TW201333032A - 使用免疫球蛋白片段之位點專一性ｇｌｐ－２接合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種類升糖素胜肽-2(GLP-2)接合物，包含經由非胜肽聚合物共價性連接之原始GLP-2或其衍生物與免疫球蛋白Fc片段，其中該原始GLP-2或其衍生物之C-端具有硫醇基，以及該非胜肽聚合物之一端連接至除了GLP-2之N-末端胺基以外之GLP-2的胺基酸殘基；一種製備該GLP-2接合物之方法；一種包含該GLP-2接合物之醫藥組成物；以及一種使用該GLP-2接合物以治療或預防腸疾病、腸損傷或胃酸過多(gastrosia)之方法。由於本發明GLP-2接合物具有顯著增加之GLP-2受體結合親和力，顯示延長體內半衰期並增進體外耐久性與穩定性。因此，本發明GLP-2接合物可以相當低之劑量給藥，並展現增進之藥物依從性，而不使血糖濃度波動。因此，本發明之長效性GLP-2接合物可有效用於預防或治療腸疾病、腸損傷或胃酸過多。

Description

使用免疫球蛋白片段之位點專一性GLP-2接合物
本發明係關於一種類升糖素胜肽-2(GLP-2)接合物，其中，原始GLP-2或其衍生物係經由非胜肽聚合物共價性連接至免疫球蛋白Fc片段，其中該原始GLP-2或其衍生物之C-端具有硫醇基，以及該非胜肽聚合物及免疫球蛋白Fc片段係位點專一性地連接至除了GLP-2或其衍生物之N-末端胺基以外之胺基酸殘基；一種製備該GLP-2接合物之方法；一種包含該GLP-2接合物之醫藥組成物；以及一種使用該醫藥組成物以治療或預防腸疾病、腸損傷或胃酸過多(gastrosia)之方法。
類升糖素胜肽-2(GLP-2)為一種具有33個胺基酸之胜肽荷爾蒙，由腸內分泌L細胞於營養攝取後製造出。GPL-2於小腸和大腸中刺激黏膜增長(DG Burrin等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279(6)：G1249-1256,2000)，並抑制腸細胞和隱窩細胞(crypt cell)之細胞凋亡(Bernardo Yusta等人，Gastrpenterology 137(3)：986-996,2009)。此外，GLP-2促進小腸之養分吸收(PALLE BJ等人，Gastrpenterology 120：806-815,2001)，以及降低腸通透性(Cameron HL等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 284(6)：G905-12,2003)。此外，GLP-2抑制胃排空和胃酸分泌(Meier JJ等人，Gastrpenterology 130(1)：44-54,2006)，同時增加腸血流速率(Bremholm L等人，Scand J Gastroenterol.44(3)：314-9,2009)和鬆弛腸平滑肌(Amato A等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.296(3)：G678-84,2009)。
由於GLP-2有能力吸收與保護能量並活化腸細胞功能，已證實於各種體內腸疾病和損傷模式中具有高度治療潛力。作為一種調節營養吸收之荷爾蒙，GLP-2對於短腸症候群(short bowel syndrome；SBS)之治療具有極大療效。SBS係由先天性原因或後天之原因引起，係無原因如手術切除腸道，由於小腸吸收面積減少而導致營養缺乏。據報導，在有SBS之大鼠模式中，GLP-2改善消化道營養攝取與吸收(Ljungmann K等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.281(3)：G779-85,2001)。
另外，克隆氏症(Crohn’s disease)係一種慢性發炎性腸疾病，可於口腔至肛門間消化道範圍內的任何部位引發。克隆氏症成因仍不明，但一般認為係身體對正常存活於消化道內之細菌細胞產生過度發炎反應伴隨環境和遺傳因素所引起。已知GLP-2可預防或緩解黏膜上皮細胞之損傷，尤其針對化療或遺傳因素造成之黏膜炎、腸炎或發炎性腸疾病(Qiang Xiao等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.278(4)：R1057-R1063,2000)。
化療引起之腹瀉(Chemotherapy-induced diarrhea；CID)乃侷限抗癌藥物劑量之一因素，且為最常見之抗癌化療副作用。大約10%患者為末期癌症。約80%末期癌症患者接受5-FU(5-氟尿嘧啶，Adrucil)/愛萊諾迪肯(Camptosar)之單獨/組合治療後，發生 CID症狀，且其中約30%出現3至5級之嚴重腹瀉症狀。此外，如果黏膜炎或嗜中性球減少症(neutropenia)同時出現於CID患者身上，可能會有死亡風險。於CID誘發大鼠模式中顯示，GLP-2減緩5-FU誘發之腸重量減輕、絨毛高度和隱窩深度之減少，因而證實其於CID治療上之治療潛力(A.Tavakkolizadeh等人，J Surg Res.91(1)：77-82,2000)。
儘管具有高療效潛力，要將GLP-2發展為商業藥物 仍有限制。胜肽如GLP-2由於穩定性低容易被轉化，會被體內蛋白酶分解並失去活性，且由於其分子量相對較小，容易由腎臟排除。因此，為了維持胜肽藥物之理想血中濃度和力價，需要更頻繁投予胜肽藥物。然而，大多數胜肽藥物以各種類型之注射方式給藥，並需頻繁注射以維持胜肽藥物之血中濃度，導致患者嚴重疼痛。在此方面，已有許多嘗試解決這些問題之方法，其中之一為發展增加胜肽藥物之膜通透性，使胜肽藥物可經口或鼻途徑進入體內之方法。但是，相較於注射方式，此方法具有胜肽藥物傳輸效率低之限制，因此胜肽藥物仍難以維持足夠的生物活性，以作為治療之用。
特別的是，GLP-2具有極短之體內半衰期(7分鐘或 更短)，因其胺基酸位置2(Ala)與位置3(Asp)之間會被二胜肽基胜肽酶IV(DPP IV)切斷而失活(Bolette H.等人，The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism.85(8)：2884-2888,2000)。目前已有人嘗試藉由胺基酸取代來增加GLP-2之體內半衰期。
目前，NPS Pharmaceuticals Inc.(U.S.A.)正開發GLP-2類似物“Teduglutide”，以作為克隆氏症、SBS和胃腸道疾病之治 療藥物，其中原始GLP-2之胺基酸位置2(Ala)經天門冬醯胺酸(Asp)取代。Teduglutide係由於胺基酸位置2經取代，而能抵抗DPPIV切割，而增加其穩定性和功效。然而，儘管抵抗DPPIV切割之能力增加，但仍不足以延長Teduglutide之體內半衰期。因此，Teduglutide亦需每日注射一次給藥，這對患者而言仍是一大負擔(WO 2005/067368)。
Zealand Pharma(丹麥)目前正開發GLP-2類似物，係 以原始GLP-2之胺基酸位置3、8、16、24、28、31、32和33經一或多個胺基酸取代。這些取代不僅增加胜肽穩定性和效力，亦可藉由下述方式選擇性地治療症狀根據取代之位置而使其於小腸之生長促進活性較於結腸中高，反之亦然。此外，Zealand Pharma正開發Elsiglutide(ZP1846)，為GLP-2類似物，針對胃腸道(GI)-黏膜炎和CID，而Elsiglutide正進行第一期臨床試驗。然而，上述類似物亦不具足夠之體內半衰期，因此需要每日注射一次給藥(WO 2006/117565)。
聚乙二醇(PEG)非專一性結合至標的胜肽之一特定 位置或多個位置上，並增加其分子量，藉此防止標的胜肽受腎臟清除和水解，而不引起任何副作用。舉例而言，美國專利第4,179,337號揭示了連結降鈣素(calcitonin)與PEG之方法，以增進降鈣素之體內半衰期和膜通透性。WO 2006/076471揭示了增加B型鈉利尿胜肽(B-type natriuretic peptide；BNP)(其已使用作為充血性心臟衰竭之治療藥物)之體內半衰期之方法，係藉由以連結至PEG而達成。此外，美國專利第6,924,264號揭示了增加艾塞那肽-4(exendin-4)體內半衰期之方法，係以PEG連結其離胺酸殘基而 達成。雖然這些方法可藉由連結PEG以增加分子量，並延長胜肽藥物之體內半衰期，但PEG分子量增加仍存在幾個問題，包括胜肽藥物力價降低，以及PEG與胜肽藥物之反應性下降，使產量減少。
WO 02/46227揭示一種方法，係以人類血清白蛋白或 免疫球蛋白Fc區製備GLP-1、艾塞那肽-4或其類似物之融合蛋白。美國專利第6,756,480號亦揭示一種方法，係用以製備副甲狀腺激素(PTH)或其類似物與免疫球蛋白Fc區之融合蛋白。這些方法可解決聚乙二醇化(pegylation)之問題，例如低產量和非專一性，但其增加胜肽藥物體內半衰期之效果不如預期顯著，且有時其力價仍低。欲使胜肽藥物之體內半衰期增加最大化，可使用多種胜肽連接物(linker)，但有誘發免疫反應之風險。另外，若使用具有雙硫鍵之胜肽藥物如BNP，則錯誤折疊(misfolding)機率高。最終，若使用包含有非自然存在胺基酸之胜肽藥物，則無法以基因重組方式產生其融合蛋白。
在先前研究中，本發明人開發一種製備具延長體內半衰期之GLP-2接合物之方法，其中GLP-2接合物係經由非胜肽聚合物，共價性地連接GLP-2或其衍生物與免疫球蛋白Fc片段而製備。此方法中，GLP-2衍生物，例如β-羥基-咪唑基-丙醯基GLP-2，其N-端胺基係以羥基取代；去-胺基-組胺醯基GLP-2，其N-末端胺基係刪除；以及咪唑基-乙醯基-GLP-2，其第一個組胺酸之α-碳與其相連之N-末端胺基係刪除，顯示其抵抗DPPIV之能力增加，並維持生物活性，因此GLP-2接合物之體內半衰期顯著增加。
然而，在免疫球蛋白Fc片段位點專一性地連接至這 些GLP-2衍生物之離胺酸殘基之情況下，所得GLP-2接合物對GLP-2受體顯示顯著降低的結合親和力，因此會有體內效力與持續期降低的問題。
以尋求可增加血中GLP-2之體內半衰期和體內持續 期最大化之方法而言，本發明人已開發GLP-2接合物，係將其C-端經導入硫醇基之GLP-2衍生物共價性地連接至非胜肽基聚合物與免疫球蛋白Fc片段，且發現GLP-2接合物對GLP-2受體顯現增加的結合親和力，且體內持續期明顯提升。特別的是，已發現當非胜肽聚合物與免疫球蛋白Fc片段，係位點專一性地連接至C-端經導入半胱胺酸殘基之咪唑基-乙醯基-GLP-2時，其第一個組胺酸之α-碳與連接至其之N-端胺基經刪除，造成其抵抗DPPIV切割之能力增加，以及咪唑基-乙醯基-GLP-2接合物之體外效力顯著增加。
因此，本發明之一目的係提供具有增加體內療效與穩定性之GLP-2結合物。
本發明之另一目的係提供一種製備GLP-2結合物之方法。
本發明之又一目的係提供一種醫藥組成物，包含作為活性成分之GLP-2結合物，以預防或治療腸疾病、腸損傷或胃酸過多。
本發明之GLP-2結合物具有明顯高之GLP-2受體結 合親和力，因而顯示持久之體內療效和延長之體內半衰期。因此，本發明之GLP-2接合物可有效用於治療或預防腸疾病、腸損傷或胃酸過多，且給藥頻率明顯較低。
第1圖顯示CA GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-免疫球蛋白Ec接合物之純化情形，係以Source Phe管柱純化。
第2圖顯示CA GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-免疫球蛋白Fc接合物之純化情形，係以Source 15Q管柱純化。
第3圖顯示CA GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-免疫球蛋白Fc接合物之純化情形，係以Source ISO管柱純化。
第4圖顯示逆相HPLC之結果，係分析CA GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-免疫球蛋白Fc接合物之純度。
第5圖顯示GLP-2衍生物與原始GLP-2之體外GLP-2受體結合親和力測定結果。
本發明之一態樣中，係提供一種類升糖素胜肽-2(GLP-2)接合物，包含經由非胜肽聚合物共價性連接之原始GLP-2或其衍生物與免疫球蛋白Fc片段，其中該原始GLP-2或其衍生物之C-端經導入硫醇基，以及該非胜肽聚合物之一端連接至除了GLP-2或其衍生物之N-末端胺基以外之胺基酸殘基上。
使用於此，“類升糖素胜肽-2(GLP-2)”一詞意指一種經由小腸分泌之激素，一般可促進胰島素之生合成和分泌、抑制升糖素分泌和促進細胞之葡萄糖吸收。GLP-2經由結合至GLP-2 受體而具有治療或預防腸疾病、腸損傷或胃酸過多之功能。GLP-2含有33個胺基酸，其原始GLP-2胺基酸序列如下：GLP-2(1-33)HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO：1)
本發明之GLP-2包括原始形式GLP-2、其促效劑、衍生物、片段或變體及其類似物。
使用於此，“GLP-2促效劑”一詞意指可結合至GLP-2受體，而不論其與GLP-2之結構相似性如何，並誘發與原始GLP-2相同或相似之生理活性之物質。
使用於此，“GLP-2片段”一詞意指一胜肽，其具有於原始GLP-2之N-端或C-端加入或刪除一或多個胺基酸，其中加入之胺基酸可為非自然存在之胺基酸(如D-胺基酸)。
在一較佳之實施例中，本發明之GLP-2包括在其C-端具有經導入之硫醇基，其中硫醇基之導入係以於GLP-2之C-端加入半胱胺酸殘基而達成，但不侷限於此。
使用於此，“GLP-2變體”一詞意指一胜肽，其具有一或多個異於原始GLP-2之胺基酸。就此，可導入非自然存在胺基酸及自然存在胺基酸之取代反應。
使用於此，“GLP-2衍生物”一詞意指一胜肽，其與原始GLP-2具有至少80%胺基酸序列同源性，以及意指其中一部分胺基酸殘基可經化學取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、刪除(例如，脫胺化)或修飾(例如，N-甲基化)之胜肽。較佳之情況為，本發明GLP-2衍生物係以取代、刪除或修飾該原始GLP-2之N-端而製備，並可選自於由具有GLP-2功能之胜肽、片段與變體組 成之群組。
更佳之情況為，本發明之GLP-2衍生物可選自於由下列化合物組成之群組：咪唑基-乙醯基-GLP-2(CA-GLP2)，其中原始GLP-2之N-端第一個組胺酸殘基之α-碳及連接至其之N-端胺基經刪除；去-胺基-組胺醯基-GLP-2(DA-GLP2)，其中原始GLP-2之N-端胺基經刪除；β-羥基-咪唑基-丙醯基-GLP-2(OH-GLP-2)，其中原始GLP-2之N-端胺基經羥基取代；二甲基-組胺醯基-GLP-2(DM-GLP-2)，其中原始GLP-2之N-端胺基經二甲基修飾；以及β-羧基-咪唑基-丙醯基-GLP-2(CX-GLP2)，其中原始GLP-2之N-端胺基經羧基取代。
尤佳之情況為，GLP-2衍生物可為CA-GLP-2，其中原始GLP-2之N-端第一個胺基酸殘基，組胺酸之α-碳及連接至其之N-端胺基經刪除。
在一較佳之實施例中，本發明之GLP-2或其衍生物可為一胜肽，其中半胱胺酸殘基係導入至原始GLP-2之C-端、其N-端之α-碳和連接至其之胺基經刪除，以及視需要地，第二個胺基酸，丙胺酸經甘胺酸取代。
本發明之原始GLP-2與GLP-2衍生物可利用固相合成法或重組技術合成。
使用於此，“非胜肽聚合物”一詞意指生物可相容聚合物，其包括經胜肽鍵以外之任何共價鍵彼此連接之至少兩個 重複單元。本發明適用之非胜肽聚合物係選自於由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚醣、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物，如聚乳酸(PLA)與聚乳酸乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸及其組合物組成之群組，較佳為聚乙二醇。此外，本發明非胜肽聚合物之範疇包括以上所列聚合物之衍生物，係由習知技藝所知或易於由相關技藝製備。
融合蛋白所使用之胜肽連接物係以傳統讀框 (in-frame)融合法製備，其缺點為易於被水解酶分解，因此由於需使用載體，生理活性胜肽難以獲得明顯增加之體內半衰期。然而，本發明使用之聚合物具有抵抗此水解酶之能力，因此生理活性胜肽之體內半衰期可維持與載體類似。
因此，任何非胜肽聚合物皆可用於本發明而無侷 限，只要其為具有抵抗水解酶能力之聚合物。本發明適用之非胜肽聚合物具有分子量範圍1至100 kDa，且較佳為1至20 kDa。同時，連接至免疫球蛋白Fc片段之本發明非胜肽基聚合物可由單一種聚合物或不同種類聚合物之組合組成。
本發明之非胜肽聚合物具有末端反應性基團，該基 團可於2端結合免疫球蛋白Fc片段和胜肽藥物。非胜肽聚合物之兩末端反應性基團較佳為選自於由反應性乙醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基和琥珀醯亞胺衍生物組成之群組。琥珀醯亞胺衍生物之範例為丙酸琥珀醯亞胺基酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基和碳酸琥珀醯亞胺基酯。非胜肽聚合物之兩末端反應性基可彼此相同或不同。舉例而言，非胜肽聚合物之一末端 可為馬來醯亞胺基，而其另一末端可為乙醛基、丙醛基或丁醛基。以兩末端具羥基之聚乙二醇(PEG)使用作為非胜肽聚合物之情況而言，其中該羥基可經由傳統化學反應活化成各種反應性基團。此外，商業上可購得之具有經修飾反應基團之PEG，可用於製備本發明之GLP-2接合物。
特別的是，當使用一末端具有醛基且另一末端為馬來醯亞胺基之非胜肽基聚合物時，可使非專一性反應最小化，並可有效地誘導GLP-2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段結合至非胜肽基聚合物之各末端。經還原性烷基化由醛基鍵結所產生之最終產物，其穩定性更甚於醯胺鍵結之產物。該醛基於低pH值時可選擇性地結合至N-端，但於高pH值如pH 9.0時，其結合至離胺酸殘基以形成共價鍵。
在一較佳實施例中，本發明之非胜肽聚合物可於一端具有馬來醯亞胺基以及另一端具有醛基，更佳之情況為，其為一端具有馬來醯亞胺基以及另一端具有醛基之聚乙二醇。
在本發明中，免疫球蛋白(Ig)Fc片段適於作為藥物載體，因其於體內為生物可分解。同時，Fc片段有利於製備、純化和生產其與胜肽藥物形成之複合物，因其分子量相對小於整體免疫球蛋白分子。另外，由於因抗體間之胺基酸序列差異而顯出高度非均一性之Fab區，已經移除，Fc片段具有大幅增加的物質均一性以及誘發血清抗原性的低可能性。
使用於此，“載體”一詞意指連接於藥物之物質。典型而言，含連接至載體之藥物之複合物大幅降低藥物之生理上活性。然而，為了達到本發明之目的，係使用本發明之載體，以 使有興趣藥物之生理活性降低情況最小化、連接至載體，並降低載體之免疫性，因而可提升藥物之體內穩定性。為了達成這些目標，本發明使用經非胜肽聚合物修飾之Fc片段作為載體。
使用於此，“免疫球蛋白G(IgG)”一詞整體指藉由 選擇性作用於抗原而參與身體保護性免疫反應之蛋白質。免疫球蛋白由兩相同輕鏈與兩相同重鏈組成。輕鏈和重鏈包含可變區和恆定區。依據其等之恆定區之胺基酸序列差異，重鏈有五種不同類型：γ、μ、α、δ與ε型，且重鏈包括以下子類(subclasses)：γ 1、γ 2、γ 3、γ 4、α 1與α 2。同時，依據其等之恆定區之胺基酸序列差異，輕鏈有兩種類型：κ與λ型(Coleman等人，Fundamental Immunology,2nd Ed.,1989,55-73)。依據重鏈恆定區之特徵，免疫球蛋白可分成五種同型(isotypes)：IgG、IgA、IgD、IgE與IgM。IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3與IgG4子類。
免疫球蛋白已知產生數種結構不同之片段，包括 Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd與Fc。在這些免疫球蛋白片段中，Fab含有輕鏈和重鏈之可變區、輕鏈之恆定區和重鏈之第一恆定區(CH1)，並具有單一抗原結合位點。由其鉸鏈區於其重鏈CH1域之C-端(羧基端)含有一或多個半胱胺酸殘基之觀點而言，F(ab’)片段不同於Fab片段。F(ab’)2片段係於F(ab’)片段鉸鏈區之半胱胺酸殘基之間形成雙硫鍵而產生為F(ab’)片段配對。Fv為最小抗體片段，其僅含有重鏈可變區與輕鏈可變區。scfv(單鏈Fv)片段含有重鏈可變區與輕鏈可變區，係經由胜肽連接物連接彼此，因此以單一多胜肽鏈形式存在。同時，Fd片段僅含有重鏈之可變區與CH1域。
使用於此，“免疫球蛋白Fc片段”一詞意指免疫球 蛋白(Ig)分子經木瓜酶(papain)分解之產物，係除了輕鏈可變區(VL)與恆定區(CL)，及重鏈可變區(VH)與恆定區1(CH1)以外之免疫球蛋白分子區。Fc片段可進一步包括位於重鏈恆定區之鉸鏈區。同時，Fc片段可實質上等同於原始型，或經延伸之Fc片段，其中包含部分或全部重鏈恆定區1(CH1)與/或輕鏈恆定區1(CL1)，只要其具備改進之功效。此外，Fc片段可為具備刪除相對較長CH2與/或CH3胺基酸序列部分之片段。較佳之Fc片段為IgG或IgM衍生之Fc片段。IgG衍生之Pc片段為更佳，且IgG2 Fc與IgG4 Fc片段為尤佳。
本發明之經修飾Fc片段可衍生自IgG、IgA、IgD、 IgE與IgM之Fc片段之組合物或併合物。“組合物”一詞意指多胜肽之雙體或多體，其中相同來源之單鏈Fc片段係連結至不同來源之單鏈Fc片段，以形成雙體或多體。“雜合物”一詞意指一多胜肽，其中由不同來源之二或多個域存在於單鏈Fc片段。舉例而言，雜合物可由選自於IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc與IgG4 Fc所含之CH1、CH2、CH3與CH4域之一至四個域組成。
依據本發明修飾之Fc片段，可衍生自人類或其他動 物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠與天竺鼠，且較佳為人類。人類衍生性Fc片段優於非人類衍生性Fc片段，後者可作為人體內之抗原並產生不良免疫反應，如產生新抗體以對抗該抗原。
依據本發明修飾之Fc片段，包括原始胺基酸序列及 其序列突變體(變體)。“胺基酸序列突變體”一詞，意指原始胺 基酸序列之一或更多個胺基酸殘基，經刪除、插入、非保留性或保留性取代或其組合，而具有不同序列。蛋白質或胜肽經胺基酸交換而不改變蛋白質或胜肽活性，為已知技術(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常發生之交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu與Asp/Gly之雙方互換。此外，Fc片段可視需求經由磷酸化、硫化、丙醯基化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯化、醯胺化及其類似作用修飾。
胺基酸變體可為具有生物活性與原始蛋白相同之功 能相等物，或者視需求可藉由改變原始形式之特性而製作。舉例而言，變體可具有對抗熱、pH值等之增加的結構穩定性，或改變與修飾其原始胺基酸序列而增加溶解性。舉例而言，IgG Fc片段中，已知結合作用之重要胺基酸殘基位於位置214至238、297至299、318至322，或327至331，可作為修飾作用之適用標的。此外，可能有其他各種衍生物，包括刪除可形成雙硫鍵之區域者，或者原始Fc形式N-端之某些胺基酸殘基經去除者，或加入甲硫胺酸殘基者。此外，欲移除起效子之功能，補體結合位點，如C1q結合位點和ADCC位點，可能進行刪除作用。製備此免疫球蛋白Fc片段之序列衍生物之技術，係揭示於國際專利公開號WO97/34631與WO96/32478及其類似文獻。
依據本發明修飾之Fc片段，可得自人類和其他動物 所單離之原始形式，或得自重組技術之經轉形動物細胞或微生物。
依據本發明修飾之Fc片段，其形式可為具有原始糖 鏈、相較於原始形式其糖鏈增加，或相較於原始形式其糖鏈減少，或者可為去糖基化形式。經糖基化作用之Fc片段具有誘發免疫反應之高度風險，因其補體依賴性細胞毒性(CDC)活性強於其非糖基化形式。因此，就本發明目的而言，較佳為非糖基化或去糖基化之Fc片段。
使用於此，“去糖基化Fc片段”一詞意指Fc片段 之糖基部分經人為移除，而“非糖基化Fc片段”一詞意指Fc片段以未被糖基化形式，經由原核生物產生，原核生物較佳為大腸桿菌。Fc片段糖鏈之增加、減少或移除之方法可由習知技藝達成，例如化學方法、酵素方法和利用微生物之基因工程方法。
重組Fc片段由於其三維結構異於原始形式具有增 加的酵素敏感性。同時，相較於原始IgG，非糖基化IgG對於蛋白水解酶(胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)為高度敏感(Morrison等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989)。重組Fc片段具有與原始Fc經木瓜酶處理後相同之FcRn結合親和力，但原始Fc片段之血清半衰期較長於重組Fc片段2至3倍(Eur.J.Immunology 29：2819-2825,1999)。依據本發明修飾之Fc片段，其酵素切割位點係受非胜肽基聚合物保護。此保護作用防止由於Fc片段對水解酶之高度敏感，而降低其體內半衰期之情況。
本發明所使用之GLP-2可於不同位點連接至非胜肽 聚合物上。當GLP-2經連接至對於胜肽之生理活性相當重要之N端，以外之位點時，反應性硫醇基可被導入至原始GLP-2胺基酸序列之欲修飾胺基酸殘基，並於GLP-2之硫醇基與非胜肽聚合物之馬來醯亞胺基或醛基之間形成共價鍵。
當使用非胜肽聚合物之醛基時，其可與N-端或離胺 酸殘基之胺基反應。此時，可使用經修飾形式之GLP-2，以選擇性增加反應產量。舉例而言，經由保護GLP-2之N-末端、以其他胺基酸取代離胺酸殘基以及於其C-末端導入胺基，可維持僅有一個胺基可與非胜肽聚合物於希望之位點反應，因而增加聚乙二醇化(pegylation)和偶合反應之產量。保護N末端之方法可包括二甲基化、甲基化、脫胺反應、乙醯化其及類似反應，但不侷限於此。
在本發明之一較佳實施例中，為了誘導GLP-2之C- 末端胺基酸殘基之選擇性聚乙二醇化，係將半胱胺酸殘基導入GLP-2衍生物之C-末端，並隨即以具有馬來醯亞胺基之PEG，連接至GLP-2之C-末端之半胱胺酸殘基。尤其是已發現，其中免疫球蛋白Fc片段係位點專一性地連接至咪唑基-乙醯基-GLP-2(CA-GLP-2)之C-末端(其第一個組胺酸α-碳與相連接之N-末端胺基係經刪除)之GLP-2接合物，相較於長效型GLP-2衍生物(其中免疫球蛋白Fc片段連接至原始離胺酸殘基)，顯示增加的GLP-2受體之結合親和力(請見第5圖)。
在另一實施例中，本發明提供一種製備GLP-2接合 物之方法，包含以下步驟：1)將兩末端具有反應性基團之非胜肽基聚合物共價性地連接至原始GLP-2或其衍生物之胺基或硫醇基，其中反應性基團係選自於由醛、馬來醯亞胺和琥珀醯亞胺衍生物組成之群組，且其中GLP-2或其衍生物之C-末端係經導入硫醇基；2)由步驟1)之反應混合物單離包含非胜肽基聚合物和GLP-2或其衍生物之複合物，其中非胜肽基聚合物係共價性 地連接至GLP-2或其衍生物之除了N-末端胺基團以外之胺基酸殘基；以及3)共價性地連接免疫球蛋白Fc片段至步驟2)所單離出之複合物之非胜肽聚合物之另一端，因此產生包含免疫球蛋白Fc區、非胜肽聚合物和GLP-2或其衍生物之GLP-2接合物，其中非胜肽聚合物之一端，係共價性地連接至免疫球蛋白Fc片段，且另一端係共價性地連接至GLP-2或其衍生物。
使用於此，“複合物”一詞意指非胜肽聚合物與GLP-2衍生物彼此共價性地相連接之中間物。之後，非胜肽聚合物未連接至GLP-2衍生物之另一端，係連接至免疫球蛋白Fc片段。
步驟1)係共價性地連接GLP-2或其衍生物至非胜肽聚合物之一端。較佳之情況為，GLP-2或其衍生物可為具有如SEQ ID NO：1胺基酸序列之原始GLP-2，或其具有硫醇基經導入於GLP-2或其衍生物之C-末端之N-末端衍生物。較佳之情況為，GLP-2衍生物可為CA-GLP-2、DA-GLP2、OH-GLP2、DM-GLP-2或CX-CLP-2。更佳之情況為，GLP-2衍生物可為CA-GLP-2，其中半胱胺酸殘基係經導入其C-末端。
在步驟1)中，非胜肽聚合物兩端之反應性基團可相同或不同。較佳之情況為，非胜肽聚合物之一端具有馬來醯亞胺基，而另一端具有醛基。
此外，步驟1)之非胜肽聚合物係共價性地連接至GLP-2或其衍生物之N-末端以外之胺基酸殘基，較佳為經導入至GLP-2或其衍生物之C-末端之半胱胺酸殘基之硫醇基。在選擇性位點專一性地將非胜肽聚合物連接至GLP-2或其衍生物之硫醇基 時，步驟1)之GLP-2或其衍生物與非胜肽聚合物間之反應可於pH 2至4進行，較佳為pH 3。此時，此反應GLP-2或其衍生物與非胜肽聚合物之莫耳比範圍可為1：2至1：10，但不侷限於此。
若有需要，步驟1)之反應可於還原劑存在下進行， 並依據非胜肽聚合物兩端之反應性基團類型而定。反應所適用之還原劑可包括氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride；NaCNBH3)、硼氫化鈉、二甲基胺硼酸鹽或吡啶硼酸鹽。
步驟2)係由步驟1)之反應混合物中所單離之GLP-2- 非胜肽聚合物之複合物，其中GLP-2或其衍生物係共價性地連接至非胜肽聚合物之一端。考量標的蛋白質之物理特性，如純度、分子量和淨電荷，步驟2)之單離反應可適當選取習知技藝中常見的方法進行蛋白質之純化與分離。舉例而言，可使用多種常見方法，包括尺寸排阻層析法和離子交換層析法，且若有需要，可搭配使用以增加經純化標的物之產量。
步驟3)係進行步驟2)單離出之複合物(GLP-2-非胜肽 聚合物)與免疫球蛋白Fc片段之間的反應，以共價性地連接免疫球蛋白Fc片段至複合物所含非胜肽聚合物之另一端。
在步驟3)中，GLP-2-非胜肽聚合物之複合物與免疫球蛋白Fc片段間之反應可於pH 5.0至8.0，較佳為pH 6.0進行。此時，此反應中GLP-2-非胜肽聚合物之複合物與免疫球蛋白Fc片段之莫耳比範圍可由1：2至1：10，較佳為1：4至1：8。
若有需要，步驟3)之反應可於還原劑存在下進行，並依據非胜肽聚合物兩端之反應性基團類型而定。反應所適用之還原劑可包括氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、二甲基胺硼酸 鹽或吡啶硼酸鹽。
在一較佳實施例中，本發明製備GLP-2接合物之方 法包含以下步驟：1)共價性地連接一端具有馬來醯亞胺基團及於另一端具有醛基之非胜肽聚合物至原始GLP-2或其衍生物之硫醇基，且其中硫醇基係經導入至其C-末端；2)由步驟1)之反應混合物單離出包含非胜肽聚合物和GLP-2或其衍生物之複合物，其中非胜肽聚合物係共價性地連接至GLP-2或其衍生物之硫醇基；以及3)共價性地連接免疫球蛋白Fc片段至步驟2)所單離之複合物之非胜肽聚合物之另一端，因此產生包含免疫球蛋白Fc區、非胜肽聚合物和GLP-2或其衍生物之GLP-2接合物，其中非胜肽聚合物之一端係共價性地連接至免疫球蛋白Fc片段，而另一端係共價性地連接至GLP-2或其衍生物。
在又一觀點中，本發明提供一種醫藥組成物，包含作為活性成分之GLP-2接合物。
本發明之醫藥組成物可用於預防或治療一或多種選自於由腸疾病、腸損傷與胃酸過多組成之疾病。尤其是，本發明之醫藥組成物可用於預防或治療之疾病包括，但不侷限於GI疾病，包括SBS、發炎性腸疾病(IBD)、克隆氏症、結腸炎、胰腺炎、迴腸炎、發炎性腸阻塞、癌症化療與/或放射線治療造成之黏膜炎、全胃腸道外營養或局部缺血造成之胃萎縮、骨骼障礙、兒科胃腸道(GI)失調包括腸衰竭誘發之新生兒壞死性腸炎，及其類似疾病。
使用於此，“預防”一詞意指涵蓋經由投予本發明 之醫藥組成物，可抑制或延緩上述疾病如腸疾病、腸損傷與胃酸過多之發生或進程之所有作用。
本文中“治療”一詞意指涵蓋經由投予本發明醫藥 上組成物，可改善或有益於改變上述疾病如腸疾病、腸損傷與胃酸過多之症狀之所有作用。
本發明之醫藥上組成物包含作為活性成分之長效性 GLP-2接合物，其具備延長之體內半衰期，以及經本發明所增進之體內功效與穩定性，因此可明顯減少給藥劑量，並展現增進之藥物依從性，而不使血糖濃度波動。因此，本發明之醫藥上組成物可有效用於預防與治療腸疾病、腸損傷或胃酸過多。
本發明之醫藥組成物可更包含醫藥上可接受之載 體。針對口服給藥，醫藥上可接受之載體可包括粘合劑、潤滑劑、分解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色劑和香料。針對注射給藥，醫藥上可接受之載體可包括緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶劑、等張劑和穩定劑。針對局部給藥，醫藥上可接受之載體可包括基劑、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。
本發明之醫藥組成物可結合前述醫藥上可接受之載 體而配製成多種劑型。舉例而言，針對口服給藥，醫藥組成物可配製成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或粉片。針對注射給藥，醫藥上組成物可配製成單劑量劑型或單位劑型之安瓿，例如多劑量貯劑。醫藥組成物亦可配製成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊和長效製劑。
另一方面，本發明之醫藥組成物之適用載體、賦形 劑和稀釋劑之範例，可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲基酯、羥基苯甲酸丙基酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，本發明之醫藥組成物可進一步包括充填劑、抗凝結劑、潤滑劑、保濕劑、香料和防腐劑。
本發明之醫藥組成物可經由任一常見途徑給藥，只 要其能到達所希望之組織。各種給藥方式均列入考慮，包括腹腔、靜脈、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內，但不侷限於此。
然而，由於經口服給藥會使胜肽被分解，故口服給 藥之醫藥組成物之有效成分須經包覆或配製，以保護其免於胃中降解。較佳之情況為，本發明之醫藥組成物可經注射形式給藥。 此外，本發明醫藥組成物之給藥，可使用特定設備以傳輸有效成分進入標的細胞。
本發明醫藥組成物之投藥頻率與劑量可由數個相關 因子決定，包括待治療之疾病類型、給藥途徑、患者年齡、性別、體重與病情嚴重性，以及作為有效成分之藥物種類。然而，劑量之增加或減少係依據給藥途徑、病情嚴重性和患者性別、體重、年齡而定，因此並未侷限本發明之範疇。由於展現極佳之體內持久性與力價，本發明之醫藥組成物可明顯降低給藥頻率。本發明之醫藥組成物具有極佳之體內耐久性與穩定性，以及延長之體內半衰期，可明顯降低藥物之給藥頻率與劑量。
依據又一態樣，本發明提供一種預防或治療腸疾 病、腸損傷或胃酸過多之方法，包含投予治療有效量之長效性GLP-2接合物至有需求之個體。
使用於此，“給藥”一詞意指以合適之方式將有效 成分導入至患者。只要有效成分可到達標的組織，任何給藥方式皆可採用。給藥途徑之範例包括腹腔、靜脈、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內給藥，但不侷限於此。然而，由於經口服給藥會使胜肽被分解，故口服給藥之醫藥組成物之有效成分須經包覆或配製，以保護其免於胃中降解。較佳之情況為，有效成分可配製成注射形式。此外，長效性接合物可輔以任何可傳輸有效成分進入標的細胞之裝置以進行投藥。
待治療之個體範例包括人類、猿、牛、馬、羊、豬、 雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔和天竺鼠，但不侷限於此。較佳之個體為哺乳類動物，特別是人類。
有效成分文中所使用“治療有效量”一詞意指足以 預防或治療疾病，亦即腸疾病、腸損傷或胃酸過多之一定量，並具有合理之效益/風險比，以用於醫療。
本發明之長效性GLP-2接合物，顯示具有延長之體 內半衰期及增進之體內耐久性與穩定性。因此，本發明之長效性GLP-2接合物可以明顯低劑量給藥，並展現增進之藥物依從性而不使血糖濃度波動。因此，本發明之長效性GLP-2接合物可有效用於預防或治療腸疾病、腸損傷或胃酸過多。
本發明以下列實例進一步說明。然而，應瞭解這些 實例僅用於具體闡述本發明，而不可被理解為其以任何形式侷限本發明。
實例1：咪唑基-乙醯基-GLP-2之聚乙二醇化作用
咪唑基-乙醯基-GLP-2(CA-GLP-2,A2G,34C,American Peptide,U.S.A.)係與10K MAL-PEG-ALD PEG(異雙官能PEG，兩端各具有馬來醯亞胺與醛基，NOF Inc.,Japan)反應，以使CA-GLP-2之位置34之半胱胺酸殘基(Cys34)聚乙二醇化。於此，CA-GLP-2與PEG之莫耳比為1：3，且反應於室溫進行3小時，其中胜肽濃度為3.5 mg/mL。此外，反應於50 mM Tris-HCl緩衝溶液中並於20 mM氰基硼氫化鈉(SCB)還原劑存在下進行。反應完成後，所得產物，單-聚乙二醇化CA-GLP-2-PEG複合物，係以SOURCE S管柱(LRC25,Pall Corporation)於下列條件進行層析純化。
管柱：SOURCE S(LRC25,Pall Corporation)
流速：4.0 ml/分
梯度：沖提液B 0% → 40%進行240分鐘(A：20 mM檸檬酸，pH 2.0+45%乙醇，B：A+1 M KCl)
實例2：咪唑基-乙醯基-GLP-2(A2G,34C)-PEG-免疫球蛋白Fc接合物之製備
將前述經純化之單-聚乙二醇化CA-GLP-2(A2G,34C)複合物與免疫球蛋白(IgG)Fc片段(韓國專利申請案第10-725315號)，以莫耳比1：6混合，接著於4℃反應20小時，其中胜肽濃度為20 mg/mL。此時，反應於100 mM磷酸鉀緩衝溶液(pH 6.0)中，並於20 mM SCB(作為還原劑)存在下進行。反應完成後，將反應混合物進行三步驟層析純化，係利用SOURCE Phe管柱(XK16,GE Healthcare)、SOURCE 15Q管柱(LRC25,Pall Corporation)和SOURCE ISO管柱(HR16,GE Healthcare)於下列條件 中進行。
管柱：SOURCE Phe(XK16,GE Healthcare)
流速：2.0 ml/分
梯度：沖提液B 100% → 0%(A：20 mM Tris，pH 8.0；B：A+2.6 M NaCl)
管柱：SOURCE 15Q(LRC25,Pall Corporation)
流速：5.0 ml/分
梯度：沖提液B 0% → 30%進行120分鐘(A：20 mM Tris-HCl，pH 8.0；B：A+1 M NaCl)
管柱：SOURCE ISO(HR16,GE Healthcare)
流速：2.0 ml/分
梯度：沖提液B 100% → 0%進行100分鐘(A：20 mM Tris-HCl，pH 8.0；B：A+1.1 M硫酸銨)
SOURCE Phe管柱、SOURCE 15Q管柱和SOURCE ISO管柱之各純化狀況，分別如第1圖、第2圖與第3圖所示。經由逆相HPLC分析之結果，CA-GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-Fc接合物純化後之純度為94.2%(第4圖)，且其產率為12.5%。
實例3：CA-GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-Fc接合物對於GLP-2受體之體外結合親和力測定
欲測定實例2製備之CA-GLP-2(A2G,34C)-10K PEG-Fc接合物(在下文中，以“GLP-2接合物”表示)之效用，係使用以下所示方法測定體外細胞活性。此方法中，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株CHO/hGLP-2R經轉形以表達編碼人類GLP-2受體之基因。
CHO/hGLP-2R細胞經繼代培養，每週2至3次，並 以濃度1×105細胞/培養孔接種於96-孔培養盤中，接著培養24小時。隨後，經培養之CHO/hGLP-2R細胞係分別以濃度1000至0.002 nM之原始GLP-2；濃度10000至0.02 nM之原始GLP-2長效性製劑(GLP-2-PEG-Fc接合物，LAPS-GLP-2)；濃度10000至0.02 nM之經離胺酸專一性接合之GLP-2衍生物長效性製劑(LAPS-DA-GLP-2、LAPS-CA-GLP-2、LAPS-OH-GLP-2)；以及濃度10000至0.02 nM之經C-末端半胱胺酸專一性接合之GLP-2衍生物長效性製劑(LAPS-CA-GLP-2(A2G,34C))處理。作為訊息傳遞之第二信使之cAMP於經各化合物處理之CHO/hGLP-2R細胞中之細胞內含量，係以cAMP分析套件(MD,USA)測定，並以VICTOR LIGHT光度計(PerkinElmer Life Sciences)分析螢光素酶活性。亦測量各化合物之EC50值。
如第5圖所示，經離胺酸專一性接合之GLP-2衍生 物長效性製劑(LAPS-DA-GLP-2、LAPS-CA-GLP-2、LAPS-OH-GLP-2)之體外活性，低於原始GLP-2長效性製劑(LAPS-GLP-2)(2.6至7.5%與8.6%)。相反地，經C-末端半胱胺酸專一性接合之GLP-2衍生物長效性製劑(LAPS-CA-GLP-2(A2G,34C))之體外活性，高於原始GLP-2長效性製劑(LAPS-GLP-2)(相較於原始GLP-2為9.9%)。
這些結果已證實，GLP-2接合物(其中非胜肽聚合物 之一端共價性地連接至GLP-2衍生物之C-末端，而另一端共價性地連接至免疫球蛋白Fc片段)，與先前之GLP-2接合物相較，顯示出增進之GLP-2受體結合親和力，因此可延長體內半衰期並改善體內耐久性與穩定性。
本說明書所使用之特定術語係僅用於描述特定實施 例，且不可視為侷限本發明。本說明書所使用之單數形式包括複數形式，除非其明顯表達相反意義。本說明書所使用之“包括”或“具有”目的係體現特定屬性、區域、整數、步驟、操作、元件與/或成分，但不可視為排除存在或增加其他屬性、區域、整數、步驟、操作、元件、成分與/或群組。
<110> 韓美科學股份有限公司(HANMI SCIENCE CO.,LTD.)
<120> 使用免疫球蛋白片段之位點專一性GLP-2接合物(A SITE-SPECIFIC GLP-2 CONJUGATE USING AN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT)
<130> OPA12175
<150> KR10-2011-0147684
<151> 2011-12-30
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (23)

  1. 一種類升糖素胜肽-2(GLP-2)接合物，包含經由非胜肽聚合物共價性連接之原始GLP-2或其衍生物與免疫球蛋白Fc片段，其中該原始GLP-2或其衍生物於C-末端經導入硫醇基，以及該非胜肽聚合物之一端連接至除了GLP-2之N-末端胺基以外之胺基酸殘基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該GLP-2或其衍生物之硫醇基，係以將半胱胺酸結合至其C-末端之方式導入。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該GLP-2衍生物係以於原始GLP-2之N-末端胺基進行取代、刪除或修飾之方式製備，並具有與GLP-2受體結合之功能。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之GLP-2接合物，其中該GLP-2之衍生物係選自於由下列所組成之群組：經由移除位於原始GLP-2之N-末端第一個胺基酸位置組胺酸之α-碳以及相連至其之N-末端胺基所製備之GLP-2衍生物；經由刪除原始GLP-2之N-末端胺基所製備之GLP-2衍生物；以羥基取代原始GLP-2之N-末端胺基所製備之GLP-2衍生物；以二甲基修飾原始GLP-2之N-末端胺基所製備之GLP-2衍生物；以及以羧基取代原始GLP-2之N-末端胺基所製備之GLP-2衍生物。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該非胜肽聚合物之一端係共價性地連接至該免疫球蛋白Fc片段，以及另一端係共價性地連接至GLP-2或其衍生物之該胺基或硫醇基。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之GLP-2接合物，其中該非胜肽聚 合物係共價性地連接至GLP-2或其衍生物之該硫醇基。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該非胜肽聚合物係選自於由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚醣、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸及其組合物所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該非胜肽聚合物之兩末端皆具有選自於由乙醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基和琥珀醯亞胺衍生物所組成群組之反應性基團。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之GLP-2接合物，其中該琥珀醯亞胺衍生物係選自於由丙酸琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基，以及碳酸琥珀醯亞胺基酯所組成之群組。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之GLP-2接合物，其中該非胜肽聚合物之一端具有馬來醯亞胺基，以及另一端具有乙醛基。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為非糖基化。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段由選自於由CH1、CH2、CH3與CH4域所組成之群組之1至4個域構成。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段更包含鉸鏈區。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段之每一域皆為源自不同免疫球蛋白之域的雜合物，該不同免疫球蛋白選自於由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM所組成之群組。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為由包含源自於相同免疫球蛋白之域之糖基化免疫球蛋白之雙體或多體構成。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為IgG4 Fc片段。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之GLP-2接合物，其中該免疫球蛋白Fc片段為人類非糖基化IgG4 Fc片段。
  19. 一種製備申請專利範圍第1至18項中任一項所述之GLP-2接合物之方法，包含有：1)將其兩末端具有，選自於由乙醛、馬來醯亞胺和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組之反應性基團之非胜肽聚合物，共價性地連接至GLP-2或其衍生物之胺基或硫醇基，其中該GLP-2或其衍生物於C-末端經導入硫醇基；2)自步驟1)之反應混合物中單離複合物，其中該非胜肽聚合物係共價性地連接至該GLP-2或其衍生物之該胺基或硫醇基；3)共價性地連接該複合物之非胜肽聚合物之另一端至免疫球蛋白Fc片段；以及4)自步驟3)之反應混合物中單離GLP-2接合物，其中該非胜肽聚合物之兩端係分別連接至該免疫球蛋白Fc片段以及 該GLP-2或其衍生物。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中步驟1)之該非胜肽聚合物係共價性地連接至該GLP-2或其衍生物之該C-末端硫醇基。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中步驟1)之該GLP-2或其衍生物與該非胜肽聚合物，係於pH 2至4之條件下，以莫耳比1：2至1：10進行反應。
  22. 一種醫藥組成物，包含有申請專利範圍第1至18項中任一項所述之GLP-2接合物作為活性成分，以預防或治療一或多種疾病，該疾病選自於腸疾病、腸損傷，以及胃酸過多。
  23. 一種預防或治療一或多種疾病之方法，該疾病選自於腸疾病、腸損傷和胃酸過多，包含投予申請專利範圍第1至18項中任一項所述之GLP-2接合物至有其需求之患者。
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