JP7425916B2 - アプラグルチドの製造、配合、及び投薬 - Google Patents

アプラグルチドの製造、配合、及び投薬 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０２０年６月９日に出願された米国仮出願第６３／０３６，５０７号、２０２０年９月３日に出願された米国仮出願第６３／０７４，１１９号、及び２０２１年３月５日に出願された米国仮出願第６３／１５７，０８３号の優先権及び利益を主張する。前述の特許出願の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願はＥＦＳ－Ｗｅｂによって提出されたＡＳＣＩＩフォーマットの配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年６月７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称「ＶＥＣＴ－００２＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」、サイズ約２ＫＢである。
本開示は、アプラグルチドの製造、配合、及び投薬に関する。
グルカゴン様ペプチド２（Glucagon-like peptide 2、ＧＬＰ－２）は、腸の腸内分泌
Ｌ細胞におけるプログルカゴンの翻訳後処理から放出される３３アミノ酸のペプチドである。
本発明者らは、腸の障害又は機能不全を治療するためにアプラグルチドを使用することを企図している。一実施形態では、本発明者らは、短腸症候群の治療を企図している。短腸症候群（short bowel syndrome）は、他の病因も存在するものの最も一般的には腸間膜虚血又は炎症性腸疾患（Inflammatory Bowel Disease、ＩＢＤ）による外科的切除の結果としての機能的腸長の極端な減少を特徴とする吸収不良状態である。腸不全を伴うＳＢＳ（SBS with intestinal failure、ＳＢＳ－ＩＦ）は、健康及び／又は成長を維持するた
めに静脈内補給が必要とされるような、多量栄養素及び／又は流体及び電解質の吸収に必要な最小値を下回る腸機能の低下として定義される。ＳＢＳ－ＩＦを有する患者では、中心静脈カテーテルを通して送達される非経口支援（parenteral support、ＰＳ）が、適切な流体、エネルギー、電解質、微量元素、ビタミン、及び栄養バランスを維持するために必要とされる。ＳＢＳ－ＩＦ患者には、大きなＰＳ容量を必要とするストーマ及び非結腸連続性（colon-in-continuity、ＣＩＣ）を有する患者から、より低いＰＳ容量を必要と
するＣＩＣを有する患者までの範囲がある。この範囲の結果として、ＰＳへの依存性の減少は、ＰＳ容量の減少、ＰＳの休止日数、又は経腸自律性の達成を含む、解剖学的構造に依存する種々の結果において実証され得る。外科的切除後、残りの腸は、腸適応と称されるプロセスを経て、それにより、その吸収能力が増加し、その減少した長さが補償される。腸適応のこのプロセスは、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）又は延長された半減期を有するより安定な類似体（例えば、テヅグルチド及びアプラグルチド）を投与することによって増強され得ることが実証されている。結腸の生理学的役割により、ＣＩＣの患者は、結腸が機能していない患者よりも体液バランスをうまく管理でき、ストーマ患者と比較してベースラインでの非経口支援量が少なくなる。ＰＳは、流体及び電解質を含有する任意の静脈内注入として定義され、非経口栄養（parenteral nutrition、ＰＮ）を含む場合もあれば、含まない場合もある。非経口栄養は、タンパク質、炭水化物、脂肪、ビタミン、及び／又は微量元素を含むＰＳとして定義される。良性疾患に起因する慢性腸不全を有する患者は、ＰＳで長期生存する可能性が高くなる。
ＧＬＰ－２は、粘膜上皮増殖の強力な刺激物質として同定されて以来、腸傷害の治療剤
として注目されている。短腸症候群を有する患者における予備試験では、流体及び栄養素の両方の腸吸収における改善が生じた。ＧＬＰ－２は小腸粘膜上皮の有意な増殖を誘導する。それはまた、腸通過を遅くする。しかし、天然に存在するＧＬＰ－２は、ペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ ＩＶ）によって急速に分解されるので、適切な薬物候補ではない。結果として、ＧＬＰ－２は、非常に短い半減期（ヒトにおいてｔ１／２＝１０分）及び急速なクリアランス（clearance、ＣＬ）を有する。
薬物動態学的特性が改善された、高収率で実質的に純粋なＧＬＰ－２アナログペプチドを生成する方法が必要とされている。更に、実質的に純粋な、例えば実質的に不純物を含まないＧＬＰ－２アナログペプチド組成物が必要とされている。本開示は、この必要性を満たすことを対象とする。
発明の概要
一態様では、高純度のＧＬＰ－２類似体の新規な合成が開示される。別の態様では、ＧＬＰ－２類似体の新規なナトリウム塩が開示される。この方法は、樹脂上で固相ペプチド合成（solid phase peptide synthesis、ＳＰＰＳ）を実施することと、合成されたＧＬ
Ｐ－２アナログペプチドを樹脂から切断することと、樹脂を、トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid、ＴＦＡ）、水、及びアニソールを含む溶液で処理することによってペプチドの側鎖を脱保護することと、逆相高速液体クロマトグラフィ（reversed-phase high performance liquid chromatography、ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して２回の精製を実施す
ることと、実質的に純粋なＧＬＰ－２アナログペプチドを含む精製されたペプチド粉末を凍結乾燥及びパッケージングすることと、を含み得る。一部の実施形態では、アプラグルチドは９５％以上の純度を有する。一部の実施形態では、アプラグルチドは９７％以上の純度を有する。
本開示の別の態様は、少なくとも９７％の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドに関する。一部の実施形態では、アプラグルチドなどのＧＬＰ－２アナログペプチドは、１％未満のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド不純物、及び／又は３％未満のアスパルチミド３アプラグルチド、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物、及び／又は１％未満の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物を含む。
本開示の別の態様は、少なくとも９７％の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドに関する。一部の実施形態では、アプラグルチドなどのＧＬＰ－２アナログペプチドは、１％以下のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド不純物、及び／又は３％以下のアスパルチミド３アプラグルチド、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物、及び／又は１％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物を含む。
本開示の別の態様は、少なくとも９７％の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドに関する。一部の実施形態では、アプラグルチドなどのＧＬＰ－２アナログペプチドは、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド及びアスパルチミド３アプラグルチド不純物の合計の１％未満、Ｄ－アスパルチミド３アプラグルチド不純物の１％未満、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド不純物の１％未満、Ｄｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物の１％未満、及び／又は［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物の１％未満を含む。
本開示の別の態様は、少なくとも９７％の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドに関する。一部の実施形態では、アプラグルチドなどのＧＬＰ－２アナログペプチドは、１％以下のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド及びアスパルチミド３アプラグルチド不純物、
１％以下のＤ－アスパルチミド３アプラグルチド不純物、１％以下のＡｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド不純物、１％以下のＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物、及び／又は１％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物を含む。
本発明者らは、以下のことを認識した。
ｉ）Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリングサイクル中のＦｍｏｃ保護アミノ酸、すなわちＦｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｍｂ－Ｇｌｙ－ＯＨによる置換は、カップリング効率を改善し、アスパルチミド形成を減少させる。
ｉｉ）Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリングサイクル中にカップリング添加剤としてＨＯＢｔの代わりにオキシマを使用すると、ペプチド酸化及び［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物形成が最小限に抑えられる。
ｉｉｉ）分取ＲＰ－ＨＰＬＣによるナトリウム塩変換中に、移動相組成物のためのアセトニトリル（acetonitrile、ＡＣＮ）の使用、ｐＨ調整ステップの導入、及び滴定ステップの除去を行うと、アプラグルチドのナトリウム塩変換及び精製アプラグルチドの質が改善される。別の態様では、アプラグルチドの新規な配合物及び塩が開示される。
一実施形態によれば、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチドは、以下の化学構造を有する。
別の態様では、有効量のアプラグルチドを、それを必要とする患者に投薬する新規な方法が開示される。一部の実施形態では、有効量は、１～１０ｍｇのアプラグルチド又はその薬学的に許容される塩を含む。好ましい実施形態では、アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩は、体重５０ｋｇ未満の患者に週１回２．５ｍｇで投薬される。別の好ましい実施形態では、アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩は、体重５０ｋｇ以上の患者に週１回５．０ｍｇで投薬される。一部の実施形態では、本方法は、アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩を静脈内投与することを含む。他の実施形態では、本方法は、アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩を皮下投与することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、化合物又はその薬学的に許容される塩を、１日２回～月２回、好ましくは週１回の頻度で投与することを含む。
１日１回未満、好ましくは週１回投薬することができる、アプラグルチドのようなより長い半減期を有するＧＬＰ－２類似体が必要とされている。
本開示の方法で使用され得る例示的なＧＬＰ－２アゴニスト（アプラグルチド）のペプチド配列及び構造を示す。図１に示す配列は、配列番号１～４に対応する。 アプラグルチドなどのＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する改善された方法（以下、プロセスＢと称する）を対象とする本開示の第１の態様におけるステップ１～２のフロー図の概略図である。 アプラグルチドなどのＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する改善された方法（以下、プロセスＢと称する）を対象とする本開示の第１の態様におけるステップ３～６のフロー図の概略図である。 アプラグルチドを含む医薬組成物の製造を対象とする本開示の製造プロセスのフローダイアグラムの概略図である。 本開示の試験設計の概略図である。 尿排出量（ｍＬ／日）におけるベースラインから治療終了までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。破線は平均を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 尿排出量（ｍＬ／日）のベースラインからの変化を示すグラフであり、調整平均（点）及び９５％ＣＩ（黒線）は、分析パートＡ＋Ｂからのものである。 尿中ナトリウム排泄（ｍｍｏｌ／日）におけるベースラインから治療終了までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。破線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 尿排出量におけるベースラインから最初の注射直後までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。破線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 尿中ナトリウム排泄におけるベースラインから１回目の治療の直後までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。破線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 プラセボ治療を受けた患者における流体複合効果の個々の変化及び平均変化を示すグラフである。液体複合効果は、尿産生の増加（２７～２９日目）、ＰＳ量の減少、及び自発的な経口輸液摂取の減少（２０～２２日目）の合計として定義される。 ５ｍｇのアプラグルチドを受けた患者における流体複合効果の個々の変化及び平均変化を示すグラフである。液体複合効果は、尿産生の増加（２７～２９日目）、ＰＳ量の減少、及び自発的な経口輸液摂取の減少（２０～２２日目）の合計として定義される。 １０ｍｇのアプラグルチドを受けた患者における流体複合効果の個々の変化及び平均変化を示すグラフである。液体複合効果は、尿産生の増加（２７～２９日目）、ＰＳ量の減少、及び自発的な経口輸液摂取の減少（２０～２２日目）の合計として定義される。 血漿中Ｌ－シトルリンの絶対濃度におけるベースラインから治療終了までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。破線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 臨床試験報告に関する統合基準（Consolidated Standards of Reporting Trials、ＣＯＮＳＯＲＴ）の概略図である。 臨床試験報告に関する統合基準（ＣＯＮＳＯＲＴ）の概略図である。 ベースラインから治療終了までの、湿重量食事摂取量、糞便排出、腸吸収、及び尿産生における個々の変化及び平均変化を示すグラフである。太線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。破線は、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 カリウム、ナトリウム、マグネシウム及びカルシウムの吸収におけるベースラインから治療終了時までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。太線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。破線は、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 エネルギー食事摂取、糞便排出、及び吸収における、ベースラインから治療終了までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。太線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。破線は、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 多量栄養素の吸収におけるベースラインから治療終了までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。太線は平均を示し、Ｂはベースラインを示し、Ｔは治療を示し、Δはベースラインからの平均変化（標準偏差）を示す。破線は、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者を示す。グレースケールの差は個々の患者を示す。 アプラグルチドの１回目の投薬後の時間（日）の関数としての血漿中シトルリン濃度（ｕｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ＳＤ＝標準偏差、ＳＣ＝皮下。データは算術平均（±ＳＤ）である。１、５又は１０ｍｇのアプラグルチドの毎週のＳＣ投与を、１、８、１５、２２、２９及び３６日目に計画した。 アプラグルチドの１回目の投薬後の時間（日）の関数としての血漿中シトルリン濃度（ｕｇ／ｍＬ）のベースラインからの変化についての対応する最小二乗（least square、ＬＳ）平均プロットを示すグラフである。ＣＩ＝信頼区間、ＳＣ＝皮下。データは、推定最小二乗平均（９５％ＣＩ）である。１、５又は１０ｍｇのアプラグルチドの毎週のＳＣ投与を、１、８、１５、２２、２９及び３６日目に計画した。 アプラグルチドの１回目の投薬後の時間（日）の関数としての血漿中アプラグルチド濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ＳＣ＝皮下、ＳＤ＝標準偏差。１、５又は１０ｍｇのアプラグルチドの毎週のＳＣ投与を、１、８、１５、２２、２９及び３６日目に計画した。定量限界未満の値（＜１ｎｇ／ｍＬ）を０に設定した。用量レベル当たりのデータは、線形スケール上の算術平均±ＳＤとして提示される。 アプラグルチドの１回目の投薬後の時間（日）の関数としての血漿中アプラグルチド濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ＳＣ＝皮下、ＳＤ＝標準偏差。１、５又は１０ｍｇのアプラグルチドの毎週のＳＣ投与を、１、８、１５、２２、２９及び３６日目に計画した。定量限界未満の値（＜１ｎｇ／ｍＬ）を０に設定した。用量レベル当たりのデータは、対数スケール上の算術平均±ＳＤとして提示される。 ６週目における用量レベルによる個々のアプラグルチドＣｍａｘ値及び対応するシトルリンＲｍａｘ値（ｕｇ／ｍＬ）を示すグラフである。Ｃｍａｘアプラグルチド（ｎｇ／ｍＬ）、Ｃｍａｘ＝最大濃度、Ｒｍａｘ＝最大応答。回帰については、回帰直線、方程式、傾きのｐ値及びＲ二乗値が表示される。 ６週目における用量レベルによる個々のアプラグルチドＡＵＣｔａｕ値及び対応するシトルリンＲｍａｘ値（ｕｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ＡＵＣｔａｕ＝対応する投薬の治療期間の終了までの血漿濃度－時間曲線下の面積、Ｒｍａｘ＝最大応答。回帰については、回帰直線、方程式、傾きのｐ値及びＲ二乗値が表示される。 ６週目における用量レベルによる個々のアプラグルチドＡＵＣｔａｕ値及び対応するシトルリンＲｍａｘ値の相関プロットである。黒い点は、最後の投薬の前の評価を表し、線は、最後の投薬の２週間後までのその後の評価を結ぶ。 ６週目に１ｍｇを投薬された各対象についての全てのアプラグルチド濃度及び対応するシトルリン濃度の相関プロットである。黒い点は、最後の投薬の前の評価を表し、線は、最後の投薬の２週間後までのその後の評価を結ぶ。 ６週目に５ｍｇを投薬された各対象についての全てのアプラグルチド濃度及び対応するシトルリン濃度の相関プロットである。黒い点は、最後の投薬の前の評価を表し、線は、最後の投薬の２週間後までのその後の評価を結ぶ。 アプラグルチド２．５、５、又は１０ｍｇを毎週皮下投与された７０ｋｇの個体についての予測される血漿中アプラグルチド濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 ２．５、５又は１０ｍｇの皮下アプラグルチドを毎週投与された７０ｋｇの個体についての予測される血漿中シトルリン濃度（ｕｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 血漿中Ｌ－シトルリンの濃度におけるベースラインから治療後までの個々の変化及び平均変化を示すグラフである。ベースラインからの平均変化を、対応のあるｔ検定を使用して分析した。＊ｐ＜０．０５黒い実線は平均変化を表し、色付きの線は個々の患者を表す。点線＝ＳＢＳ－ＩＩ（腸機能不全）、実線＝ＳＢＳ－ＩＦ（腸不全）。Δは、ベースラインからの平均変化を示す。 アプラグルチドの３回の週１回投薬後のシトルリン血漿濃度（ｕｇ／ｍＬ）を示すグラフである。平均±標準誤差（standard error of the mean、ＳＥＭ）を示す。 ５ｍｇのアプラグルチドの単回皮下投薬後の時間（時）の関数としての血漿中アプラグルチド濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
詳細な説明
短腸症候群（short bowel syndrome、ＳＢＳ）は、広範な外科的腸切除によって引き起こされる身体障害性吸収不良障害である。広範な腸切除を受けた患者は、液体及び栄養吸収を調節する胃腸の神経内分泌フィードバックにおける障害に罹患する可能性がある。この障害には、末端回腸及び結腸中のＬ細胞によって通常産生されるＧＬＰ－２の食後分泌障害が含まれる。ＧＬＰ－２の欠如は、胃腸の空化の加速、胃腸の分泌過多、減少した腸の血流、免疫学的及びバリア機能の妨害、及び粘膜の成長の阻害をもたらし得る。結果として起こる腸適応の欠如は、頻繁な下痢又はストーマの空化、栄養不良、脱水、電解質不均衡及び体重減少を含む、ＳＢＳの病態生理学的特徴をもたらす。ＳＢＳはまた、有意な罹患率及び死亡率、並びに生活の質の低下と関連する。ＳＢＳ及び腸不全（ＳＢＳ－ＩＦ）を有する患者では、静脈内輸液及び／又は非経口栄養の任意の組み合わせを含む非経口支援（ＰＳ）が、健康及び／又は成長を維持するために必要とされる。
長期のＰＳの提供は、カテーテル関連血流感染（catheter-related blood stream infection、ＣＲＢＳＩ）及び腸不全関連肝疾患（intestinal failure-associated liver disease、ＩＦＡＬＤ）などの重篤な合併症をもたらし得る。ＳＢＳ－ＩＦを有する患者とは対照的に、ＳＢＳ腸機能不全（SBS intestinal insufficiency、ＳＢＳ－ＩＩ）を有する患者は、過食症、代謝調節、及び／又は薬理学的治療による吸収不良を補償する能力があるため、ＰＳなしで管理される。しかし、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者は、体液と電解質との不均衡のリスクがあり得、ＰＳ投与のために入院を繰り返すことを必要とする。全体として、ＳＢＳを有する患者は、生活の質が損なわれ、罹患率及び死亡率が高く、医療費が高額となる。世界的に見ても、ＳＢＳ－ＩＦは治療の可能性が限られた、無視された臓器障害である。したがって、新たな治療法を特定することにより、疾患の自覚、罹患率及び死亡率を改善し、衰弱性の症状を軽減し、患者の治療負担を軽減することができる。
外科的切除後、残存腸は、その吸収能力を高めるために、構造的及び機能的変化を起こすことがある（概して、腸適応と称される）。胃腸管全体にわたる神経内分泌ペプチドの分泌は、この適応に寄与する。ＳＢＳの病態生理学的形質は、神経内分泌フィードバック機構の障害及び腸適応の欠如によって引き起こされることが多い。これには、末端回腸及び近位結腸に主に位置する腸Ｌ細胞によって産生されるグルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の食後分泌障害が含まれる。
天然のＧＬＰ－２は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（dipeptidyl peptidase-IV、
ＤＰＰ４）による切断のために短い循環半減期を有する。アプラグルチドは、次世代の合成的に製造されたＧＬＰ－２類似体であり、ヒトＧＬＰ－２及び他のＧＬＰ－２類似体と比較して、長く持続する一定の曝露及び少なくとも３０時間の増加した半減期を提供するように設計された分子構造を有する。アプラグルチドは、４つのアミノ酸置換によってヒトＧＬＰ－２と異なり、［Ｇｌｙ２］ｈＧＬＰ－２（１－３３）の１１位及び１６位における親油性アミノ酸置換の化学構造－活性相関試験を通じて同定された。動物モデルにおいて、アプラグルチドは、腸の長さ及び体重、絨毛の高さ及び陰窩の深さの増加を促進した。動物における薬物動態学的（Pharmacokinetic、ＰＫ）及び薬力学的試験は、アプラ
グルチドが、他のＧＬＰ－２類似体と比較して、低いクリアランス、長い排出半減期及び高い血漿タンパク結合を有し得ることを示唆している。したがって、アプラグルチドは、週１回投薬レジメンの候補であり得る。アプラグルチド治療は、潜在的に、患者が腸内自律性を回復するか、又はＰＳ必要量を減少させ、吸収不良の症状を改善し、ＩＩ及びＩＦに続発する臓器不全を軽減し、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者が間欠的又は慢性ＩＦの状況に悪化するのを防止するのに役立ち得る。
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸の両方を含む。特に明記しない限り、アミノ酸はＬ－アミノ酸である。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に提示される。
本明細書で使用される場合、「対照」という用語は、単独で、又は量若しくはレベルに関して使用される場合、治療（例えば、有効用量のＧＬＰ－２アゴニスト）の投与前に対象において観察されたレベル、対照の対象又は対象の集団において観察されたレベル（経過的に観察されたレベルを含む）を指し得る。対象に関して使用される場合、「対照」は、所与の治療（例えば、有効用量のＧＬＰ－２アゴニスト）を受ける前の同じ対象、所与の状態のためのいかなる治療も受けていない同様の対象、又は所与の治療（例えば、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与）を含まない治療（例えば、手術、創傷ケア、及び／又は栄養補助）を受けている同様の対象を指し得る。
本明細書中で使用される場合、「ＧＬＰ－２アゴニスト」という用語は、脊椎動物における天然に存在するＧＬＰ－２の類似体を集合的に指し、これは、天然に存在するＧＬＰ－２に類似するか又は匹敵する活性を誘発するが、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、置換、修飾によって、かつ／又はブロック基を有する１つ以上のアミノ酸の組み込みによって、所定の脊椎動物ＧＬＰ－２に対して構造的に変更されている。かかるアゴニストは、好ましくは、ＧＬＰ－２又は同じ数のアミノ酸残基を有するＧＬＰ－２のフラグメントのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。
本明細書中で使用される場合、「患者」及び「対象」という用語は、交換可能に使用され、治療が所望される任意の対象をいう。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」又は「治療すること」ともいう）という用語は、非経口支援の必要性を部分的又は完全に低減する治療実体（例えば、本明細書に記載の治療用化合物又は組成物）の任意の投与を指す。
本明細書で使用される場合、「純度」という用語は、クロマトグラフィ法によって、より具体的には、超高速液体クロマトグラフィ（Ultra Performance Liquid Chromatography、ＵＰＬＣ）法及び／又は高速液体クロマトグラフィ（High Performance Liquid Chromatography、ＨＰＬＣ）法によって決定される純度を指すために使用される。
本明細書で使用される場合、物質（例えば、オキシマ）の「当量」という用語は、物質のモル比、より具体的には、１モルの別の物質と反応する物質のモル数を指すために使用される。
本明細書に記載される実施形態及び／又は態様のうちのいずれか１つは、本明細書に記載される任意の他の実施形態及び／又は態様と組み合わせることができ、任意の数の実施形態及び／又は態様を組み合わせることができる。
本発明の方法において使用され得るＧＬＰ－２アゴニストとしては、例えば、国際特許出願第２００６／１１７５６５号及び米国特許第８，５８９，９１８号に開示されるものが挙げられ、これらの各々の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。ＧＬＰ－アゴニストアプラグルチド及び関連する化合物（例えば、米国特許第８，５８９，９１８号を参照）は、優れた薬物動態学的特性を有し、本発明の方法における使用に好ましい。
配列番号：アミノ酸配列
好ましい実施形態では、ＧＬＰ－２アゴニストは、配列番号２（式中、Ｎｌｅはノルロイシンであり、Ｄ－ＰｈｅはＤ－アミノ酸フェニルアラニンである）のアミノ酸を有するペプチドであるアプラグルチドである。
合成
アプラグルチドを調製する方法は、当該分野で記載されており、固相ペプチド合成方法を含む。例えば、アプラグルチドを含むＧＬＰ－２アゴニストを調製する方法を記載する米国特許第８，５８０，９１８号を参照されたい。９３％の純度しか達成することができなかった以前のアプラグルチド合成方法（例えば、米国特許第８，５８０，９１８号に開示されている方法）とは対照的に、本開示は、実質的に、例えば、≧９５％又は≧９７％純粋であるアプラグルチドを作製する方法を提供するものであり、この方法は、更に、商業的製造プロセスで使用されるのに十分高い収率を提供する。更に、米国特許第８，５８０，９１８号は、アプラグルチドのアンモニア塩を開示している。アプラグルチドの好ま
しい塩であるナトリウム塩の合成が本明細書に開示されている。
アプラグルチド生産プロセスは、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーを使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に基づく。アミノ酸配列は、Ｆｍｏｃ脱保護及び次のＦｍｏｃアミノ酸のカップリングの連続サイクルによってＣ末端から段階的に構築される。アプラグルチドの新規な合成方法は、以下に記載する多くの改良点を有する。Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミド－ＭＢＨＡ（ＭｅｔｈｙｌＢｅｎｚＨｙｄｒｉｌ Ａｍｉｎｅ、メチルベンズヒドリルアミン）樹脂を使用し、ペプチドと樹脂との間の連結は、Ｋｎｏｒｒリンカーを介して実施する。Ｆｍｏｃ脱保護後、酸化不純物のレベルを低下させるために、オキシマ（エチル［ヒドロキシアミノ］シアノアセテート）を使用してピペリジン／ＤＭＦ（Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド）洗浄を実施する。カップリング時間を短縮するために、２回のＤＩＣ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ジイソプロピルカルボジイミド）添加を実施する。各アミノ酸カップリング反応の後、完全性を、未反応アミンを明らかにすることに基づく半定量的カイザー試験によって制御する。組み立て及び最後のＦｍｏｃ基脱保護の後、ペプチド樹脂をＩＰＡ（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ、イソプロパノール）で洗浄し、真空下で乾燥させる。新規な合成プロセスを使用すると、全体のカップリング時間は、粗ペプチドＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）純度及びプロセス収率に影響を及ぼすことなく、初期条件と比較して約２５％短縮される。
ペプチド合成の完了後、樹脂からのペプチドの切断を、窒素下、室温でＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｈ２Ｏ／アニソール混合物で処理することによって実施する。切断されたペプチドは、濾過によって樹脂から分離され、改良された下流の精製ステップにおいて更に処理されて、ＨＰＬＣ純度≧９７％を有するアプラグルチドのナトリウム塩を生成する。
アプラグルチド合成プロセスの改善バージョン（プロセスＢ；図２Ａ及び図２Ｂに示される）は、ＴＦＡ系移動相（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル）中でのＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）クロマトグラフィによる一次精製（重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を使用して画分のｐＨを調整して≧９０％の純度にする）、続いてＮａＨＣＯ３移動相（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル）中でのＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）による二次精製（≧９７％の純度にする）、続いて酢酸ナトリウム（sodium acetate、ＮａＯＡｃ）／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル移動相中でのＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）による脱塩／緩衝液交換を含む。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、アプラグルチドのナトリウム塩を≧９７％の純度で生成する。本明細書に記載されるアプラグルチド合成プロセスの改善バージョンは、高純度のアプラグルチド（例えば、≧９５％又は≧９７％純度）を提供することができる一方で、アプラグルチドの大規模な商業的製造に適した収率を依然として維持する。当業者に理解されるように、超高純度化合物を生成する方法は、典型的には、低い収率に悩まされており、商業的な製造におけるそれらの使用は実行不可能となっている。驚くべきことに、本明細書に記載されるアプラグルチド合成方法は、高純度のアプラグルチドを提供するだけでなく、商業的な製造状況での使用に適した収率も示す。
本開示は、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法を提供し、該方法は、
ａ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を実施して、樹脂上でＧＬＰ－２アナログペプチドを合成することと、
ｂ）樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水、及びアニソールを含む溶液で処理することによって、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを樹脂から切断し、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドの側鎖を脱保護することと、
ｃ）合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを、分取逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して精製することと、
ｄ）第２の分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（及び任意選択で、脱塩及び緩衝液交換が行われる第３の分取ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して、ステップ（ｃ）からの生成物を更に精製して、精製されたペプチド溶液を生成することと、
ｅ）精製されたペプチド溶液を凍結乾燥して、精製されたペプチド粉末を生成することと、
ｆ）精製されたペプチド粉末をアルゴン下でパッケージングすることと、を含む。
本開示は、樹脂上でＳＰＰＳを実施してＧＬＰ－２アナログペプチドを合成することを含む、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法を提供し、樹脂は、４－メチルベンズヒドリルアミン（4-Methylbenzhydrylamine、ＭＢＨＡ）樹脂である。
本開示は、樹脂上でＧＬＰ－２アナログペプチドを合成するためにＳＰＰＳを実施することを含む、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法を提供し、ＳＰＰＳは、樹脂を、ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で洗浄することを含む。
本開示は、樹脂上でＳＰＰＳを実施してＧＬＰ－２アナログペプチドを合成することを含む、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法を提供し、ＳＰＰＳは、樹脂を、ＤＩＣ及びオキシマを含む２つの量の溶液と接触させることによって実施されるカップリングステップを含み、これらの量は、３０分離して接触される。
本開示は、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法であって、切断されたペプチド樹脂混合物から粗ペプチドを抽出するために、ペプチドを、水、アセトニトリル（ＡＣＮ）、及び水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を含む溶液と接触させ、その後の酸性化ステップを省略することによって、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを精製することを含む方法を提供する。
本開示は、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法であって、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを、０．０５％ＴＦＡ、水、及びアセトニトリルを含む溶液を溶出液として使用してＲＰ－ＨＰＬＣによって精製することと、精製されたペプチド画分のｐＨを、水中０．１％（酢酸）ＡｃＯＨを使用して約ｐＨ７．９に調整することと、を含む方法を提供する。
本開示は、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法であって、０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、水、及びアセトニトリルを含む溶液を溶出液として使用するＲＰ－ＨＰＬＣによる第２の精製で、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを精製することを含む方法を提供する。
本開示は、１．５ｍＭ ＮａＯＡｃ／Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ溶液を移動相として使用してＨＰＬＣ精製を実施することを含む、ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法を提供する。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ａ）は、
ｉ）ＳＰＰＳが実施される樹脂を調製することと、
ｉｉ）初期Ｆｍｏｃ脱保護を実施し、続いてカップリング反応を実施して、第１のＦｍｏｃ保護アミノ酸を樹脂に付加し、それによって樹脂上に保護ペプチドを形成することと、
ｉｉｉ）Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施して、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸を保護ペプチドに付加することと、
ｉｖ）ＧＬＰ－２アナログペプチドが樹脂上で合成されるまでステップｉｉｉを繰り返すことであって、Ｆｍｏｃ保護及び側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドが樹脂に連結さ
れており、ペプチドは、Ｌ－ヒスチジル－グリシル－Ｌ－アスパルチル－グリシル－Ｌ－セリル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－セリル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミル－Ｌ－ノルロイシル－Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－トレオニル－リゾロイシル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アルギニル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－アスパラギニル－Ｌトリプトファニル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－スレオニル－Ｌ－リシル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－スレオニル－ラスパラギン酸アミドを含む、繰り返すことと、
ｖ）Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施して、樹脂に連結された側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを生成することと、
ｖｉ）樹脂に連結された側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを乾燥させることと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ａ）（ｉ）は、
（ａ１）樹脂を、Ｎ２雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Diisopropylethylamine、ＤＩＥＡ）を含む溶液で、樹脂１グラ
ム当たり５ｍＬの溶液で洗浄することと、
（ｂ１）ＤＭＦ中に２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium、ＨＢＴＵ）、ＤＩＥＡ、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（Hydroxybenzotriazole、ＨＯＢｔ）を含む溶液中で、Ｒｉｎｋアミドリンカーを樹脂にカップリング
させることと、
（ｃ１）ステップ（ｂ１）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、
（ｄ１）樹脂を、ＤＭＦ中に無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）及びＤＩＥＡを含む溶液と接触させることによって還元反応を実施することと、
（ｅ１）ステップ（ｄ１）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、樹脂はメチルベンズヒドリルアミン樹脂である。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ａ）（ｉ）（ａ１）～（ａ）（ｉ）（ｅ１）の生成物は、Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミド－ＭＢＨＡ樹脂である。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ１）及び／又はステップ（ｅ１）は、樹脂１グラムに対して５ミリリットルのＤＭＦの比で生成物を３回洗浄することを含む。
本開示の方法の一部の態様では、カップリング試験は、ステップ（ｄ１）と（ｅ１）との間で実施され得る。
本開示の方法の一部の態様では、カップリングの完了が達成されたかどうかを判定するために、カイザー試験が実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ａ）（ｉ）（ｅ１）の完了時の生成物は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＴｍｂＧｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｎｌｅ－ＤＰｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ－アミド－ＭＢＨＡ樹脂である。
本開示の方法の一部の態様では、Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施することは、
（ａ２）樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で処理することと、
（ｂ２）樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
（ｃ２）樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸と、ＤＭＦ中にジイソプロピルカルボジイミド（diisopropylcarbodiimide、ＤＩＣ）及びシアノヒドロキシイミノ酢
酸エチル（オキシマ）を含む溶液とに接触させ、それにより、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸をカップリングさせることと、
（ｄ２）ステップ（ｃ２）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液は、ＤＭＦ中の３５％ピペリジン溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で樹脂を処理することは、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で樹脂を３分間洗浄し、続いてＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で樹脂を２回目に３分間洗浄し、続いてＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で樹脂を１０分間洗浄することによって実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液での樹脂の処理は、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液での樹脂の１５分間の洗浄、続いてＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液での樹脂の第２の１５分間の洗浄によって行われる。
本開示の方法の一部の態様では、洗浄は、樹脂１グラムに対して、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液５ミリリットルの比で実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｂ２）における樹脂の洗浄は、樹脂１グラムに対して１５ミリリットルのＤＭＦの比で第１のＤＭＦ洗浄を実施し、続いて樹脂１グラムに対して５ミリリットルのＤＭＦの比で第２のＤＭＦ洗浄を実施することを含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｂ２）における樹脂の洗浄は、
ｉ）樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
ｉｉ）樹脂を、ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で洗浄することと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液は、２当量のオキシマを含む。
本開示の方法の一部の態様では、残基Ａｓｐ３のＦｍｏｃ脱保護反応を実施することは、樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む溶液で処理することを含む。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中ピペリジン及びオキシマを含む溶液は、ＤＭＦ中の１０％ピペリジン及び２％オキシマ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中のピペリジン及びオキシマを含む溶液は、ＤＭＦ中の５％ピペリジン及び１％オキシマ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中のピペリジン及びオキシマを含む溶液は、Ｄ
ＭＦ中の１５％ピペリジン及び３％オキシマ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中ピペリジン及びオキシマを含む溶液は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン及び４％オキシマ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中のピペリジン及びオキシマを含む溶液は、ＤＭＦ中の２５％ピペリジン及び５％オキシマ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中のピペリジン及びオキシマを含む溶液は、ＤＭＦ中の３０％ピペリジン及び６％オキシマ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む溶液での樹脂の処理は、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む溶液での樹脂の１５分間の洗浄、続いてＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む溶液での樹脂の第２の３０分間の洗浄によって行われる。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ２）は、
ｉ）樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護されたアミノ酸並びにＤＩＣ及びオキシマをＤＭＦ中に含む溶液と接触させることと、
ｉｉ）樹脂を、ＤＩＣを含む第２の量の溶液と接触させることと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、樹脂を少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸と接触させた後、樹脂を、ＤＩＣを含む第２の量の溶液と、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０分間接触させる。
一部の態様では、少なくとも１つの保護されたアミノ酸は、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨを含むジペプチドである。
一部の態様では、少なくとも１つの保護されたアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨを含むジペプチドである。
一部の態様では、ジペプチドは、ジペプチドをカップリングする前に、１０分間、３０分間、４５分間、６０分間、２時間、３時間、又は４時間、予め活性化される。
一部の態様では、ジペプチドは、ジペプチドをカップリングする前に、５℃±２℃、１０℃±２℃、１５℃±２℃、２０℃±２℃、２５℃±２℃、３０℃±２℃、又は３５℃±２℃で予備活性化される。
一部の態様では、ジペプチドは、ジペプチドをカップリングする前に、７ｍＬのＤＭＦ中にＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨ／オキシマ／ＤＩＣ２．５ｍｍｏｌ／２．５ｍｍｏｌ／２．５ｍｍｏｌを含む溶液中で予め活性化される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ２）は、
ｉ）樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護されたアミノ酸、並びにＤＭＦ中にＤＩＣ及びオキシマを含む溶液と接触させることと、
ｉｉ）樹脂を、ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液と接触させることと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液は、樹脂を少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸と接触させた約３０分後に、樹脂と接触させる。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ２）において、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸は、１、２、３、４、又は５当量の濃度で提供される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ２）において、ＤＩＣは、１、２、３、４、又は５当量の濃度で提供され、オキシマは、１、２、３、４、又は５当量の濃度で提供される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ２）において、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－ＯＨである。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ２）において、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－ＯＨは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５当量の濃度で提供される。
本開示の方法の一部の態様では、方法は、ステップ（ｂ２）とステップ（ｃ２）との間に、ピペリジンの量を測定することによって残留ピペリジンの試験を実施することを更に含む。
本開示の方法の一部の態様では、測定されたピペリジンの量が１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｐｐｍを超える場合、樹脂を、ＤＭＦ及び／又はＤＭＦとオキシマとを含む溶液で再度洗浄する。
本開示の方法の一部の態様では、カップリング試験は、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）との間で実施される。
本開示の方法の一部の態様では、カップリング試験はニンヒドリンアッセイである。
本開示の方法の一部の態様では、ステップａ（ｖ）は、
（ａ３）樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で処理することと、
（ｂ３）樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
（ｃ３）樹脂をイソプロパノールで洗浄することと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｂ３）における樹脂の洗浄は、
ｉ）樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
ｉｉ）樹脂を、ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で洗浄することと、を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ３）において樹脂をイソプロパノールで洗浄することは、樹脂をイソプロパノールで５回洗浄することを含み、各洗浄は、樹脂１グラムについてイソプロパノール５ミリリットルの比で実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ａ）（ｖ）の完了時の生成物は、Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＴｍｂＧｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｎｌｅ－ＤＰｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ－アミド－ＭＢＨＡ樹脂を含む樹脂上の保護ペプチドである。
本開示の方法の一部の態様では、ＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液は、９５：２．５：２．５のＴＦＡ：水：アニソールの比でＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液は、９０：５：５のＴＦＡ：水：アニソールの比でＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液は、８０：１０：１０のＴＦＡ：水：アニソールの比でＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液は、７０：１５：１５のＴＦＡ：水：アニソールの比でＴＦＡ、水、及びアニソールを含む溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｂ）は、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（tert-butyl methyl ether、ＭＴＢＥ）を使用して、切断及び脱保護されたＧＬＰ－２
アナログペプチドを沈殿及び洗浄することを更に含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｂ）の完了時の生成物は、Ｈ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ５－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－ＮＬｅ１０－ＤＰｈｅ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ１５－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ２０－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ－Ｔｒｐ２５－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ３０－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－ＮＨ２である。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）ステップ（ｂ）の生成物を、水、アセトニトリル及びＮＨ４ＯＨを含む溶液と接触させることと、
（ｉｉ）合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを、分取逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して精製することと、を含む。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、アンモニア緩衝液中に８０：２０の比のＨ２Ｏ／ＡＣＮの混合物を含む。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、アンモニア緩衝液中に７０：３０の比のＨ２Ｏ／ＡＣＮの混合物を含む。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、アンモニア緩衝液中に、９０：１０の比、８０：２０の比、７０：３０の比、６０：４０の比、５０：５０の比、又は４０：６０の比のＨ２Ｏ／ＡＣＮの混合物を含む。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、標的ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９、ｐＨ１０、又はｐＨ１１に調整される。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、標的ｐＨ≧７に調整される。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、標的ｐＨ８．０±０．１に調整される。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、標的ｐＨ８．０±０．１、±０．２、±０．３、±０．４、±０．５、±０．６、±０．７、±０．８、又は±０．９に調整される。
一部の態様では、水及びアセトニトリルを含むステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、約ｐＨ１０に調整される。
本開示の方法の一部の態様では、ｐＨは、２５％酢酸を使用して調整される。
本開示の方法の一部の態様では、ｐＨは、Ｈ２Ｏ中の２５％ＮＨ４ＯＨを使用して調整される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、０℃、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、又は８０℃で維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、５０℃で維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、室温℃で維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、本明細書に開示される温度で１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１０分間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、２０時間、２４時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、又は７２時間維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、本明細書に開示される温度で６５分間維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、本明細書に開示される温度で２４時間維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、５０℃で６５分間維持される。
一部の態様では、ステップ（ｃ）（ｉ）の溶液は、室温℃で２４時間維持される。
本開示の方法の一部の態様では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｃ１８カラムを使用して実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、ＮａＨＣＯ３、水、及びアセトニトリルを含む溶液を溶出液として使用して行われる。
本開示の方法の一部の態様では、ＮａＨＣＯ３、水、及びアセトニトリルを含む溶液は、０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、又は０．５ＭのＮａＨＣＯ３を含む。
本開示の方法の一部の態様では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、ＴＦＡ、水、及びアセトニトリルを含む溶液を溶出液として使用して実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ＴＦＡ、水、及びアセトニトリルを含む溶液は、０．
０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％又は０．５％のＴＦＡを含む。
本開示の方法の一部の態様では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、精製されたペプチド画分のｐＨを調整することを含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｄ）において、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドは、そのナトリウムカチオン形態に変換される。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｄ）は、水中の０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、又は２％のＡｃＯＨを使用して、精製ペプチド溶液のｐＨを約ｐＨ７．９に調整することを含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｄ）は、水中の０．１％ＡｃＯＨを使用して、精製ペプチド溶液のｐＨを約ｐＨ７．９に調整することを含む。
本開示の方法の一部の態様では、ステップ（ｃ）からの生成物は、ＨＰＬＣを使用して精製され、更に精製されたペプチド溶液を生成する。
本開示の方法の一部の態様では、ＨＰＬＣは、ＡｃＯＨ、水、及びアセトニトリルを含む溶液を使用して実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ＡｃＯＨ、水、及びアセトニトリルを含む溶液は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％のＡｃＯＨ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＨＰＬＣは、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、水、及びアセトニトリルを含む溶液を使用して実施される。
本開示の方法の一部の態様では、ＮａＯＡｃ、水、及びアセトニトリルを含む溶液は、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、又は３ｍＭ ＮａＯＡｃ溶液である。
本開示の方法の一部の態様では、ＨＰＬＣ精製後、更に精製されたペプチド溶液のｐＨを、水中０．１％ＡｃＯＨを使用して約ｐＨ７．９に調整する。
本開示の方法の一部の態様では、ＨＰＬＣ精製後、更に精製されたペプチド溶液のｐＨは、水中０．１％ＡｃＯＨを使用して、約ｐＨ５、約ｐＨ６、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８、約ｐＨ８．５、又は約ｐＨ９に調整される。
一部の態様では、表１に示される出発物質を本開示の方法で使用することができる。一部の態様では、表１に示される出発物質は、表１の「純度」の列に示される純度を有することができる。
本開示の方法の一部の態様では、アプラグルチドは９５％以上の純度を有する。
本開示の方法の一部の態様では、アプラグルチドは９７％以上の純度を有する。
一部の態様では、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ、Ｄｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド、及び［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］の濃度及び／又は存在は、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して決定され得る。表２ａは、上記合成の２つの変形における純度及び主要な不純物を示す。表２ｂは、本明細書に記載されるアプラグルチド合成プロセスの３つの変形における純度及び収率を示す。
一部の実施形態では、精製されたペプチドプールは、不特定の不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、精製されたペプチドプールは、いかなる不特定の不純物も１％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、精製されたペプチドプールは、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２類似体含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、精製されたペプチドプールは、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２類似体を、３％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、精製ペプチドプールは、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７－ＧＬＰ－２類似体不純物の合計を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、精製ペプチドプールは、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７－ＧＬＰ－２類似体不純物の合計を、２％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、精製されたペプチドプールは、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２類似体を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、精製されたペプチドプールは、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２アナログ不純物を、２％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣで測定したＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩の純度は、９５％、９７％又は９９％より大きい。一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定される精製されたペプチドプールの純度は、９５％より大きい。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩の純度は、不特定の不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、不特定の不純物を、１％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２類似体を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２アナログ不純物を、３％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７－ＧＬＰ－２アナログ不純物の合計を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７－ＧＬＰ－２アナログ不純物の合計を、２％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２類似体を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドナトリウム塩は、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２類似体不純物を、２％を超える濃度で含有しない。
本開示の方法の一部の態様では、本方法は、ペプチドのナトリウム塩形態への変換後のプロセス内管理を更に含むことができ、プロセス内管理はＲＰ－ＨＰＬＣによって実施され、合格基準は、ペプチドが≧９５．０％の純度及び以下の不純物、すなわちＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド≦３．０％、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチドの合計≦２．０％、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド≦２．０％、及び任意の他の不特定の不純物≦１．０％を有することである。
理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリングサイクルの間のＦｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｍｂ－Ｇｌｙ－ＯＨの使用は、カップリング効率を改善し、アスパルチミド形成を減少させる。
理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリングサイクルの間のカップリング添加剤としてのオキシマの使用は、酸化及び［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２アナログ不純物の形成を最小にする。
理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、分取ＲＰ－ＨＰＬＣによるナトリウム塩変換中の移動相組成物のためのＡＣＮの使用は、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物のナトリウム塩変換を改善する。一部の実施形態では、分取ＲＰ－ＨＰＬＣによるナトリウム塩変換間の滴定ステップの除去は、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物のナトリウム塩変換を改善する。一部の実施形態では、分取ＲＰ－ＨＰＬＣによるナトリウム塩変換間のｐＨ調整の導入は、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物のナトリウム塩変換を改善する。
Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２類似体不純物は、ペプチド中に存在しないＧｌｙ４を含む。アスパルチミド３ＧＬＰ－２類似体不純物は、Ａｓｐ３カップリング中のアスパルチミド形成を含む。Ａｓｐ３３－ＯＨ ＧＬＰ－２類似体不純物は、ペプチドのＣ末端アミド加水分解を含む。Ｄｅｓ－Ｓｅｒ７ＧＬＰ－２類似体不純物は、ペプチド中にＳｅｒ７欠損を含む。［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２類似体不純物は、切断プロセス中のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ（Ｔｍｂ）－ＯＨ形成を含む。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、いかなる個々の不純物も、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、又は４％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、いかなる個々の不純物も、１．５％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２類似体含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２アナログ不純物を、３％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、β－Ａｓｐ３ＧＬＰ－２類似体含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、β－Ａｓｐ３ＧＬＰ－２アナログ不純物を、１．５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、β－Ａｓｐ３ＧＬＰ－２アナログ不純物を、１％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、Ｄ－Ｈｉｓ ＧＬＰ－２類似体を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、Ｄ－Ｈｉｓ ＧＬＰ－２類似体不純物を、１．５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、Ｄ－Ｈｉｓ ＧＬＰ－２アナログ不純物を、１％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７－ＧＬＰ－２アナログ不純物の合計を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、アスパルチミド３、Ａｓｐ３３－ＯＨ及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７－ＧＬＰ－２アナログ不純物の合計を、２％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２類似体を含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２アナログ不純物を、２％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドは、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２アナログ、アスパルチミド３ＧＬＰ－２アナログ、Ａｓｐ３３－ＯＨ ＧＬＰ－２アナログ、Ｄｅｓ－Ｓｅｒ７ＧＬＰ－２アナログ、又は［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２類似体含む不純物を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％、２．５％、３％、３．５％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチドは、Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４ＧＬＰ－２アナログペプチド、アスパルチミド３ＧＬＰ－２アナログペプチド、Ａｓｐ３３－ＯＨ ＧＬＰ－２アナログペプチド、Ｄｅｓ－Ｓｅｒ７ＧＬＰ－２アナログペプチド、又は［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］ＧＬＰ－２アナログペプチドを含む不純物を、０．５％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、不純物の総量を、１％、３％、５％、又は７％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、不純物の総量を、５％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、酢酸塩を含む不純物を、１％、２％、３％、４％、又は５％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、酢酸塩を、５％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、トリフルオロ酢酸を含む不純物を、０．０１％、０．０３％、０．０５％、０．０７％、０．１％、０．２％、０．５％、又は１％を超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、トリフルオロ酢酸を、０．１％を超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、アセトニトリルを含む不純物を、５，０００、４，０００、３，０００、２，０００、１，０００、５００、４００、３００、２００、又は１００ｐｐｍ未満で含有する。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、アセトニトリルを、４５０ｐｐｍ未満で含有する。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、細菌エンドトキシンを含む不純物を、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ＥＵ／ｍｇを超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、細菌内毒素を、５．０ＥＵ／ｍｇを超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、好気性微生物を含む不純物を、１、１０、５０、１００、１５０、又は２００ＣＦＵ／０．１ｇを超える濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、好気性微生物を、１００ＣＦＵ／０．１ｇを超える濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、酵母及びカビを含む不純物を、０．１、１、５、１０、１５、又は２０ＣＦＵ／０．１ｇを超える合計濃度で含有しない。一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、酵母及びカビを、１０ＣＦＵ／０．１ｇを超える合計濃度で含有しない。
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸、アセトニトリル、細菌内毒素、好気性微生物、酵母、カビ、又はそれらの任意の組み合わせを含む不純物を含有しない。
合成後、アプラグルチド活性医薬成分（active pharmaceutical ingredient、「ＡＰＩ」）は凍結乾燥され、その後、薬物製品に配合される。
配合物
本開示のＧＬＰ－２アゴニストは、医薬として単独で、又は活性成分としての１つ以上のＧＬＰ－２アゴニスト及び薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、希釈剤、若しくは担体を含む医薬組成物中で使用することができる。医薬組成物はまた、他の活性成分を含んでもよい。
適切な医薬に受容可能なキャリアとしては、ペプチドベースの薬物とともに代表的に使用されるキャリアが挙げられる。薬物配合物についての一般的なガイダンスについては、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」２２ｎｄ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０１２を参照されたい。適切な賦形剤の非限定的な例としては、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、マンニトール、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
好ましい配合物は、緩衝剤としてグリシンを使用する。Ｌ－ヒスチジンは、物理的安定化剤としてこの配合物に使用される。Ｌ－ヒスチジンは、標的ｐＨを維持する緩衝液としても機能する。マンニトールは、この配合物において、凍結乾燥プロセスステップにおける増量剤として使用される。注射用水はこの配合物の溶媒であり、凍結乾燥ステップ中に注射用水が除去される。ｐＨ調整には水酸化ナトリウムが使用される。ｐＨを測定し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液で８．３０±０．１０に調整することができる。
本開示は、薬物製品の製造のためのロバストで再現可能な凍結乾燥サイクルを提供する。臨床バッチの製造に使用されることが意図される同じ容器クロージャを使用して、２つのスケールダウンされた開発バッチを充填した。凍結乾燥サイクルを一次乾燥（一次乾燥サイクル）のために最適化して、薬物製品の臨床製造において実施されるプロセスを規定した。最適化された凍結乾燥サイクルは、期待される品質属性（すなわち、アッセイ、純度及び不純物レベル、再構成時間及び水分含量）を有する薬物製品をもたらし、薬物製品の臨床バッチに適切であるとみなされた。第２のスケールダウンされた開発バッチに対して行われた安定性試験により、薬物製品が、３ヶ月までの間、意図された貯蔵温度（２～８℃）で変化しないままであったことが実証された。
一部の態様では、表３に示される注射用アプラグルチド及び再構成溶液の組成物は、本開示の方法を使用して生成され得る例示的な組成物である。
ａ使用される原体の量は、対応する原体バッチ中のアプラグルチド含量に基づいて計算される。
ｂ最終製品中に現れない、薬物製品の製造中に使用される成分。
一部の実施形態では、アプラグルチド組成物は、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、マンニトール、注射用水（ＷＦＩ）、滅菌注射用水（sterile water for injection、ｓＷＦＩ）
、水酸化ナトリウム、スクロース、又はそれらの任意の組み合わせを含む賦形剤を含み得る。
一態様では、本開示は、水に溶解した本開示のアプラグルチド、グリシン、Ｌ－ヒスチジン及びマンニトールを含む医薬組成物であって、アプラグルチドの濃度が２５ｍｇ／ｍＬであり、グリシンの濃度が３．７５ｍｇ／ｍＬであり、Ｌ－ヒスチジンの濃度が７．７５ｍｇ／ｍＬ水であり、マンニトールの濃度が１１５．０ｍｇ／ｍＬである医薬組成物を提供する。一部の態様では、水の容積は０．５ｍＬであり得る。一部の態様では、前述の医薬組成物は、溶液のｐＨが約ｐＨ８．３であるような量で水酸化ナトリウムを更に含むことができる。
一部の態様では、本開示の医薬組成物のモル浸透圧濃度は、２９０～７８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。一部の態様では、本開示の医薬組成物のモル浸透圧濃度は、約７８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。一部の態様では、本開示の医薬組成物のモル浸透圧濃度は、約７８０±１６０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
注射用ＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、無菌で製造された注射用溶液のための凍結乾燥粉末であってもよい。それは、凍結乾燥された無菌製品に適した無色のガラスバイアルに入れ、ゴム栓で閉じ、アルミニウムキャップで密封して提供することができる。投与前に、注射用ＧＬＰ－２アナログペプチドを０．５ｍＬの注射用滅菌水（ｓＷＦＩ）に溶解してもよい。再構成された溶液は、皮下投与され得る。
投与
一部の実施形態では、ＧＬＰ－２アゴニスト、例えばアプラグルチドは、非経口的に、例えば注射によって投与される。非経口投与に適した配合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び配合物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。注射可能な溶液のための液体キャリ
アとしては、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、アプラグルチドは、２チャンバシリンジ又はデュアルカートリッジインジェクターを介して送達される。かかるシリンジの一例は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０００７８７に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
投薬
有効用量を構成する量は、患者の疾患及び臨床状態（例えば、体重）並びに投与経路などの種々の要因に依存し得る。用量は、例えば、１日２回、１日１回、週２回、毎週、隔週、毎月１回又は２回などで投与され得る。用量は、概して、約１週間～約１００週間の期間にわたって、１週間当たり約１ｍｇ～約１０ｍｇの範囲である。一部の実施形態では、週１回用量は、約１ｍｇ～１０ｍｇである。一部の実施形態では、対象は、約１週間～約１００週間、約１週間～約８０週間、約１週間～約６０週間、約１週間～約４８週間、約２週間～約２４週間、約２週間～約２０週間、又は約２週間～約１６週間投薬される。一部の実施形態では、対象は、週に約１回用量を投与される。一部の実施形態では、対象は、２週間に約１回又は１ヶ月に約２回の用量を投与される。２週間に約１回又は１ヶ月に約２回。
アプラグルチドは、用量に依存してシトルリンレベルを増加させる。シトルリンは、小腸腸細胞量のマーカーである。１ｍｇ、５ｍｇ及び１０ｍｇでのアプラグルチドの投薬は、患者におけるシトルリン濃度の長期にわたる増加を誘導する。
一部の実施形態では、アプラグルチドは、非経口的に（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、又は経口で）投与される。一部の実施形態では、アプラグルチドは静脈内投与される。一部の実施形態では、アプラグルチドは皮下投与される。
体重が減少するにつれて曝露（ＡＵＣ及びＣｍａｘ）が非線形的に増加するため、５０ｋｇ未満の体重を有する患者に２．５ｍｇを投薬して高曝露を防止することが望ましい。５０ｋｇ以上の患者は、５ｍｇ以上の用量を受けてもよい。
効果
一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与された対象は、対照と比較してより少ない栄養補助を必要とする。例えば、一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与された対象は、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％少ない栄養補助を必要とする。一実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与された対象は、対照（すなわち、経腸自律性）と比較して１００％少ない栄養補助を必要とする。
一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与された対象は、対照と比較してより少ない日数の完全な非経口支援を必要とする。例えば、一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与は、完全な非経口支援が必要とされる時間の長さを、対照と比較して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％減少させ得る。一実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与は、完全な非経口支援が必要とされる時間の長さを、対照（すなわち、経腸自律性）と比較して１００％減少させる。一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与された対象は、１年に８５日未
満、１年に８０日未満、１年に７５日未満、１年に７０日未満、１年に６５日未満、１年に６０日未満、１年に５５日未満、１年に５０日未満、１年に４５日未満、１年に４０日未満、１年に３５日未満、１年に３０日未満、１年に２５日未満、１年に２０日未満、１年に１５日未満、１年に１０日未満、又は１年に５日未満の完全な非経口支援を必要とする。
一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与される対象は、治療後に完全非経口栄養を必要としない。
一部の実施形態では、アプラグルチドを受けている患者は、
ａ．結腸連続性（「ＣＩＣ」）が残っており、ストーマがなく（利用可能な医学的／外科的記録に基づいて、小腸が十二指腸空腸湾曲部から２００ｃｍ未満）、最後の腸切除がスクリーニングの少なくとも１２ヶ月前であること、又は
ｂ．最新の腸切除がスクリーニングの少なくとも６ヶ月前である、空腸造瘻術又は回腸造瘻術（利用可能な医学的／外科的記録に基づいて、十二指腸－空腸屈曲から＜２００ｃｍ）、のいずれかによる小腸の外科的切除に続いて、腸管外補助を受けている、短腸症候群関連腸不全（「ＳＢＳ－ＩＦ」）を有する男性及び女性対象を含む。
一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与は、対照と比較して入院期間の短縮をもたらす。例えば、一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与は、入院期間を、対照と比較して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％短縮し得る。一部の実施形態では、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストを投与された対象は、５０日未満、４５日未満、４０日未満、３５日未満、３０日未満、２５日未満、２０日未満、１５日未満、１０日未満、又は５日未満の間入院する。
一部の実施形態では、対象の集団への有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与は、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与を含まない標準ケア治療（例えば、外科的治療、栄養補助、及び創傷ケア）を受ける対象の集団と比較して死亡率を低下させる。例えば、一部の実施形態では、死亡率は、１５％未満、１２％未満、１０％未満、８％未満、５％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満に低下する。ＳＣ注射は、典型的には、腹部領域又は大腿部に投与される。注射部位は、注射が最後の注射が投与された場所から少なくとも５ｃｍ離れて投与されるように回転させる必要がある。
アプラグルチドは、週１回の投薬の２４週間後に、ＣＩＣ又はストーマのいずれかを有するＳＢＳ－ＩＦ対象において臨床的有効性（ＰＳ量の減少）を実証することができると考えられる。したがって、一実施形態では、アプラグルチド又は対応するプラセボの単回２．５ｍｇ用量（直近の試験来院時に５０ｋｇ未満の体重を有する対象に対して）又は５ｍｇ用量（直近の試験来院時に５０ｋｇ以上の体重を有する対象に対して）が、２４週間（ストーマ）又は４８週間（ＣＩＣ）の治療期間中に週１回、皮下（「ＳＣ」）注射によって投与される。
アプラグルチドは、他のＧＬＰ－２類似体と比較して、より少ない頻度の投薬（すなわち、週１回）でエネルギー吸収に対して優れた効果を示した。５ｍｇを週１回投薬した場合、アプラグルチドは、尿流入量のベースライン増加から１４０．１％（＋１５．８）の変化、７６０．４ｇ／日（＋２３６．１）の湿重量吸収のベースラインの変化、及び１，０７４ｋｊ／日（＋３７７）のエネルギー吸収のベースラインの変化を引き起こした。
アプラグルチドは、表９に示すように、プラセボと比較して７１１ｍＬ／日の調整平均（９５％ＣＩ １３２～１，２８９；Ｐ＝．０２１）だけ絶対尿排出量の増加を促進し、これは４８％の１日の増加（９５％ＣＩ １２～８４；Ｐ＝．０１４）に相当する。アプラグルチドは、表１０に示すように、絶対尿排出量の増加を７１４ｍＬ／日（９５％ＣＩ
４９０～９３９；Ｐ＝．００２）の調整平均で促進し、これは４９％の１日増加（９５％ＣＩ ４～９４；Ｐ＝．０４１）に相当する。１０ｍｇのアプラグルチドによる治療は、プラセボと比較して、絶対尿排出量の増加を７９５ｍＬの調整平均（９５％ＣＩ １９５～１，３９４；Ｐ＝．０１４）だけ促進した。相対尿産生の対応する変化は３４％（９５％ＣＩ－４～７１；Ｐ＝．０７２）であった。
アプラグルチドは、表９に示すように、プラセボと比較して尿中ナトリウム排泄を５６ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ－１０～１２３；Ｐ＝．０８７）の調整平均だけ増加させた。５ｍｇのアプラグルチドは、表１０に示すように、プラセボと比較して尿中ナトリウム排泄を６６ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ－６９～２０１；Ｐ＝．１７１）の調整平均だけ増加させた。１０ｍｇ用量群では、表９に示すように、プラセボと比較して絶対尿中ナトリウム排泄は、８８ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ ２０～１５６；Ｐ＝．０１７）の調整平均だけ増加した。
アプラグルチドは、表１９に示すように、腸のエネルギー吸収を１，０９５ｋＪ／日（９５％ＣＩ １９６～１，９９４；Ｐ＝．０２４）増加させた。
対照的に、１日１回投薬されたテヅグルチドは、Ｊｅｐｐｅｓｅｎ，Ｇｕｔ，５４，ｐｐ．１２２４－１２３１（２００５）に報告されているように、尿流入量のベースライン増加から１３９．３％の変化、７４３ｇ／日（＋１１９．２５）の湿重量吸収のベースラインの変化、及び７９２ｋｊ／日（＋５７０）のエネルギー吸収のベースラインの変化を引き起こした。
同様に、対照的に、１日１回投薬されたグレパグルチドは、Ｍａｉｍｉ，Ｌａｎｃｅｔ
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ，４，ｐｐ．３５４－３６３（２０１９）に報告されているように、尿排出のベースライン増加から１１１％（０．１ｍｇ用量）、１４０％（１．０ｍｇ用量）又は１３２％（１０ｍｇ用量）の変化、－２１１ｇ／日（０．１ｍｇ用量）、６５０ｇ／日（１．０ｍｇ用量）又は７８６ｇ／日（１０ｍｇ用量）の湿重量吸収のベースラインの変化、及び－３７７ｋｊ／日（０．１ｍｇ用量）、４３５ｋｊ／日（１．０ｍｇ用量）又は５８８ｋｊ／日（１０ｍｇ用量）のエネルギー吸収のベースラインの変化を引き起こした。
調査中のＩＭＰ以外の天然のＧＬＰ－２、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２、ＧＬＰ－１類似体などの成長因子、グルタミン又は成長ホルモンのいかなる使用も、アプラグルチドの投与前の１２ヶ月（ＣＩＣ対象）及び６ヶ月（ストーマ対象）の間中断する必要がある。
一部の実施形態では、対象の集団への有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与は、有効用量のＧＬＰ－２アゴニストの投与を含まない標準ケア治療（例えば、外科的治療、栄養補助、及び創傷ケア）を受ける対象の集団と比較して死亡率を低下させる。例えば、一部の実施形態では、罹患率は、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、又は１０％未満に低下する。
一部の実施形態では、アプラグルチドは、術後腸内自律性回復のために、又は腸皮瘻の治療のために使用される。一部の実施形態では、アプラグルチドは、吻合部漏出、機能性腸不全、腸機能不全、壊死性腸炎、移植片対宿主疾患、クローン病、又はセリアック病の
治療に使用される。
本開示は、対象における短腸症候群を治療する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を投与することを含む方法を提供する。
本開示は、対象における短腸症候群の治療における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
本開示は、対象における短腸症候群を治療するための医薬の製造のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
本開示は、短腸症候群を有する対象において湿重量の腸吸収を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において湿重量の腸吸収を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において湿重量の腸吸収を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、湿重量の腸吸収の増加は、少なくとも約１００ｇ／日、又は少なくとも約２００ｇ／日、又は少なくとも約３００ｇ／日、又は少なくとも約４００ｇ／日、又は少なくとも約５００ｇ／日、又は少なくとも約６００ｇ／日、又は少なくとも約７００ｇ／日、又は少なくとも約８００ｇ／日、又は少なくとも約９００ｇ／日、又は少なくとも約１０００ｇ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において糞便排出を減少させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象においてストーマ排出を減少させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において糞便排出を減少させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において糞便排出を減少させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、糞便排出の減少は、少なくとも約１００ｇ／日、又は少なくとも約２００ｇ／日、又は少なくとも約３００ｇ／日、又は少なくとも約４００ｇ／日、又は少なくとも約５００ｇ／日、又は少なくとも約６００ｇ／日、又は少なくとも約７００ｇ／日、又は少なくとも約８００ｇ／日、又は少なくとも約９００ｇ／日、又は少なくとも約１０００ｇ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において尿産生を増加させるための方法であって、
少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において尿産生を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において尿産生を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、尿産生の増加は、少なくとも約１００ｇ／日、又は少なくとも約２００ｇ／日、又は少なくとも約３００ｇ／日、又は少なくとも約４００ｇ／日、又は少なくとも約５００ｇ／日、又は少なくとも約６００ｇ／日、又は少なくとも約７００ｇ／日、又は少なくとも約８００ｇ／日、又は少なくとも約９００ｇ／日、又は少なくとも約１０００ｇ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象においてナトリウム及び／又はカリウムの吸収を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象においてナトリウム及び／又はカリウムの吸収を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象においてナトリウム及び／又はカリウムの吸収を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、ナトリウム及び／又はカリウムの吸収の増加は、少なくとも約５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約１０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約１５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約２０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約２５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約３０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約３５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約４０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約４５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約５０ｍｍｏｌ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において尿中ナトリウム及び／又はカリウム排泄を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において尿中ナトリウム及び／又はカリウム排泄を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において尿中ナトリウム及び／又はカリウム排泄を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、尿中ナトリウム及び／又はカリウム排泄の増加は、少なくとも約５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約１０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約１５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約２０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約２５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約３０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約３５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約４０ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約４５ｍｍｏｌ／日、又は少なくとも約５０ｍｍｏｌ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象においてエネルギーの腸吸収を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象においてエネルギーの腸吸収を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象においてエネルギーの腸吸収させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、エネルギーの腸吸収の増加は、少なくとも約５００ｋｊ／日、又は少なくとも約６００ｋｊ／日、又は少なくとも約７００ｋｊ／日、又は少なくとも約８００ｋｊ／日、又は少なくとも約９００ｋｊ／日、又は少なくとも約１０００ｋｊ／日、又は少なくとも約１１００ｋｊ／日、又は少なくとも約１２００ｋｊ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において糞便排出のエネルギー含量を減少させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において糞便排出のエネルギー含量を減少させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において糞便排出のエネルギー含量を減少させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、糞便排泄のエネルギー含量の減少は、少なくとも約５００ｋｊ／日、又は少なくとも約６００ｋｊ／日、又は少なくとも約７００ｋｊ／日、又は少なくとも約８００ｋｊ／日、又は少なくとも約９００ｋｊ／日、又は少なくとも約１０００ｋｊ／日、又は少なくとも約１１００ｋｊ／日、又は少なくとも約１２００ｋｊ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において炭水化物及び／又は脂質吸収を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において炭水化物及び／又は脂質吸収を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において炭水化物及び／又は脂質吸収を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、炭水化物及び／又は脂質吸収の増加は、少なくとも約１００ｋｊ／日、又は少なくとも約２００ｋｊ／日、又は少なくとも約３００ｋｊ／日、又は少なくとも約４００ｋｊ／日、又は少なくとも約５００ｋｊ／日、又は少なくとも約６００ｋｊ／日、又は少なくとも約７００ｋｊ／日、又は少なくとも約８００ｋｊ／日、又は少なくとも約９００ｋｊ／日、又は少なくとも約１０００ｋｊ／日、又は少なくとも約１１００ｋｊ／日、又は少なくとも約１２００ｋｊ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象においてタンパク質吸収を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象においてタンパク質吸収を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象においてタンパク質吸収を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、タンパク質吸収の増加は、少なくとも約１００ｋｊ／日、又は少なくとも約２００ｋｊ／日、又は少なくとも約３００ｋｊ／日、又は少なくとも約４００ｋｊ／日、又は少なくとも約５００ｋｊ／日、又は少なくとも約６００ｋｊ／日、又は少なくとも約７００ｋｊ／日、又は少なくとも約８００ｋｊ／日、又は少なくとも約９００ｋｊ／日、又は少なくとも約１０００ｋｊ／日、又は少なくとも約１１００ｋｊ／日、又は少なくとも約１２００ｋｊ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において体重を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において体重を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において体重を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、体重の増加は、少なくとも約０．５ｋｇ、又は少なくとも約１．０ｋｇ、又は少なくとも約１．５ｋｇ、又は少なくとも約２．０ｋｇ、又は少なくとも約２．５ｋｇ、又は少なくとも約３．０ｋｇ、又は少なくとも約３．５ｋｇ、又は少なくとも約４．０ｋｇ、又は少なくとも約４．５ｋｇ、又は少なくとも約５．０ｋｇであり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において除脂肪体重を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において除脂肪体重を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において除脂肪体重を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、除脂肪体重の増加は、少なくとも約０．５ｋｇ、又は少なくとも約１．０ｋｇ、又は少なくとも約１．５ｋｇ、又は少なくとも約２．０ｋｇ、又は少なくとも約２．５ｋｇ、又は少なくとも約３．０ｋｇ、又は少なくとも約３．５ｋｇ、又は少なくとも約４．０ｋｇ、又は少なくとも約４．５ｋｇ、又は少なくとも約５．０ｋｇであり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において脂肪量を減少させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与
することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において体脂肪量を減少させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において脂肪量を減少させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、脂肪量の減少は、少なくとも約０．５ｋｇ、又は少なくとも約１．０ｋｇ、又は少なくとも約１．５ｋｇ、又は少なくとも約２．０ｋｇ、又は少なくとも約２．５ｋｇ、又は少なくとも約３．０ｋｇ、又は少なくとも約３．５ｋｇ、又は少なくとも約４．０ｋｇ、又は少なくとも約４．５ｋｇ、又は少なくとも約５．０ｋｇであり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において血漿中のＬ－シトルリンの濃度を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において血漿中のＬ－シトルリンの濃度を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において血漿中のＬ－シトルリンの濃度を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、血漿中のＬ－シトルリンの濃度の増加は、少なくとも約５μｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約１０μｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約１５μｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約２０μｍｏｌ／Ｌであり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において尿排出量を増加させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において尿排出量を増加させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において尿排出量を増加させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、尿排出量の増加は、少なくとも約４００ｍＬ／日、又は少なくとも約５００ｍＬ／日、又は少なくとも約６００ｍＬ／日、又は少なくとも約７００ｍＬ／日、又は少なくとも約８００ｍＬ／日、又は少なくとも約９００ｍＬ／日、又は少なくとも約１０００ｍＬ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において経口輸液摂取を減少させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において経口輸液摂取を減少させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において経口輸液摂取を減少させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ
－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、経口輸液摂取の減少は、少なくとも約４００ｍＬ／日、又は少なくとも約５００ｍＬ／日、又は少なくとも約６００ｍＬ／日、又は少なくとも約７００ｍＬ／日、又は少なくとも約８００ｍＬ／日、又は少なくとも約９００ｍＬ／日、又は少なくとも約１０００ｍＬ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において非経口支援量を減少させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において非経口支援量を減少させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において非経口支援量を減少させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、非経口支援量の減少は、少なくとも約４００ｍＬ／日、又は少なくとも約５００ｍＬ／日、又は少なくとも約６００ｍＬ／日、又は少なくとも約７００ｍＬ／日、又は少なくとも約８００ｍＬ／日、又は少なくとも約９００ｍＬ／日、又は少なくとも約１０００ｍＬ／日であり得る。
本開示は、短腸症候群を有する対象において血漿アルドステロン濃度を低下させるための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示は、短腸症候群を有する対象において血漿アルドステロン濃度を低下させる方法における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。本開示は、短腸症候群を有する対象において血漿アルドステロン濃度を低下させるための医薬の製造における使用のための本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物を提供し、ここで、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物は、少なくとも１つの治療有効量で対象に投与するためのものである。
一部の態様では、血漿アルドステロン濃度の低下は、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約１２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約１５００ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約１７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約２０００ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約２２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約２５００ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約２７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約３０００ｐｍｏｌ／Ｌであり得る。
前述の方法の一部の態様では、増加は、対照レベルと比較して、少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の増加であり得る。一部の態様では、対照レベルは、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物の投与前の量である。
前述の方法の一部の態様では、減少は、対照レベルと比較して、少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の減少であり得る。一部の態様では、対照レベルは、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物の投与前の量である。
一部の態様では、前述の方法によって列挙された増加又は減少は、本開示のＧＬＰ－２アナログペプチド組成物での治療の少なくとも約４週間後である。
一部の態様では、短腸症候群は、短腸症候群腸機能不全（ＳＢＳ－ＩＩ）であり得る。一部の態様では、短腸症候群は、短腸症候群腸不全であり得る。
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
例示的な実施形態
実施形態１。アプラグルチドのナトリウム塩を含む組成物であって、アプラグルチドのナトリウム塩は、９５％以上の純度を有し、アプラグルチドは、以下の構造を有する、組成物。
実施形態２。アプラグルチドのナトリウム塩は、９７％以上の純度を有する、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３。組成物は、３％以下のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド不純物を含む、実施形態１又は２に記載の組成物。
実施形態４。組成物中のアスパルチミド３アプラグルチド、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグ
ルチド及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物の合計は、２％以下である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５。組成物は、２％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６。組成物は、１．５％以下のβ－Ａｓｐ３アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７。組成物は、１％以下のβ－Ａｓｐ３アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８。組成物は、１％以下のＤ－Ｈｉｓアプラグルチド不純物を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９。組成物は、
１％以下のＡｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド不純物と、
１％以下のＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物と、
１％以下のＤ－アスパルチミド３アプラグルチド不純物と、
１％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物と、を含み、
組成物中のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド及びアスパルチミド３アプラグルチド不純物の合計は、１％以下である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０。アプラグルチドのナトリウム塩は、凍結乾燥粉末として提供される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１１。実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物を含む医薬組成物。
実施形態１２。グリシン、Ｌ－ヒスチジン及びマンニトールのうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態１１に記載の医薬組成物。
実施形態１３。医薬組成物は、
約１２．５ｍｇのアプラグルチド（ナトリウム塩）と、
約１．８８ｍｇのグリシンと、
約３．８８ｍｇのＬ－ヒスチジンと、
約５７．５ｍｇのマンニトールと、を含む、実施形態１０に記載の医薬組成物。
実施形態１４。医薬組成物は、凍結乾燥粉末として提供される、実施形態１２に記載の医薬組成物。
実施形態１５。実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物又は実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む２チャンバ粉末シリンジ。
実施形態１６。ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法であって、
ａ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を実施して、Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミド－メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上でＧＬＰ－２アナログペプチドを合成することと、
ｂ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水、及びアニソールを含む溶液で樹脂を処理するこ
とによって、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを樹脂から切断し、合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドの側鎖を脱保護することと、
ｃ）ステップ（ｂ）からの合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを、ＴＦＡ系移動相を使用して第１の分取逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製を実施することによって精製し、それにより、９０％以上の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドを含む溶液を生成することと、
ｄ）ＮａＨＣＯ３系移動相を使用して、第２のＲＰ－ＨＰＬＣ精製を実施することによって、ステップ（ｃ）の生成物を精製し、それにより、９７％以上の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドを含む溶液を生成することと、を含む、方法。
実施形態１７。
ｅ）ＮａＯＡｃ系移動相を使用して第３のＲＰ－ＨＰＬＣ精製を実施することによって、ステップ（ｄ）からの生成物を更に精製し、それにより、９７％以上の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドのナトリウム塩を含む溶液を生成することを更に含む、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８。
ｆ）水中０．１％ＡｃＯＨを使用して、ＧＬＰ－２アナログペプチドのナトリウム塩を含むｐＨ溶液を約ｐＨ７．９に調整することと、
ｇ）ステップ（ｆ）の生成物を、０．２μｍの孔径を有するフィルタに通すことと、
ｈ）ステップ（ｇ）の生成物を凍結乾燥し、それにより、９７％以上の純度を有するＧＬＰ－２アナログペプチドの凍結乾燥されたナトリウム塩を生成することと、を更に含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９。
ｃ）（ｉ）合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドの脱炭酸を、アンモニア緩衝液中に水及びアセトニトリルを含む溶液中にペプチドを可溶化することによって実施することを更に含む、実施形態１６に記載の方法。
実施形態２０。アンモニア緩衝液中に水及びアセトニトリルを含む溶液のｐＨは、約ｐＨ８．０に調整される、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１。ステップ（ａ）は、
ｉ）ＳＰＰＳが実施されるＭＢＨＡ樹脂を調製することと、
ｉｉ）初期Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施して、第１のＦｍｏｃ保護アミノ酸を樹脂に付加し、それによって樹脂上に保護ペプチドを形成することと、
ｉｉｉ）Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施して、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸を保護ペプチドに付加することと、
ｉｖ）ＧＬＰ－２アナログペプチドが樹脂上で合成されて、樹脂に連結されたＦｍｏｃ保護及び側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを生成するまで、ステップｉｉｉを繰り返すことと、
ｖ）Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施して、樹脂に連結された側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを生成することと、
ｖｉ）樹脂に連結された側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを乾燥させることと、を含む、実施形態１６～２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２。ステップ（ａ）（ｉ）は、
（ａ１）樹脂を、Ｎ２雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ－ジイソ
プロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含む溶液で、樹脂１グラム当たり５ｍＬの溶液で洗浄することと、
（ｂ１）ＤＭＦ中に２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、
ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ＤＩＥＡ、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む溶液中で、Ｒｉｎｋアミドリンカーを樹脂にカップリングさせることと、
（ｃ１）ステップ（ｂ１）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、
（ｄ１）樹脂を、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）及びＤＩＥＡをＤＭＦ中に含む溶液と接触させることによって還元反応を実施することと、
（ｅ１）ステップ（ｄ１）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３。Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施することは、
（ａ２）樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で処理することと、
（ｂ２）樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
（ｃ２）ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で樹脂を洗浄することと、
（ｄ２）樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸、並びにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（オキシマ）を含む第１の量の溶液と接触させることと、
（ｅ２）樹脂を、ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液と接触させることと、
（ｆ２）ステップ（ｅ２）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む、実施形態２１又は２２に記載の方法。
実施形態２４。樹脂を、樹脂を第１の量のＤＩＣ及びオキシマを含む溶液と接触させた約３０分後に、第２の量のＤＩＣ及びオキシマを含む溶液と接触させる、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５。Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施することは、
（ａ２）樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む溶液で処理することと、
（ｂ２）樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
（ｃ２）ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で樹脂を洗浄することと、
（ｄ２）樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸、並びにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（オキシマ）を含む第１の量の溶液と接触させることと、
（ｅ２）樹脂を、ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液と接触させることと、
（ｆ２）ステップ（ｅ２）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む、実施形態２１又は２２に記載の方法。
実施形態２６。樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む第１の量の溶液と１５分間接触させ、続いて樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む第２の量の溶液と３０分間接触させる、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７。少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－ＯＨである、実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２８。少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（Ｔｍｂ
）－ＯＨである、実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９。少なくとも１つの保護されたアミノ酸は、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨである、実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０。方法は、ステップ（ｅ２）と（ｆ２）との間に、カップリング試験を実施することを更に含み、カップリング試験は、カイザー試験である、実施形態２３～２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１。ＧＬＰ－２アナログペプチドは、アプラグルチドである、実施形態１６～３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２。実施形態１６～３１のいずれか１つに記載の方法を用いて製造されたＧＬＰ－２アナログペプチドを含む組成物。
実施形態３３。対象における短腸症候群関連腸不全（ＳＢＳ－ＩＦ）又は短腸症候群関連腸機能不全（ＳＢＳ－ＩＩ）を治療する方法であって、アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含み、
アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩は、対象が５０ｋｇ未満の体重を有する場合、約２．５ｍｇ／週の用量で投与され、又は
アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩は、対象が５０ｋｇ以上の体重を有する場合、約５ｍｇ／週の用量で投与される、方法。
実施形態３４。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩は、皮下注射によって投与される、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５。対象は、結腸連続性を有し、アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩は、約４８週間投与される、実施形態３３又は３４に記載の方法。
実施形態３６。対象は、５０％を超える結腸連続性を有する、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７。対象は、少なくとも１つのストーマを有し、アプラグルチドは、約２４週間投与される、実施形態３３又は３４に記載の方法。
実施形態３８。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象における食事摂取湿重量の腸吸収を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３９。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象における糞便排出を減少させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４０。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象における絶対尿排出量を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４１。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象におけるナトリウム及びカリウムの腸吸収を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４２。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象におけるナトリウム及びカリウムの尿排泄を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４３。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象におけるエネルギーの腸吸収を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４４。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象における糞便排出のエネルギー含量を減少させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４５。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象における炭水化物、タンパク質、及び脂質の腸吸収を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４６。アプラグルチド又はその薬学的に許容される塩の投与は、非治療又はプラセボ治療対象と比較して、対象におけるシトルリン濃度を増加させる、実施形態３３に記載の方法。
実施形態４７。９５％以上の純度を有するアプラグルチドのナトリウム塩であって、アプラグルチドは、以下の構造を有する、アプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態４８。アプラグルチドのナトリウム塩は、９７％以上の純度を有する、実施形態４７に記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態４９。アプラグルチドのナトリウム塩は、３％以下のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～４８のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５０。アプラグルチドのナトリウム塩中のアスパルチミド３アプラグルチド、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物の合計は、２％以下である、実施形態１～４９のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５１。アプラグルチドの組成物ナトリウム塩は、２％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５２。アプラグルチドのナトリウム塩は、１．５％以下のβ－Ａｓｐ３アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５３。アプラグルチドのナトリウム塩は、１％以下のβ－Ａｓｐ３アプラグルチド不純物を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５４。アプラグルチドのナトリウム塩は、１％以下のＤ－Ｈｉｓアプラグルチド不純物を含む、実施形態１～５３のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５５。アプラグルチドのナトリウム塩は、
１％以下のＡｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド不純物と、
１％以下のＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物と、
１％以下のＤ－アスパルチミド３アプラグルチド不純物と、
１％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物と、を含み、
アプラグルチドのナトリウム塩中のＤｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド及びアスパルチミド３アプラグルチド不純物の合計は、１％以下である、実施形態１～５４のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５６。アプラグルチドのナトリウム塩は、凍結乾燥粉末として提供される、実施形態１～５５のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩。
実施形態５７。実施形態１～５６のいずれか１つに記載のアプラグルチドのナトリウム塩を含む医薬組成物。
実施形態５８。グリシン、Ｌ－ヒスチジン及びマンニトールのうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
実施形態５９。医薬組成物は、
約１２．５ｍｇのアプラグルチド（ナトリウム塩）と、
約１．８８ｍｇのグリシンと、
約３．８８ｍｇのＬ－ヒスチジンと、
約５７．５ｍｇのマンニトールと、を含む、実施形態５８に記載の医薬組成物。
実施形態６０。医薬組成物は、凍結乾燥粉末として提供される、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６１。実施形態４７～５６のいずれか１つに記載の組成物又は実施形態５７～６０のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む２チャンバ粉末シリンジ。
実施例
以下の実施例は、本明細書中に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの記載を当業者に提供するために提示され、単に本発明の例示であることを意図するものであり、本発明とみなされる範囲を限定することは意図しない。
実施例１：アプラグルチド製造プロセス（Ｉ）
固相ペプチド合成（ステップ１）
以下は、以前に説明された合成経路（例えば、米国特許第８，５８０，９１８号）と比較して改善された純度レベルでアプラグルチドを製造するための本開示の例示的な方法である。ＳＰＰＳは、以下のステップを含むサイクルの反復による、固体支持体上に固定されたペプチド鎖の逐次合成である。
１．ペプチド樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去
２．ＤＭＦ洗浄
３．Ｆｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨのカップリング
４．カップリング試験
５．ＤＭＦ洗浄
このサイクルは、ペプチド配列が完了するまで繰り返される。
アミノ酸のα－アミノ基は、塩基感受性９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護される。側鎖官能基は酸不安定基で保護されている。本プロセスで使用される全てのアミノ酸誘導体は市販されている。
ＳＰＰＳは、固体支持体上に固定されたペプチド鎖の逐次合成である。合成では、ＭＢＨＡ樹脂を用いてペプチド配列を組み立てることができる。樹脂を膨潤させ、ＤＭＦで洗浄し、次いで、窒素雰囲気下、ＤＭＦ／ＤＩＥＡで洗浄した後、Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミドリンカーを、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＨＯＢｔを使用してカップリングさせることができる。カップリング後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、次いでＡｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡを使用してアセチル化することができる。カイザー試験を実施して、カップリングの完了を確認することができる。
樹脂をＤＭＦで洗浄した後、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸をそれぞれ以下のサイクルに従って樹脂結合ペプチドにカップリングさせる。
１．Ｆｍｏｃ－保護基をＤＭＦ中のピペリジンで除去し、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄する。
２．カップリングは、活性化のためにＤＩＣ／オキシマを使用して、可変アミノ酸当量を用いてＤＭＦ中で実施する。
３．アミノ酸のカップリングは、各合成サイクル中に実施されるニンヒドリンアッセイを使用することによってモニタされる。
組み立ての最後に、最後のアミノ酸をカップリングし、脱保護した後、樹脂をＤＭＦ及びイソプロパノールで洗浄し、真空下で乾燥させる。
樹脂からのペプチドの切断及び脱保護（ステップ２）
保護されたペプチドは、ＴＦＡ／水／アニソールの混合物で処理することによって、同時に樹脂から切断し、脱保護することができる。続いて、ＭＴＢＥをペプチド／ＴＦＡスラリーに添加して、切断された樹脂の存在下で粗ペプチドを沈殿させる。得られた粗ペプ
チドを濾過し、ＭＴＢＥで洗浄し、真空下で一定重量まで乾燥させる。
脱炭酸反応（ステップ３ａ）
粗ペプチドを、アンモニア緩衝液中のＨ２Ｏ／ＡＣＮ（８０：２０比）の混合物中に可溶化する。Ｈ２Ｏ中の２５％ＮＨ４ＯＨを使用して、溶液を標的ｐＨ≧７に調整する。脱炭酸反応を室温で２４時間維持する。粗ペプチドを、約ｐＨ１０のアンモニア緩衝液中のＨ２Ｏ／ＡＣＮ（８０：２０比）の溶液で洗浄し、室温で保存する。
分取ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製（ステップ３ｂ）
粗ペプチドを水／アセトニトリル／ＮＨ４ＯＨの混合物に溶解する。この溶液を酢酸で希釈し、次いで濾過する。
一次精製は、溶出液としてＮａＨＣＯ３／Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮを用いる分取ＲＰ－ＨＰＬＣで実施する。カラムからの溶出をＵＶでモニタし、得られた画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析する。モニタリング基準を満たす画分を、合わせたプール中で混合する。モニタリング基準を満たさない画分は、精製ステップを繰り返すことによってリサイクルされ得る。プールの純度を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより制御する。
分取ＲＰ－ＨＰＬＣによるナトリウム塩の変換（ステップ４）
このステップは、ｐＨ変化を介してペプチドの対イオンをＴＦＡアニオンからナトリウムカチオンに交換し、ペプチドを更に精製するために実施され得る。ステップ３からの合わせたプールを水で希釈し、ＮａＯＡｃ溶出液を使用する分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって再精製する。
続いて、精製されたペプチド溶液を真空下での蒸発に供して、溶液中のアセトニトリルを減少させる。次いで、精製されたペプチド溶液を、０．１％ＡｃＯＨを使用して標的ｐＨ７．９に調整する。
純粋なプールを濃縮し、凍結乾燥することができる。プールの純度をＲＰ－ＨＰＬＣにより分析する。
凍結乾燥及びパッケージング（ステップ５）
凍結乾燥の前に、溶液中の精製されたペプチドを、０．２μｍ膜を通して濾過する。凍結乾燥は低圧で行われる。得られた凍結乾燥最終ペプチドをアルゴン下で充填する。凍結乾燥アプラグルチドをアプラグルチド規格に従って制御する。
再処理
アプラグルチド規格で確立された基準を満たさない凍結乾燥アプラグルチドは、再精製に供することができる。
再精製は、上記のように、精製ステップ及び対イオン変換ステップを繰り返すことによって、ペプチドの再構成後に実施され得る。
再精製後、この物質を上記の手順に従って凍結乾燥する。
アプラグルチド規格において確立された基準を満たさない凍結乾燥アプラグルチドは、再凍結乾燥に供され得る。
再凍結乾燥は、上記のように、凍結乾燥ステップを繰り返すことによって、ペプチドの再構成後に実施され得る。
不純物
本開示の方法の一部の態様では、アプラグルチドは、製造プロセスで使用される試薬及び物質（副生成物を含む）の残留物を含むがこれらに限定されない有機不純物を実質的に含まない。
本開示の方法の一部の態様では、アプラグルチドは、非ペプチド不純物を実質的に含まない。
本開示の方法の一部の態様では、アプラグルチドは、残留溶媒を実質的に含まない。
Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド、アスパルチミド３アプラグルチド、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド、Ｄｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド、及び［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチドを含むがこれらに限定されないペプチド不純物が、アプラグルチド組成物中で観察され得る。
注射用アプラグルチドは、長期保存条件（５℃±３℃）で保存される凍結乾燥粉末であってもよい。本明細書で提供される安定性の結果（表５）は、長期保存条件で分解が観察されなかったことを実証するものである。
非経腸アプラグルチド組成物に必要とされるように、アプラグルチド組成物の製造、パッケージング、保存及び流通後の微生物の質を確実にするために、細菌エンドトキシンの試験が好ましい場合がある。試験はＰｈＥｕｒ．２．６．１４／ＵＳＰ＜８５＞に従って行われる。
生成物の化学的特性
本開示の化合物は、天然のＧＬＰ－２に匹敵する効力及び選択性を有するＧＬＰ－２受容体の選択的な完全アゴニストとして作用する、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の３３アミノ酸の合成ペプチド類似体である。
本開示のペプチドは、直鎖状ペプチドである。ペプチドの配列は、１つのＤ立体異性体アミノ酸（Ｄ－フェニルアラニン）、１つの非天然アミノ酸（ノルロイシン）及び２つのアキラルアミノ酸（グリシン）を含有する。他の全てのアミノ酸はＬ－配置である。本開示のペプチドは、規定されたキラリティーの全ての立体中心を有する単一のエナンチオマーとして合成される。それは、天然成分としてのいくらかの残留水とともにそのナトリウム塩形態で単離され得る。
開示されたペプチドの外観は、白色からオフホワイトの均質な粉末である。これは、逆相クロマトグラフィ精製によって単離し、続いて凍結乾燥することができる。結晶形態又は多形形態は知られていない。
精製水中の開示されたペプチドの溶解度は、１００ｍｇ／ｍＬより大きい。
１００ｍｇ／ｍＬの開示されたペプチドの水溶液のｐＨは、７．６～８．４である。計算された等電点は４．３ａである。
アプラグルチドの最適な溶解性及び化学的安定度は、ｐＨ８．０～８．５で観察された。
プロセス内管理
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定される精製されたペプチドプールの純度は、９５％、９７％又は９９％より大きい。一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定される精製されたペプチドプールの純度は、９５％より大きい。
一部の態様では、表４に提示されるプロセス内対照は、本開示の方法において使用することができる。一部の態様では、表４に示されるプロセス内対照は、表４の「合格基準」の列に示される純度を有することができる。
本実施例で説明する製造プロセスは、本明細書ではプロセスＡと称される。表２ａは、プロセスＡを使用して生成されたアプラグルチド生成物の純度、並びに主要な汚染物質のレベルを示す。表２ａ及び表２ｂに示すように、プロセスＡは、９５％以上の純度及び低レベルの汚染物質を有するアプラグルチドを得ることができる。更に、プロセスＡは、１５％～２２％の範囲の生成物収率を示す。
実施例２：インビトロＧＬＰ－２アゴニスト活性の測定
ｈＧＬＰ－２受容体に対する本開示のＧＬＰ－２アゴニストの活性を決定するために、転写レポーター遺伝子アッセイを使用する。２つの構築物、すなわちｈＧＬＰ－２受容体発現ＤＮＡ構築物及びホタルルシフェラーゼの発現を調節する細胞内ｃＡＭＰ応答性プロモーターエレメントを含有するレポーターＤＮＡ構築物を、ヒト胚腎臓細胞株（human embryonic kidney cell line、ＨＥＫ－２９３）に一過性にトランスフェクトする。（例えば、このアッセイの詳細についてＨｉｍｍＬｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｒｅｓ．，（１９９３），１３，７９－７４を参照されたい。）
細胞を、１用量当たり半対数希釈した化合物の連続希釈物に５時間曝露する。化合物に曝露した後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定し、化合物の有効性及びＥＣ５０値を非線形回帰分析によって測定する。天然の３３アミノ酸ペプチドリガンドであるｈＧＬＰ－２を、各実験の内部対照として使用する。
実施例３：配合物
皮下注射に適した配合物を生成するために、アプラグルチドを無菌的に製造し、医薬賦形剤であるグリシン、Ｌ－ヒスチジン、及びマンニトールとともに凍結乾燥して粉末にする。凍結乾燥粉末は、注射のために滅菌水又は緩衝液で再構成される。
凍結乾燥配合物を開発するために、液相中のアプラグルチドの所望の物理的安定度を達成するための最適な増量剤及び賦形剤を評価するスクリーニング試験を行った。増量剤スクロース及びマンニトールの初期検査により、両方が、凍結乾燥プロセスに、並びに再構成時間、含水量及び凍結乾燥生成物の目視検査に関して適切であることが実証された。安定剤と２つの増量剤、スクロース及びマンニトールとの濃度及び組み合わせの効果を調べた。グリシン及びＴｒｉｓを、２０Ｍｍ（グリシンについて１．５０ｍｇ／ｍＬ及びＴｒｉｓについて２．４ｍｇ／ｍＬ）及び４０ｍＭ（グリシンについて３．０ｍｇ／ｍＬ及び
Ｔｒｉｓについて４．８ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ８．２～８．５の濃度で緩衝剤として試験した。全ての配合物を、２０ｍＭ（３．１０ｍｇ／ｍＬ）濃度のＬ－ヒスチジンの存在下又は非存在下で、増量剤としてマンニトール又はスクロースのいずれかを用いて試験した。合計１１の配合物を、要因計画を用いて調製した。配合物をオービティングテーブル上に置き、４０℃の加速温度で３日間、物理的負荷をかけた。配合物の物理的安定性を、サイズ排除クロマトグラフィ、光学密度及び粘度によって評価した。アプラグルチドの化学的安定度を、逆相液体クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによって評価した。ヒスチジンと組み合わせてグリシンを含有する配合物の化学的及び物理的安定性は、Ｔｒｉｓ緩衝液を含有する配合物よりも優れていた。マンニトール及びスクロースは両方とも増量剤として適していた。しかしながら、凍結乾燥中のより良好な加工性のために、マンニトールを選択した。
グリシン濃度の効果はスクリーニング試験から結論付けることができなかったので、実験室規模の安定性試験を、それぞれ２０Ｍｍ（１．５０ｍｇ／ｍＬ）及び４０Ｍｍ（３．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度でグリシンを含有する２つの配合物を用いて設定した。両配合物は、Ｌ－ヒスチジン、マンニトール、アプラグルチドを含有し、ｐＨを８．３に調整した。配合物を凍結乾燥し、－２０℃、５℃、２５℃及び４０℃で３ヶ月間追跡した。結論として、－２０℃、５℃、及び２５℃で、両方の配合物が３ヶ月の試験期間を通して化学的及び物理的に安定であった。４０℃では、両方の配合物が、３ヶ月で物理的安定性の低下の徴候を示した。より低い濃度の２０ｍＭグリシンを含有する配合物は、Ｘ線粉末回折によって評価した場合、マンニトールの好ましいより高い結晶化度を有していた。したがって、２０ｍＭグリシンを配合物のために選択した。
実施例４：アプラグルチド効果のマーカーとしてのシトルリン
血漿中シトルリンを薬力学的（pharmacodynamic、「ＰＤ」）マーカーとして使用して
、アプラグルチドの効果を説明した。薬物動態（「ＰＫ」）モデル開発と同様に、ＰＫ／ＰＤモデルは、試験ＧＬＹ－１０１－２０１５及びＴＡ７９９－００２のみからの健康な個体について開発された。ＰＤモデルの開発のために、ＰＤ観察を、その構造、残差－、共変量－及びランダム効果－モデルを有する最終ＰＫモデルを使用して、ＰＫ観察とともに適合させた。出発モデルは、血漿シトルリンが合成速度ｋｓｙｎ及び分解速度ｋｄｅｇで絶えず合成及び分解される代謝回転モデルであった。血漿中アプラグルチドは、ベースラインのシトルリンレベルＲ０とのシグモイドＥｍａｘ関係、濃度ＥＣ５０での半最大効果、最大効果Ｅｍａｘ、及びヒル係数ガンマを介してシトルリン合成を刺激した。シトルリン代謝回転は、シトルリン合成がシトルリンベースライン及び分解によってのみ決定されるような定常状態にあると仮定した。血漿中アプラグルチドの集団ＰＫ／ＰＤは、健常ボランティアにおける２つの試験及び２．５～５０ｍｇ ＳＣの用量を試験したＳＢＳ患者を用いた２つの試験からのデータを用いて確立された。アプラグルチドの濃度は、２コンパートメント及び用量非線形動態による。アプラグルチドクリアランスは１６．８Ｌ／日と推定され、５ｍｇのＳＣ投薬を受けた７０ｋｇの個体についての分布の中心容積は３１．５Ｌであった。半減期は１．３日と推定された。分布容積及びクリアランスは、係数βＶ１／Ｆ，ＢＷ＝１．９４、及びβＣｌ／Ｆ，ＢＷ＝１．８で体重依存性であった。これらの係数は、強い体重依存性を示した。０次吸収持続時間は、βＴｋ０，Ｄｏｓｅ＝０．２４９の係数で用量に依存した。
血漿中シトルリンに対する血漿中アプラグルチドの効果はＳ字状であることが見出され、シトルリン飽和が５ｍｇの用量で現れた。この現象は、その合成がアプラグルチドによってＥｍａｘモデルに従って刺激されたシトルリン代謝回転モデルを用いて説明された。シトルリンベースラインは５．１２μｇ／ｍＬであることが見出され、一方、最大効果は０．６２６であり、半最大有効アプラグルチド濃度は１３．７ｎｇ／ｍＬであった。
集団ＰＫ／ＰＤモデルを使用して、２．５、５、又は１０ｍｇのＳＣの週１回用量を受けている４０～１２０ｋｇの体重を有する個体について、個体間変動を伴う及び伴わない、血漿中アプラグルチド曝露及び血漿中シトルリントラフ濃度－時間プロファイルを予測した。個体間変動のない予測は、シトルリンに対するアプラグルチドの効果が、毎週５ｍｇのアプラグルチドＳＣを受けている４０ｋｇの個体について飽和し始めること、すなわち、体重が減少するにつれて、同じアプラグルチド用量がシトルリンに対する減少効果をもたらしたことを示した。この飽和効果は、毎週１０ｍｇのアプラグルチドＳＣを受けている個体について更により顕著であることが見出された。個体間変動性を有する予測は、血漿シトルリン濃度－時間プロファイル及び血漿シトルリントラフレベルにおいて大きな変動性を示した。４０～１２０ｋｇの体重及び２．５、５、又は１０ｍｇのアプラグルチドＳＣ投薬についてのアプラグルチド曝露を、ＳＢＳ患者の事後曝露推定値と比較した。２．５～５ｍｇの用量の間の体重５０ｋｇでのブラケティングをシミュレートした。このブラケティング変形は、毎週５ｍｇのアプラグルチドＳＣを受けているＳＢＳ患者の事後ＡＵＣ推定値の範囲内のアプラグルチド曝露をもたらした。臨床バイオマーカーとして、尿排出を、ＳＢＳ患者における血漿中アプラグルチド曝露及び血漿中シトルリントラフレベルの事後推定値と相関させた。アプラグルチド曝露及びシトルリントラフレベルは、尿排出と弱く相関するのみであることが見出された。
腸細胞量のバイオマーカーである血漿シトルリンは、ヒト臨床試験においてＧＬＰ－２類似体投与後に増加する。
短腸症候群のために開発中の新規な長時間作用型ＧＬＰ－２類似体であるアプラグルチドとシトルリンとの間の薬物動態／薬力学（pharmacokinetic/pharmacodynamic、ＰＫ／
ＰＤ）関係を、無作為化、二重盲検、並行群、プラセボ対照、複数用量試験で評価した。２３人の健康な成人ボランティアは、アプラグルチド（１、５、又は１０ｍｇ）又はプラセボの６回の週１回の皮下投薬を受け、最後の投薬後更に６週間追跡された。血液採取を、食事、生活様式、及び日周効果について管理した。Ｌ－シトルリンを、有効なＬＣ－ＭＳ法を用いて定量した。ＰＫデータは非コンパートメント解析を受け、ＰＤデータはＡＮＣＯＶＡによって解析された。
ＰＫパラメータは、７２時間の半減期を示した。シトルリンの増加は、１回目のアプラグルチド投薬の２日後に観察され、最大効果は、ほとんどの対象において４又は７日後に達成された。平均シトルリンレベルは、全てのアプラグルチドアームにおいてベースラインから上昇し、６週間の治療期間中、上昇したままであった。シトルリンの増加は、プラセボに対してアプラグルチド１ｍｇよりもアプラグルチド５ｍｇ及び１０ｍｇで有意に大きかった（表５）。５ｍｇと１０ｍｇとのアプラグルチド用量レベルの間に統計的に有意な差はなかった。血漿中シトルリンレベルは、最後のアプラグルチド投薬後１０～１７日間上昇したままであった。アプラグルチドは安全であり、忍容性良好であり、重篤なＡＥはなかった。
アプラグルチドは安全で忍容性良好であり、血漿中曝露よりも長いＰＤ応答を示した。これらのＰＫ及びＰＤデータは、アプラグルチドの週１回の皮下投薬の可能性を確認するものである。
実施例５：本開示のアプラグルチド組成物の投与の第２相ヒト臨床試験結果
以下の非限定的な実施例では、ＳＢＳ－ＩＦを有する対象を本開示のアプラグルチド配合物で治療した第２相臨床試験からの結果を説明する。この第２相試験は、ＳＢＳ－ＩＦを有する患者における５及び１０ｍｇのアプラグルチドの安全及び有効性を調査した。
理論に束縛されることを望むものではないが、ＳＢＳ患者におけるＧＬＰ－２類似体の有益な効果には、治療結果を評価する際に考慮され得る体液恒常性の動的変化が含まれ得る。腸吸収が改善されると、糞便排出が減少する。腸で吸収された大量の水及びナトリウムは、体循環を通して腎臓によって排泄されるので、ＳＢＳ患者における吸収の増加は、尿量生産及びナトリウム排泄の増加をもたらし得る。したがって、概して、ＳＢＳ患者の水分補給状態は、尿量及び尿中ナトリウムを測定することによって監視することができる。
ＳＢＳ－ＩＦを有する８人の成人患者を、表６に従って本開示のアプラグルチド組成物で治療した。簡潔には、ＳＢＳ－ＩＦを有する患者に、５ｍｇの本開示のアプラグルチド又はプラセボを週１回、４週間投与した。次いで、患者に本開示のアプラグルチド１０ｍｇを週１回、４週間投与した。更に、治療の間に６～１０週間の休薬期間を設けた。
結果
試験の一部として、合計１２人の患者をスクリーニングし、そのうち８人を治療のために無作為化した。８人の患者全員が、追加の治療期間において、１０ｍｇのアプラグルチド（パートＢ）を用いた非盲検レジメンを継続した。１人の患者は、試験手順から疲労し、効果が得られなかったため、パートＢ治療期間における１回目の薬物投与後に試験を中止した。患者は、治療後ではなく、即時測定のためのデータを提供した。８人の患者が、安全性分析セット及び完全分析セットを構成した。患者の人口統計及びベースライン特性を表７に要約する。表７のデータは、平均（ＳＤ）又はＮ（％）であり、非経口支援（ＰＳ）は、週平均に基づいて試験開始時に予定されたＰＳであった。
３人の患者は、臨床試験においてＧＬＰ－２類似体で以前に治療されていた（６ヶ月以上前）。個々の患者のプロットは、ウォッシュアウト期間後に全ての効果がベースラインに戻ったことを示した。したがって、キャリーオーバー効果は観察されなかった。
安全性結果
一般的な関連有害事象を表８に報告する（データはＮ又はＮ（％）である）。２人を超える患者で発生した有害事象には、多尿（ｎ＝７）、ストーマ合併症（ｎ＝６）、消化管ストーマ合併症（ｎ＝５）、消化管ストーマ排出の減少（ｎ＝６）、消化管ストーマ排出の異常（ｎ＝５）、口渇の減少（ｎ＝５）、浮腫（ｎ＝４）、体重増加（ｎ＝３）、及び食欲不振（ｎ＝３）が含まれた。３人の患者が注射部位反応を経験した。全ての注射部位反応は、積極的治療で起こった。５ｍｇ用量群では１人の患者が注射部位反応を有し、１０ｍｇ用量群では３人の患者が注射部位反応を有した。重篤な有害事象の合計８症例が５人の患者によって報告された。これらのいずれも、試験薬物に関連するとは考えられなかった。２つの重篤な有害事象は、ＰＳ投与のために患者によって使用されたトンネル式中心静脈カテーテルに関連する機械的合併症を伴い、両方ともカテーテル交換のための入院を必要とした。６つの重篤な有害事象は、カテーテル関連血流感染（ＣＲＢＳＩ）であった。１人の患者は、ＣＲＢＳＩの４回の再発事象を有した。重篤な有害事象は、プラセボ期間と治療期間との間で等しく分布した。ほとんどの患者は少なくとも１つの治療関連有害事象を有し、その全てが軽度から中程度であり、活性用量レベル間に明らかな差はなかった。
関連する有害事象による試験の中止又は減少はなかった。１人の患者は、末梢浮腫のために、プラセボ期間中にアプラグルチドの３回目の投薬を省略した。バイタルサイン、血液試料、ＥＣＧ、尿試験紙検尿又は体重から安全性の懸念は生じなかった。死亡はなかった。
３人の患者が、試験中に抗アプラグルチド抗体を発現した。２人の患者は、５ｍｇの治療期間の終わりに抗アプラグルチド抗体について陽性であり、１人の患者は１０ｍｇの治療期間の終わりに陽性であった。５ｍｇ治療期間の終了時に陽性抗体を有していた１人の患者は、１０ｍｇ治療期間の終了時にも陽性抗体を有していた。５ｍｇ治療期間中に陽性抗体を発現した２人の患者については、６～１０週間のウォッシュアウト期間後に陰性であった。１０ｍｇ治療の終了時に陽性抗体を有する２人の患者については、両方とも４～６週間のウォッシュアウト期間後も依然として陽性であったが、力価は１０ｍｇ治療期間の終了時よりも低かった。ＰＫプロファイル、アプラグルチドに対する薬力学的応答、又は有害事象の数若しくは期間に対して、抗アプラグルチド抗体の効果は検出されなかった。
尿排出量及び尿中ナトリウム排泄：ベースラインから治療終了（２７～２９日目）までの変化
絶対尿排出量におけるベースラインから各治療の終了までの個々の変化を、各治療についての平均変化を含めて、図５にプロットする。平均変化は、治療をプラセボと比較する統計分析において計算された調整平均とは異なっていた。パートＡ＋Ｂの統計的分析のために、表９に示すように、５ｍｇのアプラグルチドは、プラセボと比較して調整平均７１１ｍＬ／日（９５％ＣＩ １３２～１，２８９；Ｐ＝．０２１）だけ絶対尿排出量の増加を促進し、これは４８％の１日の増加（９５％ＣＩ １２～８４；Ｐ＝．０１４）に相当する。パートＡの統計的分析のために、表１０に示すように、５ｍｇのアプラグルチドは、調整平均７１４ｍＬ／日（９５％ＣＩ ４９０～９３９；Ｐ＝．００２）だけ絶対尿排出量の増加を促進し、これは４９％の１日増加（９５％ＣＩ ４～９４；Ｐ＝．０４１）に相当する。１０ｍｇのアプラグルチドによる治療は、プラセボと比較して、絶対尿排出量の増加を７９５ｍＬの調整平均（９５％ＣＩ １９５～１，３９４；Ｐ＝．０１４）だけ促進した。相対尿産生の対応する変化は３４％（９５％ＣＩ－４～７１；Ｐ＝．０７２）であった。表９に示すように、５ｍｇ用量群と１０ｍｇ用量群との間に差は見られなかった。表９において、データは、調整平均（９５％ＣＩ）として示され、計算は、ベースラインから個々の用量群の治療の終了又は治療の終了近くまでの変化に基づき、Ｎは、完全な分析セットにおける患者の数を示す。パートＡ＋Ｂの統計分析からの結果を図６にグラフで示す。
絶対尿中ナトリウム排泄におけるベースラインから各治療の終了までの個々の変化を図７にプロットする。パートＡ＋Ｂの統計的分析のために、表９に示すように、５ｍｇのアプラグルチドは、プラセボと比較して、尿中ナトリウム排泄を５６ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ－１０～１２３；Ｐ＝．０８７）の調整平均だけ増加させた。パートＡの統計的分析について、５ｍｇのアプラグルチドは、表１０に示すように、プラセボと比較して尿中ナトリウム排泄を６６ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ－６９～２０１；Ｐ＝．１７１）の調整平均だけ増加させた。表１０において、データは、調整平均（９５％ＣＩ）として示され、計算は、ベースラインから個々の用量群の治療の終了までの変化に基づき、Ｎは、完全な分析セットにおける患者の数を示す。１０ｍｇ用量群では、表９に示すように、プラセボと比較して絶対尿中ナトリウム排泄は、８８ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ ２０～１５６；Ｐ＝．０１７）の調整平均だけ増加した。表９及び１０に示すように、相対的な尿中ナトリウム排泄は、アプラグルチド処理後に変化しなかった。表９に更に示すように、５ｍｇ用量群と１０ｍｇ用量群との間に差異は見出されなかった。
尿排出量及び尿中ナトリウム排泄：ベースラインから１回目の治療注射の直後（１～３日目）までの変化
絶対尿排出及び尿中ナトリウム排泄におけるベースラインから１回目の治療注射直後までの個体の変化を、それぞれ図８及び図９にプロットして示す。表１１に示すように、プラセボと比較して５ｍｇ又は１０ｍｇの用量群では即時の変化は観察されず、活性用量群
間に差はなかった。表１１において、データは、調整平均（９５％ＣＩ）として示され、計算は、ベースラインから個々の用量群の１回目の治療注射の直後までの変化に基づき、Ｎは、完全な分析セットにおける患者の数を示す。
経口輸液摂取：ベースラインから治療の終了近く（２０～２２日目）までの変化
２０～２２日目に、１０ｍｇのアプラグルチドでの治療は、絶対及び相対経口輸液摂取を、それぞれ３６３ｍＬ／日（９５％ＣＩ－６４１～－８６；Ｐ＝．０１５）及び－１５％（９５％ＣＩ－２５～－５；Ｐ＝．００６）の調整平均だけ減少させた。パートＡ＋Ｂの分析では、表９に示すように、２４４ｍＬ／日（９５％ＣＩ－５１２～２３；Ｐ＝．０７０）の調整平均減少を有する５ｍｇ用量群について、及び表１０に示されるように、２４２ｍＬ／日（９５％ＣＩ－５６０～７６；Ｐ＝．１０３）の平均減少を有するパートＡの分析について見られた。更に、表９に示すように、活性用量群の間に差異は見出されなかった。
ＰＳ体積：ベースラインから治療の終わり近く（２０～２２日目）までの変化
２０～２２日目に、１０ｍｇのアプラグルチドは、プラセボと比較して、相対的な毎日のＰＳ量を－２８％（－５１～－４；Ｐ＝．０２５）減少させた。同様の傾向が、表９に示すように、４６９ｍＬ／日（－９４１～４；Ｐ＝．０５２）減少した毎日のＰＳ量の絶対変化について見られた。表９及び１０に示すように、５ｍｇ用量群についてＰＳ体積の変化は観察されず、表９に示すように、５ｍｇ用量群と１０ｍｇ用量群との間に差異は見られなかった。
流体複合効果：ベースラインから治療の終了近く（２０～２２日目）までの変化
パートＡ＋Ｂについての事後分析を実施して、尿産生の増加（２７～２９日目）、ＰＳ体積の減少、及び自発的な経口輸液摂取の減少（２０～２２日目）の合計として定義される液体複合効果を計算した。自発的な経口輸液摂取及びＰＳ体積減少は、尿採取の間変化しないままであったので、治療期間の終わり近くに評価した。５ｍｇ及び１０ｍｇのアプラグルチドの投与は、プラセボと比較して流体複合効果をそれぞれ１，０３６ｍＬ／日（９５％ＣＩ ２６２～１，８１０；Ｐ＝．０１４）及び１，６３０ｍＬ／日（９５％ＣＩ
８２７～２，４３３；Ｐ＝．００１）増加させた。２つの用量の間に差はなく、推定差は５９４（９５％ＣＩ－２０７～１，３９６；Ｐ＝．１２９）であった。流体複合効果の個々のプロットを、治療終了時の尿排出量とともに図１０Ａ～図１０Ｃに示す。
水和状態パラメータ
パートＡ＋Ｂアプラグルチドの事後分析において、５ｍｇ及び１０ｍｇは血漿中アルドステロンをそれぞれ２，８９４ｐｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ－６２４７～４５８；Ｐ＝．０８３）及び３，０４５ｐｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ－６，４６０～３７０；Ｐ＝．０７５）減少させた。アプラグルチドは、表１２に示すように、クレアチニン、尿、ヘマトクリット、アルブミン、蛋白及びＣＯ２合計を含む他の水和パラメータを変化させなかった。表１２において、データは、調整平均（９５％ＣＩ）として示され、計算は、ベースライン
から個々の用量群の治療の終了までの変化に基づき、Ｎは、完全な分析セットにおける患者の数を示す。
血漿中Ｌ－シトルリン
パートＡ＋Ｂの統計解析において、５ｍｇのアプラグルチドは、絶対血漿中Ｌ－シトルリンを１７．６μｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ ２．０～３３．２；Ｐ＝．０３１）の調整平均だけ増加させ、これは、６５％の増加（９５％ＣＩ １５～１１５；Ｐ＝．０１５）に相当する。パートＡの統計的分析において、５ｍｇのアプラグルチドは、絶対血漿中Ｌ－シトルリンを１７．７μｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ－６．３～４１．７；Ｐ＝．１００）の調整平均だけ増加させ、これは、６６％の相対的増加（９５％ＣＩ－１３～１４５；Ｐ＝．０７７）に相当する。１０ｍｇ用量対プラセボについてのベースラインからの変化の差は、表１３に示されるようにより小さかった。表１３において、データは、調整平均（９５％ＣＩ）として示され、計算は、ベースラインから個々の用量群の治療の終了までの変化に基づき、Ｎは、完全な分析セットにおける患者の数を示す。血漿中Ｌ－シトルリンの絶対濃度におけるベースラインからの個々の変化を図１１にプロットする。ベースラインからの平均変化及び個々の患者の血漿中Ｌ－シトルリン変化を図２７にプロットする。１回目の投薬の２日後に開始して、血漿シトルリンレベルの用量依存的増加がアプラグルチドで観察された。図２８に示すように、プラセボと比較して、アプラグルチドの３回の週１回投薬後、シトルリンレベルは有意に増加した。
体重及び身体組成
パートＡ＋Ｂの分析では、５ｍｇのアプラグルチドは、絶対及び相対脂肪量をそれぞれ
１．７７ｋｇ（９５％ＣＩ ０．２９～３．２４；Ｐ＝．０２４）及び１０％（９５％ １～１８；Ｐ＝０．０３５）だけ有意に増加させた。脂肪量の増加に対応して、５ｍｇのアプラグルチドは体重を１．９ｋｇ増加させた（９５％ＣＩ ０．１～３．７；Ｐ＝．０４３）。プラセボと比較して、いずれの用量群についても除脂肪体重又は骨塩量に変化は見られなかった。パートＡの統計的分析では、表１４に示すように、５ｍｇアプラグルチドについて脂肪量及び体重の増加傾向が観察された。表１４において、データは、調整平均（９５％ＣＩ）として示され、計算は、ベースラインから個々の用量群の治療の終了までの変化に基づき、Ｎは、完全な分析セットにおける患者の数を示す。
薬物動態
アプラグルチドの血漿中濃度は投薬後に増加し、最大平均濃度は投薬の７２時間後に測定された。２回目の投薬前のアプラグルチドの平均血漿中濃度（Ｃｔｒｏｕｇｈ）は、５ｍｇ及び１０ｍｇの治療期間でそれぞれ４．５ｎｇ／ｍＬ及び８．９ｎｇ／ｍＬであった。
実施例５のまとめ
実施例５に記載される結果は、本開示のアプラグルチド組成物の対象への投与が、安全であり、忍容性良好であり、腸液吸収における有益な変化（尿量の増加が挙げられるが、これに限定されない）を誘導したことを実証するものである。
治療に関連する有害事象は軽度から中程度であり、ＧＬＰ－２の生理学的効果に対応していた。有害事象についての用量依存性はなかった。注射部位反応はわずかであり、週に１回の投薬レジメンを反映していた。治療に関連する腹痛又は腹部膨満の事象はなかった。
週に１回の５及び１０ｍｇのアプラグルチド用量での治療は、プラセボと比較した場合、尿排出量を増加させた。１０ｍｇのアプラグルチドは、治療の終わりに尿中ナトリウム排出を有意に増加させ、経口輸液摂取並びにＰＳ量を減少させた（治療の終わり近くに評価した）。同様の傾向が、尿中ナトリウム排出及び経口輸液摂取について５ｍｇ用量で見られた。
全体として、これらの尿量の増加は、腸液及びナトリウム吸収の増加を反映する。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、脱水、ナトリウム枯渇及び腎機能障害のリスクが高いＳＢＳ患者にとって重要な効果である。体液及び電解質異常はまた、罹患率及び入院の原因であり得る。
４週間という比較的短い治療期間のために、体液貯留の臨床的徴候があった場合には、
ＰＳ体積の減少を行った。長期アプラグルチド治療の間、尿排出の増加は、より大きな流体複合効果によっても証明されるように、ＰＳ容量の更なる減少を可能にし得ることが想定される。５ｍｇのアプラグルチドでの治療は、プラセボと比較して８人の患者のうち６人において相対尿排出量を増加させ、ＰＳ量の減少を誘発したであろう１０％の増加を超えた。
Ｌ－シトルリンの血漿濃度は、両方の積極的治療期間中に増加した。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、腸細胞量の増加を示し、腸上皮に対するアプラグルチドの腸栄養性効果と一致する。５ｍｇ治療期間において尿排出の臨床的に有意な増加（２７～２９日目に評価）を有した２人の患者において、１０ｍｇの減少した効果が観察された。しかしながら、これらの患者は、１０ｍｇの治療期間の間にＰＳ体積及び経口輸液摂取（２０～２２日目に評価）の付随する減少を有し、尿産生の増加、ＰＳ体積の必要性の減少及び経口輸液摂取の減少を含む有益な効果の合計として定義される、正の液体複合効果をもたらした。
当業者によって理解されるように、ＳＢＳを有する患者は、過剰な糞便中ナトリウム損失及び慢性的なナトリウム枯渇に起因して、二次性高アルドステロン症に罹患し得る。実施例５に記載される試験において、アプラグルチドの投与は、プラセボと比較して、両方の用量群においてアルドステロンレベルを減少させる傾向があることが見出された。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、アプラグルチドが、改善された流体及びナトリウム吸収に起因して、二次的な高アルドステロン症を緩和することを示す。
５ｍｇのアプラグルチドによる治療は、脂肪量及び体重の増加と関連していた。これは、ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２類似体ｔによる治療後の対象において脂肪量の増加が観察された初めての例である。体重の増加は、脂肪量及び／又は除脂肪量の対応する変化とよく相関する。
実施例５に記載の統計分析を２つのバージョンで実施し、パートＡでは５ｍｇをプラセボと比較したが、パートＡ＋Ｂはプラセボ、５ｍｇ及び１０ｍｇを含み、３つの治療間の対比を推定した。パートＡ及びパートＡ＋Ｂ分析の結果は概して同じであった。
要約すると、実施例５に記載された結果は、５及び１０ｍｇの週１回の４週間のアプラグルチド投薬が忍容性良好であり、安全であったことを実証するものである。また、この結果により、週１回の投薬によるＧＬＰ－２類似体の臨床効果が実証された。アプラグルチドによる週１回の治療は、試験した両方の用量（５及び１０ｍｇ）で、ＳＢＳを有する患者における尿排出量の増加及び腸リハビリテーションの他のマーカーの改善をもたらしたが、応答の差は観察されなかった。本開示のアプラグルチド組成物は、毎日とは対照的に週１回の投与を可能にすることによって、患者のケア及びコンプライアンスに寄与し得、これが次に、生活の質を改善し得ることが想定される。低減された注射頻度は、患者の受容性を高め、注射部位反応のリスクを低減することができる。これらの結果は、アプラグルチド処理が腸適応を促進することによって腸吸収の増加をもたらすことを示している。理論に束縛されることを望むものではないが、これらの結果は、インビボでのアプラグルチドによる治療が、ＳＢＳ－ＩＦを有する患者における腸の湿重量吸収を改善することができ、したがって、治療設定において実施することができることを示す。
方法
試験設計及び参加者
実施例５に記載の試験は、二重盲検、クロスオーバー、無作為化、プラセボ対照、第２相試験であり、その後に非盲検レジメンでの追加の治療期間が続いた。ＳＢＳ－ＩＦを有する８人の成人患者（年齢１８歳以上８０歳以下）を試験に登録した。患者の適格性をス
クリーニング来院中に評価した。主な組み入れ基準は以下の通りですなわち、空腸又は回腸造瘻術を用いた小腸の外科的切除に続発するＳＢＳを有する患者、最後の腸切除から少なくとも６ヶ月、過去１８ヶ月以内に記録された少なくとも１５００ｇ／日の糞便排泄、及び患者の医療記録に従って≧１２ヶ月間、週３回以上のＰＳ注入であった。患者における活動性の臨床徴候、５年以内のがんの病歴、又は不十分な肝臓、腎臓、若しくは心臓の機能を有した場合、患者を除外した。患者が過去３ヶ月以内に天然のＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２類似体を投与されていた場合も除外した。
図４に示すように、試験を２つのパート、すなわちパートＡ及びＢに編成した。パートＡは、二重盲検、クロスオーバー、無作為化、プラセボ対照試験であった。パートＡでは、患者を５ｍｇのアプラグルチド又はプラセボで週１回４週間治療した。６～１０週間のウォッシュアウト期間の後、代替治療を施した。パートＡに続いて、患者がパートＢに入る前に６～１０週間の第２の休薬期間を設けた。パートＢは、１０ｍｇのアプラグルチドを週１回４週間投与する非盲検投薬レジメンであった。１０ｍｇ投薬の安全性及び忍容性を調査するために、追加の非盲検治療期間（パートＢ）を含めた。各治療期間中の手順は一貫していた。試験薬物は、再構成のための凍結乾燥粉末として提供され、腹部領域に皮下注射として投与された。
手順
安全性評価を各治療期間について実施し、安全性評価は、注射部位反応、バイタルサイン、血液試料、心電図（electrocardiogram、ＥＣＧ）、尿試験紙検尿、体重及び肝臓酵
素についての観察を含んでいた。それらは、表１５に示すように、ベースライン時、試験薬物の各注射中（投与前及び連続時点）、１回目の治療注射の４日後、各治療期間の終了時、及び試験の終了時の最後の投薬の４～６週間後に実施した。更に、肝臓酵素を各薬物投与の前に測定した。
有効性評価を２９日の各治療期間について実施した。患者は、特定の時点でのＰＳ体積投与、尿収集及び経口輸液摂取を記録するための紙日誌を受領した。患者は、ベースライン時（－２～１日目）、１回目の治療注射の直後（１～３日目）、及び治療期間の終了時
（２７～２９日目、試験薬物の４回目の投与の５日後）に、自宅で４８時間の尿採取を行った。尿は、体積マーキングを有する尿容器中に患者によって収集され、４８時間尿量が日誌に報告された。４８時間の収集を完了した後、患者は、約１００ｍＬの尿を容器から試料に移し、試料は、次の患者の来院時に送達された。次いで、４８時間当たりに排出されたナトリウム量を、試料中のナトリウムの濃度に収集した尿の総量を乗じたものとして計算した。各尿採取の間、週１回のＰＳ体積及び含量並びに毎日の経口輸液摂取を一定に保った。それらは一定に保たれたので、尿量の増加は、液体吸収の増加の徴候であった。患者は、ベースライン来院時（－３日目）の習慣的な経口輸液摂取に基づいて、２４時間飲用メニューを作成するように通知された。患者は、各尿採取の間、自身の飲用メニューを順守し、付随する４８時間の経口輸液摂取が、各尿採取の間、日誌に報告された。
２０～２２日目に、患者は、４８時間の間の自発的な経口輸液摂取を記録するように通知された。この測定は、腸吸収の増加が自発的な経口輸液摂取の減少と関連するかどうかを調査するために含まれた。
４日目～２４日目の間に、試験者によって臨床的に必要であると判断された場合、ＰＳ容量の減少を可能にした。４週間という比較的短い治療期間のため、ＰＳ量は、患者が体液貯留の臨床徴候（浮腫及び過剰な意図しない体重増加など）を有した場合にのみ低減された。ＰＳ体積減少を２０～２２日目の間に評価した。患者は、治療尿収集の終わり（２７～２９日目）の間に、自身のベースラインＰＳ容量及び内容物に戻った。プロトンポンプ阻害剤、ロペラミド、及びアヘン剤を含む併用薬は、試験を通して不変かつ安定に保たれた。必要であれば、患者と試験者との間の議論に基づいて、治療期間の間に、飲用メニュー並びに処方されたＰＳ量及び含量において調整を実施することができる。
体重は、水平なプラットフォームスケールを用いて測定した。ベースライン時及び治療終了時に、二重エネルギーＸ線吸収測定法（Ｎｏｒｌａｎｄ ＸＲ－３６ ＤＸＡ濃度計、Ｆｏｒｄ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって身体組成を測定した。
アプラグルチド及び空腹時血漿中Ｌ－シトルリン（腸細胞塊のマーカー）の血漿中濃度の分析のための採血を、ベースライン、１回目及び２回目の治療注射の間、１回目の治療注射の４日後、及び治療の最後に収集した。空腹時血漿中Ｌ－シトルリンのための血液試料も、試験終了時の最後の投薬の４～６週間後に採取した。抗アプラグルチド抗体のための採血は、ベースライン、治療終了時、及び試験終了時の最後の投薬の４～６週間後に採取した。
尿中ナトリウム濃度の分析
尿中ナトリウムは、定量下限１０ｍｍｏｌ／リットルのイオン特異的電極システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、ＣＯＢＡＳ ８０００モジュラー分析器シリーズで測定した。尿中ナトリウムが定量の下限未満である場合、試料を炎光光度法によって分析した。
アプラグルチド血漿中濃度及びＬ－シトルリンの分析
アプラグルチド及びＬ－シトルリンを、有効なＬＣ－ＭＳベースの方法を使用して定量した。アプラグルチドについては、分析手法は、完全なアプラグルチド及びその内部標準の固相抽出精製を使用した。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５０００四重極質量分析計を使用するＭＳ／ＭＳ検出を伴う逆相ＨＰＬＣを使用して、化合物を同定及び定量した。５．００ｎｇ／ｍＬの定量限界未満の試料については、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５５００四重極質量分析計を使用するＭＳ／ＭＳ検出を伴う逆相ＵＨＰＬＣを使用して、化合物を同定し、定量した。Ｌ－シトルリンについて、分析方法は、Ｌ－シトルリン及びその内部標準のタンパク質沈殿抽出を使用した。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５０００四重極質量
分析計を使用するＭＳ／ＭＳ検出を伴うＨｉｌｉｃ ＨＰＬＣを使用して、化合物を同定及び定量した。
抗アプラグルチド抗体の分析
完全に検証されたＥＬＩＳＡ法を、３段階アッセイアプローチに従って、血清中の抗アプラグルチド抗体の検出のために使用した。第１の段階では、試料及び対照中に存在する抗アプラグルチド抗体が、微量滴定プレート上に固定されたアプラグルチドに結合した。次いで、結合した抗アプラグルチド抗体を、プロテインＡ／Ｇ及びプロテインＬを用いて検出した。検証されたスクリーニングカットポイントを超えるシグナルを有する試料を、潜在的に陽性であるとみなし、次いで、第２の段階、確認アッセイにおいて試験した。このために、試料を上記のアッセイで試験する前に過剰のアプラグルチドで前処理した。検証された確認カットポイント以上のシグナルの阻害は、抗体の存在を確認した。次いで、試料を抗アプラグルチド陽性として報告した。次いで、力価を、全ての確認された陽性試料の連続希釈によって決定した。
統計分析
クロスオーバーデザインを適用し、ここで、各患者は、対象間の変動性を排除し、交絡共変量の影響を低減するための自身自身の対照としての役割を果たした。
安全性を、少なくとも１用量の試験薬物（活性又はプラセボ）を受けた全ての患者において評価した。有効性は、少なくとも１つの有効なベースライン後有効性測定値（完全な分析セット）を有する全ての無作為化された患者を含む修正された治療意図原理に従って評価された。
２つの異なる統計分析、すなわちパートＡのみのバージョン及びパートＡ＋Ｂの全バージョンを行った。パートＡバージョンは、２×２クロスオーバー設計に基づいたが、パートＡ＋Ｂバージョンは、３つの異なる治療（プラセボ、５ｍｇ、及び１０ｍｇ）間の対比を推定するために、期間効果を仮定しなかった。統計分析のパートＡ及びパートＡ＋Ｂバージョンの両方を結果に含めた。パートＡの分析は無作為化され、盲検化された。パートＡ＋Ｂの分析は、プラセボ、５ｍｇ、及び１０ｍｇの間の比較を実施するために含まれた。分散分析を使用して、アプラグルチドの効果を評価した。結果変数の期間特異的ベースライン測定、経口輸液摂取、及びＰＳ体積を分析に含めた。全ての統計的検定は、５％の有意水準で両側検定を用いて行った。推定値を、約９５％の信頼区間及びｐ値とともに示した。ＳＡＳバージョン９．４を分析に使用した。
実施例６：第２相代謝バランス試験
以下の非限定的な実施例では、短腸症候群腸不全及び短腸症候群腸不全を有する対象が本開示のアプラグルチド配合物を使用して治療された第２相臨床試験からの結果を説明する。この第２相試験は、本開示のアプラグルチド配合物の安全及び有効性を調査した。
グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）アナログでの治療は、短腸症候群（ＳＢＳ）を有する患者において腸適応を促進する。アプラグルチドは、週１回の投薬を可能にするように設計された新規の長時間作用型ＧＬＰ－２類似体である。この第２相試験は、ＳＢＳ腸不全（ＳＢＳ－ＩＦ）及びＳＢＳ腸機能不全（ＳＢＳ－ＩＩ）を有する患者における週１回５ｍｇアプラグルチドの安全及び有効性を調査した。この非盲検試験では、ＳＢＳ－ＩＦ（ｎ＝４）又はＳＢＳ－ＩＩ（ｎ＝４）及び糞便湿重量≧１５００ｇ／日を有する８人の成人患者を、４週間にわたって週１回皮下５ｍｇアプラグルチドで治療した。安全性が一次エンドポイントであった。二次エンドポイントとして、７２時間代謝バランス試験を使用して、湿重量、エネルギー（ボンベ熱量測定によって測定される）及び電解質の腸吸収、並びに糞便湿重量及び尿産生におけるベースラインからの変化を検査した。一般
的な治療関連有害事象は、ＧＬＰ－２の生理学的効果と一致し、ストーマ排出の減少（ｎ＝６）、ストーマ合併症（ｎ＝６）、悪心（ｎ＝５）、鼓腸（ｎ＝４）、多尿（ｎ＝３）及び腹痛（ｎ＝３）を含んでいた。週１回のアプラグルチドは、エネルギー、湿重量及び電解物吸収を有意に増加させ、糞便湿重量を減少させ、尿産生を増加させた（表１６）。
結果
９人の患者をスクリーニングした。１人の患者は、糞便排出≧１，５００ｇ／日及び尿量＜２，０００ｍＬ／日（ベースライン代謝バランス試験中に評価された）の組み入れ基準を満たさなかった。８人の患者が試験において投薬された。図１３に示すように、８人の患者全員が試験を完了し、安全性及び完全な分析セットを構成した。患者の人口統計及びベースライン特性を表１７に要約する。表１７のデータは、平均（ＳＤ）又はＮ（％）であり、非経口支援（ＰＳ）は、週平均に基づいて試験開始時に予定されたＰＳであった。
安全性結果
全ての患者は、少なくとも１つの治療関連有害事象を経験した。有害事象は軽度から中等度であった。一般的な有害事象を表１８に要約する（データはＮ又はＮ（％）である）。２人を超える患者で発生した有害事象には、胃腸ストーマ排出の減少（ｎ＝６）、ストーマ合併症（ｎ＝６）、胃腸ストーマ合併症（ｎ＝５）、悪心（ｎ＝５）、異常な胃腸ストーマ排出（ｎ＝４）、鼓腸（ｎ＝４）、多尿（ｎ＝３）及び腹痛（ｎ＝３）が含まれた。１人の患者は、１回の注射の後に一過性の注射部位反応（局所的な紅班及びそう痒症）を経験し、これは、抗アプラグルチド抗体の存在とは無関係であった。３人の患者は、臨床試験において天然ＧＬＰ－２又は別のＧＬＰ－２類似体を以前に受けていた（試験組み入れの最低１６ヶ月前）。合計３つの重篤な有害事象（serious adverse event、ＳＡＥ
）が２人の患者で起こった。入院を必要とする腹痛の事象である１つのＳＡＥは、試験薬物に関連すると評価された。腹痛は保存的に治療され、患者は２４時間以内に退院した。一時的な中断及び減少した用量での再チャレンジは、患者が試験を完了することを可能にした。残りの２つのＳＡＥは、アプラグルチドに関連するとは考えられなかった。自身は、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者における脱水に起因する急性腎損傷の１つの事象及びＳＢＳ－ＩＦを有する患者におけるＣＲＢＳＩの１つの事象を含んでいた。２人の追加の患者は、試験を完了するために用量減少を必要とした。ＳＢＳ－ＩＩを有する１人の患者は、１回目の薬物投与後に体液貯留の徴候を有し、したがって、２回目及び３回目の投与は、低減された用量で与えられた。４回目／最後の投与は、更なる合併症なしに全用量（５ｍｇ）で与えられた。１人の患者は、１回目の薬物投与後に便秘を経験し、その結果、２回目の投与は低減された用量で与えられた。更なる合併症なしに、３回目及び４回目／最後の投与のために全用量を再導入した。
バイタルサイン、血液試料、ＥＣＧ、尿試験紙検尿又は体重から安全性の懸念は生じなかった。ＳＢＳ－ＩＦを有する１人の患者は、試験中に抗アプラグルチド抗体を発現した。抗体は、４～６週間のウォッシュアウト後に陰性であった。患者は、以前に、２０１６年の臨床試験設定においてＧＬＰ－２類似体で治療されていた。薬物動態プロファイル、アプラグルチドに対する薬力学的応答、又は有害事象の数若しくは持続期間に対する抗アプラグルチド抗体の効果は検出されなかった。有害事象のために試験を中止した患者はおらず、死亡は生じなかった。
有効性エンドポイント
湿重量
食事摂取、糞便排出、尿、及び吸収の湿重量における、アプラグルチドでの治療後のベースラインからの個体の変化を図１４に示す。アプラグルチドは、表１９に示すように、食事摂取の湿重量を変化させなかった。表１９において、データは調整平均（９５％ＣＩ
）として示され、計算はベースラインから治療の終了までの変化に基づく。アプラグルチドは、表１９に示すように、湿重量の腸吸収を７４１ｇ／日（９５％ＣＩ １９４～１２８７；Ｐ＝．０１５）増加させた。アプラグルチドは、表１９に示すように、糞便排出を６８０ｇ／日（９５％ＣＩ－１２００～－１５９；Ｐ＝．０１８）まで有意に減少させ、尿産生を５６０ｇ／日（９５％ＣＩ ７２～１０４８；Ｐ＝．０３０）増加させた。
電解質
アプラグルチドは、表１９に示すように、ナトリウム及びカリウムの吸収をそれぞれ３８ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ ３～７４；Ｐ＝．０３９）及び１８ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ ４～３２；Ｐ＝．０２０）増加させた。表１９に示すように、尿中ナトリウム及びカリウム排出は２７ｍｍｏｌ／日（５～４９；Ｐ＝．０２４）及び１３ｍｍｏｌ／日（９５％ＣＩ ６～２０；Ｐ＝．００３）増加した。表１９に示すように、マグネシウム及びカルシウムの吸収又は尿排出に変化はなかった。表１９に示すように、食事摂取の電解質含量及び糞便排出は変化しなかった。電解質吸収におけるベースラインからの個々の変化を図１５に示す。
エネルギー及び多量栄養素
図１６は、エネルギー食事摂取のエネルギー含量、糞便排出、及び吸収におけるベースラインからの個々の変化を示す。アプラグルチドは、表１９に示すように、総食事エネルギー摂取又は任意の個々の多量栄養素を変化させなかった。ベースラインと比較して、表１９に示すように、アプラグルチドはエネルギーの腸吸収を１，０９５ｋｊ／日（９５％ＣＩ １９６～１，９９４；Ｐ＝．０２４）増加させた。エネルギー吸収における改善の示唆により、糞便排出のエネルギー含量は、表１９に示すように、９４１ｋｊ／日（９５％ＣＩ－２，４３８～５５６Ｐ＝．１８１）減少した。炭水化物及び脂質吸収は、表１９に示すように、それぞれ５１８ｋｊ／日（９５％ＣＩ １１２～９２４；Ｐ＝．０１９）及び３７６ｋｊ／日（９５％ＣＩ ６１～６９１；Ｐ＝．０２６）有意に増加した。タンパク質吸収は、表１９に示すように、１０４ｋｊ／日（９５％ＣＩ－２０５～４１２；Ｐ＝．４５３）増加した。多量栄養素吸収の個々の変化を図１７にプロットする。
体重及び身体組成
体重は、４週間のアプラグルチド処理後、１．８ｋｇ増加した（９５％ＣＩ ０．４～３．１；Ｐ＝．０１６）。除脂肪体重は１．７ｋｇ（９５％ＣＩ ０．８～２．６；Ｐ＝．００３）有意に増加し、体脂肪量は１．１ｋｇ（９５％ＣＩ－２．１～－０．０；Ｐ＝．０４４）減少した。骨塩量に有意な変化はなく、骨塩量は－２０ｇ（９５％ＣＩ－５８～１９；Ｐ＝．２６８）までに変化した。
シトルリン
ベースラインと比較して、アプラグルチドはＬ－シトルリンの絶対及び相対血漿中濃度をそれぞれ１５．２μｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ ３．３～２７．１；Ｐ＝．０１９）及び６６％（９５％ＣＩ ３～１２８；Ｐ＝．０４３）増加させた。
薬物動態
アプラグルチドの血漿中濃度は投薬後急速に増加し、平均２９．５時間後に１１８．０ｎｇ／ｍＬの最大平均濃度に達した。平均消失半減期は２７．０時間であり、平均クリアランスは０．９Ｌ／ｈであった。Ｗ
実施例６のまとめ
実施例６に記載される結果は、週１回投与された５ｍｇのアプラグルチドが、ＳＢＳ－ＩＩ及びＳＢＳ－ＩＦを有する患者において、治療の４週間後に安全であり、忍容性良好であり、腸吸収に対して正の効果を示したことを実証し、これは、臨床設定において、ＰＳの必要性を排除又は低減する。
有害事象は、ＧＬＰ－２の公知の生理学的効果と一致した。頻繁に報告された関連する有害事象は、胃腸起源のものであったが、それらは概して軽度かつ一過性であった。
アプラグルチドは、湿重量、エネルギー及び電解質（ナトリウム及びカリウム）の腸吸収を有意に増加させた。吸収の改善は、糞便湿重量の有意な減少並びに尿産生及び尿電解質排出（ナトリウム及びカリウム）の増加を伴った。この試験で見出された尿産生の変化は、ＰＳの減少を可能にするか、又はＳＢＳ－ＩＦを有する患者における腸内自律性の回復を助けることができるので、臨床的に関連すると考えられる。これらの改善はまた、最終的に、ＳＢＳ－ＩＩを有する患者において間欠的又は慢性的なＩＦを発症するリスクを低減し、吸収不良の症状負担を軽減し得ることが想定される。
アプラグルチドの薬物動態プロファイルは、週１回投薬レジメンを支持した。
アプラグルチドは、ボンベ熱量測定によって測定した場合に、ＳＢＳ集団における全患者範囲にわたってエネルギーの吸収を改善する最初のＧＬＰ－２類似体であり、これは、腸のエネルギー吸収を定量化するためのゴールドスタンダードの実験室的方法とみなされている。個々の多量栄養素について、アプラグルチドは炭水化物及び脂質の吸収を増加させたが、タンパク質吸収は変化しなかった。当業者によって理解されるように、臨床開発の後の段階では、エネルギー所要量の減少を伴うＰＳの離脱は、エネルギー吸収の改善の証拠と考えられる。
アプラグルチドのＰＫプロファイルは、エネルギー吸収に対する改善された効果を説明し得る一貫した曝露を可能にした。
アプラグルチドは、体重及び除脂肪体重を有意に増加させ、脂肪量を減少させており、これは、当業者に理解されるように、水和状態の改善の可能性を示すものである。
アプラグルチドは食事摂取の湿重量又はエネルギー含量を変化させなかった。経口輸液摂取は固定されたが、固体の食事摂取は制限されなかった。ＧＬＰ－２は、健康なヒトにおいて食欲又は食後の満腹感に有意に影響を及ぼさなかった。食事摂取の減少は、腸損失を補償するために過食症に依存するＳＢＳ患者において、望ましくない副作用であり得る。長期ＧＬＰ－２治療により、患者は、同程度の吸収を維持しながら、食事摂取を減少させることができた。したがって、アプラグルチドの投与は、特に重篤なＳＢＳ－ＩＩを有する患者において優勢な症状である重篤な過食症の必要性を軽減し得ることが想定される。
アプラグルチドは、腸細胞量のマーカーである血漿中Ｌ－シトルリンを有意に増加させ、その予想される適応促進効果を支持した。ＧＬＰ－２はまた、胃腸運動性を阻害し、胃酸分泌を減少させ、それによって腸細胞の管腔内容物への曝露を増加させることができた。腸間膜血流はまた、ＧＬＰ－２によって刺激され得、これは、栄養吸収を増加させ得る。ＧＬＰ－２はまた、動物試験において示されるように、輸送タンパク質をアップレギュレートし得る。
実施例６に記載される結果は、４週間にわたって毎週投与される５ｍｇのアプラグルチド治療が、ＳＢＳ－ＩＦ及びＳＢＳ－ＩＩを有する患者において安全であり、忍容性良好であることを示すものである。これらの結果は、週１回のＧＬＰ－２類似体が、湿重量、エネルギー、電解質の吸収を有意に改善し、尿産生を増加させたことを初めて実証している。アプラグルチドは、毎週の注射しか必要とせず、これは、注射の負担を軽減し、患者のケア及びコンプライアンスに寄与し得る。注射頻度の減少はまた、患者の受容性を増加させ、注射部位反応のリスクを減少させることができる。
週１回のアプラグルチドによる治療は、液体、電解質及びエネルギーの腸吸収を増加させた。理論に束縛されることを望むものではないが、これらの結果は、本開示のアプラグルチド組成物を用いた患者の治療が、ＳＢＳ－ＩＦを有する患者における腸の湿重量吸収及びエネルギーを改善することができ、したがって、治療設定で実施することができることを示す。
方法
試験設計及び参加者
ＳＢＳを有する合計９人の成人患者（年齢１８歳以上８０歳以下）をスクリーニングし、そのうちの８人を試験に登録した。４人の患者はＳＢＳ－ＩＩを有し、４人の患者はＳＢＳ－ＩＦを有した。両方のサブグループの患者を、疾患の範囲にわたってアプラグルチドの安全及び有効性を調査するために含めた。患者の適格性をスクリーニング来院中に評価した。主な組み入れ基準は、結腸を伴う又は伴わない小腸の外科的切除に続発するＳＢＳ、最後の外科的腸切除から少なくとも６ヶ月、及び糞便湿重量排出≧１，５００ｇ／日及び尿量生産＜２０００ｍＬ／日と定義される重度の吸収不良であった。糞便排出及び尿量生産をベースライン検査の間に確認した。患者における活動性の臨床徴候、５年以内のがんの病歴、又は不十分な肝臓、腎臓、若しくは心臓の機能を有した場合、患者を除外した。また、妊娠中又は授乳中であるか、ＨＩＶ陽性、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎試験陽性であるか、スクリーニング来院前１ヶ月以内に入院したか、又は過去３ヶ月以内に天然ＧＬＰ－２又はＧＬＰ－２類似体を投与された患者も除外した。
手順
患者を週１回５ｍｇのアプラグルチドで４週間治療した。アプラグルチドは、注射前に無菌水中で再構成するための凍結乾燥粉末として提供され、治療は、腹部領域に皮下注射として投与された。７２時間代謝バランス試験を、ベースライン時及び治療期間の終了時（４回目及び最後のアプラグルチド注射の１日後に開始）に実施した。各７２時間代謝バランス試験を、５日の入院の間に実施した。入院の日に、患者は、習慣的な経口輸液摂取に基づいて２４時間飲用メニューを作成するように指示された。飲用メニューは、各バランス試験の間に従う必要があった。入院の２日目に、患者が排尿してストーマバッグを空にしたか又は排便した直後に、バランス試験を開始した。患者は、２４時間後に交換されるそれぞれのバケツに、糞便排出、尿、及び食事摂取の正確な複製（流体及び固体が分離されている）を収集するように指示された。患者は、食物への自由なアクセスを有したが、毎日のＰＳ（体積及び内容物）及び経口輸液摂取は、ベースライン及び治療後の代謝バランス試験期間の間、一定に保たれた。毎日のＰＳ及び経口輸液摂取を一定に維持して、
ベースライン及び治療後の測定値が、治療効果の測定に関して同等であることを確実にした。毎日のＰＳ及び所定の飲用メニューへのコンプライアンスを入院中に記録した。プロトンポンプ阻害剤、ロペラミド及びオピエートを含む併用薬は、試験を通して変化しないままであった。
バケツの内容物を秤量し、乾燥物質中で処理し、前述のように分析した。エネルギーはボンベ熱量測定により、窒素はケルダール法により、脂質は修正バン・デ・カマー（Van de Kamer）滴定技術により、炭水化物はエングリスト法により、ナトリウム及びカリウムは炎光光度法により、カルシウム及びマグネシウムは原子吸光分析法により分析した。３つの２４時間期間に基づいて、２４時間平均を計算した。絶対変化を、ベースラインと治療後値との間の差として計算した。相対変化を、ベースライン値で割って１００を掛けた絶対変化として計算した。
体重は、水平なプラットフォームスケールを用いて測定した。身体組成を、ベースライン時及び治療後に二重エネルギーＸ線吸収測定法（Ｎｏｒｌａｎｄ ＸＲ－３６ ＤＸＡ濃度計、Ｎｏｒｌａｎｄ、Ｆｏｒｄ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって測定した。
１回目、２回目及び４回目のアプラグルチド注射を院内で行った。安全性評価には、注射部位反応、バイタルサイン、血液試料、心電図（ＥＣＧ）、尿検査及び体重の観察が含まれた。それらは、表２０に示すように、ベースライン時、試験薬物の各注射中、第１の注射の４日後、治療の終了時、及び試験の終了時の最後の投薬の４～６週間後に実施した。肝臓酵素を各薬物投与の前に測定した。
アプラグルチドの血漿中濃度及び空腹時Ｌ－シトルリン（腸細胞塊のマーカー）の血漿
中濃度の分析のための採血を、ベースライン、１回目及び２回目の注射の間（事前投薬及び連続した時点）、１回目の注射の４日後、及び治療の最後に収集した。９６時間にわたる４回目及び最後の注射の後に、アプラグルチド薬物動態のための採血も実施した。空腹時血漿中Ｌ－シトルリンのための血液試料も、試験終了時の最後の投薬の４～６週間後に採取した。抗アプラグルチド抗体のための採血を、ベースライン時、治療の終了時、及び４～６週間の追跡調査来院時に収集した。８人の患者全員が、ベースライン時に抗アプラグルチド抗体について陰性であると検査された。
結果
この試験の一次エンドポイントは安全性であった。二次エンドポイントは、食事摂取、湿重量の糞便排泄及び吸収、エネルギー、多量栄養素及び電解質、尿産生、尿電解質排泄、体重、身体組成、骨塩量、血漿中Ｌ－シトルリン、並びに薬物動態プロファイルにおけるベースラインからの絶対的及び相対的変化であった。血漿中Ｌ－シトルリンにおけるベースラインからの変化を除いて、絶対的な変化のみを本開示の範囲内で提示した。
アプラグルチド及びＬ－シトルリンの血漿中濃度の分析
アプラグルチド及びＬ－シトルリンを、有効なＬＣ－ＭＳベースの方法を使用して定量した。アプラグルチドについては、分析手法は、完全なアプラグルチド及びその内部標準の固相抽出精製を使用した。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５０００四重極質量分析計を使用するＭＳ／ＭＳ検出を伴う逆相ＨＰＬＣを使用して、化合物を同定及び定量した。５．００ｎｇ／ｍＬの定量限界未満の試料については、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５５００四重極質量分析計を使用するＭＳ／ＭＳ検出を伴う逆相ＵＨＰＬＣを使用して、化合物を同定し、定量した。Ｌ－シトルリンについて、分析方法は、Ｌ－シトルリン及びその内部標準のタンパク質沈殿抽出を使用した。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５０００四重極質量分析計を使用するＭＳ／ＭＳ検出を伴うＨｉｌｉｃ ＨＰＬＣを使用して、化合物を同定及び定量した。
抗アプラグルチド抗体の分析
完全に検証されたＥＬＩＳＡ法を、３段階アッセイアプローチに従って、血清中の抗アプラグルチド抗体の検出のために使用した。第１の段階では、試料及び対照中に存在する抗アプラグルチド抗体が、微量滴定プレート上に固定されたアプラグルチドに結合した。次いで、結合した抗アプラグルチド抗体を、プロテインＡ／Ｇ及びプロテインＬを用いて検出した。検証されたスクリーニングカットポイントを超えるシグナルを有する試料を、潜在的に陽性であるとみなし、次いで、第２の段階、確認アッセイにおいて試験した。このために、試料を上記のアッセイで試験する前に過剰のアプラグルチドで前処理した。検証された確認カットポイント以上のシグナルの阻害は、抗体の存在を確認した。次いで、試料を抗アプラグルチド陽性として報告した。次いで、力価を、全ての確認された陽性試料の連続希釈によって決定した。
統計分析
ベースラインから治療終了までの調整平均変化の統計的検定を、対応のあるｔ検定を使用して分析した。全ての統計的検定は、５％の有意水準で両側検定を用いて行った。推定値を、約９５％の信頼区間及びｐ値とともに示した。ＳＡＳバージョン９．４を分析に使用した。
実施例７：薬物動態学的／薬力学的評価
人口統計及び他のベースライン特性
１１人の女性及び１３人の男性が試験に含まれた。人口統計及びベースラインデータを表２１に要約する。関連する病歴は報告されなかった。最も頻繁に報告された以前の併用薬は、産児制限に関するものであった。１回目の投薬後、最も頻繁に報告された併用薬は
パラセタモールであった。併用薬における関連する差異は、治療群間で認められなかった。
ＢＭＩ＝体格指数、ＳＤ＝標準偏差。
治療コンプライアンスの測定
治療は、臨床スタッフのメンバーによって対象に皮下（subcutaneously、ＳＣ）投与され、完全な治療コンプライアンスがあった。
薬力学的及び有効性の結果
投薬レベル当たりのアプラグルチドの１回目の投薬後の時間に対する血漿中シトルリン濃度を図１８に示す。ベースラインからの変化についての対応する最小二乗（ＬＳ）平均プロットを図１９に提供する。シトルリンの要約薬物動態パラメータを表２２に提供する。
アプラグルチドの薬力学的効果を評価するために、内因性マーカーシトルリンを選択した。シトルリンは、全てのベースライン及び投薬後試料において検出された。３つのベースラインシトルリン試料を、スクリーニングと１回目の投薬日との間の２回のベースライン来院の間、及び１回目の投薬日の投薬前に得た。２４人の対象のうち１３人は、３つのベースライン試料に対して＜０．５μｇ／ｍＬの差を有し、最小の差は、１０ｍｇを投薬された対象について観察された０．０６１μｇ／ｍＬであった。別の５人及び４人の対象は、ベースライン評価にわたってそれぞれ０．５～１μｇ／ｍＬと１～２μｇ／ｍＬとの間の差を有した。残りの２人の対象は、＞２μｇ／ｍＬの差を有し、最大の差は、１ｍｇを投薬した対象について観察された２．７６２μｇ／ｍＬであった。ベースラインにおいて、平均シトルリン範囲は、プラセボについて５．３８２５～５．６２０７μｇ／ｍＬ、１ｍｇのアプラグルチドについて５．３９００～６．２０２８μｇ／ｍＬ、５ｍｇのアプラグルチドについて４．８９８３～５．３０２３μｇ／ｍＬ及び１０ｍｇのアプラグルチドについて５．０７３０～５．４６９０μｇ／ｍＬであった。プラセボ群では、平均シトルリン濃度は、試験にわたって比較的安定したままであり、４．９７３５～５．８２５３μｇ／ｍＬの範囲であった。
アプラグルチドの１回目の週１回のＳＣ投薬後、シトルリンは用量依存的に増加し、２日後に最大シトルリン濃度に達した１ｍｇ群の１人の対象を除いて、４日又は７日後に最高シトルリンレベルが測定された。最も高い平均シトルリン値は、１、５及び１０ｍｇについて、それぞれ６．３９２０μｇ／ｍＬ（４日後）、７．１９３３μｇ／ｍＬ（４日後）及び７．８４８７μｇ／ｍＬ（７日後）であったが、プラセボについては５．８３２５μｇ／ｍＬ（１日後）であった。
各投与間隔の終了時の濃度、Ｒｐｒｅ－ｄｏｓｅを各投薬について評価し、概してシトルリンレベルが全治療期間にわたって同様であることが示された（表２２）。
アプラグルチドの６回目及び最後の週１回のＳＣ投薬後、全ての用量レベルで、特に最
も高い用量で増加が観察された。平均Ｒｍａｘは７．１７０２、８．１５７７及び８．７２５４μｇ／ｍＬであり、それぞれ１、５及び１０ｍｇの最終投薬の２．０、３．９及び３．９日後に到達した（表２２）。対応するプラセボレベルは、最終投薬の１６．９日後に６．３７０７μｇ／ｍＬであった。これらのＲｍａｘ値は、試験全体にわたって評価された平均Ｒｍａｘよりもわずかに低いだけであり、差は、１０、５及び１ｍｇについてそれぞれ０．０３６２、０．０９７３及び０．１０１６μｇ／ｍＬの範囲であった。プラセボでは、差は０．２５８６μｇ／ｍＬであった。平均Ｒｍａｘは、全てのアプラグルチド群についてほぼ同じ時間に生じ、それぞれ１及び５ｍｇの１回目の投薬後３５．９～３８．９日の範囲であったが、プラセボは１回目の投薬後５０．４日でピークに達した。
最終投薬後に観察された平均シトルリン増加は、１０ｍｇと比較して最も低い用量でより急速に低下するようであった。シトルリンを７７日目まで評価した。最終投薬後の最も低い平均シトルリンレベルは、１及び１０ｍｇの両方について１７日後に到達した。５ｍｇについては、最も低い平均シトルリンレベルは、更に１週間後に到達した。Ｒｔ１／２を、両方とも１０ｍｇを投薬された２人の対象について評価し、６．５日及び１１．０日であった（表２２）。
ＮＡ＝適用せず、全試験期間にわたって評価、ＮＤ＝利用可能なデータなし、Ｒｍａｘ＝最大応答、Ｒｐｒｅ－ｄｏｓｅ＝投与直前の応答、Ｒｔｍａｘ＝最大応答に達するまでの時間、Ｒｔ１／２＝応答半減期。
対象の数（Ｎ）は、他に示されない限り、６であった。
＊１名の欠測対象（Ｎ＝５）及び＊＊４名の欠測対象（Ｎ＝２）。
変動係数（％ＣＶ）として表されるＲｐｒｅ－ｄｏｓｅ及びＲｍａｘ（両方とも最終投薬後及び試験全体を通して）にわたる変動性は、プラセボについて１６．０～３１．９％の範囲であった（表２２）。これは、１及び５ｍｇについて観察された１８．１～２９．２％の％ＣＶ範囲と一致した。１０ｍｇについての％ＣＶはわずかに高く、３２．４～４４．０％であった。
Ｈｅｌｍｅｒｔのアプローチを使用して、用量レベル当たりの統計的定常状態分析を実施した。要するに、試験された第１の対比は、第１の時点（１週目）での平均Ｒｐｒｅ－ｄｏｓｅを、全ての残りの時点（２～６週目）にわたってプールされた平均Ｒｐｒｅ－ｄｏｓｅと比較した。２回目の対比では、２週目の平均を３～６週目にわたってプールした平均と比較したなど、対比が統計的に有意でなくなるまで試験を続けた。５週目の平均Ｒ
ｐｒｅ－ｄｏｓｅに対して、１０ｍｇの６週目の平均Ｒｐｒｅ－ｄｏｓｅ（０．８７２０、９５％ＣＩ：０．１５９０；１．５８５０及びｐ＝０．０１７２）は統計的に有意であった。データの目視検査は、調査した全ての用量レベルで１回目の投薬後に定常状態濃度に達したことを示唆している。
シトルリンデータを、混合モデル分散分析を使用して分析した。分析結果のまとめを表２３に示す。統計的分析は、シトルリンに対するアプラグルチドの有意な全体的な治療効果を明らかに示した（ｐ＝０．０００７）。プラセボと１ｍｇとの差は統計的に有意ではなかったが、全ての用量群でプラセボと比較して増加が見られた。プラセボと比較した増加は、用量の増加とともにより顕著かつ有意になり、すなわち、５ｍｇ用量では１．２５７４μｇ／ｍＬ（ｐ＝０．００２５）及び１０ｍｇでは１．６３４３μｇ／ｍＬ（ｐ＝０．０００２）の増加であった（表２３）。更に、用量レベルを互いに比較した場合、５及び１０ｍｇ用量は、１ｍｇ用量と比較して有意に高いシトルリンレベルを誘導した（それぞれ、０．９４２９μｇ／ｍＬ高い［ｐ＝０．０１８６］及び１．３１９８μｇ／ｍＬ高い［ｐ＝０．００１８］）。５ｍｇ用量と１０ｍｇ用量との間の差異は、統計的に有意ではなかったが、１０ｍｇ後の効果は、５ｍｇ後よりもわずかに高いようであった。
全体的な治療ｐ値（プラセボと比較した全ての用量群）及びその後の治療群の比較を示す。９５％信頼区間及びｐ値を有する差の推定値を、比較ごとに示す。
シトルリンに加えて、ブリストル便スケール及び体重を薬力学的エンドポイントとして評価した。シトルリン及び体重とは対照的に、ブリストル便スケールは、離散変数である。対象は、便秘（１型）から下痢（７型）までの範囲のブリストル便スケールを使用して、過去２４時間の便を評価した。過去２４時間以内に便がないことを０として記録した。２人の対象（１ｍｇ又は５ｍｇのいずれかに割り当てられた）は、１回目の投薬の前に便がないことを報告したので、スクリーニングブリストル便スケールスコアもまた、ベースラインブリストル便スケールスコアを決定する場合に考慮された。
ブリストル大便スケールに対するアプラグルチドの有意な全体的治療効果が観察され、ｐ値は０．０１８９であった（表２３）。特異的プラセボ対用量レベルの対比は、プラセボと比較して１及び５ｍｇ群において有意な減少を示した（－０．９、ｐ＝０．００９２及び－１．０、ｐ＝０．００４６）。プラセボと比較した１０ｍｇ群における減少は、統計的に有意ではなかった。このパターンは、時折便がないことを報告した少数の対象によって引き起こされたようであった。１回目の投薬に続いて、ブリストル便スケールの評価を１１回の来院時及び試験退院時に予定した。これらの来院のうち、過去２４時間における便は、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇの群において、それぞれ６回（２人の対象）、１３回（４人の対象）及び１回（１人の対象）報告されなかった。プラセボ群では、全ての対象が、各来院時に過去２４時間以内に便を報告した。６回の投薬週の間に９回及びその後の６週に１１回便が報告されず、投薬との関連がないことが示された。
対象が２４時間ごとに正常に排便しなかった可能性がある場合に、便なしを０としてスコア付けすることの潜在的な影響を考慮して（２４人の対象のうち２人が１回目の投薬の前に０を報告したという観察によって支持される）、便なしを欠測に設定した感度分析として分析を繰り返した。この調整された分析では、全体的にも特定の治療対比のいずれについても、有意な治療効果は見出されなかった（表２３）。
体重は、全試験期間にわたってかなり一定であるようであり、体重全体に対して、又は特定の治療対比のいずれについても、アプラグルチドの統計学的に有意な治療効果はなかった（表２３）。個々の体重値を考慮すると、プラセボ対象１００７は、スクリーニング時の９２．９０ｋｇから試験退院来院時の９９．３０ｋｇへの体重増加を示した。
シトルリン、ＢＳＳ及び体重データを、固定因子治療、時間及び時間による治療、ランダム因子対象、並びに共変量としての平均予備値を用いた混合モデル分散分析で分析する。スクリーニング値を平均ベースラインの計算にも使用したＢＳＳを除いて、スクリーニング後及び投薬前の全ての予備値から平均予備値を計算した。
ＭＣＰ－ＭＯＤ分析
ＭＣＰ－ＭＯＤ法を適用した。この統計的方法は、２つのステップ、すなわち多重比較ステップ及びモデリングステップから構成されていた。手順の第１のステップ（ＭＣＰ）は、予め指定された候補モデルを評価することによって、有意な用量応答について試験するために使用される。用量応答が確立されると、第２のステップ（ＭＯＤ）を使用して、用量応答曲線を推定し、目的の標的用量を推定する。以下の５つの候補モデルが特定された。
－１０ｍｇ用量について最大効果を有する線形モデル
－１０ｍｇ用量について最大効果を有する対数線形モデル
－５ｍｇのＥＤ５０を有する最大効果（Ｅｍａｘ）モデルを誘導する用量
－１ｍｇのＥＤ５０及び２のヒル係数（hill coefficient、ＨＩＬＬ）を有するシグモイドＥｍａｘモデル
－５ｍｇのＥＤ５０及び５のＨＩＬＬを有するシグモイドＥｍａｘモデル
ＭＣＰステップの結果は、全ての５つの候補用量応答モデルが、＜０．０００１のｐ値で有意な対比を生じたことを示した（表２４）。差の推定値は、わずかに特徴的であり、より良好な適合を有するモデルのセット及びわずかに悪い適合を有するセットをもたらした。差の最大推定値を生じる候補用量応答モデルは、１）ＥＤ５０＝５ｍｇを有するＥｍａｘモデル、２）対数線形モデル、及び３）１ｍｇのＥＤ５０及び２のＨＩＬＬを有するシグモイドＥｍａｘモデルであった（表２４）。これらの差の推定値は非常に類似していたので、３つのモデル全てをＭＯＤ部分に取り込んだ。モデルは、それぞれ、１）Ｅｍａｘ、２）ＬｏｇＬｉｎ及び３）シグモイドＥｍａｘモデルと称される。
ＣＩ＝信頼区間、ＥＤ５０＝最大効果の５０％を誘導する用量、Ｅｍａｘ＝最大効果、Ｈ＝ヒル係数、ＭＣＰ－ＭＯＤ＝多重比較手順－モデリング。用量は、０（プラセボ）、１、５及び１０ｍｇのアプラグルチドから構成された。シトルリン応答データは、平均ベースライン値及び３５日目～４２日目（＝６週目）のデータを含んでいた。候補用量応答モデルごとに、分析結果は、検定統計量、コントラストのｐ値、及び９５％ＣＩでの差の推定値によって特徴付けられる。
シトルリンデータのサブセットを、平均予備値及び３５～４２日目＝６週目のデータを用いて作成した。係数は、固定因子治療、時間及び時間による治療、ランダム因子対象、並びに共変量としての平均予備値を用いて、分散の混合モデル分析において実行した。平均予備値を、スクリーニング後及び投薬前の全ての予備値から計算した。
以下のコントラストがモデル内で計算される。
－線形（係数－０．５０８－０．３８１ ０．１２７ ０．７６２）
－ＬｉｎＬｏｇ（係数－０．６５４－０．２８３ ０．３０６ ０．６３１）
－Ｅｍａｘ（係数－０．６３２－０．３１６ ０．３１６ ０．６３２）
－シグモイドＥｍａｘ Ｈｉｌｌ＝２ ＥＤ５０＝１（係数－０．７５９－０．１４０
０．４３２ ０．４６７）
－シグモイドＥｍａｘ Ｈｉｌｌ＝５ ＥＤ５０＝５（係数－０．４５６－０．４５５
０．１６４ ０．７４７）
ＭＯＤステップは、１、５及び１０ｍｇの用量についてのプラセボからの予測されるシトルリン変化が、３つ全てのモデルについてかなり類似していたことを示した（表２５）。１ｍｇの用量では、３つのモデルにわたるシトルリンの予測されたプラセボ及びベースライン補正された変化は、０．７１２５～０．８７１２μｇ／ｍＬの範囲であり、Ｅｍａｘ（ｐ＝０．０１８４）及び対数線形（ｐ＝０．０２３８）モデルについて有意な結果であった。シグモイドＥｍａｘモデルでは、ｐ値は０．０６４５であった。用量を５ｍｇに増加させると、プラセボからの予測される変化は２．１６５２～２．３３２７μｇ／ｍＬの範囲に増加した。１０ｍｇの用量では、プラセボからの予測される変化はわずかに高く、２．６９４６～２．８６０４μｇ／ｍＬの範囲であった。５及び１０ｍｇの両方についてのプラセボに対する予測された応答は、全てのモデルについて統計的に有意であり、ｐ値は＜０．０００１であった。
１、２及び３μｇ／ｍＬのベースライン及びプラセボ補正シトルリン増加に必要なアプラグルチド用量レベルを予測した（表２５）。シグモイドＥｍａｘモデルのＥｍａｘは＜３μｇ／ｍＬであったので、このモデルについては２．５μｇ／ｍＬの変化を最大応答として選択した。１μｇ／ｍＬのシトルリン増加についての予測アプラグルチド用量は、Ｅｍａｘ、ＬｏｇＬｉｎ及びシグモイドＥｍａｘモデルについて、それぞれ１．２３３３ｍｇ、１．２２４９ｍｇ及び１．３６０６ｍｇであった。２μｇ／ｍＬのシトルリン増加を誘発するために、予測されるアプラグルチド用量は、Ｅｍａｘ、ＬｏｇＬｉｎ及びシグモイドＥｍａｘモデルについて、それぞれ３．８４７１ｍｇ、４．２０１１ｍｇ及び３．４０４２ｍｇであった。最後に、２．５又は３μｇ／ｍＬのプラセボからの変化についての予測アプラグルチド用量は、Ｅｍａｘ、ＬｏｇＬｉｎ及びシグモイドＥｍａｘモデルを使用して、それぞれ１３．１０５３ｍｇ、１１．４３２５ｍｇ及び６．４６１９ｍｇであった。特に２．５又は３μｇ／ｍＬの効果を達成するためには、予測されるアプラグルチド用量の不確実性がかなり大きいことに留意すべきである。
ＣＩ＝信頼区間、Ｅｍａｘ＝最大効果。ＮＤ＝測定せず。＊シグモイドＥｍａｘモデルのＥｍａｘは＜３μｇ／ｍＬであったので、最大応答を２．５μｇ／ｍＬに設定した。０（プラセボ）、１、５及び１０ｍｇのアプラグルチドの用量に基づいて予測を実施し、平均ベースライン値及び３５～４２日目（＝６週目）のデータからなるシトルリン応答データを得た。９５％ＣＩ及びｐ値を用いた推定変化／用量を予測ごとに示す。
共変量の調整
全ての薬力学的エンドポイント（シトルリン、ブリストル便スケール及び体重）について、予備値を共変量として使用した。スクリーニング値を平均ベースラインの計算にも使用したブリストル便スケールを除いて、スクリーニング後及び投薬前の全ての予備値から平均予備値を計算した。シトルリンの平均予備値も、シグモイドＥｍａｘモデルを除いて、ＭＣＰ－ＭＯＤにおける共変量として使用した。これは、６週目の値から、予備値にＭＣＰ部分の線形モデルの傾きを乗じたものを減算することによって対処された。
薬物用量、薬物濃度、及び応答との関係
用量レベルによるアプラグルチドの１回目の投薬後の時間に対する血漿中アプラグルチド濃度を図２０Ａ～図２０Ｂに示す。アプラグルチドの要約薬物動態パラメータを表２６に提供する。
平均の見かけの総クリアランス（ＣＬ／Ｆ）は、３つの用量レベルにわたって一定であるようであり、１６．４８０（５ｍｇ）～２０．７４７Ｌ／ｄ（１０ｍｇ）の範囲であった（表２６）。最終投薬後の終末消失相（Ｖｚ／Ｆ）の間の分布の平均見かけ体積は、５及び１０ｍｇについてそれぞれ５５．４２６及び１０５．０２１Ｌの値で用量依存性であるようであった。１ｍｇ用量群についてＶｚ／Ｆを決定するために利用可能なデータ点は
不十分であった（不十分な数の試料が、最後の投薬後のサンプリング期間中に定量化の下限を上回った）。
アプラグルチドの１回目の週１回のＳＣ投薬後、血漿中アプラグルチド濃度は、全ての対象（次の投薬まで検出できる濃度を有さなかった１ｍｇの対象１００２を除く）において明らかな遅延時間なしに増加した。Ｃｍａｘは、１日目に、それぞれ１ｍｇ、５ｍｇ及び１０ｍｇのアプラグルチドを投与された４人、４人及び１人の対象によって達成された（図２０）。残りの対象は、２日目にＣｍａｘに達した。１ｍｇの対象は、４日目又は７日目に定量限界（limit of quantification、ＬＯＱ）を下回ったが、５ｍｇ及び１０ｍ
ｇの対象は、次の用量までＬＯＱを上回ったままであった。１回目の投薬後の曝露は用量依存的であり、１、５及び１０ｍｇ用量群についてそれぞれ１３．９１８±１１．２、９４．０８８±５０．５及び１３６．８５５±５５．０ｎｇ／ｍＬの平均Ｃｍａｘ、並びにそれぞれ３５．２１４、３００．２６９及び４７６．９３７ｄ＊ｎｇ／ｍＬのＡＵＣｔａｕ値であった（表２６）。５ｍｇ用量群における用量＃６の後に測定された半減期（ｈ）は、７２．７±２３．０と測定され、１０ｍｇ用量群における用量＃６の後に測定された半減期は、７６．３±２７．６と測定された。
次の５用量のＣｔｒｏｕｇｈにおいて、５人の対象（全て１ｍｇを投薬された）は、アプラグルチドについて検出不能であった１つ又は複数の試料を有した。他の全ての対象は、測定できるアプラグルチド濃度を示した。６用量にわたる平均Ｃｔｒｏｕｇｈは、１ｍｇアプラグルチドについて０．０００（１週目）～０．８７３ｎｇ／ｍＬ（４週目）、５ｍｇアプラグルチドについて７．６０５（５週目）～１０．１６３ｎｇ／ｍＬ（４週目）、及び１０ｍｇアプラグルチドについて１３．７１０（６週目）～１８．４６０ｎｇ／ｍＬ（２週目）の範囲であった（表２６）。
アプラグルチドの６回目及び最後の週１回のＳＣ投薬の後、全ての対象（対象３００４は投薬中止のため除外された）は、アプラグルチド濃度の増加を示し、明らかな遅延時間はなかった。対象は、２日後にＣｍａｘに達した、それぞれ５及び１０ｍｇの２及び３人の対象を除いて、最終投薬の１日後にＣｍａｘに達した。最終投薬後２週間まで、薬物動態パラメータを評価した。１ｍｇでの全ての対象及び５ｍｇでの１人の対象は、最後の２つ又は３つの試料において定量不可能な濃度を有した。残りの対象（１０ｍｇの全ての対象を含む）は、最後の薬物動態学的試料において、４．４６ｎｇ／ｍＬまでのなお定量可能な濃度を有した。
ＡＵＣｌａｓｔ＝時間０から最後の測定可能な濃度までの血漿濃度－時間曲線下面積、ＡＵＣｔａｕ＝対応する投薬の治療期間の終了までの血漿濃度－時間曲線下の面積、ＣＬ／Ｆ＝見かけの総クリアランス、Ｃｍａｘ＝最大濃度、Ｃトラフ＝次の投薬直前の血漿濃度、ｌａｍｂｄａ ｚ＝末端脱離速度定数、ＰＫ＝薬物動態、ｔ１／２＝終末消失半減期、ｔｍａｘ＝最大血漿濃度に達するまでの時間、Ｖｚ／Ｆ＝最終消失相の間の見かけの分布容積。
＊１名の欠損対象（Ｎ＝５）、＊＊２名の欠損対象（Ｎ＝４）及び＊＊＊３名の欠損対象（Ｎ＝３、ＰＫパラメータは計算せず）。定量限界未満の値（＜１ｎｇ／ｍＬ）を０に設定した。他に示されない限り、対象の数は６である。
６回目の投薬後に観察された濃度プロファイルは、１回目の投薬に匹敵するようであったが、曝露はわずかに高かった（図２０）。曝露は、１、５及び１０ｍｇ用量群について、それぞれ０．０２４２４、０．０２４９６及び０．０１８２４ｎｇ／ｍＬ／μｇの平均Ｃｍａｘ／用量並びに０．０５９４４、０．０７１５３及び０．０５８２４ｄ＊ｎｇ／ｍＬ／μｇのＡＵＣｔａｕ／用量との用量比例性を示した（表２６）。
１ｍｇを投薬された６人の対象のうち３人において、最終消失速度定数を決定するために利用可能なデータ点が不十分であった（不十分な数の試料が、最終投薬後のサンプリング期間中に定量化の下限を上回った）。続いて、平均半減期を５及び１０ｍｇ用量群についてのみ決定し、２つの群の間で同等であった（それぞれ３．０４及び３．１８日）。
Ｃｍａｘ及びＡＵＣｔａｕの変動性は、それぞれ１４５．５及び１４５．３％の％ＣＶで１ｍｇの第１の用量の後に顕著であった（表２６）。１ｍｇの最後の用量並びに５及び１０ｍｇ用量レベルの最初及び最後の用量の両方の後、変動性はより低かった。Ｃｍａｘの％ＣＶは、３９．９～６４．６％の範囲であり、ＡＵＣｔａｕの％ＣＶの対応する範囲は、２３．１～５２．４％であった。
用量正規化された薬物動態パラメータＣｍａｘ及びＡＵＣｔａｕ値の目視検査は、１～１０ｍｇの用量範囲にわたって、アプラグルチドが線形速度論に従うことを示唆した。これは、付随する一定のＣＬ／Ｆと一致する。
シトルリンと同様に、Ｈｅｌｍｅｒｔのアプローチを使用して、アプラグルチドについて用量レベルごとの統計的定常状態分析を実施した。この定常状態分析は、２週目の平均Ｃｔｒｏｕｇｈ（－３．６１６、９５％ＣＩ：－５．８９３；－１．３９９及びｐ＝０．００２３）に対して、１０ｍｇについて３～６週目にわたる平均Ｃｔｒｏｕｇｈを除いて、いずれの対比も統計的に有意でないことを明らかにした。データの目視検査は、調査した全ての用量レベルで１回目の投薬後に定常状態に達したことを示唆している。
グラフ分析を実施して、アプラグルチド濃度－シトルリン効果の関係を評価した。一部の個々のシトルリンパラメータ（Ｒｍａｘ及びＲｐｒｅ－ｄｏｓｅ）を、アプラグルチド薬物動態パラメータ（Ｃｍａｘ、Ｃｔｒｏｕｇｈ及びＡＵＣｔａｕ）に対してプロットした。用量６で評価されたパラメータについて、回帰直線を作成した。傾きのｐ値は、Ｃｍａｘについて、Ｒｍａｘに対して０．０６０８の値でほぼ有意に達した（図２１）。ＡＵＣｔａｕは、Ｒｍａｘと正に相関しているようであり、ｐ値は０．０３７７であった（図２２）。回帰直線によれば、６週目におけるＡＵＣｔａｕの各１００ｄ＊ｎｇ／ｍＬの増加について、対応する最大シトルリン応答は、０．３９μｇ／ｍＬ増加した。Ｒ二乗値は、Ｒｍａｘの変動性の２６％がＡＵＣｔａｕによって説明されることを示した。図２３、図２４、及び図２５に示すように、６週目に用量レベルによって評価された全てのアプラグルチド及びシトルリン濃度の相関図は、測定されたアプラグルチド濃度とシトルリン効果との間に時間遅延があったので、反時計回りのヒステリシスを明らかにした。
薬物動態
平均ＣＬ／Ｆは３つの用量レベルにわたって一定であり、１６．４８０（５ｍｇ）～２０．７４７Ｌ／日（１０ｍｇ）の範囲であった。平均Ｖｚ／Ｆは、５及び１０ｍｇ用量群についてのみ決定され、５及び１０ｍｇについてそれぞれ５５．４２６及び１０５．０２１Ｌの値で用量依存性であった。平均ｔ１／２は、５及び１０ｍｇアプラグルチド用量群についてのみ決定することができ、これらの群について同等であった（それぞれ、３．０４及び３．１８日）。
アプラグルチドの１回目の週１回のＳＣ投薬後の曝露は、１、５及び１０ｍｇ用量群に
ついてそれぞれ１３．９１８、９４．０８８及び１３６．８５５ｎｇ／ｍＬの平均Ｃｍａｘ、並びにそれぞれ３５．２１４、３００．２６９及び４７６．９３７ｄ＊ｎｇ／ｍＬのＡＵＣｔａｕ値を有する用量比例性を示した。６回目の投薬後に観察された濃度プロファイルは、１回目の投薬に匹敵したが、曝露は数値的により高かった。曝露は、１、５及び１０ｍｇ用量群について、それぞれ０．０２４２４、０．０２４９６及び０．０１８２４ｎｇ／ｍＬ／μｇの平均Ｃｍａｘ／用量並びに０．０５９４４、０．０７１５３及び０．０５８２４ｄ＊ｎｇ／ｍＬ／μｇのＡＵＣｔａｕ／用量との用量比例性を示した。用量１及び６において、ｔｍａｘは、１ｍｇ及び５ｍｇのアプラグルチド用量については約１日であり、１０ｍｇの用量については２日であった。
用量正規化された薬物動態パラメータＣｍａｘ及びＡＵＣｔａｕ値の目視検査は、１～１０ｍｇの用量範囲にわたって、アプラグルチドが線形速度論に従うことを示唆している。データの目視検査は、調査した全ての用量レベルで１回目の投薬後に定常状態に達したことを示唆している。
薬力学
アプラグルチドの１回目及び最終投薬後、シトルリン濃度は用量依存的に増加した。最終投薬後に観察された平均シトルリン増加は、１０ｍｇ用量と比較して、１ｍｇ及び５ｍｇ用量でより急速に低下するようであった。Ｒｔ１／２は、両方とも１０ｍｇを投薬された２人の対象についてのみ評価することができ、６．５及び１１．０日であることが見出された。
用量６では、平均Ｒｍａｘは、１、５及び１０ｍｇの最終用量後にそれぞれ７．１７０２、８．１５７７及び８．７２５４μｇ／ｍＬであり、２．０、３．９及び３．９日目に到達した。対応するプラセボ値は、最終投薬の１６．９日後に６．３７０７μｇ／ｍＬであった。これらのＲｍａｘ値は、全試験期間にわたって平均Ｒｍａｘと同等であった。データの目視検査は、調査した全ての用量レベルで１回目の投薬後に定常状態に達したことを示唆している。
アプラグルチドの有意な治療効果が、シトルリンについて観察された（ｐ＝０．０００７）。アプラグルチドはシトルリンの増加を誘導した。この応答は統計的に有意であり、プラセボと比較して５ｍｇのアプラグルチドでは１．２５７４μｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ：０．５０３７；２．０１１２；ｐ＝０．００２５）、１０ｍｇのアプラグルチドでは１．６３４３μｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ：０．８８０９；２．３８７８；ｐ＝０．０００２）の増加であり、１ｍｇのアプラグルチドではプラセボと比較した増加は統計的に有意ではなかった（０．３１４６μｇ／ｍＬ、９５％ＣＩ：－０．４３７１；１．０６６３；ｐ＝０．３９１０）。用量群間の対比は、５及び１０ｍｇ用量が、１ｍｇ用量と比較して有意に高いシトルリンレベルを誘導したことを示した（それぞれ０．９４２９μｇ／ｍＬ、９５％ＣＩ：０．１７６８；１．７０８９；ｐ＝０．０１８６及び１．３１９８μｇ／ｍＬ、９５％ＣＩ：０．５５８６；２．０８１０；ｐ＝０．００１８）。重要なことに、５ｍｇと１０ｍｇとのアプラグルチドの間の差は統計的に有意ではなかったが、１０ｍｇの後の効果は５ｍｇの後よりもわずかに高いようであった。
ブリストル大便スケールに対するアプラグルチドの有意な治療効果が、０．０１８９のｐ値で観察された（全ての用量群をプラセボと比較した）。プラセボと比較して有意な減少のみが１及び５ｍｇ用量群で観察されたので、この効果は用量依存的ではなかった（それぞれ－０．９、９５％ＣＩ：－１．６；－０．３；ｐ＝０．００９２、及び－１．０、９５％ＣＩ－１．７；－０．４；ｐ＝０．００４６）。
探索的グラフ分析は、用量６でのＲｍａｘに対するＣｍａｘについての回帰直線の傾き
が、０．０６０８のｐ値でほぼ有意に達したことを明らかにした。ＡＵＣｔａｕは、Ｒｍａｘと正の相関があるようであり、ｐ値は０．０３７７であった。回帰直線によれば、６週目におけるＡＵＣｔａｕの各１００ｄ＊ｎｇ／ｍＬの増加について、対応する最大シトルリン応答は、０．３９μｇ／ｍＬ増加した。Ｒ二乗値は、Ｒｍａｘの変動性の２６％がＡＵＣｔａｕによって説明されることを示した。６週目に評価された全てのアプラグルチド及びシトルリン濃度の相関プロットは、反時計回りのヒステリシスを明らかにした。
ＭＣＰ－ＭＯＤ手順は、３つの候補の予め指定されたモデル、すなわち１）Ｅｍａｘ、２）ＬｏｇＬｉｎ及び３）シグモイドＥｍａｘモデルが、ＭＣＰ部分における用量応答に最も適合する同様の結果をもたらしたことを示した。これらの３つのモデルは全てＭＯＤ部分に適用され、１、５及び１０ｍｇのアプラグルチドの用量についてプラセボからの同様のシトルリン変化を予測した。１ｍｇの用量では、３つのモデルにわたるシトルリンの予測されたプラセボ及びベースライン補正された変化は、０．７１２５～０．８７１２μｇ／ｍＬの範囲であり、Ｅｍａｘ（ｐ＝０．０１８４）及びＬｏｇＬｉｎ（ｐ＝０．０２３８）モデルについて有意な結果であった。シグモイドＥｍａｘモデルでは、ｐ値は０．０６４５であった。５ｍｇの用量では、応答は２．１６５２～２．３３２７μｇ／ｍＬの範囲であった。１０ｍｇ用量では、２．６９４６～２．８６０４μｇ／ｍＬの範囲のわずかに強い応答が得られた。５及び１０ｍｇの両方についてのプラセボに対する予測された応答は、全てのモデルについて統計的に有意であり、ｐ値は＜０．０００１であった。
１、２及び３μｇ／ｍＬのベースライン及びプラセボ補正シトルリン増加に必要なアプラグルチド用量レベルを予測した。シグモイドＥｍａｘモデルのＥｍａｘは＜３μｇ／ｍＬであったので、このモデルについては、２．５μｇ／ｍＬの変化を最大応答として設定した。１μｇ／ｍＬのシトルリン増加に対する予測アプラグルチド用量は、それぞれＥｍａｘ、ＬｏｇＬｉｎ及びシグモイドＥｍａｘモデルについて、１．２３３３ｍｇ（９５％ＣＩ：－０．０４２４６；２．５０９１）、１．２２４９ｍｇ（９５％ＣＩ：－０．２１６９；２．６６６７）及び１．３６０６ｍｇ（９５％ＣＩ：０．２６８０；２．４５３２）であった。２μｇ／ｍＬのシトルリン増加を誘発するために、予測されたアプラグルチド用量は、それぞれＥｍａｘ、ＬｏｇＬｉｎ及びシグモイドＥｍａｘモデルについて、３．８４７１ｍｇ（９５％ＣＩ：０．３５３４；７．３４０９）、４．２０１１ｍｇ（９５％ＣＩ：０．６４０６；７．７６１７）及び３．４０４２ｍｇ（９５％ＣＩ：－０．１２９０；６．９３７４）であった。２．５又は３μｇ／ｍＬのプラセボからの変化について予測されたアプラグルチド用量は、それぞれＥｍａｘ、ＬｏｇＬｉｎ及びシグモイドＥｍａｘモデルを使用して、１３．１０５３ｍｇ（９５％ＣＩ：－６．３０６８；３２．５１７３）、１１．４３２５ｍｇ（９５％ＣＩ：１．５８０８；２１．２８４３）及び６．４６１９ｍｇ（９５％ＣＩ：－０．５５２１；１３．４７５９）であった。
ＰＤ／ＰＫモデル
臨床薬物動態学的観察は、Ｖ１／Ｆ及びＣｌ／Ｆと、吸収持続時間に関する用量共変量並びにＶ１／Ｆ及びＣｌ／Ｆに関する体重共変量との間の相関を有するモデルによって最もよく一致した。次いで、薬力学的観察をこのモデルに加えて、ＰＫ／ＰＤモデルを作成した。血漿シトルリンは、代謝回転モデル及び最大ＰＤ効果モデルによって記載された。
母集団ＰＫ／ＰＤモデルは、アプラグルチド５ｍｇ皮下注射を受けた７０ｋｇの個体が、１．３９日で３１．３Ｌの分布容積及びピーク血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を達成すると推定した。アプラグルチド２．５、５、又は１０ｍｇの毎週の皮下注射による、シミュレートされたアプラグルチド及びシトルリンの血漿中濃度プロファイルを図２６に示す。
ＰＫ／ＰＤモデルは、経時的なアプラグルチドのいかなる蓄積も示さなかった。シトルリンの蓄積は、治療の最初の３週間の間に明らかであったが、その後、定常状態濃度に達
した。体重によるシミュレートされたアプラグルチド濃度－時間プロフィールは、体重の増加とともに、定常状態でより低い曲線下面積（area-under-the curve、ＡＵＣ）及びＣｍａｘを示した。
実施例８：アプラグルチド製造プロセス－（ＩＩ）
以下は、以前に説明された合成経路（例えば、米国特許第８，５８０，９１８号）と比較して改善された純度レベルでアプラグルチドを製造するための本開示の例示的な方法である。
固相ペプチド合成（ステップ１）
ＳＰＰＳは、以下のステップを包含するサイクルの反復による、固体支持体上に固定されたペプチド鎖の逐次合成である。
１．ペプチド樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去
１ａ．一部の態様では、残基Ａｓｐ３のＦｍｏｃ脱保護反応は、ＤＭＦ中の１０％ピペリジン及び２％オキシマの溶液で樹脂を処理することを含む。脱保護反応を２サイクルで実施し、第１のサイクルは１５分間、第２のサイクルは３０分間である。
２．ＤＭＦ洗浄
３．Ｆｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨのカップリング
４．カップリング試験
５．ＤＭＦ洗浄
このサイクルは、ペプチド配列が完了するまで繰り返される。
アミノ酸のα－アミノ基は、塩基感受性９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護される。側鎖官能基は酸不安定基で保護されている。本プロセスで使用される全てのアミノ酸誘導体は市販されている。
ＳＰＰＳは、固体支持体上に固定されたペプチド鎖の逐次合成である。合成では、ＭＢＨＡ樹脂を用いてペプチド配列を組み立てることができる。樹脂を膨潤させ、ＤＭＦで洗浄し、次いで、窒素雰囲気下、ＤＭＦ／ＤＩＥＡで洗浄した後、Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミドリンカーを、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＨＯＢｔを使用してカップリングさせることができる。カップリング後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、次いでＡｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡを使用してアセチル化することができる。カイザー試験を実施して、カップリングの完了を確認することができる。
樹脂をＤＭＦで洗浄した後、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸をそれぞれ以下のサイクルに従って樹脂結合ペプチドにカップリングさせる。
１．Ｆｍｏｃ－保護基をＤＭＦ中のピペリジンで除去し、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄する。
２．カップリングは、活性化のためにＤＩＣ／オキシマを使用して、可変アミノ酸当量を用いてＤＭＦ中で実施する。
２ａ．一部の態様では、ジペプチドＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨは、Ｇｌｙアミノ酸及びＨｉｓアミノ酸の連続的な組み立ての代わりに樹脂にカップリングされる。ジペプチドを、カップリング反応に添加する前に、７ｍＬのＤＭＦ中のＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨ／オキシマ／ＤＩＣ（２．５ｍｍｏｌ／２．５ｍｍｏｌ／２．５ｍｍｏｌ）を使用して２０℃±２℃で１時間予備活性化する。カイザー試験を実施して、カップリングの完了を確認することができる。
３．アミノ酸のカップリングは、各合成サイクル中に実施されるニンヒドリンアッセイを使用することによってモニタされる。
組み立ての最後に、最後のアミノ酸をカップリングし、脱保護した後、樹脂をＤＭＦ及びイソプロパノールで洗浄し、真空下で乾燥させる。
樹脂からのペプチドの切断及び脱保護（ステップ２）
保護されたペプチドは、ＴＦＡ／水／アニソールの混合物で処理することによって、同時に樹脂から切断し、脱保護することができる。続いて、ＭＴＢＥをペプチド／ＴＦＡスラリーに添加して、切断された樹脂の存在下で粗ペプチドを沈殿させる。得られた粗ペプチドを濾過し、ＭＴＢＥで洗浄し、真空下で一定重量まで乾燥させる。
脱炭酸反応（ステップ３ａ）
粗ペプチドを、アンモニア緩衝液中のＨ２Ｏ／ＡＣＮ（７０：３０比）の混合物中に可溶化する。溶液を、２５％酢酸又はＨ２Ｏ中の２５％ＮＨ４ＯＨを使用して標的ｐＨ８．０±０．１に調整する。脱炭酸反応を５０℃で６５分間維持する。粗ペプチドをｐＨ８．０±０．１のアンモニア緩衝液中のＨ２Ｏ／ＡＣＮ（７０：３０比）の溶液で洗浄し、５℃±３℃で保存する。
分取ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製（ステップ３ｂ）
粗ペプチドを水／アセトニトリル／ＮＨ４ＯＨの混合物に溶解する。この溶液を酢酸で希釈し、次いで濾過する。
一次精製は、ＮａＨＣＯ３／Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮを溶出液として用いる分取ＲＰ－ＨＰＬＣで実施する。カラムからの溶出をＵＶでモニタし、得られた画分をＲＰ－ＨＰＬＣで分析する。モニタリング基準を満たす画分を、合わせたプール中で混合する。モニタリング基準を満たさない画分は、精製ステップを繰り返すことによってリサイクルされ得る。プールの純度を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより制御する。
分取ＲＰ－ＨＰＬＣによるナトリウム塩の変換（ステップ４）
このステップは、ｐＨ変化を介してペプチドの対イオンをＴＦＡアニオンからナトリウムカチオンに交換し、ペプチドを更に精製するために実施され得る。ステップ３からの合わせたプールを水で希釈し、ＮａＯＡｃ溶出液を使用する分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって再精製する。
続いて、精製されたペプチド溶液を真空下での蒸発に供して、溶液中のアセトニトリルを減少させる。次いで、精製されたペプチド溶液を、０．１％ＡｃＯＨを使用して標的ｐＨ７．９に調整する。
純粋なプールを濃縮し、凍結乾燥することができる。プールの純度をＲＰ－ＨＰＬＣにより分析する。
凍結乾燥及びパッケージング（ステップ５）
凍結乾燥の前に、溶液中の精製されたペプチドを、０．２μｍ膜を通して濾過する。凍結乾燥は低圧で行われる。得られた凍結乾燥最終ペプチドをアルゴン下で充填する。凍結乾燥アプラグルチドをアプラグルチド規格に従って制御する。
再処理
アプラグルチド規格で確立された基準を満たさない凍結乾燥アプラグルチドは、再精製に供することができる。
再精製は、上記のように、精製ステップ及び対イオン変換ステップを繰り返すことによって、ペプチドの再構成後に実施され得る。
再精製後、この物質を上記の手順に従って凍結乾燥する。
アプラグルチド規格において確立された基準を満たさない凍結乾燥アプラグルチドは、再凍結乾燥に供され得る。
再凍結乾燥は、上記のように、凍結乾燥ステップを繰り返すことによって、ペプチドの再構成後に実施され得る。
不純物
実施例８に記載したアプラグルチド製造プロセスを実施して、アプラグルチド中のβ－Ａｓｐ３ペプチド異性体不純物のレベルを１．５％未満に減少させた。一部の実施形態では、実施例８に記載されたアプラグルチド製造プロセスは、アプラグルチド中のβ－Ａｓｐ３ペプチドイソマー不純物のレベルを１％未満に減少させた。
β－Ａｓｐ３不純物の形成は、高いｐＨ及び配列Ａｓｐ３－Ｇｌｙ４の存在によって支持される。Ａｓｐ－Ｇｌｙ配列は、閉環（β－カルボキシ側鎖上のα－カルボキシアミド結合からの窒素の攻撃）に起因するアスパルチミド形成を特に受けやすい。アスパルチミドは、塩基触媒によるエピマー化を受けやすく、開環反応を受ける場合があり、これは複数の副生成物の形成をもたらす場合がある。水による攻撃は、β－アスパルチルペプチドを生成し得る。
樹脂からのペプチド切断の際の脱炭酸／抽出ステップ（ステップ３ａ）の間のβ－Ａｓｐ３不純物の形成は、＞１％のレベルに達し得、極端なｐＨ（特に、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ８０：２０中のアンモニアの強塩基溶液、室温で約１０のｐＨ）への長期の曝露によって促進される。実施例８に記載したアプラグルチド製造プロセスは、ｐＨを１０から８に低下させ、脱炭酸反応時間を２４時間から６５分に短縮し、反応温度を室温から５０℃に変化させ、保存温度を室温から５℃に低下させた。これらの変化は、１．５％未満のレベルでβ－Ａｓｐ３不純物を生じた。一部の実施形態では、これらの変化は、１％未満のレベルでβ－Ａｓｐ３不純物を生じた。
実施例８に記載されたアプラグルチド製造プロセスは、残基Ａｓｐ３のＦｍｏｃ脱保護反応を修正して、ＤＭＦ中の１０％ピペリジン及び２％オキシマの溶液を使用し、２サイクルの脱保護（第１のサイクルは１５分間、第２のサイクルは３０分間）を行った。これらのより穏やかな塩基性条件は、Ａｓｐ３の完全な脱保護を可能にし、アスパルチミド及びその後のβ－Ａｓｐ３副生成物形成を減少させた。
Ｄ－Ｈｉｓ不純物の形成は、ＤＩＣ／オキシマを使用するカップリング反応の間のアミノ酸のラセミ化に起因して生じ得る。個々のＧｌｙ及びＨｉｓアミノ酸の連続的組み立てのプロセスは、０．３％～１．２％の間のＤ－Ｈｉｓ不純物のレベルの変動性を示し、時には不完全なカップリングを伴った。カップリング試薬ＤＩＣ／オキシマを用いたＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨの取り込みは、ＨｉｓのＤ型へのラセミ化に有利であり得る。
実施例８に記載されるようなアプラグルチド製造プロセスは、Ｇｌｙアミノ酸及びＨｉｓアミノ酸の連続的な組み立ての代わりに、この反応のための出発物質としてジペプチドＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨを使用した。これは、Ｈｉｓ中のラセミ化レベルを１％未満（１回の実施バッチで０．３％）に減少させることを可能にし、最終Ｄ－Ｈｉｓレベルをジペプチド（Ｂｏｃ－Ｄ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の仕様に組み込む。これはまた、脱保護ステップの数の減少を可能にし、したがって、上記のように、
β－Ａｓｐ３不純物形成に対する脱保護条件（高ｐＨ）の寄与する影響を最小にする。
実施例９：本開示のアプラグルチド組成物の投与の第３相ヒト臨床試験
以下の非限定的な実施例では、ＳＢＳ－ＩＦを有する対象が本開示のアプラグルチド配合物で治療される第３相臨床試験を説明する。この第２相臨床試験は、ＳＢＳ－ＩＦを有する患者における腸管外支持依存性を低減することにおける毎週の皮下アプラグルチドの有効性を調査する。
ＳＢＳ－ＩＦを有する１４４人の成人患者を、本開示のアプラグルチド組成物又はプラセボで治療する。ＳＢＳ－ＩＦを有する患者は、対象が５０ｋｇ未満の体重を有する場合、２．５ｍｇの本開示のアプラグルチド、又は対象が５０ｋｇ以上の体重を有する場合、５ｍｇの本開示のアプラグルチド、又はプラセボを週１回、４８週間投与される。
試験は、多施設、二重盲検、無作為化、プラセボ対照、第３相試験である。参加者の無作為化は、ストーマ及び結腸連続性の解剖学的構造特異的無作為化を含む。
一次エンドポイント有効性評価を２４週目に実施する。主要評価項目は、実際の週１回のＰＳ量におけるベースラインからの相対的変化を評価する。二次エンドポイント有効性評価は、２４週目及び４８週目に行われる。解剖学的構造に特異的な二次エンドポイント並びに全ての患者に共通する二次エンドポイントを評価する。
評価される二次エンドポイントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
１．２４／４８週目でＰＳの少なくとも１日／週の減少を達成する対象。
２．１２／２４／４８週目における実際の週１回のＰＳ量のベースラインからの相対的変化。
３．ＳＢＳ－ＩＦ患者は、２４／４８週目で腸内自律性に達した。
４．２０／２４週目でのベースラインからのＰＳ体積の少なくとも２０％の減少。
５．２４週目での非経口栄養（ＰＮ）におけるカロリー低下。
６．患者の重症度の全体的印象（Patient Global Impression of Severity、ＰＧＩＳ
）のベースラインからの変化
７．ピッツバーグ睡眠質問票（Pittsburgh Sleep Quality Inventory、ＰＳＱＩ）のベースラインからの変化
８．患者の全般的な変化（Patient Global Impression of Change、ＰＧＩＣ）のベー
スラインからの変化。
９．集団ＰＫデータ解析によるアプラグルチドの吸収率定数（ｋａ）
１０．集団ＰＫデータ解析によるアプラグルチドの見かけのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）
１１．集団ＰＫデータ解析によるアプラグルチドの見かけの分布容積（Ｖｚ／Ｆ）
実施例１０：本開示のアプラグルチド組成物の投与の第１相ヒト臨床試験
以下の非限定的な実施例では、正常及び腎機能障害を有する対象が本開示のアプラグルチド配合物で治療される第１相臨床試験を説明する。この第１相臨床試験は、種々の程度の腎臓機能を有する対象における５ｍｇアプラグルチドの単回皮下投与の薬物動態及び安全を調査する。腎機能は、慢性腎疾患疫学（Chronic Kidney Disease Epidemiology、Ｃ
ＫＤ－ＥＰＩ）クレアチニン方程式に従って、推定糸球体濾過量（estimated glomerular
filtration rate、ｅＧＦＲ）によって計算される。
試験は、２段階、非盲検、多施設、非無作為化、第１相試験である。試験の第１部では、重度の腎機能障害を有する８人の対象（コホート１）及び正常な腎臓機能を有する６人の対象（コホート２）に、単回用量５ｍｇの本開示のアプラグルチドを投与する。試験の
第２部では、中等度の腎機能障害を有する８人の対象（コホート３）及び軽度の腎機能障害を有する８人の対象（コホート４）に、単回用量５ｍｇの本開示のアプラグルチドを投与する。対照群と比較した重度腎機能障害群についてのＡＵＣｉｎｆ又はＡＵＣｌａｓｔの幾何平均比（geometric mean ratio、ＧＭＲ）が≧２である場合、対象を登録する。
患者の適格性は、スクリーニング来院中に評価される。主な組み入れ基準は以下の通りである。
１．全ての参加者
ａ．１８歳以上７５歳以下
ｂ．試験手順に従う意思があり、従うことができる対象
ｃ．同意書を理解することができ、署名する意思がある対象
ｄ．≧１７．５～≦４０ｋｇ／ｍ２の肥満度指数（ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ、ＢＭＩ）；及び≧５０ｋｇ（１１０ｌｂ）の総体重
ｅ．試験中及び試験終了（end of trial、ＥＯＴ）来院後１ヶ月間の非常に有効な避妊方法を受けている妊娠可能な女性（women of childbearing potential、ＷＯＣＢＰ）
不妊又は不妊又は閉経後の女性。
ｆ．妊娠の可能性がある女性パートナーを有する男性対象：非常に有効な避妊方法であり、試験中及び（ＥＯＴ）来院後１ヶ月間、精子提供なし。
２．健康な参加者
ａ．臨床的に関連する異常（病歴、バイタルサイン、ＥＣＧ、安全性検査）がない
ｂ．２回のスクリーニング来院時にＣＫＤ－ＥＰＩによって測定されたｅＧＦＲ≧９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
ｃ．腎機能障害を有する対象の群と人口統計学的に同等である
３．腎機能障害を有する参加者
ａ．重度の腎機能障害：ｅＧＦＲ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２であるが、血液透析を必要としない
ｂ．中程度の腎機能障害：ｅＧＦＲ≧３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２かつ＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
ｃ．軽度腎機能障害：ｅＧＦＲ≧６０かつ＜９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
一次エンドポイント有効性評価を、単回投薬の２４０時間後に実施する。一次エンドポイントは、最大血漿（Ｃｍａｘ）、０から無限大までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）及び０から２４０時間までの最後の測定可能な濃度までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）を評価する。二次エンドポイント有効性評価は、２４０時間、７日、１４日、及び２８日に実施される。一次及び二次エンドポイントは、全ての対象にわたって評価される。
評価される二次エンドポイントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
１．時間０～７日の最後の測定可能な濃度までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０～７日）。単回投薬後１６８時間にわたって試料を収集した
２．最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）。単回投薬後２４０時間にわたって試料を収集した
３．最終消失速度定数。単回投薬後２４０時間にわたって試料を収集した
４．最終消失半減期。単回投薬後２４０時間にわたって試料を収集した
５．血管外投与後の見かけのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）。単回投薬後２４０時間にわたって試料を収集した。
６．血管外投与後の見かけの分布容積（Ｖｚ／Ｆ）。単回投薬後２４０時間にわたって試料を収集した。
７．１４～２８日目に有害事象又は特に関心のある有害事象を有する参加者の数
８．１４～２８日目におけるバイタルサインのベースラインからの臨床的に有意な変化
９．１４～２８日目の記録された三連の１２誘導ＥＣＧにおけるベースラインからの臨床的に有意な変化
１０．１４～２８日目に臨床検査評価においてベースラインからの臨床的に有意な変化を経験した参加者の数
当業者には理解されるように、腎機能障害は、肝臓／腸の薬物代謝の一部の経路に悪影響を及ぼす可能性があり、吸収、血漿タンパク質結合、輸送、及び組織分布の変化などの他の変化にも関連しているので、腎機能障害を有する患者は、通常、薬物投薬の調整を必要とする。例え薬物動態データが、腎排出がアプラグルチドの主要な排出経路ではないことを示したとしても、他のＧＬＰ－２類似体（すなわちテヅグルチド）は、中等度及び重度の腎機能障害並びに末期腎臓疾患を有する患者において用量低減を必要とする。実施例１０に記載の試験において、重度のＣＫＤを有する患者にアプラグルチド５ｍｇを投薬することが、この集団における過剰摂取のリスクなしに安全であることが見出された。理論に拘束されることを望むものではないが、このことは、アプラグルチドが適合なしに腎機能障害患者に投薬される可能性を有することを示す。
薬物動態
５ｍｇのアプラグルチドの単回皮下投薬後のアプラグルチドの血漿中濃度を、健康な対象（コホート２）及び重度のＣＫＤを有する対象（コホート１）の両方において２４０時間にわたってモニタリングし、図２９に示す。
アプラグルチドの薬物動態パラメータの概要を表２７に示す。個々のアプラグルチド血漿中濃度曲線を分析する際に、２つの外れ値が特定された（各コホートに１つ）。コホート１における外れ値は、この群において最も高い体重（bodyweight、ＢＷ）及びボディマス指数（ＢＭＩ）を有したが、コホート２における外れ値は、この群において最も低いＢＷ及びＢＭＩを有した。幾何平均比を、外れ値対象を用いて及び用いずに計算した。
Ｃｍａｘ＝最大血漿、ＡＵＣｉｎｆ＝０から無限大までの濃度－時間曲線下面積。
全対象集団について、Ｃｍａｘについての幾何平均比は０．５７２であり、９０％ＣＩは０．３７～０．８８５であり、ＡＵＣｉｎｆについては０．６１４であり、９０％ＣＩは０．３８８～０．９７２であった。一方、外れ値対象からデータを除去した場合、Ｃｍａｘの幾何平均比は０．７７４であり、９０％ＣＩは０．５５６～１．０７７であり、ＡＵＣｉｎｆの幾何平均比は０．８４９であり、９０％ＣＩは０．６５７～１．０９８であった。当業者によって理解されるように、重度の腎機能障害を有する患者は、健康な対象よりも高い体重及びボディマス指数を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、コホート１の対象が、より低い血漿濃度に起因して、アプラグルチドへのより低い曝露を有することを示し得る。
実施例１１：アプラグルチド製造プロセス－（ＩＩＩ）
図２Ａ及び図２Ｂは、以前に記載された合成経路（例えば、米国特許第８，５８０，９１８号）と比較して改善された純度レベルでアプラグルチドを製造するための本開示の例示的な方法を概略的に示す。図２Ａ及び図２Ｂに記載される製造プロセスは、本明細書中でプロセスＢと称され、ＴＦＡ系移動相（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル）中でのＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）クロマトグラフィによる一次精製（重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を使用して画分のｐＨを調整して≧９０％の純度にする）、続いてＮａＨＣＯ３移動相（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル）中でのＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）による二次精製（≧９７％の純度にする）、続いて酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル移動相中でのＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８）による脱塩／緩衝液交換を含む。表２ａは、プロセスＢを使用して生成されたアプラグルチド生成物の純度、並びに主要な汚染物質のレベルを示す。表２ａは、プロセスＢを使用して生成されたアプラグルチド生成物の純度、並びにこのプロセスの全生成物収率を示す。表２ａ及び表２ｂに示すように、プロセスＢは、９７％以上の純度及び低レベルの汚染物質を有するアプラグルチドを得ることができる。更に、プロセスＢは約２０％の生成物収率を示す。
不純物
図２Ａ及び図２Ｂに記載したアプラグルチド製造プロセスを更に修正して、アプラグルチド中のβ－Ａｓｐ３ペプチド異性体不純物のレベルを１．５％未満に低下させることができる。一部の実施形態では、実施例８に記載されたアプラグルチド製造プロセスは、アプラグルチド中のβ－Ａｓｐ３ペプチドイソマー不純物のレベルを１％未満に減少させた。
β－Ａｓｐ３不純物の形成は、高いｐＨ及び配列Ａｓｐ３－Ｇｌｙ４の存在によって支持される。Ａｓｐ－Ｇｌｙ配列は、閉環（β－カルボキシ側鎖上のα－カルボキシアミド結合からの窒素の攻撃）に起因するアスパルチミド形成を特に受けやすい。アスパルチミドは、塩基触媒によるエピマー化を受けやすく、開環反応を受ける場合があり、これは複数の副生成物の形成をもたらす場合がある。水による攻撃は、β－アスパルチルペプチドを生成し得る。
樹脂からのペプチド切断の際の脱炭酸／抽出ステップ（ステップ３（１）、図２Ｂ）の間のβ－Ａｓｐ３不純物の形成は、＞１％のレベルに達し得、極端なｐＨ（特に、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ８０：２０中のアンモニアの強塩基溶液、室温で約１０のｐＨ）への長期の曝露によって促進される。図２Ａ及び図２Ｂに記載されたアプラグルチド製造プロセスは、ｐＨを１０から８に低下させ、脱炭酸反応時間を２４時間から６５分に短縮し、反応温度を室温から５０℃に変更し、保存温度を室温から５℃に低下させるように修正することができる。これらの変化は、１．５％未満のレベルでβ－Ａｓｐ３不純物を生じ得る。一部の実施形態では、これらの変化は、１％未満のレベルでβ－Ａｓｐ３不純物を生じた。
図２Ａ及び図２Ｂに記載されたアプラグルチド製造プロセスはまた、残基Ａｓｐ３のＦｍｏｃ脱保護反応が、ＤＭＦ中の１０％ピペリジン及び２％オキシマの溶液を使用し、２サイクルの脱保護（第１のサイクルは１５分間、第２のサイクルは３０分間）を伴うように修正され得る。これらのより穏やかな塩基性条件は、Ａｓｐ３の完全な脱保護を可能にし、アスパルチミド及びその後のβ－Ａｓｐ３副生成物形成を減少させる。
Ｄ－Ｈｉｓ不純物の形成は、ＤＩＣ／オキシマを使用するカップリング反応の間のアミノ酸のラセミ化に起因して生じ得る。個々のＧｌｙ及びＨｉｓアミノ酸の連続的組み立てのプロセスは、０．３％～１．２％の間のＤ－Ｈｉｓ不純物のレベルの変動性を示し、時には不完全なカップリングを伴った。カップリング試薬ＤＩＣ／オキシマを用いたＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨの取り込みは、ＨｉｓのＤ型へのラセミ化に有利であり得る。
図２Ａ及び図２Ｂに記載されるようなアプラグルチド製造プロセスは、Ｇｌｙ及びＨｉｓアミノ酸の連続的な組み立ての代わりに、この反応のための出発物質としてジペプチドＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨを使用するように改変され得る。これは、Ｈｉｓ中のラセミ化レベルを１％未満（１回の実施バッチで０．３％）に減少させることを可能にし、最終Ｄ－Ｈｉｓレベルをジペプチド（Ｂｏｃ－Ｄ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の仕様に組み込む。これはまた、脱保護ステップの数の減少を可能にし、したがって、上記のように、β－Ａｓｐ３不純物形成に対する脱保護条件（高ｐＨ）の寄与する影響を最小にする。
図２Ａ及び図２Ｂに記載され、上記のように修正されたアプラグルチド製造プロセスは、本明細書中で「プロセスＣ」と称される。表２ｂに示すように、プロセスＣは、９７％以上の純度を有し、約２２％の生成物収率を示すアプラグルチドを得ることができる。
等価物
前述の説明は、例示の目的でのみ提示されており、本開示を開示された正確な形態に限定することを意図するものではない。本開示の１つ以上の実施形態及び／又は態様の詳細は、上記の付随する説明に記載されている。本明細書に記載される実施形態及び／又は態様のいずれか１つは、本明細書に記載される任意の他の実施形態及び／又は態様と組み合わせることができ、任意の数の実施形態及び／又は態様を組み合わせることができる。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び物質を本開示の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び物質をここで記載する。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって概して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で引用される全ての特許及び刊行物は、参考として援用される。

Claims (22)

  1. ＧＬＰ－２アナログペプチドを作製する方法であって、
    ａ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を実施して、Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミド－メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上で前記ＧＬＰ－２アナログペプチドを合成することと、
    ｂ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水、及びアニソールを含む溶液で前記樹脂を処理することによって、前記合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを前記樹脂から切断し、前記合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドの側鎖を脱保護することと、
    ｃ）ステップ（ｂ）からの前記合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドを、ＴＦＡ系移動相を使用して第１の分取逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製を実施することによって精製し、それにより、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法によって決定される９０％以上の純度を有する前記ＧＬＰ－２アナログペプチドを含む溶液を生成することと、
    ｄ）ＮａＨＣＯ３系移動相を使用して、第２のＲＰ－ＨＰＬＣ精製を実施することによって、ステップ（ｃ）の生成物を精製し、それにより、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法によって決定される９７％以上の純度を有する前記ＧＬＰ－２アナログペプチドを含む溶液を生成することと、を含む、方法。
  2. ｅ）ＮａＯＡｃ系移動相を使用して第３のＲＰ－ＨＰＬＣ精製を実施することによって、ステップ（ｄ）からの生成物を更に精製し、それにより、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法によって決定される９７％以上の純度を有する前記ＧＬＰ－２アナログペプチドのナトリウム塩を含む溶液を生成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. ｆ）水中０．１％ＡｃＯＨを使用して、前記ＧＬＰ－２アナログペプチドの前記ナトリウム塩を含むｐＨ溶液を約ｐＨ７．９に調整することと、
    ｇ）ステップ（ｆ）の生成物を、０．２μｍの孔径を有するフィルタに通すことと、
    ｈ）ステップ（ｇ）の生成物を凍結乾燥し、それにより、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法によって決定される９７％以上の純度を有する前記ＧＬＰ－２アナログペプチドの凍結乾燥されたナトリウム塩を生成することと、を更に含む、請求項２に記載の方法。
  4. ｃ）（ｉ）前記合成されたＧＬＰ－２アナログペプチドの脱炭酸を、アンモニア緩衝液
    中に水及びアセトニトリルを含む溶液中に前記ペプチドを可溶化することによって実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記アンモニア緩衝液中に水及びアセトニトリルを含む溶液のｐＨが、約ｐＨ８．０に調整される、請求項４に記載の方法。
  6. ステップ（ａ）が、
    ｉ）前記ＳＰＰＳが実施されるＭＢＨＡ樹脂を調製することと、
    ｉｉ）初期Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施して、第１のＦｍｏｃ保護アミノ酸を前記樹脂に付加し、それにより前記樹脂上に保護ペプチドを形成することと、
    ｉｉｉ）Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施して、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸を前記保護ペプチドに付加することと、
    ｉｖ）前記ＧＬＰ－２アナログペプチドが前記樹脂上で合成されて、前記樹脂に連結されたＦｍｏｃ保護及び側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを生成するまで、ステップｉｉｉを繰り返すことと、
    ｖ）Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施して、前記樹脂に連結された側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを生成することと、
    ｖｉ）前記樹脂に連結された前記側鎖保護ＧＬＰ－２アナログペプチドを乾燥させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
  7. ステップ（ａ）（ｉ）が、
    （ａ１）前記樹脂を、Ｎ２雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含む溶液で、樹脂１グラム当たり５ｍＬの溶液で洗浄することと、
    （ｂ１）ＤＭＦ中に２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、
    ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ＤＩＥＡ、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む溶液中で、Ｒｉｎｋアミドリンカーを前記樹脂にカップリングさせることと、
    （ｃ１）ステップ（ｂ１）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、
    （ｄ１）前記樹脂を、ＤＭＦ中に無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）及びＤＩＥＡを含む溶液と接触させることによって還元反応を実施することと、
    （ｅ１）ステップ（ｄ１）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む、請求項６に記載の方法。
  8. Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施することが、
    （ａ２）前記樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジンを含む溶液で処理することと、
    （ｂ２）前記樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
    （ｃ２）前記樹脂を、ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で洗浄することと、
    （ｄ２）前記樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸、並びにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（オキシマ）を含む第１の量の溶液と接触させることと、
    （ｅ２）前記樹脂を、ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液と接触させることと、
    （ｆ２）ステップ（ｅ２）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記樹脂を、前記樹脂を前記ＤＩＣ及びオキシマを含む第１の量の溶液と接触させた約３０分後に、前記ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液と接触させる、請求項８に記載の方法。
  10. Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施し、続いてカップリング反応を実施することが、
    （ａ２）前記樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む溶液で処理することと、
    （ｂ２）前記樹脂をＤＭＦで洗浄することと、
    （ｃ２）前記樹脂を、ＤＭＦ及びオキシマを含む溶液で洗浄することと、
    （ｄ２）前記樹脂を、少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸、並びにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（オキシマ）を含む第１の量の溶液と接触させることと、
    （ｅ２）前記樹脂を、ＤＩＣ及びオキシマを含む第２の量の溶液と接触させることと、
    （ｆ２）ステップ（ｅ２）で形成された生成物をＤＭＦで洗浄することと、を含む、請求項６に記載の方法。
  11. 前記樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む第１の量の溶液と１５分間接触させ、続いて前記樹脂を、ＤＭＦ中にピペリジン及びオキシマを含む第２の量の溶液と３０分間接触させる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）－ＯＨである、請求項８に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つのＦｍｏｃ保護アミノ酸が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（Ｔｍｂ）－ＯＨである、請求項８に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つの保護されたアミノ酸が、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨである、請求項８に記載の方法。
  15. 前記方法が、ステップ（ｅ２）と（ｆ２）との間に、カップリング試験を実施することを更に含み、前記カップリング試験が、カイザー試験である、請求項８に記載の方法。
  16. 前記ＧＬＰ－２アナログペプチドが、アプラグルチドである、請求項１に記載の方法。
  17. ステップ（ｄ）で生成された溶液中のアスパルチミド３アプラグルチド不純物、Ａｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド不純物及びＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物の合計が、２％以下である、請求項１６に記載の方法。
  18. ステップ（ｄ）で生成された溶液が、２％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物を含む、請求項１１に記載の方法。
  19. ステップ（ｄ）で生成された溶液が、１．５％以下のβ－Ａｓｐ３アプラグルチド不純物を含む、請求項１１に記載の方法。
  20. ステップ（ｄ）で生成された溶液が、１％以下のβ－Ａｓｐ３アプラグルチド不純物を含む、請求項１１に記載の方法。
  21. ステップ（ｄ）で生成された溶液が、１％以下のＤ－Ｈｉｓアプラグルチド不純物を含む、請求項１１に記載の方法。
  22. ステップ（ｄ）で生成された溶液が、
    １％以下のＡｓｐ３３－ＯＨアプラグルチド不純物と、
    １％以下のＤｅｓ－Ｓｅｒ７アプラグルチド不純物と、
    １％以下のＤ－アスパルチミド３アプラグルチド不純物と、
    １％以下の［Ｔｒｐ２５，２－（２，４，６－トリメトキシフェニル）］アプラグルチド不純物と、を含み、
    前記Ｄｅｓ－Ｇｌｙ４アプラグルチド不純物及びアスパルチミド３アプラグルチド不純物の合計が、１％以下である、請求項１１に記載の方法。
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