JP2021518132A - Gipr抗体及びglp−1とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び用途 - Google Patents
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Abstract
Description
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、抗体も、本明細書において提供される。
本明細書において特に定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
消化管抑制ペプチド受容体は、7−膜貫通Gタンパク質で結合される受容体のファミリーのタイプBに属する。受容体は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)によって1つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される(非特許文献24)。これまで、研究は、GIPRが、主に、膵β細胞及び脂肪細胞の表面で発現され(非特許文献2)、ヒトにおいてグルコース及び脂質代謝の両方に関与し、したがって糖尿病、肥満及び関連疾患に密接に関連していることを示す(非特許文献25)。本明細書において使用される「ヒトGIPR」及び「hGIPR」は両方とも、ヒト腸抑制ペプチド受容体を指し、同義的に使用され得る。本明細書において使用される「マウスGIPR」及び「mGIPR」は両方とも、マウス胃抑制ペプチド受容体を指し、これらも同義的に使用され得る。
ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))ポリヌクレオチド(配列番号114);受託番号:S79852;
ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))アミノ酸(配列番号113);受託番号:AAB35419.2;
サル(アカゲザル(Rhesus macaque))ポリヌクレオチド(配列番号116);受託番号:XM_015124289.1;
サル(アカゲザル(Rhesus macaque))アミノ酸(配列番号115);受託番号:XP_014979775;
マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))ポリヌクレオチド(配列番号118);受託番号:CCDS39795;及びマウス(ハツカネズミ(Mus musculus))アミノ酸(配列番号117);受託番号:Q0P543。
一実施形態において、GIPR抗体が、本明細書において提供される。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、完全GIPR抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体フラグメントである。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体の誘導体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体突然変異タンパク質である。さらなる実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体の変異体である。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;及び
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;及び
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26
から選択される。
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される。
a.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
b.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
c.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
d.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
d.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
d.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;
b.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ;及び
c.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号18、配列番号19、及び配列番号20の組合せ;
b.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号18、配列番号21、及び配列番号22の組合せ;
c.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25の組合せ;
d.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28の組合せ;
e.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号13、配列番号11、配列番号14、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28の組合せ;又は
f.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号26、配列番号29、及び配列番号30の組合せ
を含む。
a.軽鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列;及び
b.重鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
から選択される。
a.軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列;及び
b.重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、及び配列番号100;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
a.軽鎖定常アミノ酸配列:配列番号101及び配列番号102;及び
b.重鎖定常アミノ酸配列:配列番号103及び配列番号104、及び配列番号124
から選択される。
ヒト軽鎖κ定常ドメインアミノ酸配列:(配列番号101);及び
ヒト軽鎖λ定常ドメインアミノ酸配列:(配列番号102)。
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG2):(配列番号103);
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG4):(配列番号104);及び
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG4):(配列番号124)。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全長抗体(完全長重鎖及び/又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む)である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメント、例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fc、又はFdフラグメントであり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ(maxibodies)、ミニボディ(minibodies)、イントラボディ(intrabodies)、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、v−NAR及びビス−scFvに組み込まれ得る(例えば、非特許文献26を参照)。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、フィブロネクチンポリペプチド単一特異性抗体(monobodies)を含む、(特許文献8)に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、(特許文献9)に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
L1及びH1のヌクレオチド配列が、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発(例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異)によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、1つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、(非特許文献55);(非特許文献56);(非特許文献57);(非特許文献58);並びに(特許文献12)及び(特許文献13)に記載されている。これらの及び他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、GIPRに対する親和性、アビディティ(avidity)、若しくは特異性又はインビボ若しくはインビトロ安定性の向上、又は生体内副作用の減少を有する、例えば、GIPR抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
一実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、4、5、6、7、又は8つのGLP−1フラグメント又は逆GLP−1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP−1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP−1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端に結合するか、又は逆GLP−1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
一態様において、本発明は、本明細書において提供される抗体をコードする単離核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗体又はGLP−1融合タンパク質の全て又は部分、例えば、本発明の抗体、又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド;ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド;ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、又は増幅するためのPCRプライマー又はシーケンシングプライマー;ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び上記のものの相補的配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000又はそれ以上のヌクレオチド長であり得、及び/又は1つ又は複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、及び/又はより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、RNA及び/又はDNAヌクレオチド、及びその人工変異体(例えば、ペプチド核酸)を含み得る。
GIPR抗体の活性は、GIPRに特異的に結合し、GIPシグナル伝達を阻害又は阻止し、その後、治療的生物学的効果を示し、例えば、肥満、T2DM及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を処置する際の、本明細書において提供される抗体の効果を指す。「GIPシグナル伝達の生物学的活性を低下させる」又は「GIPシグナル伝達の生物学的活性を阻害又は阻止する」という用語は、インビボでGIPRに結合することによって、GIPに対する下流の細胞応答を阻害又は阻止する際の、GIPR抗体又はそのGLP−1融合タンパク質の効果を指す。それらの応答としては、限定はされないが、インスリン分泌促進作用、脂肪蓄積の促進、及び脂肪分解の阻害が挙げられる。一実施形態において、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体は、ヒトGIPRに特異的に結合する。このような抗体は、GIPシグナル伝達を低減又は中和する拮抗又は中和抗体を含む。
a.GIPRに結合する際に、参照抗体と実質的に同様のKdを提供すること;
b.GIPによって活性化されるGIPRに拮抗する際に、参照抗体と実質的に同様のIC50を提供すること;及び
c.ヒトGIPRに対する参照抗体との交差競合的結合(cross−competing binding)。
GIPR抗体及びGLP−1の融合タンパク質の生物学的活性は、GLP−1の生物学的活性及びGIPR抗体の活性を含む。GIPR抗体の活性は、上述されるとおりである。「GLP−1の生物学的活性」は、GLP−1受容体にインビボで結合し、それを活性化し、細胞内シグナル伝達応答を引き起こし、肥満、2型糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎などの治療効果を示す、GIPR抗体及びGLP−1の融合タンパク質の生物学的活性を指す。シグナル伝達応答は、限定はされないが、インスリン分泌の増加、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、体重減少、満腹感の誘発、アポトーシスの阻害、膵β細胞増殖の誘発、及び膵β細胞分化を含む。GLP−1及びGIPR抗体の生物学的活性を組み合わせて、本明細書において提供されるGLP−1融合タンパク質を用いて、GLP−1R及びGIPRに関連する様々な疾患及び障害を処置することができる。融合タンパク質は、GLP−1R及び/又はGIPRに作用することによってその生物学的効果を発揮するため、本明細書において提供されるGLP−1融合タンパク質処置を用いて、疾患又は症状が「GLP−1Rシグナル伝達の増加」又は「GIPRシグナル伝達の低減」から利益を得る被験体を処置することができる。これらの被験体は、「GLP−1R刺激療法を必要とする」又は「GIPR刺激を低減する必要がある」被験体と呼ばれ、このような対照は、非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳卒中(GLP−1R、(特許文献28)を参照)、心筋梗塞(GLP−1R、(特許文献29)を参照)、肥満(GLP−1R、(特許文献30)を参照;GIPR、(非特許文献94);(特許文献31)を参照)、外科手術後の異化変化(GLP−1R、(特許文献32)を参照)、機能性ディスペプシア及び過敏性腸症候群(GLP−1R、(特許文献33)を参照)、脂肪肝(GIPR、(特許文献31)を参照)、非アルコール性脂肪肝疾患(GLP−1R、(非特許文献95)を参照;GIPR、(特許文献31)を参照)、非アルコール性脂肪性肝炎(GLP−1、(非特許文献96)を参照;GIPR、(特許文献31)を参照)を含み、また、非インスリン依存性糖尿病を発症するリスクのある被験体(特許文献34を参照)、耐糖能異常又は空腹時血糖異常の被験体、体重が標準体重より約25%多い被験体、及び膵部分切除を有する被験体も含む。
一実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるGIPR抗体と、1つ又は複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
一実施形態において、2型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
CHO−DHFR−細胞を、6ウェルプレート中に播種した。24時間後、細胞に、hGIPR遺伝子(ヌクレオチド配列については配列番号114、及びアミノ酸配列については配列番号113を参照)を含むpTM15プラスミドをトランスフェクトした。製造業者の推奨するプロトコルにしたがって、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの48時間後、培地を、300μg/mLのハイグロマイシンを含有する完全培地と交換し、安定したクローンが現れるまで、約2週間の培養の間、3日ごとに培地を交換した。分散された細胞群体を、プレートから取り出し、細胞が100%コンフルエンスに達するまで連続的に継代培養した。構築された安定した細胞系を、圧力選択後に陽性クローンを確認するために、V5タグに対するモノクローナル抗体(Life Technologies)を用いて、FACSによって分析した。大量の細胞表面hGIPR発現が、選択されたCHO−DHFR−hGIPR細胞において検出された。最後に、3つの高hGIPR発現の安定した細胞系が、サブクローニング及びさらなる確認によって同定された。これらの細胞系を、抗体調製のための免疫原を産生するのに使用した(実施例2を参照)。さらに、ある実施形態において、hGIPR及びhIgG Fcの細胞外ドメインの融合タンパク質も、抗体調製のための免疫原として使用され得る。調製方法は、以下のとおりである:hGIPR細胞外ドメイン、hIgG Fc及びペプチドリンカー(リンカー)の融合タンパク質遺伝子を、pTM5プラスミド中にサブクローニングする。細胞上清を、懸濁されたHEK293細胞を用いて大量一過性発現(mass transient expression)によって生成し、次に、hGIPR細胞外ドメイン融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー精製によって得た。
hGIPRに対する抗体が、以下のいずれかを含む免疫原を用いて産生され得る。例えば、特定の実施形態において、hGIPRを発現する全細胞が、hGIPRに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。さらに、特定の実施形態において、hGIPR及びhFcのN末端細胞外ドメインを含む融合タンパク質が、hGIPRに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。免疫原及び水酸化アルミニウムアジュバントを混合し、BALB/cマウス(6〜8週齢)の皮下に注入し、週に1回追加免疫した。合計6回の免疫付与後、血液試料を、尾静脈から採取し、血清を遠心分離によって分離し、次に、血清力価をFACSによって分析した。最も高い力価が得られた後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を、無菌状態で採取した。対数増殖期のSP2/0細胞を収集し、遠心分離し、細胞ペレットを、無血清培地で再度懸濁させ、次に、遠心分離し、再度二度目の懸濁を行い、計数した。脾臓細胞及びSP2/0細胞を、SP2/0細胞:脾臓細胞≧1:1の比率で混合した後、3回の洗浄−遠心分離を行った。最後の遠心分離からペレットを取り出した後、1mLの予め温めたPEG−1500を滴下して加え、1分間にわたってピペット混合し、30mLの予め温めた無血清培地をゆっくりと加えて、PEG融合を停止させた。細胞ペレットを、融合培地中で再度懸濁させた。100μL中の脾臓細胞及び支持細胞層細胞を、96ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。融合されたハイブリドーマ細胞及び支持細胞層細胞を、HAT(サルシン、アメトプテリン及びチミジン)選択を用いて、96ウェルプレート中で共培養して、非融合細胞を除去した。10日後、培養プレート中のハイブリドーマ細胞の上清を、ELISA分析のために収集した。
hGIPRを過剰発現するCHO−DHFR−hGIPR細胞及びCHO−DHFR−ブランク細胞を、96ウェルプレート中に別々に移し、90%コンフルエンスに到達させた。培地の上清を除去し、付着した細胞を、PBSで2回洗浄し、100%のメタノールを加えて、4℃で細胞を固定した。次に、100μLの、作製したばかりの0.6%のH2O2−PBSを加え、室温で20分間にわたるインキュベーションの後、細胞をPBSで2回洗浄した。1%のBSA溶液(PBSに溶解された)でブロックした後、ハイブリドーマ上清を加え、4℃で90分間インキュベートした。数回の洗浄後、100μLの希釈されたヤギ抗マウスFc−HRP二次抗体(Sigma−Aldrich)を、各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした。5回洗浄した後、100μLのTMB発色性基質を加え、37℃で15分間インキュベートし、次に、50μLの2MのH2SO4を加えて反応を停止させてから、450nmで読み取った。さらに、特定の実施形態において、hGIPR及びhFcのN末端細胞外ドメインの融合タンパク質が、コーティング抗原として使用される。1%のBSA(PBSに溶解された)でブロックした後、ハイブリドーマ細胞の上清を加え、4℃で90分間インキュベートした。後続の工程は、抗hGIPRモノクローナル抗体をスクリーニングする上記のELISA方法と同じである。陽性対照は、免疫付与されたマウスの血清であり;陰性対照は、細胞培地である。ELISAによる予備スクリーニングの後、hGIPR抗体を分泌するいくつかの陽性ハイブリドーマ細胞系が得られた。hGIPR抗体を分泌するこれらのハイブリドーマ細胞系を選択し、限界希釈法によってサブクローニングした。最後に、陽性ハイブリドーマ細胞の上清を、FACS分析によって確認した(実施例10を参照)。
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集した。ハイブリドーマmRNAを、QIAGEN mRNA抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出した。次に、抽出されたmRNAを、cDNAに逆転写した。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、特に、重鎖逆転写プライマーは、(5’−TTTGGRGGGAAGATGAAGAC−3’)であり、軽鎖逆転写プライマーは、(5’−TTAACACTCTCCCCTGTTGAA−3’)及び(5’−TTAACACTCATTCCTGTTGAA−3’)であった。RT−PCR反応条件は、以下のとおりに指定されていた:25℃で5分、50℃で60分、及び70℃で15分。逆転写されたcDNAを、500μLになるまで0.1mMのTEで希釈し、限外ろ過遠心分離管(Amicon Ultra−0.5)に加え、10分間にわたって2,000gで遠心分離した。ろ液を除去し、500μLの0.1mMのTEを加え、10分間にわたって2,000gで遠心分離した。ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、10分間にわたって2,000gで遠心分離して、精製されたcDNAを得た。精製されたcDNA(10μL)を鋳型として取った後、4μLの5倍のテーリングバッファー(Promega)、4μLのdATP(1mM)及び10U末端トランスフェラーゼ(Promega)を加え、均一に混合し、37℃で5分間、次に、65℃で5分間インキュベートした。ポリAテイルcDNAを、鋳型として使用し、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を増幅するために、PCRを行った。上流プライマーは全て、オリゴdTであり、重鎖下流プライマーは、(5’−TGGACAGGGATCCAGAGTTCC−3’)及び(5’−TGGACAGGGCTCCATAGTTCC−3’)であり、軽鎖下流プライマーは、(5’−ACTCGTCCTTGGTCAACGTG−3’)であった。PCR反応条件は、以下のとおりであった:95℃で5分;95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1分、40サイクル;及び72℃で7分。PCR産物を、配列決定のためにPMD 18−Tベクター(Takara Bio)に連結した。PCRプライマーを、抗体のDNA配列に基づいて設計し、したがって、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスIgG1定常領域を、発現ベクターpTM5に連結した。
最初に、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の配列を、NCBIオンライン抗体可変領域配列アライメントツール(Ig Blast)を用いた検索において入力として使用して、ヒト化のためのマウス抗体可変領域配列と相同のヒト抗体の生殖系列遺伝子配列(Ig Germline Gene配列)を検索し、CDR配列を除いて最も高い相同性を有するヒト遺伝子配列を、CDRグラフト化のための鋳型として使用して、ヒト化抗体可変領域配列を得た。ヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を合成し、ヒトIgG2又はIgG4定常領域配列と組み合わせて、完全長組み換えヒト化抗体配列を得た。組み換え抗体を、実施例8にしたがって発現させ、GIPRに対するそれらの親和性を、実施例10に記載されるようにFACSによって分析して、最良の親和性を有する抗体を選択した。ヒト化抗体の可変領域配列を、部位特異的突然変異によって操作して、GIPRに対するその親和性をさらに改善した。
最適化ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を、アウトソーシングによって合成した。このプロセス中、2つの制限部位、5’末端におけるNheI及び3’末端におけるSalIを、重鎖可変領域配列に導入した。完全な重鎖可変領域を、pTM5の発現ベクターにおける重鎖定常領域と連結した。同様に、NheIを5’末端に及びBsiwIを3’末端に導入することによって、軽鎖可変領域を、pTM5の発現ベクターにおける軽鎖定常領域と連結した。
最適化ヒト化抗体を、軽鎖のN末端又はC末端を介して、GLP−1又はその誘導体配列と融合して、GLP−1融合タンパク質を形成し、2つの配列を架橋としてのペプチドリンカー配列(リンカー)によって連結した。シグナルペプチド−GLP−1−リンカーのヌクレオチド配列が、Genscript Biotechnology Co.,Ltdによって合成される。合成遺伝子を鋳型として用いて、「シグナルペプチド−GLP1−リンカー」部分の配列を、PCRを用いて増幅した。さらに、ヒト化抗体のヌクレオチド配列を鋳型として用いて、融合タンパク質配列の抗体の配列を増幅する。次に、オーバーラップPCRによって、融合タンパク質の核酸配列の「シグナルペプチド−GLP−1−ペプチドリンカー」部分を、抗体部分と連結して、2つの制限酵素部位Nhe1及びNot1を、プライマーの両端に導入し、それによって、完全融合タンパク質配列及び発現ベクターpTM5が一緒に連結される。
HEK293又はCHO浮遊細胞(5×105/mL)を、振とうフラスコに接種した。37℃で24時間回転させた後、細胞密度は、1×106/mLに達し、これをトランスフェクションに使用した。ポリエチレンイミン(PEI)を、トランスフェクション試薬として使用し、それをDNAと混合する。PEI/DNAの混合物を、15分間のインキュベーションの後、細胞培養物に加えた。PEI/DNAの混合物を与えた後、細胞を、37℃、5%のCO2で24時間にわたって連続的に培養した。次に、トリプトンを、発現のための補助として細胞培養物に加えた。最後に、タンパク質の発現が完了した(96時間超)後、細胞上清を、抗体精製のために収集した。
細胞及び細胞残屑を、遠心分離(8000rpm)後に培養物から除去し、上清を、0.22μmフィルタに通してろ過した。清澄化された上清が、精製に使用される。精製プロセスを、クロマトグラフによって完了させた。上清が、まず、プロテインA/Gアフィニティーカラムを通って流れ、その間、抗体が、プロテインA/Gに結合され、カラムに残っていた。次に、抗体を、低pH(3.0以下)を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムから溶離した。低pH溶離剤を、1Mのトリス−HClで直ぐに中和した。次に、精製された抗体を、PBS又は他の緩衝系に対して透析した。
10mMのEDTAを含有するPBSを用いて、CHO−DHFR−hGIPR細胞を取り出し、管当たり105個の細胞を、1.5mLのEP管中に分配し、上清を、遠心分離後に除去した。陰性対照試料を、ローディングバッファー(PBS、2%のFBS)で再度懸濁させた。陽性対照については、特定の濃度の200μLのGIPR抗体溶液を、細胞に加え、室温でインキュベートし;インキュベーションの後、次に、細胞を、1500rpmで遠心分離して、上清を除去し、FACSローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を、1:50の希釈率でのFITC標識ヤギ抗マウス蛍光抗体又はPE標識ヤギ抗ヒト蛍光抗体の添加(200μL/ウェル)により再度懸濁させ、暗所で30分間にわたって室温でインキュベートした。上清を、遠心分離後に除去し、細胞を、FACSローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離し、FACS分析のためにローディングバッファーで再度懸濁させた。組み換え抗hGIPR機能性抗体は、GIPR発現CHO−DHFR−GIPR細胞に特異的に結合する。図1に示される実験結果において、灰色のピーク及び点線のピークは、陰性対照であり;1μMの抗体L10H8に対応する実線のピークは、著しい右への移動を示して、L10H8及びCHO−DHFR−GIPRの特異的結合を証明する。
ヒトGIPRを安定的に発現するCHO−DHFR細胞を、ウェル当たり30,000個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃、5%のCO2の培養器に一晩入れた。翌日、上清を除去し、45μL/ウェルのハイブリドーマ上清又は連続希釈された抗体を加えた。細胞を30分間にわたって室温にしておき、次に、GIPペプチドを、45μL/ウェルで加えた(Phoenix Pharmaceuticals、50pM)。次に、96ウェルプレートを、37℃、5%のCO2の培養器に30分間入れ、10μL/ウェルの10%のTriton X−100を加えて、細胞を室温で溶解させ、溶解物をピペットで均一に混合した。cAMPキット(CisBio)を用いて、実験において産生されたcAMPを検出した。10μL超/ウェルの細胞溶解物を、白色の384ウェルプレートに移し、5μL/ウェルの1:20で希釈されたcAMP−d2を加え、最後に、5μL/ウェルの1:20で希釈された抗cAMP−Eu3±クリプテートを加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。時間分解蛍光665nm/620nmシグナル比を、Envision 2103マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、Prism5.0を用いて、IC50値を計算した。図2は、L7H6が、IC50=7.6nMで、GIPRに拮抗することを示す。図3は、GLP−1−リンカー−L7H6が、IC50=14.9nMで、GIPRに拮抗することを示す。
hGLP1R及びCRE−ルシフェラーゼを共発現するCHO−DHFR−細胞を、ウェル当たり20000個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。細胞を無血清培地で2回洗浄し、残液を同様に除去した。次に、連続希釈された抗体又はGLP−1を含有する100μLの無血清培地を加え、37℃で4時間インキュベートした。刺激の後、100μLのBright Glo化学発光基質(Promega)を加えた。最後に、細胞溶解物を、白色の96ウェルプレートに移し、相対光度を、SpectraMax Lマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)において記録した。図4は、GLP−1−リンカー−L7H6が、EC50=0.04nMで、hGLP−1Rを活性化することを示す。
60%の高脂肪食誘導性C57BL/6マウス肥満モデル(DIOマウス)を確立した。マウスを購入し、1週間にわたって普通食を与えた後、通常のマウスの餌を与える正常対照群として一定数のマウスをランダムに選択し、残りの動物に高脂肪食を与えた。全ての動物に、8週間にわたって連続的に給餌し、体重及び食物摂取を週に1回評価した。その後、高脂肪食を与えられたマウスを、その体重に応じて、L10H8群(10mg/kg)及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、6週間にわたって2日ごとに皮下注入した。正常対照群は投与されず、モデル群は、同じ量のブランク製剤を与えられる。体重、食物摂取及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験の最終日に、12時間の絶食(水の摂取は自由)の後、血清を分離するために、動物の眼窩血液を採取し、次に、安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のALT、AST、GLU、TC及びTG、並びに肝臓中のTGを調べた(表3中の結果を参照)。
合計6匹のカニクイザル(3匹の雄及び3匹の雌)に、2mg/kgの用量でGLP−1/hGIPR抗体融合タンパク質の単回の皮下注入を与え、0.6mLの全血試料を、投与部位と同じ体側の前肢の静脈を介して、投与前(0分)、投与後2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、2日、4日、6日、8日、10日、12日、18日、28日の時点でそれぞれ採取し、氷上の遠心分離管に入れ、自然な凝固の後、次に、血液試料を遠心分離して、血清を分離し、使用するまで低温(−80℃)で貯蔵した。血清試料中のGLP−1/hGIPR抗体融合タンパク質のGLP−1部分及びhGIPR抗体部分を、ELISAによって別々に定量し、カニクイザルにおける両方の半減期を、ソフトウェア解析によって決定した。
60%の高脂肪食誘導性カニクイザルが、肥満カニクイザルモデル(DIOカニクイザル)を確立し、次に、皮下投与によるGLP−1−リンカー−L7H6のインビボ有効性を評価するために使用される。高脂肪食誘導性サルを、その体重に応じて、GLP−1−リンカー−L7H6(10mg/kg)群及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、合計8週間にわたって2日ごとに皮下注入し、モデル群に、等体積のブランク製剤を与えた。体重、食物摂取及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験が完了した後、動物を安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のALT、AST、GLU、TC及びTG、並びに肝臓中のTGを調べた。
Claims (39)
- 1、2、3、4、5又は6つのアミノ酸配列を含む、ヒトGIPRに特異的に結合する抗体であって、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;及び
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;及び
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26
から選択される、請求項1に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される、請求項1又は請求項2に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
b.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17から選択される、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30から選択される、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項1〜請求項7のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖可変ドメイン配列:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列;及び
b.重鎖可変ドメイン配列:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
から選択される、請求項1〜請求項9のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記ポリヌクレオチドコード配列が、1又は2つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列:
a.軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列;及び
b.重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、及び配列番号100;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される、請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項1〜請求項11のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号73、配列番号74、配列番号76、及び配列番号77から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項1〜請求項14のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、及び配列番号68及び配列番号77から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項1〜請求項15のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖定常アミノ酸配列:配列番号101及び配列番号102;及び
b.重鎖定常アミノ酸配列:配列番号103、配列番号104及び配列番号124
から選択される、請求項1〜請求項16のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、マウスGIPR抗体又はヒト化GIPR抗体である、請求項1〜請求項17のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、GIPRモノクローナル抗体である、請求項1〜請求項18のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である、請求項1〜請求項19のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)xフラグメント、ドメイン抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、又はIgG4抗体から選択される、請求項1〜請求項20のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトGIPのシグナル伝達を低減する際に、約1nM〜200nM又は1nM〜100nMのIC50を有する、請求項1〜請求項21のいずれか一項に記載の抗体。
- GLP−1融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体、及び1、2、3、4、5、6、7又は8つのGLP−1フラグメント又は逆GLP−1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、GLP−1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合するか、又は逆GLP−1フラグメントのアミノ末端を、前記GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合するという構造的特徴を有するGLP−1融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、GIPR抗体及び1、2、3又は4つのGLP−1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、GLP−1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、GIPR抗体及び1、2、3又は4つの逆GLP−1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、逆GLP−1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合する、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、GIPR抗体及び2つのGLP−1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、GLP−1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、GIPR抗体及び2つの逆GLP−1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、逆GLP−1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合する、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記GIPR抗体、GLP−1フラグメント及びペプチドリンカーが、以下の方法のうちの1つにおいて融合されて前記融合タンパク質を形成し:
ペプチドリンカーを介して、GLP−1フラグメントのカルボキシ末端が、GIPR抗体の軽鎖のアミノ末端に融合され:N’−GLP−1−リンカー−R−C’;
ペプチドリンカーを介して、GLP−1フラグメントのカルボキシ末端が、GIPR抗体の重鎖のアミノ末端に融合され:N’−GLP−1−リンカー−R−C’;
ここで:N’が、前記融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、C’が、前記融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、GLP−1が、GLP−1フラグメントを表し、Rが、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ポリペプチドリンカーを表す、請求項23に記載の融合タンパク質。 - 前記ペプチドリンカーが、配列番号110、配列番号111、及び配列番号112から独立して選択される、完全長、部分的、又は反復アミノ酸配列を含む、請求項23〜28のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質。
- 前記GLP−1フラグメントが、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、及び配列番号109から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか;又は前記逆GLP−1フラグメントが、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、及び配列番号123から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23〜29のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体、又は請求項23〜30のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項31に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項32に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 薬学的に許容できる担体と混合された、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項23〜30のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質を含む医薬組成物。
- 非アルコール性脂肪肝疾患を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項23〜29のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 2型糖尿病を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項23〜29のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 肥満及び肥満関連疾患を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項23〜29のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、又は2型糖尿病のうちの2つ以上の疾患を同時に予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項1〜22のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項23〜29のいずれか一項に記載のGLP−1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 前記医薬組成物が、静脈内に又は皮下に投与されるものである、請求項35〜38のいずれか一項に記載の使用。
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