CN101331224A

CN101331224A - Glp-2模拟体、多肽、组合物、方法和用途

Info

Publication number: CN101331224A
Application number: CNA2006800476647A
Authority: CN
Inventors: A·E·巴克; B·A·穆尔; T·尼斯波尔; K·奥内尔; J·M·帕尔默; K·皮查; S·萨古
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2005-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2008-12-24
Also published as: ZA200804502B

Abstract

公开了哺乳动物GLP－2模拟体、多肽和核酸。还公开了使用所述模拟体和多肽治疗GLP－2相关疾病的方法。

Description

GLP-2模拟体、多肽、组合物、方法和用途

发明领域

本发明涉及哺乳动物GLP-2多肽和模拟体，以及它们作为治疗剂的用途。

发明背景

胰高血糖素样肽2(GLP-2)是经胰高血糖素原的翻译后加工产生的33个氨基酸的促肠肽激素(Orskov等，FEBS Lett.247：193-196(1989)；Hartmann等，Peptides 21：73-80(2000))。在哺乳动物中，由于激素原转化酶在肠内分泌细胞中的细胞特异性表达，GLP-2由肠和脑中的胰高血糖素原释放，但不由胰腺中的胰高血糖素原释放(Dhanvantari等，Mol.Endocrinol.10：342-355(1996)；Rothenberg等，Mol.Endocrinol.10：334-341(1996)；Damholt等，Endocrinology140：4800-4808(1999)；Holst，Trends Endocrinol Metab.10：229-235(1999))。使用高效液相层析和位点特异性GLP-2抗血清的组合分析大鼠和人血浆揭示，存在两种主要的循环分子形式GLP-2^1-33和GLP-2^3-33(Hartmann等，出处同上；Brubaker等，Endocrinol.138：4837-4843(1997)；Hartmann等，J.Clin.Endocrinol.Metab.85：2884-2888(2000))。GLP-2^1-33在体内被蛋白酶二肽基肽酶IV(DPP IV)切割，二肽基肽酶IV去除前两个残基组氨酸和丙氨酸(HA)。产生的肽GLP-2^3-33基本上无活性。

GLP-2调节胃动力、胃酸分泌、肠己糖运输，并增加肠上皮的屏障功能(综述于Drucker，J.Clin.Endocr.Metab.86：1759-1764(2001))。其通过刺激隐窝细胞增殖以及抑制肠细胞和隐窝区凋亡显著增加粘膜上皮的表面积。(Drucker等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：7911-7916(1996))。GLP-2降低小肠炎和大肠炎的死亡率，减少粘膜损伤、细胞因子表达和细菌败血症(Boushey等，Am.J.Physiol.277：E937-E947(1999)；Prasad等，J.Pediatr.Surg.35：357-359(2000))。GLP-2还增强患有短肠综合征(SBS)的啮齿动物或人的营养吸收和肠适应(Jeppesen等，Gastroenterology 120：806-815(2001))。

GLP-2的作用由GLP-2受体(GLP-2R)转导，GLP-2受体是在胃、小肠、结肠的肠内分泌细胞以及肠神经元和内皮下肌成纤维细胞中表达的G蛋白偶联受体(Munroe等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.96：1569-1573(1999)；Yusta等，Gastroenterology 119：744-755(2000)；Bjerknes等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：12497-12502(2001)；Orskov等，Regul.Pept.124：105-112(2005))。在表达GLP-2受体的转染幼年仓鼠肾成纤维细胞(BHK-GLP-2R细胞)中直接活化GLP-2R信号转导赋予对环己酰亚胺诱导的凋亡的抗性(Yusta等，J.Biol.Chem.275：35345-35352(2000))。

GLP-2的细胞保护、修复和能量保留特性提示，GLP-2潜在地可用于治疗特征在于肠粘膜上皮的损伤和/或功能异常的人类疾病。肠上皮损伤可见于包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的炎性肠病(IBD)患者，以及可见于与肠中的炎性反应有关的自身免疫病(例如乳糜泻)患者(综述于Hanauer，New England J.Med.334：841-848(1996))。另外，某些化疗药物引起肠上皮的损伤，产生剂量限制性的毒性副作用(Oster，Oncology 13：41(1999))。还报告急性胰腺炎时的肠渗透性增加(Kouris等，Am.J.Surg.181：571-575(2001))，其可能通过允许大分子进入内皮下区室而促发食物变态反应(Troncone等，Allergy 49：142-146(1994))。

作为营养吸收中的重要调节激素，GLP-2还有希望治疗短肠综合征(SBS)患者(Drucker等，出处同上；Rubin，Gastroenterol.117：261-263(1999)；Nightingale，Gut 45：478-479(1999))。SBS被定义为由显著长度的小肠的形态或功能损失引起的吸收障碍(综述于Jeppesen，J.Nutr.133：3721-3724(2003))。短肠综合征的病因在成人和儿童之间不同：在成人中，其最经常是针对克罗恩氏病或肠系膜梗阻的手术之后的结果；而在婴儿中，病因更通常包括坏死性小肠结肠炎、腹裂、闭锁和肠扭转(Platell等，World J.Gastroenterol.8：13-20(2002))。

替度鲁肽(Teduglutide)为DPP-IV抗性的GLP-2肽类似物(其中丙氨酸-2被甘氨酸取代(A2G))，正被开发用于胃肠(GI)疾病的潜在治疗，所述疾病包括SBS、克罗恩氏病和儿科GI疾病。替度鲁肽还具有治疗与癌症化疗相关的粘膜炎和IBD的潜力。然而，由于替度鲁肽的分子量低，所以该肽因半衰期不足30分钟而被快速清除。因此，需要每日给药来保持治疗剂水平(Shin等，Curr.Opin.Endocrin.Diabetes12：63-71(2005))。因此，需要修饰的GLP-2，其将克服短半衰期，同时保持其功能，并保证易于开发和制造。

炎性肠梗阻为侵入性手术或外伤性损伤之后的协调胃肠动力的短暂损伤，仍是临床上的大问题，延长住院期，并经常在康复期当中促发药物并发症(Holte和Kehlet，Br.J.Surg.87：1480-1493(2000))。肠梗阻的特征在于延迟的胃排空、小肠和结肠的扩张、腹胀、失去正常推进收缩模式和不能排空气体或粪便，导致患者不适延长(腹胀、恶心、呕吐)。

在诸如老年人或心肺损伤患者的易感个体中，肠梗阻可产生更严重的并发症，包括急性胃扩张、心律失常、呼吸窘迫、吸入性肺炎和不能手术吻合。在严重情况下，长期失去GI道的正常“看家(housekeeping)”收缩活性可促发细菌过度生长和肠屏障功能的破坏，之后细菌移位，并进入系统循环(Anup和Balasubramanian，J.Surg.Res.92：291-300(2000))。这又可导致内毒素血症、败血症、多器官衰竭，并最终导致老年患者最易感的结果一死亡。即便在没有并发症时，正常肠功能的恢复也是患者出院的主要限制因素，炎性肠梗阻增加住院期达3-5天。因此，死亡率增加和住院期延长增加的成本可能是显著的。

促使肠梗阻发展和维持的因素包括将去甲肾上腺素释放到肠壁中的中枢交感抑制反射的活化、抑制性体液物质、麻醉剂和止痛剂以及炎性介导物(Livingston和Passaro，Dig.Dis.Sci.35：121-132(1990)；Bauer等，Curr.Opin.Crit.Care 8：152-157(2002))。啮齿动物研究的结果提示，GI道壁中的炎症在发作和维持肠梗阻方面起核心作用。

使用手术后肠梗阻的啮齿动物模型的研究表明，外肌层为高度免疫活性区室。一般定居于外肌层中的是大量普通白细胞(Mikkelsen，Histol.Histopathol.10：719-736(1995)；Kalff等，Ann.Surg.228：652-663(1998))。其中最丰富的是定居的巨噬细胞，其形成了由食道至结肠的广泛细胞网络，随时保护胃肠道免遭潜在的损伤和疾病。在腹部手术当中的肠失调活化该巨噬细胞网络，启动局部分子炎性反应。活化的巨噬细胞释放促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNFα)和趋化因子(MCP-1)，它们抑制肌层中的神经肌肉联系，诱导血管内皮上的粘附分子(ICAM-1、P-选择素)表达(Kalff等，J.Leukoc.Biol.63：683-691(1998)；Josephs等，J.Surg.Res.86：50-54(1999)；Kalff等，Gastroenterology117：378-387(1999)；Kalff等，Gastroenterology 118：316-327(2000)；Wehner等，Surgery 137：436-46(2005))。这又产生以由系统循环募集白细胞(单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、肥大细胞)为特征的细胞炎性反应，其中在炎性细胞浸润程度和肠梗阻严重性之间存在正相关(Kalff等，Surgery 126：498-509(1999))。浸润白细胞释放额外的细胞因子以及前列腺素、一氧化氮、蛋白酶和活性氧物质，它们进一步促发神经肌肉功能障碍(von Ritter等，Gastroenterology 97：605-609(1989)；Bielefeldt和Conklin，Dig.Dis.Sci.42：878-884(1997))。

迄今为止，在临床中几乎没有可用于治疗炎性肠梗阻的选择。业已表明，诸如西沙比利和新斯的明的促动力药改善手术后肠动力(Shibata和Toyoda，Surg.Today 28：787-791(1998))。然而，结果前后矛盾，且这些药物的心血管副作用风险增加，这些心血管副作用就严重性和患者易感性而言已被证实难以预测。已在动物研究中表明COX-2抑制剂起抗手术后小肠蠕动异常的保护作用(Schwarz等，Gastroenterology 121：1354-1371(2001))，但对结肠蠕动异常几乎没有作用(Turler等，Anal.Surg.，231(1)：56-66(2002))。完成了对比塞来昔布和罗非昔布的人体I期临床试验(Bouras等，Neurogastroenterol.Motil.16：729-735(2004))，未发现哪一种药物改善手术后动力性。

业已提议将手术后快速恢复进食作为刺激正常激素调节的肠动力模式的方法。发现该方法加速肠功能的恢复，而且用作肠恢复多样模式方法的一部分时改善一部分患者的舒适性(Holte & Kehlet，Minerva.Anestesiol.，68(4)：152-156(2002))。但是，该治疗不会导致住院期长度显著下降。而且，对激素模式的足够刺激需要许多患者不能耐受的热载量阈值。

其中一种有助于延长的肠梗阻发展的最常见因素是给予鸦片类镇痛剂，用于减轻手术后疼痛。鸦片类物质通过与大脑的疼痛处理中心中的神经元上存在的3种受体亚型中的一种或多种相互作用发挥它们的镇痛作用。最新的鸦片类镇痛剂如吗啡主要通过活化μ和δ鸦片类受体起作用。但是，这些相同的受体还在控制肠动力性的胃肠道中的神经元上表达。无论存在还是不存在炎性肠梗阻，受体的活化都显著抑制胃肠收缩功能，引起肠淤积和便秘。Adalor Corporation已使用爱维莫潘进行了I期和II期临床试验，爱维莫潘是外围限制性和选择性的μ-OR拮抗剂，不穿过血脑屏障。当连同鸦片类镇痛剂联合给予时，爱维莫潘阻止鸦片类镇痛剂诱导的肠动力性抑制(Gonenne等，Clin.Gastroenterol.Hepatol.3：784-791(2005))。在与安慰剂相比时，发现爱维莫潘加速肠功能恢复，在进行腹部手术后经历轻微至中等手术后肠梗阻的患者缩短了住院期(Viscusi等，Surg.Endosc.20：64-70(2006))。爱维莫潘对炎症没有影响。

迄今为止，没有可用于治疗炎性肠梗阻的安全且可靠的治疗选择。目前可用的最有效的治疗法实际上是辅助性的，或者改善鸦片类镇痛法的复合效应。它们没有解决作为肠梗阻基础病因的炎症。因此，仍然存在明显未被满足的医疗需求。

附图简述

图1表明，GLP-2模拟体Pro取代变体(SED ID NO：43和44)与U937细胞裂解物温育后的SDS-PAGE凝胶图像。

图2表明，用A2G GLP-2模拟体治疗小鼠的粘膜刮屑的湿重剂量依赖性增加。

图3表明，在A2G-GLP-2肽治疗小鼠中肠转运显著加速。统计学显著性通过非配对Student T检验确定。

图4表明，在A2G GLP-2模拟体治疗小鼠中肠转运显著加速。统计学显著性通过非配对Student T检验确定。

图5表明，在鼠A2G GLP-2模拟体治疗小鼠中与手术后炎性肠梗阻相关的胃肠转运延迟显著衰减。统计学显著性通过ANOVA后接Bonferroni事后检验确定。

图6显示了在腹部手术后具有含增加数量的髓过氧物酶(MPO)的白细胞的肠肌层整封标本。用鼠A2G GLP-2模拟体治疗显著降低浸润细胞的数目，而IgG2a没有作用。

图7显示了采用已编辑的图6细胞计数的直方图。统计学显著性通过ANOVA后接Bonferroni事后检验确定。

发明概述

本发明的一个方面是具有通式(II)的模拟体：

(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)_(t)

(II)

其中GLP2RAg为哺乳动物GLP-2R激动剂，Lk为多肽或化学键，V2为免疫球蛋白可变区C末端的一部分，Hg为免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，C_H2为免疫球蛋白重链C_H2恒定区，C_H3为免疫球蛋白重链C_H3恒定区，t独立地为1-10的整数。

本发明的另一方面是模拟体，其包含具有示于SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的序列的多肽。

本发明的另一方面是多核苷酸，其包含具有示于SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18、46、47、48、49、66、67、68、69、70、71、72、73、76或78的序列或互补序列的多核苷酸。

本发明的另一方面是多核苷酸，其包含编码示于SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的氨基酸序列的多核苷酸。

本发明的另一方面是多肽，其包含具有示于SEQ ID NO：52、54、55或74的序列的多肽。

本发明的另一方面是多核苷酸，其包含编码示于SEQ ID NO：52、54、55或74的氨基酸序列的多核苷酸。

本发明的另一方面是减轻疾病症状或治疗疾病的方法，所述疾病的特征在于肠粘膜上皮的损伤和/或功能障碍，所述方法包括给予其需要的患者GLP-2多肽组合物或GLP-2模拟体组合物。

本发明的另一方面是预防炎性肠梗阻、减轻炎性肠梗阻症状或治疗炎性肠梗阻的方法，其包括给予其需要的患者GLP-2多肽组合物或GLP-2模拟体组合物。

发明详述

在本说明书中提及的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都如同完整陈述一样在此引入作为参考。单字母氨基酸密码如本领域技术人员所理解的一样在本文使用。免疫球蛋白恒定区中的氨基酸残基编号基于为野生型IgG1或IgG4 Fc结构域中的N末端氨基酸的残基编号。

本发明提供具有哺乳动物GLP-2特性和活性的蛋白构建体。本发明的一个实施方案是模拟不同类型的免疫球蛋白分子(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)及其任何亚类(例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或其组合的蛋白构建体，在后文称为“GLP-2模拟体”或仅称为“模拟体”。本发明的另一个实施方案是为GLP-2变体的多肽，其中所述多肽具有野生型分子的特性和活性。本发明还提供编码GLP-2模拟体、多肽的核酸、包含这些核酸的载体、宿主细胞、制备和使用GLP-2模拟体和多肽的组合物和方法。

GLP-2模拟体、多肽和组合物

一般地讲，本发明涉及具有通式(I)的模拟体多肽：

(Pep-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)_(t)

(I)

其中Pep为具有需要的生物特性的多肽，Lk为多肽或化学键，V2为免疫球蛋白可变区C末端的一部分，Hg为免疫球蛋白铰链区的至少一部分，C_H2为免疫球蛋白重链C_H2恒定区，C_H3为免疫球蛋白重链C_H3恒定区，t独立地为1-10的整数。

更具体地说，本发明涉及能够在结合时活化GLP-2R的GLP-2模拟体多肽。所述多肽具有通式(II)：

(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)_(t)

(II)

其中GLP2RAg为哺乳动物GLP-2R激动剂，Lk为多肽或化学键，V2为免疫球蛋白可变区C末端的一部分，Hg为免疫球蛋白铰链区的至少一部分，C_H2为免疫球蛋白重链C_H2恒定区，C_H3为免疫球蛋白重链C_H3恒定区，t独立地为1-10的整数。

本文使用的“GLP-2R激动剂”包括在结合GLP-2R时活化GLP-2R的任何分子。GLP-2R激动剂包括野生型哺乳动物GLP-2和GLP-2的肽类似物。代表性的野生型GLP-2肽具有示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列。已知天然GLP-2中的某些氨基酸残基可被其它氨基酸残基取代，类似物保持野生型GLP-2的GLP-2R结合特性。例如，野生型人GLP-2肽的Ala2可被Ser(A2S)或Gly(A2G)取代。获得的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2和3。

在本发明中，已开发了用作GLP-2R激动剂的野生型人GLP-2的新类似物。这些类似物的氨基酸序列示于以下所示的SEQ ID NO：50、51、52、53、54、55、56、57和74(针对野生型GLP-2命名的突变)。这些类似物可用作模拟体的GLP2RAg组分。

SEQID NO：	氨基酸序列	突变
SEQID NO：	氨基酸序列	突变	50	HGDGSFSSDMSTILDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、D8S、E9D、N11S
51	HGDGSFSSDVSTILDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、D8S、E9D、M10V、N11S	50	HGDGSFSSDMSTILDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、D8S、E9D、N11S
51	HGDGSFSSDVSTILDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、D8S、E9D、M10V、N11S	52	HGDGSFSDEMNTYLDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、I13Y
53	HGDGSFSDEMNTILDGLAARDFINWLIQTKITD	A2G、N16G	52	HGDGSFSDEMNTYLDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、I13Y
53	HGDGSFSDEMNTILDGLAARDFINWLIQTKITD	A2G、N16G	54	HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD	A2G、L17Q
55	HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD	A2G、N16G、L17Q	54	HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD	A2G、L17Q
55	HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD	A2G、N16G、L17Q	56	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFIAWLIQTKITD	A2G、N24A
57	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLVKGKITD	A2G、I27V、Q28K、T29G	56	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFIAWLIQTKITD	A2G、N24A
57	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLVKGKITD	A2G、I27V、Q28K、T29G	74	HGDGSFSDEVNTILDNLAARDFINWLIQTKITD	A2G、M10V

已观察到GLP-2肽可自缔合，造成了均一治疗候选物的开发和制造问题。参见美国专利申请公布号20040122210A1。如在以下的实施例中所述，具有示于SEQ ID NO：52、54、55和74的氨基酸序列的多肽被设计成于pH 7.5为单体，具有降低的螺旋倾向性。因此，这些人GLP-2肽类似物在模拟体构建体中或作为裸治疗肽时应特别有用。

在本发明的模拟体中，连接物部分(Lk)通过使模拟体具有可变的方向和结合特性而提供了结构灵活性。代表性的连接物包括非肽化学键或通过肽键连接的1-20个氨基酸，其中所述氨基酸选自20个天然氨基酸。连接物部分可包含大部分在结构上不受阻碍的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，包括GS、GGGS(SEQ ID NO：19)、GSGGGS(SEQ ID NO：20)及其聚合物或组合。在本发明范围内的其它代表性连接物可长于20个残基，并可以包括非甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的残基。

在本发明的模拟体中，V2是免疫球蛋白可变区(例如重链可变区)C末端结构域的一部分。代表性的V2氨基酸序列为GTLVTVSS(SEQID NO：21)。

业已表明，O-糖基化可在V2区的两个Tyr残基处发生，但糖基化程度高度依赖于宿主细胞系，并还有可能受到培养条件影响。O-聚糖可用于阻断聚集和蛋白水解，导致体内稳定性更大。然而，由于不均一性和较差的重现性，可能需要废除O-糖基化。因此，替代的代表性V2氨基酸序列为GALVAVSS(SEQ ID NO：22)。

在本发明的模拟体中，Hg为免疫球蛋白可变区(例如重链可变区)铰链结构域的一部分。代表性的Hg氨基酸序列包括EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：23)、EPKSADKTHTCPPCP(SEQID NO：24)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：25)、ESKYGPPCPPCP(SEQID NO：26)和CPPCP(SEQ ID NO：27)。

在本发明的模拟体中，C_H2为免疫球蛋白重链C_H2恒定区。代表性的C_H2氨基酸序列包括：

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：28)、

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：29)、

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：30)和

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：31)。

在本发明的模拟体中，C_H3为免疫球蛋白重链C_H3恒定区。代表性的C_H3氨基酸序列包括：

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：32)和

GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：33)。本领域技术人员会认识到，本发明模拟体的C_H3区在某些重组系统中表达时其C-末端氨基酸可被切除。

在本发明的模拟体中，免疫球蛋白分子的FcRn清道夫受体结合位点保留在C_H2和C_H3区的接合处。因为FcRn结合能够将被胞饮的免疫球蛋白返回到胞外间隙，所以预期GLP-2模拟体的半衰期相对于GLP-2肽将显著延长。

在本发明模拟体的一个实施方案中，单体结构(GLP2-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)可非共价地或通过共价键(例如但不限于Cys-Cys二硫键)连接至其它单体。

IgG1和IgG4亚类在铰链区中的半胱氨酸数目不同。和IgG1亚类一样，在IgG4铰链中有两个半胱氨酸参与重链之间的二硫键键合。但是，在IgG1铰链中一般涉及和轻链二硫键键合的半胱氨酸在IgG4铰链中不存在。因此，IgG4铰链不如IgG1铰链灵活。

另外，两种同种型介导补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力不同。CDC是存在补体时靶的裂解。补体活化途径因补体系统的第一个组分(C1q)与复合关连抗原的分子的结合而启动。IgG1是补体级联和随后的CDC活性的强诱导物，而IgG4几乎没有补体诱导活性。

ADCC是细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞裂解。IgG1亚类以高亲和性结合Fc受体，并有助于ADCC，而IgG4仅微弱结合。IgG4相对不能活化效应子功能是合乎需要的，因为有可能在没有细胞杀伤作用的情况下将模拟体传送至细胞。

而且，在IgG4和IgG1同种型中存在FcRn清道夫受体的结合位点，二者具有类似的结合特征。因此，预期本发明的IgG1和IgG4模拟体的药代动力学是类似的。

免疫球蛋白区的铰链-C_H2-C_H3部分(Hg-C_H2-C_H3)也可以被广泛修饰，以形成符合本发明的变体。例如，可去除提供模拟体分子不需要的结构特征或功能活性的一个或多个天然位点。这些位点例如可通过取代或缺失残基、向所述位点插入残基或截断含所述位点的部分而被去除。下文讨论了代表性的Hg-C_H2-C_H3变体。

1.涉及二硫键形成的位点可通过缺失或被本发明模拟体中的其它氨基酸取代而被去除。典型地，存在于这些基序中的半胱氨酸残基被去除或取代。这些位点的去除可避免与生产模拟体的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸的蛋白二硫键键合，或者避免基于IgG4的构建体中的重链内二硫键键合，同时仍允许非共价保持在一起的二聚化CH3-CH2-铰链结构域存在。

大部分IgG型抗体，例如IgG1，是由两个相同重(H)链和两个相同轻(L)链组成的同二聚化分子，通常缩写为H₂L₂。因此，这些分子就抗原结合而言一般是2价的，即IgG分子的两个抗原结合(Fab)臂具有相同的结合特异性。

IgG4同种型重链在它们能够形成重链间或重链内二硫键的铰链区中包含CPSC(SEQ ID NO：34)基序，即CPSC基序中的两个Cys残基可与其它H链中的对应Cys残基二硫键键合(之间)，或者给定CPSC基序中的两个Cys残基彼此可以二硫键键合(之内)。据信体内异构酶能够将IgG4分子的重链间键转变为重链内键，反之亦然(Aalberse和Schuurman，Immunology 105，9-19(2002))。因此，因为那些IgG4分子中的HL对与铰链区中的重链内键彼此不共价结合，所以它们可解离为HL单体，然后HL单体与来自其它IgG4分子的HL单体再结合，形成双特异性的异二聚化IgG4分子。在双特异性IgG抗体中，抗体分子的两个Fab的不同之处在于它们结合的表位。用Pro取代IgG4铰链区中的Ser228产生“IgG1样行为”，即所述分子在重链之间形成稳定的二硫键，因此对与其它IgG4分子的HL交换不敏感。

2.可修饰H-C_H2-C_H3，以产生与选定宿主细胞更匹配的本发明模拟体。例如，当本发明的模拟体在细菌细胞如大肠杆菌中重组表达时，铰链中的Pro-Ala序列可被去除，以防止大肠杆菌酶脯氨酸亚氨基肽酶消化。

3.一部分铰链区可缺失或被本发明模拟体中的其它氨基酸取代，以防止在选定宿主细胞中表达的产物中的不均一性。

4.本发明模拟体中的一个或多个糖基化位点可被去除。通常被糖基化的残基(例如Asn)可赋予模拟体Fc依赖性的细胞介导的细胞裂解活性。这样的残基可缺失或被不糖基化的残基如Ala取代。

5.在本发明的模拟体中参与和补体的相互作用的位点如C1q结合位点被去除。

6.在本发明模拟体中影响与非FcRn补救受体的Fc受体结合的位点可去除。例如，在本发明模拟体中涉及ADCC活性的Fc受体可被去除。例如，IgG1铰链区中Leu234/Leu235突变为L234A/L235A或IgG4铰链区中Phe234/Leu235突变为P234A/L235A使FcR结合最小化，减弱了免疫球蛋白介导补体依赖性细胞毒性和ADCC的能力。

本发明的一个实施方案是式(II)的GLP-2模拟体，其中Hg-C_H2-C_H3来自IgG4亚类，并含有Ser228Pro(S228P)取代和P234A/L235A突变。在GLP-2肽序列中具有这些突变以及A2S和A2G的代表性GLP-2模拟体的完整多肽序列分别示于SEQ ID NO：4和5。这些序列包含模拟体构建体的所有结构域，即GLP2RAg-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3结构域。预期这些模拟体构建体是均一且稳定的群，不触发FcR介导的效应子功能。本文所示的取代和突变是代表性的；在本发明范围内的Hg-C_H2-C_H3结构域可包括其它取代、突变和/或缺失。

基于A2G的、具有可变连接物长度的其它代表性的本发明GLP-2模拟体的部分多肽序列示于SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11。这些序列显示了除C_H2和C_H3结构域以外的所有结构域。本领域技术人员会理解，C_H2和C_H3结构域应包含在功能性模拟体中。

基于具有SEQ ID NO：50、51、52、53、54、55、56和57所示的氨基酸序列的GLP-2类似物的其它代表性的本发明GLP-2模拟体的部分多肽序列分别示于SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64和65。这些序列显示了除C_H2和C_H3结构域以外的所有结构域。本领域技术人员会理解，C_H2和C_H3结构域应包含在功能性模拟体中。

本发明包括能够在结合时活化GLP-2R的GLP-2模拟体。本发明的模拟体可以广泛范围的亲和力结合GLP-2R。GLP-2模拟体对GLP-2R的亲和力可使用任何合适的方法经试验确定，例如使用Biacore或KinExA设备的方法、ELISA和竞争性结合测定。

本发明的GLP-2模拟体和多肽可用于治疗以肠粘膜上皮炎症、损伤和/或功能障碍为特征的疾病或症状。由于GLP-2作为中枢饱感因子的作用，所以其在骨形成和保持以及中枢神经系统介导的疾病中的作用也是显著的。可使用本发明的GLP-2模拟体或多肽治疗的疾病或症状包括但不限于GI疾病，包括SBS、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠炎、胰腺炎、回肠炎、炎性肠梗阻(手术后的和其它病因的)、与癌症化疗和/或放疗相关的粘膜炎、由完全肠胃外营养或局部缺血引起的肠萎缩症、骨相关疾病如骨质疏松症、包括肥胖在内的营养相关疾病以及儿科GI疾病，包括在新生婴儿中由于坏死性小肠结肠炎引起的肠衰竭。本发明的GLP-2模拟体或多肽还可以用于预防炎性肠梗阻、减轻炎性肠梗阻的症状和治疗炎性肠梗阻。

因此，本发明的另一方面是包含至少一种本发明的GLP-2模拟体或多肽和本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。所述载体或稀释剂可为溶液剂、悬浮剂、乳浊剂、胶体或粉末。

本发明的GLP-2模拟体或多肽被配制为治疗或预防有效量的药物组合物。术语“有效量”一般指有效治疗必需的模拟体或多肽的量，有效治疗即寻求治疗的症状或疾病的部分或完全缓解。用于降低上述症状或疾病的发作可能性的预防性治疗包含在有效治疗的定义中。

所述组合物可任选地包含至少一种可用于治疗本文所讨论病症的其它化合物、蛋白或组合物。例如，可与谷胺酰胺或其它营养补充物组合使用的本发明模拟体或多肽涉及增加体重、帮助肠恢复或改善营养吸收。此外，还设想了与抗炎剂的组合。本文和权利要求中使用的术语“与......组合”是指所述药剂可在混合物中一起给予哺乳动物，或作为单个药剂同时给予哺乳动物，或作为单个药剂按照任何顺序序贯给予哺乳动物。

核酸、载体和细胞系

本发明的另一方面是分离的核酸分子，其包含编码本发明的至少一种GLP-2模拟体或多肽的多核苷酸、与所述多核苷酸互补或与所述多核苷酸具有显著同一性。本发明的其它方面包括含有编码本发明的至少一种GLP-2模拟体或多肽的核酸分子的重组载体以及能够表达所述核酸分子的细胞系和生物体。核酸、表达载体和细胞系一般可用于生产本发明的模拟体。

在一个实施方案中，本发明的核酸组合物编码的多肽具有与SEQID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、74、75和77中的任一个相同或基本同源的氨基酸序列。编码示于SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75和77的多肽序列的代表性核酸序列分别示于SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18、46、47、48、49、66、67、68、69、70、71、72、73、76和78。还提供了上述核酸的等位基因变体。

典型地，在用于制备本发明的GLP-2模拟体或多肽的表达载体中使用本发明的核酸。在本发明范围内的载体提供了真核生物表达必需的元件，包括病毒启动子驱动的载体，例如CMV启动子驱动的载体，例如pcDNA3.1、pCEP4以及它们的衍生物、杆状病毒表达载体、果蝇表达载体和由哺乳动物基因启动子驱动的表达载体，例如人Ig基因启动子。其它实例包括原核生物表达载体，例如T7启动子驱动的载体如pET41、乳糖启动子驱动的载体和阿拉伯糖基因启动子驱动的载体。

本发明还涉及表达本发明的GLP-2模拟体或多肽的细胞系。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。代表性的真核细胞为哺乳动物细胞，例如但不限于COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa细胞、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或其任何衍生物。最优选地，宿主细胞为HEK293、NS0、SP2/0或CHO细胞。本发明的细胞系可稳定表达至少一种GLP-2模拟体。所述细胞系可通过本领域众所周知的稳定或瞬时的转染方法产生。

本发明还提供表达至少一种GLP-2模拟体或多肽的方法，其包括在其中GLP-2模拟体或多肽以可检测的量或可回收的量表达的条件下培养细胞系。本发明还提供产生至少一种GLP-2模拟体或多肽的方法，包括在体外或原位条件下翻译编码GLP-2模拟体或多肽的核酸，使得GLP-2模拟体或多肽以可检测量或可回收量表达。本发明还包括通过以上方法生产的GLP-2模拟体或多肽。

GLP-2模拟体可通过众所周知的方法回收和纯化，包括但不限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。反向高效液相层析(RP-HPLC)也可以用于纯化。

或者，本发明的GLP-2衍生多肽可通过本领域技术人员众所周知的化学合成技术制备。通过重组或化学方法生产的本发明多肽可通过本领域众所周知的方法回收和纯化。

使用方法

GLP-2模拟体或多肽尤其可用作研究试剂和治疗剂。一方面，本发明涉及改变GLP-2生物活性的方法，包括向其需要的哺乳动物提供至少一种GLP-2模拟体或多肽。GLP-2模拟体或多肽可通过GLP-2R活化细胞信号转导级联。具体地说，GLP-2模拟体或多肽可用作GLP-2R的激动剂。术语“激动剂”在最广义上使用，包括能够直接或间接地、部分或完整地活化、增加或促进GLP-2R的一种或多种生物活性的分子。

本发明还提供减弱至少一种GLP-2相关病症或疾病的症状或治疗至少一种GLP-2相关病症或疾病的方法，包括给予其需要的患者治疗有效量的至少一种GLP-2模拟体或多肽药物组合物。适于使用本发明方法治疗的病症和疾病包括但不限于GI疾病，包括SBS、克罗恩氏病和儿科GI疾病、与癌症化疗相关的粘膜炎、IBD、炎性肠梗阻和上述的其它疾病和病症。

GLP-2优先与主要存在于肠神经系统的神经元和含有GLP-2的肠内分泌细胞上的GLP-2R相互作用(Guan等，Gastroenterology 130：150-164(2006))。GLP-2的其中一种主要功能是促进绒毛隐窝中的柱状细胞增殖，在绒毛隐窝中，GLP-2增强上皮细胞更新和粘膜伤口愈合(Bulut等，Regul.Pept.121：137-43(2004))，增强粘膜屏障功能(Benjamin等，Gut 47：112-119(2000))，并抑制细胞经由凋亡死亡(Brubaker和Drucker，Endocrinology 145：2653-2659(2004))。业已表明这些作用是神经依赖性的，因为GLP-2R在隐窝柱状上皮细胞中不表达(Bjerknes和Cheng，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：12497-12502(2001))。肠神经元上存在GLP-2R提示，GLP-2可改变动力性以及在肠炎症中起作用的神经-免疫相互作用。

因此，本发明还提供预防炎性肠梗阻、减轻炎性肠梗阻的症状或治疗炎性肠梗阻的方法，包括给予其需要的患者GLP-2多肽组合物或GLP-2模拟体组合物。本文使用的“炎性肠梗阻”可为胃肠道的任何部分的肠梗阻，例如胃、小肠和/或结肠。另外，“炎性肠梗阻”可由引起肠梗阻的任何因素引起，例如手术，包括腹部手术，例如移植手术或非移植手术的腹部手术；肠手术，例如肠切除；以及整形手术；外伤性损伤，例如跌倒、车祸、个人伤害或由外伤性损伤引起的任何后遗症，例如肢体骨折、肋骨骨折、脊骨骨折、胸部病变、局部缺血、腹膜后血肿；腹膜内炎症，例如腹腔感染、急性阑尾炎、胆囊炎、胰腺炎、输尿管绞痛、基础性肺炎；心肌梗塞；代谢紊乱；或任何其组合。

如上所述，GLP-2模拟体或多肽药物组合物包含有效量的至少一种GLP-2模拟体或多肽和药学上可接受的载体或稀释剂。针对给定治疗的有效量，无论是治疗性的还是预防性的，一般都取决于许多不同的因素，包括给药方法、目标部位和给予的其它药物。因此，治疗剂量需要逐步调整，以使安全性和有效性最佳。

本发明的方法任选地还可以包含连同用于治疗以上列出疾病的标准疗法的共给予或联合疗法。

给予的方式可为任何适宜的途径，以将药学上有效量的本发明GLP-2模拟体或多肽传递给宿主。例如，GLP-2模拟体或多肽可经胃肠外给予传送，例如皮下、肌内、皮内、静脉内或鼻内给予，或本领域已知的任何其它方法。

参考以下实施例进一步描述本发明。这些实施例仅阐述本发明的各个方面，无意限制本发明。

实施例1

GLP-2模拟体在哺乳动物细胞中的克隆、表达和纯化

编码A2S GLP-2的核酸序列以2步PCR扩增产生。第一轮扩增使用正向引物5′-CCAAAGTATACAGGCGCATAGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3′(SEQ ID NO：37)和反向引物5′-TTGGTCTGAATCAACCAGTTTATAAAGTCTCGAGCGGCAAGATTATCAAGAATGGTGTTCATCTC-3′(SEQ ID NO：38)进行。解链温度、退火温度和延伸温度分别设定为96℃、48℃和72℃。进行3轮反应。

对于第二轮扩增，正向引物包含NotI限制酶识别位点，反向引物包含BamHI位点。正向引物的序列为5′-TTTGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCG-3′(SEQ ID NO：39)，反向引物为5′-AAAGGATCCGTCAGTGATTTTGGTCTGAATCAACCAG-3′(SEQID NO：40)。解链温度、退火温度和延伸温度分别设定为96℃、48℃和60℃。进行30轮反应。

以相同的方法产生编码A2G GLP-2的核酸序列，只是在第一轮扩增中使用的正向引物为5′-CCAAAGTATACAGGCGCATGGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3′(SEQ ID NO：41)。

使用标准克隆方法，将扩增的PCR产物(A2S和A2G GLP-2)克隆入CMV启动子驱动的人IgG4 ΔCH1、Ser至Pro、Ala/Ala表达载体的NotI/BamHI位点中。

A2S和A2G GLP-2 IgG4模拟体在HEK 293E细胞中瞬时表达，并使用A蛋白亲和层析按照标准方法由条件培养基纯化。由A蛋白亲和柱洗脱的物质还经过大小排阻柱，用于进一步纯化。

纯化的A2S和A2G GLP-2模拟体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和偶合静态光散射分析(SEC-SLS)的大小排阻层析进行分析。在还原和非还原变性条件下纯化的模拟体在SDS-PAGE上的迁移在预期的范围内。通过SEC-SLS分析表明，具有约123KD分子量的蛋白质对应于模拟体的二聚体。因为GLP-2模拟体作为单体在SDS-PAGE凝胶上迁移，所以二聚化是经由非共价作用。

实施例2

cAMP表达测定

为了评价GLP-2模拟体的体外活性，开发了cAMP表达测定。为实现此目标，通过转染HEK 293E细胞产生表达突变的人GLP-2R的克隆细胞系。突变的人GLP-2R与野生型人GLP-2R(SEQ ID NO：35)的不同之处在于C末端胞内区中的3个氨基酸位置(SEQ ID NO：36)。GLP-2肽刺激该细胞系中的cAMP表达，刺激是特异性的，因为对照肽不刺激cAMP表达。

比较A2S和A2G IgG4GLP-2模拟体与对应的GLP-2肽(A2S和A2G)在重组细胞系中刺激cAMP表达的能力。简而言之，将细胞与个体GLP-2模拟体或GLP-2肽温育30分钟。cAMP表达使用cAMP DirectScreen System(目录号CSD 200，Applied Biosystems，Bedford，MA)定量。A2S和A2G肽的EC₅₀分别为0.5nM和0.8nM；A2S和A2G模拟体的EC₅₀分别为2.2nM和3.8nM。因此，在该测定中GLP-2模拟体的功效比所述肽低约4倍。

实施例3

GLP-2模拟体变体

为研究GLP-2模拟体上连接物长度的作用，产生具有多种连接物长度的不同构建体。核心区的序列示于以下的表1。

这些变体在HEK 293细胞中瞬时表达，通过SDS-PAGE纯化和分析。SEC-SLS分析表明，除了一个峰对应于模拟体的二聚体以外，具有65-70kDa的分子量的峰对应于模拟体的单体。观察到连接物长度越长，单体群的比例越高。

在实施例2描述的cAMP表达测定中测试连接物长度和V2区变体。数据证实，依据EC₅₀检测的GLP-2模拟体活性与连接物长度正相关，即具有较长连接物的模拟体具有较高活性(表1)。

表1.核心氨基酸序列和具有可变连接物长度的GLP-2模拟体的EC₅₀

SEQ IDNO：	氨基酸序列	EC₅₀(nM)
SEQ IDNO：	氨基酸序列	EC₅₀(nM)	5^*	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP	5.1
6	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKIT	40	5^*	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP	5.1

	DGGGGSCPPCP
	DGGGGSCPPCP		7	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSCPPCP	22.5
8	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP	12.7	7	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSCPPCP	22.5
8	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP	12.7	9	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP	4.6
10	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP	2.1	9	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP	4.6
10		2.1	11^**	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVAVSSESLYGPPCPPCP	3.1

^*表中仅显示了SEQ ID NO：5的氨基酸编号1-59。

^**SEQ ID NO：11显示了V2区变体。

为了增加GLP-2模拟体的稳定性，构建一系列变体，其中在V2或Hg区域中的蛋白酶剪切敏感位点处的氨基酸残基被Pro取代。GLP-2模拟体变体的核心区序列示于以下的表2。

表2.核心氨基酸序列和具有Pro取代的GLP-2模拟体的EC₅₀

SEQ IDNO：	氨基酸序列	EC₅₀(nM)
SEQ IDNO：	氨基酸序列	EC₅₀(nM)	42	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVPVSSESKYGPPCPPCP	3.6
43	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVAVPSESKYGPPCPPCP	4.8	42	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVPVSSESKYGPPCPPCP	3.6
43	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVAVPSESKYGPPCPPCP	4.8	44	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVAVSPESKYGPPCPPCP	7.7
45	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVAVSSESKPGPPCPPCP	5.8	44	HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGSGGGSGALVAVSPESKYGPPCPPCP	7.7

Pro取代变体在HEK 293细胞中瞬时表达，通过SDS-PAGE纯化和分析。cAMP表达测定的数据证实，依据EC₅₀检测的这些GLP-2模拟体变体的活性与A2G GLP-2模拟体(SEQ ID NO：5)的活性相当。

在CompleteMini蛋白酶抑制剂片(目录号1836153，RocheApplied Science，Indianapolis，IN)存在下，将纯化的Pro取代变体与U937细胞裂解物温育达0、12或24小时。此后，GLP-2模拟体变体使用A蛋白珠纯化，并在SDS-PAGE凝胶上解析。如图1所示，与A2G GLP-2模拟体(SEQ ID NO：5)相比，Pro取代变体(SEQ ID NO：43或44)在24小时的测试时间段内几乎没有降解。总之，Pro取代变体在体外更抗蛋白水解。

实施例4

GLP-2模拟体刺激小肠中的粘膜重量增加

为证实GLP-2模拟体的体内活性，用GLP-2模拟体注射CD1小鼠，评价小肠中的终点。简而言之，每日皮下注射给予雌性CD1小鼠A2G GLP-2肽(SEQ ID NO：3)、A2G GLP-2IgG4模拟体(SEQ ID NO：5)或对照模拟体，共计10天。此后，麻醉小鼠，取出小肠，用盐水冲洗，如下所述处理。

具体地说，收集4cm部分：(1)紧接幽门的远端(十二指肠)，(2)Treitz韧带的前2cm远端(空肠)，和(3)紧接盲肠的近端(回肠)。由Treitz韧带的约6cm远端至盲肠的4cm近端的剩余小肠用于制备粘膜刮屑。由剩余物的近和远末端去除等距离，直至留下15cm部分，剩余物被纵向切开，淋洗，并使用玻璃显微镜载玻片的短端去除粘膜层。检测完整肠段和粘膜的湿重。

由不同小鼠的空肠和回肠之间的15cm肠段获得的粘膜刮屑的重量示于图2。对于注射A2G GLP-2模拟体的小鼠，观察到粘膜湿重剂量依赖性增加。与对照模拟体相比，于0.8和8mg/kg(分别为0.26和2.6nmol)的增加是统计学显著的(分别为p＜0.0001和p＜0.0004)。

在注射2.5mg/kg(13.3nmol)A2G GLP-2肽的小鼠中也观察到统计学显著增加(p＜0.0001)。相比之下，A2G GLP-2模拟体以比A2GGLP-2肽低50倍的剂量(基于体积摩尔)在体内有效。

实施例5

GLP-2模拟体的药代动力学

为检测GLP-2模拟体的药代动力学，CD1小鼠静脉内或皮下给药3mg/kg的A2G GLP-2模拟体(SEQ ID NO：5)。于不同时间点将血液收集入含蛋白酶抑制剂的柠檬酸盐缓冲液中，以最小化离体降解的可能性，并通过离心分离血浆。

使用时间分辨荧光(TRF)测定检测活性模拟体。活性模拟体反映出所述肽的完整N末端仍连接至模拟体的Fc区。

基于TRF试验，在小鼠中计算的A2G GLP-2模拟体的半衰期为26.5小时。相比之下，在人中报告的GLP-2肽的半衰期为7.2±2分钟(Hartmann等，J.Clin.Endocrinol.Metab.85：2884-2888(2000))。因此，A2G GLP-2模拟体的半衰期比GLP-2肽的半衰期高200多倍。

在类似的试验中，静脉内给药猕猴1mg/kg的A2G GLP-2模拟体。基于TRF数据，在猕猴中计算的A2G GLP-2模拟体的半衰期为4.8天。

实施例6

GLP-2模拟体的药效动力学

基于GLP-2模拟体的延长的药代动力学，预期GLP-2模拟体具有较长的响应时程。为评价A2G GLP-2模拟体的药效动力学，每日一次、每隔一天一次、每周一次或仅在研究开始时一次给药小鼠。为控制动物处理，在小鼠不接受A2G GLP-2模拟体的日子给它们注射阴性对照模拟体，即没有GLP-2肽的模拟体免疫球蛋白骨架。A2G GLP-2模拟体和阴性对照的剂量对所有组别都是4mg/kg(1.3nmol/kg)。研究时程为11天，组织如在实施例4中所述处理。

与对照模拟体相比，每周一次给药A2G GLP-2模拟体的小鼠具有显著增加的粘膜重量。在每天一次或每隔一天一次给予A2G GLP-2模拟体时差异更显著。对小肠部分的湿重观察到类似的模式。对除单次给药试验之外的所有方案，在十二指肠和空肠中均观察到超过对照模拟体的显著重量增加。

实施例7

GLP-2中的突变防止肽二聚化

野生型GLP-2肽(SEQ ID NO：1)以高浓度二聚化。例如，在PBS(pH 7.5)中，GLP-2于0.4mg/mL作为单体存在，但是于2mg/mL为单体(约20％)和可逆地自缔合的二聚体(约80％)的混合物(未显示数据)。自缔合对开发和制造均一治疗剂提出了挑战。

设计保留野生型GLP-2生物活性并于高浓度作为单体存在的肽类似物(SEQ ID NO：52、54、55和74)。合成GLP-2(A2G、L17Q)(SEQID NO：54)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)(SEQ ID NO：55)，并纯化至＞95％纯度。在类似物表征中纳入肽GLP-2(SEQ ID NO：1)、GLP-2(A2G)(SEQ ID NO：3)和GLP-1(SEQ ID NO：79)作为对照。

肽的溶液分子量通过SEC-SLS检测。简而言之，0.4-2.0mg/mL的肽的PBS溶液(pH 7.5)经Superdex肽柱分级分离(AmershamPharmacia)。洗脱峰通过690nm的静态光散射监测，溶液分子量于UV 280nm使用Astra软件包(Wyatt Inc.)测定。

GLP-1在1mg/ml作为单峰洗脱，分子量在预期的单体大小之内。GLP-2和GLP-2(A2G)显示出类似的重叠二聚体和单体峰分布。类似物肽GLP-2(A2G、L17Q)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)作为单峰洗脱，分子量与主要的单体肽一致。

测试肽的二级结构使用0.2mg/mL肽的PBS溶液测定。简而言之，一式三份以1nm间隔于25℃在0.1cm光程池中收集CD光谱。二级结构通过使用CD光谱软件(CD Spectra Deconvolution软件2.1)拟合CD光谱确定。所有的测试肽都包含对应于存在的α螺旋的峰。但是，在类似物肽GLP-2(A2G、L17Q)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)中的螺旋含量为约17％，类似于GLP-1的螺旋含量，低于GLP-2和GLP-2(A2G)的螺旋含量(表3)。

表3.在GLP肽中螺旋和无规卷曲结构的百分率

结构	GLP-2	GLP-2(A2G)	GLP-2(A2G、L17Q)	GLP-2(A2G、N16G、L17Q)	GLP-1
结构	GLP-2	GLP-2(A2G)	GLP-2(A2G、L17Q)	GLP-2(A2G、N16G、L17Q)	GLP-1	螺旋	19.6％	20.7％	16.9％	17.0％	16.8％
无规卷曲	37.9％	37.1％	41.8％	41.4％	41.9％	螺旋	19.6％	20.7％	16.9％	17.0％	16.8％

另外，已知三氟乙醇(TFE)在肽中诱导螺旋形成(Soennichsen等，Biochemistry 31：8791(1992))。因此，使用TFE进行螺旋倾向性分析。简而言之，以含0％、1％、5％、15％、33％或50％TFE的PBS(pH 7.5)将测试肽稀释至0.2mg/mL。收集CD光谱，在数据平均、扣除缓冲液和曲线平滑后产生CD作图。螺旋倾向性值由222nm的平均残基椭圆率(MRE)对TFE％作图获得。于222nm实现CD光谱50％转变的TFE浓度用作螺旋倾向性的检测结果。

结果表明，GLP-2和GLP-2(A2G)显示出较大的螺旋倾向性，转变为最大螺旋信号需要约16％的TFE。相比之下，GLP-1具有较低的螺旋倾向性，螺旋转变需要＞20％的TFE。显然，类似物肽GLP-2(A2G、L17Q)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)的螺旋转变均需要＞20％的TFE，与GLP-1的相似性比GLP-2更紧密。因此，L17Q取代降低了GLP-2肽的螺旋形成潜力。

实施例8

GLP-2中的突变防止模拟体二聚化

编码具有A2G、L17Q(SEQ ID NO：75)和A2G、N16G、L17Q(SEQID NO：77)的GLP-2模拟体类似物的核酸序列使用Stratagene的QuickChange XL试剂盒产生。这些模拟体变体在HEK 293E细胞中瞬时表达，并按照实施例1中所描述的步骤纯化。

基于SEC-SLS分析，GLP-2(A2G、N16G、L17Q)模拟体表现出与单体一致的分子量，而GLP-2(A2G、L17Q)模拟体表现出反映单体和二聚体混合物的分子量。

实施例9

GLP-2类似物模拟体的体外活性

以cAMP表达测定检测GLP-2类似物的体外活性。该测定基于Applied Biosystems的cAMP Direct Screen Sysstem，使用在HEK 293E细胞中表达突变huGLP-2R的细胞系。将0.01nM至1.0μM浓度范围的肽在含0.5％BSA的PBS中的溶液加入至悬浮在96孔板中的约50,000个细胞中。于37℃温育30分钟后，按照生产商的方法(AppliedBiosystems发光方案：cAMP-Screen Direct System)加入裂解缓冲液，之后加入发光试剂(Applied Biosystems)。使用TopCount液体闪烁分析仪(PerkinElmer)定量发光，数据使用Softmax软件(Molecular DevicesCorporation)处理。得自cAMP水平对肽浓度作图的EC-50值列于以下的表5。

表5：得自cAMP对肽浓度作图的GLP-2肽的EC-50值

结构	Wt-GLP-2	GLP-2(A2G)	GLP-2(A2G、N16G、L17Q)	GLP-2(A2G、L17Q)
结构	Wt-GLP-2	GLP-2(A2G)	GLP-2(A2G、N16G、L17Q)	GLP-2(A2G、L17Q)	cAMP体外EC₅₀值(nM)	1.6	1.9	3.5	5.2

数据表明，相对于野生型GLP-2，GLP-2_{(A2G、N16G、L17Q)}和GLP-2_(A2G、 _L17Q)的活性分别仅低至2倍和3倍。

实施例10

A2G-GLP-2肽加速上GI转运

为测试A2G-GLP-2对正常小鼠中上胃肠道转运的作用，将小鼠随机分为2组(每个测试组14只动物)。连续10天每组每日接受一次A2G-GLP-2肽(50μg/小鼠)或磷酸缓冲盐水溶媒的皮下注射(总体积200ml)。

在研究当日，使用胭脂红染料技术检测上胃肠道转运。将0.25ml混合入0.5％(重量/体积)甲基纤维素中的6％(重量/体积)胭脂虫洋红粉溶液的试验餐通过18号弯曲饲管胃内给予喂饲小鼠。在口服给予测试餐后，将小鼠放回到它们的居住笼中。在给予标记餐后20分钟，通过颈椎脱臼使小鼠快速安乐死，由远端结肠开始直至胃幽门切下完整的胃肠道。将切除的肠器官纵向平行于直线米尺放置，小心避免拉伸肠器官。检测胭脂红染料前沿经由小肠移动的直线距离以及小肠的总长度。上胃肠道转运表示为在20分钟测试期内脂红染料前沿移动行程除以整个小肠长度的百分率：位移小肠％＝[染料前沿经由小肠的移动距离(cm)/完整小肠长度(cm)×100]。如在图3中所示，A2G-GLP-2治疗导致上胃肠道转运加速。

实施例11

GLP-2模拟体加速上GI转运

为测试GLP-2模拟体对正常小鼠中上胃肠道转运的作用，将小鼠随机分为2组(每组4只动物)。每组在检测胃肠转运之前4天接受单次注射的A2G GLP-2模拟体(SEQ ID NO：5)(4mg/kg)或IgG4阴性对照。

在研究当日，使用FITC-葡聚糖法检测上胃肠道转运。该方法既提供胃肠道转运的检测结果，又提供测试餐沿着胃肠道的分布模式的显示。通过18号弯曲饲管胃内给予150ml FITC-葡聚糖溶液(5mg/ml缀合荧光素-异硫氰酸酯的70,000分子量葡聚糖在0.5％甲基纤维素/去离子水中的溶液)喂饲小鼠测试餐。在口服给予FITC-葡聚糖测试餐之后，将小鼠放回到它们的居住笼中。已表明30分钟的测试期是检测加速转运的最佳时程，而45分钟测试期对检测延迟转运最佳。在适宜的测试期后，通过二氧化碳接触处死小鼠。取出由食管下端括约肌至末端结肠的完整胃肠道。沿着肠系膜缘打开肠段。将胃的组织和内腔内容物、10段相等的小肠、盲肠和3段相等的结肠置于含1ml PBS的单个Eppendorf管中。在台式涡旋器上剧烈混合组织，固体物质通过离心沉淀。一式两份在96孔荧光读板器上读取澄清上清液的等份试样，以定量每个肠段的荧光信号大小。这些值用于计算几何中心(GC)，其被定义为沿着胃肠道的荧光信号的加权平均分布：GC＝∑(每段的总荧光信号的百分率×段数)/100。依据1-15的分级，较高的值代表较快的转运速率。如图4所示，1剂GLP-2模拟体治疗导致上胃肠道转运加速。模拟体诱导的FITC-葡聚糖分布模式的迁移示于上图。胃中的标记降低，大量标记向更远的小肠段全面迁移。在下图中计算用于统计学比较的GC。正常小鼠在30分钟测试时间段后表现出GC＝6，其未被采用IgG4骨架的治疗改变。采用GLP-2模拟体的治疗将GC增加至7.5。

实施例12

GLP-2模拟体减弱与手术后炎性肠梗阻相关的GI动力性受损

由于人IgG4在小鼠中的免疫原性，在以下试验中使用鼠GLP-2模拟体，即在鼠IgG2a骨架中的人A2G-GLP2肽(SEQ ID NO：80)。

为测试GLP-2模拟体对与手术后炎性肠梗阻相关的GI动力性受损的作用，将小鼠随机分为3组(每组8只动物)，并用2mg/kg鼠A2G-GLP-2模拟体、IgG2a或PBS治疗。1小时后，对小鼠进行剖腹手术和小肠操作。简而言之，通过吸入异氟烷麻醉雄性CD-1小鼠，并做手术准备。腹部备皮，用消毒液处理。然后给动物盖上手术巾。经中线剖腹术打开腹部，从腹中取出完整小肠放在无菌手术巾上。然后使用两个湿润的无菌棉签沿着由Treitz韧带至回盲部的小肠长度轻柔地按压小肠。然后将小肠放回到腹腔，缝合切口。此后，将小鼠放回到它们的居住笼中。第4组的8只动物用作空白对照。

在手术后48小时，所有小鼠都接受口服的FITC-葡聚糖测试餐。在口服喂饲后45分钟测定胃肠道转运。如在图5中所示，空白对照表现出正常的45分钟转运(GC＝8.2)。腹部手术在PBS治疗动物中导致胃肠道转运显著延迟。用IgG2a治疗对手术诱发的转运延迟没有作用，而用鼠A2G-GLP-2模拟体治疗导致转运显著改善。

实施例13

GLP-2模拟体减弱与手术后炎性肠梗阻相关的细胞炎症

为测试GLP-2模拟体对细胞炎症的作用，如在实施例12中所述诱发手术后炎性肠梗阻。对手术后48小时由小鼠的中段小肠收集的组织进行髓过氧物酶组织化学。

简而言之，由在实施例12中描述的离心管收集中段小肠的区段。如下制备肌肉层的整封标本：将所述组织块(tissue flat)钉在衬有

的培养皿中，并将组织拉伸至其长度的2倍和其宽度的1.5倍。通过精细解剖取出粘膜。然后用100％乙醇固定肌层整封标本达1小时，用PBS洗涤3次，在含0.1％过氧化氢和1mg/ml Hanker-Yates试剂的PBS中温育20分钟。在用PBS第二次洗涤之后，在玻璃载玻片上制作整封标本，盖片，并用光学显微镜目测。计数6-8个邻接的200X光学视野中含髓过氧化物酶的白细胞，计算并记录平均细胞计数。

使用Hanker-Yates试剂对髓过氧化物酶(MPO)活性染色的代表性肠肌层整封标本示于图6。黑点代表浸润小肠肌肉层的MPO阳性白细胞。在由空白小鼠收集的组织中几乎没有发现MPO阳性细胞。在进行小肠手术操作之前，在用PBS治疗的小鼠中发现浸润白细胞数显著增加。用IgG2a治疗对浸润细胞数没有影响。相比之下，用鼠A2G-GLP-2模拟体治疗显著减少了浸润细胞数。细胞计数汇编于图7，用于统计学比较。

现在已完整描述了本发明，对本领域一般技术人员显而易见的是，在不偏离随附权利要求的精神或范围的情况下，可对本发明实施许多变更和修改。

序列表

<110>BAKER，AUDREY E.

MOORE，BEVERLY A.

NESSPOR，TOM

O’NEIL，KARYN

PALMER，JEFFREY M.

PICHA，KRISTEN

SAGUE，SARAH

<120>GLP-2模拟体、多肽、组合物、方法和用途

<130>CEN5115USNP

<140>待分配

<141>2006-10-24

<150>60/729704

<151>2005-10-24

<150>60/824160

<151>2006-08-31

<150>60/862487

<151>2006-10-23

<160>79

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>人

<400>1

His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>2

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>2

His Ser Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>3

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>3

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>4

<211>275

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>4

His Ser Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Asp Thr Leu Met

65 70 75 80

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val ValVal Asp Val Ser Gln

85 90 95

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

100 105 110

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

115 120 125

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

130 135 140

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

145 150 155 160

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

180 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

195 200 205

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

210 215 220

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

225 230 235 240

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

245 250 255

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

260 265 270

Leu Gly Lys

275

<210>5

<211>276

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>5

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210>6

<211>43

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>6

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

35 40

<210>7

<211>48

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>7

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

35 40 45

<210>8

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>8

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Cys Pro Pro Cys Pro

50

<210>9

<211>58

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>9

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>10

<211>63

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>10

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

50 55 60

<210>11

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>11

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>12

<211>831

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>12

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180

cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240

atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300

gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360

cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540

cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720

gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780

ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaatg a 831

<210>13

<211>129

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>13

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atcctgccca 120

ccatgcccg 129

<210>14

<211>144

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>14

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggtggt 120

ggcggcagtt gcccaccatg cccg 144

<210>15

<211>159

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>15

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggcggt 120

ggcggatctg gtggtggcgg cagttgccca ccatgcccg 159

<210>16

<211>174

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>16

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggtgga 120

ggaggctcag gcggtggcgg atctggtggt ggcggcagtt gcccaccatg cccg 174

<210>17

<211>189

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>17

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggcgga 120

ggaggttccg gtggaggagg ctcaggcggt ggcggatctg gtggtggcgg cagttgccca 180

ccatgcccg 189

<210>18

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>18

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

gccttagtcg ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>19

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>连接物

<400>19

Gly Gly Gly Ser

1

<210>20

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>连接物

<400>20

Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210>21

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>21

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>V2变体

<400>22

Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser

1 5

<210>23

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>23

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210>24

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>24

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210>25

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>25

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210>26

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>26

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210>27

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>27

Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210>28

<211>110

<212>PRT

<213>人

<400>28

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210>29

<211>110

<212>PRT

<213>人

<400>29

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210>30

<211>110

<212>PRT

<213>人

<400>30

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210>31

<211>110

<212>PRT

<213>人

<400>31

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210>32

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>32

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>33

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>33

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

100 105

<210>34

<211>4

<212>PRT

<213>人

<400>34

Cys Pro Ser Cys

1

<210>35

<211>553

<212>PRT

<213>人

<400>35

Met Lys Leu Gly Ser Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Gly

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Val His Glu Leu Pro Met Gly Ile Pro Ala Pro Trp

20 25 30

Gly Thr Ser Pro Leu Ser Phe His Arg Lys Cys Ser Leu Trp Ala Pro

35 40 45

Gly Arg Pro Phe Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Ser Ile Lys Gln Val

50 55 60

Thr Gly Ser Leu Leu Glu Glu Thr Thr Arg Lys Trp Ala Gln Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Ala Cys Leu Arg Asp Leu Leu Lys Glu Pro Ser Gly Ile Phe Cys

85 90 95

Asn Gly Thr Phe Asp Gln Tyr Val Cys Trp Pro His Ser Ser Pro Gly

100 105 110

Asn Val Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Trp Ser Glu Glu

115 120 125

Ser Ser Gly Arg Ala Tyr Arg His Cys Leu Ala Gln Gly Thr Trp Gln

130 135 140

Thr Ile Glu Asn Ala Thr Asp Ile Trp Gln Asp Asp Ser Glu Cys Ser

145 150 155 160

Glu Asn His Ser Phe Lys Gln Asn Val Asp Arg Tyr Ala Leu Leu Ser

165 170 175

Thr Leu Gln Leu Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Phe Ser Leu Ile Ser

180 185 190

Leu Phe Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Phe Leu Arg Lys Leu His Cys

195 200 205

Thr Arg Asn Tyr Ile His Met Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg

210 215 220

Thr Leu Ala Val Leu Val Lys Asp Val Val Phe Tyr Asn Ser Tyr Ser

225 230 235 240

Lys Arg Pro Asp Asn Glu Asn Gly Trp Met Ser Tyr Leu Ser Glu Met

245 250 255

Ser Thr Ser Cys Arg Ser Val Gln Val Leu Leu His Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ala Asn Tyr Leu Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Thr Leu

275 280 285

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290 295 300

Leu Leu Gly Trp Ala Phe Pro Val Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Phe

305 310 315 320

Ala Arg Ala His Leu Glu Asn Thr Gly Cys Trp Thr Thr Asn Gly Asn

325 330 335

Lys Lys Ile Trp Trp Ile Ile Arg Gly Pro Met Met Leu Cys Val Thr

340 345 350

Val Asn Phe Phe Ile Phe Leu Lys Ile Leu Lys Leu Leu Ile Ser Lys

355 360 365

Leu Lys Ala His Gln Met Cys Phe Arg Asp Tyr Lys Tyr Arg Leu Ala

370 375 380

Lys Ser Thr Leu Val Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Ile Leu

385 390 395 400

Phe Ser Phe Ile Thr Asp Asp Gln Val Glu Gly Phe Ala Lys Leu Ile

405 410 415

Arg Leu Phe Ile Gln Leu Thr Leu Ser Ser Phe His Gly Phe Leu Val

420 425 430

Ala Leu Gln Tyr Gly Phe Ala Asn Gly Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg

435 440 445

Lys Tyr Trp Val Arg Phe Leu Leu Ala Arg His Ser Gly Cys Arg Ala

450 455 460

Cys Val Leu Gly Lys Asp Phe Arg Phe Leu Gly Lys Cys Pro Lys Lys

465 470 475 480

Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ala Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Pro Ser

485 490 495

Leu Asn Ser Gly Arg Leu Leu His Leu Ala Met Arg Gly Leu Gly Glu

500 505 510

Leu Gly Ala Gln Pro Gln Gln Asp His Ala Arg Trp Pro Arg Gly Ser

515 520 525

Ser Leu Ser Glu Cys Ser Glu Gly Asp Val Thr Met Ala Asn Thr Met

530 535 540

Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ser Glu Ile

545 550

<210>36

<211>553

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP 2R变体

<400>36

Met Lys Leu Gly Ser Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Gly

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Val His Glu Leu Pro Met Gly Ile Pro Ala Pro Trp

20 25 30

Gly Thr Ser Pro Leu Ser Phe His Arg Lys Cys Ser Leu Trp Ala Pro

35 40 45

Gly Arg Pro Phe Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Ser Ile Lys Gln Val

50 55 60

Thr Gly Ser Leu Leu Glu Glu Thr Thr Arg Lys Trp Ala Gln Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Ala Cys Leu Arg Asp Leu Leu Lys Glu Pro Ser Gly Ile Phe Cys

85 90 95

Asn Gly Thr Phe Asp Gln Tyr Val Cys Trp Pro His Ser Ser Pro Gly

100 105 110

Asn Val Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Trp Ser Glu Glu

115 120 125

Ser Ser Gly Arg Ala Tyr Arg His Cys Leu Ala Gln Gly Thr Trp Gln

130 135 140

Thr Ile Glu Asn Ala Thr Asp Ile Trp Gln Asp Asp Ser Glu Cys Ser

145 150 155 160

Glu Asn His Ser Phe Lys Gln Asn Val Asp Arg Tyr Ala Leu Leu Ser

165 170 175

Thr Leu Gln Leu Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Phe Ser Leu Ile Ser

180 185 190

Leu Phe Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Phe Leu Arg Lys Leu His Cys

195 200 205

Thr Arg Asn Tyr Ile His Met Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg

210 215 220

Thr Leu Ala Val Leu Val Lys Asp Val Val Phe Tyr Asn Ser Tyr Ser

225 230 235 240

Lys Arg Pro Asp Asn Glu Asn Gly Trp Met Ser Tyr Leu Ser Glu Met

245 250 255

Ser Thr Ser Cys Arg Ser Val Gln Val Leu Leu His Tyr Phe Val Gly

260 265 270

Ala Asn Tyr Leu Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Thr Leu

275 280 285

Leu Glu Pro Thr Val Leu Pro Glu Arg Arg Leu Trp Pro Arg Tyr Leu

290 295 300

Leu Leu Gly Trp Ala Phe Pro Val Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Phe

305 310 315 320

Ala Arg Ala His Leu Glu Asn Thr Gly Cys Trp Thr Thr Asn Gly Asn

325 330 335

Lys Lys Ile Trp Trp Ile Ile Arg Gly Pro Met Met Leu Cys Val Thr

340 345 350

Val Asn Phe Phe Ile Phe Leu Lys Ile Leu Lys Leu Leu Ile Ser Lys

355 360 365

Leu Lys Ala His Gln Met Cys Phe Arg Asp Tyr Lys Tyr Arg Leu Ala

370 375 380

Lys Ser Thr Leu Val Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Ile Leu

385 390 395 400

Phe Ser Phe Ile Thr Asp Asp Gln Val Glu Gly Phe Ala Lys Leu Ile

405 410 415

Arg Leu Phe Ile Gln Leu Thr Leu Ser Ser Phe His Gly Phe Leu Val

420 425 430

Ala Leu Gln Tyr Gly Phe Ala Asn Gly Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg

435 440 445

Lys Tyr Trp Val Arg Phe Leu Leu Ala Arg His Ser Gly Cys Arg Ala

450 455 460

Cys Val Leu Gly Lys Asp Phe Arg Phe Leu Gly Lys Cys Pro Lys Lys

465 470 475 480

Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ala Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Pro Ser

485 490 495

Leu Asn Ser Gly Arg Leu Leu His Leu Ala Met Arg Gly Leu Ala Asp

500 505 510

Val Gly Ala Gln Pro Gln Gln Asp His Ala Arg Trp Pro Arg Gly Ser

515 520 525

Ser Leu Ser Glu Cys Ser Glu Gly Asp Val Thr Met Ala Asn Thr Met

530 535 540

Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ser Glu Ile

545 550

<210>37

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

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<210>38

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

ttggtctgaa tcaaccagtt tataaagtct cgagcggcaa gattatcaag aatggtgttc 60

atctc 65

<210>39

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

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<210>40

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

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<210>41

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

ccaaagtata caggcgcatg gcgatggttc tttctctgat gagatgaaca ccattcttg 59

<210>42

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>42

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Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

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<210>43

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>43

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1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Pro Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

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<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>44

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1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Pro Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>45

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>45

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Pro Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

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<210>46

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>46

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gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

gccttagtcc ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>47

<211>176

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>47

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actttataaa ctggttgatt cagaccaaaa tcactgacgg atccggtgga ggctccggtg 120

ccttagtcgc cgtcccctca gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccg 176

<210>48

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>48

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

gccttagtcg ccgtctcccc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>49

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>49

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

gccttagtcg ccgtctcctc agagtccaaa cctggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>50

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>50

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>51

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>51

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>52

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>52

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Tyr Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>53

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>53

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>54

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>54

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>55

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>55

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>56

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>56

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>57

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-2变体

<400>57

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210>58

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>58

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

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<210>59

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>59

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

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Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>60

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>60

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1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>61

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>61

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>62

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>62

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>63

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>63

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>64

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>64

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>65

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>65

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

50 55

<210>66

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>66

catggcgatg gttctttctc tagtgacatg tcgaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>67

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>67

catggcgatg gttctttctc tagtgacgtc tcgaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>68

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>68

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacacctatc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>69

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>69

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggtct tgccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>70

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>70

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatca ggccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>71

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>71

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggcca ggccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>72

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>72

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttatag cctggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>73

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>模拟体

<400>73

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60

gactttataa actggttggt taagggcaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177

<210>74

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有A2G、M10V突变的GLP-2肽

<400>74

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Val Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile

20 25 30

Thr Asp

<210>75

<211>276

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有A2G、L17Q突变的GLP-2模拟体氨基酸序列

<400>75

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met IIe Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210>76

<211>828

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有A2G、L17Q突变的GLP-2模拟体核酸序列

<400>76

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatca ggccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180

cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240

atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300

gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360

cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540

cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720

gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780

ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaa 828

<210>77

<211>276

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有A2G、N16G、L17Q突变的GLP-2模拟体核酸序列

<400>77

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210>78

<211>828

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有A2G、N16G、L17Q突变的GLP-2模拟体核酸序列

<400>78

catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggcca ggccgctcga 60

gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120

accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180

cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240

atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300

gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360

cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540

cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720

gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780

ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaa 828

<210>79

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GLP-1模拟体氨基酸序列

<400>79

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210>80

<211>280

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>在鼠IgG2a骨架中的人A2G-GLP2肽

<400>1

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Glu

35 40 45

Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala

50 55 60

Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile

65 70 75 80

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val

85 90 95

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

100 105 110

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

115 120 125

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln

130 135 140

Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

145 150 155 160

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

165 170 175

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

180 185 190

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu

195 200 205

Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr

210 215 220

Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr

225 230 235 240

Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr

245 250 255

Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

260 265 270

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

275 280

Claims

1.一种式(II)的模拟体：

(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)_(t)

(II)

其中GLP2RAg为哺乳动物GLP-2R激动剂，Lk为多肽或化学键，V2为免疫球蛋白可变区C末端的一部分，Hg至少为免疫球蛋白可变铰链区的一部分，C_H2为免疫球蛋白重链C_H2恒定区，C_H3为免疫球蛋白重链C_H3恒定区，t独立地为1-10的整数。

2.权利要求1的模拟体，其中GLP2RAg具有SEQ ID NO：2、3、50、51、52、53、54、55、56、57或74的氨基酸序列。

3.权利要求1的模拟体，其中Hg、C_H2和C_H3属于IgG1亚类。

4.权利要求3的模拟体，其中Hg的Cys220被Ala取代，而C_H2的Leu234和Leu235突变为Ala234和Ala235。

5.权利要求1的模拟体，其中Hg属于IgG4亚类，C_H2和C_H3属于IgG1亚类。

6.权利要求1的模拟体，其中Hg、C_H2和C_H3属于IgG4亚类。

7.权利要求6的模拟体，其中Hg的Ser228被Pro取代，而C_H2的Phe234和Leu235突变为Ala234和Ala235。

8.权利要求1的模拟体，其中所述模拟体结合GLP-2受体。

9.一种模拟体，所述模拟体包含具有示于SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的序列的多肽。

10.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-9中任一项的模拟体。

11.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含具有示于SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18、46、47、48、49、66、67、68、69、70、71、72、73、76或78的序列或互补序列的多核苷酸。

12.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码示于SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的氨基酸序列的多核苷酸。

13.一种载体，所述载体包含权利要求11或12的多核苷酸。

14.一种细胞系，所述细胞系表达权利要求1-9中任一项的模拟体。

15.一种细胞系，所述细胞系包含权利要求13的载体。

16.权利要求15的细胞系，其中所述细胞系为HEK293、NSO、SP2/0或CHO细胞。

17.一种生产多肽的方法，所述方法包括培养权利要求16的细胞系并纯化表达的多肽的步骤。

18.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的至少一种权利要求1-9中任一项的模拟体和药学上可接受的载体或稀释剂。

19.一种改变哺乳动物的GLP-2生物活性的方法，所述方法包括给予哺乳动物权利要求18的药物组合物。

20.一种减轻至少一种GLP-2相关病症或障碍的症状或治疗至少一种GLP-2相关病症或障碍的方法，所述方法包括给予其需要的患者权利要求18的药物组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述GLP-2相关病症或障碍为胃肠疾病、骨相关疾病或营养相关疾病。

22.权利要求21的方法，其中所述胃肠疾病为短肠综合征、炎性肠病、克罗恩氏疾病、结肠炎、胰腺炎、回肠炎、粘膜炎或肠萎缩症。

23.权利要求21的方法，其中所述胃肠疾病为儿科胃肠疾病。

24.权利要求21的方法，其中所述骨相关疾病为骨质疏松症。

25.权利要求21的方法，其中所述营养相关疾病为肥胖症。

26.一种预防炎性肠梗阻、减轻炎性肠梗阻的症状或治疗炎性肠梗阻的方法，所述方法包括给予其需要的患者权利要求18的药物组合物。

27.一种多肽，所述多肽包含具有示于SEQ ID NO：52、54、55或74的序列的多肽。

28.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的权利要求27的多肽和药学上可接受的载体或稀释剂。

29.一种改变哺乳动物的GLP-2生物活性的方法，所述方法包括给予哺乳动物权利要求28的药物组合物。

30.一种减轻至少一种GLP-2相关病症或障碍的症状或治疗至少一种GLP-2相关病症或障碍的方法，所述方法包括给予其需要的患者权利要求28的药物组合物。

31.一种预防炎性肠梗阻、减轻炎性肠梗阻的症状或治疗炎性肠梗阻的方法，所述方法包括给予其需要的患者权利要求28的药物组合物。