCl₂, 0.4 mM dNTP, 0.06 pmole의 센스 및 안티센스 프라이머, 및 2.5 U Taq DNA 폴리머라제를 포함하는 반응용액과 혼합하였다. cDNA의 증폭은 Standard PCR Thermal Cycler(TaKaRa)를 사용하였으며, 94 ℃에서 5분간 변성시키고, 다시 94 ℃에서 30초 변성, 58 ℃에서 30초간 어닐링, 72 ℃에서 30초간 증폭하는 방식으로 28 내지 35 사이클을 반복하였다. PCR 산물은 TBE 완충용액에 담겨 진 2% 아가로스 겔에 도입해 전기영동 하였고, 전기영동 후 DNA 밴드를 UV transilluminator를 이용해 육안으로 확인하고 사진을 찍었다.

도 6 은 각 다이아민를 16시간 처리 한 후 발현된 mRNA를 보여준다. 특히 Nkx2.2와 MafA의 mRNA 발현이 증가함을 확인되었다. Nkx2.2 단백질은 베타세포 발달단계에 꼭 필요한 분자로써 결핍시 베타세포의 성숙이 제대로 이루어지지 않는다고 보고되었다. MafA는 인슐린을 분비하는 세포에서 발현되며, 인슐린 분비를 위한 기본적인 단백질로 알려져 있다. 다이아민에 의해 인슐린 분비 및 베타세포의 성숙에 관여하는 전사인자의 발현을 높임으로써 인슐린 분비량이 증가된 것을 설명할 수 있었다.

3-3: 인슐린 분비 관련 분자의 단백질 발현 조사

상기에서 확인한 전사 인자 중 인슐린 분비에 관여한다고 알려진 MafA의 단백질 발현을 조사하고자 면역형광염색법을 이용하였다. MIN-6 베타 세포를 8 well plate에 well당 3.5 x 10⁴개로 분주하고 48시간 동안 배양하였다. 퓨트레신과 카다베린을 각각 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도로 처리하고 16시간 동안 배양하였다. Intracellular immunofluorescent staining flow analysis kit (Imgenex, San Diego, CA, USA)의 200 μL의 고정용액을 넣고 10분간 배양하였다. 완충용액 (PBS)를 이용하여 세척하고, permeabilization 용액 200 μL를 넣고 3분간 배양하였다. Permeabilization 용액을 이용하여 anti-mouse MafA 일차 antibody를 세포에 처리한 후 실온, 암실에서 2시간 동안 배양한 후 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 다시 permeabilization 용액에 FITC 형광이 부착된 이차 안티바디를 세포에 처리한 후 4 ℃ 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 핵염색을 위하여 hoechst를 완충용액을 이용하여 섞고, 세포에 처리 한 후 5분 동안 배양하였다. 완충용액을 이용하여 3회 세척 후 Nikon Eclipse TE2000U 형광현미경을 사용하여 100배 배율에서 관찰하였다(도 7).

도 7 은 마우스 베타세포에 퓨트레신과 카다베린을 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도별 처리 후 16시간 후에 세포 내 MafA 단백질의 발현을 확인한 결과이다(A). 대조군과 비교하여 퓨트레신과 카다베린 처리 군에서 MafA를 강하게 발현하는 세포들의 수가 유의적으로 많음을 확인하였다(B).

< 실시예 4> 다이아민의 정상마우스에서 혈당강하 효능

4-1: 동물 실험

8-10 주령의 웅성 ICR 마우스를 ㈜오리엔트에서 구입하여 실험에 사용하였으며, 중량은 28 ~ 30g 의 마우스를 사용하였다. 마우스는 사료와 물을 무제한으로 급여하면서 실험 전 약 1주간 안정화 시킨 후 실험에 사용하였다. 사육실의 조명은 12시간씩 dark/light주기로 실시하였고, 온도는 23.5 ± 1.5℃, 습도는 60 ± 10%를 유지하였다.

4-2: 경구 당부하 검사 ( Oral glucose tolerance test )

8 ~ 10주령의 수컷 ICR 마우스를 14 ~ 16시간 절식시킨 후 대조군에는 3차 증류수를 복강 혹은 경구투여 하고 실험군은 각각의 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민은 2 mg/kg을 복강투여 하였고, 퓨트레신과 카다베린은 2 mg/kg을 경구투여 하였다. 다이아민을 투여 한 2시간 후에 꼬리정맥에서 채혈하여 0 시간 혈당 농도를 측정한 후 포도당 용액 (2 g/kg/10ml)을 경구 투여하였고 15, 30, 60, 120분에 꼬리정맥으로부터 채혈하여 SD CHECK GOLD Blood Glucose Testing System (SD diagnostic, Korea)를 사용하여 혈당을 측정하였다.

에틸렌디아민에선 대조군과 차이가 없었고(도 8), 트리메틸렌디아민 처리에선 포도당 투여 후 15분 혈당에서 대조군과 유의적인 차이를 보였으며, 30분까지 혈당감소 경향을 보였다(도 9).

보다 구체적으로, 도 8 은 대조군과 에틸렌디아민 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것으로, 대조 군과 처리 군 간의 차이는 없었다.

도 9 는 대조 군과 트리메틸렌디아민 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것으로, 포도당 투여 후 15분 혈당에서 대조군 혈당 340 mg/dl 를 보인반면 처리 군 혈당 255 mg/dl로 유의적으로 낮은 혈당을 보였다. 30분 혈당에서는 유의적인 차이는 없었으나 낮은 경향을 보였다.

퓨트레신과 카다베린에선 유의적인 차이는 보이지 않았으나 대체로 혈당이 낮은 경향을 보였다(도 10, 12).

도 10 은 대조군과 퓨트레신 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것으로, 유의적인 차이는 없었으나 처리 군 혈당이 낮은 경향을 보였다.

도 11 은 대조군과 카다베린 처리 군으로 나누어 2 mg/kg을 복강 투여 2시간 후에 경구 당부하 검사 후 혈당을 조사한 것으로, 유의적인 차이는 없었으나 처리 군 혈당이 낮은 경향을 보였다.

< 실시예 5> 다이아민의 당뇨마우스에서 혈당강하 효능

5.1: 당뇨 마우스 모델 제조

8 ~ 9주령의 수컷 ICR 마우스를 4 시간 절식시킨 후 citrate buffer에 녹인 STZ(streptozotocin, 150 mg/kg)을 복강 투여하였다. STZ를 투여 한 2일 후부터 공복 시 혈당을 측정하여 300 mg/㎗ 이상이고 2일 이상 지속 되는 마우스를 선별하여 실험에 사용하였다.

5.2: 당뇨 마우스 모델에 다이아민 처리

대조군과 실험군으로 나누어 다이아민의 처리 전 꼬리 정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하였다. 대조군은 증류수를 실험군은 에틸렌디아민과 트리메틸렌디아민을 각각 2 mg/kg의 농도로 복강 투여하였고, 2일 간격으로 투여하였다.

당뇨 마우스에서 다이아민 처리가 혈당조절에 미치는 영향을 확인하기 위해 STZ (150 mg/kg)로 유도된 ICR 마우스를 대조군, 에틸렌디아민 처리군, 트리메틸렌디아민 처리군으로 나누고 2일 간격으로 각 다이아민을 복강투여로 3주간의 혈당 변화를 확인하였다(도 12). 대조군은 3주간 고혈당(600 mg/㎗이상)을 유지하였으나 에틸렌디아민(523.83 ± 53.29 mg/㎗)과 트리메틸렌디아민(491.79 ± 32.1 mg/㎗) 처리군에서 8일 이후부터 대조군보다 낮은 혈당을 보였다.

Claims

당뇨병 예방 또는 치료용으로 에틸렌디아민, 트리메틸렌디아민, 퓨트레신 또는 카다베린을 포함하는 약학 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
당뇨병 예방 또는 치료용으로 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
당뇨병 예방 또는 개선용으로 에틸렌디아민, 트리메틸렌디아민, 퓨트레신 또는 카다베린을 포함하는 식품 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 식품 조성물.
삭제