BR112012003739A2 - imunoconjugados, polinucleotídeo, microorganismo transgênico, método para produzir o imunoconjugado, composição e usos do imunoconjugado e da composição - Google Patents

Abstract

MUNOCONJUGADOS, POLINUCLEOTÍDEO, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, MÉTODO PARA PRODUZIR O IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃO E USOS DO IMUNOCONJUGADO E DA COMPOSIÇÃO A presente invenção refere-se a imunoconjugados. Em realizações específicas, a presente invenção refere-se a imunoconjugados que compreendem pelo menos um componente efetor de cadeia única e dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos. Além disso, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam esses imunoconjugados, vetores e células hospedeiras que compreendem essas moléculas de ácido nucléico. A invenção ainda refere-se a métodos para produzir os imunoconjugados da invenção e métodos de uso desses imunoconjugados no tratamento de doença.

Description

"IMUNOCONJUGADOS, POLINUCLEOTÍDEO, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, MÉTODO PARA PRODUZIR O IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃO E USOS DO IMUNOCONJUGADO E DA COMPOSIÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se em geral a imunoconjugados antígeno-específicos para seletivamente fornecer componentes efetores que influenciam a atividade celular. Além disso, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam esses imunoconjugados, e vetores e células hospedeiras que compreendem essas moléculas de ácido nucléico. A invenção ainda refere-se a métodos para produzir os imunoconjugados da invenção e métodos de uso desses imunoconjugados no tratamento da doença.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A destruição seletiva de uma célula individual ou de um tipo celular específico é frequentemente desejável em uma variedade de situações clínicas. Por exemplo, é um objetivo primário da terapia de câncer especificamente destruir células tumorais, ao mesmo tempo deixando as células e tecidos saudáveis intactos e sem danos. Uma grande quantidade de vias de transdução de sinal na célula está ligada à sobrevivência e/ou morte celular. Consequentemente, a entrega direta de um fator da via envolvido na sobrevivência ou morte celular pode ser usada para contribuir para a manutenção ou destruição da célula.

As citocinas são moléculas de sinalização celular que participam da regulação do sistema imunológico. Quando usadas na terapia de câncer, as citocinas podem atuar como agentes imunomoduladores que têm efeitos antitumorais e que podem aumentar a imunogenicidade de alguns tipos de tumores. No entanto, a liberação rápida do sangue e falta de especificidade de tumor requer administração sistêmica de altas doses da citocina, a fim de alcançar uma concentração da citocina no local do tumor, suficiente para ativar uma resposta imune ou ter um efeito antitumor. Esses altos níveis de citocina sistêmica podem levar à toxicidade grave e reações adversas.

Uma forma de entregar um fator da via de transdução de sinal, 5 como uma citocina, para um local específico in vivo (por exemplo, um tumor ou microambiente do tumor) é conjugar o fator a uma imunoglobulina específica para o local. Estratégias iniciais destinadas à entrega de fatores da via de transdução de sinal, como citocinas, para um local específico in vivo incluíram cadeias pesadas de imunoglobulina conjugadas a várias citocinas, incluindo linfotoxina, fator a de necrose tumoral (TNF-a), interleucina-2 (IL-2), e fator estimulador de colônia de macrófagos granulócitos (GM-CSF). As cadeias pesadas de imunoglobulina foram tanto quimicamente conjugadas a uma citocina, como o conjugado immunogobulina-citocinas foi expresso como uma proteína de fusão. Consulte Nakamura K. e Kubo, A. Cancer Supplement 80:2650-2655 (1997); Jun, L. et a/., Chin. Med. J. 113:151-153 (2000); e Becker J.C., et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7826-7831 (1996). Pesquisadores observaram que, eles eram não só capazes de direcionar citocinas a locais específicos in vivo, eles também eram capazes de tirar vantagem do fato de que os anticorpos monoclonais têm meia-vida no soro mais longa do que a maioria das outras proteínas. Devido à toxicidade sistêmica associada com altas doses de certas citocinas não conjugadas, ou seja, IL-2, a capacidade de uma proteína de fusão imunoglobulina-citocina em maximizar as atividades imunoestimuladoras no local de um tumor, ao mesmo tempo mantendo os efeitos colaterais sistêmicos a um mínimo em uma dose menor, levaram os pesquisadores a acreditar que os imunoconjugados imunoglobulina-citocina eram ótimos agentes terapêuticos. No entanto, uma das principais limitações na utilidade clínica de imunoglobulinas como agentes de entrega é a sua absorção inadequada e fraca distribuição nos tumores, em parte devido ao grande tamanho da molécula de imunoglobulina. Consulte Xiang, J. et a/., lmmunol. Ce/1 Biol. 72:275-285 (1994). Além disso, foi sugerido que o imunoconjugado imunoglobulina-citocina pode ativar complemento e interagir com receptores Fc. Essa característica inerente à imunoglobulina foi vista de 5 maneira desfavorável porque imunoconjugados terapêuticas podem ser direcionados às células que expressam receptores Fc ao invés das células que produzem antígenos preferencias.

Uma abordagem para superar esses problemas é o uso de fragmentos de imunoglobulina elaborados geneticamente. Numerosos estudos 1o têm detalhado as características de imunoconjugados fragmento de imunoglobulina-citocina. Consulte Savage, P. et ai., Br. J. Cancer 67:304-310 (1993); Harvill, E.T. e Morrison S.L., lmmunotechnol. 1:95-105 (1995); e Yang J. et a/., Mo/. lmmunol. 32:873-881 (1995). Em geral, há dois constructos comuns de proteínas de fusão fragmento de imunoglobulina-citocina, F(ab')2-citocina expressa em células de mamíferos e scFv-citocina expressa em Escherichia co/i. Consulte Xiang, J. Hum. Antibodies 9:23-36 (1999). Tanto a reatividade de ligação de tumor da molécula parenta I de imunoglobulina como a atividade funcional da citocina são mantidas na maioria desses tipos de imunoconjugados. Recentes estudos pré- clínicos demonstraram que essas proteínas de fusão são capazes de direcionar citocinas a tumores que expressam o antígeno associado ao tumor in vivo, e inibir tanto os tumores primários como metastáticos em um modelo animal imunocompetente.

Exemplos de imunoconjugados fragmento de imunoglobulina- citocina incluem o imunoconjugado scFv-IL-2, conforme estabelecido na publicação PCT documento WO 2001/062298 A2; o imunoconjugado fragmento da cadeia cadeia pesada de imunoglobulina-GM-CSF, conforme estabelecido na patente US 5.650.150; o imunoconjugado conforme estabelecido na publicação PCT documento WO 2006/119897 A2, em que a primeira subunidade scFv-IL-12 compartilha apenas ponte(s) de bissulfeto com a segunda subunidade IL-12-scFv, e o imunoconjugado conforme descrito na publicação PCT documento WO 99/29732 A2, em que o fragmento da cadeia pesada lg-primeira subunidade IL-12 compartilha apenas ponte(s) de bissulfeto com o fragmento da cadeia pesada de 5 lg-segunda subunidade IL-12. Embora essa segunda geração de imunoconjugados tenha algumas propriedades melhoradas em comparação com a primeira geração de conjugados imunoglobulina-citocina, o desenvolvimento de mais agentes terapêuticos específicos e ainda mais seguros é desejável para uma maior eficácia contra células tumorais e uma diminuição no número e gravidade 1o dos efeitos co late rias desses produtos (por exemplo, toxicidade, destruição de células não-tumorais, etc.). Além disso, é desejável identificar maneiras de ainda estabilizar os imunoconjugados, ao mesmo tempo mantendo níveis de atividade terapêutica aceitáveis.

A presente invenção fornece imunoconjugados que apresentam eficácia aprimorada, alta especificidade de ação, toxicidade reduzida e estabilidade aprimorada no sangue em relação ao imunoconjugado conhecido.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Um aspecto da presente invenção é direcionado a imunoconjugados que apresentam eficácia aprimorada, alta especificidade de ação, toxicidade reduzida e estabilidade aprimorada, em comparação a imunoconjugados conhecidos. Os imunoconjugados da presente invenção podem ser usados para entregar seletivamente componentes efetores para um local alvo in vivo. Em outra realização, o imunoconjugado entrega uma citocina a um local alvo, em que a citocina pode exercer um efeito biológico localizado, como uma resposta inflamatória local, estímulo de crescimento e ativação de células Te/ou ativação de células B e/ou NK.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um imunoconjugado que compreende pelo menos um primeiro componente efetor

.. 5 e pelo menos um primeiro e um segundo componente que se liga ao antígeno independentemente, selecionados a partir do grupo que consiste em um Fv e um Fab, em que um primeiro componente efetor compartilha uma ligação peptídica amino ou carboxi terminal com um primeiro antígeno que se liga a um 5 componente, e um segundo componente que se liga ao antígeno compartilha uma ligação peptídica amino ou carboxi terminal tanto com (i) o primeiro componente efetor ou com (ii) o primeiro componente que se liga ao antígeno.

Outro aspecto da presente invenção é um imunoconjugado que compreende pelo menos um primeiro componente efetor de cadeia única unido 10 pelo seu aminoácido amino terminal a uma ou mais moléculas scFv e em que o primeiro componente efetor de cadeia única está unido nos seus aminoácidos carboxi terminal a uma ou mais moléculas scFv.

Outro aspecto da presente invenção é um imunoconjugado que compreende pelo menos um primeiro componente efetor de cadeia única e 15 primeiro e segundo antígeno que se ligam aos componentes, em que cada um do primeiro e segundo componente que se liga aos antígenos compreende uma molécula scFv unida pelo seu aminoácido carboxi terminal a uma região constante que compreende um domínio constante da imunoglobulina independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: lgG CH1, 20 lgG Ckappa, e lgE CH4, e em que o primeiro componente que se liga ao antígeno está unido pela sua região constante do aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um dos componentes efetores, e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes estão covalentemente ligados através de pelo menos uma ponte bissulfeto.

25 Outro aspecto da presente invenção é um imunoconjugado que compreende pelo menos um primeiro componente efetor de cadeia única e primeiro e segundo antígeno que se ligam aos componentes, em que cada um do primeiro e segundo componente que se liga aos antígenos compreende uma molécula scFv unida pelo seu aminoácido carboxi terminal a um domínio lgG1 CH3, e em que o primeiro componente que se liga ao antígeno está unido pelo seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um dos componentes efetores, e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam 5 aos componentes estão covalentemente ligados através de pelo menos uma ponte bissulfeto.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado a um imunoconjugado que compreende primeiro e segundo componentes efetores de cadeia única e primeiro e segundo componentes que se ligam aos 1o antígenos, em que cada um dos antígenos que se liga aos componentes compreende uma molécula Fab unida pelo seu aminócido carboxi terminal da cadeia pesada ou leve a um domínio lgG1 CH3, e em que cada um dos domínio lgG1 CH3 está unido pelo seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um dos componentes efetores, e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes estão covalentemente ligados através de pelo menos uma ponte bissulfeto.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 95. Em outra realização, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 104. Em outra realização, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 105. Em outra realização, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 106. Em outra realização, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:

107. Em outra realização, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 96. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 96 e uma sequência de polipeptídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 95 e 104 a 107). Em outra realização, o imunoconjugado compreende um polipeptídeo que tem uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 95, 96, e 104 a

107.

5 Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 108. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 108. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 117. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 117. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 118. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 118. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 119. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 119. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%,

90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 120. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 120. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de 5 polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 109. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 109.

1o Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 13 como SEQ ID NO: 15. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 9 como SEQ ID NO: 11. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 13 como SEQ ID NO: 15, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 9 como SEQ ID NO: 11.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ ID NO: 14 como SEQ ID NO: 16. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ 10 NO: 14 como SEQ 10 NO: 16. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ lO NO: 1O 5 como SEQ 10 NO: 12. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ lO NO: 1O como SEQ lO NO: 12.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ lO NO: 99. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ lO NO: 100 como SEQ 10 NO: 215. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ 10 NO: 101 como SEQ 10 NO: 235. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ lO NO: 100, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ lO NO: 101. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 NO: 215, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 NO: 235.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ 10 NO: 112. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ 10 NO: 112. Em uma realização, o 5 imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ 10 NO: 113 como SEQ 10 NO: 216. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ 10 NO: 113 como SEQ 10 NO: 216. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ 10 NO: 114 como SEQ 10 NO: 236. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ 10 NO: 114 como SEQ 10 NO: 236.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ 10 NO: 187, SEQ 10 NO: 191, SEQ 10 NO: 195, SEQ 10 NO: 199, SEQ 10 NO: 203 e SEQ 10 NO: 207. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ 10 NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ 10 NO: 185, SEQ 10 NO: 189, SEQ ID NO: 193, SEQ 10 NO: 197, SEQ ID NO: 201 e SEQ 10 NO: 205. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 203 e SEQ 5 ID NO: 207, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201 e SEQ ID NO: 205.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 204 e SEQ ID NO:

208. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 204 e SEQ ID NO: 208. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 202 e SEQ ID NO: 206. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 202 e SEQ ID NO: 206.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma 5 sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241 e SEQ ID NO: 243. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247 e SEQ ID NO: 249. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241 e SEQ ID NO: 243, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247 e SEQ ID NO: 249.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242 e SEQ ID NO: 244. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242 e SEQ ID NO: 244. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%,

90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248 e SEQ ID NO: 250. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos selecionada 5 a partir do grupo de SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248 e SEQ ID NO: 250.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171 e SEQ ID NO: 175. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169 e SEQ ID NO: 173. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ lO NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ lO NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ lO NO: 43, SEQ lO NO: 47, SEQ lO NO: 51, SEQ lO NO: 69, SEQ lO NO: 73, SEQ lO NO: 77, SEQ lO NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ lO NO: 89, 5 SEQ ID NO: 93, SEQ lO NO: 123, SEQ lO NO: 127, SEQ lO NO: 131, SEQ lO NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ 10 NO: 167, SEQ ID NO: 171 e SEQ ID NO: 175, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ lO NO: 33, SEQ lO NO: 37, SEQ lO NO: 41, SEQ lO NO: 45, SEQ lO NO: 49, SEQ lO NO: 67, SEQ lO NO: 71, SEQ lO NO: 75, SEQ lO NO: 79, SEQ lO NO: 83, SEQ lO NO: 87, SEQ lO NO: 91, SEQ lO NO: 121, SEQ lO NO: 125, SEQ 10 NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ 10 NO: 137, SEQ 10 NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ 10 NO: 149, SEQ 10 NO: 153, SEQ 10 NO: 157, SEQ 10 NO: 161, SEQ lO NO: 165, SEQ lO NO: 169 e SEQ lO NO: 173.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 10 NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ 10 NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ 10 NO: 36, SEQ 10 NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ 10 NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ 10 NO: 70, SEQ 10 NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ 10 NO: 86, SEQ 10 NO: 90, SEQ 10 NO: 94, SEQ 10 NO: 124, SEQ 10 NO: 128, SEQ 10 NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ 10 NO: 144, SEQ 10 NO: 148, SEQ 10 NO: 152, SEQ 10 NO: 156, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ 10 NO: 168, SEQ ID NO: 172 e SEQ 10 NO: 176. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:

SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:

5 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID

NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ

ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:

132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148,

SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID

NO: 168, SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 176. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO NO: 18, SEQ

ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38,

SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:

72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID

NO: 92, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134,

SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150, SEQ ID

NO: 154, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO:

170 e SEQ ID NO: 174. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em

SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30,

SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:

50, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID

NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126,

SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID

NO: 146, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170 e SEQ ID NO: 174.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 5 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ lO NO: 209, SEQ lO NO: 211, SEQ lO NO: 213, SEQ lO NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ lO NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225 e SEQ ID NO: 227. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 229, SEQ lO NO: 231, SEQ lO NO: 233 e SEQ lO NO: 237. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ lO NO: 211, SEQ lO NO: 219, e SEQ lO NO: 221, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 231. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225 e SEQ ID NO: 227, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ lO NO: 229. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ lO NO: 213, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 233. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 217, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 5 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 237.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226 e SEQ ID NO: 228. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226 e SEQ ID NO: 228. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 230, SEQ 10 NO: 232, SEQ 10 NO: 234 e SEQ 10 NO: 238. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234 e SEQ ID NO: 238.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 257 como SEQ ID NO: 261. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 259 como SEQ ID NO: 271.

Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 5 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 257 como SEQ ID NO: 261, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 259 como SEQ ID NO: 271.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 258 como SEQ ID NO: 262. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 258 como SEQ ID NO:

262. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 260 como SEQ ID NO:

272. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 260 como SEQ ID NO: 272.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 251 como SEQ ID NO: 255. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 253 como SEQ ID NO: 265. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica 5 à sequência tanto de SEQ ID NO: 251 como SEQ ID NO: 255, e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 253 como SEQ ID NO: 265.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 252 como SEQ ID NO: 256. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 252 como SEQ ID NO: 256. Em uma realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ ID NO: 254 como SEQ ID NO: 266. Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 254 como SEQ ID NO: 266.

Em outra realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um componente efetor, em que o componente efetor é uma citocina. Em uma realização específica, o componente efetor é uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em: interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônia de macrófagos granulócitos (GM-CSF), interferon-a (INF-a), interleucina-12 (IL- 12), interleucina-8 (IL-8), proteína-1a inflamatória de macrófago (MIP-1a), proteína-1 ~ inflamatória de macrófago (MIP-1 ~), e fator-~ de crescimento de transformação (TGF-~). Em outra realização, pelo menos um componente que se liga ao antígeno é específico para um dos seguintes determinantes antigênicos: o Domínio Extra B de fibronectina (EDB), e o domínio A 1 de tenascina (TNC-A 1), o domínio A2 de te nasci na (TNC-A2), a Proteína 5 Ativadora de Fibroblasto (FAP); e o Proteoglicano Sulfato de Condroitina de Melanoma (MCSP).

Em outra realização, o imunoconjugado da invenção se liga a um receptor do componente efetor com uma constante de dissociação (Ko) que é pelo menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 1O vezes maior que aquela para um componente efetor de controle. Em outra realização, o imunoconjugado inibe um aumento no volume tumoral in vivo por pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais no final de um período de administração. Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos por pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% quando administrado em um mamífero com necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor de controle ou um componente efetor em uma molécula imunoconjugada "diacorpo".

Outro aspecto da presente invenção é direcionado para polinucleotídeos isolados que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos. Outro aspecto da presente invenção é direcionado a um vetor de expressão que compreende um cassete de expressão que compreende as sequências de polinucleotídeos da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado para células hospedeiras que expressam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para produzir imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos, em que o método compreende cultivar células hospedeiras transformadas com vetores de expressão que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos mediante condições adequadas para expressão dos mesmos.

5 Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para promover a proliferação e diferenciação em uma célula linfócito T ativada, que compreende colocar a célula linfócito T ativada em contato com uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos 1o para promover a proliferação e diferenciação em uma célula linfócito B ativada, que compreende colocar a célula linfócito B ativada em contato com uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para promover a proliferação e diferenciação em uma célula natural killer (NK), que compreende colocar a célula NK em contato com uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para promover a proliferação e diferenciação em um granulócito, um monócito ou uma célula dendrítica, que compreende colocar um granulócito, um monócito ou uma célula dendrítica em contato com uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para promover a diferenciação de linfócitos T citotóxicos (CLT), que compreende colocar uma célula linfócito T em contato com uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para inibir a replicação viral, que compreende colocar uma célula infectada por um vírus em contato com uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para suprarregular a expressão do complexo principal de histocompatibilidade I (MHC I), que compreende colocar uma alvo em contato com uma quantidade 5 efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para induzir a morte celular, que compreende administrar a uma célula alvo uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos para induzir uma quimiotaxia em uma célula alvo, que compreende administrar a uma célula alvo uma quantidade efetiva dos imunoconjugados da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é direcionado a um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende as etapas de administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição que compreende o imunoconjugado da invenção e um veículo farmacêutico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1. Visão geral esquemática dos vários formatos de fusão de imunoconjugados. Todos os constructos na FIGURA 1 compreendem dois fragmentos de anticorpos scFv (no componente que se liga ao antígeno), e uma ou duas moléculas de citocina (como componentes efetores) conectadas aos mesmos. Os painéis A a E mostram diferentes conexões e estequiometrias do componente que se liga aos antígenos e componentes efetores. Painel A) descreve um "diacorpo"-fusão IL-2. O "diacorpo" é montado de modo não covalente a partir de duas cadeias peptídicas idênticas. O Painel B mostra um imunoconjugado que compreende uma cadeia pesada de uma molécula Fab pela sua terminação carboxila a uma citocina que, por sua vez, está unida na terminação carboxila a uma segunda cadeia pesada Fab. Uma cadeia leve é coexpressa com a cadeia pesada Fab-citocina-cadeia pesada Fab do polipeptídeo para formar o imunoconjugado. Alternativamente, as duas cadeias leves podem ser unidas à citocina, e as cadeias pesadas são coexpressas. No painel C, as duas cadeias pesadas Fab são unidas diretamente uma à outra. A 5 citocina compartilha uma ligação peptídica amino-terminal com o segundo antígeno que se liga à cadeia pesada do componente. Os dois formatos moleculares dos painéis B e C podem ser variados, de modo que a cadeia Fab é substituída por um fragmento scFv, como nos painéis D e E.

FIGURA 2. Visão geral esquemática de imunoconjugados adicionais que compreendem dois componentes que se ligam aos antígenos e pelo menos um ou mais componentes efetores. O Painel A mostra uma molécula Fab unida através de sua terminação carboxila a um domínio lgG CH3. Para atingir o antígeno covalente que se liga por homodimerização, uma ponte bissulfeto artificial pode ser introduzida na terminação carboxila do domínio lgG CH3 (imunoconjugado à direita no painel A. Um domínio lgG1 CH3 mostrado no painel de A pode ser substituído por um domínio lgE CH4.

Os componentes Fab no painel A são substituídos por fragmentos scFv no painel B. Para o imunoconjugado do painel C, a dobradiça lgG natural foi fundida ao C-terminal às moléculas Fab. Como a região carboxi-terminal de dobradiça poderia impor algumas restrições geométricas na montagem dos domínios constantes que são fundidos no C-terminal à região de dobradiça lgG, um ligante artificial pode ser introduzido entre a região carboxi-terminal da dobradiça e da terminação amina do domínio lgG CH3. A região de dobradiça também pode ser introduzida entre um fragmento scFv e um domínio constante da imunoglobulina, conforme mostrado no painel de D. Nos painéis A a D, um domínio lgG1 CH3 ou lgE CH4 é usado para homodimerizar os constructos. O Painel E representa um imunoconjugado em que a dimerização é alcançada através de uma interação de heterodimerização CH1/Ckappa· O imunoconjugado do painel de D pode ter uma ou duas citocinas por imunoconjugado.

A FIGURA 3 apresenta os resultados de um experimento de eficiência com dois formatos moleculares de imunoconjugados interleucina-2 diferentes, específicos para tumor de estroma. O teratocarcinoma F9 foi 5 injetado de modo subcutâneo em camundongos 129SvEv, e o tamanho do tumor foi medido usando-se um compasso de calibre. A molécula "diacorpo"-IL- 2 foi comparada em duas concentrações diferentes para o imunoconjugado Fab-interleucina-2-Fab (Fab-IL2-Fab), em que as concentrações refletem um número semelhante de moléculas de imunoconjugado. O imunoconjugado Fab- IL2-Fab é rotulado como "Fab-L 19", o controle de interleucina-2 não conjugada é rotulado como "Unconj RIL-2", a molécula "diacorpo"-IL-2 é rotulada como "diacorpo" na FIGURA 3. O anticorpo L19, direcionado contra o Domínio Extra B de fibronectina (EDB), foi usado para gerar o componente que se liga aos antígenos tanto no diacorpo como nos imunoconjugados L19. A quantidade de imunoconjugado injetada por camundongo (em !Jg) está indicada na legenda da figura.

A FIGURA 4 apresenta os resultados de um experimento de sobrevivência com dois formatos moleculares de imunoconjugados interleucina-2 diferentes, específicos para tumor de estroma. A linhagem celular de tumor gástrico LS174T foi injetada de modo intraesplênico em camundongos bege SCID. O imunoconjugado Fab-IL2-Fab é rotulado como "Fab-L 19", o controle de interleucina-2 não conjugada é rotulado como "Unconj RIL-2", a molécula "diacorpo"-IL-2 é rotulada como "diacorpo" na FIGURA 4. O anticorpo anti-EDB, L 19, foi usado para gerar o componente que se liga aos antígenos tanto no diacorpo como nos imunoconjugados Fab-L 19. A quantidade de imunoconjugado injetada por camundongo (em 1-1g) está indicada na legenda da figura e reflete o mesmo número de moléculas de imunoconjugado.

A FIGURA 5 mostra imagens imuno-histoquímicas do tecido do útero humano em aumento de 1OOX e 400X. A região variável 281 O gerada pelos métodos descritos no Exemplo 3 se liga ao domínio A2 de tenascina humana (TNC-A2). A região variável 2810 em um fragmento Fab foi unida a 5 um fragmento FLAG (SHD2810-FLAG). Amostras de tecidos uterinos humanos saudáveis e cancerosos foram preparadas para coloração imuno-histoquímica.

Posteriormente, as amostras foram incubadas com o fragmento Fab SHD2810 FLAG. As amostras foram lavadas e incubadas com um anticorpo específico fluorescente para o epítopo FLAG. Amostras de tecido canceroso apresentaram níveis de expressão mais elevados de TNC-A2, em comparação às amostras de tecido saudável.

A FIGURA 6 mostra os níveis de expressão de TNC-A2 em várias amostras de tecido humano em termos de % de área de superfície de imunofluorescência. Várias amostras de tecidos humanos de indivíduos saudáveis e pacientes com câncer foram incubadas com o fragmento Fab SHD2810-FLAG conforme descrito na FIGURA 5.

A FIGURA 7 mostra os níveis de expressão de Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP) em várias amostras de tecido humano em termos de% de área de superfície de imunofluorescência. Várias amostras de tecidos humanos de indivíduos saudáveis e pacientes com câncer foram incubadas com um anticorpo comercial contra FAP (Abcam). A porção superior de cada barra no gráfico representa a expressão tumoral de FAP, enquanto a porção inferior de cada barra no gráfico representa a expressão de FAP normal.

A FIGURA 8 apresenta dados de 81ACORE mostrando a afinidade de um anticorpo lgG conhecido, L19, por ED8.

A FIGURA 9 apresenta dados de 81ACORE mostrando a afinidade de um imunoconjugado Fab-IL-2-Fab específico para ED8. Os fragmentos Fab no imunoconjugado foram derivados do anticorpo L 19.

A FIGURA 1O apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um "diacorpo"-proteína de fusão IL2, específico para EDB. O diacorpo fragmento scFv foi derivado do anticorpo L 19. O "diacorpo"-proteína de fusão IL2 inclui um ligante de aminoácido 8 localizado entre o fragmento 5 scFv e a molécula IL-2.

A FIGURA 11 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um "diacorpo"-proteína de fusão IL2, específico para EDB. O diacorpo fragmento scFv foi derivado do anticorpo L 19. O "diacorpo"-proteína de fusão IL2 inclui um ligante de aminoácido 12 entre o fragmento scFv e a molécula IL-2.

A FIGURA 12 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um anticorpo lgG conhecido, F16, para o domínio imobilizado A 1 de tenascina (TNC-A1). A FIGURA 12 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um fragmento Fab do anticorpo F16 para TNC-A 1. As constantes de dissociação (Ko) calculadas para o lgG F16 e molécula Fab estão indicadas na figura.

A FIGURA 13 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade IL-2 para o receptor IL-2 imobilizado. A heterodimerização das cadeias 13 e y de IL-2R foi alcançada pela fusão das respectivas cadeias para as variantes "protuberância-em-orifícios" da porção Fc de um lgG1 humano, conforme descrito em Merchant, AM et a/. Nat. Biotech. 16:677-681 (1998). O valor K0 calculado a partir dos dados BIACORE está indicado na figura.

A FIGURA 14 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um "diacorpo"-proteína de fusão-IL-2 para TNC-A 1 e receptor IL-2.

A molécula scFv no diacorpo é derivada do anticorpo F16. Os valores K0 calculados a partir dos dados BIACORE estão indicados na figura.

A FIGURA 15 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um imunoconjugado Fab-IL-2-Fab para TNC-A 1 e receptor IL-2.

As moléculas Fab no imunoconjugado foram derivadas do anticorpo F16. Os valores Ko calculados a partir dos dados BIACORE estão indicados na figura.

A FIGURA 16 apresenta dados de BIACORE mostrando a afinidade de um imunoconjugado scFv-IL-2-scFv para TNC-A 1 e receptor IL-2.

5 As moléculas scFv no imunoconjugado foram derivadas do anticorpo F16. Os valores K0 calculados a partir dos dados BIACORE estão indicados na figura.

A FIGURA 17 é uma tabela resumo dos valores Koobtidos a partir dos estudos BIACORE apresentados nas FIGURAS 12 a 16.

A FIGURA 18 apresenta os resultados de um experimento de eficácia comparando a molécula "diacorpo"-IL-2 direcionada ao domínio EDB de fibronectina para o imunoconjugado Fab-interleucina-2-Fab (rotulados como "Fab-SH2B10", que compreende as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 3 e 7, respectivamente) direcionada ao domínio A2 de tenascina C. O controle interleucina-2 não-conjugado é rotulado como "Unconj RIL-2", a molécula "diacorpo"-IL-2 é rotulada como "diacorpo L 19" na FIGURA

18. O anticorpo anti-EDB, L 19, foi usado para gerar o componente que se liga ao antígeno no imunoconjugado diacorpo. A linhagem celular F9 de teratocarcinoma foi injetada de modo subcutâneo no camundongo imunocompetente da linhagem 129. A quantidade de imunoconjugado injetada por camundongo (em !Jg) está indicada na legenda da figura. O tratamento foi iniciado no dia 6 e 5 injeções foram realizadas no total até o dia 11 do experimento.

A FIGURA 19 mostra a indução de proliferação de células NK-92 por anti-FAP, ou anti-tenascina C, imunoconjugados Fab-IL2-Fab (gerado usando-se as sequências de VH e VL dos constructos 3F2, 309, 483 (anti-FAP), 2F11 e 2810 (anti-tenascina C)) em comparação a IL-2 humana não conjugada. A proliferação celular foi medida usando-se o sistema de CeiiTiter Glo após dois dias de incubação.

A FIGURA 20 apresenta os resultados de um teste ELISA que mede a indução de produção de IFN-y por várias interleucinas-12 que contêm imunoconjugados em comparação tanto às citocinas não-conjugadas como para imunoconjugados que contêm os domínios p35 e p40 de IL-12 em 5 moléculas separadas. O painel A mostra os resultados nas placas revestidas de fibronectina. O painel 8 mostra os resultados na solução.

A FIGURA 21 mostra análises de cinética com base na Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) de fragmentos Fab anti-FAP de afinidade madura. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para o clone 19G1 que se liga a FAP (A) humano (hu) e FAP (8) murino (mu), para o clone 20GB que se liga a FAP (C) hu, FAP (D) mu e para o clone 489 que se liga a FAP (E) hu e FAP (F) mu. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 22 mostra análises de cinética com base em SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidade madura. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para o clone 588 que se liga a FAP (A) hu e FAP (8) mu, para o clone 5F1 que se liga a FAP (C) hu, FAP (D) mu e para o clone 1483 que se liga a FAP (E) hu e FAP (F) mu. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 23 mostra análises de cinética com base em SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidade madura. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para o clone 16F1 que se liga a FAP (A) hu e FAP (8) mu, para o clone 16F8 que se liga a FAP (C) hu, FAP (D) mu e para o clone 03C9 que se liga a FAP (E) hu e FAP (F) mu. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 24 mostra análises de cinética com base em SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidade madura. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para o clone 0207 que se liga a FAP

(A) hu e FAP (8) mu, para o clone 28H1 que se liga a FAP (C) hu, FAP (D) mu cyno FAP (E) e para o clone 22A3 que se liga a FAP (F) hu, FAP (G) mu e FAP (H) Cynomolgus (cyno). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

5 A FIGURA 25 mostra análises de cinética com base em SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidade madura. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para o clone 29811 que se liga a FAP (A) hu, FAP (8) mu, FAP (C) cyno e para o clone 23C10 que se liga a FAP (D) hu, FAP (E) mu e FAP (F) cyno. As linhas suaves representam um ajuste global 1o dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 26 mostra análises de cinética com base em SPR de fragmentos Fab anti-TNC A2 de afinidade madura que se ligam a TNC A2 (hu).

Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para o clone 2810_C386 (A), clone 2810_6A12 (8), clone 2810_C3A6 (C), clone 2810_0708 (D), clone 2810_01F7 (E) e clone 2810_6H10 (F). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 27 fornece uma visão geral das três etapas de purificação realizadas para a purificação de Fab-IL2-Fab com base em 3F2.

A FIGURA 28 mostra os resultados da purificação de Fab-IL2-Fab (A e 8) com base em 3F2 e os resultados da purificação de Fab-IL2-Fab (C e D) com base em 4G8. (A, C) 4 a 12% 8is-Tris e 3 a 8% Tris Acetato SDS- PAGE com frações durante o procedimento de purificação e do produto final.

(8, D) Cromatografia de exclusão por tamanho analítica após três etapas de purificação aplicadas.

A FIGURA 29 mostra os resultados da purificação do imunoconjugado Fab-IL2-Fab. (A) 4 a 12% 8is-Tris SDS-PAGE com frações durante o procedimento de purificação e do produto final. 8) Cromatografia de exclusão por tamanho analítica após três etapas de purificação aplicadas.

A FIGURA 30 mostra a avaliação da estabilidade de anti- fibronectina EDB L 19-com base em Fab-IL2-Fab. L 19 Fab-IL2-Fab foi formulado em 20 mM de histidina HCI, 140 mM de NaCI, pH 6,0 a uma 5 concentração de 6,3 mg/ml e armazenado por 4 semanas em temperatura ambiente a 4 °C. As amostras foram analisadas a cada semana para (A) concentração por espectroscopia de UV (após a centrifugação para material precipitado potencial pellet) e (B) conteúdo de agregado por cromatografia de exclusão por tamanho analítica.

A FIGURA 31 mostra a análise cinética com base em SPR de imunoconjugados 3F2 Fab-IL2-Fab direcionados a FAP para FAP humano, murino e Cynomolgus (cyno) e receptor IL-2-~/y humano (IL2R bg), conforme determinado por Ressonância Plasmônica de Superfície. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 32 mostra a análise cinética com base em SPR de imunoconjugados 4G8 Fab-IL2-Fab direcionados a FAP para FAP humano, murino e Cynomolgus (cyno), conforme determinado por Ressonância Plasmônica de Superfície. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 33 mostra a análise cinética com base em SPR de constructos 4G8 Fab-IL2-Fab direcionados a FAP para cadeias ~/y e a do receptor IL-2 humano e murino, conforme determinado por Ressonância Plasmônica de Superfície. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de reação de dois estágios.

A FIGURA 34 mostra a análise cinética com base em SPR de constructos 309 Fab-IL2-Fab direcionados a FAP para FAP humano, murino e Cynomolgus (cyno) e receptor IL-2-~/y humano (IL2R bg), conforme determinado por Ressonância Plasmônica de Superfície. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 35 mostra a análise cinética com base em SPR de constructos 2810 Fab-IL2-Fab direcionados a TNC A2 para proteínas de fusão 5 de TNC A2 humano, murino e Cynomolgus (cyno) quimérico e receptor IL-2-Wy humano (IL2R bg), conforme determinado por Ressonância Plasmônica de Superfície. As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.

A FIGURA 36 ilustra a eficácia de imunoconjugados Fab-IL2-Fab direcionados a IL-2 que reconhecem TNC A2 (2810) ou FAP (3F2 e 4G8) na indução da proliferação de células NK92, em comparação a IL-2 (Proleucina) e ao diacorpo L 19 que reconhece ED8 de fibronectina. O eixo x é normalizado para o número de moléculas de IL-2, conforme o diacorpo tem dois componentes efetores de IL-2, enquanto os constructos Fab-IL2-Fab conêm apenas um componente efetor de IL-2. A proliferação celular foi medida usando-se o sistema de CeiiTiter Glo após dois dias de incubação.

A FIGURA 37 mostra a indução de fosforilação de STAT5 como consequência da sinalização do receptor IL-2 mediada por IL-2 após incubação com um imunoconjugado 4G8-IL-2 Fab-IL2-Fab direcionado a FAP que reconhece FAP em diferentes populações de células efetoras, incluindo (A) células NK CD56+, (B) células T auxiliares CD4+CD25-CD127+, (C) CD3+, células T citotóxicas CD8+ e células T reguladoras (D) CD4+CD25+FOXP3+ (Tregs) de PBMCs humanas em solução.

A FIGURA 38 ilustra a eficácia de imunoconjugados Fab-IL2-Fab direcionados a IL-2 que reconhecem TNC A1 (2F11), TNC A2 (2810) ou FAP (3F2, 483 e 309) na indução de liberação de IFN-y e proliferação de células NK92 em comparação a IL-2, quando os imunoconjugados estão ou não presentes na solução ou imobilizados através de FAP ou TNC A2 revestidos em placas de microtitulação.

A FIGURA 39 apresenta os resultados de um experimento de sobrevivência com dois formatos moleculares de imunoconjugados IL-2 diferentes, específicos para tumor de estroma. A linhagem celular de tumor de 5 cólon humano LS174T foi injetada de modo intraesplênico em camundongo SCID. O imunoconjugado Fab-IL2-Fab 2810 direcionado a TNC A2 é rotulado como "SH2810", o controle IL-2 não-conjugado é rotulado como "proleucina", a molécula diacorpo-IL-2 direcionada a ED8 é rotulada como "diacorpo". A quantidade de imunoconjugado injetada por camundongo (em !Jg) está indicada na legenda da figura e reflete o mesmo número de moléculas de imunoconjugado.

A FIGURA 40 apresenta os resultados de um experimento de sobrevivência com dois formatos moleculares de imunoconjugados IL-2 diferentes, específicos para tumor de estroma. A linhagem celular renal humana ACHN foi injetada de modo intrarrenal em camundongos SCID. Os imunoconjugados 3F2 ou 4G8 Fab-IL2-Fab direcionado a FAP são rotulados como "FAP-3F2" e "FAP-4G8", o controle IL-2 não-conjugado é rotulado como "proleucina", a molécula diacorpo-IL-2 direcionada a ED8 é rotulada como "diacorpo". A quantidade de imunoconjugados injetada por camundongo (em !Jg) está indicada na legenda da figura e reflete o mesmo número de moléculas de imunoconjugado.

A FIGURA 41 apresenta os resultados de um experimento de sobrevivência com dois formatos moleculares de imunoconjugados IL-2 diferentes, específicos para tumor de estroma. A linhagem celular NSCLC humana A549 foi injetada i.v. em camundongos SCID. O imunoconjugado 2810 Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 é rotulado como "2810", a molécula diacorpo-IL-2 direcionada a fibronectina ED8 é rotulada como "diacorpo". A quantidade de imunoconjugado injetada por camundongo (em !Jg) está indicada na legenda da figura e reflete o mesmo número de moléculas de imunoconjugado.

A FIGURA 42 apresenta (A) uma visão geral do processo de purificação do imunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab com L19 (ligante de 5 ectodomínio 8 de fibronectina) como Fab, e (8) um SDS-PAGE (reduzido, não- reduzido) do imunoconjugado purificado Fab-GM-CSF-Fab.

A FIGURA 43 apresenta os resultados de um teste de proliferação dependente de GM-CSF comparando o efeito de GM-CSF e do imunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab com L 19 (ligante de ectodomínio 8 de fibronectina) como Fab nas células TF-1.

A FIGURA 44 apresenta (A) uma visão geral do processo de purificação do imunoconjugado Fab-IL 12-Fab com 4G8 (ligante FAP) como Fab, e (8) um SDS-PAGE (reduzido, não-reduzido) do imunoconjugado purificado Fab-IL 12-Fab.

A FIGURA 45 apresenta os resultados de um ensaio que testa a liberação de IL-12 induzido por IFN-y, comparando o efeito da IL-12 e do imunoconjugado purificado Fab-IL 12-Fab com 4G8 (ligante FAP) como Fab, usando-se P8MCs isoladas do sangue humano fresco de um doador saudável.

A FIGURA 46 apresenta (A) uma visão geral do processo de purificação do imunoconjugado Fab-IFNa2-Fab com L 19 (ligante de ectodomínio 8 de fibronectina) como Fab, e (8) um SDS-PAGE (reduzido, não- reduzido) do imunoconjugado purificado Fab-IFNa2-Fab.

A FIGURA 47 apresenta os resultados de um ensaio que testa a inibição da proliferação induzida por IFN-a de (A) células T Jurkat e (8) células tumorais A549 que comparam o efeito de IFN-a (Roferon A, Rache) e do imunoconjugado Fab-IFNa2-Fab purificado com L 19 (ligante de ectodomínio 8 de fibronectina) como Fab.

A FIGURA 48 mostra (A) os perfis de eluição da purificação de MHLG direcionado a MCSP com base em Fab-IL2-Fab e (8) os resultados da caracterização analítica do mesmo Fab-IL2-Fab por SDS-PAGE (NuPAGE Novex 8is-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não- 5 reduzido).

A FIGURA 49 mostra (A) os perfis de eluição da purificação de MHLG1 direcionado a MCSP com base em Fab-IL2-Fab e (8) os resultados da caracterização analítica do mesmo Fab-IL2-Fab por SDS-PAGE (NuPAGE Novex 8is-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não- reduzido).

A FIGURA 50 apresenta os resultados de um ensaio que testa a liberação de IFN-y induzido por IL-2 comparando o efeito do imunoconjugado Fab-IL2-Fab purificado com 4G8 (ligante FAP) como Fab, e o imunoconjugado purificado Fab-IL2-Fab com MHLG KV9 (ligante MCSP) como Fab, usando-se células NK92 subalimentadas com IL-2.

A FIGURA 51 apresenta os resultados de um ensaio que testa a liberação de IFN-y induzido por IL-2 comparando o efeito do imunoconjugado Fab-IL2-Fab purificado com 4G8 (ligante FAP) como Fab, e o imunoconjugado purificado Fab-IL 12-Fab com MHLG KV9 (ligante MCSP) como Fab, usando-se células NK92 subalimentadas com IL-2.

A FIGURA 52 mostra a ligação do imunoconjugado MHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab direcionado a MCSP para células Colo38, conforme determinado por citometria de fluxo. Anticorpos secundários sozinhos ou células são mostrados apenas como controles negativos.

A FIGURA 53 apresenta (A) uma visão geral do processo de purificação do imunoconjugado 281 O Fab-IL2-Fab com 281 O (ligante TNC A2) como Fab, e (8) um SDS-PAGE (reduzido, não-reduzido) do imunoconjugado purificado 281 O Fab-IL2-Fab.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

DEFINIÇÕES A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos usados no presente pedido possuem o mesmo significado como 5 comumente entendido por um técnico no assunto. Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente pedido e os procedimentos laboratoriais em culturas de células, genética molecular, química e hibridização de ácido nucléico descritas abaixo são aquelas conhecidas e comumente empregadas na técnica.

Técnicas e procedimentos padrão são geralmente realizadas de acordo com métodos convencionais na técnica e diversas referências gerais (consulte geralmente, Sambrook et a/. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que é integralmente incorporado ao presente pedido como referência, que são fornecidos ao longo desse documento.

Como usado no presente pedido, o termo "imunoconjugado" refere-se a uma molécula de polipeptídeo que inclui pelo menos um componente efetor e pelo menos um componente que se liga ao antígeno. Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um componente efetor da cadeia única e pelo menos dois componentes que se ligam aos antígenos. A molécula de ligação de antígeno pode ser unida ao componente efetor por uma variedade de interações e em uma variedade de configurações conforme descrito no presente pedido.

Como usado no presente pedido, o termo "componente efetor" refere-se a um polipeptídeo, por exemplo, uma proteína ou glicoproteína, que influencia a atividade celular, por exemplo, através de transdução de sinal ou outras vias celulares. Consequentemente, o componente efetor da invenção pode ser associado com sinalização mediada por receptor que transmite um sinal de fora da membrana celular para modular uma resposta em uma célula portadora um ou mais receptores para o componente efetor. Em uma realização, um componente efetor pode obter uma resposta citotóxica em células portadoras de um ou mais receptores para o componente efetor. Em outra realização, um componente efetor pode obter uma resposta proliferativa 5 em células portadoras de um ou mais receptores para o componente efetor.

Em outra realização, um componente efetor pode obter diferenciação em células portadoras de receptores para o componente efetor. Em outra realização, um componente efetor pode alterar a expressão (ou seja, supra- regular ou infra-regular) de uma proteína celular endógena em células portadoras de receptores para o componente efetor. Exemplos não limitantes de componentes efetores incluem citocinas, fatores de crescimento, hormônios, enzimas, substratos e cofatores. O componente efetor pode ser associado com um componente que se liga ao antígeno em uma variedade de configurações para formar um imunoconjugado.

Como usado no presente pedido, o termo "citocina" refere-se a uma molécula que media e/ou regula uma função ou processo biológico ou celular (por exemplo, imunidade, inflamação e hematopoiese). O termo "citocina" como usado no presente pedido inclui "linfocinas", "quimiocinas", "monocinas" e "interleucinas". Exemplos de citocinas úteis incluem, mas não se limitam a,GM-CSF, IL-1a, IL-113, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL- 12, IFN-a, IFN-13, IFN-y, MIP-1 a, MIP-113, TGF-13, TNF-a e TNF-13.

Como usado no presente pedido, o termo "cadeia única" refere-se a uma molécula que compreende monômeros de aminoácidos ligados linearmente por ligações peptídicas. Em uma realização, o componente efetor é um componente efetor da cadeia única. Exemplos não limitantes de componentes efetores da cadeia única incluem citocinas, fatores de crescimento, hormônios, enzimas, substratos e cofatores. Quando o componente efetor é uma citocina e a citocina de interesse é normalmente encontrada como um multímero na natureza, cada subunidade da citocina multimérica é sequencialmente codificada pela cadeia única do componente efetor. Consequentemente, exemplos não limitantes de componentes efetores de cadeia única incluem GM-CSF, IL-1a, IL-1 ~~ IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 5 IL-8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-~, IFN-y, MIP-1a, MIP-1~, TGF-~, TNF-a e TNF-~.

Como usado no presente pedido, o termo "componente efetor de controle" refere-se a um componente efetor não conjugado. Por exemplo, quando comparar um imunoconjugado IL-2 da presente invenção com um componente efetor de controle, o componente efetor de controle é livre, IL-2 não-conjugado. Da mesma forma, por exemplo, quando comparar um imunoconjugado IL-12 da presente invenção com um componente efetor de controle, o componente efetor de controle é livre, IL-12 não conjugado (por exemplo, existente como uma proteína heterodimérica em que as subunidades p40 e p35 compartilham somente ponte(s) bissulfeto).

Como usado no presente pedido, o termo "receptor de componente efetor" refere-se a uma molécula de polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um componente efetor. Por exemplo, onde IL-2 é o componente efetor, o receptor de componente efetor que se liga a um IL-2 (por exemplo, um imunoconjugado que compreende IL-2) é o receptor IL-2. De maneira similar, por exemplo, onde IL-12 é o componente efetor de um imunoconjugado, o receptor de componente efetor é o receptor IL-12. Quando um componente efetor se liga especificamente a mais de um receptor, todos os receptores que se ligam especificamente ao componente efetor são "receptores de componente efetor" para aquele componente efetor.

Como usado no presente pedido, o termo "componente que se liga ao antígeno" refere-se a uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em uma realização, um componente que se liga ao antígeno é capaz de dirigir a entidade à qual está fixada (por exemplo, um componente efetor ou um segundo componente que se liga ao antígeno) a um local alvo, por exemplo, um tipo específico de célula tumoral ou tumor do estroma portador do determinante antigênico.

Componentes que se ligam aos antígenos incluem anticorpos e fragmentos dos 5 mesmos, conforme mais adiante definido no presente pedido. Por "especificamente se liga" entende-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações não desejadas ou não específicas.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos com regiões constantes, conforme mais adiante definidas no presente pedido e conhecidas na técnica. Regiões constantes de cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: a, õ, E, y ou IJ. Regiões constantes da cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: K e 'A.

Como usado no presente pedido, o termo "determinante antigênico" é sinônimo de "antígeno" e "epítopo", e refere-se a um local (por exemplo, um trecho contínuo de aminoácidos ou uma configuração adaptável composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídeo a qual um componente que se liga ao antígeno se liga, formando um complexo antígeno-componente que se liga ao antígeno.

Como usado no presente pedido, o termo "componete de ligação antígeno de controle" refere-se a um componente que se liga ao antígeno como existiria na natureza, livre de outros componentes que se ligam aos antígenos e componentes efetores. Por exemplo, quando comparar um imunoconjugado Fab-IL2-Fab da invenção com um componente que se liga ao antígeno de controle, o antígeno de controle que se liga ao componente é livre de Fab, em que o imunoconjugado Fab-IL2-Fab e a molécula Fab livre podem ambos especificamente se ligar ao mesmo determinante antígeno.

Como usado no presente pedido, os termos "primeiro" e

"segundo" em relação a um componente que se liga aos antígenos, componentes efetores, etc., são usados por conveniência de distinguir quando há mais de um de cada tipo de componente. O uso desses termos não é destinado a conferir uma ordem ou orientação específica do imunoconjugado a 5 menos que explicitamente assim declarado.

No caso onde há duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo como utilizado no presente pedido é destinado a incluir todos os significados semelhantes, a menos que explicitamente declarado em contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região determinante de complementaridade" ("COR") para descrever o local de combinação do antígeno não-contíguo encontrado dentro da região variável tanto de polipeptídeos pesados como de leves. Essa região específica tem sido descrita por Kabat et a/., U.S.

Oept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of lmmunological lnterest" (1983) e por Chothia et a/., J. Mo/. Bio/. 196:901- 917 (1987), que são incorporados ao presente pedido por referência, onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparados entre si. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma COR de um anticorpo ou variantes do mesmo é destinada a estar dentro do escopo do termo, conforme definido e usado no presente pedido. Os resíduos de aminoácidos apropriados que englobam as CORs, conforme definido por cada uma das referências acima citadas são definidas a seguir na Tabela I como uma comparação. Os números exatos de resíduo que englobam uma COR específica irá variar dependendo da sequência e do tamanho da COR.

Técnicos no assunto podem rotineiramente determinar quais resíduos compreendem uma COR específica dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.

TABELA 1· DEFINICÕES DE CDR 1 COR Kabat Chothia AbM~ VH CDR1 31-35 26-32 26-35 VH CDR2 50-65 52-58 50-58 VH CDR3 95-102 95-102 95-102 VL CDR1 24-34 26-32 24-34 VL CDR2 50-56 50-52 50-56 VLCDR3 89-97 91-96 89-97 1 Numeração de todas as definições de COR na Tabela 1 estão de acordo com as convenções de numeração apresentadas por Kabat et a/.

(consulte abaixo). 2 5 "AbM" com um "b" minúsculo como usado na Tabela 1 refere-se às CDRs conforme definido pelo programa de computação de modelagem de anticorpo "AbM" da Oxford Molecular.

Kabat et a/. também definiu um sistema de numeração de sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo.

Geralmente, um técnico no assunto pode atribuir inequivocamente esse sistema de "numeração de Kabat" para qualquer sequência de domínio variável, sem confiança de qualquer dado experimental além da própria sequência. Como usado no presente pedido, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et a/., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of lmmunological lnterest" (1983).

A menos que especificado de outra forma, referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em um componente que se liga ao antígeno da invenção estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As sequências de polipeptídeos da lista de sequência (ou seja, SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 96, 97, etc.) não são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat. No entanto, ele está bem dentro das competências normais de um técnico no assunto para converter a numeração das sequências da Listagem de

Sequências para a numeração de Kabat.

IMUNOCONJUGADOS lmunoconjugados são moléculas de polipeptídeos que compreendem pelo menos um componente efetor e pelo menos um 5 componente que se liga ao antígeno. Em uma realização, o componente efetor é um componente efetor de cadeia única. Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos dois componentes que se ligam aos antígenos. O componente que se liga aos antígenos e componentes efetores do imunoconjugado inclui aqueles que são descritos em detalhes no presente pedido acima e abaixo e nas figuras que acompanham. O componente que se liga ao antígeno do imunoconjugado pode ser direcionado contra uma variedade de moléculas alvo (por exemplo, um determinante antigênico em uma molécula de proteína expressou em uma célula tumoral ou tumor do estroma). Exemplos não limitantes de componentes que se ligam aos antígenos são descritos no presente pedido. Em uma realização, pelo menos um componente que se liga ao antígeno é direcionado a um determinante antigênico de um ou mais dos polipeptídeos representados na Tabela 5, no presente pedido abaixo. lmunoconjugados da invenção tipicamente exibem uma ou mais das seguintes propriedades: alta especificidade de ação, toxicidade reduzida e/ou estabilidade aprimorada, principalmente em comparação a imunoconjugados conhecidos de diferentes configurações que visam os mesmos determinantes antigênicos e que carregam os mesmos componentes efetores.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um primeiro componente efetor e pelo menos um primeiro e um segundo componente que se liga ao antígeno. Em uma realização preferencial, o primeiro componente efetor é um componente efetor de cadeia única. Em uma realização preferencial, o primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de um Fv e um Fab. Em uma realização específica, o primeiro componente efetor compartilha uma ligação peptídica amino terminal ou carboxila com um primeiro componente que se liga ao antígeno e um segundo 5 componente que se liga ao antígeno compartilha uma ligação peptídica amino terminal ou carboxila tanto com (i) o primeiro componente efetor, como (ii) o primeiro componente que se liga ao antígeno. Em outra realização, o imunoconjugado consiste essencialmente de um primeiro componente efetor de cadeia única e do primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente.

Em uma realização, um primeiro componente efetor compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um primeiro componente que se liga ao antígeno e ainda compartilha uma ligação peptídica amino terminal com um segundo componente que se liga ao antígeno. Em outra realização, um primeiro componente que se liga ao antígeno compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e ainda compartilha uma ligação peptídica amino terminal com um segundo componente que se liga ao antígeno. Em outra realização, um primeiro componente que se liga ao antígeno compartilha uma ligação peptídica amino terminal com um primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e ainda compartilha um peptídeo carboxi terminal com um segundo componente que se liga ao antígeno.

Em uma realização, um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma primeira região variável da cadeia pesada e ainda compartilha uma ligação peptídica amino terminal com uma segunda região variável da cadeia pesada. Em outra realização, um componente efetor,

preferencialmente um componente efetor de cadeia única, compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma primeira região variável da cadeia leve e ainda compartilha um peptídeo amino terminal com uma segunda região variável da cadeia leve. Em outra realização, uma primeira região variável da 5 cadeia pesada ou leve é unida por uma ligação peptídica carboxi terminal a um primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e é ainda unida por uma ligação peptídica amino terminal a uma segunda região variável da cadeia pesada ou leve. Em outra realização, uma primeira região variável da cadeia pesada ou leve é unida por uma ligação 1o peptídica amino terminal a um primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e é ainda unida por uma ligação peptídica carboxi terminal a uma segunda região variável da cadeia pesada ou leve.

Em uma realização, um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma primeira cadeia pesada ou leve de Fab e ainda compartilha uma ligação peptídica amino terminal com uma segunda cadeia pesada ou leve de Fab. Em outra realização, uma primeira cadeia pesada ou leve de Fab, compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um primeiro componente efetor de cadeia única e ainda compartilha uma ligação peptídica amino terminal com uma segunda cadeia pesada ou leve de Fab. Em outras realizações, uma primeira cadeia pesada ou leve de Fab, compartilha uma ligação peptídica amino terminal com um primeiro componente efetor de cadeia única e ainda compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada ou leve de Fab.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um primeiro componente efetor que compartilha uma ligação peptídica amino terminal a uma ou mais moléculas de scFv e sendo que o primeiro componente efetor ainda compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma ou mais moléculas de scFv. Em uma realização preferencial, o componente efetor é um componente efetor de cadeia única.

Em outra realização, o imunoconjugado compreende pelo menos 5 um primeiro componente efetor, de preferência um componente efetor de cadeia única e o primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente, em que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos incluem uma molécula de scFv unida a seu aminoácido carboxi terminal a uma região constante que inclui um domínio constante de imunoglobulina sendo que o primeiro componente que se liga ao antígeno é unido a seu aminoácido carboxi terminal de região constante ao aminoácido amino terminal do primeiro componente efetor, e sendo que o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno são covalentemente ligados através de pelo menos uma ponte bissulfeto. Em uma realização preferencial, a região constante é selecionada de forma independente a partir do grupo que consiste de domínios de lgG CH1, lgG CH2, lgG CH3, lgG Ckappa, lgG C1ambda e lgE CH4. Em uma realização, o domínio de imunoglobulina do primeiro componente que se liga ao antígeno é ligado de modo covalente ao domínio da imunoglobulina do segundo componente que se liga ao antígeno através de uma ponte bissulfeto. Em uma realização, pelo menos uma ponte bissulfeto está localizada na terminação carboxila dos domínios da imunoglobulina do primeiro e segundo componente que se liga ao antígeno. Em outra realização, pelo menos uma ponte bissulfeto está localizada na terminação amina dos domínios da imunoglobulina do primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente. Em outra realização, pelo menos duas pontes bissulfeto estão localizadas na terminação amina dos domínios da imunoglobulina do primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente.

Em uma realização específica, o imunoconjugado compreende o primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente, cada um compreendendo uma mólecula de scFv unida a seu aminoácido carboxi terminal a uma região constante que compreende um domínio lgG CH1, sendo que o primeiro componente que se liga ao antígeno é unido a seu aminoácido 5 amino terminal de região constante ao aminoácido amino terminal do primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e sendo que o primeiro e segundo antígeno que se ligam ao componente são ligados de modo covalente através de pelo menos uma ponte bissulfeto. O segundo componente que se liga ao antígeno do imunoconjugado, além disso, pode ser unido em seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um segundo componente efetor. Em uma realização, o segundo componente efetor é um componente efetor de cadeia única.

Em uma realização específica, o imunoconjugado compreende o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno, cada um compreendendo uma mólecula de scFv unida a seu aminoácido carboxi terminal a uma região constante que compreende um domínio lgG Ckappa.

sendo que o primeiro componente que se liga ao antígeno é unido a seu aminoácido amino terminal de região constante ao aminoácido amino terminal do primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e sendo que o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno são ligados de modo covalente através de pelo menos uma ponte bissulfeto. O segundo componente que se liga ao antígeno do imunoconjugado, além disso, pode ser unido em seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um segundo componente efetor. Em uma realização, o segundo componente efetor é um componente efetor de cadeia única.

Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno, cada um compreendendo uma mólecula de scFv unida a seu aminoácido carboxi terminal a uma região constante que compreende um domínio lgE CH4, sendo que o primeiro componente que se liga ao antígeno é unido a seu aminoácido amino terminal de região constante ao aminoácido amino terminal do primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e 5 sendo que o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno são ligados de modo covalente através de pelo menos uma ponte bissulfeto. O segundo componente que se liga ao antígeno do imunoconjugado, além disso, pode ser unido em seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um segundo componente efetor. Em uma realização, o segundo componente efetor é um componente efetor de cadeia única.

Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno, cada um compreendendo uma mólecula de scFv unida a seu aminoácido carboxi terminal a um domínio lgE CH3, sendo que o primeiro componente que se liga ao antígeno é unido a seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal do primeiro componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única e sendo que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam ao componente são ligados de modo covalente através de pelo menos uma ponte bissulfeto. O segundo componente que se liga ao antígeno do imunoconjugado, além disso, pode ser unido em seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um segundo componente efetor. Em uma realização, o segundo componente efetor é um componente efetor de cadeia única.

Em outra realização, o imunoconjugado compreende o primeiro e o segundo componente efetor e o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes, sendo que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos compreendem uma molécula de Fab unida a seu aminoácido carboxi terminal de cadeia pesada ou leve a um domínio lgG1 CH3 e sendo que cada um dos domínios lgG1 CH3 é unido a seu respectivo aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal de um dos componentes efetores e sendo que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes são ligados de modo covalente através de pelo menos uma ponte bissulfeto. Em 5 uma realização preferencial, o primeiro e/ou segundo componente efetor é um componente efetor de cadeia única. Em uma realização adicional, os domínios de lgG1 CH3 do antígeno que se ligam aos componentes podem ser unidos por ponte bissulfeto. Em outra realização, pelo menos uma ponte bissulfeto está localizada na terminação carboxi dos domínios de lgG1 CH3 do primeiro e segundo antígeno que se ligam aos componentes. Em outra realização, pelo menos uma ponte bissulfeto está localizada na terminação amina dos domínios de lgG1 CH3 do primeiro e segundo antígeno que se ligam aos componentes.

Em outra realização, pelo menos duas pontes bissulfeto estão localizadas na terminação amina dos domínios de lgG1 CH3 do primeiro e segundo antígeno que se ligam aos componentes.

Em outra realização, o imunoconjugado compreende um ou mais sítios de clivagem proteolítica localizados entre os componentes efetores e o componente que se liga aos antígenos.

Componentes do imunoconjugado (por exemplo, componente que se liga aos antígenos e/ou componentes efetores) podem ser ligados diretamente ou através de vários ligantes (por exemplo, ligantes peptídicos que compreendem um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2 a 1O aminoácidos) que são descritos no presente pedido ou são conhecidos na técnica.

Em uma realização específica, o imunoconjugado melhorou a estabilidade na solução, particularmente comparado às preparações de imunoconjugado conhecidas. Em uma realização, o imunoconjugado se liga a um determinante antigênico com uma constante de dissociação (Ko) que é pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 vezes menor do que para um antígeno controle que se liga ao componente. Em uma realização mais específica, o imunoconjugado se liga a um determinante antigênico com uma Ko que é pelo menos 1O vezes menor 5 do que para um antígeno controle que se liga ao componente. Em uma realização, o imunoconjugado se liga a um determinante antigênico com uma K0 que é menor do que cerca de 1O nM, menor do que cerca de1 nM, ou menor do que cerca de O, 1 nM.

Em outra realização, o imunoconjugado tem um perfil de 1o segurança superior em comparação a preparações de imunoconjugado conhecidas. O imunoconjugado preferencialmente produz febre e efeitos colaterais menos severos, como toxicidade, destruição de células não- tumorais, etc. A diminuição dos efeitos colaterais pode ser atribuída à redução da afinidade de ligação dos imunoconjugados da invenção dirigido aos receptores do componente efetor. Em uma realização, o imunoconjugado se liga a um receptor do componente efetor com uma Ko que é pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24 ou 25 vezes maior do que para um componente efetor controle. Em uma realização mais específica, o imunoconjugado se liga a um receptor do componente efetor com uma K0 que é pelo menos 2 vezes maior do que para um componente efetor controle. Em outra realização, o imunoconjugado se liga a um receptor do componente efetor com uma K0 que é pelo menos 1O vezes maior do que para um componente efetor controle. Em outra realização, o imunoconjugado se liga a um receptor do componente efetor com uma Ko que é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 1O vezes maior do que para um componente efetor correspondente em uma molécula imunoconjugada "diacorpo". Em outra realização, o imunoconjugado se liga a um receptor do componente efetor com uma constante de dissociação K0 que é pelo menos 1O vezes maior do que para um componente efetor correspondente em um imunoconjugado "diacorpo".

Em outra realização, o imunoconjugado tem eficácia superior, particularmente em comparação a preparações de imunoconjugado 5 conhecidas. Em uma realização, o imunoconjugado é mais capaz de inibir o aumento no volume tumoral in vivo e/ou mais capaz de prolongar a sobrevivência em mamíferos com tumores malignos. Em uma realização, o imunoconjugado inibe um aumento no volume tumoral in vivo por pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% até o final de um período de administração de cerca de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1O, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias. Em uma realização, o imunoconjugado inibe um aumento no volume tumoral in vivo em pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75% até o final de um período de administração de 13 dias. Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% quando administrado a um mamífero em necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor de controle. Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em pelo menos 30%, 32% ou 35% quando administrado a um mamífero em necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor de controle. Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em cerca de 30% quando administrado a um mamífero em necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor de controle. Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou

95% quando administrado a um mamífero em necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor em uma molécula de imunoconjugado "diacorpo". Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em pelo menos 30%, 32% ou 35% 5 quando administrado a um mamífero em necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor em uma molécula de imunoconjugado "diacorpo". Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em cerca de 30% quando administrado a um mamífero em necessidade do mesmo, em relação a um componente efetor em uma molécula de imunoconjugado "diacorpo". Em outra realização, o imunoconjugado prolonga a sobrevivência de mamíferos com tumores malignos em pelo menos 5%, 10% ou 15%, em relação a um componente efetor de controle ou um componente efetor em uma molécula de imunoconjugado "diacorpo".

COMPONENTE QUE SE LIGA AOS ANTÍGENOS O componente que se liga ao antígeno do imunoconjugado da invenção é geralmente uma molécula de polipeptídeo que se liga a um determinante antigênico específico e é capaz de dirigir a entidade à qual está fixado (por exemplo, um componente efetor ou um segundo componente que se liga ao antígeno) a um sítio alvo, por exemplo, um tipo específico de célula tumoral ou tumor do estroma portador do determinante antigênico. O imunoconjugado pode ligar-se a determinantes antigênicos encontrados, por exemplo, nas superfícies de células tumorais, nas superfícies de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, livre no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM).

Exemplos não limitantes de antígenos tumorais incluem MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, Dipeptidil peptidase IV (DPPIV), adenosina deaminase que se liga a proteína (ADAbp), ciclofilina b, Coloretal associado ao antígeno (CRC)-C017-1A/GA733, Antígeno Carcinoembriônico (CEA) e seus epítopos imunogênicos CAP-1 e CAP-2, etv6, aml1, Antígeno Específico de Prostata (PSA) e seus epítopos imunogênicos PSA-1, PSA-2, e PSA-3, antígeno de membrana específico da prostata (PSMA), receptor de célula TI 5 cadeia zeta de CD3, família MAGE de antígenos tumorais (por exemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 1O, MAGE-A 11, MAGE-A 12, MAGE-Xp2 (MAGE-82), MAGE-Xp3 (MAGE-83), MAGE-Xp4 (MAGE-84), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), família GAGE de antígenos tu morais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE- 6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), 8AGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2/neu, p21 ras, RCAS1, a- fetoproteína, E-caderina, a-catenina, ~-catenina e y-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ES0-1, cdc27, proteína polipose adenomatosa coli (APC), fodrina, Conexina 37, lg-idiotipo, p15, gp75, GM2 e GD2 gangliosídeo, produtos virais como proteínas do vírus de papiloma humano, família Smad de antígenos tumorais, lmp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por E8V (E8NA)- 1, glicogênio fosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX- 4, SSX-5, SCP-1 e CT-7, e c-erb8-2.

Exemplos não limitantes de antígenos virais incluem hemaglutinina do vírus influenza, LMP-1 do vírus Epstein-8arr, glicoproteína E2 do vírus da hepatite C, HIV gp160 e HIV gp120.

Exemplos não limitantes de antígenos de ECM incluem sindecano, heparanase, integrinas, osteopontina, link, caderinas, laminina, laminina tipo EGF, lectina, fibronectina, notch, tenascina e matrixina.

Os imunoconjugados da invenção podem ligar-se aos seguintes exemplos não limitantes específicos de antígenos de superfície celular: FAP, Her2, EGFR, CD2 (antígeno de superfície de célula T), CD3 (heteromultímero associado ao TCR), CD22 (receptor de célula 8), CD23 (receptor lgE de baixa afinidade), CD25 (cadeia a do receptor de IL-2), CD30 (receptor de citocina), CD33 (antígeno de superfície celular mielóide), CD40 (receptor do fator de necrose tumoral), IL-6R (receptor de IL6), CD20, MCSP e PDGF~R (receptor 5 do fator de crescimento derivado de plaqueta ~).

Em uma realização, o imunoconjugado da invenção compreende dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos, sendo que cada um desses componentes que se ligam aos antígenos especificamente se ligam ao mesmo determinante antigênico. Em outra realização, o imunoconjugado da invenção compreende dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos, sendo que cada um desses componentes que se ligam aos antígenos especificamente se ligam a diferentes determinantes antigênico.

O componente que se liga ao antígeno pode ser qualquer tipo de anticorpo ou fragmento do mesmo que retém ligação específica a um determinante antigênico. Fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a, fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicorpos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos (consulte, por exemplo, Hudson e Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)).

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que são específicos para o Domínio Extra B de fibronectina (EDB). Em outra realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que podem competir com o anticorpo monoclonal L 19 para ligação com um epítopo de EDB. Consulte, por exemplo, publicação PCT documento WO 2007/128563 A1 (incorporado ao presente pedido como referência na sua totalidade). Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab derivada do anticorpo monoclonal L 19 compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um segundo derivado da cadeia pesada de Fab a partir do anticorpo monoclonal

5 L19. Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab derivada do anticorpo monoclonal L19 compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-12, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um segundo derivado da cadeia pesada de Fab a partir do anticorpo monoclonal L19. Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab derivada do anticorpo monoclonal L 19 compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IFN a,

em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um segundo derivado da cadeia pesada de Fab a partir do anticorpo monoclonal

L 19. Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab derivada do anticorpo monoclonal L 19 compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula GM-CSF, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um segundo derivado da cadeia pesada de Fab a partir do anticorpo monoclonal L 19. Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que um primeiro scFv derivado do anticorpo monoclonal L 19 compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um segundo scFv derivado a partir do anticorpo monoclonal L 19. Em uma realização mais específica, o imunoconjugado compreende a sequência de polipeptídeos da

SEQ ID NO: 95 ou uma variante da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma cadeia leve de Fab derivada a partir do anticorpo monoclonal L 19. Em uma realização mais específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica

5 à SEQ ID NO: 96 ou uma variante da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o

1o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 104 ou uma variante da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 96 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 105 ou uma variante da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 96 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 106 ou uma variante da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ lO NO: 106 e SEQ lO NO: 96 ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em uma realização mais específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica 5 à SEQ 10 NO: 107 ou uma variante da mesma que retém funcionalidade. Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ lO NO: 107 e SEQ lO NO: 96 ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em outra realização específica, os 1o polipeptídeos são ligados de modo cova lente, por exemplo, por uma ponte bissulfeto.

Em uma realização, o imunoconjugado da invenção compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que são específicos para o Domínio A1 de Tenascina (TNC-A1). Em outra realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que podem competir com o anticorpo monoclonal F16 para ligação com um epítopo de TNC-A1.

Consulte, por exemplo, publicação PCT documento WO 2007/128563 A 1 (incorporado ao presente pedido como referência na sua totalidade). Em uma realização, o imunoconjugado da invenção compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que são específicos para o domínio A 1 e/ou A4 de Tenascina (TNC-A 1 ou TNC-A4 ou TNC-A1/A4). Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para o domínio A1 de Tenascina compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, uma molécula IL-12, uma molécula IFN a ou uma molécula GM-CSF, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para o domínio A1 de Tenascina.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para o domínio A1 de Tenascina compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma

5 compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para o domínio A1 de Tenascina.

Em uma realização adicional, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que um primeiro scFv específico para o domínio A1 de Tenascina compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com um segundo scFv específico para o domínio A 1 de Tenascina.

Em uma realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de

80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ ID

NO: 13 como SEQ ID NO: 15, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ ID NO: 9 como SEQ ID NO: 11, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ ID NO: 13 como SEQ ID NO: 15 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica tanto à SEQ ID NO: 9 como SEQ ID NO: 11 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ 10 NO: 14 como SEQ 10 NO: 16. Em ainda outra realização

5 específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ 10 NO: 14 como SEQ 10 NO: 16. Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%,

90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ lO NO: 1O como SEQ

10 NO: 12. Em ainda outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ

10 NO: 10 como SEQ 10 NO: 12. Em uma realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ 10 NO: 99 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ lO NO: 100 como SEQ lO

NO: 215, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ lO NO: 101 como SEQ lO

NO: 235 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 100 e SEQ lO NO: 101 ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 5 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 215 e SEQ ID NO: 235 ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em uma realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 112. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO:

112. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ ID NO: 113 como SEQ ID NO: 216. Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 113 como SEQ ID NO: 216. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica tanto à SEQ 10 NO: 114 como SEQ 10 NO: 236. Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 114 como SEQ ID NO: 236.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que são específicos para o domínio A2 de Tenascina (TNC-A2). Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para o domínio A2 de Tenascina compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, uma molécula IL-12, uma molécula IFN a ou uma molécula GM- CSF, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal 5 com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para o domínio A2 de Tenascina. Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para o domínio A2 de Tenascina compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para o domínio A2 de Tenascina. Em uma realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 7, SEQ 10 NO: 179, SEQ 10 NO: 183, SEQ 10 NO: 187, SEQ 10 NO: 191, SEQ 10 N0:195, SEQ 10 NO: 199, SEQ 10 NO: 203 e SEQ 10 NO: 207, ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em outra realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 3, SEQ 10 NO: 5, SEQ 10 NO: 177, SEQ 10 NO: 181, SEQ 10 N0:185, SEQ 10 NO: 189, SEQ 10 NO: 193, SEQ 10 NO: 197, SEQ 10 NO: 201 e SEQ 10 NO: 205, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ

ID NO: 7, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191, SEQ ID N0:195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 203 e SEQ ID NO: 207 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 5 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ ID N0:185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201 e SEQ ID NO: 205, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia 1o pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 204 e SEQ ID NO: 208. Em ainda outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ 10 NO: 204 e SEQ 10 NO: 208. Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ 10 NO: 178, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 202 e SEQ ID NO: 206. Em ainda outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO:

182, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198,

SEQ ID NO: 202 e SEQ ID NO: 206. Em uma realização específica, o

5 imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO:

239, SEQ ID NO: 241 e SEQ ID NO: 243, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado da invenção

1o compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%,

85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247 e SEQ ID

NO: 249 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241 e SEQ ID NO: 243 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 245,

SEQ ID NO: 247 e SEQ ID NO: 249 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à

SEQ ID NO: 239; proteína SEQ ID NO: 247 ou SEQ ID NO: 249, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 241 e tanto SEQ ID NO: 245 como SEQ ID NO: 247, ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 5 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 243 e SEQ ID NO: 245, ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em uma realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242 e SEQ ID NO: 244. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242 e SEQ ID NO: 244. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248 e SEQ ID NO: 250. Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionadas a partir do grupo de SEQ 10 NO: 246, SEQ 10 NO: 248 e SEQ 10 NO: 250.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que são específicos para a Proteína que Ativou Fibroblastos (FAP). Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para a FAP compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, uma molécula IL-12, uma molécula IFN a ou uma molécula GM-CSF, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para FAP.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para a FAP compartilha uma ligação

5 peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para FAP.

Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para FAP compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-12, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para FAP.

Em uma realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ

ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47,

SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:

81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 123, SEQ ID

NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO:

143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159,

SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171 e SEQ ID NO: 175, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica,

o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%,

85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:

41, SEQ lO NO: 45, SEQ lO NO: 49, SEQ lO NO: 67, SEQ lO NO: 71, SEQ lO

NO: 75, SEQ lO NO: 79, SEQ lO NO: 83, SEQ lO NO: 87, SEQ lO NO: 91, SEQ

10 NO: 121, SEQ 10 NO: 125, SEQ 10 NO: 129, SEQ 10 NO: 133, SEQ 10 NO:

137, SEQ 10 NO: 141, SEQ 10 NO: 145, SEQ 10 NO: 149, SEQ 10 NO: 153,

5 SEQ 10 NO: 157, SEQ 10 NO: 161, SEQ 10 NO: 165, SEQ 10 NO: 169 e SEQ

10 NO: 173, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,

99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ lO NO: 21, SEQ lO NO: 25, SEQ lO NO: 27, SEQ lO NO: 31,

SEQ 10 NO: 35, SEQ 10 NO: 39, SEQ 10 NO: 43, SEQ 10 NO: 47, SEQ 10 NO:

51, SEQ lO NO: 69, SEQ lO NO: 73, SEQ lO NO: 77, SEQ lO NO: 81, SEQ lO

NO: 85, SEQ 10 NO: 89, SEQ 10 NO: 93, SEQ 10 NO: 123, SEQ 10 NO: 127,

SEQ 10 NO: 131, SEQ 10 NO: 135, SEQ 10 NO: 139, SEQ 10 NO: 143, SEQ 10

NO: 147, SEQ 10 NO: 151, SEQ 10 NO: 155, SEQ 10 NO: 159, SEQ 10 NO:

163, SEQ 10 NO: 167, SEQ 10 NO: 171, e SEQ 10 NO: 175 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,

99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ 10 NO: 17, SEQ 10 NO: 19, SEQ 10 NO: 23, SEQ 10 NO: 29,

SEQ lO NO: 33, SEQ lO NO: 37, SEQ lO NO: 41, SEQ lO NO: 45, SEQ lO NO:

49, SEQ 10 NO: 67, SEQ 10 NO: 71, SEQ 10 NO: 75, SEQ lO NO: 79, SEQ 10

NO: 83, SEQ 10 NO: 87, SEQ 10 NO: 91, SEQ 10 NO: 121, SEQ 10 NO: 125,

SEQ 10 NO: 129, SEQ 10 NO: 133, SEQ 10 NO: 137, SEQ 10 NO: 141, SEQ 10

NO: 145, SEQ 10 NO: 149, SEQ 10 NO: 153, SEQ 10 NO: 157, SEQ 10 NO:

161, SEQ lO NO: 165, SEQ lO NO: 169, e SEQ lO NO: 173, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ 10 NO: 22,

5 SEQ 10 NO: 26, SEQ 10 NO: 28, SEQ 10 NO: 32, SEQ 10 NO: 36, SEQ 10 NO:

40, SEQ 10 NO: 44, SEQ 10 NO: 48, SEQ 10 NO: 52, SEQ 10 NO: 70, SEQ 10

NO: 74, SEQ 10 NO: 78, SEQ 10 NO: 82, SEQ 10 NO: 86, SEQ 10 NO: 90, SEQ

10 NO: 94, SEQ 10 NO: 124, SEQ 10 NO: 128, SEQ 10 NO: 132, SEQ 10 NO:

136, SEQ 10 NO: 140, SEQ 10 NO: 144, SEQ 10 NO: 148, SEQ 10 NO: 152,

SEQ 10 NO: 156, SEQ 10 NO: 160, SEQ 10 NO: 164, SEQ 10 NO: 168, SEQ 10

NO: 172, e SEQ 10 NO: 176. Em ainda outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ lO NO: 22, SEQ lO NO: 26,

SEQ 10 NO: 28, SEQ 10 NO: 32, SEQ 10 NO: 36, SEQ 10 NO: 40, SEQ 10 NO:

44, SEQ 10 NO: 48, SEQ 10 NO: 52, SEQ 10 NO: 70, SEQ 10 NO: 74, SEQ 10

NO: 78, SEQ 10 NO: 82, SEQ 10 NO: 86, SEQ 10 NO: 90, SEQ 10 NO: 94, SEQ

10 NO: 124, SEQ 10 NO: 128, SEQ 10 NO: 132, SEQ 10 NO: 136, SEQ 10 NO:

140, SEQ 10 NO: 144, SEQ 10 NO: 148, SEQ 10 NO: 152, SEQ 10 NO: 156,

SEQ 10 NO: 160, SEQ 10 NO: 164, SEQ 10 NO: 168, SEQ 10 NO: 172, e SEQ

10 NO: 176. Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de

80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a sequência selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ 10 NO: 18, SEQ 10 NO: 20,

SEQ 10 NO: 24, SEQ 10 NO: 30, SEQ 10 NO: 34, SEQ 10 NO: 38, SEQ 10 NO:

42, SEQ 10 NO: 46, SEQ 10 NO: 50, SEQ 10 NO: 68, SEQ 10 NO: 72, SEQ 10

NO: 76, SEQ 10 NO: 80, SEQ 10 NO: 84, SEQ 10 NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ

10 NO: 122, SEQ 10 NO: 126, SEQ 10 NO: 130, SEQ 10 NO: 134, SEQ 10 NO:

138, SEQ 10 NO: 142, SEQ 10 NO: 146, SEQ 10 NO: 150, SEQ 10 NO: 154,

SEQ 10 NO: 158, SEQ 10 NO: 162, SEQ 10 NO: 166, SEQ 10 NO: 170, e SEQ

10 NO: 174. Em ainda outra realização específica, a sequência de região

5 variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ 10 NO: 18, SEQ 10 NO: 20,

SEQ 10 NO: 24, SEQ 10 NO: 30, SEQ 10 NO: 34, SEQ 10 NO: 38, SEQ 10 NO:

42, SEQ 10 NO: 46, SEQ 10 NO: 50, SEQ 10 NO: 68, SEQ 10 NO: 72, SEQ 10

NO: 76, SEQ 10 NO: 80, SEQ 10 NO: 84, SEQ 10 NO: 88, SEQ 10 NO: 92, SEQ

10 NO: 122, SEQ 10 NO: 126, SEQ 10 NO: 130, SEQ 10 NO: 134, SEQ 10 NO:

138, SEQ 10 NO: 142, SEQ 10 NO: 146, SEQ 10 NO: 150, SEQ 10 NO: 154,

SEQ 10 NO: 158, SEQ 10 NO: 162, SEQ 10 NO: 166, SEQ 10 NO: 170, e SEQ

10 NO: 174. Em outra realização específica, o imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%,

85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ lO NO: 209, SEQ lO NO: 211, SEQ lO

NO: 213, SEQ 10 NO: 217, SEQ 10 NO: 219, SEQ 10 NO: 221, SEQ 10 NO:

223, SEQ 10 NO: 225 e SEQ 10 NO: 227, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ lO NO: 229, SEQ lO NO: 231,

SEQ 10 NO: 233 e SEQ 10 NO: 237 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ lO NO: 211, SEQ lO

NO: 219 e SEQ 10 NO: 221 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ 10 NO: 231 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o

5 imunoconjugado da presente invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de

SEQ 10 NO: 209, SEQ 10 NO: 223, SEQ 10 NO: 225 e SEQ 10 NO: 227 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ lO NO: 229 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização adicional específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ 10 NO: 213 e SEQ 10 NO: 233 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ 10 NO: 217 e SEQ ID

NO: 237 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%,

90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ 10 NO: 221 e SEQ

10 NO: 231 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%,

90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ 10 NO: 223 e SEQ

10 NO: 229 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ 10 NO: 225 e SEQ 10 NO: 229 ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em ainda outra 5 realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende duas sequências de polipeptídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ lO NO: 227 e SEQ 10 NO: 229 ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 210, SEQ 10 NO: 212, SEQ 10 NO: 214, SEQ 10 NO: 218, SEQ 10 NO: 220, SEQ 10 NO: 222, SEQ 10 NO: 224, SEQ 10 NO: 226, e SEQ 10 NO: 228. Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionadas a partir do grupo de SEQ 10 NO: 210, SEQ 10 NO: 212, SEQ 10 NO: 214, SEQ 10 NO: 218, SEQ 10 NO: 220, SEQ 10 NO: 222, SEQ 10 NO: 224, SEQ 10 NO: 226, e SEQ 10 NO: 228. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ 10 NO: 230, SEQ 10 NO: 232, SEQ 10 NO: 234, e SEQ 10 NO: 238. Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos selecionadas a partir do grupo de SEQ 10 NO: 230, SEQ 10 NO: 232, SEQ 10 NO: 234, e SEQ 10 NO: 238.

Em uma realização, o imunoconjugado compreende pelo menos um, tipicamente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos que são específicos para o Melanoma de Proteoglicano de Sulfato de Condroitina

(MCSP). Em outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para a

5 MCSP compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula

IL-2, uma molécula IL-12, uma molécula IFN a ou uma molécula GM-CSF, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para MCSP.

Em ainda outra realização, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos em que uma primeira cadeia pesada de Fab específica para a MCSP compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma molécula IL-2, em que uma a uma compartilha uma ligação peptídica carboxi terminal com uma segunda cadeia pesada de Fab específica para MCSP.

Em uma realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 257 como SEQ ID NO: 261 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%,

85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de

SEQ ID NO: 259 como SEQ ID NO: 271 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ ID NO: 257 como SEQ ID NO: 261 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%,

85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência tanto de SEQ lO NO: 259 como SEQ lO NO: 271, ou variantes da mesma que retém funcionalidade. Em uma realização mais específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência da região 5 variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 NO: 257, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 NO: 259. Em outra realização específica, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ lO NO: 261, e uma sequência de região variável da cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 NO: 259. Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a sequência tanto de SEQ 10 NO: 258 como SEQ 10 NO: 262. Em ainda outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia pesada do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ 10 NO: 258 como SEQ 10 NO:

262. Em outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a sequência tanto de SEQ 10 NO: 260 como SEQ 10 NO: 272. Em ainda outra realização específica, a sequência de região variável da cadeia leve do componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado é codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ

ID NO: 260 como SEQ ID NO: 272. Em uma realização específica, o imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

5 100% idêntica tanto à SEQ ID NO: 251 como SEQ ID NO: 255, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado da invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% idêntica tanto à SEQ ID NO: 253 como SEQ ID NO: 265, ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em uma realização mais específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ ID NO: 251 como SEQ ID NO: 255 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntica tanto à SEQ ID NO: 253 como SEQ ID NO: 265,

ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 251 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NO: 253 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado da presente invenção compreende uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 255 ou variantes da mesma que retém funcionalidade e uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica a SEQ ID NO: 253 ou variantes da mesma que retém funcionalidade.

Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a 5 sequência tanto de SEQ ID NO: 252 como SEQ ID NO: 256. Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 252 como SEQ ID NO: 256. Em outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a sequência tanto de SEQ ID NO: 254 como SEQ ID NO: 266. Em ainda outra realização específica, o imunoconjugado compreende uma sequência de polipeptídeos codificada pela sequência de polinucleotídeos tanto de SEQ ID NO: 254 como SEQ ID NO:

266.

Em uma realização, o componente que se liga aos antígenos compreende pelo menos uma região variável capaz de se ligar a um determinante antigênico. Regiões variáveis não limitantes úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata ou humana. Regiões variáveis humanas podem ser derivadas de anticorpos monoclonais humanos feitos pelo método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano para produzir anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor et a/., J. lmmunol.

133:3001-3005 (1984) e Brodeur et a/., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas. 51 a 63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987). Regiões variáveis humanas também podem ser produzidas por animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (JH) da região de união da cadeia pesada do anticorpo em camundongos de linhagem de origem mutante e quimérica resulta na inibição completa de produção de anticorpo endógeno. A transferência do 5 arranjo de genes da imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais linhagens germinativas de camundongo mutante resultará na produção de anticorpos humanos, mediante desafio com antígeno. Consulte, por exemplo, Jakobovits et a/., Nature 362:255-258 (1993).

De forma alternativa, exibição por fago pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e regiões variáveis humanas in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina, por exemplo, de doadores não imunizados. (McCafferty et a/., Nature 348:552-554 (1990).) Em um exemplo dessa técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados na estrutura tanto em um gene para proteína de revestimento principal como secundária de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcional sobre a superfície da partícula de fago.

Devido ao fato da partícula filamentosa conter uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, seleções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Dessa forma, o fago imita algumas das propriedades da célula B. Pode ser realizada exibição por fago em uma variedade de formatos. Para uma revisão de formatos de exibição por fago, consulte Hoogenboom et a/., Nucleic Acids Res. 19:4133-4137 (1991). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição por fago.

Clackson et a/., Nature, 352, 624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongo imunizado. Consulte,

Clackson et ai., Nature 352:624-628 (1991). Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um arranjo diverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et a/., J. Mo/. Biol.

5 222:581-597 (1991 ). Em uma resposta imune natural, genes de anticorpos acumulam mutações em uma alta taxa (hipermutação somática). Algumas das trocas introduzidas irão conferir afinidade mais alta e células B que exibem imunoglobulina de superfície com alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante subsequente desafio com antígeno. Esse processo natural pode ser imitado pelo emprego de técnicas conhecidas como "mistura de cadeia". Consulte Marks etal., Biotech. 10:779-783 (1992). Nesse método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" ou regiões variáveis obtidas por exibição por fago pode ser melhorada pela substituição em sequência dos genes da região V da cadeia pesada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertórios) de genes do domínio V obtidos de doadores não imunizados. Essa técnica permite a produção de anticorpos e regiões variáveis com afinidades na faixa de nM. Uma estratégia para fazer repertórios muito grandes de anticorpo por fago foi descrita por Waterhouse et a/., Nuc/. Acids Res. 21:2265-2266 (1993) e o isolamento de um anticorpo humano de alta afinidade diretamente dessa biblioteca de fago grande é relatada por Griffith et a/., J. Ce/1. Bio. 120:885-896 (1993). A mistura de genes pode também ser usada para derivar anticorpos humanos e regiões variáveis de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano ou a região variável possui afinidades similares e especificidades com o anticorpo de roedor inicial ou com a região variável. De acordo com esse método, que é também referido como "imprinting do epítopo", o gene do domínio V da cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedores obtidos por técnicas de exibição por fago é substituído por um repertório de genes do domínio V humano, criando quimeras roedor-humano. A seleção com resultados de antígenos no isolamento de regiões variáveis humanas capazes de restaurar um sítio de ligação de antígeno funcional, ou seja, o epítopo dirige (imprints) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido para substituir o domínio V do roedor 5 remanescente é obtido um anticorpo humano (consulte publicação PCT documento WO 93/06213). Diferente da humanização tradicional de anticorpos de roedores, a técnica de imprinting do epítopo fornece anticorpos completamente humanos ou regiões variáveis, que não possuem estrutura ou resíduos de COR de origem de roedor.

As regiões variáveis que podem ser usadas também incluem sequências de região variável murina que têm sido tanto sequências de região variável primatizada como humanizada como primata que foram humanizadas.

Como usado no presente pedido, o termo "humanizado" refere-se a um componente que se liga ao antígeno de sequência de região variável derivada de um anticorpo não humano, por exemplo, anticorpo murino, que retém ou substancialmente retém as propriedades de ligação de antígeno da molécula parenta!, mas que é menos imunogênica em humanos. Isso pode ser alcançado por vários métodos, que incluem (a) enxerto somente das CDRs não-humanas em regiões de estrutura humana, com ou sem retenção de resíduos de estrutura essenciais (por exemplo, aqueles que são importantes para a retenção de boa afinidade de ligação de antígeno ou funções de anticorpos) e (b) "camuflagem" das regiões variáveis não-humanas com uma seção similar à humana pela substituição dos resíduos de superfície. Tais métodos são divulgados por Jones et a/., Morrison et a/., Proc. Natl. Acad. Sei., 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. lmmunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et a/., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Mo/ec. lmmun., 28:489-498 (1991 ); Padlan, Molec. lmmun., 31 (3):169-217 (1994), todos os quais incorporados ao presente pedido como referência em sua totalidade no presente pedido. Existem geralmente três regiões determinantes de complementaridade ou CDRs, (COR 1, CDR2 e CDR3) em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo, que são ladeadas por quatro subregiões de estrutura (ou seja, FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada 5 um dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo: FR1- CDR 1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma discussão sobre anticorpos humanizados com regiões variáveis humanizadas podem ser encontradas, entre outras, na patente US 6.632.927 e na publicação de pedido US 2003/0175269, ambas as quais incorporadas ao presente pedido como 1o referência em sua totalidade.

De maneira similar, como usado no presente pedido, o termo "primatizado" é usado para se referir a um componente que se liga ao antígeno de região variável derivada de um anticorpo não-primata, por exemplo, um anticorpo murino, que retém ou substancialmente retém as propriedades de ligação do antígeno da molécula parenta!, mas que é menos imunogênico em primatas.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto pesados como leve, na produção de antígenos humanizados que se ligam aos componentes é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método também conhecido como "melhor ajuste", a sequência da região variável de um antígeno de roedor que se liga ao componente é selecionada em oposição à biblioteca completa das sequências humanas de região variável conhecidas. A sequência humana V que é a mais próxima da do roedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o antígeno humanizado que se liga ao componente (Sims et a/., J. lmmunol., 151:2296 (1993); Chothia et a/., J. Mo/.

Biol., 196:901 (1987)). Outro método de seleção da sequência de estrutura humana é comparar a sequência de cada subregião individual da estrutura de roedor completa (ou seja, FR1, FR2, FR3 e FR4) ou alguma combinação das sub regiões individuais (por exemplo, FR 1 e FR2) em relação a uma biblioteca de sequências de região variável humana conhecida que corresponde àquela subregião de estrutura (por exemplo, conforme determinado pela numeração de Kabat) e escolha da sequência humana para cada subregião ou 5 combinação que é a mais próxima dos roedores (publicação de pedido de patente US 2003/0040606A 1). Outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para diversos antígenos humanizados diferentes que se ligam a componentes (Carter et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta etal., J.lmmunol., 151:2623 (1993)).

Geralmente, o componente que se liga aos antígenos do imunoconjugado da invenção retém alta afinidade para determinantes antigênicos específicos e outras propriedades biológicas favoráveis.

Consequentemente, regiões variáveis humanizadas são preparadas por análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais que utilizam modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas.

Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares para os técnicos no assunto. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensional das sequências de região variável da imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da sequência de região variável da imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam na habilidade da sequência de região variável candidata se ligar ao seu antígeno.

Dessa maneira, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e de sequências importadas, de forma que o antígeno desejado se liga ao componente característico, assim como aumento de afinidade para o(s)

antígeno(s) alvo(s), é alcançada. Em geral, os resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de antígeno de ligação.

Em outra realização, as moléculas de ligação ao antígeno da 5 presente invenção são elaborados geneticamente para ter afinidade de ligação aprimorada de acordo com, por exemplo, os métodos divulgados na publicação de pedido de patente US 2004/0132066, os conteúdos inteiros que são incorporados ao presente pedido como referência. A habilidade do imunoconjugado da invenção tanto em ligar um receptor de componente efetor como um determinante antigênico específico pode ser medida tanto através de um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) como por outras técnicas familiares para um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmônica de superfície (analisado em um sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et a/. G/yco. J. 17:323-329 (2000)) e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, RP, Endocr. Res. 28:217-229 (2002)).

COMPONENTES EFETORES Os componentes efetores para uso na invenção geralmente são polipeptídeos que influenciam a atividade celular, por exemplo, através de vias de transdução de sinal. Consequentemente, o componente efetor do imunoconjugado da invenção pode ser associado com sinalização mediada por receptor que transmite um sinal de fora da membrana celular para modular uma resposta dentro da célula. Por exemplo, um componente efetor do imunoconjugado pode ser uma citocina. Em uma realização específica, o componente efetor é um componente efetor de cadeia única como definido no presente pedido. Em uma realização, uma ou mais componentes efetores, tipicamente componentes efetores de cadeia única, dos imunoconjugados da invenção são citocinas selecionadas a partir do grupo que consiste de: IL-2, GM-CSF, IFN-a e IL-12. Em outra realização, um ou mais componentes efetores de cadeia única dos imunoconjugados são citocinas selecionadas a partir do grupo que consiste de: IL-8, MIP-1a, MIP-1 ~e TGF-~.

Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é IL-2. Em uma 5 realização específica, o componente efetor IL-2 pode produzir uma ou mais das respostas celulares selecionadas a partir do grupo que consiste de: proliferação em uma célula de linfócito T ativada, diferenciação em uma célula de linfócito T ativada, atividade de células T citotóxicas (CTL), proliferação em uma célula B ativada, diferenciação em uma célula B ativada, proliferação em uma célula natural killer (NK), diferenciação em uma célula NK e citotoxicidade antitumoral de NKfkil/er ativado por linfocina (LAK). Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é GM-CSF. Em uma realização específica, o componente efetor GM-CSF pode produzir proliferação e/ou diferenciação em um granulócito, um monócito ou em uma célula dendrítica. Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é IFN-a. Em uma realização específica, o componente efetor IFN-a pode obter uma ou mais das respostas celulares selecionadas a partir do grupo que consiste de: inibição de replicação viral em uma célula infectada por vírus e suprarregulação da expressão do complexo principal de histocompatibilidade I (MHC 1). Em outra realização específica, o componente efetor IFN a pode inibir proliferação em uma célula tumoral. Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é IL-12. Em uma realização específica, o componente efetor IL-12 pode obter uma ou mais das respostas celulares selecionadas a partir do grupo que consiste de: proliferação em uma célula NK, diferenciação em uma célula NK, proliferação em uma célula T e diferenciação em uma célula T. Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é IL-8. Em uma realização específica, o componente efetor IL-8 pode produzir quimiotaxia em neutrófilos. Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é MIP-1a. Em uma 5 realização específica, o componente efetor MIP-1a pode produzir quimiotaxia em monócitos e células de linfócito T. Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é MIP-1 ~- Em uma realização específica, o componente efetor MIP-1 ~ pode produzir quimiotaxia em monócitos e células de linfócito T. Em uma realização, o componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, do imunoconjugado é TGF-~. Em uma realização específica, o componente efetor TGF-~ pode obter uma ou mais das respostas celulares selecionadas a partir do grupo que consiste de: quimiotaxia em monócitos, quimiotaxia em macrófagos, suprarregulação da expressão de IL-1 em macrófagos ativados e suprarregulação da expressão de lgA em células B ativadas.

POLIPEPTÍDEOS E POLINUCLEOTÍDEOS IMUNOCONJUGADOS Os imunoconjugados da invenção compreendem polipeptídeos e fragmentos dos mesmos. Como usado no presente pedido, o termo "polipeptídeo tem a intenção de englobar um "polipeptídeo" singular, bem como numerosos "polipeptídeos" e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligada de forma linear por ligações amida (também conhecida como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Dessa forma, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácidos" ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de "polipeptídeo" e o termo

"polipeptídeo" pode ser utilizado ao invés de, ou de forma intercambiável com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo" também é destinado para se referir aos produtos de modificações de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, 5 derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica ou modificação por aminoácidos de ocorrência não-natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucléico designada. Pode ser gerado de qualquer forma, inclusive por síntese química.

Um polipeptídeo da invenção pode ter um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 1O ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não necessariamente tenham tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas de preferência podem adotar um grande número de conformações diferentes e são referidos como se desdobrados.

Por um polipeptídeo "isolado" ou uma variante, ou derivado do mesmo é destinado um polipeptídeo que não está em seu meio natural.

Nenhum nível específico de purificação é requerido. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural.

Polipeptídeos e proteínas produzidos de modo recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção, como são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcialmente, ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

Também incluído como polipeptídeos da presente invenção estão derivativos, análogos ou variantes dos polipeptídeos precedentes e qualquer combinação dos mesmos. Os termos "variante", "derivativo" e "análogo" quando se refere a polipeptídeos da presente invenção incluem quaisquer 5 polipeptídeos que retenham pelo menos algumas das propriedades biológicas, antigênicas ou imunogênicas do polipeptídeo nativo correspondente. Variantes de polipeptídeos da presente invenção incluem polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido às substituições de aminoácidos, deleções ou inserções. Variantes podem ocorrer naturalmente ou serem de ocorrência não- natural. Variantes de ocorrência não-natural podem ser produzidos usando-se técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições de aminoácidos conservativas ou não- conservativas, deleções ou adições. Derivados de polipeptídeos da presente invenção são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Os exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes também podem ser referidos no presente pedido como "análogos de polipeptídeos". Como usado no presente pedido um "derivado" de um polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo de estudo que tem um ou mais resíduos quimicamente derivados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluído como "derivados" estão aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4- hidroxiprolina pode ser substituída por prolina, 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina, 3 metilhistidina pode ser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina e ornitina pode ser substituída por lisina.

Alternativamente, as variantes recombinantes que codificam esses polipeptídeos iguais ou semelhantes podem ser sintetizadas ou selecionadas, por fazer uso da "redundância" no código genético. Diversas substituições de códon, como as mudanças silenciosas que produzem vários sítios de restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um vetor de plasmídeo ou vira! ou expressão em um sistema procariótico ou 5 eucariótico específico. Mutações na sequência de polinucleotídeos podem ser refletidas no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao polipeptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo, para alterar características como afinidades de ligação do ligante, afinidades intercadeias ou degradação/taxa de rotatividade.

Preferencialmente, substituições de "aminoácidos" é o resultado da substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhante, ou seja, substituições de aminoácidos conservativas. Substituições de aminoácidos "conservativas" podem ser feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza antipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina, aminoácidos carregados positivamente (básico) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (acídico) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. "Inserções" ou "deleções" estão preferencialmente na faixa de cerca de 1 a cerca de 20 aminoácidos, mais preferencialmente de 1 a 1O aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente por inserções deleções ou substituições de aminoácidos feitas sistematicamente em uma molécula de polipeptídeo usando-se técnicas de DNA recombinante e analisando o resultado de variantes recombinantes para a atividade.

Por um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de consulta da presente invenção, pretende-se que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de estudo seja idêntica à sequência de consulta, exceto que a sequência do polipeptídeo de estudo pode incluir até cinco alterações de 5 aminoácidos para cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de consulta. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de consulta, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência estudada pode ser inserida, deletada ou substituída por outro aminoácido.

Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carboxi terminal da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer lugar entre as posições terminais, intercaladas tanto individualmente entre resíduos na sequência de referência como em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referências.

Como uma questão prática, se qualquer polipeptídeo específico, é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a um polipeptídeo de referência pode ser determinado de modo convencional usando-se programas de computador conhecidos. Um método preferido para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (uma sequência da presente invenção) e uma sequência estudada, também referido como um alinhamento de sequência global, pode ser determinada usando-se o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et a/., Comp. Appl. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequências as sequências de consultas e de estudo são tanto sequências de nucleotídeos como sequências de aminoácidos. O resultado de dito alinhamento da sequência global está em percentual de identidade. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácido FASTDB são: Matríz=PAM O, conjunto de variáveis-k=2, Penalidade de

Emparelhamento=1, Penalidade de União=20, Comprimento do Grupo de Randomização=O, Nota de Corte=1, Tamanho da Janela=comprimento da sequência, Penalidade de Gap=5, Penalidade de Tamanho de Gap-0,05, Tamanho da Janela=500 ou o comprimento da sequência de aminoácido de 5 estudo, o que for menor.

Se a sequência de estudo é mais curta do que a sequência de consulta devido a deleções N- ou C-terminal, não por causa de deleções internas, deve ser feita uma correção manual nos resultados. Isso ocorre porque o programa FASTDB não computa truncamentos N- e C-terminal da sequência de estudo quando calcula o percentual de identidade global. Para as sequências de estudo truncadas nas terminações N- e C-, em relação à sequência de consulta, o percentual de identidade é corrigido por cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que são N- e C-terminal da sequência de estudo, que não são compatíveis/alinhados com um resíduo de estudo correspondente, como um percentual do total de bases da sequência de consulta. Se um resíduo é compatível/alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Esse percentual é então subtraído do percentual de identidade, calculado pelo programa FASTDB acima usando-se os parâmetros especificados para chegar a uma pontuação final de percentual de identidade. Essa pontuação final de percentual de identidade é o que é usada para os propósitos da presente invenção. Somente resíduos para a terminação N- e C- da sequência de estudo, que não são compatíveis/alinhados com a sequência de consulta são considerados a fim de ajustar manualmente a pontuação de percentual de identidade. Em outras palavras, somente posições de resíduos de consulta fora dos resíduos N- e C- terminal mais distantes da sequência de estudo.

Por exemplo, uma sequência de estudo de resíduos de 90 aminoácidos é alinhada com uma sequência de consulta de 100 resíduos para determinar o percentual de identidade. A deleção ocorre no N-terminal da sequência de estudo e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma combinação/alinhamento dos 1O primeiros resíduos no N-terminal. Os 1O resíduos não pareados representam 10% da sequência (número de resíduos 5 nas terminações N- e C- não combinadas/número total de resíduos na sequência de consulta), e então 10% é subtraído da pontuação de percentual de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes foram perfeitamente combinados o percentual de identidade final seria de 90%.

Em outro exemplo, uma sequência de estudo de 90 resíduos é comparada a 1o uma sequência de consulta de 100 resíduos. Dessa vez, as deleções são deleções internas para que não haja resíduos nas terminações N- ou C- da sequência de estudo que não estão combinadas/ alinhadas com a consulta.

Nesse caso, o percentual de identidade calculado por FASTDB não é corrigido manualmente. Mais uma vez, somente as posições de resíduo fora das extremidades N- e C-terminal da sequência de estudo, como exibido no alinhamento FASTDB, que não estão combinados/alinhados com a sequência de consulta são corrigidos manualmente. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os propósitos da presente invenção.

Polipeptídeos da invenção incluem aqueles que são, pelo menos, cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos às sequências estabelecidas nas Tabelas 3 e 4, abaixo, incluindo fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos. A invenção também engloba polipeptídeos que compreendem sequências das Tabelas 3 ou 4 com substituições de aminoácidos conservativas.

Os polipeptídeos da invenção podem ser codificados por um único polinucleotídeo. De forma alternativa, o polinucleotídeo pode ser codificado por múltiplos polinucleotídeos (por exemplo, dois ou mais), de modo que os polipeptídeos são coexpressos. Polipeptídeos que são coexpressos a partir de polinucleotídeos múltiplos podem associar-se através de, por exemplo, pontes bissulfeto ou outros meios para formar um imunoconjugado funcional. Por exemplo, a porção da cadeia pesada de um componente que se liga ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção do 5 imunoconjugado que compreende a porção da cadeia leve do componente que se liga ao antígeno e o componente efetor. Quando coexpresso, os polipeptídeos da cadeia pesada irão associar-se aos polipeptídeos da cadeia leve para formar o componente que se liga ao antígeno. De forma alternativa, em outro exemplo a porção da cadeia leve do componente que se liga ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção do imunoconjugado que compreende a porção da cadeia pesada do componente que se liga ao antígeno e o componente efetor.

lmunoconjugados da presente invenção e fragmentos dos mesmos são geralmente codificados por polinucleotídeos. O termo "polinucleotídeo" tem a intenção de englobar um ácido nucléico singular, bem como numerosos ácidos nucléicos e refere-se a uma molécula ou constructo de ácido nucléico isolada, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não-convencional (por exemplo, uma ligação amida, como encontrada em ácidos nucléicos peptídicos (PNA)). O termo "ácido nucléico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucléico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucléico "isolado" ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo terapêutico contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa e formas de fita dupla, de vetores pestivírus 5 divulgado no presente pedido.

Polinucleotídeos ou ácidos nucléicos isolados de acordo com a presente invenção também incluem tais moléculas produzidas sinteticamente.

Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucléico pode ser ou pode incluir um elemento regulador como um promotor, sítio de ligação do ribossomo ou um terminador de transcrição.

Como usado no presente pedido, uma "região codificadora" é uma porção de ácido nucléico que consiste de códons traduzidos em aminoácidos.

Apesar de um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA), não ser traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificadora, se presente, mas qualquer uma das sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação de ribossomo, terminadores de transcrição, íntrons, regiões não-traduzidas 5' e 3' e similares, não são parte de uma região codificadora. Duas ou mais regiões codificadoras da presente invenção podem estar presentes em um constructo de polinucleotídeo único, por exemplo, em um vetor único ou em constructos de polinucleotídeos separados, por exemplo, em vetores (diferentes) separados.

Além disso, qualquer vetor pode conter uma região codificadora única ou pode compreender duas ou mais região codificadoras, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar uma ou mais poliproteínas, que são pós- ou cotraducionais separadas em proteínas finais através de clivagem proteolítica.

Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucléico da invenção podem codificar regiões codificadoras heterólogas, tanto fundidas ou não fundidas ao primeiro ou segundo ácido nucléico que codifica o imunoconjugado da invenção, com um variante ou derivativo do mesmo. Regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação elementos especializados ou motivos, como um secretário de peptídeo sinal ou um domínio funcional heterólogo.

Em certas realizações, o polinucleotídeo ou ácido nucléico é DNA.

5 No caso de DNA, um polinucleotídeo que compreende um ácido nucléico, que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente associado a uma ou mais regiões codificadoras. Uma associação operável é quando uma região codificadora para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, 1o está associado a uma ou mais sequências reguladoras de forma a como colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle da sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (como uma região codificadora de polipeptídeos e um promotor associado com isso) são "operacionalmente associados" se a indução da função promotora resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferem com a habilidade da expressão de sequências reguladoras para dirigir a expressão do produto do gene ou interferir na habilidade do molde de DNA ser transcrito. Dessa forma, uma região promotora seria operacionalmente associada a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição de tal ácido nucléico. O promotor pode ser um promotor de células específicas que direciona a transcrição substancial do DNA somente em células pré-determinadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, enhancers, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição, podem ser operacionalmente associado ao polinucleotídeo para dirigir transcrição específica de célula. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são divulgados no presente pedido.

Uma variedade de regiões de controle de transcrição são conhecidas pelos técnicos no assunto. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, como, mas não limitadas a, segmentos promotor e enhancer de citomegalovírus (por 5 exemplo, o promotor inicial imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 ( por exemplo, o promotor inicial) e retrovírus (como, por exemplo, vírus de sarcoma Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes vertebrados, como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e globina-~ de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas.

Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e enhancers tecido-específico, bem como promotores induzíveis por linfocina (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).

De maneira similar, uma variedade de elementos de controle de translação são geralmente conhecidas pelos técnicos no assunto. Esses incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação de ribossomo, iniciação de tradução e códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (especialmente um sítio interno de entrada de ribossomo ou IRES, também citado como uma sequência CITE).

Em outras realizações, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita simples ou de fita dupla.

As regiões codificadoras de polinucleotídeos e ácidos nucléicos da presente invenção podem ser associadas a regiões codificadoras adicionais que codificam peptídeos secretários ou sinal, que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese do sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm uma sequência peptídeo sinal ou líder secretária que é clivada da proteína madura, uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente através do retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Técnicos no assunto têm conhecimento de que polipeptídeos secretados pelas células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido à terminação N do polipeptídeo, que 5 é clivado a partir do polipeptídeo completo ou "inteiro" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas realizações, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, peptídeo sinal de cadeia pesada ou cadeia leve da imunoglobulina é usado ou um derivativo funcional dessa sequência que retém a habilidade de dirigir a secreção do polipeptídeo que é operacionalmente associado a ele. Alternativamente, um peptídeo sinal de mamíferos heterólogo ou um derivativo funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder tipo selvagem pode ser substituída com a sequência líder do ativador do plasminogênio tecidual humano (TPA) ou ~ glucuronidase de camundongo.

O termo "cassete de expressão" refere-se a um polinucleotídeo gerado de modo recombinante ou sinteticamente, com uma série de elementos especificados de ácido nucléico que permitem a transcrição de um ácido nucléico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA de plastídeo, vírus ou fragmento de ácido nucléico. Tipicamente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucléico a ser transcrita e um promotor. Em uma realização, o cassete de expressão da invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos.

O termo "vetor de expressão" é sinônimo de "constructo de expressão" e refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico ao qual está associado operacionalmente em uma célula alvo. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Vetores de expressão permitem transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula alvo, a molécula de ácido 5 ribonucléico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou máquinas de tradução. Em uma realização, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos.

1o O termo "artificial" refere-se a um sintético ou composição derivada de células não hospedeiras, por exemplo, um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente.

Por um ácido nucléico ou polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos, pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de polinucleotídeos pode incluir até cinco pontos de mutações para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. 95% "idêntico" a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência.

Como uma questão prática, se qualquer molécula de ácido nucléico específico ou polipeptídeo é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a uma sequência de nucleotídeo ou sequência de 5 polipeptídeo da presente invenção podem ser determinados de modo convencional usando-se programas de computador conhecidos. Um método preferido para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (uma sequência da presente invenção) e uma sequência estudada, também referida como um alinhamento de sequência global, pode ser determinada usando-se o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et a/., Comp. Appl. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequências as sequências de consulta e de estudo são ambas sequências de DNA. Uma sequência de RNA pode ser comparada por conversão de U's em T's. O resultado de dito alinhamento da sequência global está em percentual de identidade. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento FASTDB de sequências de DNA para calcular o percentual de identidade são: Matriz=Unitário, conjunto de variáveis-k=4, Penalidade de Emparelhamento=1, Penalidade de União-30, Comprimento do Grupo de Randomização=O, Pontuação de Corte=1, Penalidade de Gap=5, Penalidade de Tamanho de Gap=0,05, Tamanho da Janela=500 ou o comprimento das sequências de aminoácidos estudada, o que for menor.

Se a sequência de estudo é mais curta do que a sequência de consulta devido a deleções 5' ou 3', não por causa de deleções internas, deve ser feita uma correção manual nos resultados. Isso ocorre porque o programa FASTDB não computa truncamentos 5' e 3' da sequência de estudo quando calcula o percentual de identidade. Para as sequências de estudo truncadas nas terminações 5' e 3', em relação à sequência de consulta, o percentual de identidade é corrigido por cálculo do número de bases da sequência de consulta que são 5' e 3' da sequência de estudo, que não são compatíveis/alinhados como um percentual do total de bases da sequência de consulta. Se um nucleotídeo é compatível/alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Esse percentual é então 5 subtraído do percentual de identidade, calculado pelo programa FASTDB acima usando-se os parâmetros especificados para chegar a uma pontuação final de percentual de identidade. Essa pontuação corrigida é o que é usada para os propósitos da presente invenção. Somente bases fora das bases 5' e 3' da sequência de estudo, conforme mostrado pelo alinhamento FASTDB, que não são compatíveis/alinhadas com a sequência de consulta são calculadas a fim de ajustar manualmente a pontuação de percentual de identidade.

Por exemplo, uma sequência de estudo de 90 bases é alinhada a uma sequência de consulta de 100 bases para determinar o percentual de identidade. As deleções ocorrem na extremidade 5' da sequência de estudo e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma combinação/alinhamento das 1O primeiras bases na extremidade 5'. As 1O bases não pareadas representam 10% da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' não combinadas/número total de bases na sequência de consulta), então 10% é subtraído da pontuação de percentual de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se as 90 bases restantes foram perfeitamente combinadas o percentual de identidade final seria de 90%. Em outro exemplo, uma sequência de estudo de 90 bases é comparada a uma sequência de consulta de 100 bases. Dessa vez, as deleções são deleções internas para que não haja bases nas extremidades 5' ou 3' da sequência de estudo que não estão combinadas/ alinhadas com a consulta. Nesse caso, o percentual de identidade calculado por FASTDB não é corrigido manualmente. Mais uma vez, apenas bases 5' e 3' da sequência de estudo que não são combinadas/alinhadas com a sequência de consulta são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os propósitos da presente invenção.

Polinucleotídeos da invenção incluem aqueles que são, pelo menos, cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos às sequências estabelecidas nas Tabelas 6 e 8, abaixo, incluindo 5 fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica o imunoconjugado inteiro ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se através de, por exemplo, pontes bissulfeto ou outros meios para formar um imunoconjugado funcional. Por exemplo, a porção da cadeia pesada de um componente que se liga ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção do imunoconjugado que compreende a porção da cadeia leve do componente que se liga ao antígeno e ao componente efetor. Quando coexpresso, os polipeptídeos da cadeia pesada irão associar-se aos polipeptídeos da cadeia leve para formar o componente que se liga ao antígeno. De forma alternativa, em outro exemplo a porção da cadeia leve do componente que se liga ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção do imunoconjugado que compreende a porção da cadeia pesada do componente que se liga ao antígeno e ao componente efetor.

Em uma realização específica, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de um imunoconjugado que compreende pelo menos um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, e pelo menos um, preferencialmente dois ou mais componentes que se ligam aos antígenos, sendo que o primeiro componente efetor compartilha uma ligação peptídica amino- ou carboxi-terminal com um primeiro componente que se liga ao antígeno e um segundo componente que se liga ao antígeno compartilham uma ligação peptídica amino- ou carboxi-terminal tanto com o primeiro componente efetor como com o primeiro componente que se liga ao antígeno. Em uma realização preferencial, o componente que se liga aos antígenos são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de Fv e Fab. Em outra realização específica, o polinucleotídeo codifica 5 as cadeias pesadas de dois dos componentes que se ligam aos antígenos e um dos componentes efetores. Em outra realização específica, o polinucleotídeo codifica as cadeias leves de dois dos componentes que se ligam aos antígenos e um dos componentes efetores. Em outra realização específica, o polinucleotídeo codifica uma cadeia leve de um dos componentes que se ligam aos antígenos, uma cadeia pesada de um segundo componente que se liga ao antígeno e um dos componentes efetores.

Em outra realização específica, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de um imunoconjugado, sendo que o polinucleotídeo codifica as cadeias pesadas de duas moléculas Fab e um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única.

Em outra realização específica, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de um imunoconjugado, sendo que o polinucleotídeo codifica as cadeias leves de duas moléculas Fab e um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única. Em outra realização específica, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de um imunoconjugado, sendo que o polinucleotídeo codifica a cadeia pesada de uma molécula Fab, a cadeia leve da segunda molécula Fab e um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única.

Em uma realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um imunoconjugado que compreende pelo menos um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única, unido a seus aminoácidos amino- e carboxi-terminal a uma ou mais moléculas scFv.

Em uma realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de imunoconjugado que compreende pelo menos um componente efetor, de preferência um componente efetor de cadeia única e pelo menos o primeiro e o segundo componente que se liga ao antígeno, em que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos compreendem uma 5 molécula scFv unida a seu aminoácido carboxi-terminal a uma região constante que compreende um domínio constante de imunoglobulina independentemente selecionada a partir do grupo que consiste de lgG1 CH1, lgG Ckappa e lgE CH4 e em que um dos componentes que ligam ao antígenos é unido a seu aminoácido carboxi-terminal de região constante ao aminoácido amino-terminal 1o de um dos componentes efetores, e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes são covalentemente ligados através de uma ponte bissulfeto. Em uma realização adicional, o polinucleotídeo da invenção codifica um dos componentes que se ligam aos antígenos e um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única.

Em uma realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de imunoconjugado que compreende o primeiro e o segundo componentes efetores e dois componentes que se ligam aos antígenos, em que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos compreendem uma molécula scFv unida a seu aminoácido carboxi-terminal a uma região constante que compreende um domínio constante de imunoglobulina e em que um dos componentes que ligam ao antígenos é unido a seu aminoácido carboxi-terminal de região constante ao aminoácido amino- terminal de um dos componentes efetores, e em que o segundo componente que se liga aos antígenos é unido a seu aminoácido carboxi-terminal de região constante ao aminoácido amino-terminal do segundo componente efetor e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes são covalentemente ligados através de uma ponte bissulfeto. Em uma realização preferencial, o primeiro e/ou segundo componente efetor são componentes efetores de cadeia única. Em uma realização preferencial, o domínio constante é selecionado de forma independente a partir do grupo que consiste de lgG1 CH1, lgG Ckappa e lgE CH4. Em uma realização adicional, o polinucleotídeo da invenção codifica um dos componentes que se ligam aos antígenos e um dos 5 componentes efetores.

Em uma realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de imunoconjugado que compreende pelo menos um componente efetor, de preferência um componente efetor de cadeia única e pelo menos o primeiro e o segundo antígeno que se ligam ao componentes, em 1o que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos compreendem uma molécula scFv unida a seu aminoácido carboxi-terminal a um domínio lgG CH3 e em que um dos componentes que ligam ao antígenos é unido a seu aminoácido carboxi-terminal ao aminoácido amino-terminal de um dos componentes efetores, e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes são covalentemente ligados através de uma ponte bissulfeto.

Em uma realização adicional, o polinucleotídeo da invenção codifica um dos componentes que se ligam aos antígenos e um componente efetor, preferencialmente um componente efetor de cadeia única.

Em uma realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de imunoconjugado que compreende dois componentes efetores e dois componentes que se ligam aos antígenos, em que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos compreendem uma molécula scFv unida a seu aminoácido carboxi-terminal a um domínio lgG CH3 e em que um dos componentes que ligam ao antígenos é unido a seu aminoácido carboxi-terminal de região constante ao aminoácido amino- terminal de um dos componentes efetores, e em que o segundo componente que se liga aos antígenos é unido a seu aminoácido carboxi- terminal ao aminoácido amino-terminal do segundo componente efetor e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes são covalentemente ligados através de uma ponte bissulfeto. Em uma realização preferencial, o primeiro e/ou segundo componente efetor são componentes efetores de cadeia única. Em uma realização adicional, o 5 polinucleotídeo da invenção codifica um dos componentes que se ligam aos antígenos de um dos componentes efetores, preferencialmente um componente efetor de cadeia única.

Em uma realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de imunoconjugado que compreende dois componentes efetores e dois componentes que se ligam aos antígenos, em que cada um dos componentes que se ligam aos antígenos compreendem uma molécula Fab unida ao seu aminoácido carboxi-terminal de cadeia pesada ou leve a um domínio lgG1 CH3 e em que cada um dos domínios lgG1 CH3 é unido a seu aminoácido carboxi-terminal ao aminoácido amino- terminal de um dos componentes efetores e em que o primeiro e o segundo antígeno que se ligam aos componentes são covalentemente ligados através de uma ponte bissulfeto. Em uma realização preferencial, o primeiro e/ou segundo componente efetor são componentes efetores de cadeia única. Em uma realização adicional, o polinucleotídeo da invenção compreende uma sequência que codifica a região variável da cadeia pesada de um dos componentes que se ligam aos antígenos e um dos ditos componentes efetores, preferencialmente um componente efetor de cadeia única. Em ainda outra realização, o polinucleotídeo da invenção compreende uma sequência que codifica a região variável da cadeia leve de um dos componentes que se ligam aos antígenos e um dos componentes efetores, preferencialmente um componente efetor de cadeia única.

Em outra realização, a presente invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma sequência de região variável, conforme mostrado na Tabela 3 abaixo.

Em outra realização, a presente invenção é dirigida a um polinucleotídeo 5 isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma sequência de polipeptídeos, conforme mostrado na Tabela 4. Em outra realização, a invenção é, além disso, dirigida a um ácido nucléico isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos mostradas nas Tabelas 6 e 8 abaixo. Em outra realização, a presente invenção é dirigida a um ácido nucléico isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o ácido nucléico compreende uma sequência de ácidos nucléicos mostrada na Tabela 6 e 8.

Em outra realização, a invenção é dirigida a um ácido nucléico isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que codifica uma sequência de região variável que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos da Tabela 3.

Em outra realização, a invenção é dirigida a um ácido nucléico isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que codifica uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos da Tabela 4. A invenção engloba um ácido nucléico isolado que codifica um imunoconjugado ou fragmento do mesmo, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que codifica as sequências de região variável da Tabela 3 com substituições de aminoácidos conservativas. A invenção também engloba um ácido nucléico isolado que codifica um imunoconjugado da invenção ou fragmento do mesmo, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que codifica as sequências de polipeptídeos da Tabela 4 com substituições de aminoácidos conservativas.

TABELA 2 Constructo SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS SEQ ID NO

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACT CGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATCGTGTTAACGCAGTC TCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCT CTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCC TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATC TATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGT ATGGTAGCTCACCGCTGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGG

AAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC Molde de GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG Biblioteca para TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT biblioteca DP47-3; GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGA região codificadora GTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCA de Fab completa GCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA que compreende AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC sequência líder de CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGCCGCAG PeiB +domínio V AACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGAGCCGCAGA de Vk3_20 kappa CTACAAGGACGACGACGACAAGGGTGCCGCATAATAAGGCGC 1 +domínio GCCAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATATGAAATACCTGCTGC constante CL para CGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGG cadeia leve e Pel B CGATGGCCGAGGTGCAATTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGG + domínio V de TACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG VH3_23 + domínio GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC constante CH 1 TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAG para cadeia TGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTT pesada; pMS25opt CACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAG

ATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGT GCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCC TGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAAGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAA GTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACGCGGCCGCA AGCACTAGTGCCCATCACCATCACCATCACGCCGCGGCATAG

Constructo SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS SEQ ID NO

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACT CGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATATCCAGATGACCCAGTC TCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACCGGGTCACCATC ACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGT ACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATG CTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTT GCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGCATAATA GTTACCCCACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGC GTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGA

TGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTG Molde de AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGG Biblioteca para ATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA biblioteca DP88-3; GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT região codificadora GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC de Fab completa CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA que compreende GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGCCGCAGAACAAAAACT sequência líder de CATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGAGCCGCAGACTACAAGGA PeiB +domínio V CGACGACGACAAGGGTGCCGCATAATAAGGCGCGCCAATTCT de Vk1_17 kappa ATTTCAAGGAGACAGTCATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCT 2 +domínio GCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC constante CL para CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT cadeia leve e Pel B GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA + domínio V de TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA VH1_69 +domínio CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT constante CH1 ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA para cadeia CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA pesada; pRJH32 GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC

TATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAG GGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAAGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAAGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACGCGG CCGCAAGCACTAGTGCCCATCACCATCACCATCACGCCGCGG

CATAG TABELA 3 Constructo SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS SEQ ID NO

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP 2B10;VL KRLIYAASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 3

NGLQPATFGQGTKVEIK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP 2B10(GS); VL KRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 5

NGLQPATFGQGTKVEIK

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ 2810; VH GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE 7

DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 2F11;VL PRLLIYGASSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC 9

QQGQYTPPTFGQGTKVEI K

Constructo SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS SEQ ID NO

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 2F11(VI); VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTL TISRLEPEOFAVYYCQ 11

QGQYTPPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 2F11; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISR ONSKNTL YLQMNSLRA 13

EOMAVYYCAKWRWMMFOYWGQGTLVTVSS

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 2F11 (MT); VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 15

EOTAVYYCAKWRWMMFOYWGQGTL VTVSS

EIVLTQSPGTLSLYPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 3F2; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 17

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 3F2(YS); VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 19

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 3F2;VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 21

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 309, VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTL TISRLEPEOFAVYYCQ 23

QGQLI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGK 309, VH GLEWVSAIGVSTGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 25

EOTAVYYCAKGWLGPFOYWGQGTLVTVSS

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 309(TA); VH GLEWVSAIGVSTGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 27

EOTAVYYCAKGWLGPFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQA 4G8; VL PRLLIIGASTRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQQ 29

GQVIPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 4G8; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 31

EOTAVYYCAKGWLGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQA 483; VL PRLLIYGAYI RATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 33

QGQVI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 483; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMN SLRA 35

EOTA VYYCAKGWLGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQA 406; VL PRLLIQGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 37

QGQVI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 406; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 39

EOTAVYYCAKGWLGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 2C6; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 41

QGQQI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGK 2C6; VH GLEWVSAISGSAGYTYYAOSVKGRFTISRO NSKNTL YLQMNSLRA 43

EOTAVYYCAKGWFGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 5H5; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTL TISRLEPEOFAVYYCQ 45

QGNQIPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRRSPGK 5H5; VH 47

GLEWVSAISGGGRTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRA

Constructo SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS SEQ 10 NO

EOTAVYYCAKGWFTPFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQA 2C4; VL PRLLIYGASI RATGI PORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 49

QGNQI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 2C4; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 51

EOTAVYYCAKGWFTPFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 209; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 67

QGNQI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 209; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 69

EOTAVYYCAKGWFTPFOYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 488; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 71

QGQVIPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 488;VH GLEWVSAI SGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRA 73

EOTAVYYCAKGWLGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 7A1; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 75

QGQQI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 7A1; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 77

EOTAVYYCAKGWFGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 13C2; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 79

QGQLI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 13C2; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRA 81

EOTAVYYCAKGWLGPFOYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 13E8; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 83

QGLNIPSTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 13E8; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 85

EOTAVYYCAKGWLGPFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 14C10; VL PRLLIYGASSRATGIPORFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ 87

QGHIIPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 14C10;VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRA 89

EDTAVYYCAKAWMGPFOYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA 17A11; VL PRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ 91

QGLN IPSTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 17A11; VH GLEWVSAISGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 93

EDTAVYYCAKGWLGPFOYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 19G1;VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 121

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 19G1; VH GLEWVSAIISSGGLTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 123

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 20G8; VL EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 125

Constructo SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS SEQ ID NO

PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 20G8; VH GLEWVSAIIGSGSRTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 127

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 489; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 129

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 489; VH GLEWVSAIIGSGASTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRA 131

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 588; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 133

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 588;VH GLEWVSAIWGGGRSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLR 135

AEOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 5F1; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 137

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 5F1; VH GLEWVSAIISSGASTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 139

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 1483; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 141

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 1483; VH GLEWVSAILASGAITYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRAE 143

OTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 16F1;VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 145

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 16F1;VH GLEWVSGIIGSGGITYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRAE 147

OTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 16F8; VL PRLLI NVGSRRATGI PORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOF AVYYCQ 149

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 16F8; VH GLEWVSAILGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 151

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 03C9; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 153

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQSPGK 03C9; VH GLEWVSAIIGSGSNTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRA 155

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 0207; VL PRLLINVGSRRATGTPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYC 157

QQAIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 0207; VH GLEWVSAI SGSGGSTYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRA 159

EOTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVL TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQA 28H1;VL PRLLIIGASTRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQQ 161

GQVI PPTFGQGTKVEI K

Constructo SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS SEQ ID NO

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGK 28H1; VH GLEWVSAIWASGEQYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRA 163

EOTAVYYCAKGWLGNFOYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 22A3; VL PRLLINVGSRRATGIPORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOFAVYYCQ 165

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 22A3; VH GLEWVSAIIGSGSITYYAOSVKGRFTISRONSKNTL YLQMNSLRAE 167

OTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA 29811;VL PRLLI NVGSRRATGI PORFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ 169

QGIMLPPTFGQGTKVEIK

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK 29811;VH GLEWVSAIIGSGGITYYAOSVKGRFTISRONSKNTLYLQMNSLRAE 171

DTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQA 23C10; VL PRLLIIGASTRATGI PORFSGSGSGTOFTLTISRLEPEOF AVYYCQQ 173

GQVI PPTFGQGTKVEI K

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGK 23C10; VH GLEWVSAISTNGNYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA 175

EDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS

OIQMTQSPSSLSASVGORVTITCRASQGIRNOLGWYQQKPGKAP 2810_C386; VL KRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 177

NGLQPATFGQGTKVEI K

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAI SWVRQAPGQ 2810_C386;VH GLEWMGAIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE 179

DTAVYYCARLYGYAYYGAFOYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP 2810_6A12; VL KRLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 181

NGLQPATFGQGTKVEIK

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ 2810_6A12; VH GLEWMGVIIPILGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE 183

DTAVYYCARLYGYAYYGAFOYWGQGTTVTVSS

OIQMTQSPSSLSASVGORVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAP 2810_C3A6; VL KRLIYDSSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEOFATYYCLQ 185

NGLQPATFGQGTKVEI K

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ 2810_C3A6; VH GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITAOKSTSTAYMELSSLRSE 187

OTAVYYCARLYGYAYYGAFOYWGQGTTVTVSS

OIQMTQSPSSLSASVGORVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAP 2810_01A2_wt; KRLIYDAYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEOFATYYCLQ 189

VL NGLQPATFGQGTKVEIK

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAI SWVRQAPGQ 281 0_01A2_wt; GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTIT AOKSTST AYMELSSLRSE 191

VH OTAVYYCARLYGYAYYGAFOYWGQGTTVTVSS

OIQMTQSPSSLSASVGORVTITCRASQGIRNOLGWYQQKPGKAP 2810_D1A2_VD; KRLIYOAYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEOFATYYCLQ 193

VL NGLQPATFGQGTKVEI K

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ 2810_01A2_VO; GLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE 195

VH DTAVYYCARLYGYAYYGAFOYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWYQQKPGKAP 2810_0708; VL KRLIYOVSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEOFATYYCLQ 197

NGLQPATFGQGTKVEIK

QVQL VQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAI SWVRQAPGQ 2810_0708; VH 199

GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITAOKSTSTAYMELSSLRSE

Constructo SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS SEQ ID NO

DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAP 2810_01 F7; VL KRLIYDASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 201

NGLQPATFGQGTKVEI K

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ 2B10_01F7; VH GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE 203

DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAP 2B10_6H10; VL KRLIQAATSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 205

NGLQPATFGQGTKVEIK

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ 2B10_6H10; VH GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE 207

DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGK MHLG1; VH GLEWVAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTL YLQMNSL 257

KTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAP KV9; VL RPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQ 259

QYNSYPLTFGGGTKVEIKRT

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPG MHLG; VH KGLEWVAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNS 261

LKTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNLAWYQQKPGKAPK KV1; VL LLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQY 269

NSYPLTFGGGTKVEIKRT

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAP KV7; VL KPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQ 271

YNSYPL TFGGGTKVEIKRT TABELA4 Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGK

GLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA Fab de cadeia EDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK pesada derivado a STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS partir da variante GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDS C125A do GGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN anticorpo YKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQS monoclonal de 95

KNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI IL2-Fab de cadeia TFAQSIISTL TSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSL pesada derivado a RLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYAD partir do anticorpo SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYW monoclonal L 19 GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE

PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA Fab de cadeia leve

PRLLIYYASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ derivado de QTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL 96 anticorpo

LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL monoclonal L 19

TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC scFv derivado de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGK anticorpo-S GLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA monoclonal, EDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSSGGSGGASEIVL TQSP 97 aminoácido, GTLSLSPG ERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYA ligante-C 125A SSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQQTGRI PPT variante de IL2 FGQGTKVEISVLSSSSGSSSSGSSSSGAPTSSSTKKTQLQLEHLL

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

LDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA

EDT AVYYCAKAH NAFDYWGQGTLVTVSSASGGSSELTQDPAVSV F 16-diacorpo-1 L2 ALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSG proteína IPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFGG 98

GTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQ MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEE VLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIV EFLNRWITFAQSIISTLT EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGG SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPV LVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNS SVYTMPPWFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGAPTSSSTKK

TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKH scFv-IL2-scFv LQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETT 99 (F16, proteína)

FMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGG GSSEL TQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAP VLVIYGKNNRPSGI PDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCN SSVYTMPPWFGGGTKLTVLGSGGGSGGGSGGGSGSEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAKAHNAFDYWGQGTLVTVS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDT AVYYCAKAH NAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDS Fab-IL2-Fab (F16,

SSSGSSSSGSSSSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNY constructo de

KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK fusão de citocina 100

NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT de cadeia pesada,

FAQSIISTL TSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLR proteína)

LSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQG DSLRSYYASWYQQKPGQAPV

LVIYGKNN RPSGIPDRFSGSSSGNT ASL TITGAQAEDEADYYCNS F16, cadeia leve, SVYTMPPVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL 101 proteína

V CLI SDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNN KY AASSY LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCAVNGTSQFTCFYNSRANISCVW SQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILG APDSQKL TTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI

SLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEA proteína de fusão

PLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQ IL2R-beta- PLAFRTKPAALGKDTGAQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP 102 Fc(orifício),

KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP proteína

REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPT DSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWY KNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPR EPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLN

HCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRV IL2R-gamma-

RSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEAGAQD Fc(protuberância), 103

KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV proteína

SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCR DELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGK GLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDS GGGGSGGGGSGGGGAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLT CDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGG ETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCS

WLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDY EKYSVSCQEDVTCPTAEETLPI ELALEARQQN KYENYSTSFFI ROl I Fab-IL 12-Fab,

KPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPRSYFSLKFFVRIQ anticorpo L 19, RKKEKMKETEEGCNQKGAFFVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRY 104 sciL 12 murino,

YNSSCSKWACVPCRVRSGGDGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPAR proteína

CLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTL KTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIY EDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHN GETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSS AGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF TFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCD

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGK Fab-IL 12-Fab,

GLEWVSSI RGSSGTTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRA anticorpo L 19, EDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK 105 sciL 12 humano,

STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS proteína

GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDS

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

GGGGSGGGGSGGGGIWELKKDVYWELDWYPDAPGEMWLTC DTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGG EVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRF TCWWLTTISTDL TFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDN KEYEYSVECQEDSACP AAEESLPI EVMVDAVH KLKYENYTSSFFI RDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFC VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSS WSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCL HHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVE ACLPLEL TKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYE DLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNS ETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGG GGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS FSMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGK GLEWVSSI RGSSGTTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRA EDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDS Fab-GMCSF-Fab, GGGGSGGGGSGGGGAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLN LS anticorpo L 19, RDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLEL YKQGLRGSLTKLK 106 GM-CSF humano, GPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFD proteína CWEPVQESGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRL

SCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSGTTYYADSV KGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGK GLEWVSSI RGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRA EDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDS

GGGGSGGGGSGGGGCDLPQTHSLGN RRALI LLAQMRRI SPFSCL Fab-IFNa2-Fab, KDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSA anticorpo L 19, AWDESLLEKFYTEL YQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSI LAV 107 proteína KKYFQRITL YL TEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQERLRRK

ESGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSGTTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA

EDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS 3F2 Fab-IL2-Fab SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ (constructo de SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 209 fusão de citocina DSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGI de cadeia pesada) NNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA

QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR WITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

ADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGF NYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD 4G8 Fab-IL2-Fab SGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEH LLLDLQMI LNGI N (constructo de NYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ 211 fusão de citocina SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW de cadeia pesada) ITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGK GLEWVSAIGVSTGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD 309 Fab-IL2-Fab SGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGIN (constructo de NYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ 213 fusão de citocina SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW de cadeia pesada) ITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWVSAIGVSTGSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGPFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKWRWMMFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 2F11 Fab-IL2-Fab DSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGI (constructo de NNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA 215 fusão de citocina QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR de cadeia pesada) WITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGG

SLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDT AVYYCAKWRWMM FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS

KSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS 483 Fab-IL2-Fab

SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD (constructo de SGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGIN 217 fusão de citocina

NYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ de cadeia pesada)

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGS LRLSCAASGFTFSSY AMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFD

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSVVVRQAPGK GLEVVVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGVVLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD SGGGGSGGGGSGGGGAMVVELEKDVYWEVDVVTPDAPGETVNL TCDTPEEDDITVVTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKG GETLSHSHLLLHKKENGIVVSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTC

SVVLVQRNMDLKFNI KSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRD 4G8 Fab-IL 12-Fab YEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRD (IL-12 murino; IIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSVVEYPDSVVSTPRSYFSLKFFVRI constructo de QRKKEKMKETEEGCNQKGAFFVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDR 219 fusão de citocina YYNSSCSKVVACVPCRVRSGGDGSGGGGSGGGGSRVI PVSGPA de cadeia pesada) RCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTS

TLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLG SIYEDLKMYQTEFQAI NAALQNHNHQQII LDKGMLVAI DELMQSLN HNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRWTINRVMGYL SSAGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSVVVRQAPGKGLEVVVSAISGSGGSTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVVLGNFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS VVNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSVVVRQAPGK GLEVVVSAIVVASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGVVLGNFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD 28H1 Fab-IL2-Fab SGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEH LLLDLQMI LNGI N (constructo de NYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ 221 fusão de citocina SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRVV de cadeia pesada) ITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFTFSSHAMSVVVRQAPGKGLEVVVSAIVVASGEQYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGVVLGNFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSVVVRQAPGK GLEWVSAIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAE DTAVYYCAKGVVFGGFNYVVGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD 29811 Fab-IL2-

SGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEH LLLDLQMI LNGI N Fab

NYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ (constructo de 223

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW fusão de citocina

ITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGS de cadeia pesada)

LRLSCAASGFTFSSYAMSVVVRQAPGKGLEVVVSAIIGSGGITYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWFGGFNY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ 10 NO

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAIISSGGLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 19G1 Fab-IL2-Fab DSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGI (constructo de NNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA 225 fusão de citocina QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR de cadeia pesada) WITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGG

SLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIISSGGLTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFN YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAIIGSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 20G8 Fab-IL2-Fab DSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMI LNGI (constructo de NNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA 227 fusão de citocina QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR de cadeia pesada) WITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGG

SLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGSRTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWFGGF NYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA

PRLLI NVGSRRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQ 3F2 de cadeia leve QGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL 229

LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQA

PRLLIIGASTRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQQ 4G8 de cadeia GQVIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL 231 leve

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA

PRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQ 309 de cadeia QGQLIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL 233 leve

LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA

PRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ 2F11 de cadeia QGQYTPPTFGQGTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVC 235 leve

LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQA

PRLLIYGAYIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ 483 de cadeia QGQVI PPTFGQGTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCL 237 leve

LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ GLEWMGGII Pl FGT ANYAQKFQGRVTITADKSTST AYM ELSSLRSE

DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV

LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 2810 Fab-IL2-Fab SCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEH LLLDLQMI LN (constructo de GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL 239 fusão de citocina AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN de cadeia pesada) RWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPG

SSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANY AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGY AYY GAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ GLEWMGAIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV

LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK C386 Fab-IL2-Fab SCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN (constructo de GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL 241 fusão de citocina AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN de cadeia pesada) RWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPG

SSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGAIIPILGIANY AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYY GAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ GLEWMGVIIPILGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV

LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 6A12 Fab-IL2-Fab SCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN (constructo de GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL 243 fusão de citocina AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN de cadeia pesada) RWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPG

SSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPILGTANY AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYY GAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP

KRLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 281 O de cadeia NGLQPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL 245 leve

NNFYPREAKVQVVKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP

KRLIYDAYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ D1A2 de cadeia NGLQPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL 247 leve

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWYQQKPGKAP

KRLIYDVSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ 07D8 de cadeia 249

NGLQPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL leve

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGK GLEWVAEIRLKSNNFGRYY AASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSL KTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE MHLG1 Fab-IL2-

PKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQM Fab

ILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV (constructo de 251

LNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE fusão de citocina

FLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGL V de cadeia pesada)

KPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAEI RLKS NNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT YGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAP

RPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQ KV9 de cadeia QYNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCL 253 leve

LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPG KGLEWVAEI RLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNS LKTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF

PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV MHLG Fab-IL2- EPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQ Fab (constructo de MILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEE 255 fusão de citocina VLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIV de cadeia pesada) EFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESGGGL

VQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAEI RLK SNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCT TYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNLAWYQQKPGKAPK

LLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQY KV1 de cadeia NSYPLTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN 263 leve

NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAP

KPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQ KV7 de cadeia YNSYPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASWCLL 265 leve

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

TABELA 5 Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO

RPSRVHNSEENTMRAL TLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQS ADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESD YSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKL

AYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLA TKYALWWSPNGKFLA YAEFN DTDI PVIA YSYYGDEQYPRTI Nl PYP

KAGAKNPWRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWL TWV

TDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESR Ectodomínio FAP TGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQI humano + poly- TSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSK 53 lys-tag+ h is 6-tag KCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRT

DQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFD RSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDG RGTAFQGDKLL YAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAI WGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERF MGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQ NSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFL KQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISEQEYLHQS EDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESD YSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSKL AYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLA TKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYP KAGAKNPWRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSWLT

WVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHAWECPKNQEHVE Ectodomínio FAP ESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVE murino + poly-lys- NAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNS 55 tag +h iss-tag PPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLH

DGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMI LPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASKEGIVI ALVDGRGTAFQGDKFLHAVYRKLGVYEVEDQL TAVRKFIEMGFID EERIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASI YSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADD NVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILSGRSQNHLYT HMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH

ASTGETPNLGEVWAEVGWDALKLNWTAPEGAYEYFFIQVQEAD TNC-A2 humano + TVEAAQN LTVPGGLRSTDLPGLKAATHYTITIRGVTQDFSTTPLSV 57 avi-tag +his 6 -tag

EVLTASGLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH

EQAPELEN LTVTEVGWDGLRLNWTAADQAYEHFIIQVQEANKVE TNC-A 1 humano + AARN LTVPGSLRAVDI PGLKAATPYTVSIYGVIQGYRTPVLSAEAS 59 avi-tag +his6 -tag

TASGLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH

ISEFGSSTEEVPSLENLTVTEAGWDGLRLNWTADDLAYEYFVIQV TNC-A 1 murino + QEANNVETAHNFTVPGNLRAADIPGLKVATSYRVSIYGVARGYRT 61 avi-tag +his 6-tag

PVLSAETSTASGLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH

EDLPQLGDLAVSEVGWDGLRLNWTAADNA YEH FVIQVQEVNKVE TNC-A4 humano + AAQNL TLPGSLRAVDIPGLEAATPYRVSIYGVIRGYRTPVLSAEAS 63 avi-tag + his 6-tag

TASGLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH

Constructo SEQUENCIA DE POLIPEPTIDEOS SEQ ID NO TNC-A4 murino + ISEFGSLTEDLPQLGGLSVTEVSWDGLTLNWTTDDLAYKHFWQV avi-tag + his6-tag QEANNVEAAQNLTVPGSLRAVDI PGLKADTPYRVSIYGVIQGYRT 65

PMLSTDVSTASGLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH

TABELAS Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCA

TTAGAAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC 2810; VL CCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGC 4

GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA GGGCACCAAAGTCGAGATCAAG GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCA

TTAGAAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC 2810(GS); VL CCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGC 6

GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA GGGCACCAAAGTCGAGATCAAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT 2810; VH ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 8

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 2F11; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 10

TGGCGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGTATACTCCCCCCACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 2F11(VI); VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 12

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGTATACTCCCCCCACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC

TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG 2F11; VH AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 14

AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACATGGCCGTATATTACTGTGCGAAATG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 2F11 (MT); VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 16

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAATG GAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTATC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 18 3F2; VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 20 3F2(YS); VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 3F2;VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 22

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 309, VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 24

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGA

AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTA 309, VH GCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 26

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT

CACCGTCTCGAGT 309(TA); VH GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT 28

GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTA GCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCCGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCATTGGGGCCTCCACCAGGGCCAC 30 4G8; VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACGGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 4G8; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 32

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAATTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 483; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCGCCTACATCAGGGCCAC 34

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 483; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 36

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 406; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCCAGGGCGCCTCCAGCAGGGCCAC 38

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG

GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 406; VH GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT 40

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 2C6; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 42

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGGCTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCAGATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGGAGTGCTGGT 2C6; VH TATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 44

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGTTTGGGAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 5H5; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 46

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTAATCAGATTCCCCCTACGTTCG GTCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATACCATGAGCTGGGTCCGCCGGTCTCCAGGGA

AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTGGTGGTAGGA 5H5; VH CATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA 48

GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTTG GTTTACGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACC GTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGTAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 2C4; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCCTCCATTAGGGCCACT GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGAC 50

TTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAG TGTATTACTGTCAGCAGGGTAATCAGATTCCCCCTACGTTCGG TCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA

GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT 2C4;VH GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG 52

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGCGGTAGTGGTGGT

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGTTTACGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 209; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 68

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTAATCAGATTCCCCCTACGTTCG GTCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGCGGTAGTGGTGGT 209; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 70

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGTTTACGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 488; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 72

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 488;VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 74

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 7A1; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA 76

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCAGATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 7A1; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 78

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGTTTGGGAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGT

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 80 13C2; VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 13C2; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 82

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 84 13E8; VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCTGAATATTCCCTCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 13E8;VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 86

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGTTGGGTCCGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 14C10; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 88

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCATATTATTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 14C10; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 90

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGC TTGGATGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC 92 17A11; VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCTGAATATTCCCTCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 17A11; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 94

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG TTGGTTGGGTCCGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 19G1; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 122

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATTATTAGTAGTGGTGGT 19G1; VH CTCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 124

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 20GB; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 126

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTATTGGGAGTGGTAGT 20GB; VH CGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 12B

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC

ACCGTCTCGTCC 489; VL GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC 130

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTGCTA 489;VH GCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 132

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 134 588; VL TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTTGGGGTGGTGGTCGT 588;VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 136

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 5F1; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 138

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTATTAGTAGTGGGGCT 5F1; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 140

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 1483; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 142

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTTTGGCTAGTGGTGCG 1483; VH ATCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 144

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 16F1;VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 146

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTATTGGTAGTGGTGGT 16F1;VH ATCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 148

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 16F8; VL

GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 150

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTCTTGGTAGTGGTGGT 16F8; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 152

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 03C9; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 154

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ 10 NO

GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTTTGCCATGAGCTGGGTCCGTCAGTCTCCAGGGA

AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTAGTAA 03C9; VH CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC 156

AGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCC TGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGT GGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCAC CGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 0207; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 158

TGGCACCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGCTATTATGCTTCCTCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 0207; VH AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 160

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGTCC GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCCGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 28H1; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCATTGGGGCCTCCACCAGGGCCAC 162

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTCATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTTGGGCTAGTGGGGAG 28H1; VH CAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA 164

GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGTG GCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCAC CGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 22A3; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA 166

CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ 10 NO

GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTAGTA 22A3; VH TCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC 168

CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGG TGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCA CCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTACCAGTAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 29811;VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCAC 170

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCTTCCCCCGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTGGT 29811; VH ATCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 172

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGT GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG

TTAGCCGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA 23C10; VL GGCTCCCAGGCTCCTCATCATTGGGGCCTCCACCAGGGCCAC 174

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTACTAATGGTAATT 23C10; VH ATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC 176

CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGG TGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCA CCGTCTCGAGT GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTA

GAAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCT 2810_C386; VL AAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCC 178

ATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCA CCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCT TGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAA AGTCGAGATCAAG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGCTATCATCCCGATCCTTGGT 2810_C386;VH ATCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 180

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTA

GAAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCT 2B10_6A12; VL AAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCC 182

ATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCA CCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCT TGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAA AGTCGAGATCAAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTATGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGTGATCATCCCTATCCTTGGTA 2810_6A12; VH CCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 184

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCA

TTCGTAATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC 281 O_C3A6; VL CCCTAAGCGCCTGATCTATGATTCGTCCAGTTTGCAGAGTGGC 186

GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA GGGCACCAAAGTCGAGATCAAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT 281 O_C3A6; VH ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 188

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGGAT

TCGTAATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCC 2B10_D1A2_wt; CTAAGCGCCTGATCTATGATGCTTACAGCTTGCAGAGTGGCGTC VL CCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTC 190

TCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACT GCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCAC CAAAGTCGAGATCAAG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA

TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA 2810_01A2_wt; CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 192

VH CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGGA

TTCGTAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC 281 0_01A2_VO; CCCTAAGCGCCTGATCTATGATGCTTACAGCTTGCAGAGTGGC 194

VL GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA GGGCACCAAAGTCGAGATCAAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA

TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA 281 0_01A2_VO; CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 196

VH CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTC

GTAATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCT 2810_0708; AAGCGCCTGATCTATGATGTGTCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCC

VL ATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTC 198

ACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGC TTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCA AAGTCGAGATCAAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT 281 0_0708; VH ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 200

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCA

TTCGTAATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC 2810_01F7; VL CCCTAAGCGCCTGATCTATGATGCGTCCAGTTTGCAGAGTGGC GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTC 202

ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT ATTACTGCCTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCC AGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT 281 0_01 F7; VH ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 204

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCA

TTCGTAATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC CCCTAAGCGCCTGATCCAGGCTGCTACCAGTTTGCAGAGTGG 206 2810_6H10; VL CGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTT

CACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACC TATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCC AGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA

CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT 2810_6H10; VH ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA 208

CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCT GGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACA TTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAA

AGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATA MHLG1; VH ACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCA 258

CCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGAT GAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTAC CACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGG CCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGT GGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGT

GGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGC KV9; VL ACCTAGGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGC 260

GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTA CTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGA GGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACG GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACA TTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAA

AGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATA MHLG; VH ACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCA 262

CCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGAT GAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTAC CACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGG CCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGT

GGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGT KV1; VL GGATACTAACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCA 270

CCTAAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCG TCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTAC TACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAG GTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGT GGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGT

GGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC ACCTAAGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGC 272 KV7; VL

GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTA CTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGA

GGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG TABELA 7 Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CGCCCTTCAAGAGTTCATAACTCTGAAGAAAATACAATGAGAG CACTCACACTGAAGGATATTTTAAATGGAACATTTTCTTATAAAA CATTTTTTCCAAACTGGATTTCAGGACAAGAATATCTTCATCAA TCTGCAGATAACAATATAGTACTTTATAATATTGAAACAGGACA ATCATATACCATTTTGAGTAATAGAACCATGAAAAGTGTGAATG CTTCAAATTACGGCTTATCACCTGATCGGCAATTTGTATATCTA GAAAGTGATTATTCAAAGCTTTGGAGATACTCTTACACAGCAAC ATATTACATCTATGACCTTAGCAATGGAGAATTTGTAAGAGGAA ATGAGCTTCCTCGTCCAATTCAGTATTTATGCTGGTCGCCTGTT GGGAGTAAATTAGCATATGTCTATCAAAACAATATCTATTTGAA ACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACATTTAATGGAA GAGAAAATAAAATATTTAATGGAATCCCAGACTGGGTTTATGAA GAGGAAATGCTTGCTACAAAATATGCTCTCTGGTGGTCTCCTA ATGGAAAATTTTTGGCATATGCGGAATTTAATGATACGGATATA CCAGTTATTGCCTATTCCTATTATGGCGATGAACAATATCCTAG AACAATAAATATTCCATACCCAAAGGCTGGAGCTAAGAATCCC GTTGTTCGGATATTTATTATCGATACCACTTACCCTGCGTATGT AGGTCCCCAGGAAGTGCCTGTTCCAGCAATGATAGCCTCAAGT GATTATTATTTCAGTTGGCTCACGTGGGTTACTGATGAACGAGT

ATGTTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTCCAGAATGTTTCGGTCCTG Ectodomínio FAP TCTATATGTGACTTCAGGGAAGACTGGCAGACATGGGATTGTC humano +poly-lys- CAAAGACCCAGGAGCATATAGAAGAAAGCAGAACTGGATGGG 54 tag+his 6-tag CTGGTGGATTCTTTGTTTCAACACCAGTTTTCAGCTATGATGCC

ATTTCGTACTACAAAATATTTAGTGACAAGGATGGCTACAAACA TATTCACTATATCAAAGACACTGTGGAAAATGCTATTCAAATTA CAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATAAATATATTCAGAGTAACACA GGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAATTTGAAGAATACCCTG GAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAGCTATCCTCC AAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGGTGC CAATATTACACAGCAAGTTTCAGCGACTACGCCAAGTACTATG CACTTGTCTGCTACGGCCCAGGCATCCCCATTTCCACCCTTCA TGATGGACGCACTGATCAAGAAATTAAAATCCTGGAAGAAAAC AAGGAATTGGAAAATGCTTTGAAAAATATCCAGCTGCCTAAAGA GGAAATTAAGAAACTTGAAGTAGATGAAATTACTTTATGGTACA AGATGATTCTTCCTCCTCAATTTGACAGATCAAAGAAGTATCCC TTGCTAATTCAAGTGTATGGTGGTCCCTGCAGTCAGAGTGTAA GGTCTGTATTTGCTGTTAATTGGATATCTTATCTTGCAAGTAAG GAAGGGATGGTCATTGCCTTGGTGGATGGTCGAGGAACAGCT TTCCAAGGTGACAAACTCCTCTATGCAGTGTATCGAAAGCTGG GTGTTTATGAAGTTGAAGACCAGATTACAGCTGTCAGAAAATTC ATAGAAATGGGTTTCATTGATGAAAAAAGAATAGCCATATGGG GCTGGTCCTATGGAGGATACGTTTCATCACTGGCCCTTGCATC TGGAACTGGTCTTTTCAAATGTGGTATAGCAGTGGCTCCAGTC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

TCCAGCTGGGAATATTACGCGTCTGTCTACACAGAGAGATTCA TGGGTCTCCCAACAAAGGATGATAATCTTGAGCACTATAAGAA TTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAATATTTCAGAAATGTAGACT ATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAA AACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTCTGGTTAATGCACAAGTGG ATTTCCAGGCAATGTGGTACTCTGACCAGAACCACGGCTTATC CGGCCTGTCCACGAACCACTTATACACCCACATGACCCACTTC CTAAAGCAGTGTTTCTCTTTGTCAGACGGCAAAAAGAAAAAGA AAAAGGGCCACCACCATCACCATCAC CGTCCCTCAAGAGTTTACAAACCTGAAGGAAACACAAAGAGAG CTCTTACCTTGAAGGATATTTTAAATGGAACATTCTCATATAAAA CATATTTTCCCAACTGGATTTCAGAACAAGAATATCTTCATCAA TCTGAGGATGATAACATAGTATTTTATAATATTGAAACAAGAGA ATCATATATCATTTTGAGTAATAGCACCATGAAAAGTGTGAATG CTACAGATTATGGTTTGTCACCTGATCGGCAATTTGTGTATCTA GAAAGTGATTATTCAAAGCTCTGGCGATATTCATACACAGCGA CATACTACATCTACGACCTTCAGAATGGGGAATTTGTAAGAGG ATACGAGCTCCCTCGTCCAATTCAGTATCTATGCTGGTCGCCT GTTGGGAGTAAATTAGCATATGTATATCAAAACAATATTTATTTG AAACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACTTATACTGG AAGAGAAAATAGAATATTTAATGGAATACCAGACTGGGTTTATG AAGAGGAAATGCTTGCCACAAAATATGCTCTTTGGTGGTCTCC AGATGGAAAATTTTTGGCATATGTAGAATTTAATGATTCAGATA TACCAATTATTGCCTATTCTTATTATGGTGATGGACAGTATCCT AGAACTATAAATATTCCATATCCAAAGGCTGGGGCTAAGAATC CGGTTGTTCGTGTTTTTATTGTTGACACCACCTACCCTCACCAC GTGGGCCCAATGGAAGTGCCAGTTCCAGAAATGATAGCCTCAA GTGACTATTATTTCAGCTGGCTCACATGGGTGTCCAGTGAACG AGTATGCTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTGCAGAATGTCTCAGTC CTGTCTATATGTGATTTCAGGGAAGACTGGCATGCATGGGAAT

GTCCAAAGAACCAGGAGCATGTAGAAGAAAGCAGAACAGGAT Ectodomínio FAP GGGCTGGTGGATTCTTTGTTTCGACACCAGCTTTTAGCCAGGA murino + poly-lys- TGCCACTTCTTACTACAAAATATTTAGCGACAAGGATGGTTACA 56 tag+hiss-tag AACATATTCACTACATCAAAGACACTGTGGAAAATGCTATTCAA

ATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATATATATATTCCGCGTAA CACAGGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAATTTGAAGGTTAC CCTGGAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAACTCTC CTCCGAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAG GTGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCTACAAAGCCAAGTAC TATGCACTCGTCTGCTATGGCCCTGGCCTCCCCATTTCCACCC TCCATGATGGCCGCACAGACCAAGAAATACAAGTATTAGAAGA AAACAAAGAACTGGAAAATTCTCTGAGAAATATCCAGCTGCCTA AAGTGGAGATTAAGAAGCTCAAAGACGGGGGACTGACTTTCTG GTACAAGATGATTCTGCCTCCTCAGTTTGACAGATCAAAGAAG TACCCTTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGGTCCTTGTAGCCAGA GTGTTAAGTCTGTGTTTGCTGTTAATTGGATAACTTATCTCGCA AGTAAGGAGGGGATAGTCATTGCCCTGGTAGATGGTCGGGGC ACTGCTTTCCAAGGTGACAAATTCCTGCATGCCGTGTATCGAA AACTGGGTGTATATGAAGTTGAGGACCAGCTCACAGCTGTCAG AAAATTCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAAGAAAGAATAGCCA TATGGGGCTGGTCCTACGGAGGTTATGTTTCATCCCTGGCCCT TGCATCTGGAACTGGTCTTTTCAAATGTGGCATAGCAGTGGCT CCAGTCTCCAGCTGGGAATATTACGCATCTATCTACTCAGAGA GATTCATGGGCCTCCCAACAAAGGACGACAATCTCGAACACTA TAAAAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAATATTTCAGAAATG TAGACTATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGATAATGTGCA CTTTCAGAACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTTTGGTTAATGCAC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

AAGTGGATTTCCAGGCGATGTGGTACTCTGACCAGAACCATGG TATATTATCTGGGCGCTCCCAGAATCATTTATATACCCACATGA CGCACTTCCTCAAGCAATGCTTTTCTTTATCAGACGGCAAAAAG AAAAAGAAAAAGGGCCACCACCATCACCATCAC GCGTCCACCGGGGAAACCCCGAACCTGGGCGAAGTGGTGGT GGCGGAAGTGGGTTGGGATGCGCTGAAACTGAACTGGACCGC GCCGGAAGGCGCGTATGAATATTTTTTCATCCAGGTGCAGGAA

GCGGATACCGTTGAAGCGGCGCAGAACCTGACCGTTCCGGGC TNC-A2 humano + GGTCTGCGTAGCACCGATCTGCCGGGCCTGAAAGCGGCGACC 58 avi-tag +his6-tag CATTATACCATTACCATCCGTGGGGTGACCCAGGATTTTAGCA

CCACCCCGCTGTCTGTGGAAGTGCTGACCGCTAGCGGCCTGA ACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGTAC CCATCACCATCACCACCAC GAACAAGCCCCTGAGCTGGAAAACCTCACCGTGACTGAGGTT GGCTGGGATGGCCTCAGACTCAACTGGACCGCGGCTGACCAG GCCTATGAGCACTTTATCATTCAGGTGCAGGAGGCCAACAAGG

TGGAGGCAGCTCGGAACCTCACCGTGCCTGGCAGCCTTCGGG TNC-A 1 humano + CTGTGGACATACCGGGCCTCAAGGCTGCTACGCCTTATACAGT avi-tag +his 6-tag CTCCATCTATGGGGTGATCCAGGGCTATAGAACACCAGTGCTC 60

TCTGCTGAGGCCTCCACAGCTAGCGGCCTGAACGACATCTTC GAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGTACCCATCACCATC ACCACCAC ATTTCAGAATTCGGATCCAGCACCGAAGAAGTGCCGAGCCTG GAAAACCTGACCGTGACCGAAGCGGGCTGGGATGGCCTGCGT

CTGAACTGGACCGCGGATGATCTGGCCTATGAATATTTTGTGA TNC-A 1 murino + TCCAGGTGCAGGAAGCGAACAACGTTGAAACCGCGCATAACTT avi-tag +his 6-tag TACCGTGCCGGGCAATCTGCGTGCGGCGGATATTCCGGGCCT 62

GAAAGTGGCGACCAGCTATCGTGTGAGCATTTATGGCGTGGC GCGTGGCTATCGTACCCCGGTTCTGAGCGCGGAAACCAGCAC CGCTAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGA ATGGCACGAAGGTACCCATCACCATCACCACCAC GAAGATCTGCCGCAGCTGGGCGATCTGGCCGTGAGCGAAGTG GGCTGGGATGGCCTGCGTCTGAACTGGACCGCGGCGGATAAC

GCGTATGAACATTTTGTGATTCAGGTGCAGGAAGTGAACAAAG TNC-A4 humano + TTGAAGCGGCGCAGAACCTGACCCTGCCGGGCAGCCTGCGTG avi-tag + his6-tag CGGTGGATATTCCGGGCCTGGAAGCGGCGACCCCGTATCGTG 64

TGAGCATCTATGGCGTGATTCGTGGCTATCGTACCCCGGTTCT GAGCGCGGAAGCGAGCACCGCTAGCGGCCTGAACGACATCTT CGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGTACCCATCACCAT CACCACCAC ATTTCAGAATTCGGATCCCTGACCGAAGATCTGCCGCAGCTGG GCGGTCTGAGCGTGACCGAAGTGAGCTGGGATGGCCTGACCC

TGAACTGGACCACCGATGATCTGGCCTATAAACATTTTGTGGT TNC-A4 murino + GCAGGTGCAGGAAGCGAACAACGTTGAAGCGGCGCAGAACCT avi-tag + his5-tag GACCGTTCCGGGTAGCCTGCGTGCGGTGGATATTCCGGGCCT 66

GAAAGCGGATACCCCGTATCGTGTGAGCATTTATGGCGTGATT CAGGGCTATCGTACCCCGATGCTGTCTACCGATGTGAGCACC GCTAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAAT GGCACGAAGGTACCCATCACCATCACCACCAC

TABELA 8 Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTA CCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCG TTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAG

CGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTTCAA Fab de cadeia GTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCT pesada derivado a GGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATC partir da variante CCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAG C125A do AAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAAC anticorpo TCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAA 108 monoclonal de CTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAA IL2-Fab de cadeia pesada derivado a TAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAA

TATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGAT partir do anticorpo GGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGG monoclonal L19 CGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAG

AGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTT TAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAA GGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTAC CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC AGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGT TTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGA AAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTG TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA

GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCATCCAGCAGGGCCACT Fab de cadeia leve GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC derivado de TTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAG anticorpo TGTATTACTGTCAGCAGACGGGTCGTATTCCTCCGACGTTCGG 109 monoclonal L19 CCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACC

ATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTG GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATC GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGC AGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT CAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA GAGTGTTAG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTA CCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCG TTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCGAGTAGCGGCGGGAGCGGCGGGGCTAGCGAAATTGTGT

TGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA scFv derivado de GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCA anticorpo-8 GCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA monoclonal, GGCTCCTCATCTATTATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCC aminoácido, AGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCT 11 o ligante-C 125A CACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTAC variante de IL2 TGTCAGCAGACGGGTCGTATTCCTCCGACGTTCGGCCAAGGG

ACCAAGGTGGAAATCTCCGTGCTGTCTTCCTCATCGGGTAGTA GCTCTTCCGGCTCATCGTCCTCCGGAGCACCTACTTCAAGTTC TACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGAT TTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAA ACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAG GCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCA AACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTT CACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGT TCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATG CTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGAT TACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGC GCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTGTCGAGTGCTAGCGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGAC CCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACAT

GCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCA F16-diacorpo-IL2 GCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAA DNA AACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCC 111

AGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAG GCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTCTGTTTATA CTATGCCGCCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCG TCCTAGGCTCTTCCTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATC GTCCTCCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAG CTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAA TGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCA CATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACAT CTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGC TAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGAC TTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATC TGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACC ATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCAT

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CATCTCAACACTGACTTGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGC GCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTGTCGAGAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGG CGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTC TGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGA CAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCA GGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGC CCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAA ACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATG AGGCTGACTATTACTGTAACTCCTCTGTTTATACTATGCCGCCC GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCT TCCTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCTCCGGAG CACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGA GCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATA ATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTT

TACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTC scFv-1 L2-scFv TAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGC 112 (F16, DNA) TCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCA

ATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACA TTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATT TCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACAC TGACTTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCTGGC GGTGGCGGATCGTCTGAGCTCACTCAGGACCCTGCTGTGTCT GTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGAC AGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAG GACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCC CTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAA CACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGA GGCTGACTATTACTGTAACTCCTCTGTTTATACTATGCCGCCCG TGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTTACCGTACTAGGCTCAG GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTTCTGGCGGCGGTAGCGGATCG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGC GCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTGTCGTGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT

GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC Fab-IL2-Fab (F16, TTTAGCCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG constructo de AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT fusão de citocina AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT 113 de cadeia pesada, CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG DNA) CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGC

GCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTGTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCTTCCTCATCGGGTAG TAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCTCCGGAGCACCTACTTCAAGT TCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGG ATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCA AACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAG GCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCA AACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTT CACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGT TCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATG CTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGAT TACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGA GGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGG TGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAG CCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCA CATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGCGCA TAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTG TCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG AAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGG GACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAA GCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCC CTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGAT CCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCC TTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTAT

TACTGTAACTCCTCTGTTTATACTATGCCGCCCGTGGTATTCGG F16, cadeia leve, CGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAACCCAAGGCTGC DNA 114

CCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGGAACTGCA GGCCAACAAGGCCACCCTGGTCTGCCTGATCAGCGACTTCTA CCCAGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCC CCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCAG AGCAACAACAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACC CCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTG ACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCAC CGAGTGCAGCTGA ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGCCTCCTGCTG

CTCTGGTTCCCAGGTGCCAGGTGTGCGGTGAATGGCACTTCC proteína de fusão CAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTG IL2R-beta- TCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAG 115 Fc(orifício), DNA TCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTG

AGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGA TCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACAT CGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCG CCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGAC CCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCCAC TACTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCC CCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAG CAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGAC ACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGC GAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTC AGAACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGACACCGGAGCTCAG GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCC TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC AGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGA ATGTTGAAGCCATCATTACCATTCACATCCCTCTTATTCCTGCA GCTGCCCCTGCTGGGAGTGGGGCTGAACACGACAATTCTGAC GCCCAATGGGAATGAAGACACCACAGCTGATTTCTTCCTGACC ACTATGCCCACTGACTCCCTCAGTGTTTCCACTCTGCCCCTCC CAGAGGTTCAGTGTTTTGTGTTCAATGTCGAGTACATGAATTGC ACTTGGAACAGCAGCTCTGAGCCCCAGCCTACCAACCTCACTC TGCATTATTGGTACAAGAACTCGGATAATGATAAAGTCCAGAA GTGCAGCCACTATCTATTCTCTGAAGAAATCACTTCTGGCTGTC AGTTGCAAAAAAAGGAGATCCACCTCTACCAAACATTTGTTGTT CAGCTCCAGGACCCACGGGAACCCAGGAGACAGGCCACACA GATGCTAAAACTGCAGAATCTGGTGATCCCCTGGGCTCCAGAG AACCTAACACTTCACAAACTGAGTGAATCCCAGCTAGAACTGA ACTGGAACAACAGATTCTTGAACCACTGTTTGGAGCACTTGGT

GCAGTACCGGACTGACTGGGACCACAGCTGGACTGAACAATC IL2R-gamma- AGTGGATTATAGACATAAGTTCTCCTTGCCTAGTGTGGATGGG Fc(protuberância), CAGAAACGCTACACGTTTCGTGTTCGGAGCCGCTTTAACCCAC 116

DNA TCTGTGGAAGTGCTCAGCATTGGAGTGAATGGAGCCACCCAAT CCACTGGGGGAGCAATACTTCAAAAGAGAATCCTTTCCTGTTT GCATTGGAAGCCGGAGCTCAGGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA CCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGC CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTA CCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCG TTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAG CGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGCGGAGCCATGTGGGAG CTGGAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGGTGGACTGGACCCCC GACGCCCCTGGCGAGACAGTGAACCTGACCTGCGACACCCCC GAAGAGGACGACATCACCTGGACCAGCGACCAGCGGCACGG CGTGATCGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCACCGTGAAAGA GTTTCTGGACGCCGGCCAGTACACCTGCCACAAGGGCGGCGA GACACTGAGCCACAGCCACCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGAA

CGGCATCTGGTCCACCGAGATCCTGAAGAACTTCAAGAACAAG Fab-IL 12-Fab,

ACCTTCCTGAAGTGCGAGGCCCCCAACTACAGCGGCCGGTTC anticorpo L19,

ACCTGCAGCTGGCTGGTGCAGCGGAACATGGACCTGAAGTTC scll 12 murino, AACATCAAGAGCAGCAGCAGCCCCCCTGACAGCAGGGCCGTG 117

DNA ACCTGCGGCATGGCCAGCCTGAGCGCCGAGAAGGTGACCCT GGACCAGAGGGACTACGAGAAGTACAGCGTGAGCTGCCAGGA AGATGTCACCTGCCCCACCGCCGAGGAAACCCTGCCCATCGA GCTGGCCCTGGAAGCCCGGCAGCAGAACAAGTACGAGAACTA CTCTACCAGCTTCTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGACCCC CCCAAGAACCTGCAGATGAAGCCCCTGAAGAACAGCCAGGTG GAGGTGTCCTGGGAGTACCCTGACAGCTGGTCCACCCCCAGA AGCTACTTCAGCCTGAAGTTCTTCGTGAGAATCCAGCGGAAGA AAGAAAAGATGAAAGAGACAGAGGAAGGCTGCAACCAGAAGG GCGCCTTCTTCGTCGAGAAAACCAGCACCGAGGTGCAGTGCA AGGGCGGCAACGTGTGCGTGCAGGCCCAGGACCGGTACTAC AACAGCAGCTGCAGCAAGTGGGCCTGCGTGCCCTGCAGAGTG CGGTCTGGCGGCGACGGCTCTGGCGGCGGAGGAAGCGGCG GAGGGGGCAGCAGAGTGATCCCCGTGAGCGGCCCTGCCCGG TGCCTGAGCCAGAGCCGGAACCTGCTGAAAACCACCGACGAC ATGGTGAAAACCGCCAGAGAGAAGCTGAAGCACTACAGCTGC ACAGCCGAGGACATCGACCACGAGGACATCACCCGGGACCAG ACCAGCACCCTGAAAACCTGCCTGCCCCTGGAACTGCACAAAA ACGAGAGCTGCCTGGCCACCCGGGAGACAAGCAGCACCACC CGGGGCAGCTGCCTGCCTCCCCAGAAAACCTCCCTGATGATG ACCCTGTGCCTGGGCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTAC CAGACCGAGTTCCAGGCCATCAACGCCGCCCTGCAGAACCAC AATCACCAGCAGATCATCCTGGACAAGGGCATGCTGGTCGCC ATCGACGAGCTGATGCAGAGCCTGAACCACAACGGCGAAACC CTGCGGCAGAAACCCCCCGTGGGCGAGGCCGACCCCTACCG GGTGAAGATGAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCAGCAC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CCGGGTGGTGACCATCAACCGGGTGATGGGCTACCTGTCCTC TGCCGGGGGAGGGGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTG GCGGAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA CAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGA TTCACCTTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTC CAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTAGTT CGGGTACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCA CCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGC GAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT GGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTA CCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCG TTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAG CGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGCGGAATCTGGGAGCTGA

AGAAAGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCCGACG anticorpo L19 Fab- CCCCTGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACCCCCGAAG IL 12-Fab, scll 12 AGGACGGCATCACCTGGACCCTGGACCAGAGCAGCGAGGTG 118 humano, DNA CTGGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCCAGGTGAAAGAGTTC

GGCGACGCCGGCCAGTACACCTGCCACAAGGGCGGCGAAGT GCTGTCCCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGG CATCTGGTCCACCGACATCCTGAAGGACCAGAAAGAGCCCAA GAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAACTACAGCGG CCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACCATCAGCACCGACCT GACCTTCAGCGTGAAGAGCAGCCGGGGCAGCAGCGACCCTCA GGGCGTGACCTGCGGAGCCGCCACCCTGAGCGCCGAGAGAG TGCGGGGCGACAACAAAGAGTACGAGTACAGCGTCGAGTGCC AGGAAGATAGCGCCTGCCCTGCCGCCGAGGAAAGCCTGCCCA TCGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGA ACTACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGA CCCCCCCAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCG GCAGGTGGAGGTGTCCTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCCAC CCCCCACAGCTACTTCAGCCTGACATTCTGTGTGCAGGTGCAG GGCAAGAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGAC AAGACCAGCGCCACCGTGATCTGCCGGAAGAACGCCAGCATC AGCGTGCGGGCCCAGGACCGGTACTACAGCAGCTCCTGGTCC GAGTGGGCCAGCGTGCCTTGCAGCGGCGGAGGGGGCTCTGG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ 10 NO

CGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCCGGAACCTGCCCG TGGCCACCCCCGACCCCGGCATGTTCCCCTGCCTGCACCACA GCCAGAACCTGCTGCGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAGG CCCGGCAGACCCTGGAATTCTACCCCTGCACCAGCGAGGAAA TCGACCACGAGGACATCACCAAGGATAAGACCAGCACCGTGG AGGCCTGCCTGCCCCTGGAACTGACCAAGAACGAGAGCTGCC TGAACAGCCGGGAGACAAGCTTCATCACCAACGGCAGCTGCC TGGCCAGCAGAAAGACCAGCTTCATGATGGCCCTGTGCCTGA GCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCA AGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGCGGCAGA TCTTCCTGGATCAGAACATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGAT GCAGGCCCTGAACTTCAACAGCGAGACAGTGCCCCAGAAGTC CAGCCTGGAAGAGCCCGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCT GTGCATCCTGCTGCACGCCTTCAGAATCCGGGCCGTGACCAT CGACCGGGTGATGAGCTACCTGAACGCCAGCGGAGGGGGGG GATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAG CTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCC CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG AGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTA CGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATT TTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTG CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTG AGCCCAAATCTTGTGACTGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTA CCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCG TTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG

CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG Fab-GMCSF-Fab, GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT anticorpo L19, CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC GM-CSF humano, CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT 119

DNA GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAG CGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCCGCCCGCT CGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCA TCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTG CTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTT GACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTG TACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGC CCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCT CCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTG AAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTCCGGCGGAGGAG GATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAG CTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCC CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG AGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTA CGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATT TTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTG CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTG AGCCCAAATCTTGTGACTGA GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTA CCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCG TTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAG CGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGCGGATGCGACCTGCCCC

AGACCCACAGCCTGGGCAACAGACGGGCCCTGATCCTGCTGG Fab-IFNa2-Fab, CCCAGATGCGGCGGATCAGCCCCTTCAGCTGCCTGAAGGACC anticorpo L19, GGCACGACTTCGGCTTCCCCCAGGAAGAGTTCGACGGCAACC 120

DNA AGTTCCAGAAGGCCCAGGCCATCAGCGTGCTGCACGAGATGA TCCAGCAGACCTTCAACCTGTTCAGCACCAAGGACAGCAGCG CCGCCTGGGACGAGAGCCTGCTGGAAAAGTTCTACACCGAGC TGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCCTGCGTGATCCAGG AAGTGGGCGTCGAGGAAACCCCCCTGATGAACGTGGACAGCA TCCTGGCCGTGAAGAAGTACTTCCAGCGGATCACCCTGTACCT GACCGAGAAGAAGTATAGCCCCTGCGCCTGGGAGGTGGTGCG GGCCGAGATCATGCGGAGCTTCAGCCTGAGCACCAACCTGCA GGAACGGCTGCGGCGGAAAGAGAGCGGCGGAGGGGGATCCG GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAGCTGTTG GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTTTTCGA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGG GTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAG ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAA GAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACT ACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCA CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAG TCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCA AATCTTGTGACTGA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA TAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGG GAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTT CAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACT

GCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGA 3F2 Fab-IL2-Fab ATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCC

AAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAG (constructo de AACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAA 210 fusão de citocina AAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACG de cadeia pesada) TAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGT

GAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA GATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCC GGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCG GAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCA CCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTG GTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA AGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGGAACCCT GGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA

GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT 4G8 Fab-IL2-Fab GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC (constructo de TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG fusão de citocina AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT 212 de cadeia pesada) AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT

CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAG GGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACT TCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACT GCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGA ATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCC AAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAG AACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAA AAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACG TAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGT GAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA GATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCC GGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCG GAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCA CCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTG GTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA AGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCT GGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTA GCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG

TTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT 309 Fab-IL2-Fab

CACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC (constructo de

CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC fusão de citocina CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC 214 de cadeia pesada)

GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAG GGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACT TCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACT GCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGA ATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCC AAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ 10 NO

AACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAA AAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACG TAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGT GAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA GATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCC GGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCG GAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCA CCTTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGG TAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACA GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAG GTTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGG TCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAATG GAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC

TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG 2F11 Fab-IL2-Fab

ATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAG (constructo de

GGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACT fusão de citocina TCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACT 216 de cadeia pesada)

GCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGA ATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCC AAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAG AACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAA AAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACG TAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGT GAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA GATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCC GGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCG GAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCA CCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTG GTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAA ATGGAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCT

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACC TTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGT AGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGG GTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGT CACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAG GGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACT TCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACT GCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGA

ATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCC 483 Fab-IL2-Fab AAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAG (constructo de AACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAA 218 fusão de citocina AAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACG de cadeia pesada) TAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGT

GAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA GATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCC GGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCG GAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCA CCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTG GTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA AGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCT GGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA

GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCT 4G8 Fab-IL 12-Fab GGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCAC (IL-12 murino; CTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCCCCTGG constructo de AAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGGCAGCGGCG 220 fusão de citocina GCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCA de cadeia pesada) TCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ 10 NO

ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCA AGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACTC TGGTCACAGTGTCTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGA GGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGCGGAGCCA TGTGGGAGCTGGAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGGTGGACT GGACCCCCGACGCCCCTGGCGAGACAGTGAACCTGACCTGC GACACCCCCGAAGAGGACGACATCACCTGGACCAGCGACCAG CGGCACGGCGTGATCGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCACC GTGAAAGAGTTTCTGGACGCCGGCCAGTACACCTGCCACAAG GGCGGCGAGACACTGAGCCACAGCCACCTGCTGCTGCACAAG AAAGAGAACGGCATCTGGTCCACCGAGATCCTGAAGAACTTCA AGAACAAGACCTTCCTGAAGTGCGAGGCCCCCAACTACAGCG GCCGGTTCACCTGCAGCTGGCTGGTGCAGCGGAACATGGACC TGAAGTTCAACATCAAGAGCAGCAGCAGCCCCCCTGACAGCA GGGCCGTGACCTGCGGCATGGCCAGCCTGAGCGCCGAGAAG GTGACCCTGGACCAGAGGGACTACGAGAAGTACAGCGTGAGC TGCCAGGAAGATGTCACCTGCCCCACCGCCGAGGAAACCCTG CCCATCGAGCTGGCCCTGGAAGCCCGGCAGCAGAACAAGTAC GAGAACTACTCTACCAGCTTCTTCATCCGGGACATCATCAAGC CCGACCCCCCCAAGAACCTGCAGATGAAGCCCCTGAAGAACA GCCAGGTGGAGGTGTCCTGGGAGTACCCTGACAGCTGGTCCA CCCCCAGAAGCTACTTCAGCCTGAAGTTCTTCGTGAGAATCCA GCGGAAGAAAGAAAAGATGAAAGAGACAGAGGAAGGCTGCAA CCAGAAGGGCGCCTTCTTCGTCGAGAAAACCAGCACCGAGGT GCAGTGCAAGGGCGGCAACGTGTGCGTGCAGGCCCAGGACC GGTACTACAACAGCAGCTGCAGCAAGTGGGCCTGCGTGCCCT GCAGAGTGCGGTCTGGCGGCGACGGCTCTGGCGGCGGAGGA AGCGGCGGAGGGGGCAGCAGAGTGATCCCCGTGAGCGGCCC TGCCCGGTGCCTGAGCCAGAGCCGGAACCTGCTGAAAACCAC CGACGACATGGTGAAAACCGCCAGAGAGAAGCTGAAGCACTA CAGCTGCACAGCCGAGGACATCGACCACGAGGACATCACCCG GGACCAGACCAGCACCCTGAAAACCTGCCTGCCCCTGGAACT GCACAAAAACGAGAGCTGCCTGGCCACCCGGGAGACAAGCAG CACCACCCGGGGCAGCTGCCTGCCTCCCCAGAAAACCTCCCT GATGATGACCCTGTGCCTGGGCAGCATCTACGAGGACCTGAA GATGTACCAGACCGAGTTCCAGGCCATCAACGCCGCCCTGCA GAACCACAATCACCAGCAGATCATCCTGGACAAGGGCATGCT GGTCGCCATCGACGAGCTGATGCAGAGCCTGAACCACAACGG CGAAACCCTGCGGCAGAAACCCCCCGTGGGCGAGGCCGACC CCTACCGGGTGAAGATGAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCT TCAGCACCCGGGTGGTGACCATCAACCGGGTGATGGGCTACC TGTCCTCTGCCGGGGGAGGGGGATCCGGCGGAGGTGGCTCT GGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGG ACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCG CCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCC GCCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCA GCGGCAGCGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAG GGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTG TACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

GGCCAGGGCACTCTGGTCACAGTGTCTAGCGCTAGCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC TTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACTGA GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCT GGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACC TTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGC AAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAG CAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCC TGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCT GGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCA CCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCCC TGGCCCCCTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCCGCTC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG TGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCT TTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTC CGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAGTGGTGGGGGAG GATCTGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGCGCTCCTACAT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTCCAGCTGGAACATCTCCT

GCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAG 28H1 Fab-IL2-Fab

AACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGC (constructo de

CCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAAG fusão de citocina AGGAACTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGT 222 de cadeia pesada)

CCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGACCTGATCTCCAACAT CAACGTGATCGTGCTGGAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTT CATGTGCGAGTACGCCGACGAGACAGCTACCATCGTGGAATTT CTGAACCGGTGGATCACCTTCGCCCAGTCCATCATCTCCACCC TGACCTCCGGTGGTGGCGGATCCGGGGGAGGGGGTTCTGGC GGAGGCGGAGAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCT GGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTC CGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACA GGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGG CCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCA GATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTG TGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGCCAGGG CACCCTGGTCACCGTGTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCCTC CGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGG CACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA GCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTA CTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAAC

ACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACTGA 29811 Fab-IL2- GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCT Fab GGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACC (constructo de TTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCA 224 fusão de citocina AAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCCGGCGGCA de cadeia pesada) TCACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ 10 NO

CCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCC CTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGC TGGTTCGGAGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTC ACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCC CTGGCCCCCTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACC GTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACC TTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCT CCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAGTGGTGGGGGAG GATCTGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGCGCTCCTACAT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTCCAGCTGGAACATCTCCT GCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAG AACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGC CCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAAG AGGAACTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGT CCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGACCTGATCTCCAACAT CAACGTGATCGTGCTGGAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTT CATGTGCGAGTACGCCGACGAGACAGCTACCATCGTGGAATTT CTGAACCGGTGGATCACCTTCGCCCAGTCCATCATCTCCACCC TGACCTCCGGTGGTGGCGGATCCGGGGGAGGGGGTTCTGGC GGAGGCGGAGAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCT GGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTC CGGCTTCACCTTCTCCTCCTATGCCATGTCCTGGGTCCGACAG GCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGC TCCGGCGGCATCACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGG TTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGC AGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACT GTGCCAAGGGCTGGTTCGGAGGCTTCAACTACTGGGGCCAGG GCACCCTGGTCACCGTGTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCCT CCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCG GCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGT ACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAA CACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACTG A GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCC TGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCAC CTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGG CAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCAGCTCTGGCGG CCTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAA

CAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAA 19G1 Fab-IL2-Fab GGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCT (constructo de GGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCAGCGTGTT 226 fusão de citocina CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC de cadeia pesada) CGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGT

GACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCC TGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCC AGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACTCCGGCG GAGGCGGATCTGGCGGTGGAGGCTCCGGAGGCGGAGGCGCT CCTACTAGCAGCTCCACCAAGAAAACCCAGCTCCAGCTGGAAC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

ATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAA CTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTC TACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAACATCTGCAGTGCC TGGAAGAGGAACTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGG CCCAGAGCAAGAACTTCCACCTGAGGCCCAGGGACCTGATCA GCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTGAAGGGCAGCGAGA CAACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCGCCCAGAGCATCAT CAGCACCCTGACAAGCGGAGGCGGCGGATCCGGCGGAGGCG GATCTGGCGGAGGAGGCGAGGTCCAGCTGCTCGAAAGCGGC GGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGC GCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGG GTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGC CATCATCAGCTCTGGCGGCCTGACCTACTACGCCGACAGCGT GAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTA CTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAG CACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGA CTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTAG CTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAG AGCTGCGACTGA GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCC TGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCAC CTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGG CAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCAG CCGGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAA GGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCT GGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCAGCGTGTT CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGC

ACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCC 20G8 Fab-IL2-Fab

TGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCC (constructo de

AGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAA fusão de citocina GGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACTCCGGCG 228 de cadeia pesada)

GAGGCGGATCTGGCGGTGGAGGCTCCGGAGGCGGAGGCGCT CCTACTAGCAGCTCCACCAAGAAAACCCAGCTCCAGCTGGAAC ATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAA CTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTC TACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAACATCTGCAGTGCC TGGAAGAGGAACTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGG CCCAGAGCAAGAACTTCCACCTGAGGCCCAGGGACCTGATCA GCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTGAAGGGCAGCGAGA CAACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCGCCCAGAGCATCAT CAGCACCCTGACAAGCGGAGGCGGCGGATCCGGCGGAGGCG GATCTGGCGGAGGAGGCGAGGTCCAGCTGCTCGAAAGCGGC GGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGC GCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGG GTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CATCATCGGCTCTGGCAGCCGGACCTACTACGCCGACAGCGT GAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTA CTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAG CACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGA CTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTAG CTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAG AGCTGCGACTGA GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGC CCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCC GTGACCTCCTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGC CAGGCCCCTCGGCTGCTGATCAACGTGGGCAGTCGGAGAGCC ACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACC GACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTC

GCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCATCATGCTGCCCCCCACC 3F2 de cadeia leve TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCC 230

GCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGA AGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCC TGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACT CCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTC CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGT GACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAA CCGGGGCGAGTGCTGATGA GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGC CCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCC GTGTCCCGGTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGC CAGGCCCCTCGGCTGCTGATCATCGGCGCCTCTACCAGAGCC ACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACC GACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTC

GCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTCATCCCTCCCACC 4G8 de cadeia TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCC 232 leve GCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGA

AGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCC TGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACT CCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTC CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGT GACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAA CCGGGGCGAGTGCTGATGA GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC

TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA 309 de cadeia CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA leve GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCTTATTCCCCCTACGTTCG 234

GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCAC CATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

ACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCA TCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGTTAG GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG TTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA

GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGTATACTCCCCCCACGTTCG 2F11 de cadeia GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCAC 236 leve CATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT

GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGG ACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCA TCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGTTAG GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTG TTAGCAGCAATTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCGCCTACATCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA

GTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTATTCCCCCTACGTTCG 483 de cadeia GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCAC 238 leve CATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT

GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGG ACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCA TCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGTTAG CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGT ACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC

TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA 2810 Fab-IL2-Fab

AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCC (constructo de

ATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGG fusão de citocina GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC 240 de cadeia pesada)

CGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC TCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTG GCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACA ACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAA TTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTT AAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTC

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

AGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAA TTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAA TCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGT AGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCT CAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGC TCTGGCGGTGGCGGACAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG GCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTG CGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGAT CATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAG GGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCC TACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTG TATTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTT TTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTG AGCCCAAATCTTGTGACTGA CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGCTATCATCCCGATCCTTGGT ATCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCC ATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGG GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC CGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTT

GGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG C3B6 Fab-IL2-Fab CAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC (constructo de TCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTG 242 fusão de citocina GCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACA de cadeia pesada) ACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAA

TTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTT AAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTC AGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAA TTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAA TCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGT AGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCT CAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGC TCTGGCGGTGGCGGACAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG GCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTG CGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGCTATC ATCCCGATCCTTGGTATCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGG GCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTA CATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTA

.

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

TTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTT GACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCT AGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACTGA CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACA TTCAGCAGCTATGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGA CAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGTGATCATCCCTATCCTTGGTA CCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTA CTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAC TGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCA AGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCC ATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGG GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC CGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC TCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTG GCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACA ACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAA

TTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTT 6A12 Fab-IL2-Fab AAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTC (constructo de AGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAA 244 fusão de citocina TTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAA de cadeia pesada) TCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA

ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGT AGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCT CAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGC TCTGGCGGTGGCGGACAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG GCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCTATGCTATAAGCTGGGTG CGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGTGATC ATCCCTATCCTTGGTACCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGG GCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTA CATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTA TTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTT GACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCT AGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAG

CCCAAATCTTGTGACTGA 281 Ode cadeia GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG leve TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCA 246

TTAGAAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC

...

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGC GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA GGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATC TGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA GTGTTAG GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGGA TTCGTAATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC CCCTAAGCGCCTGATCTATGATGCTTACAGCTTGCAGAGTGGC GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT

ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA D1A2 de cadeia GGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATC 248 leve TGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA

ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA GTGTTAG GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG TCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGAGCA TTCGTAATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC CCCTAAGCGCCTGATCTATGATGTGTCCAGTTTGCAGAGTGGC GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCT

ATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCA 0708 de cadeia GGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATC leve TGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA 250

ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA GTGTTAG GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCT GGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACA

TTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAA MHLG1 Fab-IL2- AGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATA Fab ACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCA (constructo de CCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGAT 252 fusão de citocina GAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTAC de cadeia pesada) CACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGG

CCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGTGCTAGCACCAAGGG CCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC

. 156 Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTAC AACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGA ATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATT TAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTT CAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAA ATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTA ATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGA AACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATT GTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCAT CTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGA GGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGT GCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGG TGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAG ATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAG CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAA CACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATAC GGCCGTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCAC TACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCC AGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGT GGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGT GGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGC ACCTAGGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGC GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTA

CTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGA KV9 de cadeia GGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCT 254 leve GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA

CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGG TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG TGTTAG GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCT

GGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACA MHLG Fab-IL2- TTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAA Fab (constructo de AGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATA ACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCA 256 fusão de citocina CCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGAT de cadeia pesada) GAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTAC

CACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGG CCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGTGCTAGCACCAAGGG

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTAC AACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGA ATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATT TAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTT CAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAA ATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTA ATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGA AACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATT GTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCAT CTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGA GGAGGCTTGGTCCAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGT GCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGG TGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAG ATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAG CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAA CACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATAC GGCCGTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCAC TACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCC AGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACTGA GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGT GGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGT GGATACTAACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCA CCTAAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCG TCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCA CTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTAC

TACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAG KV1 de cadeia GTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTG 264 leve TCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACT

GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACT ACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGT

GGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGT KV7 de cadeia GGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGC 266 leve ACCTAAGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGC

GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTC ACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTA

...

Constructo SEQUENCIA DE POLINUCLEOTIDEOS SEQ ID NO

CTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGA GGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGG TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG TGTTAG

CÉLULAS HOSPEDEIRAS Como usado no presente pedido, o termo "célula hospedeira" refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser elaborado geneticamente para gerar os imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos 5 mesmos. Em uma realização, a célula hospedeira é elaborada geneticamente para permitir a produção de um fragmento de imunoconjugado. Células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamífero, como células CHO, HEK, células BHK, NSO, células Sp2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, 10 PER, células C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal. Em uma realização, a célula hospedeira da invenção compreende um vetor de expressão que compreende 15 sequências de polinucleotídeos que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos. Células hospedeiras da invenção podem ser eucarióticas ou procarióticas.

PURIFICAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE IMUNOCONJUGADO E FRAGMENTOS DOS

MESMOS 20 Os imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos podem ser purificados por técnicas conhecidas como cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel,

cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e similares. As condições atuais usadas para purificar uma proteína específica dependerão, em parte, de fatores como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade, etc., e serão evidentes para técnicos no assunto.

5 Para purificação de cromatografia por afinidade, pode ser usada uma matriz com proteína A ou proteína G. Alternativamente, para purificação de cromatografia por afinidade, pode ser usado qualquer anticorpo que se liga especificamente ao componente efetor de cadeia única do imunoconjugado.

Para produzir anticorpos, diversos animais hospedeiros, incluem, mas não se limitam a, coelhos, camundongos, ratos, etc., podem ser imunizados por injeção com um imunoconjugado da invenção ou um fragmento do mesmo. O imunoconjugado pode ser anexado a um veículo adequado, como albumina de soro bovino (BSA), por meio de um grupo funcional de cadeia lateral ou ligantes anexados a um grupo funcional de cadeia lateral. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras, e incluem, mas não se limitam a, adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície como lisolecitina, pluronic polióis, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Consequentemente, uma realização inclui um método para produzir os imunoconjugados da invenção por cultura de uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que compreende as sequências de polinucleotídeos que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos sob condições adequadas para a expressão do mesmo.

MÉTODOS DE USO DE IMUNOCONJUGADOS Os imunoconjugados da invenção são úteis para o direcionamento de determinantes antigênicos específicos e que obtêm várias respostas celulares em células alvo e recrutadas. O imunoconjugado da invenção também é útil como um reagente de diagnóstico. A ligação de um imunoconjugado a um determinante antigênico pode ser facilmente detectada 5 pelo uso de um anticorpo secundário específico para o componente efetor. Em uma realização, o anticorpo secundário e o imunoconjugado facilitam a detecção de ligação do imunoconjugado a um determinante antigênico localizado em uma célula ou superfície de tecido.

Em algumas realizações, uma quantidade efetiva dos 1o imunoconjugados da invenção são administrados a uma célula. Em outras realizações, uma quantidade terapeuticamente efetiva do imunoconjugado da invenção é administrada a um indivíduo para tratar a doença. O termo "quantidade efetiva" como usado no presente pedido é definido como a quantidade do imunoconjugado da invenção que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual ele é administrado. O termo "quantidade terapeuticamente efetiva" como usado no presente pedido é definido como a quantidade do imunoconjugado da invenção que elimina, diminui, atrasa, minimiza ou previne os efeitos adversos de uma doença.

Os imunoconjugados da invenção podem ser administrados a um sujeito por si só ou na forma de uma composição farmacêutica. Em uma realização, a doença é uma disfunção proliferativa, como câncer. Exemplos não limitantes de disfunções proliferativas como câncer incluem o câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de sangue, câncer de pele, carcinoma de célula escamosa, câncer ósseo e câncer de rim.

Outros distúrbios de proliferação celular que podem ser tratados usando-se um imunoconjugado da presente invenção incluem, mas não se limitam a neoplasmas localizadas no: abdome, osso, seio, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóide, glândula pituitária, testículos, ovário, timo, tiróide), olhos, cabeça e pescoço, sistema 5 nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também incluídas estão condições ou lesões pré-cancerosas e metástase de câncer. De maneira similar, outros distúrbios de proliferação celular também podem ser tratados pelos imunoconjugados da presente invenção. Exemplos de tais distúrbios de proliferação celular incluem, mas não se limitam a: hipergamaglobulinemia, disfunções linfoproliferativas, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, síndrome de Sézary, macroglobulinemia de Waldenstron, doença de Gaucher, histiocitose e qualquer outra doença de proliferação celular, além de neoplasia, localizada em um sistema de órgãos listado acima. Em outra realização, a doença está relacionada à auto-imunidade, rejeição de transplante, respostas imunes pós-traumáticas e doenças infecciosas (por exemplo, HIV). Mais especificamente, os imunoconjugados podem ser usados em células de eliminação envolvidas nas disfunções mediadas por célula imunes, incluindo linfoma, autoimunidade, rejeição de transplante, doença do enxerto contra hospedeiro, isquemia e acidente vascular cerebral. Um técnico no assunto prontamente reconhece que em muitos casos o imunoconjugado pode não fornecer uma cura, mas só pode fornecer o benefício parcial. Em algumas realizações, uma alteração fisiológica que tem algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Dessa forma, em algumas realizações, uma quantidade de imunoconjugado que fornece uma alteração fisiológica é considerada uma "quantidade efetiva" ou uma "quantidade terapeuticamente efetiva".

O sujeito, paciente ou indivíduo com necessidade de tratamento é tipicamente um mamífero, mais especificamente um humano.

COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES, DOSAGENS E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO Composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade efetiva de um ou mais imunoconjugados dissolvidos ou 5 dispersos em um veículo farmaceuticamente aceitável. As frases "farmacêutica ou farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou desagradável quando administrada a um animal, como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um imunoconjugado e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será conhecida por técnicos no assunto, em consideração a presente divulgação, como exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pedido como referência. Além disso, para a administração em animal (por exemplo, humano), será entendido que as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade segurança geral e pureza como requerido pelo FDA Office of Biologica/ Standards ou autoridades correspondentes em outros países.

Como usado no presente pedido, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de atraso de absorção, sais, conservantes, drogas, estabilizadores de drogas, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, corantes, como materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, páginas. 1289 a 1329, incorporado ao presente pedido como referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o componente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplado.

Os imunoconjugados podem compreender diferentes tipos de 5 veículos, dependendo se é para ser administrado na forma sólida, líquida ou aerossol e se ele precisa ser esterilizado por tais rotas de administração como injeção. A presente invenção pode ser administrada de modo intravenoso, intradérmico, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniano, intra- articular, intraprostática, intra-esplênica, intrarenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, retal, tópico, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutâneo, subconjuntival, intravesicular, via mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, via oral, tópico, localmente, inalação (por exemplo, inalação de aerossol), injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada que banha células alvo diretamente, através de um cateter, através de uma lavagem, em cremes, em composições de lipídios (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação das antecedentes como geralmente seria conhecido por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutica/ Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pedido como referência).

Administração parenteral, em injeção intravenosa específica é mais comumente usada para administrar moléculas de polipeptídeos como os imunoconjugados da invenção.

A quantidade de dosagem real de uma composição da presente invenção administrada a um sujeito pode ser determinada por fatores físicos e fisiológicos, como peso corporal, gravidade da condição, o tipo de doença a ser tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, idiopatia do paciente e sobre a via de administração. O médico responsável pela administração irá, em todo caso, determinar a concentração de ingrediente(s)

ativo(s) em uma composição e dose(s) apropriada(s) para o paciente individual.

Em certas realizações, composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de O, 1% do imunoconjugado da invenção. Em outras realizações, os imunoconjugados podem incluir entre 5 cerca de 2% a cerca de 75% do peso da unidade ou entre cerca de 25% a cerca de 60%, por exemplo, e qualquer faixa derivável nisso. Em outros exemplos não limitantes, uma dose também pode compreender cerca de 1 micrograma/kg/peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 1O microgramas/kg/peso corporal, cerca de 50 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 100 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 200 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 350 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 500 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 1 miligrama/kg/peso corporal, cerca de 5 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 1O miligramas/kg/peso corporal, cerca de 50 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 100 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 350 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal a cerca de 1000 mg/kg/peso corporal ou mais por administração e qualquer faixa derivável nisso. Em exemplos não limitantes de uma faixa derivável dos números listados no presente pedido, uma faixa de cerca de 5 mg/kg/peso corporal a cerca de 100 mg/kg/peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg/peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal, etc., podem ser administrados com base nos números descritos acima.

Em qualquer caso, a composição pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a prevenção contra a ação de microorganismos pode ser provocada por conservantes como os vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, mas não limitados a parabenos (por exemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou combinações dos mesmos.

Os imunoconjugados podem ser formulados em uma composição com uma forma livre de base, neutra ou salgada. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados 5 com os grupos livres de amina de uma composição proteinácea ou que são formados com ácidos inorgânicos, como por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos ou como ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Sais formados com os grupos livre de carboxila também podem ser derivados a partir de bases inorgânicas, como por exemplo, hidróxido de sódio, 1o de potássio, de amônia, de cálcio ou de ferro; ou bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína.

Em realizações onde a composição está em uma forma líquida, um veículo pode ser um meio solvente ou de dispersão que compreende, mas não se limita a, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, etc.), lipídios (por exemplo, triglicerídeos, óleos vegetais, lipossomos) e combinações dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida por dispersão em veículos como, por exemplo poliol líquido ou lipídeos, pelo uso de tensoativos como, por exemplo hidroxipropilcelulose ou combinações dos mesmos de tais métodos.

Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio ou combinações dos mesmos e/ou agentes tamponantes para manter os valores de pH fisiologicamente aceitáveis.

Em outras realizações, podem-se usar colírios, soluções ou sprays nasais, aerossóis ou inalantes na presente invenção. Tais composições são geralmente projetadas para serem compatíveis com o tipo de tecido alvo.

Em um exemplo não-limitante, soluções nasais são geralmente soluções aquosas projetadas para serem administradas às passagens nasais em gotas ou sprays. Soluções nasais são preparadas de modo que elas são semelhantes em muitos aspectos às secreções nasais, de modo que a ação ciliar normal é mantida. Dessa forma, em algumas realizações as soluções nasais aquosas geralmente são isotônicas ou levemente tamponadas para 5 manter um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Além disso, conservantes antimicrobianos, semelhantes àqueles usados em preparações oftálmicas, drogas ou estabilizadores de droga apropriada, se necessário, podem ser incluídos na formulação. Por exemplo, várias preparações comerciais nasais são conhecidas e incluem drogas como antibióticos ou anti-histamínicos.

1o Em certas realizações, o imunoconjugado é preparado para administração por tais rotas, como ingestão oral. Nessas realizações, a composição sólida pode compreender, por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina de invólucro duro ou macio), formulações de liberação sustentada, composições orais, pastilhas, elixires, suspensões, xaropes, wafers ou combinações dos mesmos. Composições orais podem ser incorporadas diretamente com o alimento da dieta. Veículos preferidos para administração oral compreendem diluentes inertes, veículos comestíveis assimiláveis ou combinações dos mesmos. Em outros aspectos da invenção, a composição oral pode ser preparada como um xarope ou elixir. Um xarope ou elixir, e pode compreender, por exemplo, pelo menos um agente ativo, um agente adoçante, um conservante, um agente aromatizante, um corante, um conservante ou combinações dos mesmos.

Em certas realizações, uma composição oral pode compreender um ou mais ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes aromatizantes e combinações dos mesmos. Em certas realizações, uma composição pode compreender um ou mais dos seguintes: um ligante como, por exemplo, goma tragacanto, acácia, amido de milho, gelatina ou combinações dos mesmos; um excipiente como, por exemplo, fosfato bicálcico, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sodica, celulose, carbonato de magnésio ou combinações dos mesmos; um agente de desintegração como, por exemplo, amido de milho, fécula de batata, ácido 5 algínico ou combinações dos mesmos; um lubrificante como, por exemplo, estearato de magnésio, um agente adoçante como, por exemplo, sacarose, lactose, sacarina ou combinações dos mesmos, um agente aromatizante como, por exemplo, menta, óleo de wintergreen, aroma de cereja, aroma de laranja, etc.; ou combinações das mesmas dispostas acima. Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acima, veículos como um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou de outra forma modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos.

Formulações adicionais que são adequadas para outras formas de administração incluem supositórios. Supositórios são formas de dosagem sólidas de vários pesos e formas, usualmente medicados, para inserção no reto, vagina ou uretra. Após a inserção, supositórios amolecem, derretem ou se dissolvem nos fluidos da cavidade. Em geral, para supositórios, veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis, triglicérides ou combinações dos mesmos. Em certas realizações, supositórios podem ser formados de misturas que contêm, por exemplo, o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% para cerca de 10% e preferencialmente cerca de 1% a cerca de 2%.

Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos imunoconjugados da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação de vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são técnicas 5 de secagem a vácuo ou liofilização que produzem um pó de ingrediente ativo e mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido previamente esterilizado-filtrado do mesmo. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado, se necessário, e o primeiro diluente líquido isotônico processado antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente.

1o Na preparação de composições altamente concentradas para injeção direta também é contemplada, onde o uso de DMSO como solvente é prevista para resultar em penetração extremamente rápida, entregando altas concentrações de agentes ativos para uma pequena área.

A composição deve ser estável nas condições de produção e armazenamento e preservado contra a ação de contaminação de microrganismos, como bactérias e fungos. Estima-se que a contaminação de endotoxina deve ser minimamente mantida em um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína.

Em realizações específicas, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pelo uso das composições de agentes de atraso de absorção como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.

Composições farmacêuticas que compreendem os imunoconjugados da invenção podem ser produzidas por meio de processos de mistura convencional, dissolução, granulação, produção de drágeas, preparação de composto homogêneo, emulsificação, encapsulamento, inserção ou liofilização. Composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional usando-se um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.

Para administração tópica os imunoconjugados da invenção 5 podem ser formulados como soluções, géis, pomadas, cremes, suspensões, etc., conforme são bem conhecidos na técnica.

Formulações sistêmicas incluem aquelas projetadas para administração por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal, bem como aquelas projetadas para administração transdermal, transmucosal, inalação, oral ou pulmonar.

Para injeção, os imunoconjugados da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes formuladores como suspensão, estabilização e/ou agentes de dispersão.

De forma alternativa, os imunoconjugados podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água apirogênica estéril, antes de usar.

Para administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

Para a administração oral, os imunoconjugados podem ser facilmente formulados por combinação com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais veículos permitem que os imunoconjugados da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para a ingestão oral por um paciente a ser tratado. Para formulações orais sólidas como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, excipientes adequados incluem preenchedores como açúcares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol e sorbitol, preparações de celulose como amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, fécula de batata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou 5 polivinilpirrolidona (PVP), agentes de granulação e agentes de ligação. Se desejado, os agentes de desintegração podem ser adicionados como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal dos mesmos, como alginato de sódio.

Se desejado, formas de dosagem sólidas podem ser revestidas de açúcar ou com revestimento entérico usando-se técnicas padrão.

Para preparações líquidas orais como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções, veículos adequados, excipientes ou diluentes incluem água, glicóis, óleos, álcoois, etc. Adicionalmente, podem ser adicionados agentes aromatizantes, conservantes, agentes de coloração e similares.

Para administração bucal, os imunoconjugados podem assumir a forma de comprimidos, pastilhas, etc. formulados de maneira convencional.

Para administração por inalação, os imunoconjugados para uso de acordo com a invenção são convenientemente entregues na forma de um spray aerossol por meio de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada pelo fornecimento de uma válvula para entregar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do imunoconjugado e uma base de pó adequada, como lactose ou amido.

Os imunoconjugados também podem ser formulados em composições retais ou vaginais, como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, que contêm bases de supositórios convencionais, como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

Além das formulações descritas anteriormente, os imunoconjugados também podem ser formulados como uma preparação de 5 depósito. Essas formulações de longa ação podem ser administradas por implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou por injeção intramuscular. Dessa forma, por exemplo, os imunoconjugados podem ser formulados com materiais poliméricos adequados ou hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica 1o ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, como um sal pouco solúvel.

Alternativamente, podem ser empregados outros sistemas de distribuição farmacêutica. Lipossomos e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos de distribuição que podem ser usados para distribuição dos imunoconjugados da invenção. Certos solventes orgânicos como dimetilsulfóxido também podem ser empregados, embora geralmente à custa de maior toxicidade. Adicionalmente, os imunoconjugados podem ser distribuídos usando-se um sistema de liberação sustentado, como matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos que contém o agente terapêutico.

Diversos materiais de liberação sustentada foram estabelecidos e são bem conhecidas por técnicos no assunto. Cápsulas de liberação sustentada podem, dependendo de sua natureza química, liberar os imunoconjugados por algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica dos imunoconjugados, podem ser empregadas estratégias adicionais para a estabilização de imunoconjugados.

Como os imunoconjugados da invenção podem conter cadeias ou terminações laterais carregadas, eles podem ser incluídos em qualquer das formulações acima descritas como os ácidos ou bases livres ou como sais farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamente aceitáveis são aqueles sais que substancialmente retêm a atividade biológica das bases livres e que são preparados por reação com ácidos inorgânicos. Sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros práticos do que são as correspondentes formas de base livre.

5 Os imunoconjugados da invenção geralmente serão usados em uma quantidade efetiva para alcançar o objetivo pretendido. Para usar, para tratar ou prevenir uma condição de doença, os imunoconjugados da invenção ou composições farmacêuticas dos mesmos, são administrados ou aplicados em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Uma quantidade 1o terapeuticamente efetiva é uma quantidade efetiva para melhorar ou prevenir os sintomas ou prolongar a sobrevivência do paciente que está sendo tratado.

A determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva está bem dentro das capacidades de técnicos no assunto, especialmente em consideração com a divulgação detalhada fornecida no presente pedido.

Para a administração sistêmica, uma dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para obter uma faixa de concentração circulante que inclui o IC 50 , conforme determinado em cultura celular. Tal informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em humanos.

Doses iniciais também podem ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas conhecido na técnica. Geralmente um técnico no assunto poderia facilmente otimizar a administração para humanos com base em dados de animais.

A quantidade e intervalo de dosagem podem ser ajustadas individualmente para fornecer os níveis de plasma dos imunoconjugados que são suficientes para manter o efeito terapêutico. Dosagens usuais para pacientes para administração por injeção na faixa de cerca de O, 1 a 50 mg/kg/dia, tipicamente de cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Níveis de soro terapeuticamente efetivos podem ser alcançados por administração de doses múltiplas a cada dia.

5 Nos casos de administração local ou absorção seletiva, a concentração local efetiva dos imunoconjugados não pode estar relacionada à concentração de plasma. Um técnico no assunto será capaz de otimizar as dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação exagerada.

A quantidade de imunoconjugado administrada será, certamente, 1o dependente do sujeito a ser tratado, do peso do sujeito, da severidade da aflição, da forma de administração e do julgamento do médico prescritor.

A terapia pode ser repetida de modo intermitente enquanto os sintomas são detectáveis ou mesmo quando eles não são detectáveis. A terapia pode ser fornecida sozinha ou em combinação com outras drogas. No caso de disfunções autoimunes, as drogas que podem ser usadas em combinação com imunoconjugados da invenção incluem, mas se limitam a, agentes anti-inflamatórios esteróides e não esteróides.

TOXICIDADE Uma dose terapeuticamente efetiva do imunoconjugado descrito no presente pedido geralmente fornecerá benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial. Toxicidade dos imunoconjugados pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, por determinação da LD 50 (a dose letal para 50% da população) ou a LD 100 (a dose letal para 100% da população). A taxa de dose entre o efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Em uma realização, o imunoconjugado exibe um alto índice terapêutico. Os dados obtidos a partir desses ensaios de cultura celular e estudos de animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem que não é tóxica, por exemplo, para uso em humanos. A dosagem dos imunoconjugados descrita no presente pedido situa-se preferencialmente dentro da faixa de concentrações circulantes que incluem a dose efetiva com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem 5 empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas por cada médico em vista das condições do paciente. Consulte, por exemplo, Fingi et ai., 1975, In: The Pharmacologica/ Basis of Therapeutics, Capítulo 1, página 1) (incorporado ao presente pedido como referência em sua totalidade).

1O OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS Está contemplado que outros agentes podem ser usados em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Esses agentes adicionais incluem agentes imunomoduladores, agentes que afetam a suprarregulação de receptores de superfície celular e junções GAP, agentes citostáticos e de diferenciação, inibidores de adesão celulares ou agentes que aumentam a sensibilidade das células hiperproliferativas para indutores apoptóticos. Agentes imunomoduladores incluem o fator de necrose tumoral; interferon alfa, beta e gama; IL-2 e outras citocinas; F42K e outras citocinas análogas; ou MIP-1, MIP-1 ~. MCP-1, RANTES e outras quimiocinas. Além disso, é contemplado que a suprarregulação de receptores de superfície celular ou seus ligantes, como ligante Fas/Fas, DR4 ou DR5/TRAIL potencializariam as habilidades de indução apoptótica da presente invenção por estabelecimento de um efeito autócrino ou parácrino sobre as células hiperproliferativas. O aumento na sinalização intercelular por elevação do número de junções GAP aumentaria os efeitos anti-hiperproliferativos na população de células hiperproliferativas vizinhas. Em outras realizações, agentes citostáticos ou de diferenciação podem ser usados em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia anti-hiperproliferativa dos tratamentos. Os inibidores de adesão celular são contemplados para melhorar a eficácia da presente invenção. Exemplos de inibidores de adesão celular são inibidores da quinase de adesão focal (FAKs) e da Lovastatina. Além disso, é contemplado que outros agentes que 5 aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativas à apoptose, como o anticorpo C225, poderia ser usada em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia do tratamento.

Também pode ser usada terapia hormonal em conjunto com a presente invenção ou em combinação com qualquer outra terapia de câncer 1o descrita anteriormente. O uso de hormônios pode ser empregado no tratamento de certos tipos de câncer como de mama, próstata, ovário ou câncer cervical para reduzir o nível ou bloquear os efeitos de certos hormônios como a testosterona ou o estrógeno. Esse tratamento é frequentemente usado em combinação com pelo menos uma outra terapia de câncer como uma opção de tratamento ou para reduzir o risco de metástases.

Os imunoconjugados da invenção também podem ser administrados em conjunto com a quimioterapia, radioterapia ou outras imunoterapias. Agentes anticâncer para essas terapias de combinação podem, por exemplo, ser selecionados a partir de grupos de interruptores de microtúbulos (por exemplo, alcalóides da vinca, como vimblastina ou vincristina, taxanos, tais como paclitaxel ou docetaxel, epotilonas como ixabepilona), antimetabólitos (por exemplo antifolatos como metotrexato ou aminopterina, antipurinas, como fludarabina, 6-mercaptopurina ou 6-tioguanina, antipirimidinas como 5-fluorouracil, capecitabina ou gemcitabina, hidroxiuréia), inibidores da topoisomerase (por exemplo, camptotecina, irinotecano, topotecano ou podofilotoxinas como etoposide) intercaladores de DNA (por exemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, actinomicina, bleomicina), agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, clorambucil, nitrosureas como carmustina ou nimustina, estreptozocina, busulfano, cisplatina, oxaliplatina, trietilenomelamina, dacarbazina), terapias hormonais (por exemplo, glicocorticóides inibidores da aromatase como tamoxifeno, antiandrogênicos como flutamida, hormônio liberador de gonadotropina (GnRH) análogos, como 5 leuprolida), antibióticos, inibidores da quinase (por exemplo, erlotinibe, gefitinibe, imatinibe), antagonistas dos receptores (por exemplo, anticorpos alvo receptores de superfície celular conhecidos por promover carcinogênese e crescimento do tumor), inibidores da enzima (por exemplo, inibidores de quinase dependente de ciclina (CDK)), enzimas de depleção de aminoácidos (por exemplo, asparaginase), leucovorina, retinóides, ativadores da apoptose de células tumorais e agentes antiangiogênicos.

EXEMPLOS EXEMPL01 Quando a distribuição de citocinas mediada por anticorpos foi realizada pela primeira vez por Harvill E.T. e Morrison S.L. lmmunotech.

1(2):95-1 05 (1995), os constructos tinham dois antígenos que se ligavam aos componentes para direcionar o antígeno do tumor e dois componentes citocina para indução de ativação de linfócitos (uma molécula IL-2 é fundida a cada uma das terminações C de cadeia pesada de lgG3). A afinidade da citocina é geralmente alta em direção ao seu receptor. Uma molécula que carrega duas unidades de citocina poderia ter uma afinidade ainda maior para os receptores de citocina por causa dos efeitos de avidez (ou multivalência). Tal molécula poderia, portanto, facilmente ativar linfócitos na corrente sanguínea, mesmo antes do direcionamento do tumor ocorrer. Esse efeito não seria desejado para o paciente. Em contraste, uma molécula de imunoconjugado que carrega somente um componente citocina e dois ou mais domínios alvo seria menos provável ativar os linfócitos na circulação e poderia direcionar a molécula de imunoconjugado inteira para o tumor, onde a ativação de linfócitos pode ocorrer em uma velocidade menor. Portanto, as moléculas como descritas nas Figuras 1 e 2, foram construídas com interleucina-2 (IL-2) como uma citocina modelo. Todas as moléculas geradas são bivalentes para o antígeno do tumor e são tanto bivalente como 5 monovalente para a citocina IL-2, conforme indicado nos desenhos.

Afinidades para o antígeno foram comparadas para dois formatos diferentes de imunoconjugados usando-se o anticorpo L 19 como um exemplo. Como referência, esse anticorpo foi clonado no formato de lgG1 humana, o formato diacorpo (Figura 1A) e a fusão Fab-IL2-Fab (Figura 1B). Uma variável foi testada no formato diacorpo tal que o peptídeo ligante entre o VH e o VL era tanto oito como doze aminoácidos de comprimento. O antígeno purificado de Domínio Extra B de fibronectina (EBD) foi imobilizado em um chip BIACORE e o constructo de fusão do anticorpo foi usado como um analito solúvel para determinação de afinidade. As figuras 8 a 11 mostram os resultados desse experimento. A lgG foi considerada ser o caso ideal de um evento de ligação bivalente. Nesse ponto, foi observada uma afinidade constante de 260 pM.

O constructo de fusão Fab-IL2-Fab deu uma afinidade de 31 O pM, que é essencialmente idêntica à lgG. As duas variantes do diacorpo (mostradas nas Figuras 1O e 11) tinha medido afinidades de 270 pM e 360 pM, respectivamente. Portanto, todos esses constructos têm afinidades semelhantes para o antígeno. A afinidade para o antígeno e o receptor IL-2 foi endereçada usando-se constructos semelhantes com base na sequência de anticorpos F16 (Brack, SS et a/. Clin. Gane. Res. 12(1 0):3200-3208 (2006)). A Figura 12 mostra os sensorgramas BIACORE da lgG F16 e seu correspondente fragmento Fab monovalente, quando o domínio de TNC-A1 foi imobilizado no chip BIACORE. Sob essas condições experimentais específicas, a molécula de lgG mostrou uma afinidade constante de 2,6 nM e as moléculas de Fab mostraram uma afinidade constante de 50 nM. Nesse ponto, o aumento de afinidade atribuída à bivalência é um fator de 20. O diacorpo, o Fab-IL2-Fab e os imunoconjugados scFv-IL2-scFv mostraram afinidades para o antígeno de 5 nM, 4,8 nM e 12 nM, respectivamente.

Todos esses constructos, portanto, têm afinidades para o antígeno que mais 5 se assemelha ao caráter bivalente de uma molécula de lgG do que o comportamento monovalente do fragmento Fab.

As diferenças foram mais acentuadas quando se olha para afinidades para o receptor IL-2. Para estudar afinidade de ligação do receptor IL-2, uma ferramenta que foi gerada permitiu a expressão de um receptor IL-2 heterodimérico, a cadeia ~ do receptor IL-2 foi fundida a uma molécula Fc que foi elaborada geneticamente para heterodimerizar (Fc (protuberância)) usando a tecnologia "protuberância em orifícios" ((Merchant, A.M. et ai., Nat. Biotech. 16:677-681 (1998)). A cadeia gama do receptor IL-2 foi então fundida à variante Fc(orifício), que heterodimerizou com Fc(protuberância). Essa proteína de fusão Fc heterodimérica foi então usada como um substrato para análise da interação do receptor IL-2/IL-2. A Figura 13 mostra o sensorgrama BIACORE de IL-2 disponível comercialmente (Proleucina), como o analito, com o receptor IL-2 imobilizado. A afinidade medida de aproximadamente 0,5 nM está de acordo com valores previamente publicados. As afinidades dos vários constructos para o receptor IL-2 estão resumidas na Figura 17. Um resultado importante que foi observado foi a diferença entre o diacorpo (F16 dia IL2), que é bivalente em relação à citocina e a molécula Fab-IL2-Fab que carrega somente um componente IL-2. A afinidade de ligação do receptor IL-2 do diacorpo (0,8 nM) foi semelhante à da não-conjugada IL-2 (Proleucina) (0,5 nM), apesar do diacorpo ser bivalente e a IL-2 ser monovalente. A fusão Fab-IL2-Fab possuia uma afinidade de ligação do receptor IL-2 quase reduzida por um fator de 1O em comparação com o diacorpo, que foi refletido em uma capacidade reduzida de induzir a proliferação de células NK92 como mostrado na Figura 19.

EXEMPLO 2

CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE FAB GENÉRICAS 5 Bibliotecas de anticorpos genéricos no formato Fab foram construídas com base em genes de linhagem germinativa humana germline usando-se os seguintes pares de domínio V: Vk3_20 kappa de cadeia leve com VH3_23 de cadeia pesada para a biblioteca DP47-3 e Vk1_17 kappa de cadeia leve com VH1_69 de cadeia pesada para a biblioteca DP88-3. Consulte a Tabela 2. Ambas as bibliotecas foram randomizados na CDR3 da cadeia leve (L3) e CDR3 da cadeia pesada (H3) e foram montadas a partir de 3 fragmentos por biblioteca por splicing por sobreposição de extensão de PCR (SOE).

Fragmento 1 compreende a extremidade 5' do gene do anticorpo incluindo L3 randomizado, o fragmento 2 é um fragmento central constante que se extende desde L3 a H3, enquanto que o fragmento 3 compreende H3 randomizado e a porção 3' do gene do anticorpo.

As seguintes combinações de primers foram utilizadas para gerar biblioteca de fragmentos para biblioteca DP47-3: fragmento 1 (LMB3 - Libl 1b_new), fragmento 2 (MS63 - MS64), fragmento 3 (Lib2H - fdseqlong).

Consulte a Tabela 9. As seguintes combinações de primers foram utilizadas para gerar biblioteca de fragmentos para a biblioteca DP88-3: fragmento 1 (LMB3 - RJH_LIB3), fragmento 2 (RJH31 - RJH32) e fragmento 3 (LIB88_2 - fdseqlong). Consulte a Tabela 1O.

TABELA 9 Primers Usados na Biblioteca DP47-3 LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC Libl 1b_new

CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGTMNNGGGMNNMNNMNNACCCTGC

TGACAGTAATACACTGC MS63 TTTCGCACAGTAATATACGGCCGTGTCC MS64 ACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGG Lib2H GGCCGTATATTACTGTGCGAAANNKNNKNNKNNKNNKTTTGACTACTG

GGGCCAAGGAAC

GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG TABELA 10 Primers Usados na Biblioteca DP88-3 LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC

GACTTTGGTGCCCTGGCCAAACGT MNN GGG MNN MNN ACC MNN RJH LIB3

CTGCAAGCAGTAATAGGTGGCAAAATC RJH31 ACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG RJH32 TCTCGCACAGTAATACACGGCGGTGTCC GGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGA -[(33% GAC Asp; 26% GGT Gly; 10% GAA Glu; 9% CGT Arg; 7% Lys; 6% GTT Vai; 5% TCT Ser; 4% LIB88 2 CTG Leu)1 - (23% GGT Gly; 17% TAC Tyr; 16% TCT Ser; 11% GCT Ala; 9% CGT Arg; 7% AAC Asn; 6% ACT Thr; 6% GTT Vai; 5% CCG Pro)8]-

TTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC fdseqlong GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG O protocolo de PCR para produzir biblioteca de fragmentos incluiu: 5 minutos de desnaturação inicial a 94 °C, 25 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 58 °C e 1 minuto a 72 °C e alongamento terminal por 1O minutos a 72 °C. Para a 5 montagem de PCR, taxas equimolares dos três fragmentos foram usadas como molde. A montagem do protocolo da PCR incluiu: 3 minutos de desnaturação inicial a 94 °C e 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 1 minuto a 58 °C, e 2 minutos a 72 °C.

Nesse estágio, primers complementares aos fragmentos 1 a 3 fora da sequência foram adicionados e foram realizados 20 ciclos adicionais antes de um alongamento 1o terminal de 1Omin a 72 °C.

Após a montagem de quantidades suficientes de constructos de Fab randomizados inteiros, os constructos de Fab foram digeridos com Ncoi!Notl para a biblioteca DP47-3 e com Ncoi/Nhel para a biblioteca DP88-3 juntamente com vetor fagomídeo aceitante tratado de modo similar. Para a biblioteca DP47-3, 22,8 ~g de biblioteca de Fab foi ligada com 16,2 ~g de vetor fagomídeo. Para a biblioteca DP88-3, 30,6 ~g de biblioteca de Fab foi ligada com 30,6 ~g de vetor fagomídeo.

Ligações purificadas foram usadas por 68 transformações para a biblioteca DP47-3 e 64 transformações para a biblioteca DP88-3, respectivamente, para obter tamanhos de biblioteca final de 4,2 x 10 10 para DP47-3 e 3,3 x 109 para DP88-3.

Partículas de fagomídeo que exibem as bibliotecas de Fab foram resgatadas e purificadas por purificação PEG/NaCI para ser usado para seleções.

EXEMPL03 SELEÇÃO DE CLONE 2810 ANTI-TNC A2 5 Seleções foram realizadas contra TNC-A2 humana expressa em E.

co/i que foi subclonado 5' de um avi-tag e 6xhis-tag. Consulte SEQ ID NO: 57 na Tabela 5. O antígeno foi biotinilado in vivo sob expressão. Foram realizadas seleções em solução de acordo com o seguinte protocolo: (i) ligação de aproximadamente 1012 partículas de fagomídeo da biblioteca DP88-3 e 100nM de 1o TNC A2 humano biotinilado por 0,5 hora em um volume total de 1ml; (i i) captura de TNC-A2 humano biotinilado e fago anexado por adição de 5,4 x 107 microesferas magnéticas revestidas com streptavidina por 1O minutos; (iii) lavagem de microesferas usando-se 5x 1 ml de PBS/Tween20 e 5x 1ml de PBS; (iv) elução de partículas de fago por adição de 1 ml de 100 mM de TEA (trietilamina) por 1O minutos e neutralização por adição de 500 IJI de 1M de Tris/HCI pH 7,4; e (v) reinfecção de fase log de células TG1 de E. co/i, infecção com fago auxiliar VCSM13 e subsequente preciptação de PEG/NaCI de partículas de fagomídeos a serem usadas de modo subsequente nas rodadas de seleção.

Seleções foram realizadas ao longo de 3 rodadas usando-se concentrações de antígeno constante a 100 nM. Na rodada 2, captura de antígeno: complexos de fago foram realizados em placas de neutravidina ao invés de microesferas de estreptavidina. Ligantes específicos foram identificados por ELISA da seguinte forma utilizando: 100 IJI de 100 nM de TNC-A2 humano biotinilado foi revestido em cada poço de placas de neutravidina.

Foram adicionados sobrenadantes bacterianos que contêm Fab e ligações Fabs foram detectadas através de seus marcadores Flag usando-se um anticorpo secundário anti-Fiag/HRP. Uma vez identificado, clone 2810 foi expresso em bactérias em 0,5 litro de volume de cultura, afinidade purificada e, além disso, caracterizados por análise SPR usando-se BIACORE T1 00. Consulte SEQ lO NOs: 3 e 7 da Tabela 3.

EXEMPL04 5 SELEÇÃO DE CLONE 2F11 ANTI-TNC A1/A4 Seleções foram realizadas contra TNC-A 1 humana expressa em E. co/i que foi subclonado 5' de um avi-tag e 6xhis-tag. Consulte SEQ ID NO: 59 da Tabela 5. O antígeno foi biotinilado in vivo sob expressão.

Foram realizadas seleções em solução de acordo com o seguinte protocolo: (i) ligação de aproximadamente 10 12 partículas de fagomídeo da biblioteca DP47-3 e 100nM de TNC A1 humano biotinilado por 0,5 hora em um volume total de 1ml; (i i) captura de TNC-A 1 humano biotinilado e fago anexado pela adição de 5,4 x 10 7 microesferas magnéticas revestidas com streptavidina por 1O minutos; (iii) lavagem de microesferas usando-se 5x 1 ml de PBS/Tween20 e 5x 1ml de PBS; (iv) elução de partículas de fago por adição de 1 ml de 100 mM de TEA (trietilamina) por 1O minutos e neutralização por adição de 500 1-11 de 1M de Tris/HCI pH 7,4; e (v) reinfecção de fase log de células TG1 de E. co/i, infecção com fago auxiliar VCSM13 e subsequente preciptação de PEG/NaCI de partículas de fagomídeos a serem usadas de modo subsequente na rodada de seleção.

Seleções foram realizadas ao longo de 3 rodadas usando-se concentrações de antígeno constante a 100 nM. Na rodada 2, captura de antígeno: complexos de fago foram realizados em placas de neutravidina ao invés de microesferas de estreptavidina.

Todas as reações de ligação foram suplementadas com 100 nM de domínio constante de lgG CH3 humana não-biotinilada que compreende um carboxi-terminal avi-tag e 6xhis-tag, a fim de competir por clones indesejados que reconhecem os marcadores do antígeno.

Em uma primeira etapa de seleção, ligantes específicos foram identificados por ELISA como segue: 100 ~I de 100 nM de TNC-A 1 humano biotinilado foi revestido em cada poço de placas de neutravidina. Foram adicionados sobrenadantes bacterianos que contêm Fab e Fabs que 5 especificamente se ligaram a TNC-A 1 humano foram detectados através de seus marcadores Flag usando-se um anticorpo secundário anti-Fiag/HRP.

Em uma segunda etapa de seleção, o ELISA acima foi repetido usando-se também TNC-A 1 murino, TNC A4 humano e TNC A4 mu como antígenos, a fim de determinar a reatividade cruzada. Todos os antígenos 1o compreenderam a mesma avi-tag e 6xhis-tag em seu C-terminal e foram biotinilados in vivo. Consulte SEQ ID NOs: 50 e 61 da Tabela 5.

Uma vez identificado, clone 2F11 foi expresso em bactérias em 0,5 litro de volume de cultura, afinidade purificada e, além disso, caracterizados por análise SPR usando-se BIACORE T100. Consulte SEQ ID NOs: 9 e 13 da Tabela 3.

EXEMPLO 5 SELEÇÃO DE CLONES ANTI-FAP (SELEÇÕES PRIMÁRIAS) Seleções foram realizadas contra o ectodomínio de proteína de ativação de fibroblasto (FAP) humana ou murina, que foram clonadas a montante de uma poli-lisina e uma 6xhis-tag. Consulte SEQ 10 NOs: 53 e 55 da Tabela 5. Anterior às seleções, os antígenos foram revestidos em imunotubos em uma concentração tanto de 1O ~g/ml como de 5 ~g/ml, dependendo da rodada de seleção. Foram realizadas seleções de acordo com o seguinte protocolo: (i) ligação de aproximadamente 10 12 partículas de fagomídeo da biblioteca DP47-3 para FAP humano ou murino imobilizado por 2 horas; (ii) lavagem de imunotubos usando-se 5 x 5 ml de PBS/Tween20 e 5 x 5 ml de PBS; (iii) elução de partículas de fago por adição de 1 ml de 100 mM de TEA (trietilamina) por 1O minutos e neutralização pela adição de 500 ~I de 1M de

Tris/HCI pH 7,4; e (iv) reinfecção de fase log de células TG1 de E. co/i, infecção com fago auxiliar VCSM13 e subsequente preciptação de PEG/NaCI de partículas de fagomídeos a serem usadas de modo subsequente nas rodadas de seleção.

5 Foram realizadas seleções por mais de três ou quatro rodadas usando-se concentrações de antígeno decrescentes de FAP humano e em alguns casos usando-se FAP murino em 5 ug/ml na rodada de selecção final.

Ligantes específicos foram definidos como sinais 5x maiores do que o fundo e foram identificados por ELISA Placas Maxisorp NUNC foram revestidas com 10 ug/ml de FAP humano ou murino seguido por adição de sobrenadantes bacterianos que contém Fab e detecção de Fabs que se ligam especificamente, através dos seus marcadores Flag por utilização de um anticorpo secundário anti-Fiag/HRP.

Clones positivos para ELISA foram expressos através de bactérias como 1 ml de culturas em formatos de 96 poços e os sobrenadantes foram submetidos a um experimento de seleção cinética usando-se 81ACORE T100.

EXEMPLO 6 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE ANTI-FAP Três bibliotecas de maturação de afinidade foram construídas com base em anticorpos pré-selecionados das seleções anti-FAP primárias.

Mais precisamente, elas foram baseadas em (i) clone 209 de FAP anti-humano (biblioteca a.m.FAP209) (consulte SEQ 10 Nos: 67 e 69 da Tabela 3), (ii) clone 488 de FAP anti-murino (biblioteca a.m.FAP488) (consulte SEQ 10 Nos: 71 e 73 da Tabela 3) e (iii) clones 7A1, 1382, 13C2, 13E8, 14C10 e 17A11 de reatividade cruzada (biblioteca a.m.FAPpool) (consulte SEQ 10 Nos: 75 e 77 da Tabela 3 que corresponde às sequências de região variável de 7A1; SEQ 10 NOs: 79 e 81 da Tabela 3 que corresponde às sequências de região variável de 13c2; SEQ 10 NOs: 83 e 85 que corresponde às sequências de região variável de 13E8; SEQ 10 NOs: 87 e 89 que corresponde às sequências de região variável de 14C10; e SEQ 10 NOs: 91 e 93 que corresponde às sequências de região variável de 17A11).

Cada uma dessas bibliotecas é constituída de duas sub-bibliotecas, randomizadas tanto em COR1 e COR2 da cadeia leve (L 1/L2) como COR1 e COR2 da cadeia pesada (H1/H2), respectivamente. Essas sub-bibliotecas foram agrupadas sob transformação. Cada uma dessas sub-bibliotecas foi construída por quatro etapas subsequentes de amplificação e montagem.

Para bibliotecas L 1/L2, a amplificação e o protocolo de montagem incluiram: (i) amplificação do fragmento 1 (LMB3 OPK22_COR1_rand_ba_opt) e fragmento 2 (OPK22_COR1_fo OPK22_Ck_BstWI_ba); (i i) montagem dos fragmentos 1 e 2 usando primers externos LMB3 e OPK22_Ck_BstWI_ba para criar o molde para o fragmento 3; (iii) amplificação do fragmento 3 (LMB3- OPK22_COR2_rand_ba) e fragmento 4 (OPK22_COR2_fo - OPK22_Ck_BstWI_ba); e (iv) montagem final dos fragmentos 3 e 4 usando os mesmos primers externos como acima. Consulte a Tabela 11 para sequências de primers.

TABELA 11 Primers Usados nas Bibliotecas de Maturação de Afinidade L1/L2 para Maturação de Afinidade de Anti-FAP LM83 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC DPK22_CDR1_rand_ba_opt CAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAGTAGCTGCTGCTA

ACACTCTGACTGGCCCTGCAAG DPK22_CDR1_fo TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTG DPK22_Ck_Bs!WI_ba GGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCC DPK22_CDR2_rand_ba CTGTCTGGGATGCCAGTGGCCCTGCTGGAGGCGCCAI 6GATGAGGAGCCTGGGAGCCTG DPK22_ CDR2_fo AGGGCCACTGGCATCCCAGACAG Negrito: 60% da base original e 40% de randomização em relação aM Sublinhado: 60% da base original e 40% de randomização em relação a N Para bibliotecas H1/H2, a amplificação e o protocolo de 5 montagem incluiram: (i) amplificação do fragmento 1 (RJH53 - DP47_CDR1_rand_ba_opt) e fragmento 2 (DP47 _CDR1_fo - MS52); (ii) montagem dos fragmentos 1 e 2 usando primers externos RJH53 e MS52 para criar o molde para o fragmento 3; (iii) amplificação do fragmento 3 (RJH53- DP47 _CDR2_rand_ba) e fragmento 4 (DP47 _CDR2_fo- MS52); e (iv) montagem final dos fragmentos 3 e 4 usando os mesmos primers externos como acima. Consulte a Tabela 12 para sequências de primers.

TABELA 12 Primers Usados nas Bibliotecas de Maturação de Afinidade H1/H2 para Maturação de Afinidade de Anti-FAP RJH53 CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC DP47_CDR1_rand_ba_opt GAGCCTGGCGGACCCAGCTCATGGCATAACTGCTAA

AGGTGAATCCGGAGGC DP47 CDR1 fo ATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTC MS 52 GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG

CCTTCACGGAGTCTGCGTAGTATGTGCTACCACCAÇ DP47_CDR2_rand_ba IACCACTAATAGCTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCC c DP47_CDR2_fo ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGG Negrito: 60% da base original e 40% de randomização em relação aM Sublinhado: 60% da base original e 40% de randomização em relação a N Produtos de montagem final foram digeridos com Ncoi/BstWI para sub-bibliotecas L 1/L2 de a.m.FAP2D9 e a.m.FAP4B8, com Muni e Nhel para sub-bibliotecas H1/H2 de a.m.FAP2D9 e a.m.FAP4B8 bem como com Ncoi/BamHI para biblioteca L 1/L2 de a.m.FAPpool e com BspEI/Pstl para bibliotecas H1/H2 de a.m.FAPpool, respectivamente, juntamente com vetores aceitantes tratados de modo similar baseado em preparações de plasmídeo de clones 209, 488 ou uma mistura equimolar de clones 7A 1, 1382, 13C2, 13E8, 14C10 e 17A11, respectivamente. As seguintes quantidades de domínios V randomizados digeridos (parcial) e vetor(es) aceitante(s) digerido(s) foram 5 ligados às respectivas bibliotecas (!Jg de domínio V/j.Jg de vetor): sub-biblioteca L 1/L2 a.m.FAP209 (5.7/21.5), sub-biblioteca H1/H2 a.m.FAP209 (4.1/15.5), sub-biblioteca L 1/L2 a.m.FAP488 (6.5/24.5), sub-biblioteca H1/H2 a.m.FAP488 (5.7/21.5), sub-biblioteca L 1/L2 a.m.FAPpool (4.4/20), sub-biblioteca H1/H2 a.m.FAPpool (3.4/15.5).

Ligações purificadas de sub-bibliotecas L 1/L2 e H1/H2 foram agrupadas e utilizadas para 60 transformações para cada uma das 3 bibliotecas de maturação de afinidade, para se obter tamanhos de bibliotecas finais de 6,2 x 109 para a.m.FAP209, 9,9 x 109 para a.m.FAP488 e 2,2 x 109 para a.m.FAPpool.

Partículas de fagomídeo que exibem essas bibliotecas de Fab foram resgatadas e purificadas por purificação PEG/NaCI para ser usadas para seleções secundárias.

EXEMPLO 7 SELEÇÃO DE CLONES ANTI-FAP DE AFINIDADE MADURA Seleções foram realizadas contra o ectodomínio de proteína de ativação de fibroblasto (FAP) humana ou murina, que foram clonadas 5' de uma poli-lisina e uma 6xhis-tag. Consulte SEQ 10 NOs: 53 e 55 da Tabela 5.

Anterior às seleções, os antígenos foram revestidos em imunotubos em uma concentração tanto de 1O j.Jg/ml, 5 j.Jg/ml como 0,2 j.Jg/ml, dependendo da biblioteca e da rodada de seleção. Foram realizadas seleções de acordo com o seguinte protocolo: (i) ligação de aproximadamente 10 12 partículas de fagomídeo da biblioteca a.m.FAP209, a.m.FAP488 ou a.m.FAPpool para FAP humano ou murino imobilizado por 2 horas; (ii) lavagem de imunotubos usando-

se 1O- 20 x 5 ml de PBS!fween20 e 1O- 20 x 5 ml de PBS (dependendo da biblioteca de da rodada de seleção); (iii) elução de partículas de fago por adição de 1 ml de 100 mM de TEA (trietilamina) por 1O minutos e neutralização por adição de 500 IJI de 1M de Tris/HCI pH 7,4; e (iv) reinfecção de fase log de 5 células TG1 de E. co/i, infecção com fago auxiliar VCSM13 e subsequente preciptação de PEG/NaCI de partículas de fagomídeos a serem usadas de modo subsequente nas rodadas de seleção.

Foram realizadas seleções ao longo de 2 rodadas e as condições foram ajustadas para cada uma das 3 bibliotecas individualmente. Em detalhe, os parâmetros de seleção foram: a.m.FAP2D9 (5 IJg /ml de FAP humano e 20 lavagens no total para a rodada 1, 1 j.Jg/ml de FAP humano e 30 lavagens no total para a rodada 2), a.m.FAP488 (1 j.Jg/ml de FAP murino e 30 lavagens no total para a rodada 1, 0,2 IJg/ml de FAP humano e 40 lavagens no total para a rodada 2) e a.m.FAPpool (5 IJg/ml de FAP humano e 30 lavagens no total para a rodada 1, 5 j.Jg/ml de FAP murino e 30 lavagens no total para a rodada 2).

Ligantes específicos foram definidos como sinais 5x maiores do que o fundo e foram identificados por ELISA. Placas Maxisorp NUNC foram revestidas com 1 j.Jg/ml ou 0.2 j.Jg/ml de FAP humano ou murino seguido por adição de sobrenadantes bacterianos que contém Fab e detecção de Fabs que se ligam especificamente, através dos seus marcadores Flag por utilização de um anticorpo secundário anti-Fiag/HRP.

Clones positivos para ELISA foram expressos através de bactérias como 1 ml de culturas em formatos de 96 poços e os sobrenadantes foram submetidos a um experimento de seleção cinética usando-se BIACORE T1 00.

EXEMPLO 8 ESTUDOS DE EFICÁCIA DE DIFERENTES FORMATOS DE ll-2 DIRECIONADA Foi executado um experimento de eficácia usando-se dois diferentes formatos moleculares de imunoconjugado lnterleucina-2 específico para tumor de estroma. O teratocarcinoma F9 foi injetado de modo subcutâneo em camundongos 129SvEv e o tamanho do tumor foi medido usando-se um compasso de calibre. A molécula "diacorpo"-IL-2 foi 5 comparada em duas concentrações diferentes para o imunoconjugado Fab- interleucina-2-Fab (Fab-IL2-Fab), em que as concentrações refletem um número semelhante de moléculas de imunoconjugado. Os resultados são mostrados na Figura 3. O imunoconjugado Fab-IL2-Fab mostra uma significante inibição do crescimento do tumor e é melhor do que o formato diacorpo em duas concentrações diferentes e melhores do que os controles.

Também foi examinada a sobrevivência dos camundongos tratados com dois diferentes formatos moleculares de imunoconjugado lnterleucina-2 específico para tumor de estroma. A linhagem celular de tumor gástrico LS174T foi injetada de modo intraesplênico em camundongos bege SCID. A molécula "diacorpo"-IL-2 foi comparada em duas concentrações diferentes para o imunoconjugado Fab-IL-2-Fab, em que as concentrações refletem um número semelhante de moléculas de imunoconjugado. Os resultados são mostrados na Figura 4. O formato Fab- IL-2-ab resultou em um percentual de sobrevivência maior em comparação com o formato diacorpo e controles.

EXEMPLO 9

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE Os métodos padrão foram usados para manipular o DNA como descrito em Sambrook, J. et a/., Molecular C/oning: A /aboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante.

Informações gerais com respeito às sequências de nucleotídeos de imunoglobulinas humanas de cadeias leves e pesadas são dadas em: Kabat, E. A. et a/., ( 1991) Sequences of Proteíns of lmmuno/ogícal lnterest, sa edição, publicação NIH N° 91-3242.

5 SEQUENCIAMENTO DE DNA As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de fita dupla.

SíNTESE GENÉTICA Segmentos de genes desejados foram preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemanha) de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por síntese de gene automatizada. Os segmentos de genes que são flanqueados por sítios de clivagem para endonuclease de restrição singular foram clonados em plasmídeos pGA 18 (ampR). O DNA de plasmídeo foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração determinada por espectroscopia de UV. As sequências de DNA dos fragmentos de gene subclonados foram confirmadas por sequenciamento de DNA. Segmentos de genes foram projetados com sítios de restrição adequados para permitir a subclonagem nos vetores de expressão respectivos. Todas os constructos foram projetados com uma sequência codificadora de DNA de extremidade 5' para um peptídeo líder que direciona as proteínas para secreção em células eucariontes. A Tabela 13 e 14 fornece peptídeos líderes exemplares e sequências codificadoras de polinucleotídeos dos mesmos, respectivamente.

TABELA 13 . SEQUÊNCIAS LíDER PARA SECREÇÃO' SEQUÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEOS Sequência de Polipeptídeos SEQ ID NO MDWlWRILFLVAAATGAHS 273 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC 276 MGWSCIILFLVATATGVHS 278

TABELA 14 SEQUÊNCIAS LíDER PARA SECREÇÃO' SEQUÊNCIAS DE POLINUCLEOTÍDEOS Sequência de Polinucleotídeos SEQ ID NO ATGGACTGGACCTGGAGAATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACAG 274

GAGCCCACTCC ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACAG 275

GAGCCCACTCC ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGCCTCCTGCTGCTCT 277

GGTTCCCAGGTGCCAGGTGT ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACCG 279

GTGTGCATTCC ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACTG 280

GAGTGCATTCC ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTCGCCACAGCCACCG 281

GCGTGCACTCT

PREPARAÇÃO DE IMUNOCONJUGADOS As sequências de DNA resultantes foram subclonadas em 5 vetores de expressão de mamíferos (um para a cadeia leve e outro para a cadeia pesada/proteína de fusão) sob o controle do promotor MPSV e a montante de um sítio polyA sintético, cada vetor carregando uma sequência OriP de E8V.

lmunoconjugados como aplicado nos exemplos a seguir foram produzidos por cotransfecção de crescimento exponencial de células HEK293- E8NA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando uma transfecção de fosfato de cálcio. Alternativamente, cultivo de células HEK293 em suspensão foram transfectadas por polietilenimina (PEI) com os vetores de expressão ou pools de células CHO transfectadas com estabilidade foram usados. Embora constructos Fab-IL2-Fab direcionados a FAP com base em 3F2 e 4G8 possam ser purificados por cromatografia de afinidade utilizando uma matriz de proteína A, constructos Fab-IL2-Fab direcionados a TNC A2 com base em 281 O têm que ser purificados por cromatografia de afinidade em uma matriz de proteína G.

Resumidamente, 2810 Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 foi purificado a partir de sobrenadantes por uma etapa de afinidade (proteína G),

seguido por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare). A coluna de proteína G foi equilibrada em 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5, o sobrenadante foi carregado e a coluna foi lavada com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 5 pH 7,5. Fab-IL2-Fab foi eluído com 8,8 mM de ácido fórmico pH 3. As frações eluídas foram agrupadas e refinadas por cromatografia de exclusão por tamanho na formulação tampão final: 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 6,7. A Figura 53 mostra os resultados exemplares de purificação e analíticos 3F2 Fab-IL2-Fab ou 4G8 Fab-IL2-Fab direcionado a FAP foi purificado por um método similar composto de uma etapa de afinidade (proteína A), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare). A coluna de proteína A foi equilibrada em 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5, o sobrenadante foi carregado e a coluna foi lavada com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, pH 7,5, seguido por uma lavagem com 13,3 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, pH 5,45. Foi opcionalmente executada uma terceira lavagem com 1O mM de MES, 50 mM de cloreto de sódio pH 5. Fab-IL2-Fab foi eluído com 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina, pH 3. As frações eluídas foram agrupadas e refinadas por cromatografia de exclusão por tamanho na formulação tampão final: 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 6,7.

EXEMPLO 10 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE ANTI-FAP ADICIONAIS (COM BASE EM CLONES 3F2, 309, 4G8, 4B3 E 2C6) Quatro bibliotecas de maturação de afinidade adicionais foram construídas com base em anticorpos de reatividade cruzada pré- selecionados da primeira campanha de maturação de afinidade de anticorpos anti-FAP, em outras palavras, clones 3F2, 309, 4G8, 483 e 2C6 (consulte SEQ 10 NOs: 17 e 21 da Tabela 3 que corresponde às 5 sequências de região variável de 3F2; SEQ 10 NOs: 23 e 25 da Tabela 3 que corresponde às sequências de região variável de 309; SEQ 10 NOs: 33 e 35 da Tabela 3 que corresponde às sequências de região variável de 483; SEQ 10 NOs: 41 e 43 da Tabela 3 que corresponde às sequências de região variável de 2C6). Mais precisamente, as quatro bibliotecas foram baseados em 1) clones 3F2, 4G8 e 483 anti-FAP (biblioteca VH, randomizada nas CORs 1 e 2 da cadeia pesada variável, ou seja, biblioteca H1/H2), 2) clones 309 e 2C6 anti-FAP (biblioteca VL, randomizada nas CORs 1 e 2 da cadeia leve variável, ou seja, biblioteca L 1/L2), 3) clone 3F2 anti-FAP (biblioteca L3 com randomização leve na COR3 da cadeia leve, ou seja, biblioteca L3) e 4) clone 3F2 anti FAP (biblioteca H3 com randomização leve na COR3 da cadeia pesada, ou seja, biblioteca H3). As duas primeiras bibliotecas foram construídas exatamente da mesma maneira como descrito para a primeira campanha de maturação de afinidade de anticorpos anti-FAP, para as bibliotecas L 1/L2 e H1/H2, respectivamente. Em contrapartida, para as bibliotecas de maturação de afinidade L3 e H3 com base no clone 3F2, foram usados dois primers novos para introduzir randomização leve em L3 (AM_3F2_0PK22_L3_ba:

CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC com bases sublinhadas sendo 60% da base fonecida e 40% de mistura de N (mistura dos quatro nucleotídeos A, C, G e T)) e H3 (AM_3F2_0P47 _H3_fo:

GGCCGTATATTACTGTGCG AAA GGG TGG TTT GGT GGT ITT AAC TACTGGGGCCAAGGAAC com bases sublinhadas sendo 60% da base fonecida e 40% de mistura de N, bases em itálico sendo 60% da base fornecida e 40% de G, bem como bases sublinhadas em itálico sendo 60% da base fornecida e 40% da mistura K, (mistura dos dois nucleotídeos G e T)) do clone parenta!. Os tamanhos das bibliotecas foram os seguintes: 5 biblioteca H 1/H2 (1, 13 x 1010 ), biblioteca L 1/L2 (5,6 x 109 ), biblioteca L3 (2,3 x 1010 ) e biblioteca H3 (2,64 x 1010 ).

EXEMPLO 11 SELEÇÃO DE CLONES ANTI-FAP DE AFINIDADE MADURA Seleções foram realizadas contra o ectodomínio de proteína de ativação de fibroblasto (FAP) humana ou murina, que foram clonadas a montante de uma 6x-lisina e uma 6xhis tag (consulte SEQ ID NOs: 53 e 55 da Tabela 5). Anterior às seleções, os antígenos foram revestidos em imunotubos em uma concentração tanto de 1 ~g/ml, 0,2 ~g/ml como 0,02 ~g/ml, dependendo da biblioteca e da rodada de seleção. Triagens e seleções baseadas em ELISA foram realizadas conforme descrito para a primeira campanha de maturação de afinidade de anticorpos anti-FAP. Seleções secundárias foram realizadas utilizando um biosensor ProteOn XPR36 (8ioRad) e constantes de taxa cinética e afinidades foram determinadas analisando-se preparações de Fab de afinidade purificada no mesmo instrumento. Foram identificados os seguintes clones de afinidade madura: 19G1 (consulte SEQ ID NOs: 121 e 123 da Tabela 3), 20G8 (consulte SEQ ID NOs: 125 e 127 da Tabela 3), 489 (consulte SEQ ID NOs: 129 e 131 da Tabela 3), 588 (consulte SEQ ID NOs: 133 e 135 da Tabela 3), 5F1 (consulte SEQ ID NOs: 137 e 139 da Tabela 3), 1483 (consulte SEQ ID NOs: 141 e 143 da Tabela 3), 16F1 (consulte SEQ ID NOs: 145 e 147 da Tabela 3), 16F8 (consulte SEQ ID NOs: 149 e 151 da Tabela 3), 03C9 (consulte SEQ ID NOs: 153 e 155 da Tabela 3), 22A3 (consulte SEQ ID NOs: 165 e 167 da Tabela 3) e 29811 (consulte SEQ ID NOs: 169 e 171 da Tabela 3) (todos esses clones foram selecionados da biblioteca H1/H2 e são derivados do clone parenta! 3F2), 0207 (consulte SEQ 10 NOs: 157 e 159 da Tabela 3) (selecionados da biblioteca L3 com base no clone parenta! 3F2), e 28H1 (consulte SEQ 10 NOs: 161 e 163 da Tabela 3) e 23C10 (consulte SEQ 10 NOs: 173 e 175 da Tabela 5 3) (esses dois clones foram selecionados da biblioteca H1/H2 e são derivados do clone parenta! 4G8).

As Figuras 21 a 25 mostram os sensorgramas de Ressonância Plasmônica de Superfície dos Fabs de afinidade madura selecionados contra FAP e a Tabela 15 fornece as respectivas afinidades. Os Fabs selecionados abrangem uma alta taxa de afinidade na faixa de pM a nM e têm reatividade cruzada para FAP humano (hu) e murino (um), bem como FAP Cynomolgus (cyno), conforme determinado por clones selecionados.

Os Fabs anti-FAP de afinidade madura foram convertidos no formato Fab- IL2-Fab. Foi mostrada especificidade de ligação por falta de ligação a OPPIV como homólogo próximo de FAP, expresso em células HEK293 ou CHO.

TABELA 15 RESUMO DE CONSTANTES DE EQUILÍBRIO CINÉTICO (K 0 ) DE ANTICORPOS ANTI-FAP DE AFINIDADE MADURA EM RELACÃO A FRAGMENTOS FAB (LIGACÃO MONOVALENTE) afinidade (K0 ) a FAP hu afinidade (K0 ) a FAP mu afinidade (K 0 ) a FAP cyno anticorpo [pM] [pM] [pM] 19G1 76 2600 n.d. 20G8 69 2800 n.d. 4B9 157 3300 n.d. 5B8 690 3200 n.d. 5F1 243 4100 n.d. 14B3 377 3800 n.d. 16F1 193 3400 n.d. 16F8 301 3800 n.d. 03C9 160 3700 n.d. 02D7 619 8300 n.d.

afinidade (K 0 ) a FAP hu afinidade (K 0 ) a FAP mu afinidade (K 0 ) a FAP cyno anticorpo [pM] [pM] [pM]

28H1 200 9 3600 22A3 34 655 522 29811 35 436 23 23C10 1600 125 990

EXEMPLO 12

CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTI-TNC A2

(COM BASE NO CLONE 2B10)

Uma biblioteca de maturação de afinidade foi construída com

5 base em anticorpo pré-selecionado das seleções de TNC A2 primária.

Mais precisamente, ela foi baseada no clone parenta! 281 O e consistiu em duas sub-bibliotecas: 1) sub-biblioteca VL, randomizada na COR 1 e CDR2 da cadeia leve (L 1/L2) e 2) sub-biblioteca VH, randomizada na CDR1 e CDR2 da cadeia pesada (H1/H2). Essas sub-bibliotecas foram agrupadas sob transformação.

Cada uma dessas sub-bibliotecas foi construída por quatro etapas subsequentes de amplificação e montagem.

Para bibliotecas L 1/L2:

1) amplificação do fragmento 1 (LMB3 - AM_Vk1A30_L 1_ba) e fragmento

2 (RJH50 (Vk1A30_L 1/L2_fo) - RJH51 (Vk1A30_BsiWI_ba)), 2) montagem dos fragmentos 1 e 2 usando primers externos LMB3 e RJH51

(Vk1A30_BsiWI_ba) para criar o molde para o fragmento 3) amplificação do fragmento 3 (LMB3 - AM_Vk1A30_L2_ba) e fragmento 4 (RJH52

(Vk1A30_L2/L3) - RJH51 (Vk1A30_BsiWI_ba)) e 4) montagem final dos fragmentos 3 e 4 usando os mesmos primers externos como acima.

Para bibliotecas H 1/H2: 1) amplificação do fragmento 1 (RJH53

AM_DP88_H1_ba_opt) e fragmento 2 (RJH54(DP88_H1/H2_fo) - MS52),

2) montagem dos fragmentos 1 e 2 usando primers externos RJH53 e

MS52 para criar o molde para o fragmento 3) amplificação do fragmento 3

(RJH53 - AM_DP88_H2_ba) e fragmento 4 (RJH55 (DP88_H2H3_fo) -

MS 52) e 4) montagem final dos fragmentos 3 e 4 usando os mesmos primers externos como acima. Produtos de montagem final foram digeridos com Ncoi/BstWI para sub-bibliotecas VL e Muni e Nhel para sub-bibliotecas VH e foram clonados em vetores aceitantes digeridos de modo semelhante.

Tamanho da biblioteca resultou em 1,16 x 10 10 clones independentes.

TABELA 16 Primers Usados nas Bibliotecas de Maturação de Afinidade L1/L2 para ligante 2B10 Anti- TNCA2 LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC AM_Vk1A30_L 1_ba CCTGGCTTCTGCTGGTACCAGCCTAA6TC6TTACGAATQ

CCCTGACTTGCCCGGCAGGTGATG RJH50(Vk1A30_L 1/L2_fo) GCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAG RJH51 (Vk1A30_BsiWI_ba) GGTGCAGCCACCGTACGCTTGATCTC AM_Vk1A30_L2_ba CTTGATGGGACGCCACTCTGCAA6CTGGAÇGC6GC6TA

GATCAGGCGCTTAGGGGCTTTCC RJH52(Vk1 A30_L2/L3) TTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTC Sublinhado: 60% da base original e 40% de randomização em relação a V Negrito: 60% da base original e 40% de randomização em relação aN TABELA 17 Primers Usados nas Bibliotecas de Maturação de Afinidade H1/H2 para ligante 2B10 Anti-TNC A2 RJH53 CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AM_DP88_H 1_ba_opt GTCCAGGGGCCTGTCGCACCCAGCTTAT6GCQT

AGCTGCTGAATGTGCCTCCGGAGGCCTTG RJH54(DP88_H1/H2_fo) ATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGAC MS 52 GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG

GACCCTGCCCTGGAACTTCTGTGCGTAGTTTGC AM_DP88_H2_ba GGTACC6AAGAT6GGGATGATÇCCTCCCATCCA

CTCGAGCCCTTGTCCAG RJH55 (DP88_H2H3_fo) TACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC Sublinhado: 60% da base original e 40% de randomização em relação a V

Negrito: 60% da base original e 40% de randomização em relação aN EXEMPLO 13 SELEÇÃO DE CLONES ANTI-TNC A2 DE AFINIDADE MADURA 5 Seleções foram realizadas contra TNC-A2 humana expressa em E. co/i que foi clonada a montante de um avi-tag e 6xhis-tag (consulte SEQ 10 NO: 57 da Tabela 5). O antígeno foi biotinilado in vivo sob expressão. Foram executadas seleções em solução como descrito para as seleções TNC A2 primárias usando-se concentrações decrescentes de TNC A2 humana que variam de 100 a 2 nM. Após a identificação de clones de afinidade madura por ELISA, seleções secundárias foram executadas utilizando um biosensor ProteOn XPR36 (8ioRad) e constantes de taxa cinética e afinidades foram determinadas analisando-se preparações de Fab de afinidade purificada no mesmo instrumento. Foram identificados os seguintes clones de afinidade madura: 2810_01 F7 (consulte SEQ lO NOs: 201 e 203 da Tabela 3), 281 0_6H1 O (consulte SEQ lO NOs: 205 e 207 da Tabela 3), 2810_C3A6 (consulte SEQ 10 NOs: 185 e 187 da Tabela 3), 2810_01A2 (consulte SEQ 10 NOs: 189 e 191 da Tabela 3) e 2810_0708 (consulte SEQ 10 NOs: 197 e 199 da Tabela 3) (todos esses são derivados da sub-biblioteca VL), bem como 2810_C386 (consulte SEQ 10 NOs: 177 e 179 da Tabela 3) e 2810_6A12 (consulte SEQ 10 NOs: 181 e 183 da Tabela 3) (esses dois clones são derivados das sub-bibliotecas VH). Além disso, para o clone 2810_D1A2, foi gerado um V32D mutante (consulte SEQ ID NOs: 193 e 195 da Tabela 3) (numeração de acordo com Kabat).

A Figura 26 mostra os sensorgramas de Ressonância Plasmônica de Superfície dos Fabs de afinidade madura selecionados contra TNC e a Tabela 18 fornece as respectivas afinidades. Os Fabs selecionados abrangem uma alta taxa de afinidade na faixa de pM.

TABELA 18 RESUMO DE CONSTANTES DE EQUILÍBRIO CINÉTICO (K 0 ) DE ANTICORPOS ANTI-TNC A2 DE AFINIDADE MADURA EM RELAÇÃO A FRAGMENTOS FAB (liGAÇÃO MONOVALENTE) afinidade (K 0 ) a anticorpo TNC A2 hu [pM] 2B10_C3B6 191 2810 6A12 290 2810 C3A6 497 2810 07D8 147 2810 01F7 56 2810 6H10 810 5 EXEMPLO 14 PURIFICAÇÃO DE CONSTRUCTOS FAB-Il2-FAB COM BASE EM 2810, 3F2 E 4G8 Outro método de purificação (além do descrito no Exemplo 9) foi desenvolvido para constructos Fab-IL2-Fab com base em 2810, 3F2 e 4G8.

Embora constructos Fab-IL2-Fab com base em 3F2 e 4G8 possam ser 1o purificados por cromatografia de afinidade utilizando uma matriz de proteína A (por exemplo, MabSelect Sure), constructos Fab-IL2-Fab com base em 2810 têm que ser purificados por cromatografia de afinidade em uma matriz de proteína G. O procedimento de purificação é baseado nas quatro etapas seguintes:

1. Cromatografia de afinidade com MabSelect Sure ou proteína G

2. Manter o pH baixo para a inativação retroviral

3. Cromatografia de troca aniônica - cromatografia CaptoQ, para remover DNA

4. Cromatografia de troca catiônica - cromatografia SP Sepharose FF, para remover agregados Para a remoção de agregados em pequena escala, a cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 200 (GE

Healthcare) pode ser utilizada de modo alternativo.

Um exemplo do processo de purificação é dado de modo subsequente para Fab-IL2-Fab com base em 3F2. Em uma primeira etapa sobrenadantes de células HEK293 transfectadas por PEI temporariamente em 5 meio Freestyle (lnvitrogen) foi ajustado para pH 7 e aplicado a uma coluna de proteína A MabSelect (GE Healthcare), lavado com 100 mM de NaP04, 250 mM de NaCI pH 7 e eluído com B,B mM de formiato de sódio pH 3. Frações selecionadas foram trocadas em tampão de lavagem e aplicadas a uma coluna CaptoQ (GE Healthcare), lavadas com 10 mM de NaP04, 40 mM de NaCI pH 6,5 e eluídas com 2 M de NaCI. O fluxo contínuo foi ajustado para pH 5 e aplicado a uma coluna SP Sepharose FF (GE Healthcare), lavado com 25 mM de acetato de sódio, 25 mM de NaCI, pH 5 e eluído com 25 mM de acetato de sódio, 300 mM de NaCI pH 5. Foram trocadas frações em formulação tampão final. A Figura 27 mostra uma visão geral do processo de purificação.

O Fab-IL2-Fab com base em 3F2 purificado ficou puro após purificação (Figura 2BA) e não continha agregados (Figura 2B8). O procedimento de purificação descrito foi aplicado a Fab-IL2-Fab com base em 4GB. Fab-IL2-Fab com base em 4GB se comportou de modo semelhante ao Fab-IL2-Fab com base em 3F2. O material purificado ficou puro após a purificação e não continha agregados (Figura 28, C a 0).

Foi executada purificação para o formato Fab-IL2-Fab com 2810 (ligante TNC A2) como fragmento Fab. Em uma primeira etapa sobrenadantes de células HEK293 transfectadas por PEI temporariamente em meio Freestyle (lnvitrogen) foi ajustado para pH 7 e aplicado a uma coluna de proteína G (GE Healthcare), lavado com 100 mM de NaP04, 250 mM de NaCI pH 7 e eluído com B,B mM de formiato de sódio pH 3. Frações selecionadas foram trocadas em tampão de lavagem e aplicadas a uma coluna CaptoQ (GE Healthcare), lavadas com 1O mM de NaP0 4, 40 mM de Na CI pH 6,5 e eluídas com 2 M de

NaCI. O fluxo contínuo foi ajustado para pH 5 e aplicado a uma coluna SP Sepharose FF (GE Healthcare), lavado com 25 mM de acetato de sódio, 25 mM de NaCI, pH 5 e eluído com 25 mM de acetato de sódio, 300 mM de NaCI pH 5. Foram trocadas frações em formulação tampão final.

5 A Figura 29 mostra os resultados de (A) a caracterização analítica do produto por SDS-PAGE (NuPAGE Novex 8is-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não reduzido) e (8) cromatografia de exclusão por tamanho analítica do produto após cada uma das três etapas de purificação. Foram detectados 2,3% de agregados no produto final.

EXEMPLO 15

TESTE DE ESTABILIDADE Foi executado teste de estabilidade para o formato Fab-IL2- Fab com ligante L 19 de fibronectina ectodomínio 8 como fragmento Fab.

Para testes de estabilidade o constructo Fab-IL2-Fab foi purificado por cromatografia de afinidade da proteína A com uma etapa de eluição em pH 3, seguido por cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare), conforme descrito. Três tampões diferentes foram testados e 20 mM de histidina HCI, 140 mM de NaCI, pH 6,0 foi identificado como um tampão adequado. De modo subsequente, L19 Fab- IL2-Fab foi formulado em 20 mM de histidina HCI, 140 mM de NaCI, pH 6,0 a uma concentração de 6,3 mg/ml e armazenado por quatro semanas em temperatura ambiente a 4 °C. A Figura 30 mostra os dados de estabilidade exemplares: As sondas foram analisadas a cada semana para concentração por espectroscopia de UV (Figura 30A) (após a centrifugação para material precipitado potencial pe/let) e para conteúdo de agregado por cromatografia de exclusão por tamanho analítica em uma coluna Superdex 200 (Figura 308). Os resultados mostram que não ocorreu nenhuma agregação e nenhuma degradação, quando o constructo foi armazenado a 4 °C ou em temperatura ambiente por 28 dias, bem como após um ciclo de congelamento/descongelamento em 6 mg/ml de concentração. Esses dados mostram que o formato Fab-IL2-Fab é altamente estável e se 5 comporta de modo comparável aos anticorpos lgG.

EXEMPLO 16 AFINIDADES DE LIGAÇÃO DE FAB-Il2-FAB DIRECIONADO A FAP POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (BIACORE) Afinidades de ligação dos três constructos Fab-IL2-Fab direcionado a FAP, 3F2 Fab-IL2-Fab, 4G8 Fab-IL2-Fab e 309 Fab-IL2-Fab, foram determinados por Ressonância Plasmônica de Superfície.

Para determinação de ligação de FAP, FAP foi capturado por um anticorpo anti-His imobilizado (Penta His, Qiagen #34660) e os constructos foram usados como analitos. A temperatura de análise foi de 25 °C e os constructos Fab-IL2-Fab foram diluídos 1:05 de 1O nM para 3,2 pM. Os seguintes parâmetros de medição foram aplicados: Tempo de associação 180 s, dissociação 900 s, fluxo 90 !JI/min. O chip foi regenerado com 1O mM de glicina pH 2 por 60 s. As curvas foram ajustadas com o modelo 1:1 para obter os valores de K0 (Rmax local, RI = 0).

Para determinar a afinidade para cadeias receptoras de IL-2 (IL- 2R), as cadeias !3 e y (b/g; constructo protuberância em orifício) ou a cadeia a (a) de IL-2R foram imobilizadas no chip e os constructos Fab-IL2-Fab foram usados como analitos. A temperatura de análise foi de 25 °C. Os constructos Fab-IL2-Fab 3F2 e 309 foram diluídos 1:2 de 25 nM para 0,78 nM e os seguintes parâmetros de medição foram aplicados: Tempo de associação 100 s, dissociação 180 s, fluxo 90 IJI!min. A regeneração foi feita com 10 mM de glicina pH 1,5 por 20 s. Os constructos Fab-IL2-Fab 4GB foram diluídos de 100 nM para 3,125 nM e os seguintes parâmetros de medição foram aplicados:

Tempo de associação 180 s, dissociação 180 s, fluxo 40 1-JI/min. Regeneração com 3 M de MgCb por 30 s.

A Tabela 19 apresenta um resumo de afinidades de ligação dos imunoconjugados 3F2 Fab-IL2-Fab, 4G8 Fab-IL2-Fab e 309 Fab-IL2- Fab. Valores picomolares de afinidade alcançam o limite de detecção do Biacore. As Figuras 31 a 34 mostram os respectivos sensorgramas e afinidades Biacore.

TABELA 19 RESUMO DE CONSTANTES DE EQUILÍBRIO CINÉTICO (K 0 ) DE CONSTRUCTOS FAB-Il2- FAB DIRECIONADOS A FAP A PARTIR DE DIFERENTES ESPÉCIES E RECEPTORES ll-2

CONFORME DETERMINADO POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE Afinidade ao Afinidade ao FAP FAP FAP receptor IL-2 (b/g) receptor IL-2 (a) Constructo Humano Murino Cynomolgus Receptor Receptor imobilizado imobilizado Fab-IL2-Fab Avidez: Avidez: Avidez: 2,7 nM 3F2 25 pM 49 pM 24 pM hu IL-2R bg

NO 3,8 nM 4,5 nM Fab-IL2-Fab Avidez: Avidez: Avidez: hu IL-2R bg hu IL-2R a 4G8 83 pM 2,3 pM 74 pM 45,6 nM 29 nM mu IL-2R bg mu IL-2R a Fab-IL2-Fab Avidez: Avidez: Avidez: 2,7 nM 309 96 pM 63 pM 105 pM hu IL-2R bg

NO EXEMPLO 17 AFINIDADES DE LIGAÇÃO DE FAB-Il2-FAB DIRECIONADO A TNC A2 POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (BIACORE) Para a determinação de ligação TNC A2 os antígenos biotinilados (domínios fn5-A 1-A2-A3 TNC, fundidos, expressos em E. co/i.

enquanto os domínios fn5 e o A3 são sempre de origem humana, os domínios A 1 e A2 são humanos, murinos ou cynomolgus) foram imobilizados em um chip de estreptavidina e os constructos do immunoconjugate foram usados como analitos. A temperatura de análise foi de 25 °C. Fab-IL2-Fab foram diluídos 1:2 de 25 nM para 0,39 nM e os seguintes parâmetros de medição foram aplicados: Tempo de associação 180 s, dissociação 180 s, fluxo 50 IJI/min. Regeneração com 1O mM de glicina pH 1,5 por 60 s. As curvas foram ajustadas com o modelo 1:1 para obter os valores de K0 . Como um controle negativo, domínios TNC de 1 a 8 produzidos em células HEK foram aplicados (TNC 1-8 HEK).

Para determinar a afinidade para cadeias ~ e y receptoras de IL-2 (IL-2R) (b/g; constructo protuberância em orifício) o constructo IL-2R foi imobilizado no chip e os imunoconjugados Fab-IL2-Fab foram usados como analitos. A temperatura de análise foi de 25 °C. lmunoconjugados Fab-IL2-Fab foram diluídos 1:2 de 25 nM para 0,78 nM e os seguintes parâmetros de medição foram aplicados: Tempo de associação 100 s, dissociação 180 s, fluxo 90 IJI/min. A regeneração foi feita com 1O mM de glicina pH 1,5 por 20 s. Os constructos Fab-IL2-Fab foram diluídos de 100 nM para 3,125 nM e os seguintes parâmetros de medição foram aplicados: Tempo de associação 180 s, dissociação 180 s, fluxo 40 IJI/min.

Regeneração com 3 M de MgCb por 30 s. A Tabela 20 apresenta um resumo de afinidades de ligação para o imunoconjugado 281 O Fab-IL2- Fab, a Figura 35 mostra os respectivos sensorgramas e afinidades Biacore.

TABELA 20 RESUMO DE CONSTANTES DE EQUILÍBRIO CINÉTICO (K 0 ) DE CONSTRUCTOS FAB-Il2- FAB DIRECIONADOS A TNC A2 PARA TNC A2 A PARTIR DE DIFERENTES ESPÉCIES E RECEPTORES 6/y ll-2 CONFORME DETERMINADO POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA

DE SUPERFÍCIE Afinidade ao receptor

TNC TNC TNC Constructo IL-2 (JJ/y) Humano Murino Cynomolgus Receptor imobilizado Fab-IL2-Fab 2810 Avidez: Antígeno de E. co/i 0.12 nM lmob. Avidez: Avidez: 2,7 nM 0,77 nM 0,12 nM TNC 1-8 HEK sem (controle negativo) ligação

EXEMPLO 18 TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA COM IMUNOCONJUGADOS FAB-Il2-FAB DIRECIONADOS A ll-2 A atividade biológica de imunoconjugados Fab-IL2-Fab 5 direcionados a IL-2 foi investigada em diversos testes celulares em comparação a IL-2 (Proleucina).

INDUÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS NK92 Moléculas Fab-IL2-Fab direcionados a IL-2 que reconhecem TNC A2 (281 O) ou FAP (3F2 e 4G8) foram investigadas para seus potenciais na indução da proliferação de células NK92, em comparação a IL-2 (Proleucina) e ao diacorpo IL-2 L 19 que reconhece EDB de fibronectina.

2 IJg/ml de Tenascina humana, FAP ou Fibronectina foram revestidos durante a noite a 4 oc em placas de 96 poços de fundo plano de ELISA. Após bloqueio da placa, os constructos Fab-IL2-Fab ou o diacorpo foram titulados nas placas e incubados por 90 min em temperatura ambiente (RT) para ligação. Após lavagem intensa para remover os constructos não ligados, células NK92 subalimentadas com IL-2 (1 0000 células/poço) foram adicionadas. Como controle positivo, Proleucina foi adicionada na solução em alguns poços. As células foram incubadas por 2 dias a 37 oc em um incubador umidificado (com 5% de C0 2 ) antes da lise das células para determinar a proliferação por medição de ATP usando-se CeiiTiter Glo Kit (Promega).

Os resultados na Figura 36 mostram que todos os constructos Fab-IL2-Fab foram capazes de ativar a sinalização de IL-2R nas células NK92 e estimular a proliferação das mesmas. Devido à afinidade de ligação reduzida para o heterodímero IL-2R ~/y necessária para sinalização, a potência de indução de crescimento celular foi reduzida para um fator de aproximadamente 1O ou mais, em comparação a IL-2 (Proleucina). Entretanto, a eficácia geral em altas doses foi mantida e comparável a IL-2 (Proleucina).

INDUÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE ST A T5 Em outro experimento foi testado a indução de fosforilação de STAT5 como consequência da sinalização de IL-2R mediada por IL-2 após 5 incubação com uma molécula IL-2 Fab-IL2-Fab que reconhece FAP (com base em 4G8) em diferentes populações de células efetoras, incluindo A) células NK CD56+, 8) células T auxiliares CD4+CD25-CD127+, C) CD3+, células T citotóxicas CD8+ e O) células T reguladoras (D) CD4+CD25+FOXP3+ (Tregs) de PBMCs humanas em solução.

PBMCs isoladas do sangue de doadores saudáveis foram tratadas por 20 min com diferentes concentrações de Proleucina ou Fab-IL2- Fab antes da fixação/permeabilização das mesmas e coloração com anticorpo anti-PhosphoSTAT5 (Becton Dickinson) de acordo com as instruções do fornecedor. Após coloração intracelular de STAT5 fosforilada bem como FOXP3, os marcadores de superfície (CD3, CD4, CD8, CD56 e CD127) foram corados para determinação das diferentes subpopulações por citometria de fluxo (FACS Canto 11).

Os resultados na Figura 37 confirmam os achados da Figura 36 e mostram que o constructo 4G8 Fab-IL2-Fab foi capaz de ativar a sinalização de IL-2R em várias células efetoras positivas para IL-2R e induzir a sinalização a jusante de IL-2R e fosforilação de STAT5. Devido à afinidade de ligação reduzida para o heterodímero IL-2R f3/y necessária para sinalização, a potência de indução de fosforilação de STAT5 foi reduzida para um fator de aproximadamente 1O ou mais, em comparação a IL-2 (Proleucina). Entretanto, a eficácia geral em altas doses foi mantida e comparável a IL-2 (Proleucina).

LIBERAÇÃO DE IFN-y E INDUÇÃO DE PROLIFERAÇÃO EM SOLUÇÃO E MEDIANTE

IMOBILIZAÇÃO Em outro experimento nós buscamos imitar a situação como ocorreria em um tumor, onde o imunoconjugado IL-2 é ligado e imobilizado nas células tumorais ou tumor de estroma e podem ativar as células efetoras. Para fazer isso, nós realizamos o teste de liberação de IFN-y com células NK92, bem como um teste de proliferação com os imunoconjugados em solução ou 5 nós revestimos as placas de microtitulação com antígenos TNC ou FAP, de modo que os imunoconjugados direcionados a IL-2 fossem imobilizados mediante ligação a TNC ou FAP.

2 IJg/ml de Tenascina humana ou FAP foram revestidos durante a noite a 4 oc em placas de 96 poços de fundo plano ELISA. Após bloqueio da placa, os constructos Fab-IL2-Fab foram titulados nas placas e incubados por 90 min em RT para ligação. Após lavagem intensa para remover os constructos não ligados, células NK92 subalimentadas com IL- 2 (1 0000 células/poço) foram adicionadas. Como controle positivo, Proleucina foi adicionada na solução em alguns poços. Para determinação de proliferação, as células foram incubadas por 2 dias a 37 oc em um incubador umidificado (com 5% de C0 2 ) antes da lise das células para determinar a proliferação por medição de ATP usando-se CeiiTiter Glo Kit (Promega). A liberação de IFN-y foi medida em uma abordagem separada após 24 h de incubação com Fab-IL-2-Fab no sobrenadante das células com o Kit IFN-y ELISA da Becton Dickinson.

Os resultados confirmaram que todos os constructos Fab-IL2- Fab que direcionam FAP, TNC A1 ou TNC A2 foram capazes de ativar a sinalização de IL-2R nas células NK92 e induzir a proliferação (Figura 38A) das células, bem como secreção de IFN-y (Figura 38C) quando presente na solução. Devido à afinidade de ligação reduzida para o heterodímero IL- 2R ~/y necessária para sinalização, a potência de indução de liberação de IFN-y foi reduzida para um fator de aproximadamente 1O ou mais, em comparação a IL-2 (Proleucina). Entretanto, a eficácia geral em altas doses foi mantida e comparável a IL-2 (Proleucina). Se as placas de microtítulo eram revestidas com FAP ou TNC e os constructos imobilizados nas placas, todos os constructos Fab-IL2-Fab que direcionam FAP, TNC A1 ou TNC A2 eram ainda capzes de ativar a sinalização de IL-2R nas células 5 NK92 e induzir o crescimento celular (Figura 388) e liberação de IFN-y (Figura 380). Em comparação ao teste realizado na solução, a diferença de eficácia entre IL-2 (Proleucina não revestida) e os constructos Fab-IL2- Fab foi de ordem de magnitude maior, entretanto, a eficácia geral em doses mais altas foi mantida e comparável a IL-2 (Proleucina).

Estes dados sustentam fortemente o conceito de gerar imunoconjugados direcionados com baixa exposição sistêmica, mas acúmulo no local da doença onde eles podem mediar suas funções.

No exemplo a seguir nós investigamos se essas propriedades in vitro se traduzem em eficácia superior nos modelos de xenoenxerto in vivo. EXEMPLO 19 EFICÁCIA IN VIVO DE IMUNOCONJUGADOS FAB-Il2-FAB CONTRA FAP E TNC A2 EM

XENOENXERTOS DE LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS lmunoconjugados Fab-IL2-Fab direcionados contra FAP e TNC A2 foram testados para sua eficácia antitumoral em diversos modelos de xenoenxerto.

MODELO DE XENOENXERTO l5174T O imunoconjugado 2810 Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 foi testado na linhagem celular colorretal humana LS174T, injetado de modo intraesplênico em camundongos SCID.

Células LS174T (células de carcinoma de cólon humano) foram originalmente obtidas junto a ECACC (Coleção Européia de Cultura Celular) e após expansão, depositadas no banco interno de células da Glycart.

LS174T foram cultivadas em meio de Eagle MEM contendo 10% de FCS

(PAA Laboratories, Áustria), 1% de Glutamax e 1% de MEM Aminoácidos Não-Essenciais (Sigma). As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada de água a 5% de C0 2 . A passagem 15 in vitro foi usada para injeção intresplênica, a uma viabilidade de 92,8%. Uma pequena 5 incisão foi feita à esquerda no abdômen de camundongos SCID/bege 6 anestesiados. Cinquenta micro litros de suspensão celular (3 x 10 células LS174T em meio AimV) foram injetados através da parede abdominal exatamente abaixo da cápsula do baço. As feridas na pele foram fechadas usando-se grampos.

Camundongos SCID fêmeas, com idade entre 8 e 9 semanas no início do experimento (adquiridas junto à Taconics, Dinamarca) foram mantidas mediante condições livres de patógeno específico com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão, de acordo com as diretrizes de comprometimento (GV- Solas; Felasa; TierschG). O protocolo de estudo do experimento foi revisado e aprovado pelo governo local (P 2008016). Após chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se adaptarem ao novo ambiente e para observação. O monitoramento contínuo da saúde foi realizado em uma base regular.

Os camundongos foram injetados de modo intraesplênico no dia O do estudo com 3 x 106 células LS174T, randomizados e pesados. Uma semana após a injeção de células tumorais, os camundongos foram injetados i.v. com 2810 Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 (Fab-IL2-Fab-SH2B10), diacorpo L19 IL-2 direcionado a EDB de Fibronectina ou Proleucina duas vezes por semana por três semanas.

Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 !JI da solução apropriada. Os camundongos no grupo de veículo foram injetados com PBS e os grupos de tratamento com o constructo Fab-IL2-Fab, o diacorpo ou proleucina. Para se obter a quantidade apropriada de imunoconjugado por 200 !JI, a solução estoque foi diluída com PBS quando necessário.

A Figura 39 mostra que o imunoconjugado 281 O Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 mediou eficácia superior em termos de 5 sobrevivência média aumentada, em comparação a IL-2 nu (Proleucina) e à molécula de diacorpo IL-2 que direciona EDB de fibronectina.

TABELA 21 Concentração Composto Dose Formulação tampão (mg/ml) 20 mM de citrato de sódio, 2,00 12 diacorpo L 19 IL-2 190 mM de sacarose, (=solução 1-19 20 mM de ar9inina, estoque) pH 6,5 manitol 1.0 Proleucina (IL-2) 4 1-19 lauril sulfato de sódio (=solução fosfato de sódio esto_gue) 25 mM de fosfato de potássio, 1,86 huTNC A2 281 O (G65S) Fab-IL2-Fab 16 125 mM de NaCI, (=solução = SH2B10 1-19 100 mM de 9licina, estoque) pH 6,7

MODELO DE XENOENXERTO ACHN Os imunoconjugados 3F2 direcionado a FAP ou 4GB Fab-IL2-Fab foram testados na linhagem celular renal humana ACHN, injetado de modo intraesplênico em camundongos SCID.

Células ACHN (células de adenocarcinoma renal humano) foram originalmente obtidas junto a ATCC (Coleção Americana de Cultura Celular) e após expansão, depositadas no banco interno de células da Glycart. ACHN foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FCS. As células foram cultivadas a 37 oc em uma atmosfera saturada de água a 5% de C0 2 . A passagem 9 in vitro foi usada para injeção intrarenal, a uma viabilidade de 97,7%. Uma pequena incisão (2 em) foi feita no flanco direito e na parede peritoneal de camundongos SCID anestesiados. Cinquenta !JI (1x10 6 de células ACHN em meio AimV) de suspensão celular foram injetados 2 mm de modo subcapsular no rim. As feridas na pele e na parede peritoneal foram fechadas usando-se grampos.

Camundongos SCID fêmeas, com idades entre 8 e 9 semanas no início do experimento (adquiridos junto à Charles River, Sulzfeld, Alemanha) 5 foram mantidas mediante condições livres de patógeno específico com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão, de acordo com as diretrizes de comprometimento (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo de estudo do experimento foi revisado e aprovado pelo governo local (P 2008016). Após chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se adaptarem ao novo ambiente e para observação. O monitoramento contínuo da saúde foi realizado em uma base regular.

Os camundongos foram injetados de modo intrarenal no dia O do estudo com 1 x 106 células ACHN, randomizados e pesados. Uma semana após a injeção das células tu morais, os camundongos foram injetados i. v. com diacorpo L 19 IL-2 ou imunoconjugados 4G8 ou 3F2 Fab-IL2-Fab direcinados a FAP duas vezes por semana durante três semanas.

Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 1-JI da solução apropriada. Os camundongos no grupo de veículo foram injetados com PBS e os grupos de tratamento com Proleucina, diacorpo L19 IL-2 ou imunoconjugados 4G8 ou 3F2 Fab-IL2-Fab direcionados a FAP. Para se obter a quantidade apropriada de imunoconjugado por 200 1-JI, a solução estoque foi diluída com PBS quando necessário.

A Figura 40 mostra que os imunoconjugados 3F2 e 4G8 Fab-IL2- Fab direcionado a FAP mediou eficácia superior em termos de sobrevivência média aumentada, em comparação a IL-2 nu (Proleucina) e à molécula de diacorpo IL-2 que direciona EDB de fibronectina. O Fab-IL2-Fab com base em 4G8, que tem uma maior afinidade para FAP murino, mediou eficácia superior do que Fab-IL2-Fab com base em 3F2.

TABELA 22 Concentração Composto Dose Formulação tampão (mg/ml) 20 mM de citrato de sódio, 2,00 190 mM de sacarose, diacorpo L19 IL-2 12 1-19 (=solução 20 mM de arginina, estoque) pH 6,5 manitol 1,O Proleucina (IL2) 4 1-19 lauril sulfato de sódio (=solução fosfato de sódio estoque) 25 mM de fosfato de potássio, 2,46 FAP 3F2 Fab-IL2-Fab = FAP 16 1-19 125 mM de NaCI, (=solução 3F2 100 mM de 9licina, estoque) pH 6,7 25 mM de fosfato de potássio, 11.8 FAP 4G8 Fab-IL2-Fab = FAP 16 1-19 125 mM de NaCI, (=solução 4GB 100 mM de 91icina, estoque) pH 6,7 MODELO DE XENOENXERTO A549 O imunoconjugado 281 O Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 foi testado na linhagem celular A549 de NSCLC humana, injetado i.v. em 5 camundongos transgênicos FcyRIII com SCID humana.

As células de carcinoma de pulmão de células não pequenas A549 foram originalmente obtidas de ATCC (CCL-185) e após a expansão depositada no banco de células interno da Glycart. A linhagem de células tu morais foi rotineiramente cultivada em DMEM contendo 10% de FCS (Gibco) a 37 °C em uma atmosfera saturada de água em 5% de C0 2 . A passagem 2 foi usada para o transplante, em uma viabilidade de 98%. Foram injetadas i.v. na veia da cauda 2 x 106 células por animal em 200 1-JI de meio de cultura celular Aim V (Gibco).

Camundongos SCID-FcyRIII fêmeas (GLYCART-RCC), com idades entre 8 e 9 semanas no início do experimento (criados por RCC, Suíça) foram mantidos sob condição livre de patógeno específico com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com diretrizes de comprometimento

(GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (P 2008016). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumar ao novo ambiente e para observação. Foi realizado monitoramento de saúde contínuo regularmente.

5 Os camundongos foram injetados i.v. no dia O de estudo com 5 x 10 6 de células A549, randomizadas e pesadas. Uma semana após a injeção das células tumorais, os camundongos foram injetados i.v. com diacorpo 281 O Fab-IL2-Fab ou L 19 IL-2 duas vezes por semana durante três semanas.

Todos os camundongos foram injetados i.v. com 200 !JI da solução apropriada. Os camundongos no grupo de veículos foram injetados com P8S e o grupo de tratamento com o constructo 281 O Fab-IL2-Fab ou o diacorpo L 19 IL-2. Para obter a quantidade adequada de imunoconjugado por 200 !JI, as soluções estoque foram diluídas com P8S, quando necessário.

A Figura 41 mostra que o imunoconjugado 281 O Fab-IL2-Fab direcionado a TNC A2 mediou eficácia superior em termos de sobrevivência mediana aprimorada em comparação a molécula de diacorpo IL-2 que direciona ED8 de fibronectina.

TABELA 23 Concentração Composto Dose Formulação tampão (mg/ml) 20 mM de citrato de sódio, 2,00 diacorpo L 19 I L-2 12 1-19 190 mM de sacarose, (=solução 20 mM de ar9inina, estoque) pH 6,5 25 mM de fosfato de potássio, 1,86 huTNC A2 2810 (G65S) Fab-IL2- 16 1-19 125 mM de NaCI, (=solução Fab = 2810 100 mM de 9licina, estoque) pH 6,7

EXEMPLO 20 PURIFICAÇÃO DE IMUNOCONJUGADO FAB-GM-CSF-FAB DIRECIONADO A GM-CSF A purificação inicial do imunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab com L 19 (ligante de ectodomínio B de fibronectina) como fragmento Fab foi 5 executada a partir de sobrenadantes de células HEK 293 de EBNA transfectadas temporariamente. Resumidamente, Fab-IFNa2-Fab foi purificado por proteína A seguido por cromatografia de exclusão por tamanho. A coluna de Proteína A foi equilibrada em 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5. O sobrenadante foi carregado e a coluna lavada primeiro com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5, seguido por 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, pH 7,5. GM-CSF direcionado foi eluído com 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 3 e posteriormente neutralizado. Para a formulação o seguinte tampão foi aplicado: 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 6,7.

A Figura 42 mostra os perfis de eluição da purificação e os resultados da caracterização analítica do produto por SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não- reduzido). O rendimento foi de 4,8 mg/1.

EXEMPLO 21 ENSAIO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA COM IMUNOCONJUGADO FAB-GM-CSF-FAB DIRECIONADO A GM-CSF O imunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab purificado com L 19 (ligante de fibronectina ectodomínio-B) como Fab foi analisado de modo subsequente em um ensaio de proliferação dependente de GM-CSF. Resumidamente, células TF-1, que crescem dependente de GM-CSF, foram semeadas durante a noite após inanição em 10.000 células/poço em uma placa de 96 poços de fundo plano. GM-CSF recombinante humana (Miltenyi #130-093-862) ou imunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab foram titulados sobre as células em solução. Após 2 dias de proliferação a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de C0 2 , as células foram lisadas e o conteúdo de ATP foi medido com 5 o ensaio CeiiTiter Glo da Promega. As células não tratadas de GM-CSF foram ajustadas como 0% de crescimento para o cálculo. Os resultados na Figura 43 mostram que o imunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab induziu forte proliferação de células TF-1.

EXEMPLO 22 PURIFICAÇÃO DE IMUNOCONJUGADO FAB-Il 12-FAB DIRECIONADO A ll-12 A purificação inicial do imunoconjugado Fab-IL 12-Fab com 4GB (ligante FAP) como fragmento Fab foi executada a partir de sobrenadantes de células HEK 293 de EBNA transfectadas temporariamente. Resumidamente, Fab-IL 12-Fab foi purificado por proteína A seguido por cromatografia de exclusão por tamanho. A coluna de proteína A foi equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5. O sobrenadante foi carregado e a coluna foi lavada com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio pH 7,5. Uma segunda lavagem foi executada com 13,3 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio pH 5,45. Após uma terceira lavagem com 1O mM de MES, 50 mM de cloreto de sódio pH 5, IL-12 direcionada foi eluída com 20 mM de citrato de sódio, 1OOmM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina, pH 3 e posteriormente neutralizada. Para a formulação o seguinte tampão foi aplicado: 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 6,7.

A Figura 44 mostra os perfis de eluição da purificação e os resultados da caracterização analítica do produto por SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não-

reduzido). O rendimento foi de 43 mg/1.

EXEMPLO 23 ENSAIO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA COM IMUNOCONJUGADO FAB-Il 12-FAB DIRECIONADO A ll-12 5 O imunoconjugado Fab-IL 12-Fab purificado com 4G8 (ligante FAP) como Fab foi posteriormente analisado para IL-12 induzida por liberação de IFN-y, que compara o efeito de IL-12 e do imunoconjugado Fab-IL 12-Fab purificado com 4G8, usando-se PBMCs isolados a partir de sangue humano fresco de um doador saudável.

Resumidamente, PBMCs foram isoladas do sangue humano fresco de um doador saudável e semeadas em uma placa de 96 poços de 5 fundo em U (1 ,5 x 10 células/poço) em meio AIM V. Foi adicionado a todos os poços uma concentração constante de 1O ng/ml de IL-2 hu (Peprotech). O constructo Fab-IL 12-Fab foi diluído em meio e titulado sobre as PBMCs. Os sobrenadantes foram coletados após aproximadamente 20 horas para determinar as concentrações de IFN-y usando-se o hu IFN-y ELISA Kit 11 da Becton Dickinson (#550612).

Os resultados na Figura 45 mostram que A) a quantidade escolhida de IL-2 humana (hu) sozinha, bem como IL-12 sozinha não foram capazes de induzir liberação de IFN-y significativa de PBMCs humanas enquanto que a combinação de ambas as citocinas levaram a liberação significativa de IFN-y por PBMCs. B) o constructo Fab-IL-12-Fab induziu liberação de IFN-y por PBMCs humanas de uma maneira dependente da concentração na presença de 1O ng/ml de IL-2 humana.

EXEMPLO 24 PURIFICAÇÃO DE IMUNOCONJUGADO FAB-IFNA2-FAB DIRECIONADO A IFN-A A purificação inicial do imunoconjugado Fab-IFNa2-Fab com L19 (ligante de ectodomínio B de fibronectina) como fragmento Fab foi executada a partir de sobrenadantes de células HEK 293 de EBNA transfectadas temporariamente. Resumidamente, Fab-IFNa2-Fab foi purificado por proteína A seguido por cromatografia de exclusão por tamanho. A coluna de proteína A foi equilibrada em 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5. O 5 sobrenadante foi carregado e a coluna lavada primeiro com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5, seguido por 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, pH 7,5. Fab- IFNa2-Fab foi eluído com 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 3 e posteriormente neutralizado. Para a formulação o seguinte tampão foi aplicado: 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 6,7.

A Figura 46 mostra os perfis de eluição da purificação e os resultados da caracterização analítica do produto por SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não- reduzido). O rendimento foi de 8,4 mg/1.

EXEMPL025 ENSAIO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA COM IMUNOCONJUGADO FAB-IFNA2-FAB COM IFN-A O imunoconjugado Fab-IFNa2-Fab purificado com L19 (ligante de ectodomínio B de fibronectina) como Fab foi posteriormente analisado por inibição de proliferação induzida por IFN-a de células T Jurkat e células tumorais A549 que comparam o efeito de IFN-a (Roferon A, Roche) e do imunoconjugado Fab-IFNa2-Fab purificado com L19. Resumidamente, as células A549 e T Jurkat que são suscetíveis a inibição da proliferação induzida por IFN-a foram semeadas em 5000 células/poço (A549) ou 10.000 células/poço (Jurkat) em placas de 96 poços de fundo plano. Diluições de Roferon A (Roche) ou Fab-IFNa2-Fab no meio de cultura celular apropriado foram titulados sobre as células em solução. Após dois dias de proliferação a

37 oc em uma incubadora umidificada com 5% de C0 2 , as células foram lisadas e o conteúdo de ATP foi medido com o ensaio CeiiTiter Glo da Promega. As células não tratadas de IFN-a foram ajustadas como 0% de crescimento para o cálculo.

5 Os resultados na Figura 47 mostram que os constructos Fab- IFNa2-Fab inibiram a proliferação de A) células T Jurkat e B) células A549 de uma maneira dependente da concentração comparável ao IFN-a (Roferon A).

EXEMPLO 26 PREPARAÇÃO DE IMUNOCONJUGADOS FAB-Il2-FAB DIRECIONADOS A MCSP O anticorpo MHLG humanizado anti-MCSP foi gerado conforme descrito no documento WO 2006/1 00582 (consulte, em particular o Exemplo 1 neste), o conteúdo completo deste é incorporado ao presente pedido como referência, e convertidos para o formato Fab-IL2-Fab (consulte SEQ 10 NOs: 255, 256, 261' 262).

O anticorpo MHLG1 anti-MCSP foi gerado como segue: A sequência de aminoácidos murino do anticorpo anti-MCSP 225.28 (cadeia leve e cadeia pesada, consulte abaixo) foi alinhada a uma coleção de genes V de anticorpo de linhagem germinativa humana, e classificada de acordo com a identidade de sequência e homologia.

cadeia leve 225.28; número de acesso no GenBank CAA65007 (SEQ 10 267):

OIELTQSPKFMSTSVGORVSVTCKASQNVOTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSAS YRYTGVPORFTGSGSGTOFTLTISNVQSEOLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKL

EIK cadeia pesada 225.28; número de acesso no GenBank não disponível (SEQ 10 268):

QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCWSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEI RLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNY

VGHYFDHWGQGTTVTVSS A sequência aceitante potencial foi selecionada com base na alta homologia geral, e na presença de resíduos regulares corretos já na sequência 5 aceitante. A sequência de linhagem germinativa humana IGHV3-15 (número de acesso IMGT X92216) foi escolhida como aceitante para sequência da cadeia pesada e a sequência IGKV1-9 (número de acesso IMGT Z00013) foi escolhida para a cadeia leve. Os constructos foram denotados M-KV1 (consulte SEQ 10 NOs: 263, 264, 269, 270}, 7 (SEQ lO NOs: 265, 266, 271, 272) e 9 (SEQ lO NOs: 253, 254, 259, 260) para a cadeia leve e MHLG1 (consulte SEQ 10 NOs: 251, 252, 257, 258) para a cadeia pesada.

Os genes para as sequências de anticorpos designados foram gerados por técnicas convencionais de PCR e fundidos aos domínios constantes kappa e lgG1 humano para a construção dos plasmídeos de expressão.

Os anticorpos foram expressos tanto como lgG como proteínas de fusão Fab-IL2-Fab em sistemas de cultura celular de mamíferos HEK ou CHO, e purificados através de cromatografia por exclusão de tamanho e proteína A.

A comparação ddos dados de ligação de variantes da cadeia leve M-KV1 e M- KV7 revelaram que um resíduo de prolina na posição 46 de Kabat é essencial para a ligação funcional ao antígeno. Duas abordagens diferentes foram tomadas para assegurar a presença desse aminoácido: A) A chamada mutação reversa foi introduzida na estrutura humana de IGKV1-9. e 8) Para evitar a presença de mutações reversas, a região 2 de estrutura inteira (posições 35 a 49 de Kabat) foi trocada pela região correspondente do anticorpo humano com entrada AAA 17574 no GenBank. Esse anticorpo tem naturalmente um resíduo de prolina na posição 46.

MHLG ou MHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab direcionado a MCSP foi purificado pelo método descrito acima (Exemplo 9) composto por uma etapa de afinidade (proteína A), seguido por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare). A coluna de proteína A foi equilibrada em 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio pH 7,5, o sobrenadante foi 5 carregado e a coluna foi lavada com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, pH 7,5, seguido por uma lavagem com 13,3 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, pH 5,45. Foi opcionalmente incluída uma terceira lavagem com 1O mM de MES, 50 mM de cloreto de sódio pH 5. Fab-IL2-Fab foi eluído com 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina, pH 3. As frações eluídas foram agrupadas e refinadas por cromatografia de exclusão por tamanho na formulação tampão final: 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina pH 6,7.

A FIGURA 48 (para MHLG Fab-IL2-Fab) e a Figura 49 (para MHLG1 Fab-IL2-Fab) mostra (A) os perfis de eluição da purificação e (8) os resultados da caracterização analítica do MHLG ou MHLG1 Fab-IL2-Fab direcionado a MCSP por SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, lnvitrogen, tampão de corrida MOPS, reduzido e não-reduzido).

EXEMPLO 27 ENSAIO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA COM IMUNOCONJUGADOS FAB-Il2-FAB

DIRECIONADOS A MCSP Os imunoconjugados Fab-IL2-Fab purificados com MHLG KV9 ou MHLG1 KV9 (ligantes MCSP) como Fab foram posteriormente analisados para liberação de IFN-y induzida por IL-12, que compara o efeito de Fab-IL2-Fab purificado com 4G8 (ligante FAP) e Fab-IL2-Fab MHLG ou MHLG1 em células NK92.

Células NK92 subalimentadas com IL-2 (pré-incubada por 2 horas sem IL-2) foram semeadas em 96 poços de placas de fundo em U (10 5 células/poço) em meio de célula NK (MEMa + 10% de FCS + 10% de soro de cavalo+ O, 1 mM de 2-mercaptoetanol + 0,2 mM de inositol + 0,02 mM de ácido fólico). Os imunoconjugados Fab-IL-2-Fab direcionados a MCSP foram diluídos em meio de célula NK e titulados sobre células NK92 em comparação direta com o imunoconjugado Fab-IL2-Fab com base em 4G8 direcionado a FAP. Os 5 sobrenadantes foram coletados após 22 a 24 horas para determinar as concentrações de IFN-y usando-se o IFN-y ELISA Kit 11 humano da Becton Dickinson (#550612).

Os resultados na Figura 50 (para Fab-IL2-Fab MHLG KV9) e Figura 51 (para Fab-IL2-Fab MHLG1 KV9) mostram que todos os imunoconjugados Fab-IL2-Fab, direcionados contra MCSP ou FAP, induziram secreção IFN-y comparável em células NK92 de uma maneira dependente da concentração, independente do componente que se liga ao antígeno utilizado.

EXEMPLO 28 ENSAIO DE LIGAÇÃO CELULAR COM IMUNOCONJUGADO FAB-ll2-FAB MHLG1 KV9

DIRECIONADO A MCSP O imunoconjugado Fab-IL2-Fab MHLG1-KV9 direcionado a MCSP purificado foi testado por citometria de fluxo para ligação com células de melanoma Colo38 que expressam MCSP humano. Resumidamente, as células foram coletadas, contadas e verificadas quanto a viabilidade. As células foram ajustadas para 1,112 x 106 células/ml (viável) em PBS/0, 1% BSA e alíquotas de 180 !JI/poço (200.000 células/poço) em uma placa de 96 poços de fundo redondo. 20 !JI de imunocitocina Fab-IL2-Fab MHLG1 KV9 (em diferentes diluições) foi adicionada à poços que contém células e incubadas por 30 min a 4 °C. As células foram posteriormente coletadas por centrifugação (4 min, 400 x g), lavadas com 150 IJI/poço PBS/0, 1% BSA, ressuspensas e incubadas por 30 min a 4 °C com 12 IJI/poço de anticorpo secundário (F(ab')2 de cabra anti- humano fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado a FITC) (Jackson lmmuno Research Lab #1 09-096-097), dissolvido em 1,5 ml de uma mistura 1:1 de água e glicerol = solução estoque), diluído 1: 20 em BSA PBS/0, 1%. As células foram posteriormente lavadas em 150 ~l/poço PBS/0, 1% BSA, seguido por uma etapa de lavagem em PBS, coletadas por centrifugação (4 min, 400 x g), e ressuspensas com 200 ~l/poço PBS/0, 1% BSA contendo iodeto de propídio 5 (PI). As medidas foram executadas usando-se uma máquina FACSCantoll (Software FACS Diva). Os resultados são apresentados na Figura 52, que mostra que o imunoconjugado Fab-IL2-Fab MHLG1 KV9 direcionado a MCSP muito bem ligado, de maneira dependente de dose, para células Colo38.

Estima-se que a seção Descrição Detalhada, e não a seção Sumário e Resumo se destina a ser usado para interpretar as reivindicações.

As seções Sumário e Resumo podem estabelecer um ou mais, mas não todas as realizações exemplares da presente invenção como contemplado pelo(s) inventor(es) e, portanto, não se destinam a limitar a presente invenção e as reivindicações anexas de forma alguma.

A presente invenção foi descrita acima, com a ajuda de blocos de construção funcionais que ilustram a implementação de funções especificadas e as relações do mesmo. Os limites desses blocos de construção funcionais têm sido arbitrariamente definidos no presente pedido para a conveniência da descrição. Limites alternativos podem ser definidos contanto que as funções especificadas e as relações do mesmo sejam adequadamente executadas.

A descrição disposta acima das realizações específicas irá portanto revelar completamente a natureza geral da invenção que outras pessoas podem, por aplicação do conhecimento dentro da habilidade na técnica, facilmente modificar e/ou adaptar para várias aplicações, tais realizações específicas, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Portanto, essas adaptações e modificações têm a intenção de estar dentro do significado e variação de equivalentes das reivindicações divulgadas, com base no ensinamento e orientação apresentados na presente invenção. É preciso entender que a fraseologia ou terminologia no presente pedido é para o propósito de descrição e não de limitação, de tal forma que a terminologia ou fraseologia da presente relatório descritivo é para ser interpretada por um técnico no assunto, em consideração com os ensinamentos e orientações.

A amplitude e o escopo da presente invenção não devem ser limitados por qualquer das realizações exemplares descritas acima, mas devem ser definidas apenas de acordo com as seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. IMUNOCONJUGADO, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pelo menos um primeiro componente efetor de cadeia 5 única; e (b) um primeiro e um segundo componente que se liga ao antígeno independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em uma Fv e uma Fab, em que o dito primeiro componente efetor compartilha uma ligação peptídica amino ou carboxi terminal com o dito primeiro componente que se liga ao antígeno; e em que o dito segundo componente que se liga ao antígeno compartilha uma ligação peptídica amino ou carboxi terminal tanto com (i) o dito primeiro componente efetor como com (ii) o dito primeiro componente que se liga ao antígeno.

2. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado consiste essencialmente em um primeiro componente efetor e um primeiro e segundo componentes que se ligam aos antígenos, unidos por uma ou mais sequências ligantes.

3. IMUNOCONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que cada um dos ditos primeiro e segundo componentes que se ligam aos antígenos são uma molécula Fab.

4. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dita primeira molécula Fab está unida pelo seu aminoácido carboxi terminal da cadeia pesada ou leve ao aminoácido amino terminal da cadeia pesada ou leve da segunda molécula Fab, e em que (i) a dita segunda molécula Fab está unida pelo seu aminoácido carboxi terminal da cadeia pesada ou leve ao aminoácido amino terminal do dito componente efetor, ou (ii) o dito componente efetor está unido pelo seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal da cadeia pesada ou leve da 5 dita primeira molécula Fab.

5. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita primeira molécula Fab está unida pela sua terminação carboxi da cadeia pesada ou leve ao aminoácido amino terminal do dito componente efetor, e o dito componente efetor está unido pelo seu aminoácido carboxi terminal ao aminoácido amino terminal da cadeia pesada ou leve da segunda molécula Fab.

6. IMUNOCONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as regiões variáveis dos ditos primeiro e segundo componentes que se ligam ao antígeno são específicas para o mesmo antígeno.

7. IMUNOCONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as regiões variáveis dos ditos primeiro e segundo componentes que se ligam ao antígeno são específicas para antígenos diferentes.

8. IMUNOCONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro e/ou o dito segundo componentes que se ligam ao antígeno são específicos para um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP), Proteoglicano Condroitina Sulfato de Melanoma (MCSP), domínio A2 de tenascina (TNC-A2), domínio A 1 de tenascina (TNC-A 1) e Domínio Extra B de fibronectina (EDB).

9. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro e/ou segundo componentes que se ligam ao antígeno são específicos para domínio A2 de tenascina (TNC-A2), e em que o dito imunoconjugado compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 5 7, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 203 e SEQ ID NO: 207, e uma sequência da região variável da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID N0:193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 205.

1O. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado compreende (i) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 5, (ii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 179 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 177, (iii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 183 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 181, (iv) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 187 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 185, (v) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 191 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 189, (vi) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 195 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 193, (vii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 199 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 197, (vi ii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 203 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 201, ou (ix) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 207 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 205.

11. IMUNOCONJUGAOO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado compreende a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 7 e a sequência da região 5 variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 5.

12. IMUNOCONJUGAOO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro e/ou segundo componentes que se ligam a antígeno são específicos para Proteína Ativada de Fibroblasto (FAP), e em que o dito imunoconjugado compreende a sequência da região variável da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO NO: 21, SEQ lO NO: 25, SEQ lO NO: 27, SEQ lO NO: 31, SEQ lO NO: 35, SEQ lO NO: 39, SEQ lO NO: 43, SEQ lO NO: 47, SEQ lO NO: 51, SEQ lO NO: 69, SEQ lO NO: 73, SEQ lO NO: 77, SEQ lO NO: 81, SEQ lO NO: 85, SEQ lO NO: 89, SEQ 10 N0:93, SEQ 10 NO: 123, SEQ 10 NO: 127, SEQ 10 NO: 131, SEQ 10 NO: 135, SEQ 10 NO: 139, SEQ 10 NO: 143, SEQ 10 NO: 147, SEQ 10 NO: 151, SEQ lO NO: 155, SEQ lO NO: 159, SEQ lO NO: 163, SEQ lO NO: 167, SEQ 10 NO: 171, e SEQ 10 NO: 175, e uma sequência da região variável da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 10 NO: 17, SEQ 10 NO: 19, SEQ 10 NO: 23, SEQ 10 NO: 29, SEQ 10 NO: 33, SEQ 10 NO: 37, SEQ 10 NO: 41, SEQ 10 NO: 45, SEQ 10 NO: 49, SEQ 10 NO: 67, SEQ lO NO: 71, SEQ 10 NO: 75, SEQ lO NO: 79, SEQ lO NO: 83, SEQ 10 NO: 87, SEQ 10 NO: 91, SEQ lO NO: 121, SEQ 10 NO: 125, SEQ 10 NO: 129, SEQ 10 NO: 133, SEQ 10 NO: 137, SEQ 10 NO: 141, SEQ 10 NO: 145, SEQ 10 NO: 149, SEQ 10 NO: 153, SEQ 10 NO: 157, SEQ 10 NO: 161, SEQ 10 NO: 165, SEQ 10 NO: 169, e SEQ 10 NO: 173.

13. IMUNOCONJUGAOO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado compreende (i) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 131 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 129, (ii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 163 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ lO NO: 161, (iii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 31 e a

5 sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 29, (iv) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 21 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 19, (v) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 25 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 23, (vi) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 35 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 33, (vii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 39 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 37, (viii) a sequência da região variável da cadeia pesada

SEQ 10 NO: 43 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO:

41, (ix) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 47 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 45, (x) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 51 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 49, (xi) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 69 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 67, (xii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 73 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 71, (xiii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO: 77 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10

NO: 75, (xiv) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO:

81 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 79, (xv) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ 10 NO 85 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ 10 NO: 83, (xvi) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 89 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 87, (xvii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 93 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 91, (xviii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 123 e a 5 sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 121, (xix) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 127 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 125, (xx) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 135 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 133, (xxi) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 139 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 137, (xxii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 143 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 141, (xxiii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 147 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 145, (xxiv), a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 151 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 149, (xxv) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 155 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 153, (xxvi) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 159 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 157, (xxvii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 167 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 165, (xxviii) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 171 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 169, ou (xxix) a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 175 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 173.

14. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 12,

caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado compreende a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 131 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 129.

15. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 12, 5 caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado compreende a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 163 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 161.

16. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado compreende a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 31 e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 29.

17. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro e/ou segundo componentes que se ligam ao antígeno são específicos para Proteoglicano Condroitina Sulfato de Melanoma (MCSP), e em que o dito imunoconjugado compreende a sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 257 ou SEQ ID NO: 261, e a sequência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 259 ou SEQ ID NO: 271.

18. IMUNOCONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado possui somente um componente efetor; e em que o dito componente efetor é uma citocina.

19. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a dita citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em: interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônia de macrófagos granulócitos (GM-CSF), interferon-a (IFN-a), e interleucina-12 (IL- 12).

20. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 18, caraterizado pelo fato de que a dita citocina é IL-2.

21. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que codifica um fragmento do imunoconjugado, conforme defino em uma das 5 reivindicações 1 a 5, em que o dito polinucleotídeo codifica (i) as cadeias pesadas dos ditos primeiro e segundo componentes que se ligam ao antígeno e o dito primeiro componente efetor; (ii) as cadeias leves dos ditos primeiro e segundo componentes que se ligam ao antígeno e o dito primeiro componente efetor; ou (iii) uma cadeia leve do dito primeiro componente que liga ao antígeno, uma cadeia pesada do dito segundo componente que se liga ao antígeno e o dito primeiro componente efetor.

22. MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleitídeo, conforme definido na reivindidação

21.

23. MÉTODO PARA PRODUZIR O IMUNOCONJUGADO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivar um microorganismo transgênico, conforme definido na reivindicação 22, mediante condições adequadas para expressão do imunoconjugado.

24. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado, conforme definido em uma das reivindidações 1 a 20, e um veículo farmacêutico.

25. USO DO IMUNOCONJUGADO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para produzir um medicamento para tratar doença em um paciente que necessite dele.

26. USO DA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que é para produzir um medicamento para tratar doença em um paciente que necessite dele.

27. USO, de acordo com uma das reivindicações 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a dita doença é câncer.

28. IMUNOCONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para tratar uma doença em um paciente que necessite dele.

29. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a dita doença é câncer.