CN110869394A - 工程改造的抗体化合物及其缀合物 - Google Patents

工程改造的抗体化合物及其缀合物 Download PDF

Info

Publication number
CN110869394A
CN110869394A CN201880038999.5A CN201880038999A CN110869394A CN 110869394 A CN110869394 A CN 110869394A CN 201880038999 A CN201880038999 A CN 201880038999A CN 110869394 A CN110869394 A CN 110869394A
Authority
CN
China
Prior art keywords
residue
antibody
domain
compound
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880038999.5A
Other languages
English (en)
Inventor
M.J.巴奇卡
丰意青
D.D.M.梁
M.D.林尼克
A.R.梅佐
J.T.帕克
P.V.特里维迪
F.A.瓦伦佐伊拉
徐江淮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of CN110869394A publication Critical patent/CN110869394A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了工程改造的抗体化合物及其缀合物，所述抗体化合物及其缀合物可用作癌症免疫疗法的药剂。

Description

工程改造的抗体化合物及其缀合物
本发明涉及新型抗体化合物及其使用方法。
抗体及其截短的片段可以与各种有效载荷(包括治疗性、细胞毒性和诊断性肽或其他小分子)缀合，用于体内和体外应用。可以使用在免疫球蛋白重链或轻链残基的表面上生成的游离半胱氨酸巯基作为反应性亲核试剂以经由各种接头与有效载荷形成稳定的化学键来合成抗体缀合物。然而，取决于反应条件，链间二硫键还原之后的常规巯基缀合导致异质抗体-药物缀合物混合物。甚至小心控制的反应将导致缀合物:抗体比率(CR)的分布。与具有较低CR的缀合物混合物相比，具有较高CR的缀合物混合物将展现不同的化学和生物物理特性。将有效载荷添加至抗体还可改变抗体的药理特性，包括潜在地影响靶标结合和Fc受体相互作用。因此期望获得具有缀合物:抗体比率的更一致和靶向的分布的缀合物。
为了实现有效载荷-缀合的抗体的更同质和靶向的分布，已将半胱氨酸残基工程改造至亲本mAb中，以便于经由巯基-缀合进行药物有效载荷的定点缀合。(例如，美国专利号7,521,541)。然而，将亲本表面氨基酸残基突变为半胱氨酸可以影响mAb的生物物理特性和表达。例如，工程改造的半胱氨酸残基可以破坏对于正确的蛋白折叠至关重要的天然的二硫化物。进一步，所得的未配对的半胱氨酸还可以形成分子间二硫化物，导致高阶聚集物。因此，仍然需要包含替代的工程改造的半胱氨酸残基的另外的IgG mAb。还仍然需要接合免疫系统的细胞的化合物中的此类抗体。
癌症免疫疗法利用人体的免疫系统来攻击癌细胞，并且是肿瘤药物发现和开发中的活跃领域。与基于使用杀肿瘤剂的疗法相反，该治疗方法代表范式转变为接合宿主的免疫系统以识别和破坏肿瘤细胞。两种成功的癌症免疫疗法策略是抑制免疫系统的阻遏以使得能够活化适应性和/或先天性免疫系统，尤其是肿瘤定向的细胞毒性T-细胞(即，免疫检查点阻断)，以及经设计以接合和/或增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体修饰。
最近已经用经设计以改变T-细胞表面受体(诸如PD-1和CTLA-4)和同源配体之间的相互作用的免疫检查点调节剂以导致T-细胞的活化和导致T-细胞介导的肿瘤细胞破坏的方式实现成功的临床结果。靶向PD-1(例如，尼沃单抗(Opdivo ®)和派姆单抗(Keytruda®))和CTLA-4(例如，伊匹单抗(Yervoy ®)的癌症免疫疗法已被FDA批准用于治疗癌症，诸如鳞状非小细胞肺癌和转移性黑色素瘤。
ADCC涉及抗体Fc结构域与位于免疫系统细胞(例如，自然杀伤细胞或“ NK”细胞)的表面上的受体(例如，Fcγ受体IIIa)的相互作用，导致溶细胞蛋白从免疫细胞释放并随后破坏被靶向的肿瘤细胞。展现ADCC的批准抗体疗法包括Rituxin ® (利妥昔单抗)、Arzerra®(奥法木单抗)、Herceptin ®(曲妥珠单抗)和Campath ® (阿伦单抗)。经由增强的Fc受体结合工程改造具有改善的ADCC活性的抗体的努力在这样的患者中是有效的，所述患者中，具有类似靶标特异性和较少ADCC活化的抗体在该疾病中无效或不再足够有效(例如，Gazyva ®(阿托珠单抗))。
尽管目前的癌症免疫疗法取得进展，但仍然需要在治疗癌症中接合免疫系统的替代方法。例如，对T-细胞定向的免疫疗法应答的患者的百分比不同，并且缺乏鉴定哪些患者将应答的可靠的预后测定法。此外，疗法诱导的自身免疫性疾病是与免疫检查点抑制剂疗法相关的严重副作用。用免疫检查点抑制剂的自身免疫性疾病的出现可能与其作用机制相关，因为它们被设计为去除对T-细胞库的抑制，使得肿瘤特异性T-细胞可以出现、增殖并被活化。因此，它们是相对非特异性的，并且这种缺乏特异性的一个后果是其允许自我反应性T-细胞破坏耐受性并诱导自身免疫性疾病，其在停止治疗后不一定是可逆的。增强的ADCC方法被设计为接合NK细胞用于肿瘤细胞杀伤。然而，NK细胞仅占血液中的总白细胞群体的约5%。
靶向先天免疫系统的多形核细胞(PMN)以接合肿瘤细胞杀伤代表癌症免疫疗法的替代方法。PMN占总白细胞群体的超过50%，并且是针对病原体(包括共生和外来细菌)的防御的主要防线。在先天免疫应答期间，由病原体呈递的病原体相关分子模式(PAMP)被位于免疫细胞(诸如嗜中性粒细胞)的表面上的模式识别受体(PRR)识别。一种此PRR是甲酰肽受体1 (FPR1)，即在嗜中性粒细胞表面上表达的膜结合的G蛋白偶联受体。FPR1检测具有N-甲酰甲硫氨酸的蛋白和多肽，包括细菌在感染后产生和释放的那些。嗜中性粒细胞的表面上的FPR1与含N-甲酰-甲硫氨酸的肽、尤其是呈递N-甲酰-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(此处为“ fMLF”)残基的那些的接合，触发嗜中性粒细胞向感染部位的运动/趋化性。甲酰肽对FPR1的活化还引发病原体杀伤机制，诸如脱粒以释放细胞毒性分子，产生活性氧物质和吞噬作用以破坏病原体。文献中存在与本发明有关的天然和非天然FPR-1激动剂的广泛描述(He HQ和Ye RD, Molecules. 2017 Mar 13;22(3). pii: E455. doi: 10.3390/molecules22030455; Hwang TL等人, Org Biomol Chem. 2013 Jun 14;11(22):3742-55.doi:10.1039/c3ob40215k; Cavicchioni G等人, Bioorg Chem. 2006 Oct;34(5):298-318; Higgins JD等人, J Med Chem. 1996 Mar 1;39(5):1013-5; Vergelli C等人,Drug Dev Res. 2017 Feb;78(1):49-62. doi: 10.1002/ddr.21370; Kirpotina LN等人,Mol Pharmacol. 2010 Feb;77(2):159-70. doi: 10.1124/mol.109.060673; CilibrizziA等人, J Med Chem. 2009 Aug 27;52(16):5044-57. doi: 10.1021/jm900592h.)。
利用fMLF生物缀合物(与肽缀合的抗体)以吸引巨噬细胞以杀死肿瘤细胞的先前努力遇到一些限制。Obrist和Sandberg使用碳二亚胺化学法将肽连接至游离赖氨酸来将fMLF与多克隆兔抗肿瘤抗体缀合。fMLF与多克隆抗体的这种非特异性缀合导致亲和力显著降低，fMLF促进巨噬细胞趋化性的功效降低100倍，和使用正常兔血清作为补体来源的抗体诱导来自预标记的肝癌细胞的补体依赖性51Cr释放的能力的明显减弱。(Obrist和Sandberg, Clin. Immun. Immunopathology, 25; 91-102 (1982))。这些数据与经由赖氨酸化学法向抗体非特异性添加fMLF可以降低抗原结合亲和力、FPR-1受体接合和Fc受体接合的可能性一致。
Obrist等人显示，用碳二亚胺化学法将fMLF与小鼠单克隆抗体偶联允许它们保留对人卵巢癌细胞的亲和力，尽管缀合确实降低对人外周血单核细胞的趋化应答。没有报道缀合对补体固定的影响。(Obrist等人, Int. J. Immunopharmac., 5(4); 307-314(1983))。当经由碳二亚胺化学法将fMLF直接缀合至黑色素瘤mAb 9.2.27时，也报道了类似的发现(保留的结合和受损的趋化性)(Obrist等人, Caner Immunol. Immunother., 32;406-08 (1991))。除了单核细胞和巨噬细胞以外，本发明的抗体缀合物化合物能够吸引和活化人嗜中性粒细胞，而现有文献观察结果几乎只针对单核细胞和巨噬细胞。这可以具有重要的治疗关联，因为嗜中性粒细胞代表人中的循环中的总白细胞群体的更高百分比，以比所有其他白细胞群体更高的速率产生，可以容易地迁移至组织中，并且当被活化时在消除靶细菌方面是非常有效的。
抗体-药物缀合的最常用方法是还原的链间二硫键的烷基化，赖氨酸残基的酰化和基因工程改造的半胱氨酸残基的烷基化。本发明考虑用于生成抗体缀合物的所有常用方法对于产生能够激动嗜中性粒细胞和先天免疫系统的细胞上的FPR-1的抗体缀合物将是有效的。
能够接合先天免疫系统的PMN嗜中性粒细胞以参与肿瘤细胞破坏的靶向肿瘤的治疗性抗体也可以提供相比于目前的癌症免疫疗法的优势。例如，这种治疗性抗体可以增强对肿瘤的T-细胞应答，并且可能不需要存在肿瘤特异性T-细胞来驱动肿瘤细胞杀伤。PMN嗜中性粒细胞对抗肿瘤活性的接合将取决于所有患者均会在嗜中性粒细胞上天然表达的FPR(例如，FPR1)的存在。进一步，能够在肿瘤细胞杀伤中接合PMN嗜中性粒细胞的药剂将受益于肿瘤杀伤细胞的稳定、持续供应，因为据估计每天产生1x1011个嗜中性粒细胞。能够在肿瘤细胞杀伤中接合嗜中性粒细胞的肿瘤靶向抗体可以具有相比于免疫检查点调节剂的安全优势。与检查点调节剂不同，嗜中性粒细胞靶向疗法不会诱导或要求免疫细胞的增殖，因为循环嗜中性粒细胞是短寿命的。另外，当嗜中性粒细胞用附着的抗体杀死靶肿瘤细胞时，消除了靶向肿瘤的抗体，提供了减少免疫刺激的负反馈环，因为治疗性抗体被靶效应细胞消耗。
能够接合肿瘤细胞中的FPR-1阳性先天免疫细胞的靶向肿瘤的治疗性抗体可能证明有用的另一种方法是治疗具有低突变负荷且因此不易被免疫系统识别的冷肿瘤。吸引和活化嗜中性粒细胞介导的肿瘤细胞杀伤可以导致在富含细胞因子的环境中局部产生新抗原，使得适应性免疫系统的细胞获得识别肿瘤并靶向其用于消除的能力。
能够在肿瘤细胞杀伤中接合嗜中性粒细胞的靶向肿瘤的抗体也可以具有相对于基于毒性剂的抗体药物缀合物(ADC)的优势，所述基于毒性剂的抗体药物缀合物(ADC)通常被设计为在内化进入肿瘤细胞后释放毒性有效载荷。像ADC一样，能够在肿瘤细胞杀伤中接合嗜中性粒细胞的肿瘤靶向抗体应识别在肿瘤细胞上具有高表达、在正常组织上具有低表达的抗原，然而，与ADC不同，能够在肿瘤细胞杀伤中接合嗜中性粒细胞的肿瘤靶向抗体需要激动剂暴露于先天免疫系统的表面上的受体，且因此预期其与具有相对较小内化潜力的靶抗原一起更好地发挥功能。
尽管可以通过还原链间二硫键以生成反应性巯基或利用表面赖氨酸用于缀合来产生缀合的抗体，但此类常规的缀合方法可以因此导致抗体的不稳定或结合亲和力的丧失。因此，本发明提供了在工程改造的半胱氨酸残基处具有N-甲酰-甲硫氨酸肽-缀合物的位点特异性添加的抗体肽缀合物，其提供了以下优点中的一种或多种：(i)位点特异性添加允许均质缀合概况，其决定N-甲酰-甲硫氨酸肽生物缀合物的功效和最大效力，(ii)间隔物可用于保留N-甲酰-甲硫氨酸肽当与抗体缀合时用于人嗜中性粒细胞的迁移和活化的功效，并在人嗜中性粒细胞迁移测定中增加N-甲酰甲硫氨酸肽的体外功效，(iii)位点特异性添加保留IgG1构建体中的Fc-受体相互作用，其可促成肿瘤细胞杀伤，(iv)位点特异性添加允许抗体保留抗原结合亲和力，其在一些、但不是全部先前文献实例中实现，和(v)位点特异性缀合维持抗体的稳定性，其可以是原料药的生产和药品的稳定性中的重要优势。
本发明还提供了包含工程改造的半胱氨酸残基的IgG抗体，其用于生成抗体缀合物化合物(也称为生物缀合物)。更具体地，本发明提供了治疗化合物，其包含含有工程改造的半胱氨酸残基、与能够活化先天免疫系统的细胞上的FPR-1的肽或肽模拟物缀合的肿瘤靶向抗体。在一个实施方案中，抗体与能够激动FPR-1的肽或肽模拟物缀合。在一些具体实施方案中，所述肽或肽模拟物是下式之一的化合物：
式I. R-P1-P2-P3-NH(CH2CH2O) nCH2CH2-Y
其中
R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
P1是Met或Nle；
P2是肽或肽模拟物；
P3是具有ε氨基酰化的赖氨酸；
n是6-24的整数；
Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸(maleimide-diaminopropionic)、碘乙酰胺或乙烯基砜；
或其盐。
式II. R-P1-P2-NH(CH2CH2O) nCH2CH2-P3-Y
其中
R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
P1是Met或Nle；
P2是肽或肽模拟物；
P3是具有ε氨基酰化的赖氨酸；
n是6-24的整数；
Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
或其盐。
式III. R-Met-X1-X2-X3-X4-NH(CH2CH2O)nCH2CH2--X5-Y
其中
R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
R1是苯基、4-氯苯基、4-甲氧基苯基、对甲苯基、间甲苯基、芳基、取代的芳基或2-烯丙基；
X1是Leu、Ile、Nle、二乙基甘氨酸或二丙基甘氨酸；
X2是Phe、α-Me-Phe、DPhe、4-F-Phe、2-Nal或1-Nal；
X3是Glu、Leu、Nle、α-Me-Leu、DLeu或不存在；
X4是Glu、DGlu、γGlu、Gla或不存在；
X5是C2-C10二氨基烷基(diaminoakyl)；且
Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
或其盐。
在一些其他具体实施方案中，所述肽是下式之一的化合物：
式IV. [R-P1-P2-NH(CH2CH2O)n CH2CH2-]2-Q-X-Y
其中
R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
P1是Met或Nle；
P2是肽或肽模拟物；
n是6-24的整数；
Q是能够在α氨基处和侧链氨基处被酰化的氨基双官能残基；
X是C2-C10二氨基烷基；且
Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
或其盐。
式V. [[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2-]4-(Q)2-Q-X-Y
其中
R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
P1是Met或Nle；
P2是肽或肽模拟物；
n是6-24的整数；
Q是能够在α氨基处和侧链氨基处被酰化的氨基双官能残基；
X是C2-C10二氨基烷基；且
Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
或其盐。
式VI. [[[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2-]8-(Q)4-(Q)2-Q-X-Y
其中
R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
P1是Met或Nle；
P2是肽或肽模拟物；
n是6-24的整数；
Q是能够在α氨基处和侧链氨基处被酰化的氨基双官能残基；
X是C2-C10二氨基烷基；且
Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
或其盐。
式IV-VI的化合物包含经由氨基双官能残基(由“ Q”代表)连接在一起的两个或更多个化学引诱物。在一些实施方案中，Q是Lys、Orn，Dap或Dab。在一个优选实施方案中，所述双官能残基是赖氨酸或鸟氨酸残基。所述双官能残基可以通过每个氨基连接至两个额外的氨基双官能残基，由此将化学引诱物的数目增加至四个化学引诱物。额外的双官能残基允许额外数目的化学引诱物。在一个优选实施方案中，化学引诱物的数目不大于八。例如，如果Q2是赖氨酸分支残基的重复，则结构如下：
Figure 392986DEST_PATH_IMAGE001
本发明提供了式I-VI中任一者的化合物，其中P2由X1-X2-X3-X4给出，且
X1是Leu、Ile、Nle、二乙基甘氨酸或二丙基甘氨酸；
X2是Phe、α-Me-Phe、DPhe、4-F-Phe、2-Nal或1-Nal；
X3是Glu、Leu、Nle、α-Me-Leu、DLeu或不存在；且
X4是Glu、DGlu、γGlu、Gla或不存在。
在一些实施方案中，式I、II、III、IV、V或VI中任一者的化合物能够激动甲酰肽受体1并与蛋白形成共价键。在一些实施方案中，式I、II、III、IV、V或VI中任一者的化合物经由接头与抗体缀合。在一些具体实施方案中，所述化合物经由如本文所述的马来酰亚胺-PEG接头缀合。在一些具体实施方案中，PEG接头与X的二氨基烷基键合。在一些具体实施方案中，不存在PEG接头，且式I、II、III、IV、V或VI中任一者的化合物与X的二氨基烷基直接键合。在一些此类实施方案中，衍生自式I、II、III、IV、V或VI中任一者的化合物能够活化先天免疫细胞、诸如嗜中性粒细胞的表面上的甲酰肽受体。
本发明的实施方案在非肿瘤环境中也可用于使先天免疫细胞参与特异性消除具有超过癌症疗法的效用的目标靶细胞。在其中期望消除正常细胞的情况下，例如在肥大性组织、进入受限的组织或病毒感染的细胞中，特异性靶向目标细胞且也能够活化先天免疫系统的细胞以提供靶向细胞杀伤的抗体对于消除那些靶组织或受感染的细胞将是有用的。
本发明考虑将FPR-1激动剂连接至工程改造的半胱氨酸残基的一系列接头(Yao等人, Int J Mol Sci. 2016 Feb 2;17(2). pii: E194. doi: 10.3390/ijms17020194)。提供的实例包括基于马来酰亚胺的接头以与半胱氨酸形成硫醚连接。还可以使用另一种接头、诸如卤代乙酰基接头的使用来缀合抗体。
因此，本发明提供了包含IgG重链和轻链恒定区的抗体，其中所述恒定区包含至少一个半胱氨酸。在一个实施方案中，所述恒定区在表面上包含未配对的游离半胱氨酸。在另一个实施方案中，所述恒定区包含工程改造的半胱氨酸。在一些具体实施方案中，所述恒定区在以下残基之一处包含至少一个工程改造的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH2结构域中的残基262，CH3结构域中的残基375，CH3结构域中的残基373，CH3结构域中的残基397，CH3结构域中的残基415，Cκ结构域中的残基156，Cκ结构域中的残基171，Cκ结构域中的残基191，Cκ结构域中的残基193，Cκ结构域中的残基202，或Cκ结构域中的残基208。
本发明还提供了包含IgG重链恒定区的抗体，其中所述恒定区包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，和CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。作为一个具体实施方案，所述IgG重链恒定区是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。甚至更具体地，所述IgG重链恒定区是人IgG1、人IgG2或人IgG4同种型，和甚至更具体地，人IgG1或人IgG4。作为一个甚至更具体实施方案，所述IgG重链恒定区是人IgG1同种型，且由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列且甚至更具体地SEQ IDNO:20、21或53的氨基酸序列给出。作为包含人IgG1重链恒定区的上述抗体的一个甚至进一步的具体实施方案，所述恒定区进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。在另一个实施方案中，所述恒定区包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和在残基332处取代的谷氨酸。作为一个替代具体实施方案，所述IgG重链恒定区是人IgG4同种型，且由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列且甚至更具体地SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出。作为包含人IgG4重链恒定区的上述抗体的一个甚至进一步的具体实施方案，所述恒定区进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸。
本发明进一步提供了包含两个重链IgG恒定区的抗体，其中每个IgG恒定区包含至少一个半胱氨酸。在一个实施方案中，每个IgG恒定区包含以下残基之一处的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH3结构域中的残基375，和CH3结构域中的残基378。本发明还提供了包含两个重链IgG恒定区的上述抗体中的任一种，其中每个IgG恒定区包含每条重链的CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，和CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。更具体地，每个IgG恒定区是人、小鼠、大鼠或兔IgG，且甚至更具体地，人IgG1、人IgG2或人IgG4同种型，且甚至更具体地，人IgG1或人IgG4。作为一个甚至更具体实施方案，每个IgG重链恒定区是人IgG1同种型，且由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列且甚至更具体地SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出。作为包含两个人IgG1重链恒定区的上述抗体的一个甚至进一步的具体实施方案，所述恒定区进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。在另一个实施方案中，所述恒定区包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和在残基332处取代的谷氨酸。作为一个替代具体实施方案，每个IgG重链恒定区是人IgG4同种型，且由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列且甚至更具体地SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出。作为包含两个人IgG4重链恒定区的上述抗体的一个甚至进一步的具体实施方案，所述恒定区进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸。
本发明进一步提供了上述抗体中的任一种，其中CH1结构域中的残基124、CH1结构域中的残基157、CH1结构域中的残基162、CH2结构域中的残基262、CH3结构域中的残基375、CH3结构域中的残基373、CH3结构域中的残基397、CH3结构域中的残基415、Cκ结构域中的残基156、Cκ结构域中的残基171、Cκ结构域中的残基191、Cκ结构域中的残基193、Cκ结构域中的残基202或Cκ结构域中的残基208处的每个半胱氨酸与化学引诱物缀合。在一个实施方案中，所述化学引诱物是f-Met肽、小分子FPR-1激动剂、PRR激动剂、肽模拟物、N-脲基-肽或细菌糖。在一个具体实施方案中，所述化学引诱物是N-甲酰-甲硫氨酸肽。在一些实施方案中，所述化学引诱物经由马来酰亚胺接头缀合至抗体半胱氨酸，其中所述接头通过马来酰亚胺官能团和半胱氨酸(位于CH1结构域中的残基124、CH1结构域中的残基157、CH1结构域中的残基162、CH2结构域中的残基262、CH3结构域中的残基375、CH3结构域中的残基373、CH3结构域中的残基397、CH3结构域中的残基415、Cκ结构域中的残基156、Cκ结构域中的残基171、Cκ结构域中的残基191、Cκ结构域中的残基193、Cκ结构域中的残基202或Cκ结构域中的残基208处)之间的硫醚键形成与所述IgG重链和轻链恒定区的共价附接并且通过与所述N-甲酰-甲硫氨酸肽的C-末端赖氨酸的ε氨基侧链的酰胺键形成与所述N-甲酰-甲硫氨酸肽的共价附接。在一个实施方案中，本发明提供了上述抗体中的任一种，其中本文中提及的每个半胱氨酸经由马来酰亚胺接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽，其中所述接头通过马来酰亚胺官能团和半胱氨酸之间的硫醚键形成与所述IgG重链恒定区的共价附接，并且还通过与所述N-甲酰-甲硫氨酸肽的C-末端赖氨酸的ε氨基侧链的酰胺键形成与所述N-甲酰-甲硫氨酸肽的共价附接。作为一个具体实施方案，本发明进一步提供了包含两个重链IgG恒定区的抗体化合物，其中每个IgG恒定区包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，和CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸，其中每个CH1结构域的残基124处的每个半胱氨酸，和CH1结构域中的残基157或162、每个CH3结构域的残基375或378处的每个半胱氨酸，经由马来酰亚胺接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽，其中所述接头通过马来酰亚胺官能团和每个IgG恒定区的残基124、157或162和375或378处的半胱氨酸之间的硫醚键共价附接至所述抗体，并且通过与所述N-甲酰-甲硫氨酸肽的C-末端赖氨酸的ε氨基侧链的酰胺键共价附接至所述N-甲酰-甲硫氨酸肽。更具体地，对于上述缀合的抗体，所述马来酰亚胺接头具有下式：
Figure 247810DEST_PATH_IMAGE002
其中n = 1-24，更具体地n = 6-24，且甚至更具体地n = 12。甚至更具体地，所述N-甲酰-甲硫氨酸肽是N-甲酰-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-X (SEQ ID NO:22)，其中X是通过形成与马来酰亚胺接头的酰胺键而修饰的赖氨酸。仍更具体地，所述缀合的抗体化合物的每个IgG恒定区是人IgG1或人IgG4同种型，且甚至更具体地，每个IgG重链恒定区是人IgG1同种型，并且进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺，或每个IgG重链恒定区是人IgG4同种型，并且进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸。
可以将本发明的工程改造的半胱氨酸残基并入现有的癌症治疗性抗体的IgG恒定区中，以便于生成替代的N-甲酰-甲硫氨酸肽缀合的免疫治疗剂。或者，可以将现有的癌症治疗性抗体的重链CDR或可变结构域与含有本发明的工程改造的半胱氨酸残基的IgG恒定区组合以生成缀合的免疫治疗剂。用于这些应用的示例性癌症疗法包括靶向实体瘤、包括表达HER-2的肿瘤(即IgG1抗体、诸如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)、液体肿瘤、包括表达CD20的液体肿瘤(即IgG1和IgG1增强的ADCC抗体、诸如利妥昔单抗、奥法木单抗、阿托珠单抗和AME133v)的IgG1治疗性抗体和靶向表达c-Met的肿瘤的抗体(即依米妥珠单抗(Emibetuzumab))。
如本文所公开的N-甲酰甲硫氨酸肽缀合的抗体还可以充当进一步缀合细胞毒性剂以实现更大效力的平台，或者充当靶向癌细胞中过表达的抗原的抗体药物缀合物中的药物缀合物的替代物。具有示例性抗体药物缀合物的靶抗原包括但不限于GPNMB (格伦巴单抗vedotin)，CD56 (洛妥珠单抗美登素(IMGN-901))，TACSTD2 (TROP2; sacituzumabgovitecan, (IMMU-132))，CEACAM5 (拉贝妥单抗SN-38)，叶酸受体-α (mirvetuximabsoravtansine (IMGN-853), vintafolide)，粘蛋白1 (sialoglycotope CA6; SAR-566658) STEAP1 (vandortuzumab vedotin (RG-7450))，间皮素(DMOT4039A, anetumabravtensine (BAY-94–9343), BMS-986148)，连接蛋白4 (enfortumab vedotin (ASG-22M6E); ASC-22CE)，ENPP3 (AGS-16M8F)，鸟苷酸环化酶C (indusatumab vedotin (MLN-0264))，SLC44A4 (ASG-5ME)，NaPi2b,(lifastuzumab vedotin)，CD70 (TNFSF7;DNIB0600A, AMG-172, MDX-1243, vorsetuzumab mafodotin (SGN-75))，CA9碳酸酐酶(BAY79–4620)，5T4 (TPBG; PF 06263507)，SLTRK6 (ASG-15ME)，SC-16 (抗Fyn3;SC16LD6.5)，组织因子(HuMax-TF-ADC (TF-011-MMAE))，LIV-1 (ZIP6; SGN-LIV1A)，P-钙粘蛋白 (PCA062)，PSMA (MLN2704, PSMA-ADC)，纤连蛋白超结构域B(人mAb L19和F8)，内皮素受体ETB (RG-7636)，VEGFR2 (CD309；抗VEGFR-2ScFv-As2O3-隐匿纳米颗粒)，腱生蛋白c (抗TnC-A1抗体SIP(F16))，骨膜蛋白(抗骨膜蛋白抗体)，DLL3 (罗伐普单抗soravtansine)，HER 2 (T-DM1、ARX788、SYD985)，EGFR (ABT-414、IMGN289 AMG-595)，CD30(本妥昔单抗vedotin，iratumumab MDX-060)，CD22 (依诺珠单抗ozogamicin (CMC-544)，吡那珠单抗vedotin，依帕珠单抗SN38)，CD79b (polatuzumab vedotin), CD19(coltuximab ravtansine、SAR-3419、SGN-CD19A)，CD138 (indatuximab ravtansine)，CD74 (milatuzumab doxorubicin)，CD37 (IMGN-529)，CD33 (吉妥珠单抗ozogamicin、IMGN779、SGN CD33 A)和CD98 (IGN523)。(参见例如，Thomas等人, Lancet Oncol. 2016Jun;17(6)e254-62以及Diamantis和Banerji, Brit. Journ. Cancer, 2016; 114, 362-367)。
因此，本发明进一步提供了包含上述癌症治疗性抗体中的任一种的重链和轻链CDR的IgG抗体，其中每个IgG恒定区包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，和CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。进一步，本发明提供了上述半胱氨酸工程改造的抗体中的任一种，其中每个IgG恒定区的残基124处的每个半胱氨酸，和每个IgG恒定区的残基157、162、375或378处的每个半胱氨酸，经由马来酰亚胺-PEG接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽，全部如本文所述。
本发明提供了化合物，其为含有至少一个任选地通过接头与化学引诱物缀合的半胱氨酸的抗体，所述化学引诱物能够吸引和/或活化免疫系统的一种或多种细胞，且其中药剂在抗体内的一个或多个半胱氨酸残基处缀合至抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含IgG重链恒定区，其中所述恒定区包含以下残基中的至少一个处的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH2结构域中的残基262，CH3结构域中的残基375，CH3结构域中的残基373，CH3结构域中的残基397，CH3结构域中的残基415，Cκ结构域中的残基156，Cκ结构域中的残基171，Cκ结构域中的残基191，Cκ结构域中的残基193，Cκ结构域中的残基202，或Cκ结构域中的残基208。在一些实施方案中，所述半胱氨酸是工程改造的半胱氨酸。在进一步实施方案中，每条重链和/或轻链上的工程改造的半胱氨酸的数目在1和3之间。在其他实施方案中，所述抗体通过接头缀合至化学引诱物。在一些实施方案中，所述接头是马来酰亚胺-PEG接头或Mal-Dap接头。在其他实施方案中，所述化学引诱物是f-Met肽、小分子FPR-1激动剂、PRR激动剂、肽模拟物、N-脲基-肽或细菌糖。
本发明提供了化合物，其为含有至少一个任选地通过接头与化学引诱物缀合的半胱氨酸的抗体，所述化学引诱物能够吸引和/或活化免疫系统的一种或多种细胞，且其中药剂在抗体内的一个或多个半胱氨酸残基处缀合至抗体，且其中所述化学引诱物是如本文所述的式I、式II、式III、式IV、式V或式VI中的任一者的化合物。在一些实施方案中，所述化合物能够吸引和活化免疫系统的一种或多种细胞。在一些具体实施方案中，所述化合物能够吸引和活化先天免疫系统的一种或多种细胞。在一个优选实施方案中，存在接头。
此外，本发明还提供了抗体、其IgG重链恒定区及其N-甲酰甲硫氨酸肽-缀合物中的任一种，其各自如本文具体例举。作为一个进一步实施方案，本发明提供了呈“分离的”形式的抗体、IgG重链恒定区、缀合的抗体或编码其中之一的核酸中的任一种。如本文所用，术语“分离的”是指不含或基本上不含在细胞环境中发现的其他大分子物质的蛋白、多肽或核酸。
本发明进一步提供了药物组合物，其包含如本文所述的任何N-甲酰甲硫氨酸肽缀合的抗体和药学上可接受的载体或赋形剂。此外，本发明进一步提供了治疗实体癌、包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨间皮癌、血管癌和纤维状癌以及相关的转移以及液体肿瘤、包括白血病和淋巴瘤的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的N-甲酰-甲硫氨酸肽缀合的抗体或其药物组合物，其各自如本文所述。进一步，本发明进一步提供了如本文所述的N-甲酰-甲硫氨酸肽-缀合的抗体中的任一种及其药物组合物，其用于疗法中。具体而言，本发明提供了如本文所述的N-甲酰-甲硫氨酸肽-缀合的抗体中的任一种及其药物组合物，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨间皮癌、血管癌和纤维状癌、白血病和淋巴瘤。作为本文的方法、用途和组合物的一个具体实施方案，N-甲酰化的甲硫氨酸肽是N-甲酰基-Met-Leu-Phe-Lys-OH。
定义：
“ IgG抗体”的一般结构是众所周知的。IgG型的野生型(WT)抗体是经由链内和链间二硫键交联的四条多肽链(两条相同的“重链”和两条相同的“轻链”)的异四聚体。每条重链(HC)由N-末端重链可变区(“VH”)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)以及CH1和CH2结构域之间的铰链区(“铰链”)构成。每条轻链(LC)由N-末端轻链可变区(“VL”)和轻链恒定区(“CL”)构成。VL和CL区域可以是kappa (“κ”)或lambda (“λ”)同种型(分别为“Cκ”或“Cλ”)的。每条重链经由重链和轻链可变结构域之间的界面(VH/VL界面)以及重链恒定CH1和轻链恒定结构域之间的界面(CH1/ CL界面)与一条轻链缔合。VH - CH1和VL – CL区段之间的缔合形成两个相同的抗原结合片段(Fab)，其指导抗体与相同的抗原靶标或表位结合。每条重链经由每条重链的铰链-CH2-CH3区段之间的界面与另一条重链缔合，其中两个CH2-CH3区段之间的缔合形成抗体的Fc区域。每个Fab和Fc一起形成IgG抗体的特征性“ Y-形”结构，其中每个Fab代表“ Y”的“臂”。IgG抗体可以进一步分为亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其区别在于铰链区的长度、链间和链内二硫键的数目和位置以及各自HC恒定区的氨基酸序列。
每个重链-轻链对的可变区缔合以形成结合位点。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)可细分为高变区，称为互补决定区(“CDRs”)，其散布有更保守的区域，称为构架区(“FR”)。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。重链的CDR可以被称为“ CDRH1、CDRH2和CDRH3”，且轻链的3个CDR可以被称为“ CDRL1、CDRL2和CDRL3”。重链的FR可以被称为HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，而轻链的FR可以被称为LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。所述CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。
本发明的化合物和方法在重链多肽的恒定区的特定残基处包含设计的氨基酸修饰。如本领域普通技术人员将理解，可以采用各种编号惯例来指定IgG恒定和可变区序列内的特定氨基酸残基。常用的编号约惯例包括“ Kabat编号”和“ EU索引编号”系统。如本文所用的 “ Kabat编号”或“ Kabat编号系统”是指在Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)中的作者设计和阐述的用于指定抗体重链和轻链的可变和恒定结构域两者中的氨基酸残基的编号系统。如本文所用的“ EU索引编号”或“ EU索引编号系统”是指用于指定抗体重链恒定结构域中的氨基酸残基的编号惯例，并且也阐述于Kabat等人(1991)中。包括针对可变结构域的校正或替代编号系统的其他惯例包括Chothia(Chothia C, Lesk AM (1987), J Mol Biol 196: 901–917; Chothia, 等人 (1989),Nature 342: 877–883)、IMGT (Lefranc, 等人 (2003), Dev Comp Immunol 27: 55–77)和AHo (Honegger A, Pluckthun A (2001) J Mol Biol 309: 657–670)。除非本文另有明确阐明，否则在说明书、实施例和权利要求中出现的对免疫球蛋白重链恒定区CH1、铰链、CH2和CH3氨基酸残基的所有引用(即编号)均基于EU索引编号系统。在知道根据EU索引编号的残基编号的情况下，根据任何常用的编号惯例，本领域普通技术人员可以应用本领域的教导来鉴定本发明内的氨基酸序列修饰。注意，尽管本发明的说明书、实施例和权利要求采用EU索引编号来标识特定氨基酸残基，但应理解，如由Patent In Version 3.5生成的本申请所附的实施例和序列表中出现的SEQ ID NO提供了给定多肽内的氨基酸的序列编号，且因此与如EU索引编号提供的相应氨基酸残基编号不一致。
当从左至右读取时，如本文所述的多肽链通过它们从N-末端至C-末端的氨基酸序列来描绘，其中每个氨基酸由其单字母或三字母氨基酸缩写代表。除非在本文另有阐述，否则用于制备本发明的多肽的所有氨基酸都是L-氨基酸。氨基酸或多肽链的“N-末端”(或氨基末端)是指氨基酸上的游离氨基或多肽链的第一个氨基酸残基上的游离氨基。进一步，术语“ N-末端氨基酸”是指多肽链中的第一个氨基酸。同样，氨基酸或多肽链的“C-末端”(或羧基末端)是指氨基酸上的游离羧基或多肽链的最后一个氨基酸残基上的游离羧基。进一步，术语“ C-末端氨基酸”是指多肽链中的最后一个氨基酸。
如本文所用，参考重链或轻链多肽的短语“在残基...处被取代的...[氨基酸名称]”是指用所示氨基酸取代亲本氨基酸。通过举例的方式，包含“在残基235处被取代的丙氨酸”的重链是指这样的重链，其中亲本氨基酸序列已被突变为在残基号235处含有丙氨酸代替亲本氨基酸。此类突变也可以通过表示特定氨基酸残基编号来代表，之前为亲本氨基酸，且随后为替代氨基酸。例如，“ F235A”是指用丙氨酸替代残基235处的苯丙氨酸。类似地，“ 235A”是指用丙氨酸替代亲本氨基酸。“工程改造的”半胱氨酸是指用半胱氨酸替代亲本氨基酸。
如本文所用，“ N-甲酰-甲硫氨酸肽”是指长度为4-10个氨基酸的肽，其中N-末端氨基酸是甲酰化的甲硫氨酸，且C-末端氨基酸是赖氨酸。特定的N-甲酰-甲硫氨酸肽是肽N-甲酰-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-OH (“fMLFK;” SEQ ID NO:23)。
如本文所用，“接头”是指连接两个或更多个额外结构的结构。接头的实例包括肽接头、蛋白接头和PEG接头。如本文所用的“马来酰亚胺-PEG接头”是指包含式“-(O-CH2-CH2)n-”(其中“ n”是6-24)的聚乙二醇(PEG)聚合物和衍生的马来酰亚胺官能团的化学部分，其中所述接头通过马来酰亚胺官能团和重链恒定区中的半胱氨酸残基之间的硫醚键形成与IgG抗体重链的共价附接，并且还通过与所述N-甲酰-甲硫氨酸肽的C-末端赖氨酸的ε氨基侧链的酰胺键形成与N-甲酰-甲硫氨酸肽的共价附接。作为一个具体实施方案，本发明的化合物的马来酰亚胺-PEG接头具有以下结构，其中虚线代表与IgG抗体重链和N-甲酰-甲硫氨酸肽的共价附接的位置：
Figure 27547DEST_PATH_IMAGE003
其中，“n” = 6 – 24，且更具体地“n” = 12。
在本情况下，用于制备以下实施例中采用的测试化合物的试剂(Mal-dPEG12-OH(QuantaBiodesign 目录号10285, 批次IH1-A1240-80))是单分散试剂，意味着其含有离散数目的乙基-氧基单体(O-CH2-CH2)单元。同样，使用该试剂将产生缀合的抗体化合物，其含有具有n = 12 (O-CH2-CH2)单元的马来酰亚胺-PEGn接头。
然而，如本领域技术人员将理解，经常通过提及试剂中含PEG的化合物的PEG聚合物部分的分子量(以道尔顿或千道尔顿计)来描述聚乙二醇化试剂。此外，许多市售的含PEG的试剂通常具有一定程度的多分散性，意味着试剂内含有的重复乙二醇单体单元的数目(“ n”)在一定范围内变化，通常在狭窄范围内变化。因此，对多分散试剂中的PEG聚合物分子量的提及通常是对试剂内含有的PEG聚合物的平均分子量的提及。用于制备本发明的缀合的抗体化合物的试剂的乙基-氧基单体(O-CH2-CH2)具有约44 g/mol或44道尔顿的分子量。因此，当使用由其平均分子量表示的多分散聚乙二醇化试剂时，本领域技术人员可以容易地确定“ n”的值，以及同样地，在所得的缀合抗体化合物中的“ n”的值。
如短语“ R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基”中所用的术语“取代的”在本文中例如表示可能存在一个或多个取代基，所述取代基选自这样的原子和基团，当存在于式II、式III、式IV、式V或式VI的化合物中时，所述原子和基团不阻止该化合物作为化学引诱物发挥功能。可以存在于取代的C5-C10芳基中的取代基的实例包括羟基、卤化物(I、Cl、F、Br)、烷氧基(MeO-、EtO-、PrO或C1-C4)或烷基(Me-、Et-、Pr或C1-C4)，其共价连接至芳基结构。
术语二氨基烷基由结构-NH(CH2)nNH-(其中n = 2- 10)给出。
甲酰基由与氢键合的羰基组成，并且由以下结构给出：CH(=O)，或者
Figure 422756DEST_PATH_IMAGE004
马来酰亚胺-二氨基丙酸经由与游离胺的酰胺键与Y偶联，并且是指结构：
Figure 424079DEST_PATH_IMAGE005
马来酰亚胺经由与游离胺的酰胺键与Y偶联，并且是指由以下结构给出的3-马来酰亚胺丙酸：
Figure 246542DEST_PATH_IMAGE006
如本文所用，术语“有需要的患者”是指人或非人哺乳动物，并且更优选地是人类，其已被诊断为具有适合用本发明的化合物的治疗或施用的病况或病症。
如本文所用，术语“有效量”是指本发明的缀合的抗体化合物的量或剂量，其在向患者单个或多个剂量施用后，在患者中提供期望的药理作用。有效量可以由作为本领域技术人员的主治诊断专家通过考虑许多因素来容易地确定，所述因素诸如哺乳动物的物种；其大小、年龄和总体健康；涉及的特定疾病或手术程序；疾病或弊病的程度或严重程度；个体患者的应答；施用的特定化合物或组合物；施用模式；施用的制备物的生物利用度特征；选择的剂量方案；以及任何伴随药物的使用。
可以使用本领域中众所周知的技术，诸如在哺乳动物或酵母细胞中的重组表达，来产生用于本发明中的半胱氨酸-工程改造的IgG抗体。具体而言，可以容易地采用本文实施例的方法和程序。另外，本发明的IgG抗体可以进一步工程改造以包含衍生自完全人框架的框架区。各种不同的人框架序列可以用于实施本发明的实施方案。作为一个具体实施方案，本发明的IgG抗体中采用的框架区是人来源的或基本上是人的(人来源的至少95%、97%或99%)。人来源的框架区的序列是本领域中已知的，并且可以获得自The Immunoglobulin Factsbook, Marie-Paule Lefranc, Gerard Lefranc, Academic Press 2001, ISBN012441351。
能够指导与其可操作连接的基因的表达的表达载体是本领域中众所周知的。表达载体含有适当的控制序列，诸如启动子序列和复制起始位点。它们还可以编码合适的选择标记以及促进从宿主细胞分泌期望的多肽产物的信号肽。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。编码期望多肽、例如本发明的缀合的IgG抗体的HC和LC组分的核酸，可以使用在单一载体中与其可操作地连接的不同启动子独立地表达，或者，可替代地，编码期望的产物的核酸可以使用在分开的载体中与其可操作连接的不同启动子独立表达。可以使用标准方法来制备编码本发明的半胱氨酸-工程改造的IgG抗体的HC和LC组分两者的单一表达载体。
如本文所用，“宿主细胞”是指用编码一种或多种期望的多肽产物的核苷酸序列稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。可以使用本领域中已知的标准技术来完成产生用于本发明中的IgG抗体的宿主细胞系的产生和分离。哺乳动物细胞是用于表达根据本发明的半胱氨酸-工程改造的IgG抗体的优选宿主细胞。特定的哺乳动物细胞包括HEK293、NS0、DG-44和CHO细胞。优选地，组装的蛋白被分泌至其中培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基可以回收和分离蛋白。可以通过常规技术纯化其中已分泌蛋白的培养基。例如，可以使用常规方法将培养基应用至蛋白A或G柱或从蛋白A或G柱洗脱。可溶性聚集物和多聚体可以通过常规技术(包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换、羟基磷灰石或混合模式色谱)有效去除。回收的产物可以立即冷冻，例如在-70℃下冷冻，或者可以冻干。如本领域技术人员将理解，当在某些生物系统(例如哺乳动物细胞系)中表达时，抗体在Fc区中糖基化，除非在Fc中引入突变以减少糖基化。另外，抗体同样可以在其他位置处糖基化。
如本文所用，“细菌糖”是指细菌的外表面处的多糖。细菌糖的一个实例是角叉菜胶。
如本文所用，“模拟物”是指功能类似于天然存在的分子的分子。例如，肽模拟物可以是分子，诸如肽，修饰的肽，或生物学模拟激素、细胞因子、酶底物、病毒或其他天然存在的分子的活性配体的任何其他分子。
如本文所用，“化学引诱物”是指能够吸引和/或活化免疫系统的细胞的结构，诸如肽。在一个优选实施方案中，化学引诱物是能够吸引和活化免疫系统的细胞的结构。化学引诱物的实例包括f-Met肽、小分子FPR-1激动剂、PRR激动剂、肽模拟物、N-脲基-肽和细菌糖。更具体的实例包括式I-IV中任一者的化合物，和SEQ ID NO 22、36-39中任一者的肽。
以下实施例进一步举例说明本发明，并且提供用于实施本发明的各个具体实施方案的典型方法和程序。然而，应理解，实施例通过举例说明而不是限制的方式进行阐述，并且本领域普通技术人员可以进行各种修改。
实施例1：含有工程改造的半胱氨酸残基的IgG重链恒定区的设计
选择IgG重链恒定区残基用于突变，以允许用具有各种可变或抗原结合结构域的亲本mAb使用工程改造的半胱氨酸设计。简而言之，选择恒定结构域中对于抗体二级和三级结构并不关键的缬氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基用于计算机芯片上的初始突变。使用公开的CH1-Cκ Fab(pdb：4DTG)和IgG4 Fc(pdb：4C55)的晶体结构，设计多种不同的抗体单半胱氨酸-工程改造的构建体。在人IgG4重链和κ轻链质粒中构建编码每种突变体设计的基因，并在细胞中表达，并通过表达水平和分析概况表征未缀合的含有工程改造的半胱氨酸的mAb。扩大并进一步表征保留与亲本野生型mAb基本上相同的靶标结合亲和力和表达水平(如通过ELISA所测定)的构建体，其在缀合前具有最小的高分子量聚集物(<10%)。
然后在HEK293细胞中表达超过二十种具有被工程改造至每个HC和LC恒定结构域中的单一半胱氨酸突变的mAb构建体，纯化并经由接头缀合至细胞毒性有效载荷，诸如单甲基澳瑞他汀E (MMAE)和念珠藻素。通过标准程序(诸如ESI-TOF质谱法或疏水性指数色谱法(HIC))监测缀合效率，同时通过分析型大小排阻色谱法测量聚集倾向。进一步检查在与两种有效载荷缀合后具有大于~60%缀合效率和小于~10%高分子聚集物的构建体，用于离体血浆和体内稳定性研究。
简而言之，将缀合物与血浆一起孵育几天，并通过质谱法分析以证实有效载荷仍然缀合在抗体上。发现在每条HC中的S124C、S157C、A162C、S375C或A378C处含有残基突变的缀合的构建体具有合适的稳定性。HC 124C突变可以与157C、162C、375C或378C组合，以产生更高的抗体/药物比率。此外，生成CH1结构域中的重链残基124、157和162、CH2结构域中的残基262和CH3结构域中的残基375、378和397以及Cκ结构域中的轻链残基156、171、191、193、202和208中的额外单一半胱氨酸工程改造的依米妥珠单抗突变体，用于与各种甲酰肽缀合。
除了包括具有缀合的化学引诱物的工程改造的半胱氨酸的单价IgG抗体以外，还可以开发具有如本文公开的具有缀合的化学引诱物的工程改造的半胱氨酸的二价抗体构建体。具有工程改造的半胱氨酸的二价抗体构建体包括，但不限于，IgG-scFv形式(如在PCT/US2015/058719中所报道)和二价IgG形式(如在US 2018/0009908中所公开)。根据此类二价抗体构建体，位点特异性工程改造的半胱氨酸包括表面暴露的半胱氨酸，用于将化学引诱物缀合至双特异性抗体。根据一个具体实施方案(具有二价IgG形式的双特异性抗体，其具有SEQ ID NO:34、35的两条HC和SEQ ID NO:58、59的两条LC)，重链残基124和378处的半胱氨酸被工程改造用于缀合化学引诱物。这种示例性实施方案的表达和组装未改变，而与测试肽的缀合递送与单特异性抗体相当的CR。
实施例2：聚乙二醇化的fMLFK肽的合成
实施例2(A)：甲酰基-Met-Leu-Phe-Lys(Mal-PEG12)-OH (“肽-‘183”) (SEQ ID NO:22)的合成。
Figure 513575DEST_PATH_IMAGE007
用作未缀合的肽的具有水解的马来酰亚胺基的肽-‘183。
Figure 712475DEST_PATH_IMAGE008
合成趋化肽甲酰基-Met-Leu-Phe-Lys-OH (SEQ ID NO:23)并纯化为HCl盐。该材料用作赖氨酸的ε-氨基处的进一步衍生化的底物。
在来自Ace Glassware Inc的100 mL烧结玻璃手动反应容器中，使用标准Fmoc/tBu化学法以0.3 mmol规模经由手动固相肽合成产生肽。用于合成的固体支持物是Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂，(NovaBiochem，目录号8.56013，批号S6696713-529)，100-200目，取代量为0.57 meq/g。使用的标准氨基酸是：Fmoc-Phe-OH (NovaBiochem, 目录号04-12-1030,批号A21653)、Fmoc-Leu-OH (NovaBiochem, 目录号04-12-1025, 批号A25917)、Fmoc-Met-OH (MidWest Biotech 目录号12400, 批号OP12240)。在每个偶联步骤之前，用20%哌啶/DMF处理(2 x 10 min)除去Fmoc基团。使用等比率的Fmoc氨基酸、二异丙基碳二亚胺(Sigma-Aldrich, 目录号DI25407, 批号80896APV)和HOAt (AK Scientific, 目录号D046, 批号1188G50I)以相比于理论肽树脂取代量的3倍摩尔过量下以DMF中~0.2 M的最终浓度进行所有偶联6小时。偶联最后一个氨基酸并除去N-末端Fmoc基团后，肽基树脂通过用6倍过量的溶解于DMF中的甲酸2,4,6-三氯苯酯(TCI, 目录号T3121, 批号P8AFA-PE)与200μL二异丙基乙胺处理而被甲酰化，并在室温下反应3小时。然后将树脂用DCM和二乙醚洗涤，并通过对反应容器应用真空抽吸5 min来彻底干燥。将干燥的树脂在室温下用25 mL裂解混合物(TFA:茴香醚:水:三异丙基硅烷，88:5:5:1 v/v)处理2小时。将树脂滤出，用5 mL纯TFA洗涤两次，并将合并的滤液用50 mL冷二乙醚处理以沉淀粗肽。然后将肽/乙醚悬浮液以4000 rpm离心4分钟以形成固体沉淀，倾析乙醚，并将固体沉淀再用乙醚研磨2次，并在真空中干燥30 min。将粗肽溶解于20%乙腈/水中，并通过RP-HPLC在C18制备型柱(Phenomenex,Luna Phenyl-Hexyl, 21 x 250 mm)上用含有0.1% HCl的水中的乙腈的线性梯度纯化，以得到作为HCl盐的冻干的肽(125 mg，基于起始树脂取代量的产率为73%)。纯度使用分析型RP-HPLC评价，并且发现其为>99%。分子量通过分析电喷雾MS测定。计算值：565.7 Da，观察值：565.3 Da (平均分子量)。观察到以下离子：566.3 (M+1H)。
赖氨酸的ε-氨基如下酰化：在超声仪的帮助下，将~50 mg (~0.088 mmol)的冻干肽溶解于5 mL无水DMF中。在分开的闪烁小瓶中，将74 mg (1.1当量)的Mal-dPEG12-OH(QuantaBiodesign 目录号10285, 批号IH1-A1240-80)用1 mL干燥DMF中的29 mg (1.1当量)的TSTU (OakWood Chemicals, 目录号024891, 批号024891)和61 µL (4当量)的DIPEA在室温下活化25 min。将活化的Mal-PEG12-OH逐滴添加至DMF (1 mL)中的增溶肽中，并添加62 µL (5当量)三乙胺，并将反应混合物在室温下混合。1小时后，通过添加冷二乙醚来终止反应。然后将溶液分开并转移至两个50 mL锥形管中，并添加更多的冷乙醚以进一步沉淀肽。然后将肽/乙醚悬浮液以4000 rpm离心4分钟以形成固体沉淀，倾析乙醚，并将固体沉淀再用乙醚研磨2次，并在真空中干燥30 min。将合并的粗肽沉淀溶解于20%乙腈/水中，并通过RP-HPLC在C18制备型柱(Phenomenex, Luna Phenyl Hexyl 21 x 250 mm)上用含有0.1%TFA的水中的乙腈的线性梯度纯化，以得到作为TFA盐的冻干的肽(44.4 mg，基于起始材料的产率为38%)。纯度使用分析型RP-HPLC评价，并且发现其为>96%。分子量通过分析电喷雾MS测定。计算值：1316.6 Da，观察值：1316.2 Da (平均分子量)。观察到以下离子：659.0 (M+2H)，和1317.2 (M+1H)。然后可以如以下实施例3中所述将该肽(甲酰基-Met-Leu-Phe-Lys(Mal-PEG12)-OH)缀合至抗体。
对于以下实施例中使用的未缀合肽，通过将20 mg来自步骤1的产物在2 mL 40 mMTris HCl缓冲液(pH 8.0)中室温下孵育过夜，来进一步水解马来酰亚胺基。18小时后，将溶液用10 mL 20%乙腈/水稀释，并通过RP-HPLC在C18制备型柱(Phenomenex, Luna PhenylHexyl 21 x 250 mm)上用含有0.1 % TFA的水中的乙腈的线性梯度纯化，以得到作为TFA盐的冻干的肽(6.4 mg，基于起始材料的产率为32%)。纯度使用分析型RP-HPLC评价，并且发现其为>94%。分子量通过分析电喷雾MS测定：计算值：1334.6 Da；观察值：1334.4 Da (平均分子量)。观察到以下离子：668.0 (M+2H)，和1335.8 (M+1H)。
实施例2(B)：H-Met-Leu-Phe-Lys(Mal-PEG12-OH (“肽-‘844”) (SEQ ID NO:24)的合成。
Figure 319037DEST_PATH_IMAGE009
用作未缀合的肽的具有水解的马来酰亚胺基的肽-‘844。
Figure 312401DEST_PATH_IMAGE010
通过手动固相肽合成，使用标准的芴基甲氧基羰基(Fmoc)/叔丁基(tBu)化学法以0.3 mmol规模产生缺乏甲酰化的阴性对照肽((H-Met-LeuPhe-Lys-OH) (SEQ ID NO:25)。肽组装在来自Ace Glassware Inc.的100 mL烧结玻璃手动反应容器中进行。用于合成的固体支持物是Fmoc-Lys(Mtt)-Wang树脂，(NovaBiochem, 目录号8.56021, 批号S6692621503)，100-200目，取代量为0.57 meq/g。使用的标准氨基酸是Fmoc-Phe-OH (NovaBiochem,目录号04-12-1030, 批号A21653)，Fmoc-Leu-OH (NovaBiochem, 目录号04-12-1025, 批号A25917)，Fmoc-Met-OH (MidWest Biotech 目录号12400, 批号OP12240)。
在每个偶联步骤之前，用20%哌啶/DMF处理(2 x 10 min)除去Fmoc基团。使用等比率的Fmoc氨基酸、二异丙基碳二亚胺(Sigma-Aldrich, 目录号DI25407, 批号80896APV)和HOAt (AK Scientific, 目录号D046, 批号1188G50I)以相比于理论肽树脂取代量的3倍摩尔过量下以DMF中~0.2 M的最终浓度进行所有偶联6小时。
偶联最后一个氨基酸并除去N-末端Fmoc基团后，肽基树脂通过用6倍过量的溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中的Boc2O (NovaBiochem, 目录号01-63-0007, 批号A25675)与200μL二异丙基乙胺处理而用Boc(丁基氧基羰基)-基团保护，并在室温下反应3小时。然后将树脂用二氯甲烷(DCM)洗涤8次，并用DCM中的20%六氟异丙醇(Oakwood Chemicals, 目录号003409)的三次连续处理(2 x 10 min和1 x 45 min)选择性除去Lys残基上的Mtt (4-甲基三苯甲基)保护基以暴露Lys的游离ε胺，用于进一步反应。随后的Fmoc PEG12-OH(BroadPharm, 目录号 BP-22241)和3-马来酰亚胺基-丙酸(Bachem, 目录号 Q-2620)的偶联以与标准氨基酸残基相同的方式完成。
合成完成后，将肽基树脂用DCM、二乙醚洗涤，并通过对反应容器应用真空抽吸5min来彻底干燥。将干燥的树脂在室温下用25 mL裂解混合物(三氟乙酸(TFA):茴香醚:水:三异丙基硅烷，88:5:5:1 v/v)处理2小时。将树脂滤出，用5 mL纯TFA洗涤两次，并将合并的滤液用50 mL冷二乙醚处理以沉淀粗肽。然后将肽/乙醚悬浮液以4000 rpm离心4分钟以形成固体沉淀，倾析乙醚，并将固体沉淀再用乙醚研磨2次，并在真空中干燥30 min。
将粗肽溶解于20%乙腈/水中，并通过RP-HPLC在C18制备型柱(Phenomenex, LunaPhenyl-Hexyl, 21 x 250 mm)上用含有0.1 % TFA的水中的乙腈的线性梯度纯化，以得到作为TFA盐的冻干的肽(38.8 mg，基于起始树脂取代量的产率为10%)。纯度使用分析型RP-HPLC评价，并且发现其为>96%。分子量通过分析电喷雾MS测定。计算值：1288.5 Da，观察值：1288.4 Da (平均分子量)。观察到以下离子：645.0 (M+2H)，和1289.7 (M+1H)。然后可以如以下实施例3中所述将该肽(H-Met-Leu-Phe-Lys(Mal-PEG12-OH)缀合至抗体。
对于以下实施例中使用的未缀合肽，通过将20 mg来自步骤1的产物在2 mL 40 mMTris HCl缓冲液(pH 8.0)中室温下孵育过夜，来进一步水解马来酰亚胺基。18小时后，将溶液用10 mL 20%乙腈/水稀释，并通过RP-HPLC在C18制备型柱(Phenomenex, Luna PhenylHexyl 21 x 250 mm)上用含有0.1 % TFA的水中的乙腈的线性梯度纯化，以得到作为TFA盐的冻干的肽(5.2 mg，基于起始材料的产率为26%)。纯度使用分析型RP-HPLC评价，并且发现其为>96%。分子量通过分析电喷雾MS测定。计算值：1306.6 Da，观察值：1306.4 Da (平均分子量)。观察到以下离子：654.0 (M+2H)，和1307.7 (M+1H)。
实施例2(c)：甲酰基-Nle-Leu-Phe-PEG12-Lys(马来酰亚胺基-丙酰基)-OH(“fNle”; SEQ ID NO:42)的合成
Figure 66730DEST_PATH_IMAGE011
趋化肽甲酰基-Nle-Leu-Phe-PEG12-Lys-OH被合成为HCl盐(PeptidesInternational)，并且不经进一步修饰即用作用于衍生化的底物。
赖氨酸的ε-氨基的酰化如下进行：在超声仪的帮助下，将~50 mg (~0.044 mmol)的冻干肽溶解于5 mL无水DMF中。在分开的闪烁小瓶中，将8.1 mg (1.1当量)的马来酰亚胺基-丙酸(Bachem, 目录号Q-2620, 批号0564230)用1 mL干燥DMF中的14.5 mg (1.1当量)的TSTU (OakWood Chemicals, 目录号024891, 批号024891)和33.4 µL (4当量)的DIPEA在室温下活化25 min。将活化的马来酰亚胺基-丙酸逐滴添加至DMF (1 mL)中的增溶肽中，且然后添加30 µL (5当量)三乙胺，并将反应物在室温下混合。1小时后，通过添加冷二乙醚来终止反应。然后将溶液分开并转移至两个50 mL锥形管中，并添加更多的冷乙醚以进一步沉淀肽。然后将肽/乙醚悬浮液以4000 rpm离心4分钟以形成固体沉淀，倾析乙醚，并将固体沉淀再用乙醚研磨2次，并在真空中干燥30 min。将合并的粗肽沉淀溶解于20%乙腈/水中，并通过RP-HPLC在C18制备型柱(Phenomenex, Luna Phenyl Hexyl 21 x 250 mm)上用含有0.1% TFA的水中的乙腈的线性梯度纯化，以得到作为TFA盐的冻干的肽(8.6 mg，基于起始材料的产率为15.1%)。纯度使用分析型RP-HPLC评价，并且发现其为>97%。分子量通过分析电喷雾MS测定。计算值：1298.5 Da，观察值：1298.8 Da (平均分子量)。观察到以下离子：650.0 (M+2H)，和1299.8 (M+1H)。然后可以将该肽缀合至抗体，如以下实施例3中所述。
实施例3：IgG抗体与肽的缀合
抗体-肽生物缀合物可以如下制备。使用Zeba™旋转脱盐柱(40K MWCO)将含有工程改造的半胱氨酸残基的亲本抗体缓冲液交换为50mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 7.5)，并使最终浓度为5mg/ml。将溶解于MilliQ水中的新鲜制备的100mM二硫苏糖醇(DTT)以40倍摩尔过量添加至抗体中。将反应混合物在室温下孵育16小时。在孵育期之后，使用Zeba旋转脱盐柱将反应混合物缓冲液交换为50mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、150mM氯化钠(NaCl)(pH 7.5)，以除去过量的未反应的DTT。
将新鲜制备的100mM脱氢抗坏血酸(dHAA)/二甲基乙酰胺以30倍摩尔过量添加至抗体中，并在室温下孵育3小时。孵育之后，将4、8或12倍摩尔过量的甲酰基-Met-Leu-Phe-Lys(Mal-PEG12)-OH (SEQ ID NO:22)、H-Met-Leu-Phe-Lys(Mal-PEG12)-OH (SEQ ID NO:24)或甲酰基-Nle-Leu-Phe-PEG12-Lys(马来酰亚胺基-丙酰基)-OH(分别如实施例2(A)、2(B)和2(C)中所述合成)分别添加(溶解于分子级水中)至具有一个、两个或三个工程改造的半胱氨酸残基的抗体，以产生2、4或6比率的生物缀合物。将该反应混合物在室温下孵育1小时。孵育后，将样品缓冲液交换为期望的缓冲液，并使用脱盐柱、制备型大小排阻色谱法(pSEC)或透析除去过量的未缀合的肽。
表1提供了基本上如本文和上文所述制备的并在随后的测定法中测试的缀合和未缀合的IgG抗体构建体，包括用于缀合的抗体HC和LC序列以及聚乙二醇化肽。如本文所用，“依米妥珠单抗”、“ TMab”(曲妥珠单抗)和“ AME133”是指含有所示抗体的可变区的抗体构建体。
表1. 缀合和未缀合的IgG抗体构建体。
Figure 803742DEST_PATH_IMAGE012
Figure 514078DEST_PATH_IMAGE013
Figure 943922DEST_PATH_IMAGE014
a 第一个术语是指亲本抗体，第二个术语是指免疫球蛋白同种型，第三个术语是指用Mal-PEG12接头与抗体缀合的N-甲酰肽(其中“ UC”意指未缀合，且因此抗体未与肽缀合)，第四个术语是指重链工程改造的半胱氨酸，通过第五个和第六个术语的残基表示(如果适用)。例如，依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-378C意味着亲本抗体是依米妥珠单抗，其为IgG4抗体，使用的N-甲酰肽是fMLFK，并且在重链中的位置378处工程改造半胱氨酸(根据EU编号)。
b 标记为“(PAA)”的抗体构建体在IgG4恒定区中含有额外突变：228P、234A和235A(根据EU编号)。
c 标记为“(IQ)”的抗体构建体在IgG1恒定区中含有额外突变：247I和339Q (根据EU编号)。
实施例4：缀合比率测定
通过完整质谱分析使用缀合加成的加权平均值测定半胱氨酸工程改造的TMab(“曲妥珠单抗”)、AME133和依米妥珠单抗构建体的重链上的肽-’183的缀合比率。使用与Agilent6230 ESI-TOF质谱仪联用的Agilent 1290 HPLC收集完整的质量测量值。用PLRP-S反相柱(Agilent)使用0.3 ml/min的流速以水/0.2%甲酸作为流动相A且以乙腈/0.2%甲酸作为流动相B用4分钟内20%至70% B的梯度分析样品(2ug)。Agilent 6230 TOF以4000V的正离子模式、65V的锥孔电压(skimmer)、300V的裂解电压(Fragmentor)、350C的气体温度、12psi的干燥气体、40psi的雾化器气体下运行。以1次扫描/秒，MS扫描为600 m/z至5000 m/z。从2分钟至15分钟收集数据，并通过对TIC峰光谱求和、随后用Agilent Mass Hunter和Bioconfirmv7.0解卷积来确定蛋白分子量。未还原样品的解卷积为50000至190000 Da.，且峰宽为1.0Da. 20次迭代和1 Da.步骤。
表2a. 肽-’183:半胱氨酸缀合比率。
Figure 185548DEST_PATH_IMAGE015
a根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
通过将50 µl 1 mg/ml抗体缀合物添加至小鼠血清并在37℃下在300 RPM摇动下孵育0.5至48小时来制备血清稳定性的样品。在测定缀合比率之前，所有体内样品或血清稳定性样品都需要从生物基质中提取。生物流体经历以13,000 RPM离心10分钟，随后使用逐步梯度将其应用于人Fc Select亲和柱。将缀合的抗体捕获于流动相A (PBS, pH 7.4)中，并用0.2% (V/V)甲酸洗脱。手动收集样品级分，并在低热下使用真空离心干燥至50-100 µl。偏离靶标的百分比表示将生物缀合物添加至除了预期的半胱氨酸以外的位点。遵循上述程序，获得以下数据。
表2b：在cMet单一工程改造的半胱氨酸突变体上与肽-frm-MLFK(Mal-PEG12)-OH(肽-‘183)的位点特异性缀合。
Figure 398355DEST_PATH_IMAGE016
表2c：在cMet单一工程改造的半胱氨酸突变体上与肽frm-Met-Ile-Phe-Leu-NH-(CH2)2-NH-[(Mal-Dap(NH2)] (SEQ ID NO:41; FRM-032)的位点特异性缀合
Figure 41825DEST_PATH_IMAGE017
ND: 未测定。
这些数据表明，经由马来酰亚胺化学法单克隆抗体在工程改造的半胱氨酸位点124、157、375和/或378与甲酰化肽构建体的缀合产生肽:抗体缀合比率，其由添加至抗体的半胱氨酸的数目所预测，如脱靶百分比所表明。
实施例5：结合人HER2的TMab生物缀合物
使用用人HER2包被的96孔细胞培养板通过ELISA测定TMab与人HER2的结合。将板暴露于结合抗体80分钟，洗涤以除去未结合的抗体，并与二抗孵育50分钟。洗涤板，然后在37℃下显色25分钟。用96孔板读数器在O.D.560处测量结合。遵循基本上如上所述的程序，获得以下数据。
表3. TMab与人HER2的结合(O.D.560)。
Figure 376992DEST_PATH_IMAGE018
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，TMab与人Her2的结合不受修饰重链以在位点124和378处引入半胱氨酸的影响，并且也不受肽-’183与位点124和378处的半胱氨酸残基的缀合的影响。
实施例6：PMN趋化性
通过在改良的Boyden腔室测定中观察人多形核嗜中性粒细胞(PMN)跨过transwell膜(Corning #3415)向抗体缀合物的迁移来测量趋化性。将来自嗜中性粒细胞富集的制备物的近似2-4 x 105个细胞接种在具有3.0 um孔的膜上的上部transwell腔室中。下部transwell腔室含有单独的缓冲液以及fMLF(N-甲酰基-Met-Leu-Phe肽作为阳性对照)和实验性抗体生物缀合物的溶液。一些实验还包括fMLFK(Mal[OH]-PEG12)-OH (水解肽-’183)和H-Met-Leu-Phe-Lys(Mal[OH]-PEG12-OH (水解肽-’844)作为阳性对照。在transwell中接种后，将细胞在37℃下置于加湿培养箱中。一小时后，除去上部腔室中的所有细胞，并使用CellTiter-Glotm (Promega #G7571)根据制造商指定的方案定量分析成功迁移至下部腔室的细胞的百分比。迁移百分比被定义为(迁移至下部腔室的细胞的数目/最初接种的细胞的数目)。细胞数目使用标准曲线测定。将所有数据都转换为相对于各单独实验的最大fMLF响应的百分比。
刺激PMN趋化性需要N-甲酰基修饰
为了确定N-甲酰基修饰的肽诱导PMN迁移的能力，将原代人PMN暴露于具有或不具有N-甲酰基修饰的肽，并测量PMN迁移响应。遵循基本上如上所述的程序，PMN分别在10 nM、1 nM和1µM的浓度对fMLF、肽-’183和肽-’844的响应最大(表4)。肽-’844与肽-’183相似，除了肽-’844缺乏N-甲酰基，并且在诱导PMN迁移方面的功效低1000倍，如肽-’183和肽-’844之间的剂量响应差异所表明。数值作为相对于10 nM fMLF的PMN迁移百分比给出。
表4a. PMN朝向fMLF、肽-’183和肽-’844的迁移。
Figure 310442DEST_PATH_IMAGE019
这些数据表明，肽的N-甲酰基修饰对于诱导PMN趋化性是重要的。
甲酰肽变体诱导嗜中性粒细胞趋化性
将原代人嗜中性粒细胞暴露于甲酰肽，并且基本上如上所述测量PMN迁移响应，除了保留原始迁移值而不是转换为细胞计数。遵循基本上如上所述的程序，提供以下数据作为相对于100 nM fMLF的百分比。
表4b. PMN朝向甲酰肽的趋化性
Figure 389257DEST_PATH_IMAGE020
n.d. = 未测定。
这些数据表明，对甲酰肽氨基酸序列和接头的修饰可以诱导通过FPR1介导的嗜中性粒细胞迁移。PEG连接的肽[肽-’183、FRM-021、FRM-029、FRM-030和FRM-031]在1和3 nM之间的暴露浓度下最大地诱导嗜中性粒细胞迁移。
N-甲酰肽氨基酸序列和缀合位点在驱动PMN趋化性中的作用
修饰人抗MET IgG4抗体(依米妥珠单抗)，以包括在每条HC的CH1-S124或CH3-A378处的半胱氨酸残基。将修饰的抗体以~2:1肽:抗体比率缀合至肽-’183或f-Nle(甲酰基-Nle-Leu-Phe-PEG12-Lys(马来酰亚胺基-丙酰基)-OH)。将原代人PMN暴露于这些不同的抗体缀合物，并测量PMN迁移响应。
抗体-肽生物缀合物如下：依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-378C、依米妥珠单抗-G4-fNle-HC-378C、依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-124C和依米妥珠单抗-G4-fNle-HC-124C。
遵循基本上如上所述的程序，与肽-’183缀合的抗体相比，fNle缀合的抗体在刺激PMN迁移方面的功效较低。在位点A378和S124处与肽-’183缀合的抗体在30 nM下最大地诱导PMN迁移，分别诱导等于fMLF对照的99.1%和117.8%的迁移响应。相比之下，fNle抗体缀合物在100 nM下最大地诱导PMN迁移，分别导致等于fMLF对照的71.7%和76.5%的迁移响应。下表5中的值作为相对于100 nM fMLF的PMN迁移百分比给出。
表5. PMN朝向抗体缀合物的迁移。
Figure 887234DEST_PATH_IMAGE021
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，在诱导PMN迁移方面，与肽-’183缀合的抗体比fNle抗体缀合物显著更有效。A378和S124位点两者均适用于N-甲酰肽缀合。
较高的肽:抗体缀合比率增加PMN迁移响应
在CH1-124C和378C或仅在378C处具有氨基酸修饰的人抗MET IgG4抗体(依米妥珠单抗)与肽-’183缀合。将原代人PMN暴露于这些抗体缀合物，并测量PMN迁移响应。
遵循基本上如上所述的程序，依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-124C-378C在12.5 nM下最大地诱导迁移，且依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-378C在25 nM下最大地诱导迁移，分别诱导等于fMLF对照的119.3%和124.3%的迁移响应(表6)。相对于缀合的抗体，未缀合的抗体不诱导PMN迁移。数值作为相对于3.12 nM fMLF的PMN迁移百分比给出。
表6. PMN朝向抗体缀合物的迁移。
Figure 658881DEST_PATH_IMAGE022
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，增加肽:抗体比率成比例地影响PMN迁移浓度响应关系。
TMab(曲妥珠单抗)和AME133抗体缀合物
基本上如上所述，在PMN趋化性测定中研究TMab-G1-fMLFK-HC-124C-378C、AME133-G1(IQ)-fMLFK-HC-124C-378C和依米妥珠单抗-G4-UC-124C-378C。TMab-G1-fMLFK-HC-124C-378C和AME133-G1(IQ)-fMLFK-HC-124C-378C分别在10 nM和3 nM下最大地诱导PMN迁移。相对于缀合抗体，依米妥珠单抗-G4-UC-124C-378C不诱导PMN迁移。值在下表7中给出，并且是相对于30 nM fMLF的PMN迁移百分比。
表7. PMN朝向抗体缀合物的迁移。
Figure 547203DEST_PATH_IMAGE023
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明与N-甲酰肽缀合的TMab和AME133抗体有效地诱导PMN迁移。因此，据信本发明的缀合的抗体可用于利用人体的免疫系统来攻击癌细胞。
实施例7：PMN活性氧物质(ROS)产生
多形核嗜中性粒细胞(PMN)能够在刺激后产生ROS，并且含有产生ROS的酶，诸如髓过氧化物酶。PMN的刺激诱导脱颗粒，并将预先形成的ROS和产生ROS的酶释放至细胞外环境中，作为对病原体响应的主要机制。PMN对ROS产生的刺激足以破坏和杀死从细菌至真核细胞的广泛范围的靶标。刺激PMN以产生ROS的最有效途径之一涉及通过N-甲酰肽接合PMN上的甲酰肽受体1(FPR1)。抗体在PMN上的Fc-受体接合也是诱导ROS产生的有效机制。
人原代PMN的ROS产生使用鲁米诺扩增的化学发光法测量。分离后，将PMN以1 x106个细胞/ml悬浮于含有钙和镁的HBSS (Gibco #14025-092)中，所述HBSS补充有0.25%人血清白蛋白(Gemini Bio 产品号800-124)和50 uM鲁米诺(SigmaAldrich #123072-2.5G)。然后将100 µl细胞悬浮液(1 x 105个总细胞)分配至适合于荧光测量的96孔板(Greiner #655098)的每个孔中，并在37℃下平衡温度5分钟。平衡之后，将抗体缀合物的10x溶液添加至孔中，达到1x最终浓度。
添加抗体缀合物后，立即在维持在37℃的光度计中记录化学发光信号，每孔停留时间为0.01秒，依次读板之间的总时间为20秒，且总运行时间为45分钟(PerkinElmerEnVision Multilabel Plate Reader)。使用来自每次运行的前5分钟的发光信号来计算曲线下面积(AUC)评分，指示每种暴露条件下初始ROS爆发的相对幅度。甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLF)肽用作阳性对照，并且环孢菌素H用作FPR1抑制剂。值展现为最大暴露浓度下的fMLF对照的百分比((AUC暴露条件 / AUC fMLF) x 100)。
将原代人PMN暴露于肽或生物缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。遵循基本上如上所述的程序，与具有所示的工程改造的半胱氨酸的单克隆抗体缀合的N-甲酰肽有效地接合由原代人多形核嗜中性粒细胞表达的甲酰肽受体并刺激细胞毒性活性氧物质的产生。缀合的N-甲酰肽对ROS产生的刺激主要是FPR1依赖性的，因为FRP1拮抗剂环孢菌素H对FPR1信号传导的抑制显著降低响应于N-甲酰肽缀合的抗体的PMN ROS产生。下面显示使用特异性抗体缀合物的实例。
肽N-甲酰基修饰
将原代人PMN暴露于肽，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表8中，并且数据报告为使用暴露于抗体缀合物后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于10uM fMLF的百分比。
表8a. PMN对ROS产生的刺激需要具有N-甲酰基修饰的肽。
Figure 429708DEST_PATH_IMAGE024
这些数据表明，在10 nM至10 uM的浓度下，暴露于肽-’183的PMN产生比对于fMLF所观察到的更多的ROS。肽-’844刺激的ROS产生显著少于对于fMLF所观察到的，表明PMN的ROS产生的有效刺激需要肽N-甲酰基修饰。
甲酰肽变体诱导嗜中性粒细胞ROS产生
将原代人嗜中性粒细胞暴露于具有氨基酸取代(包括合成氨基酸)的甲酰肽变体，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表8b中，并且数据报告为使用暴露于试剂后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于3000 nMfMLF的百分比。使用Graphpad PRISM中的最佳拟合值计算EC50值。
表8b. PMN ROS产生
Figure 782192DEST_PATH_IMAGE025
这些数据表明例举的甲酰肽变体用于诱导ROS产生的功效。预期非编码氨基酸的并入可以改善肽稳定性，并且可以并入非编码氨基酸变体以增强甲酰肽和FPR1之间的结合，导致功效增加。
小鼠嗜中性粒细胞FPR-1比fMLF衍生物对fMIFL肽和抗体缀合物更敏感
将从骨髓纯化的小鼠嗜中性粒细胞暴露于甲酰肽或抗体缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表8c中，并且数据报告为使用暴露于试剂后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于10000 nM fMLF的百分比。
表8c. 小鼠PMN ROS产生
Figure 724740DEST_PATH_IMAGE026
Nd = 无数据。
这些数据表明，小鼠嗜中性粒细胞比fMLF变体对fMIFL肽和抗体缀合物显著更敏感。在人中，fMLF是最有效的FPR1激动剂之一，而其在小鼠实验中的功效显著较低。无论FPR1激动剂是可溶性肽还是与抗体缀合，小鼠和人嗜中性粒细胞上的FPR1之间的这种关系都是如此。
TMab生物缀合物
将原代人PMN暴露于TMab生物缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表9中，并且数据报告为使用暴露于试剂后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于1000 nM fMLF的百分比。
表9. PMN ROS产生。
Figure 349625DEST_PATH_IMAGE027
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，暴露于1000 nM TMab-G1-fMLFK-HC-124C-378C的PMN产生ROS的水平等于fMLF对照的70.1%，并且其水平比TMab-G1-UC-HC-124C-378C高得多。
依米妥珠单抗缀合物
将原代人PMN暴露于依米妥珠单抗缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表10中，并且数据报告为使用暴露于抗体缀合物后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于1000 nM fMLF的百分比。
表10. PMN ROS产生。
Figure 770242DEST_PATH_IMAGE028
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，暴露于1000 nM 依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-124C-378C和依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-378C的PMN产生ROS的水平分别等于1000 nM fMLF对照的62.2%和48.9%。暴露于1000 nM 依米妥珠单抗-G4-UC-HC-124C-378C生成更低的ROS产生，等于对照的仅32.2%。
AME133(抗CD20)缀合物
将原代人PMN暴露于AME133抗体缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表11中，并且数据报告为使用暴露于抗体缀合物后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于1000 nM fMLF的百分比。
表11. PMN ROS产生。
Figure 242812DEST_PATH_IMAGE029
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，暴露于1000 nM AME133- G1(IQ)-fMLFK-HC-124C-378C和AME133-UC的PMN产生ROS的水平分别等于对照的77.9%和13.9%。
抗体缀合物和FPR1信号传导的抑制
为了确定缀合的抗体是否比未缀合的抗体激发更多的ROS产生，基本上如上所述测量ROS产生。所有肽均在300 nM最终浓度下进行测试。在添加肽之前，将PMN与1 uM环孢菌素H预孵育30分钟。
缓冲液是含有钙和镁的HBSS (Gibco #14025-092)，所述HBSS补充有0.25%人血清白蛋白(Gemini Bio 产品号800-124)和50 uM鲁米诺(SigmaAldric #123072-2.5G)。值报告于下表12a中，并且表示为相对于暴露于抗体缀合物后5分钟期间记录的发光的fMLF曲线下面积计算值的百分比。
表12a. PMN ROS产生。
Figure 293945DEST_PATH_IMAGE030
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，与未缀合的抗体相比，与fMLFK缀合的抗体激发来自人PMN的显著更多的ROS产生。数据还表明，用FPR1拮抗剂环孢菌素H预处理PMN导致抗体生物缀合物中ROS水平的显著降低，但未缀合的对照中则不会。
增强FcγR3结合的抗体突变增加响应于N-甲酰肽生物缀合物的FPR1介导的ROS产 生
将原代人嗜中性粒细胞暴露于Tmab N-甲酰肽缀合物，所述缀合物在Fc区中具有或不具有增加对FcγR3的亲和力的突变(247I、339Q、+/-332E突变)。基本上如上所述，使用鲁米诺扩增的化学发光来测量ROS产生。数据显示于下表12b中，并且数据报告为使用暴露于试剂后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于1000 nM fMLF的百分比。使用Graphpad PRISM中的最佳拟合值计算FPR1介导的ROS产生的EC50值。
表12b. PMN ROS产生
Figure 219175DEST_PATH_IMAGE031
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。Ud = 未测定。
b 标记为“(IQ)”的抗体构建体在IgG1恒定区中含有额外突变：247I和339Q(根据EU编号)。
c 标记为“(IQE)”的抗体构建体在IgG1恒定区中含有额外突变：247I、332E和339Q(根据EU编号)。
这些数据表明，可以通过优化嗜中性粒细胞的FcR接合，对N-甲酰基-Met生物缀合物进行工程改造，以进一步增强ROS产生。具有IQ和IQE氨基酸取代的Fc优化的Tmab生物缀合物相对于野生型Tmab IgG1缀合物增强嗜中性粒细胞的刺激的ROS产生，其中当与Tmab-G1-fMLFK-HC-124C-378C相比时，Tmab-G1-fMLFK-HC-124C-378C-IQ和Tmab-G1-fMLFK-HC-124C-378C-IQE变体分别显示出EC50改善2.98倍和14.9倍。预期在PMN细胞杀伤机制的活化中的Fc-工程改造的改善将在缀合的抗体介导的嗜中性粒细胞的细胞杀伤中带来实质性益处。
化合物接头长度
将原代人嗜中性粒细胞暴露于具有不同长度的PEG接头的N-甲酰肽Tmab缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。数据显示于下表12c中，并且数据报告为使用暴露于试剂后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于3000nM FRM-023 (SEQ ID NO:40)的百分比。使用Graphpad PRISM中的最佳拟合值计算FPR1介导的ROS产生的EC50值。
表12c. PMN ROS产生
Figure 443483DEST_PATH_IMAGE032
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。ND= 未测定。
这些数据表明，N-甲酰肽缀合物作为具有不同大小的PEG的FPR1激动剂维持功能性。
实施例8：抗体缀合物实现嗜中性粒细胞介导的肿瘤细胞杀伤
测定抗体化合物将PMN靶向至肿瘤并参与肿瘤细胞杀伤的能力。在实体瘤和液体瘤中评价Tmab、依米妥珠单抗和AME133抗体缀合物其在肿瘤细胞杀伤中接合PMN的能力。
使用xCelligence实时细胞分析系统(ACEA Biosciences)测量PMN对肿瘤细胞的抗体靶向杀伤。该系统通过记录培养板的生长表面上的传感器之间的电阻抗来实时监控细胞活力。其报告针对平行孔中的对照细胞归一化的归一化的细胞指数(NCI)，并且允许技术人员对相对培养物活力进行控制。在肿瘤培养物与靶向抗体孵育并以10:1 PMN:肿瘤细胞比率添加人原代PMN后24小时，以15分钟间隔连续连续测量NCI。在用肿瘤细胞接种之前，将xCelligence 96孔E-板针对背景信号校准。每个孔接受50 µl培养基(RPMI + 10% FBS +抗生素)，并在含有xCelligence读板器的加湿培养箱中将E-板平衡至37℃。
平衡后，测量背景中的E-板孔变异。将培养的肿瘤细胞系解离，计数并在培养基中稀释至1 x 105个细胞/ml的最终密度，并将100 µl稀释的肿瘤细胞铺板至E-板孔中。将E-板返回至xCelligence读取器，并且以15分钟间隔测量细胞指数过夜以建立基线。
第二天，从新鲜的人血液样品分离PMN，并使其在培养基中达到2 x 106个细胞/ml的最终密度。过夜记录后，从xCelligence读取器取出E-板，并将22 µl 10x抗体溶液或缓冲液添加至指定孔中。15分钟后，将50 µl稀释的PMN(总共1 x 105个细胞)或缓冲液添加至指定孔中。添加PMN后，立即将E-板返回至xCelligence读取器，并测量细胞指数最长达72小时。实验完成后，将细胞指数针对紧接添加抗体之前的时间点归一化(NCI)。
百分比NCI被定义为((样品的NCI)/(单独的肿瘤细胞的NCI) x 100)。对于非粘附性肿瘤细胞(Daudi细胞)，根据制造商方案，使用xCelligence免疫疗法试剂盒– B细胞杀伤测定(ACEA #8100004)来将肿瘤细胞栓系至E-板孔。在栓系和背景获取之后，如上所示进行方案。
下面显示的数据表明与N-甲酰肽缀合的抗体导致肿瘤细胞的PMN介导的杀伤。
N-甲酰基-Met-Leu-Phe肽
在SKOV3肿瘤细胞杀伤测定中评估两种N-甲酰化的肽f-Met-Leu-Phe和肽-’183，以确定在没有用单克隆抗体靶向肿瘤的情况下N-甲酰甲硫氨酸肽对PMN介导的肿瘤细胞杀伤的影响。
百分比NCI值代表暴露于所述条件2小时后SKOV3细胞的相对活力。值作为针对SKOV3对照归一化的平均百分比 ± SD给出；对于所有条件，n=4。统计显著性由单向ANOVA、随后相比于“+ PMN”的事后邓尼特氏多重比较检验来确定。
表13. 可溶性甲酰肽增强SKOV3肿瘤细胞的PMN介导的杀伤。
Figure 691931DEST_PATH_IMAGE033
这些数据表明，在PMN不存在的情况下，所述肽对肿瘤细胞活力没有统计学影响。在PMN存在的情况下，这些肽仅在最高肽浓度下引起NCI的降低。
TMab
将粘附的HER2(+) SKOV3人腺癌肿瘤细胞铺板近似24小时，且然后与TMab-G1-fMLFK-HC-124C-378C或TMab-G1-UC-HC-124C-378C孵育，并以10:1效应靶标:细胞比率暴露于原代人PMN。
百分比NCI值代表暴露于所述条件2小时后SKOV3细胞的相对活力。值在下表14中给出，并且表示为针对SKOV3对照归一化的平均百分比 ± SD。对于所有条件，N=4。
表14. TMab缀合物PMN介导的SKOV3肿瘤细胞的杀伤。
Figure 976282DEST_PATH_IMAGE034
a根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
统计显著性由单向ANOVA、随后相比于“+ PMN”的事后邓尼特氏多重比较检验来确定。NCI，归一化的细胞指数。
这些数据表明，在2小时后，与10 nM TMab-G1-fMLFK-HC-124C-378C孵育并暴露于PMN的细胞显示等于对照细胞的63.5 ± 9.9%的减小的归一化细胞指数(NCI)(p-值<0.0001)，而暴露于10 nM TMab-G1-UC-HC-124C-378C的细胞维持对照细胞的103 ± 1.2%的NCI(统计学意不显著)。在PMN不存在的情况下，两小时后，TMab-G1-fMLFK-HC-124C-378C不降低肿瘤细胞活力，并且添加不含抗体的PMN不影响SKOV3肿瘤细胞活力。
依米妥珠单抗
将粘附的MET(+) A549人肺癌细胞铺板近似24小时，然后与依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-124C-375C或依米妥珠单抗-G4-UC-HC-124C-375C孵育，并以10:1效应细胞:靶细胞比率暴露于原代人PMN。
遵循基本上如上所述的程序，获得以下数据，并显示于表15中。
表15. 甲酰肽缀合的依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-124C-375C抗体增强PMN介导的 A549肿瘤细胞的杀伤。
Figure 388809DEST_PATH_IMAGE035
Figure 416807DEST_PATH_IMAGE036
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
百分比NCI值代表暴露于所述条件2小时后A549细胞的相对活力。值作为针对“ +PMN”对照归一化的平均百分比 ± SD给出；对于所有条件，n=4。统计显著性由单向ANOVA、随后相比于“+ PMN”的事后邓尼特氏多重比较检验来确定。NCI，归一化的细胞指数；PMN，原代人多形核嗜中性粒细胞；ns，不显著。
这些数据表明，在PMN存在的情况下暴露于10 nM 依米妥珠单抗-G4-fMLFK-HC-124C-375C的培养物在2小时孵育后显示等于对照细胞的87.7 ± 0.9%的降低的NCI，而依米妥珠单抗-G4-UC-HC-124C-375C处理的细胞维持对照细胞的NCI 102.5 ± 1.9%。
AME133实施例
将非粘附的CD20 + Daudi B淋巴母细胞用xCelligence Immunotherapy Kit (ACEA #8100004)根据制造商方案固定，以将肿瘤细胞栓系至E-Plate孔，并使其暴露于下表16中显示的条件。百分比NCI值代表暴露于所述条件6小时后DAUDI细胞的相对活力。值作为针对“缓冲液对照”归一化的平均百分比 ± SD给出；对于所有条件，n=4。统计显著性由单向ANOVA、随后相比于“+ PMN”的事后邓尼特氏多重比较检验来确定。
表16. 甲酰肽缀合的AME133抗体增强PMN介导的DAUDI肿瘤细胞的杀伤。
Figure 536073DEST_PATH_IMAGE037
Figure 725746DEST_PATH_IMAGE038
a 根据与本文实施例1的表1中所述相同的惯例来命名抗体构建体。
这些数据表明，暴露于30 nM AME133-G1(IQ)-fMLFK-124C-378C的培养物在6小时孵育后具有等于对照细胞的20 ± 2.1%的降低的NCI (p-值<0.0001)，而与30 nM AME133-G1(IQ)-UC-124C-378C孵育的培养物维持对照细胞的97.3 ± 1.2%的NCI。AME133-G1(IQ)-fMLFK-124C-378C和AME133-G1(IQ)-UC-124C-378C在PMN不存在的情况下没有降低肿瘤细胞活力。然而，在抗体不存在的情况下，Daudi细胞暴露于PMN使肿瘤培养物NCI降低至对照细胞的66.9 ± 5.2% (p-值<0.0001)。
甲酰肽与单一抗体缀合物的多个半胱氨酸的缀合增加功效
将原代人嗜中性粒细胞暴露于具有不同数目的工程改造的半胱氨酸缀合位点的IgG4抗体缀合物，并且使用基本上如上所述的鲁米诺扩增化学发光法来测量ROS产生。遵循基本上如上所述的程序，获得以下数据。
表17. PMN ROS产生。
Figure 625569DEST_PATH_IMAGE039
表17中的数据被报告为使用暴露于试剂后5分钟期间记录的发光的曲线下面积计算的相对于1000 nM fMLF的百分比。
这些数据表明，与fMLFK缀合的抗体可以用额外缀合位点变得更有效。
说明性实施方案
以下包含根据本公开的说明性实施方案的列表，其代表本公开的各个实施方案。这些说明性实施方案并非旨在穷举或将本公开内容限制为所公开的精确形式，而是提供这些说明性实施方案以帮助进一步描述本公开内容，使得本领域的其他技术人员可以利用其教导。
1. 包含IgG重链恒定区和轻链恒定区的抗体，其中所述抗体包含以下残基中的至少一个处的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH2结构域中的残基262，CH3结构域中的残基375，CH3结构域中的残基373，CH3结构域中的残基397，CH3结构域中的残基415，Cκ结构域中的残基156，Cκ结构域中的残基171，Cκ结构域中的残基191，Cκ结构域中的残基193，Cκ结构域中的残基202，或Cκ结构域中的残基208。
2. 实施方案1的抗体，其中所述抗体包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，且进一步包含CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。
3. 实施方案1或2的抗体，其中所述抗体在CH1结构域的残基157处包含半胱氨酸。
4. 实施方案2的抗体，其中所述抗体在CH3结构域的残基375处包含半胱氨酸。
5. 实施方案2的抗体，其中所述抗体在CH3结构域的残基378处包含半胱氨酸。
6. 实施方案1至4中任一项的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。
7. 实施方案5的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1或人IgG4同种型。
8. 实施方案6的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1。
9. 实施方案1的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列给出的人IgG1。
10. 实施方案2的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出的人IgG1。
11. 根据实施方案7至9中任一项所述的抗体，其中所述IgG1重链恒定区进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和任选地在残基332处取代的谷氨酸。
12. 实施方案6的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人IgG4。
13. 实施方案1的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列给出的人IgG4。
14. 实施方案2的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出的人IgG4。
15. 根据实施方案11至13中任一项所述的抗体，其中所述IgG4重链恒定区进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。
16. 根据实施方案1所述的抗体，其包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含IgG重链恒定区，所述IgG重链恒定区包含以下残基之一处的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH3结构域中的残基375，和CH3结构域中的残基373。
17. 实施方案15的抗体，其中所述抗体包含每条重链的CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，且进一步包含每条重链的CH3结构域中的残基375和378以及CH1结构域中的残基157中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。
18. 实施方案16的抗体，其中所述抗体在每条重链的CH3结构域的残基375处包含半胱氨酸。
19. 实施方案16的抗体，其中所述抗体在每条重链的CH3结构域的残基378处包含半胱氨酸。
20. 实施方案15至18中任一项的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。
21. 实施方案19的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人IgG1或人IgG4同种型。
22. 实施方案20的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人IgG1。
23. 实施方案15的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列给出的人IgG1。
24. 实施方案16的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出的人IgG1。
25. 根据实施方案21至23中任一项所述的抗体，其中所述IgG1重链恒定区各自进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和任选地在残基332处取代的谷氨酸。
26. 实施方案20的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人IgG4。
27. 实施方案15的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列给出的人IgG4。
28. 实施方案16的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出的人IgG4。
29. 根据实施方案25至27中任一项所述的抗体，其中所述IgG4重链恒定区各自进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。
30. 根据实施方案1-28中任一项所述的抗体，其中每个IgG恒定区的残基124、157、162、375或378处的每个半胱氨酸经由马来酰亚胺-PEG接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽。
31. 实施方案29的缀合的抗体，其包含在每个IgG恒定区的残基124处的半胱氨酸和每个IgG恒定区的残基157、162、375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸，其中每个IgG恒定区的残基124和157、162、375或378处的每个半胱氨酸经由下式的马来酰亚胺-PEG接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽
Figure 191679DEST_PATH_IMAGE040
其中所述接头通过与所述IgG恒定区的残基124和157、162、375或378处的半胱氨酸的硫醚键共价附接至所述抗体，并且通过肽的C-末端赖氨酸的ε氨基处的酰胺键共价附接至所述N-甲酰-甲硫氨酸肽；且其中n = 6-24。
32. 实施方案30的缀合的抗体，其中每个IgG恒定区的残基124处的半胱氨酸和残基375处的半胱氨酸经由所述马来酰亚胺-PEG接头缀合至所述N-甲酰甲硫氨酸肽。
33. 实施方案30的缀合的抗体，其中每个IgG恒定区的残基124处的半胱氨酸和残基378处的半胱氨酸经由所述马来酰亚胺-PEG接头缀合至所述N-甲酰甲硫氨酸肽。
34. 实施方案30至32中任一项的缀合的抗体，其中n = 12。
35. 实施方案29至33中任一项的缀合的抗体，其中所述N-甲酰甲硫氨酸肽由SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40或SEQ ID NO:41给出。
36. 药物组合物，其包含实施方案29至34中任一项的缀合的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
37. 治疗实体癌或液体肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的根据实施方案29至35中任一项的缀合的抗体或其药物组合物。
38. 根据实施方案36所述的方法，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
39. 实施方案29至35中任一项的缀合的抗体，其用于疗法中。
40. 实施方案29至35中任一项的缀合的抗体，其用于治疗实体癌或液体肿瘤。
41. 实施方案39的缀合的抗体，用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
42. 化合物，其为包含至少一个工程改造的半胱氨酸的抗体，其中所述抗体通过接头缀合至能够吸引和/或活化免疫系统的一种或多种细胞的化学引诱物，且其中所述化学引诱物在抗体内的一个或多个半胱氨酸残基处缀合至抗体。
43. 实施方案42的化合物，其中所述抗体是单克隆抗体或双特异性抗体。
44. 实施方案42的化合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
45. 实施方案42的化合物，其中所述抗体是双特异性抗体。
46. 实施方案42-45中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸是抗体可变区内的工程改造的半胱氨酸。
47. 实施方案42-45中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸是抗体恒定区内的工程改造的半胱氨酸。
48. 实施方案42-45中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸是CH1或CH3结构域内的工程改造的半胱氨酸。
49. 实施方案42-48中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸在替代天然的丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸或甘氨酸的位置被工程改造。
50. 实施方案49的化合物，其中所述半胱氨酸在替代天然的丝氨酸、缬氨酸或丙氨酸的位置被工程改造。
51. 实施方案42-50中任一项的化合物，其中所述工程改造的半胱氨酸的总数在2和6之间。
52. 实施方案42-51中任一项的化合物，其中所述化合物能够吸引和活化免疫系统的一种或多种细胞。
53. 实施方案42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统是适应性免疫系统。
54. 实施方案42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统是先天性免疫系统。
55. 实施方案42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统的一种或多种细胞是嗜中性粒细胞。
56. 实施方案42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统的一种或多种细胞是巨噬细胞。
57. 实施方案42-56中任一项的化合物，其中所述接头是PEG接头或Mal-Dap接头。
58. 实施方案57的化合物，其中所述接头是PEG接头。
59. 实施方案57的化合物，其中所述接头是Mal-Dap接头。
60. 实施方案42-58中任一项的化合物，其中所述抗体包含IgG重链恒定区和轻链恒定区，其中所述恒定区包含以下残基中的至少一个处的工程改造的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH2结构域中的残基262，CH3结构域中的残基375，CH3结构域中的残基373，CH3结构域中的残基397，CH3结构域中的残基415，Cκ结构域中的残基156，Cκ结构域中的残基171，Cκ结构域中的残基191，Cκ结构域中的残基193，Cκ结构域中的残基202，或Cκ结构域中的残基208。
61. 实施方案60的化合物，其中所述抗体包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，且进一步包含CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。
62. 实施方案61的化合物，其中所述抗体在CH1结构域的残基157处包含半胱氨酸。
63. 实施方案61的化合物，其中所述抗体在CH3结构域的残基375处包含半胱氨酸。
64. 实施方案61的化合物，其中所述抗体在CH3结构域的残基378处包含半胱氨酸。
65. 实施方案42-64中任一项的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。
66. 实施方案65的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1或人IgG4同种型。
67. 实施方案66的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1。
68. 实施方案67的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列给出的人IgG1。
69. 实施方案67的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出的人IgG1。
70. 实施方案66-69中任一项的化合物，其中所述IgG1重链恒定区进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和任选地在残基332处取代的谷氨酸。
71. 实施方案66的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人IgG4。
72. 实施方案71的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列给出的人IgG4。
73. 实施方案71的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出的人IgG4。
74. 根据实施方案71-73中任一项所述的抗体，其中所述IgG4重链恒定区进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。
75. 实施方案42-74中任一项的化合物，其中所述化学引诱物是f-Met肽、小分子FPR-1激动剂、PRR激动剂、肽模拟物、N-脲基-肽或细菌糖。
76. 实施方案75的化合物，其中所述化学引诱物是N-甲酰甲硫氨酸肽。
77. 实施方案76的化合物，其中所述N-甲酰肽由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41给出。
78. 实施方案42-78中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸经由马来酰亚胺-PEG接头缀合至化学引诱物。
79. 实施方案78的化合物，其中所述半胱氨酸经由下式的马来酰亚胺-PEG接头缀合至化学引诱物
Figure 680299DEST_PATH_IMAGE041
其中所述接头通过与半胱氨酸的硫醚键共价附接至所述抗体，且通过肽的C-末端赖氨酸的ε氨基处的酰胺键共价附接至所述化学引诱物；且其中n = 2-24。
80. 实施方案79的化合物，其中n = 12。
81. 药物组合物，其包含实施方案42-80中任一项的化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
82. 治疗实体癌或液体肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的根据实施方案42-81中任一项的化合物或其药物组合物。
83. 根据实施方案82所述的方法，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
84. 实施方案42-80中任一项的化合物，其用于疗法中。
85. 实施方案42-80中任一项的化合物，其用于治疗实体癌或液体肿瘤。
86. 实施方案42-80中任一项的化合物，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
87. 化合物R-P1-P2-P3-NH(CH2CH2O) nCH2CH2-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) P3是具有ε氨基酰化的赖氨酸；
(vi) n是6-24的整数；
(vii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(viii) 或其盐。
88. 化合物R-P1-P2-NH(CH2CH2O) nCH2CH2-P3-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) P3是具有ε氨基酰化的赖氨酸；
(vi) n是6-24的整数；
(vii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(viii) 或其盐。
89. 化合物R-Met-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2--X5-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是苯基、4-氯苯基、4-甲氧基苯基、对甲苯基、间甲苯基、芳基、取代的芳基或2-烯丙基；
(iii) P2是肽或肽模拟物；
(iv) X5是C2-C10二氨基烷基；且
(v) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(xi) 或其盐。
90. 化合物[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)n CH2CH2-]2-Q-X-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) n是6-24的整数；
(vi) Q是Lys、Orn、Dap、Dab或能够在α氨基和侧链氨基处被酰化的其他氨基双官能残基；
(vii) X是C2-C10二氨基烷基；且
(viii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(ix) 或其盐。
91. 化合物[[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2-]4-(Q)2-Q-X-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) n是6-24的整数；
(vi) Q是Lys、Orn、Dap、Dab或能够在α氨基和侧链氨基处被酰化的其他氨基双官能残基；
(vii) X是C2-C10二氨基烷基；且
(viii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(ix) 或其盐。
92. 化合物[[[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2-]8-(Q)4-(Q)2-Q-X-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) n是6-24的整数；
(vi) Q是Lys、Orn、Dap、Dab或能够在α氨基和侧链氨基处被酰化的其他氨基双官能残基；
(vii) X是C2-C10二氨基烷基；且
(viii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(ix) 或其盐。
93. 实施方案87-92中任一项的化合物，其中P2由X1-X2-X3-X4给出，且其中：
(i) X1是Leu、Ile、Nle、二乙基甘氨酸或二丙基甘氨酸；
(ii) X2是Phe、α-Me-Phe、DPhe、4-F-Phe、2-Nal或1-Nal；
(iii) X3是Glu、Leu、Nle、α-Me-Leu、DLeu或不存在；且
(iv) X4是Glu、DGlu、γGlu、Gla或不存在。
94. 实施方案87-93中任一项的化合物，其中所述化合物能够通过硫醚键共价附接至抗体或抗体片段。
95. 实施方案87-94中任一项的化合物，其中所述化合物能够通过如下半胱氨酸处的硫醚键共价附接至抗体或抗体片段：CH1结构域中的残基124、CH1结构域中的残基157、CH1结构域中的残基162、CH2结构域中的残基262、CH3结构域中的残基375、CH3结构域中的残基373、CH3结构域中的残基397、CH3结构域中的残基415、Cκ结构域中的残基156、Cκ结构域中的残基171、Cκ结构域中的残基191、Cκ结构域中的残基193、Cκ结构域中的残基202或Cκ结构域中的残基208。
96. 化合物，其为含有至少一个通过接头与实施方案87-95中任一项的化合物缀合的半胱氨酸的抗体，所述实施方案87-95中任一项的化合物能够吸引和/或活化免疫系统的一种或多种细胞，且其中药剂在抗体内的一个或多个半胱氨酸残基处缀合至抗体。
序列
依米妥珠单抗 378C缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:1)
Figure 40873DEST_PATH_IMAGE042
(位置373处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 124C缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:2)
Figure 427992DEST_PATH_IMAGE043
(位置122处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 124C-378C缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:3)
Figure 797793DEST_PATH_IMAGE044
(位置122处的X和位置373处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 124C-375C缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:4)
Figure 626072DEST_PATH_IMAGE045
(位置122处的X和位置370处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:5)
Figure 423127DEST_PATH_IMAGE046
TMab 124C-378C缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:6)
Figure 31962DEST_PATH_IMAGE047
(位置127处的X和位置381处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
TMab缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:7)
Figure 205455DEST_PATH_IMAGE048
AME133 124C-378C缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:8)
Figure 403087DEST_PATH_IMAGE049
(位置128处的X和位置382处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
AME133缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:9)
Figure 371043DEST_PATH_IMAGE050
人IgG1恒定区(SEQ ID NO:10)
Figure 467175DEST_PATH_IMAGE051
人IgG4恒定区(SEQ ID NO:11)
Figure 178779DEST_PATH_IMAGE052
IgG4 124C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:12)
Figure 981650DEST_PATH_IMAGE053
(位置7处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 378C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:13)
Figure 120507DEST_PATH_IMAGE054
(位置258处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 375C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:14)
Figure 703935DEST_PATH_IMAGE055
(位置255处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 124C-378C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:15)
Figure 140602DEST_PATH_IMAGE056
(位置7处的X和位置258处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 124C-375C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:16)
Figure 125875DEST_PATH_IMAGE057
(位置7处的X和位置255处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 124C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:17)
Figure 435634DEST_PATH_IMAGE058
(位置7处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 378C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:18)
Figure 506358DEST_PATH_IMAGE059
(位置261处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 375C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:19)
Figure 497448DEST_PATH_IMAGE060
(位置258处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 124C-378C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:20)
Figure 337228DEST_PATH_IMAGE061
(位置7处的X和位置261处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 124C-375C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:21)
Figure 817888DEST_PATH_IMAGE062
(位置7处的X和位置258处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
fMLFX (肽-’183) (SEQ ID NO:22)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置4处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成酰胺键修饰的赖氨酸残基)
fMLFK (SEQ ID NO:23)
(位置1处的Met被甲酰化)
MLFX (肽-’844) (SEQ ID NO:24)
(位置4处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成酰胺键修饰的赖氨酸残基)
MLFK (SEQ ID NO:25)
MET 415C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:26)
Figure 110329DEST_PATH_IMAGE063
(位置410处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
MET 156C抗体缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:27)
Figure 154377DEST_PATH_IMAGE064
(位置157处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
MET 171C抗体缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:28)
Figure 848664DEST_PATH_IMAGE065
(位置172处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
MET 191C抗体缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:29)
Figure 500225DEST_PATH_IMAGE066
(位置192处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
MET 193C抗体缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:30)
Figure 483224DEST_PATH_IMAGE067
(位置194处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
MET 202C抗体缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:31)
Figure 878433DEST_PATH_IMAGE068
(位置203处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
MET 208C抗体缀合物的抗体轻链(SEQ ID NO:32)
Figure 427226DEST_PATH_IMAGE069
(位置209处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
曲妥珠单抗124C-157C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:33)
Figure 515268DEST_PATH_IMAGE070
(位置127处的X和位置160处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
124C-378C双特异性抗体I缀合物的抗体重链A(SEQ ID NO:34)
Figure 969252DEST_PATH_IMAGE071
(位置126处的X和位置380处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
124C-378C双特异性抗体I缀合物的抗体重链B(SEQ ID NO:35)
Figure 168152DEST_PATH_IMAGE072
(位置128处的X和位置382处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
fMIFLX (FRM-021) (SEQ ID NO:36)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置5处的X是通过与水解的马来酰亚胺-PEG接头形成ε酰胺键修饰的赖氨酸残基侧链)
fMXFX (FRM-029) (SEQ ID NO:37)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置2处的X是二乙基甘氨酸)
(位置4处的X是通过与式(PEG6)2-NH-(CH2)2-NH2的PEG接头形成酰胺键C-末端连接的亮氨酸残基)
fMXFX (FRM-030) (SEQ ID NO:38)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置2处的X是二丙基甘氨酸)
(位置4处的X是通过与式(PEG6)2-NH-(CH2)2-NH2的PEG接头形成酰胺键C-末端连接的亮氨酸残基)
fMIX (FRM-031) (SEQ ID NO:39)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置3处的X是通过与式PEG12-NH-(CH2)2-NH2的PEG接头形成酰胺键C-末端连接的苯丙氨酸残基)
fMIFX (FRM-023) (SEQ ID NO:40)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置4处的X是通过与式PEG12-NH-(CH2)2-NH2的PEG接头形成酰胺键C-末端连接的的亮氨酸残基)
fMIFX (FRM-032) (SEQ ID NO:41)
(位置1处的Met被甲酰化)
(位置4处的X是通过与式NH-(CH2)-NH-[(Mal-Dap(NH2)]的接头形成酰胺键修饰的亮氨酸残基)
fNleLX (FRM-009) (SEQ ID NO:42)
(位置1处的Nle被甲酰化)
(位置3处的X是通过与式PEG12-Lys(马来酰亚胺基-丙酰基)-OH的接头形成酰胺键C-末端连接的苯丙氨酸)
依米妥珠单抗缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:43)
Figure 571452DEST_PATH_IMAGE073
依米妥珠单抗 157C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:44)
Figure 830395DEST_PATH_IMAGE074
(位置155处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 162C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:45)
Figure 522407DEST_PATH_IMAGE075
(位置160处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 262C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:46)
Figure 259419DEST_PATH_IMAGE076
(位置257处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 375C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:47)
Figure 782804DEST_PATH_IMAGE077
(位置370处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 397C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:48)
Figure 405459DEST_PATH_IMAGE078
(位置392处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 124C-157C-378C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:49)
Figure 381505DEST_PATH_IMAGE079
(位置122处的X和位置155处的X和位置373处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
依米妥珠单抗 124C-162C-378C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:50)
Figure 922208DEST_PATH_IMAGE080
(位置122处的X和位置160处的X和位置373处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
Tmab (IQE) 124C-378C抗体缀合物的抗体重链(SEQ ID NO:51)
Figure 565679DEST_PATH_IMAGE081
(位置127处的X和位置381处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 157C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:52)
Figure 838528DEST_PATH_IMAGE082
(位置40处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG1 124C-157C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:53)
Figure 567450DEST_PATH_IMAGE083
(位置7处的X和位置40处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 157C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:54)
Figure 646264DEST_PATH_IMAGE084
(位置40处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 162C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:55)
Figure 331192DEST_PATH_IMAGE085
(位置45处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 124C-157C-373C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:56)
Figure 837260DEST_PATH_IMAGE086
(位置7处的X和位置40处的X和位置258处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
IgG4 124C-162C-373C缀合物的抗体重链恒定区(SEQ ID NO:57)
Figure 53478DEST_PATH_IMAGE087
(位置7处的X和位置45处的X和位置258处的X是通过与马来酰亚胺-PEG接头形成硫醚键修饰的半胱氨酸残基)
双特异性抗体I缀合物的抗体轻链A(SEQ ID NO:58)
Figure 935983DEST_PATH_IMAGE088
双特异性抗体I缀合物的抗体轻链B(SEQ ID NO:59)
Figure 226150DEST_PATH_IMAGE089
Figure IDA0002314570010000011
Figure IDA0002314570010000021
Figure IDA0002314570010000031
Figure IDA0002314570010000041
Figure IDA0002314570010000051
Figure IDA0002314570010000061
Figure IDA0002314570010000071
Figure IDA0002314570010000081
Figure IDA0002314570010000091
Figure IDA0002314570010000101
Figure IDA0002314570010000111
Figure IDA0002314570010000121
Figure IDA0002314570010000131
Figure IDA0002314570010000141
Figure IDA0002314570010000151
Figure IDA0002314570010000161
Figure IDA0002314570010000171
Figure IDA0002314570010000181
Figure IDA0002314570010000191
Figure IDA0002314570010000201
Figure IDA0002314570010000211
Figure IDA0002314570010000221
Figure IDA0002314570010000231
Figure IDA0002314570010000241
Figure IDA0002314570010000251
Figure IDA0002314570010000261
Figure IDA0002314570010000271
Figure IDA0002314570010000281
Figure IDA0002314570010000291
Figure IDA0002314570010000301
Figure IDA0002314570010000311
Figure IDA0002314570010000321
Figure IDA0002314570010000331
Figure IDA0002314570010000341
Figure IDA0002314570010000351
Figure IDA0002314570010000361
Figure IDA0002314570010000371
Figure IDA0002314570010000381
Figure IDA0002314570010000391
Figure IDA0002314570010000401
Figure IDA0002314570010000411
Figure IDA0002314570010000421
Figure IDA0002314570010000431
Figure IDA0002314570010000441
Figure IDA0002314570010000451
Figure IDA0002314570010000461
Figure IDA0002314570010000471
Figure IDA0002314570010000481
Figure IDA0002314570010000491
Figure IDA0002314570010000501
Figure IDA0002314570010000511
Figure IDA0002314570010000521
Figure IDA0002314570010000531
Figure IDA0002314570010000541
Figure IDA0002314570010000551
Figure IDA0002314570010000561
Figure IDA0002314570010000571
Figure IDA0002314570010000581
Figure IDA0002314570010000591
Figure IDA0002314570010000601
Figure IDA0002314570010000611
Figure IDA0002314570010000621
Figure IDA0002314570010000631
Figure IDA0002314570010000641
Figure IDA0002314570010000651
Figure IDA0002314570010000661
Figure IDA0002314570010000671
Figure IDA0002314570010000681
Figure IDA0002314570010000691
Figure IDA0002314570010000701
Figure IDA0002314570010000711
Figure IDA0002314570010000721
Figure IDA0002314570010000731
Figure IDA0002314570010000741
Figure IDA0002314570010000751
Figure IDA0002314570010000761
Figure IDA0002314570010000771
Figure IDA0002314570010000781
Figure IDA0002314570010000791
Figure IDA0002314570010000801
Figure IDA0002314570010000811
Figure IDA0002314570010000821
Figure IDA0002314570010000831
Figure IDA0002314570010000841
Figure IDA0002314570010000851
Figure IDA0002314570010000861
Figure IDA0002314570010000871
Figure IDA0002314570010000881
Figure IDA0002314570010000891
Figure IDA0002314570010000901
Figure IDA0002314570010000911
Figure IDA0002314570010000921
Figure IDA0002314570010000931
Figure IDA0002314570010000941

Claims (96)

1.包含IgG重链恒定区和轻链恒定区的抗体，其中所述抗体包含以下残基中的至少一个处的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH2结构域中的残基262，CH3结构域中的残基375，CH3结构域中的残基373，CH3结构域中的残基397，CH3结构域中的残基415，Cκ结构域中的残基156，Cκ结构域中的残基171，Cκ结构域中的残基191，Cκ结构域中的残基193，Cκ结构域中的残基202，或Cκ结构域中的残基208。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，且进一步包含CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体在CH1结构域的残基157处包含半胱氨酸。
4.权利要求2的抗体，其中所述抗体在CH3结构域的残基375处包含半胱氨酸。
5.权利要求2的抗体，其中所述抗体在CH3结构域的残基378处包含半胱氨酸。
6.权利要求1至4中任一项的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。
7.权利要求5的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1或人IgG4同种型。
8.权利要求6的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1。
9.权利要求1的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列给出的人IgG1。
10.权利要求2的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出的人IgG1。
11.根据权利要求7至9中任一项所述的抗体，其中所述IgG1重链恒定区进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和任选地在残基332处取代的谷氨酸。
12.权利要求6的抗体，其中所述IgG重链恒定区是人IgG4。
13.权利要求1的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列给出的人IgG4。
14.权利要求2的抗体，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出的人IgG4。
15.根据权利要求11至13中任一项所述的抗体，其中所述IgG4重链恒定区进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。
16.根据权利要求1所述的抗体，其包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含IgG重链恒定区，所述IgG重链恒定区包含以下残基之一处的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH3结构域中的残基375，和CH3结构域中的残基373。
17.权利要求15的抗体，其中所述抗体包含每条重链的CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，且进一步包含每条重链的CH3结构域中的残基375和378以及CH1结构域中的残基157中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。
18.权利要求16的抗体，其中所述抗体在每条重链的CH3结构域的残基375处包含半胱氨酸。
19.权利要求16的抗体，其中所述抗体在每条重链的CH3结构域的残基378处包含半胱氨酸。
20.权利要求15至18中任一项的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。
21.权利要求19的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人IgG1或人IgG4同种型。
22.权利要求20的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人IgG1。
23.权利要求15的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列给出的人IgG1。
24.权利要求16的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出的人IgG1。
25.根据权利要求21至23中任一项所述的抗体，其中所述IgG1重链恒定区各自进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和任选地在残基332处取代的谷氨酸。
26.权利要求20的抗体，其中所述IgG重链恒定区各自是人IgG4。
27.权利要求15的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列给出的人IgG4。
28.权利要求16的抗体，其中所述重链恒定区各自是由SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出的人IgG4。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的抗体，其中所述IgG4重链恒定区各自进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中每个IgG恒定区的残基124、157、162、375或378处的每个半胱氨酸经由马来酰亚胺-PEG接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽。
31.权利要求29的缀合的抗体，其包含在每个IgG恒定区的残基124处的半胱氨酸和每个IgG恒定区的残基157、162、375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸，其中每个IgG恒定区的残基124和157、162、375或378处的每个半胱氨酸经由下式的马来酰亚胺-PEG接头缀合至N-甲酰-甲硫氨酸肽
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中所述接头通过与所述IgG恒定区的残基124和157、162、375或378处的半胱氨酸的硫醚键共价附接至所述抗体，并且通过肽的C-末端赖氨酸的ε氨基处的酰胺键共价附接至所述N-甲酰-甲硫氨酸肽；且其中n = 6-24。
32.权利要求30的缀合的抗体，其中每个IgG恒定区的残基124处的半胱氨酸和残基375处的半胱氨酸经由所述马来酰亚胺-PEG接头缀合至所述N-甲酰甲硫氨酸肽。
33.权利要求30的缀合的抗体，其中每个IgG恒定区的残基124处的半胱氨酸和残基378处的半胱氨酸经由所述马来酰亚胺-PEG接头缀合至所述N-甲酰甲硫氨酸肽。
34.权利要求30至32中任一项的缀合的抗体，其中n = 12。
35.权利要求29至33中任一项的缀合的抗体，其中所述N-甲酰甲硫氨酸肽由SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40或SEQ ID NO:41给出。
36.药物组合物，其包含权利要求29至34中任一项的缀合的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
37.治疗实体癌或液体肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的根据权利要求29至35中任一项的缀合的抗体或其药物组合物。
38.根据权利要求36所述的方法，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
39.权利要求29至35中任一项的缀合的抗体，其用于疗法中。
40.权利要求29至35中任一项的缀合的抗体，其用于治疗实体癌或液体肿瘤。
41.权利要求39的缀合的抗体，用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
42.化合物，其为包含至少一个工程改造的半胱氨酸的抗体，其中所述抗体通过接头缀合至能够吸引和/或活化免疫系统的一种或多种细胞的化学引诱物，且其中所述化学引诱物在抗体内的一个或多个半胱氨酸残基处缀合至抗体。
43.权利要求42的化合物，其中所述抗体是单克隆抗体或双特异性抗体。
44.权利要求42的化合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
45.权利要求42的化合物，其中所述抗体是双特异性抗体。
46.权利要求42-45中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸是抗体可变区内的工程改造的半胱氨酸。
47.权利要求42-45中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸是抗体恒定区内的工程改造的半胱氨酸。
48.权利要求42-45中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸是CH1或CH3结构域内的工程改造的半胱氨酸。
49.权利要求42-48中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸在替代天然的丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸或甘氨酸的位置被工程改造。
50.权利要求49的化合物，其中所述半胱氨酸在替代天然的丝氨酸、缬氨酸或丙氨酸的位置被工程改造。
51.权利要求42-50中任一项的化合物，其中所述工程改造的半胱氨酸的总数在2和6之间。
52.权利要求42-51中任一项的化合物，其中所述化合物能够吸引和活化免疫系统的一种或多种细胞。
53.权利要求42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统是适应性免疫系统。
54.权利要求42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统是先天性免疫系统。
55.权利要求42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统的一种或多种细胞是嗜中性粒细胞。
56.权利要求42-52中任一项的化合物，其中所述免疫系统的一种或多种细胞是巨噬细胞。
57.权利要求42-56中任一项的化合物，其中所述接头是PEG接头或Mal-Dap接头。
58.权利要求57的化合物，其中所述接头是PEG接头。
59.权利要求57的化合物，其中所述接头是Mal-Dap接头。
60.权利要求42-58中任一项的化合物，其中所述抗体包含IgG重链恒定区和轻链恒定区，其中所述恒定区包含以下残基中的至少一个处的工程改造的半胱氨酸：CH1结构域中的残基124，CH1结构域中的残基157，CH1结构域中的残基162，CH2结构域中的残基262，CH3结构域中的残基375，CH3结构域中的残基373，CH3结构域中的残基397，CH3结构域中的残基415，Cκ结构域中的残基156，Cκ结构域中的残基171，Cκ结构域中的残基191，Cκ结构域中的残基193，Cκ结构域中的残基202，或Cκ结构域中的残基208。
61.权利要求60的化合物，其中所述抗体包含CH1结构域的残基124处的半胱氨酸，且进一步包含CH1结构域中的残基157和162以及CH3结构域中的残基375和378中的一个、但不是全部处的半胱氨酸。
62.权利要求61的化合物，其中所述抗体在CH1结构域的残基157处包含半胱氨酸。
63.权利要求61的化合物，其中所述抗体在CH3结构域的残基375处包含半胱氨酸。
64.权利要求61的化合物，其中所述抗体在CH3结构域的残基378处包含半胱氨酸。
65.权利要求42-64中任一项的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人、小鼠、大鼠或兔IgG恒定区。
66.权利要求65的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1或人IgG4同种型。
67.权利要求66的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人IgG1。
68.权利要求67的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:17、18、19或52的氨基酸序列给出的人IgG1。
69.权利要求67的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:20、21或53的氨基酸序列给出的人IgG1。
70.权利要求66-69中任一项的化合物，其中所述IgG1重链恒定区进一步包含在残基247处取代的异亮氨酸、在残基339处取代的谷氨酰胺和任选地在残基332处取代的谷氨酸。
71.权利要求66的化合物，其中所述IgG重链恒定区是人IgG4。
72.权利要求71的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:12、13、14、54或55的氨基酸序列给出的人IgG4。
73.权利要求71的化合物，其中所述重链恒定区是由SEQ ID NO:15、16、56或57的氨基酸序列给出的人IgG4。
74.根据权利要求71-73中任一项所述的抗体，其中所述IgG4重链恒定区进一步包含在残基228处取代的脯氨酸、在残基234处取代的丙氨酸和在残基235处取代的丙氨酸和在残基339处取代的谷氨酰胺。
75.权利要求42-74中任一项的化合物，其中所述化学引诱物是f-Met肽、小分子FPR-1激动剂、PRR激动剂、肽模拟物、N-脲基-肽或细菌糖。
76.权利要求75的化合物，其中所述化学引诱物是N-甲酰甲硫氨酸肽。
77.权利要求76的化合物，其中所述N-甲酰肽由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41给出。
78.权利要求42-78中任一项的化合物，其中所述半胱氨酸经由马来酰亚胺-PEG接头缀合至化学引诱物。
79.权利要求78的化合物，其中所述半胱氨酸经由下式的马来酰亚胺-PEG接头缀合至化学引诱物
Figure 494763DEST_PATH_IMAGE002
其中所述接头通过与半胱氨酸的硫醚键共价附接至所述抗体，且通过肽的C-末端赖氨酸的ε氨基处的酰胺键共价附接至所述化学引诱物；且其中n = 2-24。
80.权利要求79的化合物，其中n = 12。
81.药物组合物，其包含权利要求42-80中任一项的化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
82.治疗实体癌或液体肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的根据权利要求42-81中任一项的化合物或其药物组合物。
83.根据权利要求82所述的方法，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
84.权利要求42-80中任一项的化合物，其用于疗法中。
85.权利要求42-80中任一项的化合物，其用于治疗实体癌或液体肿瘤。
86.权利要求42-80中任一项的化合物，其用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、间皮癌、血管癌、纤维状癌、白血病或淋巴瘤。
87.化合物R-P1-P2-P3-NH(CH2CH2O) nCH2CH2-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) P3是具有ε氨基酰化的赖氨酸；
(vi) n是6-24的整数；
(vii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(viii) 或其盐。
88.化合物R-P1-P2-NH(CH2CH2O) nCH2CH2-P3-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) P3是具有ε氨基酰化的赖氨酸；
(vi) n是6-24的整数；
(vii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(viii) 或其盐。
89.化合物R-Met-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2--X5-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是苯基、4-氯苯基、4-甲氧基苯基、对甲苯基、间甲苯基、芳基、取代的芳基或2-烯丙基；
(iii) P2是肽或肽模拟物；
(iv) X5是C2-C10二氨基烷基；且
(v) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(xi) 或其盐。
90.化合物[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)n CH2CH2-]2-Q-X-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) n是6-24的整数；
(vi) Q是Lys、Orn、Dap、Dab或能够在α氨基和侧链氨基处被酰化的其他氨基双官能残基；
(vii) X是C2-C10二氨基烷基；且
(viii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(ix) 或其盐。
91.化合物[[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2-]4-(Q)2-Q-X-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) n是6-24的整数；
(vi) Q是Lys、Orn、Dap、Dab或能够在α氨基和侧链氨基处被酰化的其他氨基双官能残基；
(vii) X是C2-C10二氨基烷基；且
(viii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(ix) 或其盐。
92.化合物[[[R-P1-P2-NH(CH2CH2O)nCH2CH2-]8-(Q)4-(Q)2-Q-X-Y，其中：
(i) R是HC(=O)-或R1NHC(=O)NH-；
(ii) R1是可以被取代或未被取代的C5-C10芳基；
(iii) P1是Met或Nle；
(iv) P2是肽或肽模拟物；
(v) n是6-24的整数；
(vi) Q是Lys、Orn、Dap、Dab或能够在α氨基和侧链氨基处被酰化的其他氨基双官能残基；
(vii) X是C2-C10二氨基烷基；且
(viii) Y是马来酰亚胺、马来酰亚胺-二氨基丙酸、碘乙酰胺或乙烯基砜；
(ix) 或其盐。
93.权利要求87-92中任一项的化合物，其中P2由X1-X2-X3-X4给出，且其中：
(i) X1是Leu、Ile、Nle、二乙基甘氨酸或二丙基甘氨酸；
(ii) X2是Phe、α-Me-Phe、DPhe、4-F-Phe、2-Nal或1-Nal；
(iii) X3是Glu、Leu、Nle、α-Me-Leu、DLeu或不存在；且
(iv)X4是Glu、DGlu、γGlu、Gla或不存在。
94.权利要求87-93中任一项的化合物，其中所述化合物能够通过硫醚键共价附接至抗体或抗体片段。
95.权利要求87-94中任一项的化合物，其中所述化合物能够通过如下半胱氨酸处的硫醚键共价附接至抗体或抗体片段：CH1结构域中的残基124、CH1结构域中的残基157、CH1结构域中的残基162、CH2结构域中的残基262、CH3结构域中的残基375、CH3结构域中的残基373、CH3结构域中的残基397、CH3结构域中的残基415、Cκ结构域中的残基156、Cκ结构域中的残基171、Cκ结构域中的残基191、Cκ结构域中的残基193、Cκ结构域中的残基202或Cκ结构域中的残基208。
96.化合物，其为含有至少一个通过接头与权利要求87-95中任一项的化合物缀合的半胱氨酸的抗体，所述权利要求87-95中任一项的化合物能够吸引和/或活化免疫系统的一种或多种细胞，且其中药剂在抗体内的一个或多个半胱氨酸残基处缀合至抗体。
CN201880038999.5A 2017-06-16 2018-06-14 工程改造的抗体化合物及其缀合物 Pending CN110869394A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762520855P 2017-06-16 2017-06-16
US62/520855 2017-06-16
PCT/US2018/037495 WO2018232088A1 (en) 2017-06-16 2018-06-14 Engineered antibody compounds and conjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110869394A true CN110869394A (zh) 2020-03-06

Family

ID=62875283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880038999.5A Pending CN110869394A (zh) 2017-06-16 2018-06-14 工程改造的抗体化合物及其缀合物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200155702A1 (zh)
EP (1) EP3638699A1 (zh)
JP (6) JP7073487B2 (zh)
CN (1) CN110869394A (zh)
CA (1) CA3066920A1 (zh)
WO (1) WO2018232088A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US20230348528A1 (en) * 2020-02-05 2023-11-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing and/or enriching recombinant antigen-binding molecules
WO2022261124A1 (en) 2021-06-11 2022-12-15 Eli Lilly And Company Peptides comprising n-formyl-halogenated methionine residues and engineered antibody-peptide conjugates thereof
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
TW202328183A (zh) 2021-08-05 2023-07-16 美商美國禮來大藥廠 人類介白素-4受體α抗體
CN118201640A (zh) * 2021-11-01 2024-06-14 达因疗法公司 用于治疗肌养蛋白病的肌肉靶向复合物
AR127562A1 (es) 2021-11-11 2024-02-07 Lilly Co Eli ANTICUERPOS CONTRA EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL a HUMANO
WO2023220549A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Eli Lilly And Company Human tumor necrosis factor alpha antibody glucocorticoid conjugates
WO2023235738A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Eli Lilly And Company Human interleukin-4 receptor alpha antibody glucocorticoid conjugates
US20240173425A1 (en) 2022-06-22 2024-05-30 Eli Lilly And Company Human cd33 antibodies and glucocorticoid conjugates
WO2024092219A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Eli Lilly And Company Self-hydrolyzing maleimides for bioconjugation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7521541B2 (en) * 2004-09-23 2009-04-21 Genetech Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN101528263A (zh) * 2006-06-30 2009-09-09 安德烈·科尔特曼 用于癌症的先天性免疫方法的缀合物
US20120010153A1 (en) * 2009-01-14 2012-01-12 Andre Koltermann Novel tumor-targeting compounds
CN105143271A (zh) * 2013-02-08 2015-12-09 Irm责任有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
CA2949033A1 (en) * 2015-11-30 2017-05-30 Pfizer Inc. Antibodies and antibody fragments for site-specific conjugation

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2609919T3 (es) * 2005-04-28 2017-04-25 Ventana Medical Systems, Inc. Enzimas conjugados con anticuerpos mediante un conector de PEG heterobifuncional
WO2009012256A1 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
EP3539982A3 (en) * 2011-12-23 2020-01-15 Pfizer Inc Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CN106659800A (zh) * 2014-03-12 2017-05-10 诺华股份有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
DK3151865T3 (da) * 2014-05-22 2021-10-25 Byondis Bv Stedsspecifik konjugation af linker medicin til antistof og resulterende adcs
JP2017525755A (ja) * 2014-06-20 2017-09-07 アブジェノミクス インターナショナル インコーポレイテッド．Ａｂｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ． Ｈｅｒ２抗体−薬物抱合体
US20190209704A1 (en) * 2014-10-20 2019-07-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions and methods of use
MA41375A (fr) 2015-01-22 2017-11-28 Lilly Co Eli Anticorps igg bispécifiques et leurs procédés de préparation
US20190194315A1 (en) * 2015-06-17 2019-06-27 Novartis Ag Antibody drug conjugates
MA44334A (fr) * 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7521541B2 (en) * 2004-09-23 2009-04-21 Genetech Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN101528263A (zh) * 2006-06-30 2009-09-09 安德烈·科尔特曼 用于癌症的先天性免疫方法的缀合物
US20120010153A1 (en) * 2009-01-14 2012-01-12 Andre Koltermann Novel tumor-targeting compounds
CN105143271A (zh) * 2013-02-08 2015-12-09 Irm责任有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
CA2949033A1 (en) * 2015-11-30 2017-05-30 Pfizer Inc. Antibodies and antibody fragments for site-specific conjugation

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022106970A (ja) 2022-07-20
CA3066920A1 (en) 2018-12-20
JP2020523413A (ja) 2020-08-06
JP7073487B2 (ja) 2022-05-23
JP2022106976A (ja) 2022-07-20
US20200155702A1 (en) 2020-05-21
JP2022106975A (ja) 2022-07-20
EP3638699A1 (en) 2020-04-22
JP2024059848A (ja) 2024-05-01
WO2018232088A1 (en) 2018-12-20
JP2024054197A (ja) 2024-04-16
JP7467526B2 (ja) 2024-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7467526B2 (ja) 操作された抗体化合物およびこれらの抱合体
JP6728264B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及びその結合体
CN113164621A (zh) 蛋白-药物偶联物和定点偶联方法
JP2021073279A (ja) Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌処置のためのアドレッシングビヒクルとしてのその使用
CN110300766A (zh) 新型重组双功能融合蛋白及其制备方法和用途
US20230330253A1 (en) Antibody-drug conjugates targeting claudin 18.2
CN117024591A (zh) 抗人b7-h3的单克隆抗体及其应用
WO2022188743A1 (en) Anti-her2 antibody-immune agonist conjugate and applications thereof
CN114127117A (zh) 用于偶联的多肽复合物及其应用
CN116744969A (zh) 用于癌症疗法的包含免疫检查点抑制剂与抗体-鹅膏毒素缀合物的组合的组合物
KR20230042518A (ko) 항-cd228 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트
CN114981301A (zh) Pd1和vegfr2双结合剂
CN117897407A (zh) 抗Nectin-4抗体、药物缀合物及其制备方法和用途
KR20230042524A (ko) 항-her2 / 항-4-1bb 이중특이적 항체 및 이의 용도
WO2024051747A1 (en) A pharmaceutical composition of anti-her2 antibody-immune agonist conjugate and applications thereof
CN114316045A (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
WO2023178451A1 (en) Anti-folate receptor alpha antibodies and methods of use
CN115975030A (zh) 抗cd39抗体-药物偶联物及其用途
BR112012003739A2 (pt) imunoconjugados, polinucleotídeo, microorganismo transgênico, método para produzir o imunoconjugado, composição e usos do imunoconjugado e da composição

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination