BRPI0617515A2 - mimeticorpos, polipeptÍdeos, composiÇÕes, mÉtodos e usos de glp-2 - Google Patents

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Abstract

<B>MIMETICORPOS, POLI PEPTÍDEOS, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS DE GLP-2 <D>A presente invenção refere-se a mimeticorpos, polipeptídeos e ácidos nuclélcos de GLP-2 de mamífero são descritos. Métodos de utilizar os mimeticorpos e polipeptídeos para tratar doenças relacionadas a GLP-2 também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MIMETICOR-POS, POLIPEPTÍDEOS, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS DE GLP-2".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos e mimeticorpos deGLP-2 de mamífero e seu uso como terapêuticos.
Antecedentes da Invenção
O peptídeo semelhante ao glucagon 2 (GLP-2) é um hormôniopeptídico intestinotrófico de 33 aminoácidos gerado através de processa-mento pós-traducional de proglucagon (Orskov et aí., FEBS Lett. 247: 193-196 (1989); Hartmann et ai, Peptides 21: 73-80 (2000)). Em mamíferos,GLP-2 é liberado a partir de proglucagon no intestino e cérebro, mas não nopâncreas, como um resultado de expressão célula- específica de converta-ses de pró-hormônios nas células endócrinas do intestino (Dhanvantari et a!.,Mol. Endocrinol. 10: 342-355 (1996); Rothenberg et ai, Mol. Endocrinol. 10:334-341 (1996); Damholt et ai, Endocrinology 140: 4800-4808 (1999);Holst, Trends Endocrinol Metab. 10: 229-235 (1999)). A análise de plasmade rato e humano usando uma combinação de cromatografia líquida de altaeficiência e anti-soros de GLP-2 sítio-específicos revela a presença de duasformas moleculares circulantes principais, GLP-21"33 e GLP-23""33 (Hartmannet al, Supra; Brubaker et al., Endocrinol. 138: 4837-4843 (1997); Hartmannet ai, J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 2884-2888 (2000)). GLP-21"33 é clivadoin vivo pela protease dipeptidil peptidase IV (DPP IV), que remove os doisprimeiros resíduos, histidina e alanina (HA). O peptídeo GLP-23"33 resultanteé essencialmente inativo.
GLP-2 regula a motilidade gástrica, secreção de ácido gástrico,transporte de hexose intestinal e aumenta a função de barreira do epitéliointestinal (revisado em Drucker, J. Clin. Endocr. Metab. 86: 1759-1764(2001)). Ele aumenta significativamente a área de superfície do epitélio mu·coso através da estimulação de proliferação de célula da cripta e inibição deapoptose no enterócito e compartimentos da cripta (Drucker et al., Proc. Na-tl. Acad. Sei. U.S.A. 93: 7911-7916 (1996)). GLP-2 reduz a mortalidade ediminui a lesão mucosa, expressão de citocina e septicemia bacteriana nainflamação do intestino delgado e grosso (Boushey et al., Am. J. Physiol.277: E937-E947 (1999); Prasad et al., J. Pediatr. Surg. 35: 357-359 (2000)).GLP-2 também aumenta a absorção de nutrientes e a adaptação do intestinoem roedores ou humanos com a síndrome do intestino curto (SBS) (Jeppe-sen etal., Gastroenterology 120: 806-815 (2001)).
As ações de GLP-2 são transduzidas pelo receptor de GLP-2(GLP-2R), um receptor acoplado à proteína G expresso ém células endócri-nas intestinais do estômago, intestino delgado, cólon assim como neurôniosentéricos e miofibroblastos subendoteliais (Munroe et al., Proc. Natl. Acad.Sci U.S.A. 96: 1569-1573 (1999); Yusta etal., Gastroenterology 119: 744-755 (2000); Bjerknes etal., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98: 12497-12502(2001); Orskov et al., Regul. Pept. 124: 105-112 (2005)). A ativação direta dasinalização de GLP-2R em fibroblastos de rim de filhote de hamster transfec-tados que expressam o receptor de GLP-2 (células BHK-GLP-2R) confereresistência à apoptose induzida por cicloeximida (Yusta etal., J. Biol. Chem.275: 35345-35352 (2000)).
As propriedades citoprotetoras, reparadoras e de retenção deenergia de GLP-2 sugerem que GLP-2 pode potencialmente ser útil para otratamento de distúrbios humanos caracterizados por lesão e/ou disfunçãodo epitélio da mucosa intestinal. A lesão do epitélio da mucosa intestinal évista em pacientes com doença inflamatória do intestino (IBD), incluindo Do-ença de Crohn e colite ulcerativa, e em pacientes com doenças auto-imunesque estão associadas com uma resposta inflamatória no intestino, tal comoDoença Celíaca (revisada em Hanauer, New England J. Med. 334: 841-848(1996)). Além disso, alguns fármacos quimioterápicos causam lesão ao epi-télio intestinal que resulta em efeitos colaterais tóxicos que são Iimitantes dadose (Oster, Oncology 13: 41 (1999)). A permeabilidade intestinal aumenta-da também é relatada em casos de pancreatite aguda (Kouris et al., Am. J.Surg. 181: 571-575 (2001)) e poderia contribuir para alergias alimentares porpermitir o acesso de macromoléculas ao compartimento subendotelial (Tron-cone etal., Allergy 49: 142-146 (1994)).
Como um importante hormônio regulatório da absorção de nutri-entes, GLP-2 também é promissor no tratamento de pacientes com síndro-me do intestino curto (SBS) (Drucker et al, Supra; Rubin, Gastroenterol.117:261-263 (1999); Nightingale, Gut 45: 478-479 (1999)). SBS é definidacomo má absorção resultante de perda anatômica ou funcional de uma ex-tensão significativa do intestino delgado (revisado em Jeppesen, J. Nutr.133: 3721-3724 (2003)). As causas da síndrome do intestino curto diferementre adultos e crianças: em adultos, ela freqüentemente resulta após cirur-gia para doença de Crohn ou infarto mesentérico; enquanto que em crian-ças, as causas mais comuns incluem enterocolite necrosante, gastrosquise,atresia e vólvulo (Platell et ai, World J. Gastroenterol. 8: 13-20 (2002)).
Teduglutida, um análogo do peptídeo de GLP-2 resistente aDPP-IV (em que alanina 2 é substituída por glicina (A2G)), está sendo de-senvolvido para o tratamento potencial de doenças gastrointestinais (Gl),incluindo SBS, doença de Crohn e distúrbios de Gl pediátricos. Teduglutidatambém tem potencial para o tratamento de mucosite associada com quimio-terapia para câncer e IBD. Entretanto, devido ao baixo peso molecular dopeptídeo, a teduglutida é rapidamente depurada com uma meia-vida de me-nos do que 30 minutos. Conseqüentemente, a dosagem diária é necessáriapara manter o nível terapêutico (Shin et ai, Curr. Opin. Endocrin. Diabetes12: 63-71 (2005)). Portanto, existe uma necessidade por uma GLP-2 modifi-cada que supere a meia-vida curta enquanto mantém sua função e fornecedesenvolvimento e produção fáceis.
Meo inflamatório, a deficiência temporária da motilidade gastroin-testinal coordenada após cirurgia invasiva ou lesão traumática, permaneceum problema clínico importante, prolongando a permanência hospitalar efreqüentemente contribuindo para complicações médicas durante o períodode recuperação (Holte & Kehlet, Br. J. Surg. 87: 1480-1493 (2000)). O íleo écaracterizado por esvaziamento gástrico retardado, dilatação do intestinodelgado e cólon, distensão abdominal, perda dos padrões propulsores con-tráteis normais e incapacidade de evacuar gases ou fezes, levando ao des-conforto prolongado do paciente (distensão abdominal, náusea, êmese).
Em indivíduos suscetíveis, tais como os mais velhos ou pacien-tes com comprometimento cardiopulmonar, o íleo pode levar a complicaçõesmais sérias, incluindo dilatação gástrica aguda, arritmia cardíaca, desconfor-to respiratório, pneumonia por aspiração, e falha de anastomoses cirúrgicas.
Em casos severos, a perda prolongada da atividade contrátil de "limpeza"normal do trato Gl pode contribuir para a super crescimento bacteriano equebra da função de barreira do intestino, seguida por translocação bacteri-ana e entrada na circulação sistêmica (Anup & Balasubramanian, J. Surg.Res. 92: 291-300 (2000)). Isso por sua vez pode levar à endotoxemia, sep-se, falência de múltiplos órgãos e finalmente morte, uma conseqüência parao qual os pacientes mais velhos são os mais suscetíveis. Mesmo na ausên-cia de complicações, o retorno da função intestinal normal é um fator primor-dial que limita a liberação de pacientes do hospital, com íleo inflamatórioaumentando a permanência hospitalar em 3 a 5 dias. Assim, os custos acu-mulados da morbidade aumentada e permanência hospitalar prolongadapodem ser substanciais.
Fatores que contribuem para o desenvolvimento e manutençãode íleo incluem a ativação de reflexos inibitórios simpáticos centrais que libe-ram norepinefrina na parede intestinal, agentes inibitórios humorais, agentesanestésicos e analgésicos e mediadores inflamatórios (Livingston & Passara,Dig. Dis. Sei. 35: 121-132 (1990); Bauer et al., Curr. Opin. Crit. Care 8: 152-157 (2002)). Resultados de estudos com roedores sugerem que a inflama-ção dentro da parede do trato Gl desempenha um papel central na iniciaçãoe manutenção do íleo.
Estudos que empregam modelos de roedores de íleo pós-operatório demonstram que a muscularis externa é um compartimento alta-mente imunologicamente ativo. Normalmente, residentes dentro da muscularexterna está um grupo impressionante de leucócitos comuns (Mikkelsen,Histol. Histopathol. 10: 719-736 (1995); Kalff et al., Ann. Surg. 228: 652-663(1998)). Os mais abundantes desses são os macrófagos residentes, queformam uma extensa rede de células do esôfago ao cólon e que estão pron-tos para defender o trato gastrointestinal de lesão e doença em potencial.Distúrbios do intestino durante a cirurgia abdominal ativam essa rede de ma-crófagos, iniciando uma resposta inflamatória molecular local. Os macrófa-gos ativados liberam citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-1 β, TNFa) e quimio-cinas (MCP-1) que suprimem a comunicação neuromuscular dentro da mus-cular e induzem a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1, P-selectina)no endotélio vascular (Kalff et ai, J. Leukoc. Biol. 63: 683-691 (1998); Jose-phs etal., J. Surg. Res. 86: 50-54 (1999); Kalff et ai, Gastroenterology 117:378-387 (1999); Kalff etal., Gastroenterology 118: 316-327 (2000); Wehneretal., Surgery 137: 436-46 (2005)). Isso por sua vez leva à resposta inflama-tória celular caracterizada pelo recrutamento de leucócitos (monócitos, neu-trófilos, células T e células mastocitárias) da circulação sistêmica, em que háuma correlação positiva entre a magnitude do infiltrado celular inflamatório ea severidade do Neo (Kalff etal., Surgery 126: 498-509 (1999)). Leucócitosinfiltrantes liberam citocinas adicionais assim como prostaglandinas, óxidonítrico, proteases e espécies reativas de oxigênio que contribuem ainda paraa disfunção neuromuscular (von Ritter et ai, Gastroenterology 97: 605-609(1989); Bielefeldt & Conklin, Dig. Dis. Sei. 42: 878-884 (1997)).
Até hoje, há poucas opções disponíveis na clínica para o cuida-do de íleo inflamatório. Pró-cinéticos tais como cisaprida e neostigmina fo-ram mostrados melhorar a motilidade intestinal pós-operatória (Shibata &Toyoda, Surg. Today 28: 787-791 (1998)). Entretanto, resultados são incon-sistentes e esses fármacos têm um risco aumentado de efeitos cardiovascu-Iares adversos que provaram ser difíceis de prever em termos de severidadee suscetibilidade do paciente. Em estudos em animais, inibidores de COX-2se mostraram protetores contra a falta de motilidade do intestino delgado(Schwarz et ai, Gastroenterology 121: 1354-1371 (2001)), mas tiveram pou-co efeito sobre a falta de motilidade colônica (Turler et ai, Anal. Surg.,231(1): 56-66 (2002)). Estudos clínicos de fase I em seres humanos foramterminados comparando celecoxib e rofecoxib (Bouras etal., Neurogastroen-terol. Motil. 16: 729-735 (2004)), e nenhum agente foi descoberto melhorar amotilidade pós-operatória.
A rápida volta para alimentação oral após a cirurgia foi promovi-da como um meio de estimular a regulação hormonal normal de padrões demotilidade. Ela foi descoberta acelerar o retorno de função intestinal e me-lhorar o conforto em um subgrupo de pacientes quando usada como partede uma abordagem multimodal para reabilitação intestinal (Holte & Kehlet,Minerva. Anestesiol., 68(4): 152-156 (2002)). Entretanto, esse tratamentonão resultou em uma redução significativa na duração da estadia hospitalar.
Além disso, a estimulação adequada de padrões hormonais requer um limitede carga calórica que muitos pacientes são incapazes de tolerar.
Um dos fatores mais comuns que contribuem para o desenvol-vimento de íleo prolongado é a administração de analgésicos opióides paraalívio de dor pós-operatória. Os opióides exercem seus efeitos analgésicospor interagir com um ou mais dos três subtipos de receptor presentes emneurônios nos centros de processamento de dor do cérebro. Os analgésicosopióides mais comuns, tal como morfina, funcionam primariamente por ativaros receptores opióides μ (mu) e δ (delta). Entretanto, esses mesmos recep-tores também são expressos nos neurônios dentro do trato gastrointestinalque controlam a motilidade do intestino. A ativação dos receptores, na pre-sença ou na ausência de íleo inflamatório, suprime significativamente a fun-ção contrátil gastrointestinal, causando estase intestinal e constipação. Ada-lor Corporation conduziu ensaios clínicos de Fase I e Fase Il usando Alvimo-pan, um antagonista μ-OR perifericamente restrito e seletivo que não atra-vessa a barreira hemato-encefálica. Quando dado em conjunto com analgé-sicos opióides, Alvimopan evitou a supressão induzida por opióide da motili-dade intestinal (Gonenne et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 3: 784-791(2005)). Quando comparado com placebo, foi descoberto que Almivopanacelera o retorno da função do intestino e diminui a estadia no hospital empacientes que estavam sofrendo íleo pós-operatório leve a moderado apósterem sido submetidos à cirurgia abdominal (Viscusi etal., Surg. Endosc. 20:64-70 (2006)). Alvimopan não altera inflamação.
Até o momento, não há opções de tratamento seguras e confiá-veis disponíveis para o tratamento de íleo inflamatório. Os remédios maiseficazes atualmente disponíveis são de natureza auxiliar ou melhoram osefeitos de composição da analgesia de opióide. Eles não tratam a inflama-ção como a causa fundamental de íleo. Portanto, permanece uma necessi-dade médica não atingida.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1 mostra a imagem de um gel de SDS-PAGE de varian-tes de substituição de Pro de mimeticorpo de GLP-2 (SEQ ID Nqs: 43 e 44)após incubação com Iisado de célula U937.
Figura 2 mostra um aumento dose-dependente do peso úmidode raspagens mucosas de camundongos tratados com mimeticorpo de GLP-2 A2G.
Figura 3 mostra uma aceleração significativa do transito intesti-nal em camundongos tratados com o peptídeo A2G-GLP2. Significado esta-tístico determinado por teste de í-student não pareado.
Figura 4 mostra uma aceleração significativa do trânsito intesti-nal em camundongos tratados com o mimeticorpo de GLP-2 A2G. Significa-do estatístico determinado por teste de f-student não pareado.
Figura 5 mostra atenuação significativa do retardo no trânsitogastrointestinal associado com íleo inflamatório pós-operatório em camun-dongos tratados com mimeticorpo de GLP-2 A2g murino. Significado estatís-tico determinado por ANOVA seguido por teste de Bonferroni pós-hoc.
Figura 6 mostra as quantidades totais de muscularis intestinalcom números aumentados de leucócitos contendo mieloperoxidase (MPO)após cirurgia abdominal. O tratamento com mimeticorpo de GLP-2 A2G mu-rino reduziu significativamente o número de células infiltrantes, enquanto quelgG2a não teve nenhum efeito.
Figura 7 mostra o histograma com contagens celulares compila-das da Figura 6. Significado estatístico determinado por ANOVA seguido porteste de Bonferroni pós-hoc.
Sumário da Invenção
Um aspecto da invenção é um mimeticorpo que tem a fórmulagenérica (II):
<formula>formula see original document page 8</formula>em que GLP2RAg é um agonista de GLP-2R de mamífero, Lk é um polipep-tídeo ou ligação química, V2 é uma porção de uma terminação-C de umaregião variável de imunoglobulina, Hg é pelo menos uma porção de uma re-gião de dobradiça variável de imunoglobulina, Ch2 é uma região constanteCh2 de cadeia pesada de imunoglobulina e Ch3 é uma região constante Ch3de cadeia pesada de imunoglobulina e t é independentemente um inteiro dea 10.
Outro aspecto da invenção é um mimeticorpo que compreendeum polipeptídeo que tem a seqüência mostrada em SEQ ID NQ: 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75, OU 77.
Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que compreende um poli-nucleotídeo que tem a seqüência mostrada em SEQ ID N2: 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, ou 78 ou umaseqüência complementar.
Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que compreen-de um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID Ns: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64,65, 75, ou 77.
Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que compreen-de um polipeptídeo que tem a seqüência mostrada em SEQ ID Ns: 52, 54, 55ou 74.
Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que compreen-de um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID NQ: 52, 54, 55, ou 74.
Outro aspecto da invenção é um método de reduzir os sintomasde, ou tratar um distúrbio caracterizada por lesão e/ou disfunção da epitélioda mucosa intestinal, que compreende administrar uma composição de poli-peptídeo de GLP-2 ou uma composição de mimeticorpo de GLP-2 a um pa-ciente necessitado disso.
Outro aspecto da invenção é um método de prevenir, reduzir ossintomas de, ou tratar íleo inflamatório, que compreende administrar umacomposição de polipeptídeo de GLP-2 ou uma composição de mimeticorpode GLP-2 a um paciente necessitado disso.
Descrição Detalhada da Invenção
Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a paten-tes e pedidos de patente, citados nesse relatório estão incorporados aqui porreferência como se completamente descritas. Códigos de aminoácido deuma letra são usados aqui como compreendendo por aqueles versados natécnica. A numeração de resíduos de aminoácido em regiões constantes deimunoglobulina se baseia no resíduo um sendo o aminoácido N-terminal emum domínio Fc de IgGI ou lgG4 selvagem.
A presente invenção fornece construtos de proteína que têm aspropriedades e atividades de GLP-2 de mamífero. Uma modalidade da in-venção são construtos de proteína que mimetizam diferentes tipos de molé-culas de imunoglobulina tais como IgA, IgD, IgE, IgG, ou IgM, e qualquersubclasse desses, tais como IgAI, lgA2, IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4, ou com-binações desses, daqui em diante referidos como "mimeticorpos de GLP-2"ou simplesmente "mimeticorpos". Outra modalidade da invenção são poli-peptídeos que são variantes de GLP-2 em que os polipeptídeos têm as pro-priedades e atividades da molécula selvagem. A invenção ainda fornece áci-dos nucléicos que codificam mimeticorpos, polipeptídeos de GLP-2, vetoresque contêm esses ácidos nucléicos, células hospedeiras, composições emétodos de fazer e usar mimeticorpos e polipeptídeos de GLP-2.
Mimeticorpos, polipeptídeos e composições de GLP-2
A presente invenção refere-se geralmente a polipeptídeos demimeticorpos que tem a fórmula genérica (I):
<formula>formula see original document page 10</formula>
em que Pep é um polipeptídeo que tem uma propriedade biológica desejada,Lk é um polipeptídeo ou ligação química, V2 é uma porção de uma termina-ção-C de uma região variável de imunoglobulina, Hg é pelo menos uma por-ção de uma região de dobradiça de imunoglobulina, Ch2 é uma região cons-tante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina e Ch3 é uma região constan-te Cr3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina e t é independentementeum inteiro de 1 a 10.
Mais particularmente, a presente invenção refere-se a polipeptí-deos de mimeticorpo de GLP-2 que são capazes de, por ligação, ativar GLP-2R. Os polipeptídeos têm a fórmula genérica (II):
<formula>formula see original document page 11</formula>
em que GLP2RAg é um agonista de GLP-2R de mamífero, Lk é um polipep-tídeo ou ligação química, V2 é uma porção de uma terminação-C de umaregião variável de imunoglobulina, Hg é pelo menos uma porção de uma re-gião de dobradiça de imunoglobulina, Ch2 é uma região constante Ch2 de ca-deia pesada de imunoglobulina e CH3 é uma região constante Ch3 de cadeiapesada de imunoglobulina e t é independentemente um inteiro de 1 a 10.
Como usado aqui, "agonista de GLP-2R" abrange qualquer mo-lécula que, por ligação, ativa GLP-2R. Agonistas de GLP-2R incluem GLP-2de mamífero selvagem e análogos peptídicos de GLP-2. Um peptídeo deGLP-2 selvagem exemplar tem a seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID Ne: 1. Sabe-se que certos resíduos de aminoácido em GLP-2 de o-corrência natural podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidocom os análogos mantendo a propriedade de ligação a GLP-2R de GLP-2selvagem. Por exemplo, Ala2 do peptídeo de GLP-2 humano selvagem podeser substituído por Ser (A2S) ou Gly (A2G). As seqüências de aminoácidoresultantes são mostradas em SEQ ID N9S: 2 e 3, respectivamente.
Na presente invenção, foram desenvolvidos novos análogos deGLP-2 humano selvagem que funcionam como agonistas de GLP-2R. Se-qüências de aminoácido desses análogos são mostradas em SEQ ID NQS:50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, e 74 mostradas abaixo (mutações designadascontra GLP-2 selvagem). Esses análogos são úteis como componentes deGLP2RAg de um mimeticorpo.<table>table see original document page 12</column></row><table>
Foi observado que peptídeos de GLP-2 podem se auto-associara apresentar um problema para o desenvolvimento e fabricação de um can-didato terapêutico homogêneo. Veja Publicação de Pedido de Patente US Ns20040122210 A1. Como descrito nos Exemplos abaixo, os polipeptídeos quetêm as seqüências de aminoácido mostradas em SEQ ID Ngs: 52, 54, 55 e74 foram projetados para ser monoméricos em pH 7.5 e ter tendências heli-coidais reduzidas. Conseqüentemente, esses análogos de peptídeo de GLP-2 humano seriam particularmente úteis em um construto de mimeticorpo oucomo um peptídeo terapêutico nu.
Nos mimeticorpos da invenção, a porção Iigante (Lk) forneceflexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha propriedades deligação e orientações alternativas. Ligantes exemplares incluem ligaçõesquímicas não-peptídicas ou um a 20 aminoácidos ligados por ligações peptí-dicas, em que os aminoácidos são selecionados a partir dos 20 aminoácidosde ocorrência natural. A porção Iigante pode incluir uma maioria de aminoá-cidos que são impedidos estericamente, tais como glicina, alanina e serina einclui GS, GGGS (SEQ ID Ns: 19), GSGGGS (SEQ ID Ns: 20), e polímerosou combinações desses. Outros Iigantes exemplares dentro do escopo dainvenção podem ter mais do que 20 resíduos e podem incluir resíduos diferentes de glicina, alanina e serina.Nos mimeticorpos da invenção, V2 é uma porção de um domínioC-terminal de uma região variável de imunoglobulina tal como região variávelde cadeia pesada. Uma seqüência de aminoácido de V2 exemplar é G-TLVTVSS (SEQ ID Ne: 21).
Foi mostrado que pode ocorrer O-glicosilação nos dois resíduosde Tyr na região V2, embora a extensão de glicosilação seja altamente de-pendente da linhagem da célula hospedeira e também possa ser influencia-da por condições de cultura. O-glicanas podem agir para bloquear a agrega-ção e proteólise, resultando em maior estabilidade in vivo. Entretanto, podeser desejável abolir a O-glicosilação por causa da heterogeneidade e pobrereprodutibilidade. Conseqüentemente, uma seqüência de aminoácido de V2alternativa exemplar é GALVAVSS (SEQ ID N5: 22).
Nos mimeticorpos da invenção, Hg é uma porção do domínio dedobradiça de uma região variável de imunoglobulina tal como uma regiãovariável de cadeia pesada. Seqüências de aminoácido de Hg exemplaresincluem EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID Ns: 23),
EPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID Ns: 24),ESKYGPPCPSCP (SEQ ID N9: 25),ESKYGPPCPPCP (SEQ ID N9: 26) eCPPCP (SEQ ID Ne: 27).
Nos mimeticorpos da invenção, CH2 é uma região constante CH2de cadeia pesada de imunoglobulina. Seqüências de aminoácido de Ch2exemplares incluem:
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID N9: 28),
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID Ne: 29),
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK (SEQ ID N9: 30) eAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK (SEQ ID N9: 31).
Nos mimeticorpos da invenção, CH3 é uma região constante deCH3 de cadeia pesada de imunoglobulina. Seqüências de aminoácido deCH3 exemplares incluem:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N9: 32) e
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID N-: 33). Será reconhecido por aqueles versados na téc-nica que a região CH3 dos mimeticorpos da invenção também pode ter seuaminoácido C-terminal clivado quando expresso em certos sistemas recom-binantes.
Nos mimeticorpos da invenção, o sítio de ligação do receptor"scavenger" FcRn das moléculas de imunoglobulina é preservado na junçãoda região Ch2 e CH3. Como a ligação de FcRn permite o retorno de imuno-globulina pinocitada de volta para o espaço extracelular, espera-se que ameia-vida de mimeticorpos de GLP-2 seja significativamente estendida comrelação a peptídeos de GLP-2.
Em uma modalidade dos mimeticorpos da invenção, a estruturamonomérica (GLP2-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) pode ser ligada a outros monôme-ros não-covalentemente ou por ligação covalente tal como, mas não limitadoa, uma ligação de dissulfeto Cys-Cys.
Subclasses IgGI e lgG4 diferem subclasses no número de ciste-ínas na região de dobradiça. Da mesma forma que a subclasse IgGI, háduas cisteínas na dobradiça de lgG4 que participam na ligação de dissulfetoentre cadeias pesadas. Entretanto, a cisteína na dobradiça de IgGI que estánormalmente envolvida na ligação de dissulfeto à cadeia leve está ausentena dobradiça de lgG4. Portanto, a dobradiça de lgG4 é menos flexível doque a dobradiça de IgGI.Além disso, os dois isotipos diferem na sua habilidade de mediara citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e citotoxicidade depen-dente de anticorpo (ADCC). CDC é a Iise de um alvo na presença de com-plemento. A ativação da via do complemento é iniciada pela ligação do pri-meiro componente ao sistema complemento (C1q) a uma molécula comple-xada com um antígeno cognato. IgGI é um forte indutor da cascata do com-plemento e atividade de CDC subseqüente, enquanto que lgG4 tem poucaatividade indutora de complemento.
ADCC é uma reação mediada por células na qual células citotó-xicas inespecíficas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, célu-las Natural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo li-gado a uma célula alvo e subseqüentemente causam Iise da célula alvo.A subclasse IgGI se liga com alta afinidade ao receptor Fc e contribui paraADCC, enquanto que lgG4 se liga apenas fracamente. A incapacidade rela-tiva de lgG4 ativar funções efetoras é desejável já que torna possível a libe-ração do mimeticorpo às células sem morte celular.
Além disso, o sítio de ligação para o receptor seqüestrante FcRnestá presente nos isotipos lgG4 e IgGI e ambos têm características de liga-ção similares. Portanto, espera-se que as farmacocinéticas dos mimeticor-pos IgGI e lgG4 da invenção sejam similares.
A porção dobradiça-CH2-CH3 da região de imunoglobulina (Hg-Ch2- Ch3) também pode ser extensamente modificada para formar variantesde acordo com a invenção. Por exemplo, um ou mais sítios nativos que for-necem características estruturais ou atividade funcional que não são neces-sários pelas moléculas de mimeticorpo poderiam ser removidos. Esses sítiospodem ser removidos, por exemplo, por substituir ou deletar resíduos inserirresíduos no sítio, ou truncar porções que contêm o sítio. Variantes de Hg-Ch2-Ch3 exemplares são discutidos abaixo.
1. Sítios envolvidos em formação de ligação de dissulfeto podemser removidos por deleção ou substituição por outros aminoácidos nos mi-meticorpos da invenção. Tipicamente, os resíduos de cisteína presentesnesses motivos são removidos ou substituídos. A remoção desses sítios po-de evitar ligação de dissulfeto com outras proteínas que contêm cisteínapresentes na célula hospedeira produtora de mimeticorpo ou ligação de dis-sulfeto intracadeia pesada em construtos baseados em lgG4, enquanto queainda permite um domínio CH3-CH2-dobradiça dimérico que é mantido juntonão-covalentemente.
A maioria dos anticorpos do tipo IgG1 tal como IgGI, são molé-culas homodiméricas formadas de duas cadeias pesadas (H) idênticas e du-as cadeias leves (L) idênticas, tipicamente abreviadas como H2L2. Dessaforma, essas moléculas são geralmente bivalentes com relação à ligação deantígeno, isto é, ambos os braços de ligação ao antígeno (Fab) da moléculade IgG têm especificidade de ligação idêntica.
As cadeias pesadas do isotipo lgG4 contêm um motivo CPSC(SEQ ID N9: 34) nas suas regiões de dobradiça capazes de formar ligaçõesde dissulfeto inter- ou intracadeia, isto é, os dois resíduos de Cys no motivoCPSC podem fazer ligação de dissulfeto com os resíduos de Cys correspon-dentes na outra cadeia H (inter) ou os dois resíduos de Cys dentro de umdado motivo CPSC podem formar ligação de dissulfeto um com o outro (in-tra). Acredita-se que enzimas isomerase in vivo sejam capazes de converterligações intercadeia de moléculas de lgG4 em ligações intracadeia e vice-versa (Aalberse & Schuurman, Immunology 105, 9-19 (2002)). Conseqüen-temente, já que pares de HL nessas moléculas de lgG4 com ligações intra-cadeia pesada na região de dobradiça não são associados covalentementeum com o outro, eles podem se dissociar em monômeros de HL que entãose reassociam monômeros de HL derivados de outras moléculas de lgG4formando moléculas de lgG4 biespecíficas, heterodiméricas. Em um anticor-po de IgG biespecífico os dois Fabs da molécula de anticorpo diferem nosepítopos aos quais eles se ligam. Substituir Ser228 na região de dobradiçade lgG4 por Pro resulta em "comportamento semelhante à IgGV11 isto é, asmoléculas formam ligações de dissulfeto estáveis entre as cadeias pesadase portanto, não são suscetíveis a troca de HL com outras moléculas de lgG4.
2. A H-Ch2-Ch3 pode ser modificada para tornar os mimeticor-pos da invenção mais compatíveis com uma célula hospedeira selecionada.Por exemplo, quando um mimeticorpo da invenção é expresso recombinan-temente em uma célula bacteriana tal como E. coli, a seqüência Pro-Ala nadobradiça pode ser removida para evitar digestão pela enzima de E. coli pro-Iina iminopeptidase.
3. Uma porção da região de dobradiça pode ser deletada ousubstaituida por outros aminoácidos nos mimeticorpos da invenção para evi-tar heterogeneidade nos produtos expressos em uma célula hospedeira se-lecionada.
4. Um ou mais sítios de glicosilação podem ser removidos nosmimeticorpos da invenção. Resíduos que são tipicamente glicosilados (porexemplo, Asn) podem conferir atividade citolítica mediada por célula depen-dente de Fc ao mimeticorpo. Tais resíduos podem ser deletados ou substitu-ídos por resíduos que não são glicosilados, tal como Ala.
5. Sítios envolvidos na interação com o complemento, tal como osítio de ligação a C1q, são removidos nos mimeticorpos da invenção.
6. Sítios que afetam a ligação aos receptores Fc diferentes deum receptor de recuperação de FcRn podem ser removidos nos mimeticor-pos da invenção. Por exemplo, os receptores Fc envolvidos na atividade deADCC podem ser removidos nos mimeticorpos da invenção. Por exemplo,mutação de Leu234/Leu235 na região de dobradiça de IgGI paraL234A/L235A ou Phe234/Leu235 na região de dobradiça de lgG4 paraP234A/L235A minimiza a ligação de FcR e reduz a habilidade da imunoglo-bulina mediar citotoxicidade dependente de complemento e ADCC.
Uma modalidade da presente invenção é um mimeticorpo deGLP-2 de acordo com a fórmula (II) em que a Hg-CH2-CH3 é da subclasselgG4 e contém uma substituição Ser228Pro (S228P) e mutaçõesP234A/L235A. As seqüências de polipeptídeo completas de mimeticorpos deGLP-2 exemplares que têm essas mutações e A2S e A2G na seqüência depeptídeo de GLP-2 são mostradas respectivamente em SEQ ID NQS: 4 e 5.
Essas seqüências contêm todos os domínios do construto do mimeticorpo,isto é, os domínios GLP2RAg-Lk-V2-Hg-CH2-CH3. Espera-se que essesconstrutos de mimeticorpo sejam uma população homogênea e estável quenão dispare funções efetoras mediadas por FcR. A substituição e mutaçõesmostradas aqui são exemplares; domínios Hg-CH2-CH3 dentro do escopodessa invenção podem incluir outras substituições, mutações e/ou deleções.
As seqüências de polipeptídeo parciais de outros mimeticorposde GLP-2 baseados em A2G da invenção com comprimentos de Iigantesvariáveis são mostrados em SEQ ID NQS: 6, 7, 8, 9, 10 e 11. Essas seqüên-cias mostram todos os domínios com a exceção dos domínios C»2 e Ch3.Será compreendido por aqueles versados na técnica que um domínio Ch2 eCh3 poderia estar contido em um mimeticorpo funcional.
As seqüências de polipeptídeo parciais de outros mimeticorposde GLP-2 exemplares da invenção baseados nos análogos de GLP-2 quetêm as seqüências de aminoácido mostradas em SEQ ID NsS: 50, 51, 52, 53,54, 55, 56, e 57 são mostradas em SEQ ID NsS: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, e65, respectivamente. Essas seqüências mostram todos os domínios com aexceção dos domínios CH2 e Ch3. Será compreendido por aqueles versadosna técnica que um domínio Ch2 e Ch3 poderia estar contido em um mimeti-corpo funcional.
A presente invenção inclui mimeticorpos de GLP-2 que são ca-pazes de, por ligação, ativar GLP-2R. Os mimeticorpos da presente inven-ção podem se ligar a GLP-2R com uma ampla faixa de afinidades. A afinida-de de um mimeticorpo de GLP-2 por GLP-2R pode ser determinada experi-mentalmente usando qualquer método adequado, por exemplo, métodosusando instrumentação Biacore ou KinExA1 ELISA e ensaios de ligaçãocompetitiva.
Os mimeticorpos e polipeptídeos de GLP-2 da presente inven-ção são úteis no tratamento de distúrbios ou sintomas caracterizados porinflamação, injúria e/ou disfunção do epitélio da mucosa intestinal. Efeitos deGLP-2 também são observados na formação e manutenção de osso, e emdistúrbios mediados pelo sistema nervoso central devido ao seu papel comofator central de saciedade. Doenças ou sintomas que podem ser tratadosusando mimeticorpos ou polipeptídeos de GLP-2 da invenção incluem, masnão são limitados a, doenças do Gl, incluindo SBS, doença inflamatória dointestino (IBD)1 doença de Crohn, colite, pancreatite, ileíte, íleo inflamatório(tanto pós operatório como por outras causas), mucosite associada comquimioterapia e/ou radioterapia, atrofia intestinal causada por nutrição paren-teral total ou isquemia, distúrbios relacionados aos ossos tal como osteopo-rose, distúrbios relacionados com nutrientes incluindo obesidade, e distúr-bios pediátricos do Gl incluindo insuficiência intestinal devido à enterocolitenecrosante em crianças recém-nascidas. Mimeticorpos ou polipeptídeos deGLP-2 da presente invenção também podem ser usados para prevenir, re-duzir os sintomas de, e tratar íleo inflamatório.
Conseqüentemente, outro aspecto da presente invenção sãocomposições farmacêuticas que compreendem pelo menos um mimeticorpoou polipeptídeo de GLP-2 da invenção e um veículo ou diluente farmaceuti-camente aceitável conhecido na técnica. O veículo ou diluente pode ser umasolução, suspensão, colóide, ou pó.
Um mimeticorpo ou polipeptídeo da invenção é formulado comouma composição farmacêutica em uma quantidade terapeuticamente ou pro-filaticamente eficaz. O termo "quantidade eficaz" refere-se às quantidades demimeticorpo ou polipeptídeo necessárias para terapia eficaz, isto é, o alívioparcial ou completo do sintoma ou distúrbio para o qual o tratamento foi bus-cado. Incluídos dentro da definição de terapia eficaz estão tratamentos profi-láticos pretendidos para reduzir a probabilidade de início dos sintomas oudistúrbios descritos acima.
A composição pode compreender opcionalmente pelo menos umcomposto, proteína ou composição adicional útil para tratar os estados dedoença discutidos aqui. Por exemplo, os mimeticorpos da invenção podemser usados em combinação com glutamina ou outros suplementos nutricio-nais são contemplados para aumentar o peso corporal, auxiliar na cura intes-tinal ou melhorar a absorção de nutrientes. Além disso, combinações comagentes antiinflamatórios também são contempladas. O termo "em combina-ção com" como usado aqui e nas reivindicações significa que os agentesdescritos podem ser administrados a um mamífero juntos em uma mistura,concomitantemente como agentes únicos ou seqüencialmente como agentesúnicos em qualquer ordem.
Ácidos nucléicos. vetores e linhagens celulares
Outro aspecto da presente invenção são moléculas de ácido nu-cleico isoladas que compreendem, complementares a ou tendo identidadesignificativa com, um polinucleotídeo que codifica pelo menos um mimeticor-po ou polipeptídeo de GLP-2 da invenção. Outros aspectos da presente in-venção incluem vetores recombinantes que compreendem pelo menos ummimeticorpo ou polipeptídeo de GLP-2 isolado da invenção que codifica mo-léculas de ácido nucleico e linhagens celulares e organismos que são capa-zes de expressar as moléculas de ácido nucleico. Os ácidos nucléicos, veto-res de expressão, e linhagens celulares também podem ser usados geral-mente para produzir o mimeticorpo da invenção.
Em uma modalidade, as composições de ácido nucleico da in-venção codificam polipeptídeos que têm seqüências de aminoácido idênticasou substancialmente homólogas a qualquer uma de SEQ ID NQS: 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 74, 75, e 77. Seqüên-cias de ácido nucleico exemplares que codificam as seqüências de polipep-tídeo mostradas em SEQ ID N9: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 75, e 77 são mostradas em SEQ ID N9: 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, e 78, respecti-vamente. Também são fornecidas variações alélicas dos ácidos nucléicosdescritos acima.
Tipicamente, os ácidos nucléicos da presente invenção são usa-dos em vetores de expressão para a preparação do mimeticorpo ou polipep-tídeos de GLP-2 da invenção. Vetores dentro do escopo da invenção forne-cem elementos necessários para expressão eucariótica, incluindo vetoresdirecionados por promotor viral, tais como vetores direcionados por promotorde CMV, por exemplo, pcDNA3.1, pCEP4 e seus derivados, vetores de ex-pressão de Baculovírus, vetores de expressão de Drosophila e vetores deexpressão que são direcionados por promotores de genes de mamífero, taiscomo promotores de gene de Ig humana. Outros exemplos incluem vetoresde expressão procarióticos, tais como vetores direcionados por promotor deΤ7, por exemplo, pET41, vetores direcionados por promotor de Iactose e ve-tores direcionados por promotor de gene de arabinose.
A presente invenção também refere-se a linhagens celulares queexpressam mimeticorpos ou polipeptídeos de GLP-2 da invenção. As célulashospedeiras podem ser células procarióticas ou eucarióticas. Células eucari-óticas exemplares são células de mamífero, tais como, mas não limitadas a,COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, HepG2, 653, SP2/0, NSO1293, HeLa, mieloma, células de linfoma, ou qualquer outra derivadas dessas.
O mais preferivelmente, as células hospedeiras são células HEK293, NSO,SP2/0 ou CHO. As linhagens celulares da presente invenção podem expres-sar estavelmente pelo menos um mimeticorpo de GLP-2. As linhagens celu-lares podem ser geradas por procedimentos de transfecção estável ou tran-sitória que são bem conhecidos na técnica.
A presente invenção ainda fornece métodos para expressar pelomenos um mimeticorpo ou polipeptídeo de GLP-2 que compreende cultivaras linhagens celulares sob condições em que o mimeticorpo ou polipeptídeoGLP-2 seja expresso em quantidades detectáveis ou recuperáveis. A pre-sente invenção também fornece métodos para gerar pelo menos um mimeti-corpo ou polipeptídeo que compreende traduzir o mimeticorpo ou polipeptí-deo de GLP-2 que codifica ácidos nucléicos sob condições in vitro ou in situ,tal que o mimeticorpo ou polipeptídeo de GLP-2 seja expresso emquantidades detectáveis ou recuperáveis. A presente invenção tambémabrange mimeticorpos ou polipeptídeos de GLP-2 produzidos pelos métodosacima.
Um mimeticorpo de GLP-2 pode ser recuperado e purificado pormétodos bem conhecidos incluindo, mas não limitados a, purificação porproteína A, sulfato de amônio ou precipitação com etanol, extração comácido, cromatografia por troca de ânion ou cátion, cromatografia defosfocelulose, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia deafinidade, cromatografia de hidroxilapatita, e cromatografia de lectina.Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) tambémpode ser empregada para purificação.Alternativamente, um polipeptídeo derivado de GLP-2 dainvenção pode ser preparado por técnicas de síntese química bemconhecidas daqueles versados na técnica. Polipeptídeos da invençãoproduzidos tanto por métodos recombinantes como químicos podem serrecuperados e purificados por métodos bem conhecidos daqueles versadosna técnica.
Métodos de uso
Os mimeticorpos ou polipeptídeos de GLP-2 são úteis, interalia,como reagentes de pesquisa e agentes terapêuticos. Em um aspecto, apresente invenção refere-se a um método de modificar as atividadesbiológicas de GLP-2 compreendendo fornecer pelo menos um mimeticorpoou polipeptídeo de GLP-2 a um mamífero de que necessite disso. O mimeti-corpo ou polipeptídeo de GLP-2 pode ativar cascatas de sinalização celularatravés de GLP-2R. Em particular, o mimeticorpo ou polipeptídeo de GLP-2pode funcionar como um agonista de GLP-2R. O termo "agonista" é usadono sentido mais amplo e inclui uma molécula que é capaz de ativar, aumen-tar ou promover, diretamente ou indiretamente, parcialmente ou completa-mente uma ou mais atividades biológicas de GLP-2R.
A presente invenção também fornece métodos para reduzir ossintomas de, ou tratar pelo menos uma condição relacionada com GLP-2que compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz depelo menos uma composição farmacêutica de mimeticorpo ou polipeptídeode GLP-2 a um paciente que necessite disso. As condições e doenças ade-quadas para tratamento usando os métodos da presente invenção incluem,mas não são limitadas a, doenças do Gl1 incluindo SBS, doença de Crohn, edistúrbios pediátricos de Gl, mucosite associada com quimioterapia de cân-cer, IBD, íleo inflamatório, e outras doenças e condições descritas acima.
GLP-2 interage preferivelmente com GLP-2R encontrado prima-riamente em neurônios do sistema nervoso entérico, e em células enteroen-dócrinas que contêm GLP-2 (Guan et ai, Gastroenterology 130: 150-164(2006)). Uma das funções primárias de GLP-2 é promover a proliferação decélulas colunares nas criptas das vilosidades em que ela aumenta a renova-ção de células epiteliais e cura de lesão da mucosa (Bulut etal., Regul. Pept.121: 137-43 (2004)), aumenta a função de barreira da mucosa (Benjamin etai, Gut 47: 112-119 (2000)), e inibe a morte celular por apoptose (Brubaker& Drucker, Endocrinology 145: 2653-2659 (2004)). Esses efeitos foram mos-trados ser neuralmente dependentes já que GLP-2R não é expresso em cé-lulas epiteliais colunares da cripta (Bjerknes & Cheng, Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 98: 12497-12502 (2001)). A presença de GLP-2R em neurônios enté-ricos sugere que GLP-2 pode modificar a motilidade assim como interaçõesneuro-imunes que desempenham um papel em inflamação intestinal.
Conseqüentemente, a presente invenção ainda fornece métodosde prevenir, reduzir os sintomas de, ou tratar íleo inflamatório, que compre-endem administrar uma composição de polipeptídeo de GLP-2 ou uma com-posição de mimeticorpo de GLP-2 a um paciente que necessita disso. Comousado aqui, "íleo inflamatório" pode ser íleo de qualquer porção do trato gas-trointestinal, por exemplo, o estômago, o intestino delgado, e/ou o cólon. A-lém disso, "íleo inflamatório" pode resultar de qualquer fator que cause íleo,por exemplo, cirurgia, incluindo cirurgia abdominal, tal como cirurgia detransplante ou cirurgia abdominal diferente de cirurgia de transplante, cirur-gia do intestino, tal como ressecção de intestino, e cirurgia ortopédica; lesãotraumática, por exemplo, quedas, acidente de automóvel, agressão pessoal,ou quaisquer seqüelas que resultem de lesão traumática, por exemplo, fratu-ras de membros, fraturas de costelas, fraturas da espinha, lesões torácicas,isquemia, hematomas retroperitoneais; inflamação intraperitoneal, por e-xemplo, sepse intra-abdominal, apendicite aguda, colecistite, pancreatite,cólica uretérica, pneumonia basal; infarto do miocárdio; distúrbios metabóli-cos; ou qualquer combinação desses.
Como descrito acima, a composição farmacêutica de mimeticor-po ou polipeptídeo de GLP-2 compreende uma quantidade eficaz de pelomenos um mimeticorpo ou polipeptídeo de GLP-2 e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável. A quantidade eficaz para uma dada terapia,curativa ou preventiva, dependerá geralmente de vários fatores, incluindomeios de administração, sítio alvo e outros medicamentos administrados.Dessa forma, doses de tratamento precisarão ser tituladas para otimizar asegurança e eficácia.
Os métodos da presente invenção podem ainda compreenderopcionalmente co-administração ou terapias de combinação com qualquerterapia padrão usada para tratar as doenças listadas acima.
O modo de administração pode ser qualquer via adequada para liberar aquantidade farmaceuticamente eficaz de mimeticorpo ou polipeptídeo GLP-2da presente invenção a um hospedeiro. Por exemplo, o mimeticorpo ou poli-peptídeo de GLP-2 pode ser liberado através de administração parenteral,tal como administração subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosaou intranasal, ou qualquer outro meio conhecido na técnica.
A presente invenção é ainda descrita com relação aos seguintesexemplos. Esses exemplos são meramente para ilustrar aspectos da presen-te invenção e não pretendem ser limitações dessa invenção.
Exemplo 1
Clonagem. Expressão e Purificação de mimeticorpos de GLP-2 em Célulasde Mamíferos
A seqüência de ácido nucléico que codifica GLP-2 A2S foi gera-da em uma amplificação por PCR de duas etapas. A primeira rodada de am-plificação foi realizada usando o iniciador direto
5'-CCAAAGTATACAGGCGCATAGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAAC ACC ATTCTTG -3' (SEQ ID N9: 37) e o iniciador reverso 5'-TTGGTCTGAATCAACCAGTTTATAAAGTCTCGAGCGGCAAGATTATCAAGAATGGTGTTCATCTC-3' (SEQ ID Ns: 38). As temperaturas de desnatura-ção, anelamento e extensão foram de 969C, 489C, e 72SC, respectivamente.
Três ciclos de reações foram realizados.
Para a segunda rodada de amplificação, o iniciador direto incluiuum sítio de reconhecimento de enzima de restrição Notl e os iniciadores re-versos incluiram um sítio de BamHI. A seqüência do iniciador direto é 5'-TTTGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCG-3' (SEQ ID Ns: 39) e o iniciadorreverso é 5'-AAAGGATCCGTCAGTGATTTTGGTCTGAATCAACCAG-3'(SEQ ID NQ: 40). As temperaturas de desnaturação, anelamento e extensãoforam de 96QC, 48-C, e 60°C, respectivamente. Três ciclos de reações foramrealizados.
A seqüência de ácido nucleico que codifica GLP-2 A2G foi gera-da pelo mesmo procedimento exceto que o iniciador direto usado na primeirarodada de amplificação é
5'-CCAAAGTATACAGGCGCATGGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3' (SEQ ID Ns: 41).
Os produtos de PCR amplificados (A2S e A2G GLP-2) foramclonados nos sítios Notl/BamHI de um promotor de CMV direcionado, vetorde expressão de lgG4 ACH1 humano, Ser para Pro, Ala/Ala usando proce-dimentos de clonagem padronizados.
Os mimeticorpos de lgG4 GLP-2 A2S e A2G foram transitoria-mente expressos em células HEK293E e purificados a partir do meio condi-cionado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo comprocedimentos padronizados. O material eluído a partir da coluna de afinida-de de proteína A foi ainda submetido a uma coluna de exclusão de tamanhopara purificação adicional.
Os mimeticorpos de GLP-2 A2S e A2G foram analisados poreletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e a cromatografiade exclusão de tamanho acoplada à análise de dispersão da luz estática(SEC-SLS). A migração dos mimeticorpos purificados em SDS-PAGE sobambas as condições de desnaturação redutora e não redutora foi na faixaesperada. A análise por SEC-SLS mostrou uma proteína com um peso mo-lecular de aproximadamente 123 KD que corresponde ao dímero dos mime-ticorpos. Como os Mimeticorpos de GLP-2 migram como um monômero nogel de SDS-PAGE, a dimerização é através de interações não covalentes.
Exemplo 2
Ensaio de Expressão de cAMP
A fim de avaliar as atividades in vitro dos mimeticorpos de GLP-2, um ensaio de expressão de cAMP foi desenvolvido. Para se atingir esseobjetivo, uma linhagem celular clonal que expressa GLP-2R humano mutadofoi gerada pela transfecção de células HEK 293E. GLP-2R humano mutadodifere de GLP-2R humano selvagem (SEQ ID N9:35) em três posições deaminoácidos dentro da região intracelular C-terminal (SEQ ID NQ: 36). O pep-tídeo de GLP-2 estimulou a expressão de cAMP nessa linhagem celular e aestimulação foi específica, já que um peptídeo de controle não estimulou aexpressão de cAMP.
Os mimeticorpos de lgG4 GLP-2 A2S e A2G foram comparadoscom os peptídeos de GLP-2 correspondentes (A2S e A2G) quanto a sua ha-bilidade de estimular a expressão de cAMP na linhagem celular recombinan-te. Resumidamente, as células foram incubadas com o mimeticorpo de GLP-2 ou peptídeo de GLP-2 individual por 30 minutos. A expressão de cAMP foiquantificada usando o cAMP Direct Screen System (Cat. No. CSD 200, Ap-plied Biosystems, Bedford, MA). A EC5O para os peptídeos A2S e A2G é 0,5nM e 0,8 nM, respectivamente; a EC50 para os peptídeos de A2S e A2G é2,2 nM e 3,8 nM, respectivamente. Portanto, a potência dos mimeticorpos deGLP-2 nesse ensaio foi ~4 vezes menor do que o peptídeo.
Exemplo 3
Variantes de Mimeticorpos de GLP-2
Para investigar o efeito do comprimento do ligante sobre o mi-meticorpo de GLP-2, diferentes construtos com várias extensões Iigantesforam gerados. As seqüências da região central são mostradas abaixo naTabela 1.
Essas variantes foram expressas transitoriamente em célulasHEK 293, purificadas e analisadas por SDS-PAGE. A análise por SEC-SLSmostrou um pico com um peso molecular de 65-70 kDa, correspondendo aomonômero dos mimeticorpos além daquele que corresponde ao dímero dosmimeticorpos. Foi observado que quanto maior a extensão de ligante, maiora proporção da população de monômeros.
Extensões de Iigantes e variantes da região V2 foram testadasno ensaio de expressão de cAMP descrito no Exemplo 2. Os dados demons-traram que as atividades dos mimeticorpos de GLP-2, como medido porEC50, se correlacionaram diretamente com a extensão do ligante, isto é, mi-meticorpos com Iigantes mais longos tem atividade maior (Tabela 1).Tabela 1. Seqüências de aminoácidos do centro e EC5O de mimeticorpos deGLP-2 com extensão de Iigante variável.
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* Apenas os aminoácidos de números 1-59 de SEQ ID N-: 5 são mostradosna tabela.
** SEQ ID NQ: 11 mostra uma variante de região V2.
A fim de aumentar a estabilidade de mimeticorpos de GLP-2,várias variantes foram construídas nas quais os resíduos de aminoácidosnos sítios sensíveis à clivagem proteolítica na região V2 ou Hg foram substi-tuídos por Pro. As seqüências da região central das variantes do mimeticor-po de GLP-2 são mostradas abaixo na Tabela 2.Tabela 2. Seqüências de aminoácidos do centro e EC5O de mimeticorpos deGLP-2 com substituição de Pro.
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As variantes com substituição de Pro foram expressas transitori-amente em células HEK 293, purificadas e analisadas por SDS-PAGE. Osdados do ensaio de expressão de cAMP demonstraram que as atividadesdessas variantes de mimeticorpos de GLP-2, como medido pela EC50, sãocomparáveis àquelas do mimeticorpo A2G de GLP-2 (SEQ ID N9:5).
As variantes com substituição de Pro purificadas foram incuba-das com Iisado de célula U397 na presença de comprimidos do inibidor deprotease CompIeteMini (Cat. Nq 1 836 153, Roche Applied Science, Indiana-polis, IN) por O, 12 ou 24 horas. Mais tarde, as variantes do mimeticorpo deGLP-2 foram purificadas usando "beads" de Proteína A e resolvidas em umgel de SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 1, em comparação com o mi-meticorpo de GLP-2 A2G (SEQ ID Ns:5), houve menos degradação nas vari-antes com substituição de Pro (SEQ ID N9: 43 ou 44) no período de teste de24 horas. Em conclusão, as variantes com substituição de Pro são mais re-sistentes à proteólise in vitro.
Exemplo 4
Mimeticorpo de GLP-2 Estimula o Ganho de Peso Mucoso no Intestino Delgado
Para demonstrar as atividades in vivo dos mimeticorpos de GLP-2, camundongos CD1 foram inoculados com os mimeticorpos de GLP-2 epontos de medição dentro do intestino delgado foram avaliados. Resumida-mente, camundongos CD1 fêmeas foram inoculados diariamente com inje-ções subcutâneas de peptídeo de GLP-2 A2G (SEQ ID Ne: 3), mimeticorpode lgG4 de GLP-2 A2G (SEQ ID NQ: 5) ou mimeticorpo de controle por 10dias. Mais tarde, os camundongos foram sacrificados e os intestinos delga-dos foram removidos, lavados com salina e processados como descrito a-baixo.
Especificamente, seções de 4 cm foram coletadas: (1) imedia-tamente distai ao piloro (duodeno), (2) iniciando a 2 cm distais do Iigamentode Treitz (jejuno) e (3) imediatamente proximal ao ceco (íleo). O restante dointestino delgado entre ~6 cm distais ao Iigamento de Treitz até 4 cm proxi-mais ao ceco foi usado para preparar raspados de mucosa. Das extremida-des proximal e distai do restante, uma distância igual foi removida até querestou uma seção de 15 cm, o remanescente foi cortado longitudinalmente,lavado e a camada mucosa foi removida usando a extremidade curta de umalâmina de vidro de microscópio. O peso úmido dos segmentos intactos intes-tinais e da mucosa foi medido.
O peso dos raspados de mucosa retirados do segmento de 15cm entre o jejuno e íleo de camundongos diferentes é mostrado na Figura 2.Para camundongos inoculados com mimeticorpo de GLP-2 A2G, um aumen-to dependente da dose no peso úmido da mucosa foi observado. Com 0,8 e8 mg/kg (0,26 e 2,6 nmoles, respectivamente) o aumento foi estatisticamentesignificativo comparando com o mimeticorpo de controle (p<0,0001 ep<0,0004, respectivamente).
Um aumento estatisticamente significativo (p < 0,0001) tambémfoi visto em camundongos inoculados com 2,5 mg/kg (13,3 nmoles) de pep-tídeo de GLP-2 A2G. Em comparação, o mimeticorpo de GLP-2 A2G é efi-caz in vivo em uma dose 50 vezes menor do que a do peptídeo de GLP-2A2G (em base molar).
Exemplo 5
Farmacocinéticas de Mimeticorpo de GLP-2
Para medir a farmacocinética de mimeticorpos de GLP-2, ca-mundongos CD1 foram inoculados intravenosamente ou subcutaneamentecom 3 mg/kg de mimeticorpo de GLP-2 A2G (SEQ ID Ns: 5). Sangue foi co-letado em diferentes períodos de tempo em tampão citrato contendo inibido-res de protease para minimizar a possibilidade de degradação ex vivo e oplasma foi separado por centrifugação.
Um ensaio de fluorescência resolvido com o tempo (TRF) foi u-sado para medir o mimeticorpo ativo. Mimeticorpo ativo reflete a terminação-N intacta do peptídeo ainda acoplada à região Fc do mimeticorpo.
Com base nos experimentos de TRF, a meia-vida calculada domimeticorpo de GLP-2 A2G em camundongos foi de 26,5 horas. Em contras-te, a meia-vida relatada do peptídeo de GLP-2 em humanos é de 7,2 +/- 2minutos (Hartmann et ai, J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 2884-2888 (2000)).Portanto, a meia-vida do mimeticorpo de GLP-2 A2G é mais do 200 vezesmaior do que aquela do peptídeo de GLP-2.
Em um experimento similar, macacos cinomolgos foram inocula-dos intravenosamente com 1 mg/kg do mimeticorpo de GLP-2 A2G. Combase nos dados de TRF, a meia-vida calculada do mimeticorpo de GLP-2A2G em macacos cinomolgos foi de 4,8 dias.
Exemplo 6
Farmacodinâmica de Mimeticorpo de GLP-2
Com base na sua farmacocinética estendida, espera-se que omimeticorpo de GLP-2 tenha uma duração de resposta mais longa. Para a-valiar a farmacodinâmica do mimeticorpo de GLP-2 A2G, camundongos fo-ram dosados diariamente, em dias alternados, semanalmente ou apenasuma vez no início do estudo. Para controlar a manipulação dos animais, nosdias em que os camundongos não receberam mimeticorpo de GLP-2 A2G,eles foram injetados com o mimeticorpo de controle negativo, isto é, a estru-tura da imunoglobulina do mimeticorpo sem o peptídeo de GLP-2. As dosesdo mimeticorpo de GLP-2 A2G e o controle negativo foram 4 mg/kg'(1,3nmol/kg) para todos os grupos. A duração do estudo foi de 11 dias e o tecidofoi processado como descrito no Exemplo 4.
Camundongos dosados com o mimeticorpo de GLP-2 A2G umavez por semana tiveram um aumento significativo do peso da mucosa emcomparação ao mimeticorpo de controle. A diferença foi mais pronunciadaquando o mimeticorpo de GLP-2 A2G foi administrado todos os dias, ou emdias alternados. Padrão similar foi observado com relação ao peso líquido daseção de intestino delgado. Tanto no duodeno como no jejuno, um aumentosignificativo no peso sobre o mimeticorpo de controle foi visto com todos osregimes exceto para o experimento de dose única.
Exemplo 7
Mutações em GLP-2 Evitam Dimerização de Peptídeo
Peptídeo de GLP-2 selvagem (SEQ ID NQ: 1) dimeriza em altaconcentração. Por exemplo, em PBS (pH 7,5), GLP-2 existe como um mo-nômero a 0,4 mg/mL, mas como uma mistura de monômeros (cerca de 20%)e dímero reversivelmente auto-associado (cerca de 80%) a 2 mg/mL (dadosnão mostrados). A auto-associação impõe um desafio ao desenvolvimento efabricação de um terapêutico homogêneo.
Foram desenhados análogos de peptídeo (SEQ ID NQS: 52, 54,55, e 74) que retêm a atividade biológica de GLP-2 selvagem e existem co-mo um monômero em alta concentração. GLP-2 (A2G, L17Q) (SEQ ID N9:54) e GLP-2 (A2G, N16G, L17Q) (SEQ ID Ns: 55) foram sintetizados e purifi-cados para >95% de pureza. Os peptídeos GLP-2 (SEQ ID Ns: 1), GLP-2(A2G) (SEQ ID N9: 3), e GLP-1 (SEQ ID N9: 79) foram incluídos como contro-les na caracterização dos análogos.
Peso molecular da solução dos peptídeos foi medido por SEC-SLS. Resumidamente, soluções de peptídeo em PBS (pH 7.5) a 0,4 a 2,0mg/mL foram refracionadas em uma coluna de peptídeo Superdex (Amer-sham Pharmacia). Os picos eluídos foram monitorados por difração de luzestática a 690 nm e o peso molecular da solução foi determinado a UV 280nm usando o pacote de programas Astra (Wyatt Inc.).
A 1 mg/ml, GLP-1 eluiu como um único pico com peso moleculardentro do tamanho de monômero esperado. GLP-2 e GLP-2 (A2G) apresen-taram distribuições similares dos picos de dímero e monômero superpostos.Ambos os peptídeos análogos GLP-2 (A2G, L17Q) e GLP-2 (A2G, N16G,L17Q) eluiram como picos únicos com peso molecular consistente principal-mente com peptídeo monomérico.
As estruturas secundárias de peptídeos testados foram determi-nadas usando 0,2 mg/mL de soluções de peptídeo em PBS. Resumidamen-te, os espectros de CD foram coletados em triplicata em intervalos de 1 nm a25°C em célula de extensão de trajetória de 0,1 cm. Estruturas secundáriasforam determinadas pelo ajuste de espectro de CD usando o programa deespectro de CD (CD Spectra Deconvolution Software 2.1). Todos os peptí-deos testados continham picos que correspondiam a presença de alfa héli-ces. Entretanto, o conteúdo de alfa hélice nos peptídeos análogos GLP-2(A2G, L17Q) e GLP-2(A2G, N16G, L17Q) foi de -17%, similar àquele deGLP-1, e menor do que aquele de GLP-2 e GLP-2 (A2G) (Tabela 3).
Tabela 3. Porcentagem de estrutura helicoidal e espiral aleatória em peptí-deos de GLP
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Além disso, trifluoroetanol (TFE) é conhecido por induzir forma-ção de hélice em peptídeos (Soennichsen et ai, Biochemistry 31: 8791(1992)). Conseqüentemente, a análise de tendência helicoidal usando TFEfoi realizada. Resumidamente, os peptídeos testados foram diluídos para 0,2mg/mL em PBS (pH 7.5) contendo 0, 1, 5, 15, 33 ou 50% de TFE. Os espec-tros de CD foram coletados e gráficos de CD foram gerados após calcular amédia dos dados, subtração de tampão e uniformização da curva. Os valo-res de tendência helicoidal foram obtidos a partir da elipticidade de resíduomédia (MRE) a 222 nm versus gráficos de % de TFE. A concentração deTFE que efetuou uma transformação de 50% do espectro de CD a 222 nmfoi usada como uma medida da tendência helicoidal.
Os resultados mostraram que GLP-2 e GLP-2 (A2G) apresenta-ram maior tendência helicoidal, requerendo -16% de TFE para transforma-ção para sinal de hélice máximo. Em comparação, GLP-1 teve menor ten-dência helicoidal, requerendo >20% de TFE para a transformação helicoidal.De forma significativa, os peptídeos análogos GLP-2 (A2G, L17Q) e GLP-2(A2G, N16G, L17Q) requerem >20% de TFE para transformação helicoidal,tendo uma semelhança mais próxima a GLP-1 do que GLP-2. Portanto, asubstituição L17Q diminuiu o potencial de formação de hélice do peptídeo deGLP-2.
Exemplo 8
Mutações em GLP-2 Evitam a Dimerizacão do Mimeticorpo
Seqüências de ácido nucléico que codificam mimeticorpos deGLP-2 com análogos A2G, L17Q (SEQ ID N9: 75) e A2G, N16G, L17Q (SEQID N9: 77), foram gerados usando o kit QuickChange XL da Stratagene. Es-sas variantes de mimeticorpos foram transitoriamente expressas em célulasHEK 293E e purificadas seguindo os procedimentos do Exemplo 1.
Com base na análise de SEC-SLS, o mimeticorpo de GLP-2(A2G, N16G, L17Q) exibiu um peso molecular consistente com monômero,enquanto que o mimeticorpo de GLP-2 (A2G, L17Q) exibiu um peso molecu-lar que refletia uma mistura de monômero e dímero.
Exemplo 9
Atividade In vitro de Mimeticorpos Análogos de GLP-2
A atividade in vitro de análogos de GLP-2 foi testada em um en-saio de expressão de cAMP. Esse ensaio foi baseado no cAMP Direct Scre-en System de Applied Biosystems utilizando uma linhagem celular que ex-pressa huGLP-2R mutada em células HEK 293E. O peptídeo em concentra-ções que variam de 0,01 nM a 1,0 uM em PBS com BSA 0,5% foi adicionadoa -50.000 células suspensas em placas de 96 poços. Após uma incubaçãode 30 minutos a 37SC, Tampão de Lise seguido por reagentes de Iumines-cência (Applied Biosystems) foi adicionado de acordo com os procedimentosdo fabricante (Applied Biosystems Luminescence protocol: cAMP-ScreenDirect System). A luminescência foi quantificada usando um analisador decintilação líquida TopCount (PerkinEImer) e os dados foram processadosusando o programa Softmax (Molecular Devices Corporation). Os valores deEC-50 obtidos dos gráficos de níveis de cAMP versus a concentração depeptídeo estão listados na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5: Valores de EC-50 de peptídeos de GLP-2 obtidos a partir de gráfi-
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Os dados indicam apenas 2x e 3x menos atividade de GLP-2(a2g,ni6g, li7q) e GLP-2(a2g, l17q), respectivamente, em relação a GLP-2 selvagem.
Exemplo 10
Peptídeo A2G-GLP-2 Acelera o Trânsito do Gl Superior
Para testar os efeitos de A2G-GLP-2 sobre o trânsito gastroin-testinal superior em camundongos normais, camundongos foram designadosaleatoriamente em 2 grupos (14 animais por grupo de teste). Cada gruporecebeu diariamente uma injeção subcutânea (volume total de 200 ml) depeptídeo GLP-2-A2G (50 pg/camundongo) ou veículo de salina tamponadacom fosfato por 10 dias consecutivos.
No dia do estudo, o transito gastrointestinal superior foi medidousando a técnica do corante de carmim. Camundongos foram alimentadoscom uma ração de teste de 0,25 mL de uma solução a 6% (p/v) de pó decochinila carmim misturado em metilcelulose a 0,5% (p/v) administrada in-tragastricamente por um tubo de alimentação curvo de 18 gauge. Após aadministração da ração de teste oral, os camundongos foram recolocadosem suas gaiolas. Vinte minutos após a administração da ração marcadora,os camundongos foram rapidamente sacrificados por deslocamento cervicale o trato gastrointestinal completo foi retirado começando do cólon distai etrabalhando em direção ao piloro gástrico. O intestino retirado foi alinhadoem paralelo a uma régua com escala métrica linear tomando cuidado paraevitar o encolhimento do órgão. A distância linear atravessada pelo corantecarmim através do intestino delgado foi medida junto com o comprimentototal do intestino delgado. O trânsito gastrointestinal superior foi expressocomo o percentual do intestino delgado inteiro atravessado pelo corantecarmim durante o período de teste de 20 minutos: % do intestino delgadoatravessado = [distância atravessada pelo corante através do intestino del-gado (cm) / comprimento total do intestino delgado (cm) χ 100]. Como mos-trado na Figura 3, o tratamento com A2G-GLP-2 levou a uma aceleração dotrânsito gastrointestinal superior.
Exemplo 11
Mimeticorpo de GLP-2 Acelera o Trânsito de Gl Superior
Para testar os efeitos do mimeticorpo de GLP-2 sobre o trânsitogastrointestinal superior em camundongos normais, os camundongos foramdesignados aleatoriamente em 2 grupos (4 animais por grupo). Cada gruporecebeu uma única injeção de mimeticorpo de GLP-2 A2G (SEQ ID Ns: 5) (4mg/kg) ou de lgG4 de controle negativo 4 dias antes da medida do trânsitogastrointestinal.
No dia do estudo, o trânsito gastrointestinal superior foi medidousando o método FITC-dextrano. Esse método fornece tanto a medida dotrânsito gastrointestinal como uma leitura do padrão de distribuição da raçãode teste ao longo do trato gastrointestinal. Os camundongos foram alimenta-dos com uma ração de teste de 150 ml de solução de FITC-dextrano (5mg/ml de dextrano de peso molecular 70.000 conjugado com isotiocianatode fluoresceína em 0,5% de metilcelulose/água deionizada), administradaintragastricamente por um tubo de alimentação curvo de calibre 18. Após aadministração oral da ração de teste com FITC-dextrano, os camundongosforam recolocados em suas gaiolas, Foi mostrado que um período de testede 30 min era a duração ótima para detectar o trânsito acelerado, enquantoque um período de teste de 45 min era ótimo para detectar o trânsito retar-dado. Após o período de teste apropriado, os camundongos foram sacrifica-dos pela exposição a dióxido de carbono. O trato gastrointestinal completodesde o esfíncter esofagiano inferior até o cólon terminal foi removido. Ossegmentos do intestino foram abertos ao longo da borda mesentérica. O te-cido e os conteúdos Iuminais do estômago, 10 segmentos iguais de intestinodelgado, o ceco e 3 segmentos iguais do cólon foram colocados em tubosEppendorf individuais contendo 1 ml de PBS. O tecido foi vigorosamentemisturado em um vortex table-top, e os materiais sólidos foram precipitadospor centrifugação. Alíquotas do sobrenadante clarificado foram lidas em du-plicata em um leitor de fluorescência de placa de 96 poços para quantificar amagnitude do sinal fluorescente em cada segmento de intestino. Esses valo-res foram usados para calcular o Centro Geométrico (GC), que é definidocomo a distribuição média ponderada do sinal fluorescente ao longo do tratogastrointestinal: GC = X (% do sinal fluorescente total por segmento χ núme-ro de segmentos)/100. Valores maiores representam taxas mais rápidas detrânsito em uma escala de 1 a 15. Como mostrado na Figura 4, uma únicadose do tratamento com mimeticorpo de GLP-2 levou a uma aceleração dotrânsito gastrointestinal superior. A mudança induzida pelo mimeticorpo nopadrão de distribuição de FITC-dextrano é mostrada no painel superior. Háuma marcação diminuída no estômago, e uma mudança global da massa domarcador para segmentos mais distais do intestino delgado. O GC é calcu-lado no painel inferior para comparação estatística. Camundongos normaisexibem um GC = 6 após um teste de duração de 30 minutos e isso ficou inal-terado pelo tratamento com o esqueleto de lgG4. O tratamento com o mime-ticorpo de GLP-2 aumentou o GC para 7,5.
Exemplo 12
Mimeticorpo de GLP-2 Atenua a Motilidade Gl Prejudicada Associada comíleo Inflamatório Pós-Operatório
Devido a imunogenicidade de lgG4 humana em camundongos,um mimeticorpo de GLP-2 de murino, isto é, um peptídeo A2G-GLP2 huma-no em um esqueleto de lgG2a de murino (SEQ ID NQ: 80) foi usado nos se-guintes experimentos.
Para testar os efeitos do mimeticorpo de GLP-2 sobre a motili-dade de Gl prejudicada associada com íleo inflamatório pós-operatório, ca-mundongos foram randomizados em 3 grupos (8 animais por grupo) e trata-dos com 2 mg/kg de mimeticorpo A2G-GLP2 de murino, lgG2a ou PBS. Umahora mais tarde, os camundongos foram submetidos à Iaparotomia e mani-pulação do intestino delgado. Resumidamente, camundongos CD-1 machosforam anestesiados com isoflurano inalado e preparados para cirurgia. Oabdome foi raspado e tratado com solução anti-séptica. O animal foi entãocoberto com um campo cirúrgico. O abdome foi aberto através de Iaparoto-mia mediai e o intestino delgado inteiro foi exteriorizado sobre o campo esté-ril. Usando dois aplicadores com pontas de algodão, umedecidos, estéreis, ointestino delgado foi gentilmente comprimido ao longo de sua extensão apartir do Iigamento de Treitz até a junção íleo-cecal. O intestino delgado foientão recolocado em sua cavidade e a incisão fechada e suturada. Mais tar-de, os camundongos foram recolocados em suas gaiolas. Um quarto grupode 8 animais serviu como controles naive.
Todos os camundongos receberam uma ração de teste oral deFITC-dextrano 48 horas após a operação. O trânsito gastrointestinal foi de-terminado 45 minutos após a alimentação oral. Como mostrado na Figura 5,os controles naive exibiram um trânsito normal de 45 minutos (GC = 8,2). Acirurgia abdominal levou a um retardo significativo no trânsito gastrointestinalem animais tratados com PBS. O tratamento com lgG2a não teve efeito so-bre o retardo no trânsito induzido cirurgicamente, enquanto que o tratamentocom mimeticorpo A2G-GLP-2 de murino levou a uma melhora significativano trânsito.
Exemplo 13
Mimeticorpo de GLP-2 Reduz a Inflamação Celular Associada com íleo In-flamatório Pós-Operatório
Para testar os efeitos do mimeticorpo de GLP-2 sobre a inflama-ção celular, íleo inflamatório pós-operatório foi induzido em camundongoscomo descrito no Exemplo 12. A histoquímica com mieloperoxidase foi reali-zada em tecidos coletados do intestino delgado médio dos camundongos 48h após a operação.
Resumidamente, segmentos do intestino delgado médio foramcoletados dos tubos de centrífuga descritos no Exemplo 12. Preparados demembrana da camada muscular foram preparadas por fixar o tecido estendi-do em uma placa de Petri coberta com Sylgard® e esticar o tecido para 2vezes seu comprimento e 1,5 vezes sua largura. A mucosa foi removida pordissecção precisa. Preparados de membrana da muscularis foram então fi-xados com etanol 100% por uma hora, lavados 3 vezes com PBS, e incuba-dos por 20 minutos em PBS contendo 0,1% de peróxido de hidrogênio e 1mg/mL de reagente de Hanker-Yates. Após uma segunda lavagem comPBS, os preparados de membrana foram montados sobre lâminas de vidro,cobertos com lamínula, e visualizados em um microscópio ótico. Leucócitoscontendo mieloperoxidase foram contados em 6 a 8 campos de visão óticosadjacentes a 200X e as contagens celulares médias foram calculadas e re-gistradas.
Preparados de membrana representativos da muscularis intesti-nal corados para atividade de mieloperoxidase (MPO) usando reagente deHanker-Yates são mostrados na Figura 6. Pontos pretos representam leucó-citos MPO-positivos infiltrando a camada muscular do intestino delgado.Poucas células MPO-positivas foram encontradas em tecido colhido de ca-mundongos naive. Um aumento acentuado no número de leucócitos infiltran-tes foi descoberto em camundongos tratados com PBS antes de seremsubmetidos a manipulação cirúrgica do intestino delgado. Tratamento comlgG2a não teve efeito sobre os números de células infiltrantes. Em contraste,o tratamento com mimeticorpo A2G-GLP-2 de murino reduziu significativa-mente o número de células infiltrantes. As contagens celulares estão compi-ladas na Figura 7 para comparação estatística.
A presente invenção agora estando completamente descrita,será claro para um versado na técnica que muitas alterações e modificaçõespodem ser feitas a ela sem desconsiderar o espírito ou escopo das reivindi-cações anexas.
Listagem de Seqüência
<110> CENTOCOR, INC.
<12o> Mimeticorpos, Polipeptídeos, Composições, Métodos e Usos de GLP-2
<130> CEN5115PCT<140> 11/552,408<141> 2006-10-24<150> 60/729704<151> 2005-10-24<150> 60/824160<151> 2006-08-31<150> 60/862487<151> 2006-10-23<160> 80
<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp<210> 2<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> variante GLP-2<400> 2
His Ser Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 3<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> variante GLP-2
<400> 3
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 4<211> 275<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Mimeticorpo<400> 4
His Ser Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Asp Thr Leu Met65 70 75 80
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln85 90 95
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val100 105 110His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile145 150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
195 200 205
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser260 265 270
Leu Gly Lys275
<210> 5<211> 276<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 5
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu260 265 270Ser Leu Gly Lys275
<210> 6<211> 43<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 6
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro35 40
<210> 7<211> 48<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 7
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro35 40 45
<210> 8<211> 53<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 8
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Cys Pro Pro Cys Pro
50<210> 9<211> 58<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 9
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 10<211> 63<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 10
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro
50 55 60
<210> 11<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 11
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 12<211> 831<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 12catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 3.60cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaatg a 831
<210> 13<211> 129<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 13
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atcctgccca 120ccatgcccg 129
<210> 14<211> 144<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 14catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggtggt 120ggcggcagtt gcccaccatg cccg 144
<210> 15<211> 159<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 15
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggcggt 120ggcggatctg gtggtggcgg cagttgccca ccatgcccg 159
<210> 16<211> 174<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 16
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggtgga 120ggaggctcag gcggtggcgg atctggtggt ggcggcagtt gcccaccatg cccg 174
<210> 17<211> 189<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 17
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggcgga 120ggaggttccg gtggaggagg ctcaggcggt ggcggatctg gtggtggcgg cagttgccca 180ccatgcccg 189
<210> 18<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 18
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgát tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120gccttagtcg ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 19<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Ligante<400> 1920 Gly Gly Gly Ser1
<210> 20<211> 6<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Ligante<400> 20
Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 21
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 22<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> variante V2<400> 22
Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser1 5
<210> 23
<211> 15<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 23
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15
<210> 24<211> 15<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 24
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 26<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 26
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 27<211> 5<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 27
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 28<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 28
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110
<210> 29
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val20 25 30Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110
<210> 32<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 32
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105
<210> 33<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 33
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly65 70 75 8053
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys100 105
<210> 34<211> 4<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 34
Cys Pro Ser Cys1
<210> 35<211> 553<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 35
Met Lys Leu Gly Ser Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Pro Gly Val His Glu Leu Pro Met Gly Ile Pro Ala Pro Trp20 25 30
Gly Thr Ser Pro Leu Ser Phe His Arg Lys Cys Ser Leu Trp Ala Pro
35 40 45
Gly Arg Pro Phe Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Ser Ile Lys Gln Val50 55 60
Thr Gly Ser Leu Leu Glu Glu Thr Thr Arg Lys Trp Ala Gln Tyr Lys65 70 75 80
Gln Ala Cys Leu Arg Asp Leu Leu Lys Glu Pro Ser Gly Ile Phe Cys
85 90 95
Asn Gly Thr Phe Asp Gln Tyr Val Cys Trp Pro His Ser Ser Pro Gly
100 105 110
Asn Val Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Trp Ser Glu Glu115 120 125Ser Ser Gly Arg Ala Tyr Arg His Cys Leu Ala Gln Gly Thr Trp Gln
130 135 140
Thr Ile Glu Asn Ala Thr Asp Ile Trp Gln Asp Asp Ser Glu Cys Ser145 150 155 160
Glu Asn His Ser Phe Lys Gln Asn Val Asp Arg Tyr Ala Leu Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Gln Leu Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Phe Ser Leu Ile Ser
180 185 190
Leu Phe Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Phe Leu Arg Lys Leu His Cys
195 200 205
Thr Arg Asn Tyr Ile His Met Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Leu Ala Val Leu Val Lys Asp Val Val Phe Tyr Asn Ser Tyr Ser225 230 235 240
Lys Arg Pro Asp Asn Glu Asn Gly Trp Met Ser Tyr Leu Ser Glu Met
245 250 255
Ser Thr Ser Cys Arg Ser Val Gln Val Leu Leu His Tyr Phe Val Gly
260 265 270
Ala Asn Tyr Leu Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Thr Leu
275 280 285
Leu Glu Pro Thr Val Leu Pro Glu Arg Arg Leu Trp Pro Arg Tyr Leu
290 295 300
Leu Leu Gly Trp Ala Phe Pro Val Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Phe305 310 315 320
Ala Arg Ala His Leu Glu Asn Thr Gly Cys Trp Thr Thr Asn Gly Asn
325 330 335
Lys Lys Ile Trp Trp Ile Ile Arg Gly Pro Met Met Leu Cys Val Thr
340 345 350
Val Asn Phe Phe Ile Phe Leu Lys Ile Leu Lys Leu Leu Ile Ser Lys
355 360 365
Leu Lys Ala His Gln Met Cys Phe Arg Asp Tyr Lys Tyr Arg Leu Ala370 375 380Lys Ser Thr Leu Val Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Ile Leu385 390 395 400
Phe Ser Phe Ile Thr Asp Asp Gln Val Glu Gly Phe Ala Lys Leu Ile
405 410 415
Arg Leu Phe Ile Gln Leu Thr Leu Ser Ser Phe His Gly Phe Leu Val
420 425 430
Ala Leu Gln Tyr Gly Phe Ala Asn Gly Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg
435 440 445
Lys Tyr Trp Val Arg Phe Leu Leu Ala Arg His Ser Gly Cys Arg Ala
450 455 460
Cys Val Leu Gly Lys Asp Phe Arg Phe Leu Gly Lys Cys Pro Lys Lys465 470 475 480
Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ala Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Pro Ser
485 490 495
Leu Asn Ser Gly Arg Leu Leu His Leu Ala Met Arg Gly Leu Gly Glu
500 505 510
Leu Gly Ala Gln Pro Gln Gln Asp His Ala Arg Trp Pro Arg Gly Ser
515 520 525
Ser Leu Ser Glu Cys Ser Glu Gly Asp Val Thr Met Ala Asn Thr Met
530 535 540
Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ser Glu Ile545 550
<210> 36<211> 553<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP 2R<400> 36
Met Lys Leu Gly Ser Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Gly1 5 10 15Leu Leu Pro Gly Val His Glu Leu Pro Met Gly Ile Pro Ala Pro Trp
20 25 30
Gly Thr Ser Pro Leu Ser Phe His Arg Lys Cys Ser Leu Trp Ala Pro
35 40 45
Gly Arg Pro Phe Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Ser Ile Lys Gln Val
50 55 60
Thr Gly Ser Leu Leu Glu Glu Thr Thr Arg Lys Trp Ala Gln Tyr Lys65 70 75 80
Gln Ala Cys Leu Arg Asp Leu Leu Lys Glu Pro Ser Gly Ile Phe Cys
85 90 95
Asn Gly Thr Phe Asp Gln Tyr Val Cys Trp Pro His Ser Ser Pro Gly
100 105 110
Asn Val Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Trp Ser Glu Glu
115 120 125
Ser Ser Gly Arg Ala Tyr Arg His Cys Leu Ala Gln Gly Thr Trp Gln
130 135 140
Thr Ile Glu Asn Ala Thr Asp Ile Trp Gln Asp Asp Ser Glu Cys Ser145 150 155 160
Glu Asn His Ser Phe Lys Gln Asn Val Asp Arg Tyr Ala Leu Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Gln Leu Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Phe Ser Leu Ile Ser
180 185 190
Leu Phe Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Phe Leu Arg Lys Leu His Cys
195 200 205
Thr Arg Asn Tyr Ile His Met Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Leu Ala Val Leu Val Lys Asp Val Val Phe Tyr Asn Ser Tyr Ser225 230 235 240
Lys Arg Pro Asp Asn Glu Asn Gly Trp Met Ser Tyr Leu Ser Glu Met
245 250 255
Ser Thr Ser Cys Arg Ser Val Gln Val Leu Leu His Tyr Phe Val Gly260 265 270Ala Asn Tyr Leu Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Thr Leu
275 280 285
Leu Glu Pro Thr Val Leu Pro Glu Arg Arg Leu Trp Pro Arg Tyr Leu
290 295 300
Leu Leu Gly Trp Ala Phe Pro Val Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Phe305 310 315 320
Ala Arg Ala His Leu Glu Asn Thr Gly Cys Trp Thr Thr Asn Gly Asn
325 330 335
Lys Lys Ile Trp Trp Ile Ile Arg Gly Pro Met Met Leu Cys Val Thr
340 345 350
Val Asn Phe Phe Ile Phe Leu Lys Ile Leu Lys Leu Leu Ile Ser Lys
355 360 365
Leu Lys Ala His Gln Met Cys Phe Arg Asp Tyr Lys Tyr Arg Leu Ala
370 375 380
Lys Ser Thr Leu Val Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Ile Leu385 390 395 400
Phe Ser Phe Ile Thr Asp Asp Gln Val Glu Gly Phe Ala Lys Leu Ile
405 410 415
Arg Leu Phe Ile Gln Leu Thr Leu Ser Ser Phe His Gly Phe Leu Val
420 425 430
Ala Leu Gln Tyr Gly Phe Ala Asn Gly Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg
435 440 445
Lys Tyr Trp Val Arg Phe Leu Leu Ala Arg His Ser Gly Cys Arg Ala
450 455 460
Cys Val Leu Gly Lys Asp Phe Arg Phe Leu Gly Lys Cys Pro Lys Lys465 470 475 480
Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ala Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Pro Ser
485 490 495
Leu Asn Ser Gly Arg Leu Leu His Leu Ala Met Arg Gly Leu Ala Asp
500 505 510
Val Gly Ala Gln Pro Gln Gln Asp His Ala Arg Trp Pro Arg Gly Ser515 520 525Ser Leu Ser Glu Cys Ser Glu Gly Asp Val Thr Met Ala Asn Thr Met
530 535 540
Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ser Glu Ile545 550
<210> 37<211> 59<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador<400> 37
ccaaagtata caggcgcata gcgatggttc tttctctgat gagatgaaca ccattcttg 59<210> 38<211> 65<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador<400> 38
ttggtctgaa tcaaccagtt tataaagtct cgagcggcaa gattatcaag aatggtgttc 60atctc 65
<210> 39<211> 27<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador<400> 39
tttgcggccg cccaaagtat acaggcg 27
<210> 40
<211> 37<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador<400> 40
aaaggatccg tcagtgattt tggtctgaat caaccag<210> 41<211> 59<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador<400> 41
ccaaagtata caggcgcatg gcgatggttc tttctctgat gagatgaaca ccattcttg<210> 42<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 42
His Gly Asp Gly Ser
1 5
Leu Ala Ala Arg Asp20
Asp Gly Ser Gly Gly35
Ser Lys Tyr Gly Pro50
<210> 43<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
10 15
Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
25 30
Gly Ser Gly Ala Leu Val Pro Val Ser Ser Glu
40 45
Pro Cys Pro Pro Cys Pro55<220>
<223> Mimeticorpo<400> 43
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Pro Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 44<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 44
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Pro Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 45<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 45
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Pro Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 46<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 46
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120gccttagtcc ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 47<211> 176<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 47
atggcgatgg ttctttctct gatgagatga acaccattct tgataatctt gccgctcgag 60actttataaa ctggttgatt cagaccaaaa tcactgacgg atccggtgga ggctccggtg 120ccttagtcgc cgtcccctca gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccg 176
<210> 48<211> 177<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 48
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120gccttagtcg ccgtctcccc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 49<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 49
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120gccttagtcg ccgtctcctc agagtccaaa cctggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 50<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 50
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 51<211> 33<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 51
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 52<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 52
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Tyr Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Variante GLP-2
<400> 53
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30Asp
<210> 54<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 54
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 55<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 55
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 56<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 56His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 57<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Variante GLP-2<400> 57
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 .15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Lys Ile Thr20 25 30
Asp
<210> 58<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 58
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro50 55<210> 59
<211> 59
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Mimeticorpo
<400> 59
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15
Leu Alâ Ala Airg Asp Plie Xle Asn Tirp Leu Xle Gln Thr* Lys Xle Thx20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 60<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 60
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Tyr Leu Asp Asn1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 61<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 61
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 62<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 62
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 63<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 63
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 64<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 64
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 65<211> 59<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 65
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 66<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 66
catggcgatg gttctttctc tagtgacatg tcgaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gact5ttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 67<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 67
catggcgatg gttctttctc tagtgacgtc tcgaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 68<211> 177<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 68
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacacctatc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177
<210> 69<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 69
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggtct tgccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177
<210> 70<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 70
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatca ggccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177
<210> 71<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220><223> Mimeticorpo<400> 71
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggcca ggccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 72<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 72
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttatag cctggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 73<211> 177<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Mimeticorpo<400> 73
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60gactttataa actggttggt taagggcaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177<210> 74<211> 33<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo GLP-2 com mutação M10V, A2G<400> 74His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Val Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile20 25 30
Thr Asp
<210> 75
<211> 276
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência de aminoácido de mimeticorpo GLP-2 com mutação L17Q, A2G
<400> 75
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glú Glu Gln Phe Asn Ser Thr115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn130 135 140Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys275
<210> 76<211> 828<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência de aminoácido de mimeticorpo GLP-2 com mutação L17Q, A2G<400> 76
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatca ggccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaa 828
<210> 77<211> 276<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência de aminoácido de mimeticorpo GLP-2 com mutação L17Q, N16G,<400> 77
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140Ser
<210> 78<211> 828<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência de aminoácido de mimeticorpo GLP-2 com mutação L17Q, N16G, A2G
<400> 78
catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggcca ggccgctcga 60gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240atgatctccc qcracccctqa ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Leu Gly Lys275gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaa 828
<210> 79<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência de aminoácido de mimeticorpo GLP-I<400> 79
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30
<210> 80<211> 280<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo A2G-GLP2 humano em esqueleto IgG2a murino<400> 1
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Glu35 40 45Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
50 55 60
Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
65 70 75 80
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
85 90 95
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
100 105 110
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
115 120 125
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
130 135 140
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
145 150 155 160
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
165 170 175
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
180 185 190
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
195 200 205
Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr
210 215 220
Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
225 230 235 240
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
245 250 255
Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
260 265 270
Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
275 280

Claims (31)

1. Mimeticorpo de acordo com a fórmula (II):(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(II)em que GLP2RAg é um agonista de GLP-2R de mamífero, Lk é uma ligaçãode polipeptídeo ou química, V2 é uma porção de uma terminação-C de umaregião variável de imunoglobulina, Hg é pelo menos uma porção de uma re-gião de dobradiça variável de imunoglobulina, Ch2 é uma região constanteCh2 de cadeia pesada de imunoglobulina e Ch3 é uma região constante CH3de cadeia pesada de imunoglobulina e t é independentemente um númerointeiro de 1 a 10.
2. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 1, em queGLP2RAg tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9: 2, 3, 50, 51, 52,- 53, 54, 55, 56, 57, ou 74.
3. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que Hg,Ch2 e Ch3 são da subclasse IgGI.
4. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 3, em que Cys220de Hg é substituída por Ala, e Leu234 e Leu235 de Ch2 são mutadas paraAla234 e Ala235.
5. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que Hg é dasubclasse lgG4, e CH2 e CH3 são da subclasse IgGI.
6. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que Hg,Ch2 e Ch3 são da subclasse lgG4.
7. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 6, em que Ser228de Hg é substituída por Pro e Phe234 e Leu235 de Ch2 são mutadas paraAla234 e Ala235.
8. Mimeticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o mi-meticorpo se liga ao receptor de GLP-2.
9. Mimeticorpo que compreende um polipeptídeo que tem a se-qüência mostrada em SEQ ID NQ: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58,-59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75, ou 77.
10. Polinucleotídeo que codifica um mimeticorpo de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo que tema seqüência mostrada em SEQ ID N9: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 46, 47, 48,-49, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, ou 78 ou uma seqüência complementar.
12. Polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo que co-difica a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID Ns: 4. 5, 6. 7. 8, 9,-10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75, ou 77.
13. Vetor que compreende o polinucleotídeo como definido nareivindicação 11 ou 12.
14. Linhagem celular que expressa um mimeticorpo como defini-do em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
15. Linhagem celular que compreende o vetor como definido nareivindicação 13.
16. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 15, em quea linhagem celular são células HEK293, NSO, SP2/0 ou CHO.
17. Método para produzir um polipeptídeo que compreende asetapas de cultivar a linhagem celular como definida na reivindicação 16, epurificar o polipeptídeo expresso.
18. Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeeficaz de pelo menos um mimeticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
19. Método de modificar a atividade biológica de GLP-2 em ummamífero que compreende administrar a composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 18, ao mamífero.
20. Método de reduzir os sintomas de, ou tratar pelo menos umacondição ou distúrbio relacionado com GLP-2, que compreende administrara composição farmacêutica como definida na reivindicação 18, a um pacien-te que necessita disso.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a condi-ção ou distúrbio relacionado a GLP-2 é um distúrbio gastrointestinal, um dis-túrbio relacionado aos ossos, ou um distúrbio relacionado a nutrientes.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o distúr-bio gastrointestinal é síndrome do intestino curto, doença intestinal inflamató-ria, doença de Crohn, colite, pancreatite, ileíte, mucosite, ou atrofia intestinal.
23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o distúr-bio gastrointestinal é um distúrbio gastrointestinal pediátrico.
24. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o distúr-bio relacionado aos ossos é osteoporose.
25. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o distúr-bio relacionado a nutrientes é obesidade.
26. Método de prevenir, reduzir os sintomas de, ou tratar íleoinflamatório, que compreende administrar uma composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 18, a um paciente que necessita disso.
27. Polipeptídeo que compreende um polipeptídeo que tem aseqüência mostrada em SEQ ID N9: 52, 54, 55, ou 74.
28. Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeeficaz de polipeptídeo como definido na reivindicação 27, e um veículo oudiluente farmaceuticamente aceitável.
29. Método de modificar a atividade biológica de GLP-2 em ummamífero que compreende administrar a composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 28, ao mamífero.
30. Método de reduzir os sintomas de, ou tratar pelo menos umacondição ou distúrbio relacionado a GLP-2, que compreende administrar acomposição farmacêutica como definida na reivindicação 28, a um pacienteque necessita disso.
31. Método de prevenir, reduzir os sintomas de, ou tratar íleoinflamatório, que compreende administrar a composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 28, a um paciente que necessita disso.
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