KR20110101885A

KR20110101885A - 민들레 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110101885A
Application number: KR1020100021225A
Authority: KR
Inventors: 강일준; 김성문
Original assignee: 한림대학교 산학협력단; 강원도 양구군
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2011-09-16
Also published as: KR101193085B1

Abstract

본 발명은 당뇨 및/또는 당뇨합병증의 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 민들레 추출물에 유산균을 배양하여 얻은 민들레 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 당뇨 및/또는 당뇨합병증의 예방 및/또는 치료용 조성물이 제공된다.

Description

민들레 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for treating diabetes or diabete-induced complication containing an extract from Taraxacum platycarpum Dahlst}

본 발명은 민들레 (Taraxacum platycarpum Dahlst) 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 당뇨 및/또는 당뇨합병증의 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 현대인들의 생활수준의 향상과 인간수명의 증가로 인하여 건강에 대한 인식도가 증가함에 따라 급속도로 증가하고 있는 당뇨병은 전 세계적으로 주목 받고 있는 만성질환이다.

당뇨병은 대표적인 만성질환으로 포도당을 비롯한 여러 대사 장애로 망막, 신장 및 신경 등의 미세혈관 합병증과 중풍, 협심증, 심근경색증 및 말초 혈관 질환 등의 대혈관 합병증을 초래하며 사망률과 이환율을 증가시키며 삶의 질을 저하시키는 질환이다. 당뇨병은 췌장의 베타세포에서 생성되는 인슐린 호르몬 부족 또는 인슐린 저항성의 이상과 나아가 이러한 두 가지 모두의 결함으로 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사장애증후군이다. 이러한 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병 (IDDM; Type I) 과 인슐린 저항 및 인슐린 분비 손상에 의해 발생하는 인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM; Type II)으로 나눌 수 있다. 제I형과 제II형 당뇨병 모두에서 심장 질환, 장 질환, 안과 질환, 신경 질환, 뇌졸증 등과 같은 다양한 합병증이 발생하게 되는데 이는 장시간 동안 혈당과 인슐린 수준이 상승하여 만성신경질환과 심혈관질환이 발생하게 되고 단시간의 저혈당과 고혈당반응으로 급성 합병증을 야기시키게 되는 것이다.

최근 당뇨병의 치료방법이 발달됨에 따라 당뇨병 환자의 평균 수명이 연장 되고 급성대사성 합병증으로 인한 사망률이 급격하게 감소되고는 있지만 당뇨병성 만성 합병증의 발생이 증가함으로 인해 당뇨병 합병증은 당뇨병 치료 그 자체보다 더 큰 문제점으로 지적되고 있다. 당뇨병에 있어서 고혈당이 합병증을 유발시키는 기전으로 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs) 생성증가와 폴리올 경로(polyol pathway)의 활성화 및 미오이노시톨(myoinositol)의 결핍, Na+-K+ ATPase 활성도의 감소, 혈류 및 혈관 투과성의 증가에 의한 구조 및 기능의 변화 등이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 현재 당뇨합병증과 관련된 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 당뇨병 환자의 치료에 유의한 효과를 확실하게 입증하지 못하였거나 독성이 있어 활용되지 못하고 있으므로 보다 안전하고 우수한 효능을 지닌 새로운 천연약물의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 민들레 유산균 발효액이 항산화 효과와 더불어 당뇨 및 당뇨합병증 치료에 우수한 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 민들레 유산균 발효액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 당뇨 및/또는 당뇨합병증 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 민들레 유산균 발효액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 당뇨 및/또는 당뇨합병증 예방 및/또는 개선용 식품을 제공한다.

또 다른 예는 민들레 유산균 발효액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

민들레 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및/또는 당뇨합병증 예방 및/또는 치료용 조성물이 제공된다.

민들레의 일반명은 dandelion, 학명은 Taraxacum, 한방명은 포공영(浦公英, Taraxacum Herba)으로, 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본이다. 민들레는 뿌리, 잎, 꽃, 꽃줄기 등 식물체 모두를 약용할 수 있는 몇 안되는 약초로 알려져 왔으며 통상적으로 간, 담낭, 신장에 효능이 큰 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 민들레 (Taraxacum platycarpum Dahlst) 유산균 발효액을 사용하여 당뇨합병증 예방을 위한 단기검색방법으로 최종당화산물(advanced glycation endproducts)의 형성 억제와 알도오스 환원효소(aldose reductase) 억제 활성을 확인하고, 당뇨 치료와 관련있는 알파-글리코시데이즈 억제 활성을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 민들레는, 그 형태에 특별한 제한이 없으며, 민들레를 약 65 내지 약 100℃에서 1시간 추출한다. 상기 민들레는 그대로 사용되거나, 건조 및/또는 분쇄하여 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 민들레로부터 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

민들레 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 가압추출법, 환류추출법, 온침 추출법, 초음파 분쇄 추출법 등에 의할 수 있고, 바람직하게는 가압추출법에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기한 바와 같이 제조된 추출물은 이후 감압 여과과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 민들레는 통상적 방법으로 건조된 건조물과 통상적 방법으로 농축된 농축물을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 조성물의 당뇨 치료 활성은 α-글루코시데이즈(α-glucosidase) 활성 억제능을 통하여 입증하였다. α-글루코시데이즈(α-glucosidase)는 소장 상피세포의 brush-border membrane에 존재하는 효소로서 이당류나 다당류를 탄수화물이 소화 흡수되기 위한 상태인 단당류로 가수분해하는 역할을 한다. 당뇨병 환자의 식후 급격한 혈당 상승을 억제하는 α-글루코시데이즈 억제제 작용기전은 인슐린 분비를 통하지 않고 이당류 분해효소를 가역적으로 억제하여 장에서의 탄수화물 흡수를 지연시켜 식후 혈당을 감소시키고 인슐린 비의존성 당뇨병의 고혈당으로 인한 인슐린 분비 지연의 개선시킨다. 따라서, α-글루코시데이즈에 대한 저해능은 탄수화물 식이 후 혈당상승을 억제할 수 있어 항당뇨 활성 측정법으로 이용된다.

본 발명의 민들레 유산균 발효액은 α-글루코시데이즈에 대해서 기존의 혈당강하제로 사용되는 아카보오스(acarbose)보다 높은 억제 효과를 보임이 확인되었다 (실시예 1, 도 1 참조).

또한 본 발명에서는 민들레 유산균 발효액이 당뇨합병증 치료 효과를 제공한다. 당뇨합병증은 당뇨병으로 인한 고혈당과 단백질의 반응이 비가역적으로 진행되어 최종당화산물(Advanced glycation endproducts, AGEs) 이 생성되어 혈중이나 조직의 다른 단백질과 교차결합하여 유발시키는 여러 가지 합병증을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 민들레 추출물 및 민들레 유산균 발효액은 치료 효과를 갖는 당뇨합병증은 당뇨병성 혈관장애, 당뇨병성 신경장애 또는 당뇨병성 감염증 등일 수 있으며, 바람직하게는 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 혈관합병증 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장 또는 당뇨성 신증일 수 있다.

본 발명의 당뇨합병증 치료 활성은 최종당화산물(Advanced Glycation End-products, AGEs)의 형성 억제능 및 알도오스 환원효소(Aldose reductase) 억제능을 통하여 시험하였다.

최종당화산물은 비효소적 당화반응에 의해 당이 단백질과 결합하여 schiff base와 아마도리 산물(amadori product)을 거쳐서 생성된다. 그러나 만성적인 고혈당 상태에서는 아마도리 산물이 가역적으로 최종당화산물을 생성하는 비가역적인 반응으로 가속화되어 조직과 혈청 중에 대량 생성되어 축적된다. 따라서, 최종당화산물의 생성은 심각한 당뇨합병증을 일으키는 주요원인 중 하나로 된다.

제2형 당뇨병 환자의 혈액 내 최종당화산물의 농도와 심혈관계질환의 유무 및 중증도와 연관이 뚜렷하고 여러 동물 모델 연구에서도 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 만성적인 고혈당과 생체 단백질과의 비효소적 당화 반응에 의해 생성되는 최종당화산물은 당뇨합병증의 주요 원인중 하나이다. 당뇨합병증은 혈당이 정상적으로 회복되었음에도 불구하고 발병하는 경우가 많다. 최종당화산물은 고혈당의 농도에 비례하여 조직에 축적되는 단백질 당화산물로 특이한 흡광도 및 형광을 나타내고, 특히 단백질의 아미노기가 서로 cross-link 반응을 일으키는 성질을 가지고 있다. 최종당화산물은 한번 생성되면 혈당이 정상적으로 조절되어도 분해되지 않고 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시키며, atheroma성 동맥경화증, DNA의 돌연변이, 노화, 알츠하이머병, 당뇨합병증등에 관여한다고 알려져 있다.

기존에 최종 당화산물의 억제제로서 알려진 아미노구아니딘(aminogua- nidine)의 독성이 증가하는 것으로 나타남에 따라, 이를 대체할 수 있는 독성이 없는 안전한 천연물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명에 따른 민들레 유산균 발효액을 가지고 최종당화산물에 대한 억제 활성을 시험한 결과, 최종당화산물 생성 억제 효과를 갖는 것으로 나타났다 (실시예 2, 도 2 참조).

또한, 당뇨합병증의 유발기전 중 하나인 폴리올 경로(polyol pathway- y)의 증가는 세포손상을 일으키는 기전이다. 알도오스 환원효소(Aldose

reductase)는 폴리올 경로에서 글루코오스를 소르비톨에서 프룩토오스로 전환하는 과정에 관여하는 효소이다. 고혈당 상태가 되면 세포내 포도당 대사의 변화가 일어나는데, 과잉의 포도당이 세포내로 들어오면 알도오스 환원효소에 의해 소르비톨로 전환되며, 소르비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase)에 의해 프룩토오스(fructose)로 전환된다. 정상혈당 상태에서는 포도당에 대한 알도오스 환원효소의 Km값(70 mM)이 높아 세포 내 소르비톨 농도는 매우 낮다. 그러나 고혈당에 의해 세포 내 포도당 농도가 올라가면 세포 내 소르비톨 농도가 증가될 뿐만 아니라 소르비톨 탈수소효소의 반응속도가 느려 소르비톨이 세포내에 축적하게 된다. 결국 세포내에 축적된 소르비톨의 높은 삼투압으로 세포가 팽창하게 되고 세포가 손상을 입게 되며 결국 백내장, 당뇨성 신경증, 망막증 등의 합병증을 야기하게 된다.

따라서 본 발명에서는 부작용이 없으며 효과적으로 당뇨합병증을 예방할 수 있는 새로운 천연물을 개발하기 위하여, 민들레 유산규 발효액을 가지고 알도오스 환원효소 활성 억제능을 시험하였다. 그 결과 민들레 유산균 발효액이 알도오스 환원효소 활성 억제능을 갖는 것으로 나타났다 (실시예 3, 도 3 참조).

본 발명에 따른 민들레 유산균 발효액은 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 조성물의 항산화 효과를 시험하기 위하여 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) 소거효과를 시험하였다. (실시예 4, 도 4 참조).

본 발명의 조성물은 유효성분인 민들레 유산균 발효액 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 민들레 유산균 발효액 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위 또는 리코리시딘 100 중량부 당 100 내지 10,000,000 중량부 범위에서 추가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물 내의 상기 민들레 유산균 발효액 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50중량%인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.　　

상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.　 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 한 가지 이상의 부형제 및/또는 윤활제 등을 포함할 수 있다.　경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.　 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.　

상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.　 보다 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분을 기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 하는 것이 좋으나 이에 제한되는 것은 아니다.　투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.　 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.　 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여될 수 있다.　 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또 다른 예에서, 상기한 바와 같은 민들레 유산균 발효물을 포함하는 당뇨 및/또는 당뇨합병증의 예방 및/또는 개선용 식품이 제공된다. 본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 건강기능식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

상기 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품에 있어서, 상기 민들레 유산균 발효액의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 민들레 유산균 발효액을 포함하는 조성물은 당뇨 및/또는 당뇨합병증 치료 효과가 우수하면서도 독성과 부작용이 없는 천연물 유래의 조성물이므로, 당뇨 및/또는 당뇨합병증의 치료에 보다 안전하게 적용될 수 있다.

도 1은 민들레 물추출물 및 8가지 유산균 발효액의 α-glucosidase 억제활성을 보여주는 그래프이다. (Each bar represents the mean ± SD (n=3); A.C: Acarbose; Control:민들레 물추출물; L.A:민들레 물추출물 + Lactobacillus acidophilus(KACC12419) 발효액; L.B: 민들레 물추출물 + Lactobacillus brevis(KACC10553); L.C: 민들레 물추출물 + Lactobacillus casei(KACC12413); L.M: Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides(KACC12312); L.P: 민들레 물추출물 + Lactobacillus paracasei subsp . paracasei(KACC12361); L.R: 민들레 물추출물 + Lactobacillus rhamnosus(KACC11953); B.L: 민들레 물추출물 + Bifidobacterium longum(KACC20597); P.A: 민들레 물추출물 + Pediococcus acidilactici(KACC12312).
도 2는 민들레 물추출물 및 8가지 유산균 발효액의 최종당화산물(AGEs)의 생성억제 작용을 보여주는 그래프이다. (Each bar represents the mean ± SD (n=3); A.G: Aminoguanidine; Control:민들레 물추출물; L.A:민들레 물추출물 + Lactobacillus acidophilus(KACC12419) 발효액; L.B: 민들레 물추출물 + Lactobacillus brevis(KACC10553); L.C: 민들레 물추출물 + Lactobacillus casei(KACC12413); L.M: Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides(KACC12312); L.P: 민들레 물추출물 + Lactobacillus paracasei subsp . paracasei(KACC12361); L.R: 민들레 물추출물 + Lactobacillus rhamnosus(KACC11953); B.L: 민들레 물추출물 + Bifidobacterium longum(KACC20597); P.A: 민들레 물추출물 + Pediococcus acidilactici(KACC12312).
도 3은 민들레 물추출물 및 8가지 유산균 발효액의 알도오스 환원효소(Aldose reductase) 억제 효능을 보여주는 그래프이다. (Each bar represents the mean ± SD (n=3); Q: Quercetin; Control:민들레 물추출물; L.A:민들레 물추출물 + Lactobacillus acidophilus(KACC12419) 발효액; L.B: 민들레 물추출물 + Lactobacillus brevis(KACC10553); L.C: 민들레 물추출물 + Lactobacillus casei(KACC12413); L.M: Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides(KACC12312); L.P: 민들레 물추출물 + Lactobacillus paracasei subsp. paracasei(KACC12361); L.R: 민들레 물추출물 + Lactobacillus rhamnosus(KACC11953); B.L: 민들레 물추출물 + Bifidobacterium longum(KACC20597); P.A: 민들레 물추출물 + Pediococcus acidilactici(KACC12312).
도 4는 민들레 물추출물 및 8가지 유산균 발효액의 ABTS를 이용한 radical 소거능 측정 결과를 보여주는 그래프이다. (Each bar represents the mean ± SD (n=3); A.A: Ascorbic acid; Control:민들레 물추출물; L.A:민들레 물추출물 + Lactobacillus acidophilus(KACC12419) 발효액; L.B: 민들레 물추출물 + Lactobacillus brevis(KACC10553); L.C: 민들레 물추출물 + Lactobacillus casei(KACC12413); L.M: Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides(KACC12312); L.P: 민들레 물추출물 + Lactobacillus paracasei subsp. paracasei(KACC12361); L.R: 민들레 물추출물 + Lactobacillus rhamnosus(KACC11953); B.L: 민들레 물추출물 + Bifidobacterium longum(KACC20597); P.A: 민들레 물추출물 + Pediococcus acidilactici(KACC12312).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 대표적으로 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

재료준비

민들레는 강원도 양구군 약업사에서 구입하였으며, 민들레를 65 내지 100℃에서 추출하여 민들레 추출물로 사용하였다. ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), 메틸글리옥살(Methylglyoxal), 아미노구아니딘(Aminoguanidine), NADPH, DL-글리세르알데하이드(DL-glyceraldehyde), 퀘르세틴(Quercetin), NaN₃, 알파-글루코시데이즈(α-glucosidase), 4-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside), 및 NaCO₃은 Sigma(USA)로부터 구입하여 사용하였고, 그 외 분석에 사용된 모든 시약은 특급을 사용하였다.

Lactobacillus acidophilus(LA) KACC12419, Lactobacillus brevis(LB) KACC10553, Lactobacillus casei(LC) KACC12413, Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides(LM) KACC12312, Lactobacillus paracasei subsp . paracasei(LP) KACC12361, Lactobacillus rhamnosus(LR) KACC11953, Bifidobacterium longum(BL) KACC20597, Pediococcus acidilactici(PA) KACC12312를 한국농업미생물자원센터의 국가미생물은행(The National Microorganism Bank, http://kacc.rda.go.kr)에서 분양받아 사용하였다. 8가지의 유산균은 MRS broth 배지(Merck. Germany)에서 배양하였으며, master plate를 만들어 4℃에 보관하면서 실험 전에 활성화시켰다. 균을 MRS btoth 배지에 접종한 후, anaerobic jar에서 Gaspack system (Merck. Anaerocult�� Gaspack system, Germany)을 이용하여 밀봉하고 37℃ incubator에서 1~2일 동안 혐기성 배양하였다.

시료제조예 1. 민들레 유산균 발효액 제조

본 발명의 민들레 추출물은 건조된 민들레 무게 1000 g의 10배의 증류수를 가하고 수용액상에서 65~100℃에서 3시간 추출한 다음 이를 여과하여 추출액을 얻는다. 얻어진 민들레 추출액 10 mL에 각각의 유산균 10 μL를 접종 한 다음, anaerobic jar에 Gaspack system을 넣고 37℃ incubator에서 1~2일 동안 혐기성 배양하였다. 배양이 끝난 민들레 유산균 발효액은 원심분리 (3,500rpm, 15min) 한 후, 0.2 μm syringe filter로 여과하여 냉장보관하면서 시료로 사용하였다.

실시예 1. α- 글루코시데이즈 활성 억제능 시험

당뇨병환자의 식후 급격한 혈당 상승을 억제하는 α-글루코시데이즈 억제제 작용기전은 인슐린 분비를 통하지 않고 이당류 분해효소를 가역적으로 억제하여 장에서의 탄수화물 흡수를 지연시켜 식후 혈당을 감소시키고 인슐린 비의존성 당뇨병의 고혈당으로 인한 인슐린 분비 지연의 개선시킨다. 따라서, α-글루코시데이즈 억제 활성에 의하여 당뇨병 치료 활성을 시험할 수 있다.

본 실시예에서는 당류가 단당류로 분해되는 경로의 억제능을 알아볼 수 있는 에세이로 Watanabe 등의 방법(Watanabe H, Kobavashi A, Yamamoto T, Suzuki S, Hayashi H, Yamazaki N. 1990. Alterations of human erythrocyte membrane fluidity by oxygen-derived free radicals and calcium. Free Radic Biol Med. 8(6): 507-514)에 따라 α-글루코시데이즈 활성 억제능을 측정하여, α-글루코시데이즈에 대한 활성 억제능을 시험하였다.

본 실험에서 사용한 시료는 상기 시료제조예 1에서 얻어진 민들레 유산균 발효액을 사용하였다. PBS에 2 g/L BSA(bovine serum albumin), 0.2 g/L NaN₃를 용해시킨 다음, 2.1 Unit의 효모 α-글루코시데이즈(Sigma, USA) 0.024 g/L을 용해시켜 효소 용액을 만들고, 상기 효소용액 2 mL에 시료 400 μL를 첨가한 후, 1.2 mL를 취하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

25℃에서 10분간 water bath incubation하고 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(Sigma, USA)를 PBS에 0.55mM 농도로 용해하여 만든 기질용액 1 mL를 첨가하고 25℃에서 10분간 water bath incubation한 후, 반응 종결을 위해 증류수에 0.1M 농도로 용해하여 만든 반응 정지시약 NaCO₃ 1.6 mL를 첨가하고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로 증류수를 사용하였고 양성대조군으로 기존에 α-글루코시데이즈 억제제로 알려진 아카보오스(acarbose, Sigma, USA)를 상기와 같은 방법으로 사용하였다.

상기 얻어진 민들레 유산균 발효액을 α-글루코시데이즈에 대한 저해 활성 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 민들레 추출물에 8가지 유산균을 접종하여 배양된 발효액을 가지고 α-글루코시데이즈 저해 활성을 알아본 결과 2.5 μg/mL 농도에서 민들레 L.A 유산균 발효액이 75%로 민들레 물추출물(control)인 58%보다 높은 억제효과를 보였다. 이러한 억제율은 대조 물질인 아카보오스 50 μg/mL 농도에서 72% 억제율을 나타내는 것 보다 더 우수하다. 나머지 유산균 발효액은 발효하지 않은 민들레 물추출물과 유사한 억제효과를 나타내어 민들레 추출물에 L.A 유산균을 접종했을 때 당류가 단당류로 분해되는 경로의 억제능이 나타나는 것을 알 수 있다.

실시예 2. 최종당화산물(AGEs)의 억제 효과 시험

본 실시예에서는 당뇨합병증의 치료 효과를 시험하기 위하여, 메틸글리옥살을 이용한 24시간 단기 검색법으로 민들레 유산균 발효액을 최종당화산물(AGEs) 억제 효과를 Blank와 대조군을 기준으로 형광의 증가 정도를 측정하였다.

BSA(5mg/mL)와 메틸글리옥살(2mg/mL)에 시료 (상기 시료제조예 1에서 얻어진 민들레 유산균 발효액)를 넣고 50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)를 사용하여 총 부피를 5 mL로 맞추었다. 　37℃에서 24시간동안 반응시킨 후, spectrofluorometer (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 반응 전후의 시료의 형광의 발광 정도(Excitation: 355 nm, Emission: 460 nm)를 측정하였다. 흡광도의 억제율은 대조군의 발광도 증가값을 기준으로 시료의 발광도 증가값을 비교하여 계산하였다.

계산식

(억제율(%))={1-(S₁-S₀)/(C₁-C₀)}*100

(S₀: sample 0hr 발광도 반응값, S₁: sample 24hr 발광도 반응값, C₀: control 0hr 발광도 반응값, C₁: control 24hr 발광도 반응값)

(control: 약물을 넣지 않은 상태에서 BSA(5mg/mL)와 메틸글리옥살(2mg/mL)에 DMSO(dimethyl sulfoxide)만 넣은 상태)

또한, 최종당화산물에 억제효과가 있다고 알려진 양성대조군으로 아미노구아니딘 (aminoguanidine, Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA))을 사용하여 위와 같은 방법으로 발광도 억제율을 비교하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. Blank와 대조군을 기준으로 형광의 증가 정도를 측정한 결과, 8가지 유산균을 배양한 발효액 중 L.A가 22 μg/mL의 농도에서 81%로 발효액 중 가장 형광 억제가 높은 것으로 나타났고, B.L은 70%, L.C 65%순으로 억제율을 나타내었다.

실시예 3. 알도오스 환원효소( Aldose reductase ) 억제 효능 시험

당뇨성합병증 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 글루코오스 대사경로인 폴리올 경로의 촉매 효소인 알도오스 환원효소(aldose reductase) 활성에 대한 민들레 물추출물 및 민들레 유산균 발효액의 효과를 확인하였다. 알도오스 환원효소 억제제는 글루코오스를 소르비톨로 변환하는 알도오스 환원효소를 억제하는 효소 억제제이며 소르비톨의 생산을 저하시키는 것이 목적이다. 많은 연구에서 폴리올 대사 이상이 당뇨병성 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있으므로, 알도오스 환원효소 억제제는 당뇨병성 합병증의 치료제로서 유용할 수 있다.

이에, 본 실시예에서는 당뇨합병증 치료 효과를 입증하기 위하여, 민들레 물추출물 및 민들레 유산균 발효액의 알도오스 환원효소 활성 억제능을 시험하였다.

무게가 200g이 넘는 래트(Sprague-Dawly(SD) rats; 수컷, 12주령, 250~280g, 중앙실험동물센터]의 수정체(lens)를 적출하여 그 안의 수정체의 습중량에 따라 0.05M의 소듐 버퍼(pH 6.8)를 수정체 1개당 250 μL을 넣어 얼음 안에서 균질화시켰다. 이를 4℃, 7500rpm에서 30분간 원심분리(centrifuge UNION 55 R Hanil, Korea) 후, 그 상등액을 취하여 알도오스 환원효소 시험의 효소원으로 사용하였다.

알도오스 환원효소(Aldose reductase) 활성 억제능은 Haymanh와 Kinoshita가 사용한 방법을 변형하여 실험을 수행하였다(Hayman S, Kinoshita JH. 1965. Isolation and properties of lens aldose reductase. J. Biol. Chem. 240(2): 877-882). 0.05M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 530μL에 상기 준비한 효소원 160μL와 1.6mM NADPH(Applichem, Germany) 100μL, 시료 (시료제조예 1에서 얻어진 민들레 유산균 발효액) 10 μL를 넣어주고, 마지막으로 0.1M DL-글리세르알데하이드(DL-Glyceraldehyde, Sigma, USA) 100μL를 넣어주었다. 큐벳내부에서 4.4 분 동안 반응시켜 340nm에서 NADPH 흡광도의 감소율을 측정하였다. 큐벳내부에서 4.4분동안 반응시켜 0s와 280s의 흡광값으로 sample의 흡광도값을 계산하였다.

계산식 3={0s에서의 흡광도 값-280s에서의 흡광도값)/반응시킨 시간}

상기 계산식 3에서 얻어진 흡광도 값을 이용하여 아래의 계산식으로 억제율을 구하였다.

계산식 4={(control-sample)/(control-blank)}*100

(control: 약물을 넣지 않은 상태에서 효소와 기질을 넣은 것,

blank: 기질을 뺀 나머지를 모두 넣은 상태)

또한 알도오스 환원효소 억제효과가 있다고 알려진 대조 물질로 퀘르세틴 (Quercetin, Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA))을 사용하여 상기와 같은 방법으로 처리하여 흡광도의 감소율을 측정하여 시료제조예 1에서 제조된 시료들에서의 결과와 비교하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 민들레의 8가지 유산균 발효액에 대한 알도오스 환원효소 억제결과를 보여준다. 민들레 물추출물인 control은 1 μg/mL 농도에서 80%로 높은 결과를 나타내었으나 이를 8가지 유산균을 접종하여 배양한 결과 L.A가 94%로 더 높은 억제 효과를 보여주었다. 대조 물질인 퀘르세틴의 억제율은 91%로 나타나서, 민들레 L.A 유산균 발효액은 대조 물질과 유사한 수준의 억제활성을 나타내는 것으로 나타났다.

실시예 4. ABTS 를 이용한 radical 소거능 측정

총 항산화력의 측정은 ABTS?cation decolorization assay법에 따라 측정하였다. 최종농도를 7.4mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate로 혼합한 후 어두운 곳에서 24시간 방치 시켜 ABTS를 형성시키고 750nm에서 흡광도 값이 1.4~1.5가 되도록 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 290 μL에 민들레,유산균발효물을 10 μL씩 첨가한 후 10분 후에 750nm에서 흡광도를 측정하였고, 소거효과의 비교를 위한 positive control는 ascorbic acid를 사용하였다. 민들레 물추출물 및 8가지 유산균 발효액을 가지고 ABTS를 이용하여 radical 소거능을 측정하였다. ABTS를 potassium persulf와 반응시켜 활성 양이온인 ABTS+가 형성되면 추출물의 항산화력에 의해 ABTS+가 소거되어 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는 원리로 이를 흡광도 수치로 나타내어 항산화 활성을 알 수 있는 방법으로 알아본 결과 0.33 μg/mL 농도일 때 민들레 물추출물에서 70% 이상의 소거능력이 있어 항산화 효과가 있는 것으로 나타났으나 이를 유산균 배양하였을 시 양성대조군인 Ascorbic acid와 유사하게 우수한 항산화능을 갖는 것으로 나타났다.

통계처리

모든 자료의 통계분석은 SAS 통계 프로그램(SAS institute, 1987)을 이용하여 분석하였으며, 분석결과는 실험군당 평균과 표준오차로 나타냈다.　 처리군 간의 유의성은 Duncan’s multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

Claims

민들레를 물, C₃ 내지 C₅의 케톤, C₁ 내지 C₄의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 추출하여 얻어진 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물
제1항에 있어서,
상기 유산균 혼합액이 Lactobacillus acidophilus(KACC12419), Lactobacillus brevis(KACC10553), Lactobacillus casei(KACC12413), Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides(KACC12312), Lactobacillus paracasei subsp . paracasei(KACC12361), Lactobacillus rhamnosus(KACC11953), Bifidobacterium longum(KACC20597), Pediococcus acidilactici(KACC12312) 중 1종 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 민들레 추출물의 발효액 제조방법
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 당뇨합병증은 당뇨병성 혈관장애, 당뇨병성 신경장애 또는 당뇨병성 감염증인, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물
제3항에 있어서,
상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 혈관합병증인, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 식품