CN105143271A - 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过在亲本抗体或抗体片段的恒定区中利用半胱氨酸替换至少一个天然氨基酸而修饰抗体或抗体片段的特定位点，所述半胱氨酸可以用作有效载荷或接头-有效载荷组合的附着位点。

Description

用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
发明领域
由于抗体用于多种治疗应用的重要性，需要稳健方法以选择性修饰抗体来引入改善的性质或额外的功能。本发明提供用于向抗体附着部分的特定位点用于制备经修饰抗体，如用于制备抗体-药物缀合物(ADCs)。选择性缀合位点定位于抗体的恒定区并因此用于多种抗体。
发明背景
用于修饰抗体的方法的价值是众所周知的，并且已经开发了用于缀合抗体以附着多种“有效载荷”部分的许多方法。许多这些方法依赖于抗体上特定反应性氨基酸残基，如赖氨酸和半胱氨酸(其可以用于附着有效载荷)的天然存在。然而，依赖于天然氨基酸不总是想要的，因为所附着的有效载荷的位置和量取决于这些反应氨基酸的数量和位置：太多或太少此类残基使得难以有效控制有效载荷在抗体上的装载。此外，反应氨基酸的放置可能使得难以得到完整的缀合，在缀合过程中产生异质性产物。药物活性成分的异质性例如通常是不想要的，因为其加剧了向受试者的异质群体施用药物的不可预知性：其更优选施用同质产物，并且完全表征并预测异质产物的行为难得多。细胞毒性药物通过例如改造的半胱氨酸残基位点特异性缀合抗体产生同质的免疫缀合物，其展示改善的治疗指数(Junutula等,(2008)NatBiotechnol.26(8):925-932))。
已经改造了抗体以在特定位置上添加某些残基，像半胱氨酸，在所述特定位置中这些残基可以用于缀合(Lyons等,(1990)ProteinEng.,3:703-708)，但是特定取代的价值根据某些抗体可以变化，因为改造的半胱氨酸可能干扰抗体的折叠和适当分子内二硫键的氧化(Voynov等,(2010)Bioconjug.Chem.21(2):385-392)。
因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的改造的半胱氨酸在其生物合成过程中通过与谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸的二硫键被修饰(Chen等(2009)mAbs1:6,563-571)，所以最初表达的抗体药物缀合物中的修饰的半胱氨酸不与巯基反应试剂反应。激活改造的半胱氨酸需要还原GSH和/或半胱氨酸加合物(其通常导致抗体的所有链间二硫键被还原)，随后在缀合之前再氧化和再形成天然的链间二硫键(Junutula等,(2008)Nat.Biotechnol.26(8):925-32)。其中已经插入了半胱氨酸的一些位点干扰再氧化过程，接着产生不想要的非同质缀合产物。因而重要的是鉴定抗体上的位点，其中所引入的半胱氨酸在与巯基反应试剂如马来酰亚胺或溴代、氯代或碘代乙酰胺基团缀合之前不干扰再氧化过程。
半胱氨酸残基与溴代乙酰胺、碘代乙酰胺或氯代乙酰胺的缀合导致形成稳定的硫醚连接。(Alley等,(2008)BioconjugChem.19(3):759-65)。然而，化学作用不如马来酰亚胺缀合化学作用有效。因为当将有效载荷或接头附着到半胱氨酸上时，形成该巯基-马来酰亚胺连接是待使用的受欢迎且高度有效的方法，所以需要鉴定抗体上的半胱氨酸取代位点，在所述位点可以使用马来酰亚胺连接。更重要的是，位点特异性缀合的免疫缀合物可以展示改善的治疗指数，因此仍然需要鉴定特定的特权位点用于抗体中的半胱氨酸取代，其使得能够将有效载荷缀合到抗体上以有效地形成，并且提供具有高稳定性的缀合物。本发明提供该特权半胱氨酸取代位点(其为缀合目的产生改善的抗体)和包含此类改善的抗体的免疫缀合物。
发明概述
本发明在抗体或抗体片段的恒定区中提供特定位点，在所述抗体或抗体片段上可以进行亲本抗体或抗体片段上的天然氨基酸的半胱氨酸(“Cys”)取代，以提供Cys残基用于附着化学部分(例如，有效载荷/药物部分)来形成具有良好效力和稳定性的免疫缀合物。本发明还提供在这些特定位点中的一个或多个中具有一个或多个Cys残基的改造的抗体或抗体片段，以及从该改造的抗体或抗体片段制备的免疫缀合物。
用于在抗体的特定位置上插入Cys的方法为本领域所知，参见例如WO2011/005481。然而，本发明公开了抗体或抗体片段的恒定区中的特定位点，其中利用Cys替换亲本抗体或抗体片段的一个或多个天然氨基酸提供了一个或多个以下优点：良好的反应性以促进有效的免疫缀合；当使用Cys-马来酰亚胺缀合接头时丢失有效载荷的倾向降低；在抗体之间形成不想要的二硫键，如交联或形成非天然分子内二硫键的倾向降低；和所得ADC的低疏水性。
选择用于亲本抗体或抗体片段的恒定区中的天然氨基酸的Cys替换的特定特权位点以提供有效缀合，同时使不想要的影响最小化。首先，选择用于修饰的特定位点，从而在一个或多个所选位置中替换亲本抗体或抗体片段的天然氨基酸提供在新的半胱氨酸上容易缀合的抗体或抗体片段。选择特定位置成为充分表面可及的以允许半胱氨酸残基的巯基与水溶液中的亲电子试剂反应。鉴定用于Cys替换亲本抗体或抗体片段的天然氨基酸的合适位点涉及基于晶体结构数据分析天然氨基酸的表面暴露。因为本文所述的位点充分地可及并且是反应性的，所以它们可以通过本领域所熟知用于修饰天然发生的半胱氨酸残基的化学作用用于形成免疫缀合物。替换Cys残基的缀合因此使用常规方法。
当巯基-马来酰亚胺部分用于缀合时，所选的修饰位点可以显示用于反转缀合的低倾向。巯基-马来酰亚胺缀合反应经常是高度选择性的并且极其有效的，并且可以用于将有效载荷附着到蛋白质的半胱氨酸残基的巯基上或在其他地方在蛋白质和有效载荷之间的连接中用作接头。例如，马来酰亚胺可以附着到蛋白质上(例如抗体或抗体片段)，并且具有附着的巯基的有效载荷可以添加到马来酰亚胺上以形成缀合物：
因此，在该缀合步骤中，蛋白质(例如抗体或抗体片段)可以是单环的或双环的；另一个代表有效载荷。本文的免疫缀合物稳定性信息特异地涉及取代的半胱氨酸通过与马来酰亚胺基团反应的缀合。在一些实施方案中，巯基来自蛋白质(例如抗体或抗体片段)上的半胱氨酸，所以双环代表蛋白质，单环代表有效载荷。
虽然巯基-马来酰亚胺反应经常用于制备缀合物，但是如下文所述的缀合步骤的反转可以导致有效载荷的丢失或有效载荷与其他含巯基种类的混乱：
已经报道了用于半胱氨酸取代的一些位点比其他位点提供更稳定的马来酰亚胺缀合物，推测因为新半胱氨酸周围的抗体表面上的某些点上的局部化学环境可以促进琥珀酰亚胺环的水解并因此阻止免疫缀合物中巯基-马来酰亚胺连接的反转(Shen等(2012),Nat.Biotechnol.30(2):184-9)。鉴定有利位点用于满足该标准涉及插入Cys代替具有合适表面暴露的许多天然氨基酸、制备含有巯基-马来酰亚胺连接的免疫缀合物，和评估免疫缀合物的稳定性以去除其中缀合物的稳定性被去稳定位点周围的局部微环境降低的位点。基于此，可以用于将接头和有效载荷附着到替换Cys残基上的化学方法不受与上文讨论的巯基-马来酰亚胺缀合物的可反转性相关的稳定性问题的限制。许多方法可以用于在半胱氨酸上形成缀合物，包括马来酰亚胺缀合。当使用最常用缀合方法之一时，本文所述用于半胱氨酸取代的位点促进抗体缀合物产物的稳定性，使得这些位点有利于抗体改造，因为修饰的抗体可以用于众所周知的并且高度有效的马来酰亚胺缀合方法。通过表22和实施例9中给出的数据阐明基于该标准的位点选择。
可以定位所选位点，从而使不想要的二硫化物形成(其可能干扰同质缀合物的形成)最小化。当含有改造的半胱氨酸的抗体或抗体片段在哺乳动物细胞中产生时，Cys残基通常作为与游离Cys氨基酸或谷胱甘肽的二硫化物而存在(Chen等,(2009)mAbs16,353-571)。为了释放Cys残基用于与巯基反应基团缀合，抗体或抗体片段需要被还原，破坏所有的二硫键。然后在促进天然二硫化物形成(其稳定抗体或抗体片段)的条件下再氧化抗体或抗体片段。再氧化后，太显著地暴露在抗体或抗体片段的表面上的半胱氨酸残基可以通过与另一抗体或抗体片段上的Cys反应形成二硫化物(“抗体间二硫化物”)或通过形成不想要的抗体内二硫化物而形成二硫化物。已经发现，置于本文所述特定位点上的半胱氨酸残基适当地易于用于有效缀合，但是被充分屏蔽或适当定位以减少或消除抗体间和抗体内二硫键的形成，其否则在表达cys修饰的抗体时通常所需的还原/再氧化过程中发生。类似地，再氧化后，发现一些位点产生非同质缀合产物，这看起来是由于所改造的新Cys残基定位到蛋白质中，并且本文鉴定的特定位点是其中此类异质性最小化的一些位点。
优选在这样的位点上缀合药物有效载荷，在所述位点上所述有效载荷从溶剂相互作用中被隔离并且附着可以在药物附着后增加抗体的疏水性，因为一般认为降低蛋白质药物的疏水性是有益的，因为其可能减少聚集和从循环中清除。当每个抗体附着4、6或8种药物时，或当使用特别疏水的有效载荷时，选择导致疏水性最小改变的附着位点可能特别有益。
使用本文实施例中描述的这些和额外的方法评估用于Cys整合的位点，导致选择用于Cys整合的优选位点用于改造抗体或抗体片段，以引入Cys作为用于缀合，尤其用于制备ADC的位点。在本文中提供了关于选择特定位点用于Cys替换抗体的天然氨基酸的额外详细信息。
半胱氨酸取代位点定位在抗体或抗体片段的恒定区中，并且本文使用标准的编号约定对其进行鉴定。然而，众所周知的是，抗体的部分或片段而非完整的全长抗体可用于许多目的，并且同样可以以影响恒定区中位点编号的多种方式修饰抗体，即使它们基本上不影响恒定区的功能。例如，已经显示将S6标签(短肽)插入到抗体的环区内以允许保留抗体的活性，即使其可能改变抗体中许多位点的编号。因此，尽管通过基于完整抗体的编号的标准编号系统鉴定本文所述的优选的半胱氨酸取代位点，但是本发明包括抗体片段或含有其他修饰，如肽标签插入的抗体中的相应位点。那些片段或经修饰抗体中的相应位点因此是在片段或修饰抗体中用于半胱氨酸取代的优选位点，并且通过编号对半胱氨酸取代位点的参考包括经修饰抗体或抗体片段中的相应位点，所述经修饰抗体或抗体片段保留全长抗体相关部分的功能。
可以通过比对抗体片段或修饰抗体的区段与全长抗体容易地鉴定抗体片段或修饰抗体中的相应位点以鉴定抗体片段或修饰抗体中的位点，该位点匹配本发明优选半胱氨酸取代位点之一。比对可以基于足够长以保证区段匹配全长抗体的正确部分的区段，如至少20个氨基酸残基、或至少50个残基、或至少100个残基、或至少150个残基的区段。比对还可以考虑已经被改造到抗体片段或修饰抗体中的其他修饰，因此允许由于用于比对的区段中改造的点突变，特别是保守取代造成的序列差异。因此，例如，Fc结构域可以从抗体中切除，并且会含有对应于本文所述半胱氨酸取代位点的氨基酸残基，尽管具有编号差异：也期望对应于本发明半胱氨酸取代位点的Fc结构域中的位点是用于Fc结构域中半胱氨酸取代的有利位点并且包括在本发明范围内。
在一个实施方案中，本发明提供式(I)的免疫缀合物：
其中Ab代表抗体或抗体片段，其在本文所述的优选半胱氨酸取代位点之一上包含至少一个半胱氨酸残基；
LU是如本文所述的接头单元；
X是有效载荷或药物部分；
并且n是从1-16的整数。
通常，在式(I)的化合物中，LU附着到本文所述的半胱氨酸取代位点之一上的半胱氨酸上，X是药物部分，如抗癌药物，并且当Ab是抗体时，n是2-8，或当Ab是抗体片段时，n可以是1-8。
在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161、和165包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置143、147、159、163和168包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
在一个实施方案中，本发明提供在本文所述的位置上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代的经修饰抗体或其抗体片段。用于半胱氨酸取代的位点位于抗体的恒定区中并因此可应用于多种抗体，并且选择位点以提供稳定的且同质的缀合物。修饰抗体或片段可以具有两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他抗体修饰和缀合方法组合使用。
在一个实施方案中，本发明提供包含上文公开的免疫缀合物的药物组合物，和使用免疫缀合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供这的核酸，其编码在本文所述位点上具有至少一个半胱氨酸取代的本文所述的经修饰抗体或抗体片段。本发明还提供包含这些核酸的宿主细胞和使用所述核酸或宿主细胞表达并产生本文所述抗体或片段的方法。
在一个实施方案中，本发明提供方法以选择适合于被半胱氨酸替换的抗体的氨基酸，以提供良好的缀合位点，其包括：
(1)鉴定抗体恒定区中的氨基酸，其具有合适的表面暴露，以提供一组初始候选位点；
(2)对每一个初始候选位点，表达这样的抗体，其中该位点上的天然氨基酸被半胱氨酸替换；
(3)对每一个所表达的抗体，确定所述表达的蛋白质在还原和再氧化后是否基本同质，以提供在初始候选位点上具有游离半胱氨酸的功能抗体，
(4)对基本同质且有功能的每一个所表达的蛋白质，将初始候选位点上的半胱氨酸与马来酰亚胺部分缀合并确定所述巯基-马来酰亚胺连接在该位点上是否稳定；
(5)从一组初始候选位点中去除那些所表达的抗体对其基本不同质并且无功能的位点，和其中巯基-马来酰亚胺连接不稳定的那些位点，以提供一组有利位点用于半胱氨酸取代。
任选地，所述方法还包括为每个有利的半胱氨酸取代位点的缀合物确定解链温度，并从所述组中排除任何这样的位点，其中半胱氨酸取代和缀合引起解链温度与天然抗体的解链温度相差5℃或更高。
在一个实施方案中，本发明提供方法以产生免疫缀合物，其包括将接头单元(LU)或接头单元-有效载荷组合(-LU-X)附着到抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基上，其中所述半胱氨酸定位在选自所述抗体或抗体片段的重链的121、124、152、171、174、258、292、333、360和375以及所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161和165的半胱氨酸取代位点上，其中所述位置根据EU系统编号。
本文更详细地描述了本发明的其他方面和实施方案。
1.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、334、360、375和392的位点上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
2.实施方案1的免疫缀合物，其中半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代选自位置121、124、152、258、334、360和392。
3.实施方案1或2的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段包含选自SEQIDNOs:4、5、10、17、18、29、35、42、43、48、50、54、290、291、292、293、294和295的序列。
4.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161、和165的位点上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
5.实施方案4的免疫缀合物，其中半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代选自位置145或165。
6.实施方案4的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段包含选自SEQIDNOs:61、62、69、71、75、76和77的序列。
7.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置143、147、159、163、和168的位点上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
8.实施方案7的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段包含选自SEQIDNOs:92、94、96、97和98的序列。
9.实施方案1、2或3的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161、和165的位点上还包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
10.实施方案1、2或3的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置143、147、159、163、和168还包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述轻链位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
11.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在重链恒定区上在位置152和375，或在位置327和375上包含半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述位置根据EU系统编号。
12.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上包含轻链的位置107和重链的360的半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
13.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400或422的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
14.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
15.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自位置143、145、147、156、159、163、和168的所述抗体或抗体片段的轻链恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
16.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上包含半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包括在抗体重链的位置375和抗体轻链的位置165，或抗体重链的位置334和抗体轻链的位置165上的取代，并且其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
17.实施方案11、12和16任一项的免疫缀合物，其中所述药物抗体比是大约4。
18.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上包含半胱氨酸对三个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含选自
a.抗体重链的位置375和392和抗体轻链的位置165，
b.抗体重链的位置334和375和抗体轻链的位置165，和
c.抗体重链的位置334和392和抗体轻链的位置165的取代，
并且其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
19.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上包含半胱氨酸对三个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含选自
a.抗体重链的位置152、375和392，
b.抗体重链的位置152、334和375，和
c.抗体重链的位置152、334和392的取代，
并且其中所述位置根据EU系统编号。
20.实施方案18或19的免疫缀合物，其中所述药物抗体比是大约6。
21.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段在其恒定区上包含半胱氨酸对四个或多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置334、375和392和抗体轻链的位置165，或抗体重链的位置333、375和392和抗体轻链的位置165上的取代，并且其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
22.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对四个或多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置152、334、375和392，或抗体重链的位置152、333、375和392上的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
23.实施方案21或22的免疫缀合物，其中所述药物抗体比是大约8。
24.实施方案1-23任一项的免疫缀合物，其还包含药物部分。
25.实施方案24的免疫缀合物，其中药物部分通过所述半胱氨酸的硫和任选的接头附着到经修饰抗体或抗体片段上。
26.实施方案25的免疫缀合物，其中所述药物部分通过可切割的或不可切割的接头连接所述半胱氨酸的所述硫。
27.实施方案25的免疫缀合物，其中所述药物部分通过不可切割的接头连接所述半胱氨酸的所述硫。
28.实施方案25的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含巯基-马来酰亚胺连接。
29.实施方案25的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含-S-CH2-C(＝O)-连接或二硫键。
30.实施方案25-29任一项的免疫缀合物，其中所述药物部分是细胞毒性剂。
31.实施方案30的免疫缀合物，其中所述药物部分选自紫杉烷类、DNA烷化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、tubulysin类似物、多卡米星类似物、阿里他汀(auristatin)E、阿里他汀F，和美坦生类化合物(maytansinoids)。
32.实施方案1-31任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
33.实施方案1-31任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体。
34.实施方案31的免疫缀合物，其中所述抗体是人源化的或完全人抗体。
35.实施方案31的免疫缀合物，其中所述抗体是双特异性的或多特异性的抗体。
36.实施方案1-32任一项的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段特异性结合肿瘤特征性的细胞表面标志物。
37.药物组合物，其包含实施方案1-36任一项的免疫缀合物。
38.经修饰抗体或其抗体片段，其在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400或422的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
39.经修饰抗体或其抗体片段，其在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203在其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
40.经修饰抗体或其抗体片段，其在选自所述抗体或抗体片段的轻链的恒定区上的位置143、145、147、156、159、163、168包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
41.实施方案38的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是选自重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375的至少一个半胱氨酸，并且其中所述位置根据EU系统编号。
42.实施方案39的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是两个到六个半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在选自重链的121、124、152、171、174、258、292、333、360和375的位置上，并且其中所述位置根据EU系统编号。
43.实施方案39的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是至少一个半胱氨酸，选自轻链的位置107、108、142、145、159、161和165，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
44.实施方案40的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是两个到六个半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在选自轻链的107、108、142、145、159、161和165的位置上，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
45.实施方案40的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是至少一个半胱氨酸，其选自轻链的位置143、147、159、163和168，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
46.实施方案40的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是两个到六个半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在选自轻链的143、147、159、163和168的位置上，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
47.实施方案11、12、14-22、38-47任一项的经修饰抗体或抗体片段，其还附着到药物部分上，并且其中所述药物部分通过所述半胱氨酸的硫和任选的接头附着到经修饰抗体或抗体片段上。
48.实施方案47的经修饰抗体或抗体片段，其中所述药物部分通过接头单元附着到所述半胱氨酸的硫上。
49.实施方案38-48任一项的经修饰抗体或抗体片段，其还包含至少一个Pcl或非天然的氨基酸取代或肽标签用于酶介导的缀合和/其组合。
50.核酸，其编码实施方案38-49任一项的经修饰抗体或抗体片段。
51.宿主细胞，其包含实施方案50的核酸。
52.产生经修饰抗体或抗体片段的方法，其包括在用于表达所述抗体或抗体片段的合适条件下温育实施方案49的宿主细胞，并分离所述抗体或抗体片段。
53.选择适合于被半胱氨酸替换的抗体的氨基酸以提供合适的缀合位点的方法，其包括：
(1)鉴定抗体恒定区中的氨基酸，其具有合适的表面暴露，以提供一组初始候选位点；
(2)对每一个初始候选位点，表达这样的抗体，其中该位点上的天然氨基酸被半胱氨酸替换；
(3)对每一个所表达的抗体，确定所述表达的蛋白质在还原和再氧化后是否基本同质，以提供在初始候选位点上具有游离半胱氨酸的功能抗体，
(4)对基本同质且有功能的每一个所表达的蛋白质，将初始候选位点上的半胱氨酸与马来酰亚胺部分缀合并确定所述巯基-马来酰亚胺连接在该位点上是否去稳定；
(5)从一组初始候选位点中去除那些所表达的抗体对其基本不同质并且无功能的位点，和其中巯基-马来酰亚胺连接被去稳定的那些位点，以提供一组用于半胱氨酸取代的有利位点。
54.实施方案53的方法，其还包括为每个有利的半胱氨酸取代位点的缀合物确定解链温度，并从所述组中排除任何这样的位点，其中半胱氨酸取代和缀合引起解链温度与亲本抗体的解链温度相差5℃或更高。
55.实施方案53或54的方法，其还包括产生在所鉴定的一个或多个取代位点上含有半胱氨酸的抗体或抗体片段。
56.产生免疫缀合物的方法，其包括将接头单元(LU)或接头单元-有效载荷组合(-LU-X)附着到抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基上，其中所述半胱氨酸定位在选自所述抗体或抗体片段的重链的121、124、152、171、174、258、292、333、360和375以及所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161和165的半胱氨酸取代位点上，其中所述位置根据EU系统编号。
57.实施方案56的方法，其中所述免疫缀合物是式(I)的免疫缀合物：
其中Ab代表抗体或抗体片段，其在本文所述的优选的半胱氨酸取代位点之一上包含至少一个半胱氨酸残基；
LU是如本文所述的接头单元；
X是有效载荷或药物部分；
并且n是从1-16的整数。
定义
术语“氨基酸”指典型的、合成的和非天然的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以与典型氨基酸类似的方式起作用。典型氨基酸是由遗传密码编码的蛋白质生成的氨基酸并包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸，以及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸及其类似物吡咯啉-羧基-赖氨酸。氨基酸类似物指与典型氨基酸具有相同的基本化学结构，即结合氢的α-碳、羧基、氨基，和R基团的化合物，例如瓜氨酸、高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是与典型氨基酸保持相同的基本化学结构。
氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但是以与典型氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。如本文所用，术语“非天然氨基酸”旨在代表不能使用任何生物的未修饰或修饰基因(无论相同还是不同)在任何生物中通过生物合成产生的氨基酸结构。此外，此类“非天然氨基酸”通常需要经修饰的tRNA和修饰的tRNA合成酶(RS)掺入到蛋白质中。该tRNA/RS对优先掺入非天然氨基酸超过典型氨基酸。通过Schultz等(参见例如，Liu等,(2010)Annu.Rev.Biochem.79:413-444)开发的选择方法或类似的方法产生此类正交tRNA/RS对。术语“非天然氨基酸”不包括天然发生的22nd蛋白质生成的氨基酸吡咯赖氨酸(Pyl)以及其去甲基化类似物吡咯啉-羧基-赖氨酸(Pcl)，因为两种残基掺入到蛋白质中通过未修饰的、天然发生的吡咯赖氨酰-tRNA/tRNA合成酶对介导并且因为Pyl和Pcl通过生物合成产生(参见例如，Ou等,(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:10437-10442；Cellitti等,(2011)Nat.Chem.Biol.27；7(8):528-30)。还参见作为参考并入的美国临时申请61/76236，抗体轻链和重链中的位点特异性氨基酸残基可以被Pcl取代。
如本文所用的术语“抗体”指能够非共价、可逆地并以特定方式结合对应的抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然发生的IgG抗体是包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链(也称为“抗体重链”)和两条轻(L)链(也称为“抗体轻链”)的四聚体。每一条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每一条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补性决定区域(CDR)的高变异性的区域，其散布于称为构架区(FR)的更保守的区域。每一VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一个组分(C1q)的结合。
术语“抗体”包括，但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体，和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗Id抗体)。抗体可以是任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
轻链和重链均分成结构和功能同源性的区域。功能使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，将理解轻(VL)链和重(VH)链部分的可变域都决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)的恒定域和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。根据约定，恒定区结构域的编号随着它们从抗体的抗原结合位点或氨基末端变得更远而增加。N末端是可变区并且C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所用的术语“抗体片段”指抗体的抗原结合片段或抗体的非抗原结合片段(例如Fc)。如本文所用，术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原的表位(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)特异性相互作用的能力。结合片段的实例包括，但不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等,Nature341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和分离的互补性决定区(CDR)，或抗体的其他表位结合片段。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法，通过合成接头将它们连接，所述合成接头使得它们被制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等,Science242:423-426,1988；和Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。此类单链抗体也旨在包括在术语“抗原结合片段”中。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的有用性。
抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-NAR和bis-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology23:1126-1136,2005)。抗原结合片段可以移植到基于多肽的支架，如纤连蛋白III型(Fn3)上(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。
抗原结合片段可以掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,ProteinEng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指这样的多肽，其包括具有基本相同的氨基酸序列或来自相同遗传来源的抗体和抗体片段。该术语还包括单一分子组合组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位展示单一的结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有这样的可变区的抗体，其中两个构架和CDR区来自人起源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也来自此类人序列，例如，人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有来自人构架序列分析的共有构架序列的抗体，例如如Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。
本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点定向诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制造)。
如本文所用，术语“人源化”抗体指保留非人抗体的反应性同时在人中免疫原性较低的抗体。这例如通过保留非人CDR区并利用其人对应物替换抗体的剩余部分来实现。参见例如，Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。
如本文所用的术语“识别”指抗体或其抗原结合片段，其发现表位并与其相互作用(例如结合)，无论所述表位是线性的还是构象的。术语“表位”指本发明抗体或抗原结合片段特异性结合的抗原上的位点。表位可以从相邻氨基酸形成或因蛋白质的三级折叠而并置的不相邻氨基酸形成。从相邻氨基酸形成的表位在暴露在变性剂中时通常被保持，然而通过三级折叠形成的表位在利用变性剂处理时通常丧失。表位通常包括独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如x-射线结晶学和2维核磁共振(参见例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷,G.E.Morris,编辑(1996))。
如本文所用的术语“亲和力”指单一抗原位点上抗体与抗原的相互作用强度。在每一个抗原位点内，抗体“臂”的可变区在多个位点上通过弱的非共价力与抗原相互作用；相互作用越强，亲和力越强。
术语“分离的抗体”指基本没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合一个抗原的分离的抗体可能与其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞物质和/或化学品。
术语“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列时，则指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。在每一位置上(其中丙氨酸通过一个密码子确定)，可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种类型。本文编码多肽的每条核酸序列也描述了核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将认识到可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，在每条所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每种沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的各个取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表为本领域所熟知。此类保守修饰的变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有彼此为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用的术语“优化的”指已经使用生产细胞或生物，一般是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列，以编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)最初编码的氨基酸序列。
在两条或多条核酸或多肽序列的上下文中，术语“百分比同一性的”或“百分比同一性”指相同的两条或多条序列或子序列。当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查测定，比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时，如果两条序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在特定区域上或当不指定时，在全长序列上60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，那么两条序列“基本相同”。任选地，同一性存在于长度至少约30个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选地在长度至少100到500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的区域。
对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定备选参数。所述序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
如本文所用，“比较窗口”包括参考选自20到600、一般约50到约200，更一般约100到约150的任何一定数量相邻位置的区段，其中可在两条序列进行最佳比对后将序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过搜索Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手工比对和视觉检查(参阅，例如Brent等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,2003)进行序列最佳比对用于比较。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402,1977；和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件通过NationalCenterforBiotechnologyInformation公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSPs)，当在数据库序列中用相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等,上文)。这些初始邻近字命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的更长HSPs。只要可增加累积比对得分，则沿每条序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列，使用参数M(对一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当：所述累积比对得分从其最高达到值跌落X量；因一个或多个负得分残基比对累积，所述累积得分到达零或以下；或到达任何一条序列的末端时，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3，和期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参阅Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(参阅例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，并最优选低于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。
也可使用已经整合到ALIGN算法(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)的算法，使用PAM120加权残基表，空位长度罚分12和空位罚分4，测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合到GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，以及空位加权16、14、12、10、8、6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
除了上文指出的序列同一性的百分比，两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应，如下文描述。因此，多肽通常与第二条多肽基本相同，例如，其中两条肽仅因保守取代而不同。两条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”可互换使用，并指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，其为合成的、天然发生的和非天然发生的，与参考核酸具有相似的结合性质，并且以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括，但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有指出，特定核酸序列也暗中包括其沉默变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。尤其是，如下文详细描述，可通过产生这样的序列完成简并密码子取代，其中用混和碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置(Batzer等,(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsuka等,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等,(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。
在核酸上下文中的术语“有效连接”指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段的功能关系。通常，其指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其他表达系统中的转录，那么该启动子或增强子序列有效连接编码序列。一般地，有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录的序列在物理空间上邻近，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节序列，如增强子不需要与编码序列(增强子增强其转录)在物理空间上邻近或位于其附近。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用到典型氨基酸聚合物以及非典型氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体缀合物”指抗体或其抗体片段与另一试剂，如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光镜探针等的连接。该连接可以通过一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(许多所述接头为本领域所知)以形成免疫缀合物。此外，可以以融合蛋白质的形式提供免疫缀合物，其可以从编码免疫缀合物的多核苷酸表达。如本文所用，“融合蛋白质”指通过连接最初编码单独的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段产生的蛋白质。通过在N或C末端连接，或通过将基因或基因片段插入到伴侣蛋白质之一的许可区域中来产生融合蛋白质。融合基因的翻译产生具有来自每一个初始蛋白质的功能性质的单个蛋白质。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了指出时，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用的术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖有害并且可能作用于减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何试剂。
如本文所用的术语“抗癌剂”指可以用于治疗细胞增殖性病症，如癌症的任何试剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射性治疗和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
术语“药物部分”或“有效载荷”可互换使用并指缀合本发明的抗体或抗体片段的化学部分，并且可以包括用于附着抗体或抗体片段的任何部分。例如，药物部分或有效载荷可以是抗癌剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、麻醉剂。在某些实施方案中，药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里他汀、多拉司他汀、美坦生类化合物、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。合适的实例包括阿里他汀，如MMAE和MMAF；刺孢霉素，如γ-刺孢霉素；和美坦生类化合物，如DM1和DM4。用于将这些的每一个附着到与本发明的抗体和方法相容的接头上的方法为本领域所知。参见例如Singh等,(2009)TherapeuticAntibodies:MethodsandProtocols,第525卷,445-457。此外，有效载荷可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记、红外探针、亲和力探针、螯合剂、分光镜探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记、DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米颗粒、量子点、脂质体、PLGA颗粒、糖或多糖、反应性官能团，或可以连接缀合物与另一部分的结合剂、表面等。
术语“药物抗体比”(也称为“DAR”)指连接免疫缀合物的抗体的有效载荷或药物部分的数量。例如，药物抗体的比例为2表示免疫缀合物样品中结合每个抗体的两个药物部分的平均值。在样品中药物抗体比为2的一些个体免疫缀合物可能没有或仅连接一个药物部分；在该样品中其他免疫缀合物在个体抗体上将具有两个、三个、四个或甚至更多个部分。但是样品中的平均值将是2。本领域中具有不同方法用于测量免疫缀合物的药物抗体比。
在本发明的实施方案中，免疫缀合物样品中的DAR可以是“同质的”。“同质缀合物样品”是具有DAR狭窄分布的样品。作为示例性实施方案，在DAR为2的同质缀合样品中，在该样品中可以含有未缀合的抗体，和具有多于两个以约2的DAR缀合的部分的一些抗体。“大多数样品”表示在样品中具有至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将缀合到两个部分上。
作为示例性实施方案，在DAR为4的同质缀合样品中，在该样品中可以含有具有多于或少于四个以约4的DAR缀合的部分的抗体。“大多数样品”表示在样品中具有至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将缀合到四个部分上。
作为示例性实施方案，在DAR为6的同质缀合样品中，在该样品中可以含有具有多于或少于六个以约6的DAR缀合的部分的抗体。“大多数样品”表示在样品中具有至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将缀合到六个部分上。
作为示例性实施方案，在DAR为8的同质缀合样品中，在该样品中可以含有具有少于或多于八个以约4的DAR缀合的部分的一些抗体。“大多数样品”表示在样品中具有至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将缀合到八个部分上。
具有“约2的药物抗体比”的免疫缀合物指这样的免疫缀合物样品，其中药物抗体比可以在约1.6-2.4部分/抗体、1.8-2.3部分/抗体或1.9-2.1部分/抗体范围内变化。
具有“约4的药物抗体比”的免疫缀合物指这样的免疫缀合物样品，其中药物抗体比可以在约3.6-4.4部分/抗体、3.8-4.3部分/抗体或3.9-4.1部分/抗体范围内变化。
具有“约6的药物抗体比”的免疫缀合物指这样的免疫缀合物样品，其中药物抗体比可以在约5.6-6.4部分/抗体、5.8-6.3部分/抗体或5.9-6.1部分/抗体范围内变化。
具有“约8的药物抗体比”的免疫缀合物指这样的免疫缀合物样品，其中药物抗体比可以在约7.6-84部分/抗体、7.8-8.3部分/抗体或7.9-8.1部分/抗体范围内变化。
“肿瘤”指赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，和所有前癌性和癌性细胞和组织。
术语“抗肿瘤活性”表示肿瘤细胞增殖速度、活力或转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的可能方式是显示在治疗过程中发生的异常细胞的生长速度或肿瘤大小稳定性降低或减少。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型，包括但不限于异种移植物模型、同种异体移植物模型、MMTV模型，和本领域已知的其他已知模型评估该活性以研究抗肿瘤活性。
术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括通过失调的或不受控的细胞生长表征的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞还没有迁移到受试者身体的除了原发肿瘤的位点之外的位点上的那些肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，起源于转移的那些肿瘤，所述转移是肿瘤细胞迁移到不同于原发肿瘤的第二位点上)。
如本文所用，术语“光学异构体”或“立体异构体”指任何多种立体异构构型，其可以为本发明的给定化合物而存在并包括几何异构体。应理解，取代基可以附着在碳原子的手性中心。术语“手性”指这样的分子，其在其镜像伴侣上具有非可重叠性的性质，而术语“非手性”指这样的分子，其在其镜像伴侣上是可重叠的。因而，本发明包括化合物的对映体、非对映体或外消旋体。“对映体”是彼此非重叠的镜像的一对立体异构体。一对对映体的1：1混合物是“外消旋”混合物。适当时，该术语用于指定外消旋混合物。“非对映异构体”是这样的立体异构体，其具有至少两个不对称原子，但其彼此不是镜像。根据Cahn-lngold-PrelogR-S系统指定绝对立体化学。当化合物是纯的对映体时，可以通过R或S指定每个手性碳上的立体化学。其绝对构型未知的解析化合物根据它们在钠D线的波长上旋转平面偏振光的方向(右旋或左旋)被指定为(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心或轴并因此产生对映体、非对映体，和在绝对立体化学方面被定义为(R)-或(S)-的其他立体异构形式。
根据起始材料和方法的选择，化合物可以以可能的异构体之一或其混合物的形式存在，例如作为纯的旋光异构体，或作为异构体混合物，如外消旋化合物和非对映异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。本发明旨在包括所有此类可能的异构体，包括外消旋混合物、非对映体混合物和光学上纯的形式。可以使用手性合成子或手性试剂制备旋光的(R)-和(S)-异构体，或可以使用常规技术进行解析。如果化合物含有双键，那么取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，那么所述环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。也旨在包括所有的互变异构形式。
如本文所用，术语“盐”指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”指这样的盐，其保留本发明的生物有效性和性质并且其通常不是生物学上的或其他方面不想要的。在许多情况下，本发明的化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团能够形成酸盐和/或碱盐。
可以利用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴化物、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/氢氯化物、氯茶碱(chlorotheophyllinate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘化物/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以利用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。
可以衍生盐的无机碱包括例如铵盐和来自周期表第I列至第XII列的金属。在某些实施方案中，盐来自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。
可以衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然发生的取代的胺、环胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星青霉素、胆碱、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨基丁三醇。
可以通过常规的化学方法，从碱部分或酸部分合成本发明的药学上可接受的盐。一般地，可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学量的适当碱(如Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学量的适当酸反应来制备此类盐。此类反应通常在水或有机溶剂，或两者的混合物中进行。一般地，可应用时希望使用非水介质，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。例如可以在“Remington'sPharmaceuticalSciences”,第20版,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,(1985)；和Stahl和Wermuth的“HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse”(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)中发现额外的合适盐的列表。
本文给出的任何化学式也旨在代表化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有本文给出的化学式描述的结构，除了一个或多个原子被所选原子量或质量数的原子替换。可以掺入到本发明化合物中的同位素的实例分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本发明包括如本文定义的多种同位素标记的化合物，例如放射性同位素，如3H和14C存在的那些化合物，或非放射性同位素，如2H和13C存在的那些化合物。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(利用14C)、反应动力学研究(利用例如2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定，或患者的放射性治疗中。具体而言，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究是特别想要的。一般可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例和制备中描述的那些类似的方法，使用适当同位素标记的试剂代替先前使用的非标记试剂来制备式(I)的同位素标记的化合物。
此外，利用较重同位素，特别是氘(即，2H或D)的取代可以提供起因于更高代谢稳定性的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需要或治疗指数的改善。应理解在该上下文中认为氘是式(I)的化合物的取代基。可以通过同位素富集因子定义该较重同位素，尤其是氘的浓度。如本文所用的术语“同位素富集因子”表示同位素丰度与指定同位素的天然丰度之间的比例。如果本发明的化合物中的取代基被指示为氘，那么该化合物对每一个指定的氘原子，具有至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)的同位素富集因子。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，其为本领域技术人员所知(参见例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版.MackPrintingCompany,1990,第1289-1329页)。除了任一常规载体与活性成分不相容的情况之外，考虑任一常规载体在治疗或药物组合物中的用途。
术语本发明化合物的“治疗有效量”指将引起受试者的生物或医学应答，例如酶或蛋白质活性的降低或抑制，或改善症状，缓解状况，减缓或延迟疾病进程，或预防疾病等的本发明化合物的量。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指当向受试者施用时，有效地至少部分缓解、抑制、预防和/或改善状况或病症或疾病，或至少部分抑制靶酶或受体的活性的本发明化合物的量。
如本文所用，术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”指给定状况、症状或病症或疾病的减轻或抑制，或生物活性或过程的基线活性的显著降低。
如本文所用，术语任何疾病或病症的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在一个实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或降低疾病的发生或其至少一种临床症状)。在另一实施方案中，“治疗”、“治疗”或“治疗”指缓解或改善至少一个物理参数，包括患者可能不能辨别的那些。在又一实施方案中，“治疗”、“治疗”或“治疗”指身体上(例如稳定可辨别的症状)、生理上(例如稳定身体参数)或通过两种调节疾病或病症。在又一实施方案中，“治疗”、“治疗”或“治疗”指预防或延迟疾病或病症的开始或发生或进展。
如本文所用，如果该受试者将在生物学上、医学上或生活质量上从该治疗中受益，那么受试者“需要”治疗。
如本文所用，将理解术语“a”、“an”、“the”和本发明上下文中(尤其是在权利要求上下文中)使用的类似术语涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明确地相互矛盾。
如本文所用的术语“巯基-马来酰亚胺”描述了通过巯基与马来酰亚胺反应形成的基团，其具有该通式
其中Y和Z是将通过巯基-马来酰亚胺连接而连接的基团并且可以是接头单元，并且可以附着到抗体或有效载荷上。在一些情况下，Y是本发明的经改造抗体，并且式中显示的硫原子来自本文所述取代位点之一上的半胱氨酸；而Z代表连接有效载荷的接头单元。
如本文所用的“接头单元(LU)”指两个部分，如抗体与有效载荷之间的共价化学连接。每个LU可以包含本文所述的一个或多个组分，如L1、L2、L3、L4、L5和L6。可以选择接头单元以在连接的部分之间提供合适的间隔，或提供某些理化性质，或允许接头单元在某些条件下的切割。
如本文所用的“可切割的”指接头或接头单元(LU)，其通过共价连接而连接两个部分，但是在生理条件下分解以分离部分之间的共价连接。切割可以是酶促的或非酶促的，但是一般在不降解抗体的情况下从抗体上释放有效载荷。
如本文所用的“不可切割的”指在生理条件下对分解不敏感的接头或接头单元(LU)。虽然接头可以在生理学上被修饰，但是其保持有效载荷连接抗体直至抗体基本上被降解，即在体内抗体降解在接头切割之前。
如本文所用的“环辛炔”指含有碳-碳三键的8元环(乙炔)。该环任选地融合一个或两个苯环，其可以被1-4C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素、羟基、COOH、COOL1、-C(O)NH-L1、O-L1，或类似基团取代，并且可以含有N、O或S作为环成员。在优选的实施方案中，环辛炔可以是C8烃环，特别是除三键外的饱和的分离环，并且其可以被F或羟基取代，并且可以通过–O-、–C(O)、C(O)NH或C(O)O连接接头或LU。
如本文所用的“环辛炔”指含有至少一个双键，尤其是反式双键的8元环。该环任选地融合一个或两个苯环，其可以被1-4C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素、羟基、COOH、COOL1、-C(O)NH-L1、O-L1，或类似基团取代，并且可以含有N、O或S作为环成员。在优选的实施方案中，环辛烯可以是除反式双键外饱和的分离的C8烃环，并且可以被F或羟基任选地取代，并且可以通过–O-、–C(O)、C(O)NH或C(O)O连接接头或LU。
可以以任何合适的顺序进行本文所述的所有方法，除非本文另有说明或与上下文明确地相互矛盾。本文提供的任何和所有实例，或示例性语言(例如“如”)仅旨在更好地阐明本发明并且对另外要求的本发明范围不形成限制。
附图简述
图1.人IgG1重链(A)和κ轻链(B)中氨基酸残基的表面可及性图。使用SurfaceRacer5.0计算表面可及性并且将其表示为平方埃
图2.具有κ轻链的人IgG1的结构中所选的92TAG突变的定位。为TAG突变所选的残基在仅两条重链之一上被显示为黑色并且为两条κ轻链之一显示所选的残基(1HZH.pdb)。使用开源分子建模软件包PyMOL(ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,Version1.5.0.LLC)显示结构。
图3.曲妥珠单抗和抗体14090的重链恒定区的氨基酸序列比对。在曲妥珠单抗抗体和抗体14090中突变成Cys的残基加下划线。通过Eu编号系统对重链中的氨基酸残基编号(Edelman等,1969)。
图4.曲妥珠单抗、人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区的氨基酸序列比对。
图5.人κ和λ轻链的恒定区的氨基酸序列比对。A.在曲妥珠单抗的κ轻链和抗体14090的λ轻链中突变成Cys的残基加下划线。B.在人λ轻链的PyMOL结构模型中显示为Cys突变所选的残基(ProteinStructureDatabankentry3G6D.pdb)
图6.通过非还原性SDS-PAGE分析曲妥珠单抗Cys抗体。
图7.曲妥珠单抗LC-S156C突变抗体(虚线)和野生型曲妥珠单抗(实线)的大小排阻层析。
图8.通过反相高压液相层析(RP-HPLC)分析野生型曲妥珠单抗(A)和曲妥珠单抗LC-E158C突变抗体(B)。
图9.蛋白A纯化后曲妥珠单抗LC-R108C突变抗体的MS分析(完整MS)。
图10.MC-MMAF的结构。
图11.通过RP-HPLC分析曲妥珠单抗Cys抗体与MC-MMAF的缀合混合物。缀合混合物的RP-HPLC迹线显示为虚线。未修饰抗体的RP-HPLC迹线显示为实线。A.LC-R108C-MMAF,B.HC-360C-MMAF,C.LC-S156C-MMAF,和D.HC-S275C-MMAFADC。
图12.通过RP-HPLC分析曲妥珠单抗Cys抗体与MC-MMAF的缀合混合物。缀合混合物的RP-HPLC迹线显示为虚线。未修饰抗体的RP-HPLC迹线显示为实线。A.HC-S134C-MMAF,和B.HC-S136C-MMAFADC。
图13.通过分析性大小排阻层析(AnSEC)分析曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs。曲妥珠单抗HC-K290C-MMAFADC(短虚线)、曲妥珠单抗LC-R142C-MMAFADC(虚线)，和曲妥珠单抗LC-L154C-MMAFADC(点虚线)与未修饰的野生型曲妥珠单抗(实线)进行比较。
图14.未修饰的野生型曲妥珠单抗和曲妥珠单抗HC-T335C-MMAF、曲妥珠单抗HC-S337C-MMAF和曲妥珠单抗HC-K360C-MMAFADCs的热解链曲线。
图15.用于曲妥珠单抗LC-S159C-MMAF与A.HCC1954,B.MDA-MB231克隆16和C.MDA-MB231克隆40细胞的细胞增殖测定。
图16.MDA-MB231克隆16细胞增殖测定中曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的IC50。
图17.用于抗体14090HC-S375C-MMAFADC与A.CMK11-5和B.Jurkat细胞的细胞增殖测定。
图18.不展示显著药物丢失的曲妥珠单抗LC-Cys-MMAFADCs的药物动力学研究。A.野生型未缀合的曲妥珠单抗，B.LC-K107C-MMAF，C.LC-R108C-MMAF，D.LC-L154C-MMAF，和E.LC-S159C-MMAFADC。
图19.不展示显著药物丢失的曲妥珠单抗HC-Cys-MMAFADCs的药物动力学研究。A.HC-K121C-MMAD,B.HC-L174C-MMAF,C.HC-E258C-MMAF,和D.HC-R292C-MMAFADC。
图20.展示显著药物丢失的曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的药物动力学研究。A.LC-T129C-MMAF,B.LC-E143C-MMAF,C.HC-K246C-MMAF,和D.HC-R344C-MMAFADC。
图21.体内展示快速清除的两个曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的药物动力学研究。A.HC-T335C-MMAF和B.HC-S337C-MMAFADC。
图22.MDA-MB231克隆16异种移植物小鼠模型中曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的体内效力研究。
图23:如通过疏水相互作用层析测量的曲妥珠单抗PclMMAFDAR2ADCs的滞留时间。ABA-MMAF附着在取代所指示的HC或LC残基的Pcl残基上。A)HC缀合的ADCs。B)LC缀合的ADCs。指示未缀合的野生型抗体的滞留时间(WT)。
图24.具有κ轻链的人IgG1的结构中所选的有效载荷位点的定位。所选的残基在仅两条重链之一上被显示为黑色，并且为两条κ轻链之一显示所选残基(1HZH.pdb)。使用开源分子建模软件包(ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,Version1.5.0.LLC)显示结构的三种旋转。
图25.利用具有2、3或4个Cys突变的抗体制备的具有DAR4、6和8的曲妥珠单抗和抗体14090Cys-MMAFADCs的药物动力学研究。DAR4曲妥珠单抗ADCs:HC-E258C-LC-S159C-MMAF(A)、HC-S375C-LC-S159C-MMAF(B)、HC-E258C-LC-E165C-MMAF(C)、HC-S375C-LC-E165C-MMAF(D)、HC-E152C-LC-R142C-MMAF(E)、HC-P171C-LC-R142C-MMAF和HC-E152C-LC-S159C-MMAF(G)；DAR4抗体14090ADCs：HC-S375C-LC-A143C-MMAF(H)、HC-K360C-LC-V159C-MMAF(I)，和HC-S375C-LC-V159C-MMAF(J)；K.DAR6曲妥珠单抗ADCsHC-K334C-S375C-LC-E165C-MMAF和HC-K334C-K392C-LC-E165C-MMAF；L.DAR8曲妥珠单抗ADCsHC-K334C-K360C-S375C-LC-E165C-MMAF、HC-K334C-K360C-K392C-LC-E165C-MMAF和HC-K334C-S375C-K392C-LC-E165C-MMAF。抗体14090是小鼠交叉反应的，并因而比不结合任何小鼠抗原的曲妥珠单抗ADC更快速地被清除。
发明详述
本发明提供通过在特定位置上利用半胱氨酸氨基酸(“Cys”)替换亲本抗体或抗体片段的一个或多个氨基酸位点特异性标记抗体或抗体片段的方法，从而经改造的抗体或抗体片段能够缀合多种试剂(例如，细胞毒性剂)。本发明还提供通过使用本文所述的方法产生的免疫缀合物。
当将半胱氨酸改造到亲本抗体或抗体片段中时，首先从表达培养基中回收修饰的抗体或抗体片段，其具有通过二硫键连接附着到改造的半胱氨酸位点上的半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)(Chen等,(2009)mAbs16,353-571)。然后在还原步骤中去除所附着的半胱氨酸或GSH，其也还原亲本抗体或抗体片段的所有天然链间二硫键。在第二个步骤中，在缀合发生之前重新氧化这些二硫键。本公开内容显示当在某些位点上改造半胱氨酸时，所述重新氧化步骤进行地不顺利，可能是由于不正确二硫键的形成。因此，本发明分别提供分别在抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区上的独特位点组，其中如本文所述的Cys取代产生修饰的抗体或抗体片段，其在重新氧化过程中表现良好，并且还产生稳定的且表现良好的免疫缀合物。
可以利用多种化学上容易获得的标记试剂，如抗癌剂、荧光团、肽、糖、去污剂、聚乙二醇、免疫增强剂、放射成像探针、药物前体，和其他分子来实现本发明的位点特异性抗体标记。
因此，本发明提供制备具有确定的药物-比-抗体比例的同质免疫缀合物用于癌症治疗和其他适应症以及成像试剂的方法。本发明还提供由此制备的免疫缀合物，以及包含这些免疫缀合物的药物组合物。本发明的方法可以用于与本领域已知的其他缀合方法组合。
以下列举的实施方案代表了本发明的某些方面和变型：
其中Ab代表抗体或抗体片段，其在本文所述的优选半胱氨酸取代位点之一上包含至少一个半胱氨酸残基；
LU是如本文所述的接头单元；
X是有效载荷或药物部分；
并且n是从1-16的整数。在这些实施方案中，n优选为约2、约4、约6，或约8。LU通常是一组式–L1-L2-L3-L4-L5-L6-，其中L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地选自A1-、-A1X2-和-X2-；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-，或(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些这些实施方案中，免疫缀合物包含一组式
其中硫原子是修饰的抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基的硫并且定位在本文鉴定的取代位点之一上。
在任何上述实施方案中，半胱氨酸取代位点可以是对应于通过位置编号鉴定的位点之一的位置，即使序列中位点的位置已经通过全长抗体的修饰或截短被改变了。可以通过比对抗体或片段与全长抗体容易地鉴定相应的位点。
1.位点特异性半胱氨酸改造的抗体
位点特异性标记
根据Edelman等,(1969)Proc.Natl.Acad.USA63:78-85中阐明的EU编号系统对本发明的抗体(例如，亲本抗体，任选地含有一个或多个非典型氨基酸)进行编号，除了根据Kabat等,(1991)第5版.NIHPublicationNo.91-3242中阐明的Kabat编号系统对λ轻链进行编号。人IgG1恒定区用作本申请的代表。然而，本发明不限于人IgG1；可以通过序列比对容易地推导相应的氨基酸位置。例如，图4显示了人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链恒定区的序列对比，从而可以为如图4中显示的IgG2、IgG3和IgG4容易地鉴定在IgG1恒定区中鉴定的Cys改造位点。对于轻链恒定区，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4是相同的。下文表1列出了可以被半胱氨酸替换的抗体重链的恒定区中的氨基酸位置。表2列出了可以被半胱氨酸替换的抗体κ轻链的恒定区中的氨基酸位置。表3列出了可以被半胱氨酸替换的抗体λ轻链的恒定区中的氨基酸位置。
表1.人IgG1的重链恒定区中鉴定的半胱氨酸取代位点(根据EU编号系统编号的位点)。
表2.人IgG1的κ轻链恒定区中鉴定的半胱氨酸取代位点(根据EU编号系统编号的位点)。
表3.人IgG1的λ轻链上鉴定的半胱氨酸取代位点。
由于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体的恒定区的高序列同源性，本发明的发现不受任何特定抗体或抗体片段的限制。
在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或其抗体片段在选自表1中鉴定的位置的其重链恒定区上包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)氨基酸的取代。在特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、334、360、375和392的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代。例如，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分，其中所述经修饰抗体或其抗体片段在选自重链的位置121和124、121和152、121和171、121和174、121和258、121和292、121和333、121和334、121和360、121和375、121和392、124和152、124和171、124和174、124和258、124和292、124和333、124和334、124和360、124和375、124和392,152和171、152和174、152和258、152和292、152和333、152和334、152和360、152和375、152和392、171和174、171和258、171和292、171和333、171和360、171和375、174和258、174和292、174和333、174和334、174和360、174和375、174和392、258和292、258和333、258和334、258和360、258和375、258和392、292和333、292和334、292和360、292和375、292和392、333和334、333和360、333和375、333和392；334和360、334和375、334和392、360和375、360和392或375和392的其恒定区上包含半胱氨酸对两个氨基酸的取代。
在另一实施方案中，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分，其中所述经修饰抗体或其抗体片段在选自重链的位置121、124和152；121、124和171；121、124和174；121、124和258；121、124和292；121、124和333；121、124和334；121、124和360；121、124和375；121、124和392；121、152和171；121、152和174；121、152和258；121、152和292；121、152和333；121、152和334；121、152和360；121、152和375；121、152和392；121、171和174；121、171和258；121、171和292；121、171和333；121、171和334；121、171和360；121、171和375；121、171和392；121、174和258、121、174和292；121、174和333；121、174和334；121、174和360；121、174和375；121、174和392；121、258和292；121、258和333；121、258和334；121、258和360；121、258和375；121、258和392；121、292和333；121、292和334；121、292和360；121、292和375；121、292和392；121、333和334；121、333和360；121、333和375；121、333和392；121、334和360；121、334和375；121、334和392；121、360和375；121、360和392；121、375和392；124、152和171；124、152和174；124、152和258；124、152和292；124、152和333；124、152和334；124、152和360；124、152和375；124、152和392；124、171和174；124、171和258；124、171和292；124、171和333；124、171和334；124、171和360；124、171和375；124、171和392；124、174和258；124、174和292；124、174和333；124、174和334；124、174和360；124、174和375；124、174和392；124、258和292；124、258和333；124、258和334；124、258和360；124、258和375；124、258和392；124、292和333；124、292和334；124、292和360；124、292和375；124、292和392；124、333和360；124、333和334；124、333和375；124、333和392；124、334和360；124、334和375；124、334和392；124、360和375；124、360和392；124、375和392；152、171和174；152、171和258；152、171和292；152、171和333；152、171和334；152、171和360；152、171和375；152、171和392；152、174和258；152、174和292；152、174和333；152、174和334；152、174和360；152、174和375；152、174和392；152、258和292；152、258和333；152、258和334；152、258和360；152、258和375；152、258和392；152、292和333；152、292和334；152、292和360；152、292和375；152、292和392；152、333和334；152、333和360；152、333和375；152、333和392；152、334和360；152、334和375；152、334和392；152、360和375；152、360和392；152、375和392；171、174和258；171、174和292；171、174和333；171、174和334；171、174和360；171、174和375；171、174和392；171、258和292；171、258和292；171、258和333；171、258和334；171、258和360；171、258和375；171、258和392；171、292和333；171、292和334；171、292和360；171、292和375；171、292和392；171、333和334；171、333和360；171、333和375；171、333和392；171、334和360；171、334和392；171、360和375；171、360和392；171、375和392；174、258和292；174、258和333；174、258和334；174、258和360；174、258和375；174、258和392；174、292和333；174、292和334；174、292和360；174、292和375；174、292和392；174、333和334；174、333和360；174、333和375；174、333和392；174、334和360；174、334和375；174、334和392；174、360和375；174、360和392；174、375和392；258、292和333；258、292和334；258、292和360；258、292和375；258、292和392；258、333和360；258、333和375；258、333和392；258、334和360；258、334和375；258、334和392；258、360和375；258、360和392；258、375和392；292、333和334；292、333和360；292、333和375；292、333和392；292、334和360；292、334和375；292、334和392；292、360和375；292、360和392；292、375和392；333、334和360；333、334和375；333、334和392；333、360和375、333、360和392；333、375和392；334、360和375；334、360和392；或360、375和392的其恒定区上包含半胱氨酸对三个氨基酸的取代。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自重链的位置152、333、375和392；或152、334、375和392的其恒定区上包含半胱氨酸对四个氨基酸的取代。
在特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:2、3、9、11、12、13、14、16、21、25、26、28、30、31、32、33、34、36、38、39、40、43、44、45、46、47、51、53、54、56、57或60。在另一特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:6、7、8、15、19、20、22、23、24、27、36、37、41、49、52、55、58或59。
在另一实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或其抗体片段在选自表2中鉴定的位置在其轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的取代。在特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自轻链的位置107、108、142、145、159、161和165的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述轻链是人κ轻链。例如，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自轻链的位置107和108；107和142；107和145；107和159；107和161；107和165；108和142；108和145；108和159；108和161；108和165；142和145；142和159；142和161；142和165；145和159；145和161；145和165；159和161；159和165；161和165的其恒定区上包含半胱氨酸对两个氨基酸的取代，其中所述轻链是人κ轻链。在另一实施方案中，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自轻链的位置107、108和142；107、108和145；107、108和159；107、108和161；107、108和165；107、142和145；107、142和159；107、142和161；107、142和165；107、145和159；107、145和161；107、145和165；107、159和161；107、159和165；107、161和165；108、142和145；108、142和159；108、142和161；108、142和165；108、145和159；108、145和161；108、145和165；108、159和161；108、159和165；108、161和165；142、145和159；142、145和161；142、145和165；142、159和161；142、159和165；142、161和165；145、159和161；145、159和165；145、161和165；或159、161和165的其恒定区上包含半胱氨酸对三个氨基酸的取代，其中所述轻链是人κ轻链。
在特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:63、65、68、70、72、73、74、78、79、80、81、82、83、86、87或88。在另一实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:64、66、67、84、85、or8963、64、65、66、67、68、70、72、73、74、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或89。
在另一实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段在选自表3中鉴定的位置的其轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸的取代。在特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自轻链的位置143、147、159、163和168的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述轻链位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。例如，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自轻链的位置143和147；143和159；143和163；143和168；147和159；147和163；147和168；159和163；159和168；或163和168的其恒定区上包含半胱氨酸对两个氨基酸的取代，其中所述轻链位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。在另一实施方案中，本发明的免疫缀合物包含经修饰抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自轻链的位置143、147和159；143、147和163；143、147和168；143、159和163；143、159和168；143、163和168；147、159和163；147、159和168；147、163和168；或159、163和168的其恒定区上包含半胱氨酸对三个氨基酸的取代，其中所述轻链位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:92、94、96、97或98。在另一特定实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:93或95。
在一个实施方案中，免疫缀合物可以具有约2或约4的DAR。在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自表1中鉴定的位置的其重链恒定区上包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)氨基酸的Cys取代，并且在选自表2或表3中鉴定的位置的其轻链恒定区上包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)氨基酸的Cys取代。在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自位置121、124、152、171、174、258、292、333、334、360、375和392的其重链恒定区上包含一个或多个氨基酸的Cys取代；并且在选自位置107、108、142、145、159、161和165的其轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸的Cys取代，其中所述轻链是人κ轻链。在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以包含重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置107上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置108上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置142上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置145上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置161上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代。在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段包含重链的位置375和位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代。在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以包含重链的位置334和位置375上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代。在另一实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以包含重链的位置334和位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代。在一个实施方案中，那些组合的免疫缀合物可以具有约4或约6的DAR。
在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以包含重链的位置334、位置375和位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代。在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以包含重链的位置333、位置375和位置392上的Cys取代，和人κ轻链的位置165上的Cys取代。在一个实施方案中，那些组合可以具有约4、6或8的DAR。
在一个实施方案中，本发明提供包含经修饰抗体或其抗体片段，和药物部分的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自位置121、124、152、171、174、258、292、333、334、360、375和392的其重链恒定区上包含一个或多个氨基酸的Cys取代；并且在选自位置143、147、159、163和168的其轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸的Cys取代，其中所述轻链是人λ轻链。例如，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以包含重链的位置121上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置121上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置124上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置152上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置171上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置174上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置258上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置292上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置333上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置334上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置360上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置375上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人λ轻链的位置143上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人λ轻链的位置147上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人λ轻链的位置159上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人λ轻链的位置163上的Cys取代；或重链的位置392上的Cys取代，和人λ轻链的位置168上的Cys取代。
在本发明的实施方案中，本文所述的氨基酸取代是包含巯基的半胱氨酸。在本发明的一些方面，利用巯基用于化学缀合，并将其附着到接头单元(LU)和/或药物部分。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含药物部分，其选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里他汀、多拉司他汀、美坦生类化合物、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含药物部分，其是抗癌剂。本发明的经修饰抗体或抗体片段可以是本领域已知的任何形式，如单克隆的、嵌合的、人源化的、完全人的、双特异性的、或多特异性的抗体或其抗体片段。
根据本发明，经修饰抗体重链和/或轻链(或其抗体片段)在其恒定区中可以含有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个半胱氨酸取代。在一个实施方案中，经修饰抗体或抗体片段在其恒定区中含有2、4、6、8或更多个半胱氨酸取代。在一些实施方案中，经修饰抗体、其抗体片段或免疫缀合物包含2个或4个Cys取代。
在一个实施方案中，亲本抗体(没有半胱氨酸取代的抗体)是IgG、IgM、IgE或IgA抗体。在特定实施方案中，亲本抗体是IgG1抗体。在另一特定实施方案中，亲本抗体是IgG2、IgG3或IgG4抗体。
本发明还提供经修饰抗体或其抗体片段，其在选自表1中鉴定的位置的其重链恒定区上包含一个或多个氨基酸的取代。在一些实施方案中，本发明提供经修饰抗体或其抗体片段，其在选自表2或表3中鉴定的位置的其轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸的取代。
在某些实施方案中，使用本发明的方法与本领域已知的其他缀合方法(包括，但不限于通过赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、甲酰-赖氨酸、吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸、非天然氨基酸，和用于酶介导的缀合的蛋白质标签(例如S6标签)的化学选择性缀合)组合标记本文提供的经修饰抗体或抗体片段。
2.缀合化学作用
通过至少一个半胱氨酸残基的翻译后修饰产生本文提供的缀合抗体或其抗体片段，所述半胱氨酸残基通过位点特异性标记方法被掺入到上述抗体或其抗体片段中。可以通过本领域已知用于将目的有效载荷缀合到蛋白质中天然存在的半胱氨酸残基上的方法，和通过描述的用于缀合到被改造以含有额外半胱氨酸残基取代天然蛋白质序列的另一氨基酸的蛋白质上的方法来制备缀合的抗体或抗体片段。
在某些实施方案中，使用已知的方法缀合本文提供的经修饰抗体或其抗体片段，其中掺入的半胱氨酸(Cys)缀合到马来酰亚胺衍生物上，如下面的方案Ia。经历该类型缀合的本发明的修饰抗体含有巯基-马来酰亚胺连接。
方案Ia.通过巯基-马来酰亚胺加合物形成的缀合
其中：
LU是接头单元(LU)，并且
X是有效载荷或药物部分。
在其他实施方案中，掺入到经修饰抗体或抗体片段中的Cys可以通过与α-卤素羰基化合物，如下文方案Ib中所示的氯代、溴代或碘代乙酰胺反应来缀合。应该理解，除卤素以外的其他离去基团，如甲苯磺酸根、三氟甲磺酸根和其他烷基或芳基磺酸根可以用作离去基团Y。虽然方案Ib描述了Cys巯基与α-卤素乙酰胺的反应，但是所述方法包括掺入的Cys的硫与式Y-CHR-C(＝O)-的基团的烷基化，其中R是H或C1-4烷基，Y是离去基团(通常是C1、Br或I，和任选地烷基磺酸根或芳基磺酸根)；其不限于酰胺。
方案Ib.通过与α-卤素羰基化合物反应的缀合。
Y是离去基团(Cl、Br、I、Otf等)
LU是接头单元
X是有效载荷或药物部分
或者，掺入到经修饰抗体或抗体片段中的Cys可以通过在诱导外部巯基与下文方案Ic中所示的掺入的半胱氨酸残基的硫原子之间的二硫键的形成的条件下与外部巯基反应来缀合。在这些实例中，R可以是H；然而，已经发现化合物增加二硫化物的稳定性，在所述化合物中一个或两个R基团代表烷基基团，例如甲基。
方案Ic.通过二硫化物形成的缀合。
每个R独立地是H或C1-4烷基
LU是接头单元
X是有效载荷或药物部分
仅通过举例，在上文方案(Ia)-(Ic)中阐明了此类翻译后修饰，其中起始结构代表在本文鉴定的特定位点之一掺入到抗体的轻链或重链中的半胱氨酸。用于进行每种这些缀合方法的方法为本领域所熟知。可以通过这些方法在其轻链，或其重链，或轻链和重链中修饰抗体。其中每条轻链或每条重链已经被修饰以含有单个掺入的半胱氨酸的抗体一般将含有两个缀合位点，因为抗体通常含有两条轻链和两条重链。
缀合时，本发明的修饰抗体通常含有1-12，经常2-8，并优选2、4或6个6–LU-X(接头单元-有效载荷)部分。在一些实施方案中，修饰抗体轻链或重链以在本文为Cys取代鉴定的特定位点中的两个中掺入两个新的Cys残基(或者，一个Cys掺入到轻链中，一个掺入到重链中)，所以四聚体抗体最终含有四个缀合位点。同样地，可以通过利用本文在轻链或重链或其组合中鉴定的特定位点上的Cys替换3或4个其天然氨基酸来修饰抗体，导致在四聚体抗体中产生6或8个缀合位点。
这些缀合物中的X代表有效载荷，其可以是用于附着抗体的任何化学部分。在一些实施方案中，X是选自细胞毒素、抗癌剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、免疫增强剂，和麻醉剂或任何其他治疗剂，或生物活性部分或药物部分的药物部分。在另一实施方案中，X是标记物，如生物物理探针、荧光团、亲和探针、分光镜探针、放射性探针、自旋标记或量子点。在其他实施方案中，X是化学部分，其修饰抗体的理化性质，如脂质分子、聚乙二醇、聚合物、多糖、脂质体或螯合剂。在其他实施方案中，X是功能或可检测生物分子，如核酸、核糖核酸、蛋白质、肽(例如，酶或受体)、糖或多糖、抗体，或抗体片段。在其他实施方案中，X是锚定部分，如纳米颗粒、PLGA颗粒，或表面，或用于特异性结合缀合物与另一部分的任何结合部分，如组氨酸标签，聚G、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等。在其他实施方案中，X是反应性官能团，其可以用于将抗体缀合物附着到另一化学部分上，如药物部分、标记、另一抗体、另一化学部分或表面。
接头单元(LU)可以是任何合适的化学部分，其将巯基反应基团(例如，马来酰亚胺、α-卤代羰基、乙烯基羰基(例如，丙烯酸酯或丙烯酰胺)、乙烯基砜、乙烯基吡啶或巯基)共价附着到有效载荷上。许多合适的LU为本领域所知。例如，LU可以包含本文称为L1、L2、L3、L4、L5和L6的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个接头。在某些实施方案中，LU包含选自非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或其任何组合的接头，并且LU任选地含有自降解(self-immolative)间隔基。
在一些实施方案中，LU是式-L1-L2-L3-L4-or-L1-L-L3-L4-L5-L6-的基团。用于LU的连接基团L1、L2、L3、L4、L5和L6包括亚烷基-(CH2)n-(其中n是1-20，通常是1-10或1-6)、乙二醇单元(-CH2CH2O-)n(其中n是1-20，通常是1-10或1-6)、酰胺–C(＝O)-NH-或–NH-C(＝O)-、酯类–C(＝O)-O-或–O-C(＝O)-、具有两个可用附着点的环如二价苯基、C3-8环烷基或C4-8杂环基、氨基酸–NH-CHR*-C＝O-或–C(＝O)-CHR*-NH-，其中R*是已知氨基酸的侧链(经常是典型氨基酸之一，但也包括例如正缬氨酸、正亮氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其他命名的α氨基酸)、已知氨基酸的多肽(例如，二肽、三肽、四肽等)、巯基-马来酰亚胺连接(来自SH与马来酰亚胺的加成)、-S-CR2-和其他巯基醚如-S-CR2-C(＝O)-或-C(＝O)-CR2-S-，其中R是如上文为方案Ic所定义,-CH2-C(＝O)-，和二硫化物(-S-S-)，以及任何这些与下文所述其他接头的组合，例如键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在一些实施方案中，当LU是-L1-L-L3-L4-L5-L6-时，L1、L2、L3、L4、L5和L6可以选自：
-A1-,-A1X2-和-X2-；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-,-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-,-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少一个是稳定的或不可切割的接头。在一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少一个是可切割的接头，其可以被化学切割(腙、二硫化物)或酶促切割。在一些实施方案中，酶促可切割的接头是通过肽酶容易切割的接头：两个已知氨基酸的二肽Val-Cit接头(缬氨酸-瓜氨酸)是一种这样的接头。在另一实施方案中，酶促可切割的接头是通过葡糖苷酸酶的活性触发的一种接头：
是此类接头的实例，其也包含自降解间隔基，所述自降解间隔基一旦葡糖苷酸酶切割糖苷键后就在生理条件下自发分开。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含式IIA或IIB的经修饰半胱氨酸残基：
其中–CH2-S-代表在本文所述的所选Cys取代位点之一上掺入的Cys的侧链，并且L2–L6和X分别代表连接基团和有效载荷，如本文进一步描述。在IIA的一些实施方案中，L是键。在IIB的一些实施方案中，L2是NH或O。在IIA和IIB的一些实施方案中，L3选自(CH2)1-10和(CH2CH2O)1-6。L4、L5和L6是选自本文所述那些的额外任选接头。在某些实施方案中，L6可以是羰基(C＝O)或包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中：
L1是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头，并且
L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头，并且
L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在LU的一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少一个是可切割的接头，并且认为LU是可切割的。同样，在LU的一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少一个是不可切割的接头。在某些这些实施方案中，LU的每个接头是不可切割的，并且认为LU是不可切割的。
在上述实施方案的一些中，其中LU是–L1–L2–L3–L4–，L1、L2、L3和L4中的至少一个是选自-A1-、-A1X2-和-X2-的接头；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在这些实施方案中，LU的其他接头独立地选自键、A1-、-A1X2-、-X2-、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头和包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头，并且
L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，L1是C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-CH2CH2-S-，所以LU是–C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-CH2CH2-S-L2-L3-L4-。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头；
L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头或光可切割的接头，并且
L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定的接头、光可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
L2是键、非酶促可切割的接头或不可切割的接头；
L3是键、非酶促可切割的接头或不可切割的接头；
L4是键、酶促可切割的接头或包含自降解间隔基的接头。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；
L2是键、-A2-或-A2X2-；
L3是键、-A3-或-A3X2-；
L4是键、-A4-、-A4X2-、
A1是-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；
A2是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NR4-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nS-、-(C(R4)2)nS-、-S(CH2)n-、-S(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH-、-(C(R4)2)nNH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(＝O)NH(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、
A3是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nS-、-(C(R4)2)nS-、-S(CH2)n-、-S(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(＝O)NH(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(＝O)-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mC(＝O)-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mC(＝O)-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、
A4是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；
L2是键、-A2-或-A2X2-；
L3是键、-A3-或-A3X2-；
L4是键、-A4-、-A4X2-、
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
A2是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或
A3是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或
A4-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
每个X2独立地选自键、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中
L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；
L2是键、-A2-或-A2X2-；
L3是键、-A3-或-A3X2-；
L4是键、-A4-、-A4X2-、
A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
A2是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或
A3是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或
A4是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；
每个X2独立地选自键、R8、 -S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；
每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，
每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；
每个R6独立地选自H、氟、-C(＝O)OH取代的苯甲氧基、–C(＝O)OH取代的苯甲基、-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R8独立地选自
R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一个实施方案中，L1是–(CH2)1-10-C(＝O)-，例如–(CH2)5-C(＝O)-；并且L2、L3和L4各自代表键。
在某些实施方案中，LU包含该式的val-cit接头，其中X代表有效载荷，通常是药物部分，如具有抗癌活性的一种：
当L4-L5-L6是如上所示的val-cit接头时，L3优选为–(CH2)2-6-C(＝O)-。
在某些实施方案中，X基团是美坦生类化合物，如DM1或DM4，或多拉司他汀类似物或衍生物，如多拉司他汀10或15和阿里他汀MMAF或MMAE，或加利车霉素如N-乙酰-γ-加利车霉素，或标记或染料，如罗丹明或四甲基罗丹明。
如本文所用，“接头”是任何化学部分，其能够将抗体或其片段连接到X基团(有效载荷)上以形成免疫缀合物。接头在化合物或抗体保持活性的条件下可以对切割敏感，如酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割，和二硫键切割。或者，接头可以基本上对切割有抗性。接头可以包括或可以不包括自降解间隔基。
如本文所用的将X1基团缀合到本文提供的经修饰抗体或其抗体片段上的非酶促可切割的接头的非限制性实例包括，酸不稳定性接头、含有二硫化物部分的接头、含有三唑部分的接头、含有腙部分的接头、含有硫醚部分的接头、含有重氮基部分的接头、含有肟部分的接头、含有酰胺部分的接头和含有乙酰胺部分的接头。
如本文所用的将X基团缀合到本文提供的经修饰抗体或其抗体片段上的酶促可切割的接头的非限制性实例包括，但不限于被蛋白酶切割的接头、被酰胺酶切割的接头和被β-葡糖苷酸酶或另一糖苷酶切割的接头。
在某些实施方案中，此类酶可切割的接头是被组织蛋白酶，包括组织蛋白酶Z、组织蛋白酶B、组织蛋白酶H和组织蛋白酶C切割的接头。在某些实施方案中，酶促可切割的接头是被组织蛋白酶切割的二肽，包括被组织蛋白酶Z、组织蛋白酶B、组织蛋白酶H或组织蛋白酶C切割的二肽。在某些实施方案中，酶促可切割的接头是组织蛋白酶B可切割的肽接头。在某些实施方案中，酶促可切割的接头是组织蛋白酶B可切割的二肽接头。某些实施方案中，酶促可切割的二肽接头是缬氨酸-瓜氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。如本文所用的将X基团缀合到本文提供的经修饰抗体或其抗体片段上的酶促可切割的接头的其他非限制性实例包括，但不限于
被β-葡糖苷酸酶切割的接头，例如，
参见Ducryetal,BioconjugateChem,(2010)vol.21(1),5-13。
“自降解间隔基”是在一端共价连接第一个化学部分并在另一端连接第二个化学部分，由此形成稳定的三部分分子的双功能化学部分。接头可以包含键合第三个化学部分的自降解间隔基，所述第三个化学部分可以从间隔基上被化学或酶促切割。自降解间隔基与第一个化学部分或第三个化学部分之间的键被切割后，自降解间隔基经历迅速且自发的分子内反应并由此从第二个化学部分上分离。这些分子内反应一般涉及电子重排，如1,4或1,6或1,8消去反应或环化以形成高度有利的五元环或六元环。在本发明的某些实施方案中，第一个或第三个部分是酶可切割的基团，并且该切割起因于酶促反应，而在其他实施方案中，第一个或第三个部分是酸不稳定基团并且该切割由于pH的改变而发生。如应用于本发明，第二个部分是本文定义的“有效载荷”基团。在某些实施方案中，第一个或第三个部分从自降解间隔基的切割起因于蛋白水解酶的切割，而在其他实施方案中，其起因于水解酶的切割。在某些实施方案中，第一个或第三个部分从自降解间隔基的切割起因于组织蛋白酶或葡糖苷酸酶的切割。
在某些实施方案中，酶可切割的接头是肽接头并且自降解间隔基在其一个末端共价连接肽接头并在其另一个末端共价连接药物部分。该三部分分子在缺少酶的情况下是稳定的并且在药理学上是失活的，但是其在共价连接间隔基部分和肽部分的键处可以被酶进行酶促切割。肽部分被从三部分分子上切割，其起始了间隔基部分的自降解特征，导致共价连接间隔基部分和药物部分的键自发切割，由此实现药理学活性形式的药物的释放。
在其他实施方案中，接头包含自降解间隔基，其在一端直接或间接连接肽，并在另一端连接有效载荷；并且所述间隔基附着到第三个部分上，其可以例如被葡糖苷酸酶从间隔基上酶促切割。切割第三个部分后，间隔基以引起有效载荷被释放的方式降解或重排。具有该类型的自降解间隔基的接头的实例是这种葡糖苷酸酶可切割的接头，其中通过葡糖苷酸酶催化的缩醛的水解释放在生理条件下自发分解的酚化合物：
任选地用于将X1基团缀合到本文提供的经修饰抗体或其抗体片段的自降解间隔基的非限制性实例包括，但不限于包括苯甲基羰基部分、二甲苯醚部分、4-氨基丁酸酯部分、hemithioaminal部分或N-acylhemithioaminal部分的部分。
自降解间隔基的其他实例包括，但不限于对-氨基苄氧基羰基、与对-氨基苄氧基羰基电子相似的芳族化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物和邻或对-氨基苄基缩醛。在某些实施方案中，本文所用的自降解间隔基(其在酰胺键水解后进行环化)包括取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺和2-氨基苯基丙酸酰胺。
在某些实施方案中，自降解间隔基是
而在其他实施方案中，自降解间隔基是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔基是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔基是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔基是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔基是其中n是1或2。
方案(2a-2c)阐明本文提供的经修饰抗体或其抗体片段的翻译后修饰，其中接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，并且L1在每种情况下是与新Cys反应的基团。
方案2a.
方案2b.
方案3c.
在方案2a-2c的每个中，起始材料是如本文所述修饰的抗体或抗体片段中的替换Cys残基，其中虚线键表明连接到抗体或抗体片段的邻接残基；每一个R是H或C1-4烷基，通常是H或甲基；L2、L3和L4是连接单元LU的组分，如上文描述的那些；X是有效载荷；并且连接L2与本发明的取代基Cys的硫的基团是L1。
在本发明的一些实施方案中，X是反应性官能团，其可以通过与合适的互补性官能团相互作用连接缀合的抗体与另一化学部分。表4描述了X可以代表的反应性官能团与可以用于连接包含X的缀合物与另一化合物的互补性官能团的一些实例。使用X来连接相应的互补性官能团的方法为本领域所熟知。通常使用‘Click’或无铜click化学作用完成使用叠氮化合物的连接；涉及肼、烷氧基胺或酰基肼的反应通常通过与羰基官能团之一形成希夫碱进行。
表4
在表5中描述了使用这些组分制备的示例性连接产物，其中Y1代表本发明的抗体，A1代表连接抗体与有效载荷Xa的连接单元(LU)，式II-a中的-L2-L3-L4-代表可以存在于分子中通过Xa连接缀合抗体的接头单元，并且X1代表有效载荷。有效载荷Xa是反应性官能团，并且式II-a上的Xb是相应的互补性官能团，并且式II-a本身代表待连接缀合抗体的分子。表5中的第三列描述了来自Xa与Xb反应的产物。
表5
在某些实施方案中，本文提供的经修饰抗体或其抗体片段以约1-16，如1-12，或1、2、3、4、5、6、7或8的“X基团-比-抗体”(有效载荷比抗体)比值缀合，其中所述经修饰抗体或其抗体片段含有在本文公开的特定位点掺入的1、2、3、4、5、6、7或8个半胱氨酸残基。例如，可以通过将两个Cys残基掺入到抗体的重链中来实现4的“X基团-比-抗体”比值，其将含有4个缀合位点，两个来自每条重链。此类抗体的免疫缀合物将含有高达4个有效载荷基团，其可以相同或不同并且优选为全部相同。在另一实例中，可以通过将一个Cys残基掺入到抗体的重链中并将第二个Cys残基掺入到轻链中来实现4的“X基团-比-抗体”比值，产生4个缀合位点，两个位于两条重链中，两个位于两条轻链中。可以通过抗体的重链和轻链中3、4或更多个半胱氨酸取代的组合来实现比值6、8或更高。多个半胱氨酸基团取代到抗体中可以导致不适当的二硫化物形成和其他问题。因此为了将多于4个有效载荷基团装载到一个抗体分子上，本发明的方法可以备选地与不依赖于半胱氨酸硫上的反应，如赖氨酸上的酰基化的方法，或通过S6标签或Pcl方法缀合。
尽管有效载荷与抗体比值对特定的缀合分子具有精确的值，但应理解当用于描述含有许多分子的样品时，通常在缀合步骤中，由于一些程度的不同质性，该值经常是平均值。免疫缀合物样品的平均装载在本文中称为药物比抗体比值，或DAR。在一些实施方案中，DAR在约1-约16之间，通常是约1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，以重量计至少50％的样品是具有平均比值加或减2的化合物，并且优选地，样品的至少50％是含有平均比值加或减1的缀合物。优选的实施方案包括免疫缀合物，其中DAR是约2或约8，例如，约2、约4、约6或约8。在一些实施方案中，‘约n’的DAR表示用于DAR的测量值在n的10％内(在式(I)中)。
3.Fc区的构架的其他改变
本发明提供位点特异性标记的免疫缀合物。本发明的免疫缀合物可以包含经修饰抗体或其抗体片段，其进一步包含对VH和/或VL内的构架残基的修饰，例如来改善抗体的性质。通常，进行此类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更尤其地，已经进行了体细胞突变的抗体可以含有不同于抗体来源的种系序列的构架残基。可以通过比较抗体构架序列与抗体来源的种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成其种系构型，例如通过位点定向诱变可以将体细胞突变“回复突变”成种系序列。本发明也旨在包括此类“回复突变的”抗体。
另一种类型的构架修饰涉及突变构架区内，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T-细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。
除了构架或CDR区内进行的修饰或作为它的备选，可以改造本发明的抗体以在Fc区内包括修饰，通常用于改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外，可以化学修饰本发明的抗体(例如一个或多个化学部分可以附着到抗体上)或修饰本发明的抗体以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。在下文中进一步详细地描述了这些实施方案中的每一个。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，从而铰链区中的半胱氨酸残基的数量被改变，例如增加或减少。该方法进一步描述于Bodmer等的美国专利号5,677,425中。例如改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量，以促进轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更尤其地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，从而所述抗体相对于天然的Fc-铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌(Staphylococcyl)蛋白A(SpA)结合。该方法进一步详细描述于Ward等的美国专利号6,165,745中。
在又一实施方案中，通过不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以利用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，从而所述抗体对效应配体具有改变的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法描述于例如Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，从而所述抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法描述于例如Idusogie等的美国专利号6,194,551中。
在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。该方法描述于例如Bodmer等的PCT公开WO94/29351中。在特定的实施方案中，本发明抗体或其抗体片段的一个或多个氨基酸被一个或多个异型氨基酸残基，如图4中为IgG1亚类和κ同种型显示的那些氨基酸残基替换。异型氨基酸残基也包括，但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等,MAbs.1:332-338(2009)所述。
在又一实施方案中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法描述于例如Presta的PCT公开WO00/42072中。此外，已经对人IgG1与FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点作图并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。
在又一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺少糖基化)。例如可以改变糖基化以增加抗体对“抗原”的亲和力。例如可以通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区构架糖基化位点被消除，由此消除该位点上的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。该方法描述于例如Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
此外或备选地，可以制备抗体，其具有改变类型的糖基化，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。例如可以通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来实现此类碳水化合物修饰。本领域已经描述了具有改变的糖基化机器的细胞并且其可以用作这样的宿主细胞，所述宿主细胞中表达本发明的重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等的EP1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体展示低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO03/035835描述了变体CHO细胞系，Lecl3细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)连接的碳水化合物上的能力降低，也导致宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖化(也参见Shields等,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公开WO99/54342描述了被改造以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而在改造的细胞系中表达的抗体展示增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的增加的ADCC活性(还参见Umana等,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。多种方法是可能的。例如，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S或T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。或者，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获得的挽救受体结合表位，如的Presta等美国专利5,869,046和6,121,022中所述。
4.抗体缀合物
本发明提供位点特异性标记方法、经修饰抗体及其抗体片段，和因此制备的免疫缀合物。使用本发明的方法，经修饰抗体或其抗体片段可以缀合到标记上，如药物部分，例如抗癌剂、自身免疫治疗剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、或麻醉剂、或成像试剂，如用于PET成像的螯合剂、或荧光标记、或MRI造影试剂。也可以使用若干相同的或不同的标记部分，组合本发明的方法与其他缀合方法缀合抗体或抗体片段。
在某些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含药物部分，其选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里他汀、多拉司他汀、美坦生类化合物、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA合成抑制剂、驱动蛋白抑制剂、蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂，和DHFR抑制剂。
此外，本发明的经修饰抗体或抗体片段可以缀合到修饰给定生物应答的药物部分。药物部分不理解为受限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是免疫调节剂，如免疫增强剂、小分子免疫增强剂、TLR激动剂、CpG寡聚体、TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR9激动剂、TLR8激动剂、T细胞表位肽等。药物部分还可以是寡核苷酸、siRNA、shRNA、cDNA等。或者，药物部分可以是具有想要的生物活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可以包括例如，毒素如相思豆蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素，或白喉毒素、蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、细胞凋亡剂、抗血管发生剂、或生物应答修饰剂如例如淋巴因子。
在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段缀合药物部分，如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。细胞毒素的实例包括但不限于，紫杉烷类(参见例如，国际(PCT)专利公开号WO01/38318和PCT/US03/02675)、DNA烷化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、tubulysin类似物、多卡米星类似物、阿里他汀E、阿里他汀F、美坦生类化合物，和细胞毒素剂，包含反应性聚乙二醇部分(参见例如，Sasse等,J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000)、Suzawa等,Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000)、Ichimura等,J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53(1991)、Francisco等,Blood(2003)(印刷公开之前的电子公开)、美国专利号5,475,092、6,340,701、6,372,738,和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923A1、待决的美国专利申请系列号10/024,290和10/116,053，和国际(PCT)专利申请号WO01/49698)、紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾甾酮、糖皮质激素和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、消融剂(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C，和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环类(例如，柔红霉素,(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(先前的放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)(参见例如，SeattleGeneticsUS20090304721)。
可以缀合本发明的经修饰抗体或抗体片段的治疗性细胞毒素的其他实例包括多卡米星、加利车霉素、美登素和阿里他汀，及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的实例是可以通过商业途径获得的(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。
为了进一步讨论细胞毒素的类型、用于将治疗剂缀合到抗体上的接头和方法，也参见Saito等,(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215；Trail等,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)CancerCell3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
根据本发明，经修饰抗体或其抗体片段也可以缀合到放射性同位素上以产生细胞毒性放射性药物，称为放射性免疫缀合物。可以缀合到抗体上以诊断或治疗使用的放射性同位素的实例包括，但不限于碘l31、铟111、钇90和镥177。在本领域建立了用于制备放射性免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的实例是可以通过商业途径获得的，包括ZevalinTM(DECPharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且类似的方法可以用于使用本发明的抗体制备放射性免疫缀合物。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可以通过接头分子附着抗体。此类接头分子通常为本领域所知并描述于Denardo等,(1998)Clin.CancerRes.4(10):2483-90；Peterson等,(1999)Bioconjug.Chem.10(4):553-7；andZimmerman等,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中，各自完整并入作为参考。
本发明还提供特异性结合抗原的经修饰抗体或其片段。经修饰抗体或片段可以缀合或融合异源蛋白质或多肽(或其片段，优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白质。具体而言，本发明提供包含本文所述的抗体片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH片段、VHCDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白质。
在一些实施方案中，使用没有抗原结合特异性的经修饰抗体片段，如但不限于具有本发明的改造的半胱氨酸残基的经修饰Fc结构域来产生包含该抗体片段(例如改造的Fc)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白质。
可以通过基因穿梭、基序穿梭、外显子穿梭，和/或密码子穿梭(统称为“DNA穿梭”)的技术产生额外的融合蛋白质。DNA穿梭可以用于改变本发明抗体或其片段的活性(例如具有较高亲和力和较低解离常数的抗体或其片段)。一般参见美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等,(1997)Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,(1998)TrendsBiotechnol.16(2):76-82；Hansson等,(1999)J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,(1998)Biotechniques24(2):308-313(这些专利和公开物中的每一项完整并入作为参考)。可以在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或其片段，或编码的抗体或其片段。编码特异性结合抗原的抗体或其片段的多核苷酸可以与一个或多个异源分子的一种或多种组分、基序、部分(sections)、部分(parts)、结构域、片段等组合。
此外，本发明的经修饰抗体或其抗体片段可以缀合标志物序列，如肽以便于纯化。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体中提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)，其中许多是可以通过商业途径获得的。如在Gentz等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所述,例如，六组氨酸提供融合蛋白质的便利纯化。用于纯化的其他肽标签包括，但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于来自流行性感冒血凝素蛋白质的表位(Wilson等,(1984)Cell37:767)，和“FLAG”标签(A.Einhauer等,J.Biochem.Biophys.Methods49:455–465,2001)。根据本发明，抗体或抗体片段还可以缀合肿瘤穿透肽，以增强其效力。
在其他实施方案中，本发明的经修饰抗体或抗体片段缀合诊断性或可检测的试剂。此类免疫缀合物可以用于监测或预后疾病或病症的起始、发展、进展和/或严重性，作为临床测试程序的一部分，如确定特定疗法的效力。可以通过偶联抗体与可检测物质来完成该诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于荧光酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I、和121I,)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、和111In,)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn、和117Sn；和使用多种正电子发射断层的正电子发生金属和非放射性顺磁金属离子。
本发明的经修饰抗体或抗体片段还可以附着到固体支持物上,其特别用于靶抗原的免疫测定或纯化。此类固体支持物包括，但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.药物组合物
为了制备包括免疫缀合物的药物或无菌组合物，将本发明的免疫缀合物与药学上可接受的载体或赋形剂混合。组合物可以额外地含有一种或多种其他治疗剂，其适合于治疗或预防癌症(乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓样细胞白血病、慢性髓样细胞白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤(例如，神经鞘瘤)、头颈癌、膀胱癌、食管癌、巴雷特食管癌、成胶质细胞瘤、软组织的明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、gynacomastica和子宫内膜异位)。
可以通过与例如冻干粉剂、浆液、水溶液、乳液或悬浮液形式的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗和诊断剂的制剂(参见例如Hardman等,Goodman和Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.,2001；Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippincott,Williams,andWilkins,NewYork,N.Y.,2000；Avis,等(编辑),PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY,1993；Lieberman,等(编辑),PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY,1990；Lieberman,等(编辑)PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY,1990；WeinerandKotkoskie,ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,2000)。
为治疗剂选择施用方案取决于若干因素，包括实体的血清或组织更新速率、症状水平、实体的免疫原性，和生物基质中靶细胞的可及性。在某些实施方案中，施用方案使得向患者递送的治疗剂量最大化，与副作用的可接受水平一致。因此，所递送的生物剂的量部分取决于特定的实体和所治疗的状况的严重性。可以获得选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量中的指导(参见例如，Wawrzynczak,AntibodyTherapy,BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编辑),MonoclonalAntibodies,CytokinesandArthritis,MarcelDekker,NewYork,N.Y.,1991；Bach(编辑),MonoclonalAntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseases,MarcelDekker,NewYork,N.Y.,1993；Baert等,NewEngl.J.Med.348:601-608,2003；Milgrom等,NewEngl.J.Med.341:1966-1973,1999；Slamon等,NewEngl.J.Med.344:783-792,2001；Beniaminovitz等,NewEngl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等,NewEngl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等,NewEngl.J.Med.343:1594-1602,2000)。
由临床医师，例如使用本领域已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素进行适当剂量的测定。一般地，剂量以多少少于最佳剂量的量开始，然后其以小增量增加，直至相对于任何不利副作用实现想要的或最佳的效果。重要的诊断量度包括例如炎症的症状或所产生的炎性细胞因子的水平的那些量度。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可有变动，以获得有效量的活性成分，其对于特定患者、组合物和施用方式实现想要的治疗应答有效，而对患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所使用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往病史、以及医学领域已知的类似因素。
可以通过连续输注，或通过例如一天、一周或每周1-7次的间隔剂量提供包含本发明的抗体或其片段的组合物。可以经静脉内、皮下、局部、口、鼻、直肠、肌内、大脑内或通过吸入提供剂量。具体的剂量方案是涉及避免明显不想要的副作用的最大剂量或剂量频率的一种方案。
对于本发明的免疫缀合物，向患者施用的剂量可以是0.0001mg/kg-100mg/kg患者体重。所述剂量可以在0.0001mg/kg-20mg/kg、0.0001mg/kg-10mg/kg、0.0001mg/kg-5mg/kg、0.0001-2mg/kg、0.0001-1mg/kg、0.0001mg/kg-0.75mg/kg、0.0001mg/kg-0.5mg/kg、0.0001mg/kg-0.25mg/kg、0.0001-0.15mg/kg、0.0001-0.10mg/kg、0.001-0.5mg/kg、0.01-0.25mg/kg或0.01-0.10mg/kg患者体重之间。可以使用千克(kg)患者体重乘以待以mg/kg施用的剂量来计算本发明的抗体或其片段的剂量。
可以重复本发明的免疫缀合物的剂量并且施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在具体的实施方案中，每3周重复本发明的免疫缀合物的剂量。
用于特定患者的有效量可以取决于这样的因素，如治疗的状况、患者的整体健康、施用的方法途径和剂量和副作用的严重性而变化(参见例如，Maynard等,AHandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,InterpharmPress,BocaRaton,Fla.,1996；Dent,GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,UrchPubl.,London,UK,2001)。
施用途径可以是通过例如局部或表皮应用、通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊髓内、损伤内或通过持续释放系统或植入物注射或输注(参见例如Sidman等,Biopolymers22:547-556,1983；Langer等,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982；Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692,1985；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。需要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以在注射位点上减轻疼痛。此外，还可以例如通过使用吸入器或喷雾器，和利用气溶胶剂的制剂使用肺施用。参见例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572,WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903，其各自以其整体通过引入并入本文。
还可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经过一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。技术人员应当理解，施用的途径和/或方式将根据想要的结果而变化。为本发明的免疫缀合物所选的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。肠胃外施用可以代表除肠和局部施用以外的施用方式，一般是通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，可以经过非胃肠外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部施用本发明的组合物。在一个实施方案中，通过输注施用本发明的免疫缀合物。在另一实施方案中，皮下施用本发明的免疫缀合物。
如果在控制释放或持续释放系统中施用本发明的免疫缀合物，那么可以使用泵来实现控制或持续释放(参见Langer,上文；Sefton,CRCCrit.RefBiomed.Eng.14:20,1987；Buchwald等,Surgery88:507,1980；Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。聚合材料可以用于实现本发明治疗的控制或持续释放(参见例如，MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(编辑),CRCPres.,BocaRaton,Fla.,1974；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,NewYork,1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983；还参见Levy等,Science228:190,1985；During等,Ann.Neurol.25:351,1989；Howard等,J.Neurosurg.71:105,1989；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO99/20253)。用于持续释放制剂中的聚合物的实例包括,但不限于聚(2-羟基乙基异丁烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(异丁烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放制剂中的聚合物是惰性的、没有可滤去的杂质、储存稳定的、无菌的和生物可降解的。可以将控制或持续释放系统置于预防性或治疗性靶标的附近，因而仅需要全身性剂量的一部分(参见，例如，Goodson,inMedicalApplicationsofControlledRelease,上文,第2卷,第115-138页,1984)。
控制释放系统在Langer,Science249:1527-1533,1990的综述中进行了讨论。本领域技术人员已知的任何技术均可以用于产生包含本发明的一种或多种免疫缀合物的持续适当制剂。参见例如美国专利号4,526,938、PCT公开WO91/05548,PCT公开WO96/20698,Ning等,Radiotherapy&Oncology39:179-189,1996；Song等,PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397,1995；Cleek等,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997；和Lam等,Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760,1997，其各自完整并入作为参考本文。
如果局部施用本发明的免疫缀合物，那么它们可以以软膏、乳膏、透皮贴剂、乳液、凝胶、香波、喷雾、气溶胶、溶液、乳液的形式或本领域技术人员所熟知的其他形式配制。参见例如，Remington'sPharmaceuticalSciencesandIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第19版,MackPub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于非喷雾局部剂量形式，通常使用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂并具有动力学粘度(在一些情况下高于水)的粘稠至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏、软膏剂、粉剂、搽剂、药膏等，需要时，其是无菌的或与辅剂混合(例如，防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)用于影响多种性质，如例如渗透压。其他合适的局部剂量形式包括可喷雾的气溶胶制剂，其中在一些情况下活性成分与固体或液体惰性载体组合包装在与加压挥发物(例如，气体推进剂，如FreonTM)的混合物中或挤压瓶中。需要时，也可以向药物组合物和剂量形式中加入增湿剂或湿润剂。此类额外成分的实例为本领域所熟知。
如果鼻内施用包含免疫缀合物的组合物，那么其可以配制成气溶胶形式、喷雾剂、液体喷雾或滴剂形式。具体而言，可以以从加压包装或喷雾器气溶胶喷雾呈递的形式，利用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)方便地递送根据本发明使用的预防性或治疗性试剂。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门确定剂量单位以递送计量的量。可以配制胶囊和药筒(例如由明胶组成)用于吸入器或吹入器，其含有化合物与合适粉基，如乳糖或淀粉的粉末混合物。
与第二种治疗剂共施用或利用第二种治疗剂治疗的方法为本领域所知，所述第二种治疗剂例如是细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或辐射(参见例如，Hardman等,(编辑)(2001)GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,10.sup.thed.,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.；Poole和Peterson(编辑)(2001)PharmacotherapeuticsforAdvancedPractice:APracticalApproach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编辑)(2001)CancerChemotherapyandBiotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。治疗剂的有效量可以减轻症状至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％或至少50％。
可以与本发明的免疫缀合物组合施用的额外疗法(例如,预防剂或治疗剂)可以与本发明的免疫缀合物间隔低于5分钟、低于30分钟、1小时、约1小时、约1至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约7小时、约7小时至约8小时、约8小时至约9小时、约9小时至约10小时、约10小时至约11小时、约11小时至约12小时、约12小时至18小时、18小时至24小时、24小时至36小时、36小时至48小时、48小时至52小时、52小时至60小时、60小时至72小时、72小时至84小时、84小时至96小时、或96小时至120小时施用。两种或多种疗法可以在同一次患者就诊中施用。
在某些实施方案中，可以配制本发明的免疫缀合物以保证体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了保证本发明的治疗化合物穿过BBB(需要时)，例如可以在脂质体中配制它们。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种部分，其选择性地被运输到特定细胞或器官中，因此增强靶向药物递送(参见例如，Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等,(1995)FEBSLett.357:140；Owais等,(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等,(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreieretal,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。
本发明提供用于向需要的受试者施用包含单独本发明的免疫缀合物或与其他治疗组合的药物组合物的方案。可以向受试者同时或顺序施用本发明的组合治疗的治疗(例如，预防性或治疗性试剂)。也可以循环施用本发明的组合治疗的治疗(例如，预防性或治疗性试剂)。循环治疗涉及施用第一种治疗(例如第一种预防性或治疗性试剂)一段时间，随后施用第二种治疗(例如第二种预防性或治疗性试剂)一段时间并重复该顺序施用，即循环，以降低对一种治疗(例如试剂)抵抗力的产生，来避免或减少一种治疗(例如试剂)的副作用，和/或改善治疗的效力。
可以向受试者同时施用本发明的组合治疗的治疗(例如，预防性或治疗性试剂)。
术语“同时”不限于在精确的相同时间施用治疗(例如，预防性或治疗性试剂)，但其也意味着顺序地并以一定时间间隔向受试者施用包含本发明的抗体或其片段的药物组合物，从而本发明的抗体可以与其他一种治疗或多种治疗一起起作用以提供比如果以另外方式施用它们增加的益处。例如，每一种治疗可以同时或以任何顺序在不同时间点上顺序向受试者施用；然而，如果不同时施用，那么它们应该在足够近的时间上施用，以提供想要的治疗或预防效果。可以以任何适当形式并通过任何合适途径分别向受试者施用每一种治疗。在多个实施方案中，相隔低于15分钟、低于30分钟、低于1小时、约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约7小时、约7小时至约8小时、约8小时至约9小时、约9小时至约10小时、约10小时至约11小时、约11小时至约12小时、24小时、48小时、72小时或1周向受试者施用治疗(例如，预防性或治疗性试剂)。在其他实施方案中，在同一次患者就诊中施用两种或多种治疗(例如，预防性或治疗性试剂)。
组合治疗的预防性或治疗性试剂可以在相同的药物组合物中向受试者施用。或者，组合治疗的预防性或治疗性试剂可以在单独的药物组合物中同时向受试者施用。预防性或治疗性试剂可以通过相同的或不同的施用途径向受试者施用。
已经完全描述本发明，其通过以下实施例和权利要求进一步进行阐明，所述实施例和权利要求为说明性的并不旨在进一步限制。
实施例
实施例1.选择人IgG1重链和κ轻链中用于Cys突变的表面可及位点
使用Tsodikov等,“Anovelcomputerprogramforfastexactcalculationofaccessibleandmolecularsurfaceareasandaveragesurfacecurvature,”J.Comput.Chem.,23,600-609(2002)描述的计算机程序SurfaceRacer5.0，在hIgG1/κ抗体(ProteinDatabankstructureentry1HZH.pdb,表6,表7,图1)中鉴定人IgG1重链和人κ轻链的恒定区中的表面暴露残基。基于以下标准，88个残基被选择用于Cys取代，hIgG重链中的59个位点和人κ轻链中的29个位点：1)选择重链恒定区和轻链恒定区的CH1、CH2和CH3结构域中的残基；2)选择表面暴露的残基但避免全部暴露的残基和C末端区以避免抗体间二聚体的形成；3)聚焦在极性或荷电的残基，如Ser、Thr、Lys、Arg、Glu和Asp上；和4)排除FcRn结合结构域、蛋白A结合结构域和重链铰链区中的残基。
标准1)，即在抗体的恒定区中选择Cys取代位点，保证缀合位点到许多不同抗体的可转移性。标准2)基于为Cys取代主要暴露的残基(基于该标准排除的残基列于表6中)对抗体间二聚体形成的观察。基于IgG晶体结构，考虑Cys侧链的推测方向：这样的残基(Cys侧链可能被部分屏蔽与另一抗体的相互作用但是可能仍然与小分子有效载荷反应)比具有更大的表面可及性但具有使得能够与大的大分子如二聚体形成相互作用的方向的残基更有利。实施标准3)来促进保守突变以使抗体上突变的去稳定效应最小化。同样地，标准4)用于避免对抗体的功能改变，如对FcRn和蛋白A结合的效应，其可能分别影响抗体的药物动力学性质或可能导致纯化处理的丢失。基于标准4排除的残基列于表6中。88个所选的突变位点在hIgG1/κ的结构模型中的定位表明所选位点是表面可及的(图2)。
表6.人IgG1重链的氨基酸残基的表面可及性。使用SurfaceRacer5.0计算表面可及性并将其表示为平方埃“排除的位点”指出由于实施例1中提及的原因从选择中排除的位点。“选择的位点”是在本发明中为取代为Cys所选的位点。
表7.人κ轻链的氨基酸残基的表面可及性。使用SurfaceRacer5.0计算表面可及性并将其表示为平方埃“选择的位点”是在本发明中为取代为Cys所选的位点。
实施例2.制备曲妥珠单抗Cys突变抗体
化学合成编码曲妥珠单抗的重链和轻链的可变区的DNA并将其克隆到含有人IgG1和人κ轻链的恒定区的两个哺乳动物表达载体pOG-HC和pOG-LC中，分别产生两个野生型构建体pOG-曲妥珠单抗HC和pOG-曲妥珠单抗LC。在所述载体中，抗体重链和轻链构建体在哺乳动物细胞中的表达由CMV启动子驱动。所述载体在重链或轻链的N末端含有合成的24氨基酸信号序列：MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQIDNO:99)来指导其从哺乳动物细胞中分泌。已经证实该信号序列在指导293FreestyleTM细胞中的数百种哺乳动物蛋白质的蛋白分泌中有效。使用寡核苷酸指导的诱变在曲妥珠单抗中制备Cys突变构建体。化学合成88对突变引物(表8)，其对应于在实施例1中描述的人IgG1重链和κ轻链的恒定区中所选的88个Cys突变位点。在PCR扩增之前将正义和反义突变引物对混合。通过使用PfuUltraIIFusionHSDNA聚合酶(Stratagene)，利用pOG-曲妥珠单抗HC和pOG-曲妥珠单抗LC作为模板进行PCR反应。PCR反应后，在琼脂糖凝胶上验证PCR产物，并利用DPNI处理，随后在DH5a细胞中转化(Klock等,(2009)MethodsMolBiol.498:91-103)。
通过DNA测序验证88个Cys突变构建体的序列。野生型曲妥珠单抗重链的全长氨基酸序列显示为SEQIDNO:1，轻链的全长氨基酸序列显示为SEQIDNO:90。59个曲妥珠单抗HCCys突变构建体(SEQIDNO:2-SEQIDNO:60)和29个曲妥珠单抗LCCys突变构建体(SEQIDNO:61-SEQIDNO:89)的恒定区的编码蛋白质序列分别示于表9和表10中。通过Eu编号系统编号人IgG1重链和人κ轻链中的氨基酸残基(Edelman等,(1969)ProcNatlAcadSciUSA,63:78-85)。
表8.用于制备人IgG1的88条Cys突变重链和轻链的突变引物的DNA序列。
表9.人IgG1重链中Cys突变构建体的恒定区的氨基酸序列。SEQIDNO:1是全长曲妥珠单抗的序列(人IgG1)。SEQIDNO:2-SEQIDNO:60表明人IgG1重链中59个Cys突变构建体的序列ID号，仅显示恒定区的序列。
表10.29个人κ轻链Cys突变构建体的恒定区的氨基酸序列。SEQIDNO:61是野生型人κ轻链的恒定区的序列。SEQIDNO:62-SEQIDNO:90指出人κ轻链的恒定区中29个Cys突变构建体的序列ID号。
实施例3.转移曲妥珠单抗重链和轻链Cys突变至不同的抗体中
对于曲妥珠单抗，选择用于药物有效载荷附着的所有Cys突变位于其人IgG1重链和人κ轻链的恒定区中。因为抗体的恒定区在一级序列和结构中高度保守，在曲妥珠单抗背景中被鉴定为良好有效载荷附着位点的Cys突变残基也将充当其他抗体中的优选附着残基。为了证明这些一般性缀合位点至其他抗体的可转移性，我们将一组Cys突变克隆至抗体14090中。抗体14090是具有人IgG1重链和人λ轻链的抗体，其结合不同的靶蛋白质而非曲妥珠单抗。将编码抗体14090的可变区的DNA克隆到七个所选pOG曲妥珠单抗HCCys突变质粒构建体中(表11中列出的SEQIDNO)来替换如实施例2中描述的质粒中的曲妥珠单抗构建体的可变区。结果，抗体14090和曲妥珠单抗的相应的七个Cys构建体中重链恒定区的氨基酸序列相同(图3)。随后的实验显示这些位点可以容易地缀合。相反，由于不同人IgG同种型的一级序列和三级结构具有高度的相似性(图4)，曲妥珠单抗的κ轻链上的Cys突变可以被容易地转移到含有不同同种型重链的人抗体上的等同轻链中。同样地，在IgG1的恒定区中鉴定的位点可以转移到IgG2、IgG3和IgG4中。
实施例4.人λ轻链中的半胱氨酸突变
人λ和κ轻链具有很少的氨基酸序列相似性(图5A)。基于含有人λ轻链的Fab的蛋白质晶体结构模型(ProteinDatabankstructureentry3G6D.pdb)中的残基参考曲妥珠单抗的κ轻链中的想要残基的位置的近似相似性选择抗体14090的λ轻链中的突变(图5A和B)。使用寡核苷酸定向诱变(Higuchi等1988)与PIPE克隆策略(Klock和Lesley,2009)组合在抗体14090-λ轻链质粒中产生七个额外的Cys突变构建体。用于在λ轻链中产生Cys点突变的突变引物列于表12中。抗体14090的分泌也由合成的24氨基酸信号序列指导：MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQIDNO:99)。通过DNA测序验证抗体14090Cys构建体的序列。人野生型λ轻链的恒定区的序列显示为SEQIDNO:91。轻链中七个Cys突变构建体的编码蛋白质序列(SEQIDNO:92-SEQIDNO:98)示于表13中。随后的实验将显示这些Cys突变体与ADC有效载荷有效地缀合。因为所有这些突变体位于人λ轻链的恒定区中，所以这些缀合位点可以被容易地转移到具有λ轻链的其他抗体中。
表11.用于克隆抗体14090的可变区的曲妥珠单抗重链Cys构建体的序列ID号。
曲妥珠单抗HC Cys构建体的序列ID NO:
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:18
SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:50
表12.用于在人IgG1的λ轻链中诱变七个Cys突变构建体的引物的核苷酸序列。
表13.抗体14090λ轻链中Cys突变构建体的恒定区的氨基酸序列。SEQIDNO:91是野生型人λ轻链的恒定区的序列。SEQIDNO:91-SEQIDNO:98指出抗体14090的人λ轻链的恒定区中7个Cys突变体的序列。
实施例5.在293FreestyleTM细胞中表达和纯化Cys突变抗体
使用先前所述的方法(Meissner,等,BiotechnolBioeng.75:197-203(2001))，通过共转染重链和轻链质粒在293FreestyleTM细胞中表达曲妥珠单抗抗体的Cys突变体。使用Qiagen质粒制备试剂盒，根据制造商的方案制备用于共转染的DNA质粒。在FreestyleTM表达培养基(Invitrogen)中于37℃，5％CO2下悬浮培养293FreestyleTM细胞。转染的前一天，将细胞分成0.7x106细胞/ml至新鲜培养基中。在转染的当天，细胞密度通常达到1.5x106细胞/ml。使用PEI方法，利用比例为1：1的重链和轻链质粒的混合物转染细胞(Meissner等,2001)。然后将转染的细胞进一步培养5天。通过在2000xg下离心20分钟从培养物中收集培养基并通过0.2微米过滤器进行过滤。使用蛋白A-SepharoseTM(GEHealthcareLifeSciences)从过滤的培养基中纯化所表达的抗体。通过洗脱缓冲液(pH3.0)从蛋白A-SepharoseTM柱上洗脱抗体IgG并立即用1MTris-HCl(pH8.0)中和，随后将缓冲液交换成PBS。
瞬时转染的293FreestyleTM中88个Cys曲妥珠单抗突变抗体的表达水平与野生型曲妥珠单抗的表达水平相似，其平均产量为18.6mg/L+/-9.5mg/L(表14)，提示所选位点中的单点突变不通过细胞分泌机器显著改变所表达抗体的滞留。使用非还原性SDSPAGE对纯化的曲妥珠单抗Cys突变抗体的分析表明Cys突变抗体不通过改造的半胱氨酸形成二硫化物连接的寡聚体(图6)。大小排阻层析(图7)进一步支持该结论，即所有的Cys突变曲妥珠单抗抗体是单体的。突变抗体的HPLC反相分析也提示在滞留时间和同质性方面大多数Cys突变抗体与野生型曲妥珠单抗不可辨别(图8)。通过质谱(完整LC-MS)对非还原性去糖基化的全长曲妥珠单抗LC-R108C的分析揭示大多数抗体被两个半胱氨酸修饰(图9和表15)。这些观察与先前的出版物一致，其表明当在293freestyleTM细胞中表达时，曲妥珠单抗Cys突变抗体中的经改造半胱氨酸的硫羟基被半胱氨酸修饰，并且在与任何硫羟基反应试剂缀合之前需要通过还原试剂去除所述修饰(Chen,等,mAbs1:6,563-571,2009)。
使用所述PEI方法(Meissner等,2001)，通过共转染HC和LC质粒也可以在293freestyleTM细胞中表达抗体14090的Cys突变体。抗体14090的Cys突变体的表达水平与野生型抗体14090的表达水平相似(表16)。
表14.在293freestyleTM细胞中瞬时表达的曲妥珠单抗Cys突变抗体的产量。在蛋白A纯化后通过在280nm处的UV吸光度测量产量。
表15.从293freestyleTM细胞中纯化后曲妥珠单抗LC-R108C抗体的理论质量和观察质量。
表16：在293freestyleTM细胞中瞬时表达的抗体14090Cys突变体的产量。
抗体14090Cys突变体 Ab产量(mg/L)
HC-S124C 4.72
HC-S136C 3.64
抗体14090Cys突变体 Ab产量(mg/L)
HC-T139C 4.59
HC-E152C 2.93
HC-L174C 5.26
HC-E258C 5.86
HC-K360C 4.86
LC-A143C 4.63
LC-T145C 6.98
LC-A147C 8.37
LC-K156C 5.74
LC-V159C 9.67
LC-T163C 9.98
LC-S168C 5.61
实施例6.Cys突变抗体与MC-MMAF的还原、重新氧化和缀合
因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的改造的Cys在其生物合成过程中被加合物(二硫化物)，如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰，所以初始表达的产物中的修饰的Cys与巯基反应试剂，如马来酰亚胺或溴代或碘代乙酰胺基团不反应。为了在表达后缀合经改造的半胱氨酸，需要通过还原这些二硫化物去除谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，其一般需要还原所表达蛋白质中的所有二硫化物。这可以通过首先将抗体暴露在还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)中，随后通过允许抗体的所有天然二硫键重新氧化以恢复和/或稳定功能抗体结构的方法来完成。因此，为了还原所有天然二硫键和半胱氨酸或改造的半胱氨酸残基的GSH加合物之间结合的二硫化物，向先前纯化的曲妥珠单抗和抗体14090的Cys突变体中加入新鲜制备的DTT至20mM的终浓度。抗体与DTT在37℃下温育1小时后，混合物在4℃下针对PBS透析3天，每天更换缓冲液以去除DTT并重新氧化天然的二硫键。备选方法是通过脱盐柱SephadexG-25去除还原试剂。一旦蛋白质被完全还原，向脱盐的样品中加入1mM氧化的抗坏血酸(去氢抗坏血酸)并进行重新氧化温育20小时。两种方法产生相似的结果。然而，尝试遵循先前文献中描述的重新氧化方案使用CuSO4导致蛋白质沉淀。本文所有的实施例使用上述透析方案。重新氧化恢复链内二硫键，而透析允许半胱氨酸和谷胱甘肽连接到新产生的半胱氨酸上以被透析掉。
重新氧化后，抗体准备用于缀合。向PBS缓冲液(pH7.2)中的重新氧化的抗体加入马来酰亚胺-MMAF(MC-MMAF，相对于抗体的10当量，图10)。进行温育1小时至24小时。通过反相HPLC监测缀合过程，所述反相HPLC能够从未缀合的抗体分离缀合的抗体。在加热至80℃的PRLP-S4000A柱(50mmx2.1mm,Agilent)上分析缀合反应混合物并通过在含有0.1％TFA的水中的30-60％乙腈的线性梯度，以1.5ml/分钟的流速进行柱的洗脱。在280nm、254nm和215nm处监测蛋白质从柱上的洗脱。典型缀合混合物的反相HPLC迹线显示于图11中。
当通过反相HPLC分析缀合混合物时，许多Cys位点产生同质缀合产物，如通过统一的单峰洗脱谱所提示(图11)，同时一些Cys位点产生异质缀合产物(图12)。上文描述的方法涉及天然二硫键的还原和重新氧化以及半胱氨酸和改造的半胱氨酸残基的GSH加合物之间键的还原。在重新氧化过程中，改造的半胱氨酸残基可能通过二硫化物穿梭的过程干扰正确的天然二硫键的重新形成。这可能导致在改造的半胱氨酸和天然的半胱氨酸残基或在不正确配对的天然二硫键之间形成错误配对的二硫键。此类错误配对的二硫键可能影响反相HPLC柱上抗体的滞留。错配过程还可能产生除想要的改造半胱氨酸以外的非配对半胱氨酸残基。马来酰亚胺-MMAF附着到抗体的不同位置上会不同地影响滞留时间(参见下文对同质缀合的ADC的讨论)。此外，除了与改造的半胱氨酸残基的希望缀合外，不完全的重新氧化将留下有天然半胱氨酸残基的抗体，其将与马来酰亚胺-MMAF反应。与马来酰亚胺-MMAF缀合后，妨碍天然二硫键正确且完全形成的任何过程将产生复杂的HPLC谱(图11)。通过未纯化的反应混合物的UV吸光度测量的均一ADC的产量根据Cys突变而变化(表17)。使用上述还原/重新氧化方案和缀合方法，88个Cys突变曲妥珠单抗抗体中的65个产生同质缀合产物并且这些位点是当制备半胱氨酸改造的抗体用于缀合时待制备的用于Cys替换的有利位点。
在多种测定中详细分析这65个Cys-MMAFADCs：差示扫描荧光(DSF)用于测量热稳定性。分析性大小排阻层析(AnSEC)用于测量聚集。通过细胞活力测定测量体外抗原依赖性细胞杀伤效力并在小鼠中测量药物代谢动力学行为。在下文中更详细地描述了这些测定和各自的结果。
为了评估曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的聚集状态，在大小排阻层析柱(GE,Superdex200,3.2/30)上，以PBS中0.1ml/分钟的流速分析ADCs。所有65个Cys-MMAFADCs均是单体的。大多数ADCs含有少于10％的寡聚体(图13，表18)，表明MC-MMAF与曲妥珠单抗Cys突变构建体在所选位点上的缀合不引起抗体的聚集。
表17.利用曲妥珠单抗Cys突变构建体产生的MMAFADCs的产量。“Hetero”表明在反相HPLC中具有不同滞留时间的种类的异质混合物。
表18.如通过分析性大小排阻层析测定的曲妥珠单抗Cys-MMAFADC制剂中寡聚体的百分比。
b.d.:低于检测极限。
实施例7.曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的体外热稳定性测定
MMAF有效载荷缀合到曲妥珠单抗上可以稳定或去稳定抗体，导致抗体的解链温度改变，其可以通过差示扫描荧光(DSF)测定，所述差示扫描荧光基于通过环境敏感的染料，如syproorange监测的温度诱导型变性。一式三份将ADC样品等分至384孔板中的PBS中(6.7mM磷酸钠pH7.2；150mMNaCl)。在每个孔中，8μl的0.25mg/ml抗体与2μl25xsyproorange染料(Invitrogen)混合。密封平板并以从30渐升到85℃的温度，每摄氏度记录20次荧光扫描的RocheLightCycler480中对平板进行分析。从荧光强度相对于时间曲线的一阶导数测定解链温度。
用于野生型曲妥珠单抗的典型热转移测定揭示了两个解链转变(Tm)，分别为69.7℃的Tm1和81.2℃的Tm2(表19)。当曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs进行蛋白质热稳定性测定时，显而易见的是MC-MMAF与抗体的缀合根据缀合的位点诱导不同的Tm改变(表19)。当MC-MMAF缀合CH1或CH3结构域中的大多数Cys位点时，所得ADCs，例如HC-K356C-MMAF显示与野生型抗Her相似的模式，在Tm1和Tm2中具有很少的变化。然而，当MC-MMAF缀合到定位在CH2结构域中的Cys位点时，对于大多数位点观察到Tm1降低，而Tm2很大程度上保持未改变。为大多数CH2结构域Cys-MMAF缀合物观察的Tm1降低在5℃-26℃之间变化。Tm1具有最大降低的两个ADCs是HC-T335C-MMAF和HC-S337C-MMAF，Tm1分别为42℃和45℃(图14)。结果表明MC-MMAF缀合的位置可以对ADCs的稳定性具有显著影响。
表19.通过差示扫描荧光测定法(DSF)观察的曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的解链温度Tm1和Tm2。
n.d.未测定，因为Tm2的宽泛转变阻止精确的Tm测定，
n.a.不可应用
实施例8.测量CysADCs的体外细胞杀伤效力的细胞增殖测定
天然表达靶抗原的细胞或被改造以表达靶抗原的细胞系经常用于测定ADCs的活性和效力。为了评估体外曲妥珠单抗ADCs的细胞杀伤效力，使用两个改造的细胞系，MDA-MB231克隆16和克隆40，和HCC1954细胞(ClinchyB,GazdarA,RabinovskyR,YefenofE,GordonB,VitettaES.BreastCancerResTreat.(2000)61:217-228)。MDA-MB231克隆16细胞稳定表达高拷贝数(～5x105拷贝/细胞)的重组人Her2，而克隆40表达低拷贝数(～5x105拷贝/细胞)的人Her2。HCC1954细胞在表面上内源表达高水平(～5x105拷贝/细胞)的人Her2。为了测定抗体14090ADCs的细胞杀伤效力，使用CMK11-5和Jurkat细胞。尽管CMK11-5细胞在细胞表面上表达针对抗体14090的高水平的抗原，但是在Jurkat细胞中没有可检测的抗原表达。抗原依赖性细胞毒性效应应该仅杀死在细胞表面上表达足够抗原的细胞，而非缺少抗原的细胞。在细胞与多种浓度的ADCs温育后5天，利用Cell-Titer-GloTM(Promega)进行细胞增殖测定(Riss等,(2004)AssayDrugDevTechnol.2:51-62)。在一些研究中，基于细胞的测定是高通量的并且在自动化系统中进行(Melnick等,(2006)ProcNatlAcadSciUSA.103:3153-3158)。
曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs尤其杀死MDA-MB231克隆16和HCC1954，但不杀死MDA-MB231克隆40细胞(图15)。MDA-MB231克隆16细胞测定中曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的IC50在30pM-200pM之间变化(表20，图16)。类似地，抗体14090Cys-MMAFADC在细胞增殖测定中展示抗原依赖性细胞杀死。抗体14090Cys-MMAFADCs杀死表达抗原的CMK11-5细胞，但不杀死抗原阴性Jurkat细胞(图17)。CMK11-5细胞增殖测定中抗体14090-MMAFADC的IC50在400pM-1nM之间变化(表21)。
表20.MDA-MB231克隆16Her2+细胞增殖测定中曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的IC50。
表21.CMK11-5细胞增殖测定中抗体14090Cys-MMAFADCs的IC50。
实施例9.曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的药物代谢动力学研究
已经证明长的血清半衰期对于ADCs的高体内效力至关重要(Hamblett,等,“Effectsofdrugloadingontheantitumoractivityofamonoclonalantibodydrugconjugate,”ClinCancerRes.,10:7063-7070(2004)；Alley等,BioconjugChem.19:759-765(2008))。将一般疏水的药物有效载荷附着到抗体上可能显著地影响抗体的性质，并且这可能导致体内ADCs的快速清除(Hamblett等,2004)和弱的体内效力。为了评估不同缀合位点对体内MMAFADCs的清除的影响，利用65种曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs进行非肿瘤携带小鼠中的药物代谢动力学研究。为了检测小鼠血浆中含有MMAF的ADCs，产生抗MMAF抗体。使用人HER2的胞外结构域开发了用于检测ADCs的ELISA测定来从血浆中捕获曲妥珠单抗IgG分子和抗人IgG(抗-hIgG)抗体和MMAF抗体在两个单独的测定中用于信号产生。两个ELISA测定测量曲妥珠单抗抗体和“完整”ADC的血清浓度，如分别在下文中更详细地讨论。
利用1mg/kg的单剂量曲妥珠单抗Cys-MMAFADC施用每组三只小鼠。然后在两周时间里收集10份血浆样品并使用人HER2的胞外结构域通过ELISA测定来捕获所有的曲妥珠单抗IgG分子，包括曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs和缺少MMAF的曲妥珠单抗。抗MMAF和抗hIgG抗体然后用于在两次单独测定中进行检测。抗MMAF抗体ELISA仅测量曲妥珠单抗MMAF缀合物的浓度并且抗hIgGELISA定量曲妥珠单抗Cys-MMAF缀合物和缺少MMAF的曲妥珠单抗抗体。使用注射到小鼠中的相同物质分别为每一种ADC产生标准曲线。如果在注射到小鼠中后没有发生曲妥珠单抗Cys-MMAFADC的药物装载变化，那么利用抗MMAF和抗hIgG的测定因而应该产生相同的浓度读数。对于丢失一些MMAF有效载荷的曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs，利用抗MMAF抗体的ELISA测定将测量低于抗hIgGELISA的浓度。两种浓度读数的比较因而允许测量在小鼠体内温育过程中从曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的药物释放。
如通过抗hIgGELISA所测量，65ADCs中的63个展示与未缀合的野生型曲妥珠单抗抗体类似的药物代谢动力学谱(图18、19、20)，表明MC-MMAF有效载荷缀合到这些位点上不显著地影响抗体的清除。两个例外是HC-T335C和HC-S337C。MC-MMAF缀合到这两个位点上导致ADCs的快速清除，如通过抗MMAF和抗hIgGELISA所测量(图21)。蛋白质热转移测定揭示曲妥珠单抗HC-T335C-MMAF和曲妥珠单抗HC-S337C-MMAF的Tm1在野生型曲妥珠单抗抗体中从69℃分别降低至42℃和45℃(图14)。MC-MMAF缀合到两个位点上显著降低了ADC的热稳定性(分别降低了27℃和24℃)。对于显示与未缀合抗体类似的药物代谢动力学谱的63个ADCs，Tm1变化小于8℃，提示快速清除可能与ADC的低热稳定性相关。
为了测定多个Cys位点上MMAF有效载荷与抗体之间连接的化学稳定性，为每一个样品将通过抗MMAFELISA测量的曲妥珠单抗Cys-MMAFADC的浓度与通过抗hIgGELISA测量的所有曲妥珠单抗分子的浓度彼此比较。在测量的误差内，许多曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs在两周期间内两种浓度之间展示良好的重叠，提示在这些位点引入的MC-MMAF与半胱氨酸之间的键在该期间在小鼠中的循环过程中是稳定的(图18、19)。相反，一些曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs展示显著的药物损失，如通过比抗MMAF读数更高的抗hIgG读数所指示(图20)。对于一些曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs，ADC的浓度是hIgG的约50％。这些结果提示缀合到不同位点上的药物有效载荷的巯基-马来酰亚胺键的稳定性中具有显著的差异，如先前已经所提示(Shen等Nat.Biotechnol.2012,30(2):184-9)。具有良好稳定性的位点是用于制备如本文所述ADCs的优选位点。
在药物代谢动力学研究中，血浆浓度对时间曲线下的面积(AUC)是评估所施用药物的总清除和生物利用度的重要参数。在我们的药物代谢动力学研究中，对于每一个曲妥珠单抗Cys-MMAFADC，从利用抗MMAF和抗hIgGELISA的测量中分别计算两个AUC值，AUC-MMAF和AUC-hIgG。对于所有曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs，AUC-MMAF与AUC-hIgG的比值在0.4-1.2之间变化(表20)。图18、19和20包括在观察的AUC-MMAF/AUC-hIgG比值全范围内用于ADCs的PK曲线并表明测量的变异性和不确定性。AUC-MMAF与AUC-hIgG的比值>1(表20)提示不确定性>25％，因为如果没有药物损失发生，比值应该保持接近1。如表20中所示，来自两个ELISAs的具有可测量AUCs的63个曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs中，40个ADCs显示AUC-MMAF/AUC-hIgG>0.7的比值，表明在测量的精确性内，在小鼠中施用后在这些位点中观察到很少的MMAF药物损失。然而，23个ADCs展示AUC-MMAF/AUC-hIgG<0.7的比值，提示这23个位点上的MMAF有效载荷缀合物的量在小鼠中体内温育过程中显著降低。
先前已经为Cys改造的ADCs报道了不同缀合位点上马来酰亚胺连接的稳定性的差异(参见Shen等,(2012)NatBiotechnol.22；30(2):184-9的讨论和参考)。对于展示增强的血清稳定性的优选位点，抗体环境很可能催化通过马来酰亚胺与半胱氨酸反应形成的琥珀酰亚胺环的水解。水解形式不能回复并且不能释放马来酰亚胺药物。像这样，不能预测抗体环境催化环水解的能力并且其是某些改造的Cys位点的出乎预料的性质。基于该标准，在表22中具有大于0.7的AUC(MMAF)/AUC(hIgG)比值的位点因而是用于半胱氨酸取代的特别合适的位点，并且当应用时，具有约0.9或高于0.9的比值的位点是用于本发明目的的尤其优选的半胱氨酸取代位点。这些包括重链位点322、334、121、288、171、139、360、117、392、375、292、333、174、258、337、422、320、390和335；和轻链位点107、203、108和114。
表22.小鼠中曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的AUC-MMAF和AUC-hIgG
n.a:不可应用的。
实施例10：组合Cys位点以产生具有高于2的药物-抗体比的抗体药物缀合物
通过与赖氨酸残基或部分地与还原的天然二硫键缀合产生的抗体缀合物经常特征是3-4之间的药物-抗体比(DAR)。对于某些适应症，其可能希望产生具有较高DAR的ADCs，这原则上可以通过在抗体中引入多个Cys突变来实现。随着Cys突变数量的增加，该突变在ADC制备过程中干扰所需的重新氧化过程的可能性增加，因此导致异质产物也增加。在该研究中，鉴定到了具有良好重新氧化行为的大量单位点重链和轻链Cys突变体。
为了证明可以组合若干缀合位点用于产生具有高于2的DAR的ADCs，在实施例5中描述的293FreestyleTM细胞中共表达曲妥珠单抗和抗体14090(表23)的轻链和重链的若干优选单位点Cys构建体。还原、重新氧化在重链上均含有一个Cys突变并在轻链上含有一个Cys突变的纯化抗体并将其与实施例6中描述的MC-MMAF缀合。反相高压液相层析证明了单个明确的洗脱峰，提示天然二硫键的有效重新氧化。MC-MMAF缀合后反相高压液相层析也主要显示DAR4ADC种类的单个洗脱峰。通过质谱证实表23中所有ADCs的DAR是4。生产产量在16-24mg/L瞬时细胞培养物之间变化。如通过分析性大小排阻层析测定，ADCs主要是单体的；仅对于8种抗体中的2种可以检测小量的聚集(表23)。曲妥珠单抗和14090ADCs分别在MDA-MB231克隆16和CMK1105细胞增殖测定中展示抗原依赖性细胞杀伤(表23)。
表23.具有DAR为4的Cys改造的MMAFADCs的性质
n.d.不可检测到的，
无效力：在所评估的最高浓度(66nM)处无细胞杀伤迹象
SEQIDNOs仅指定抗体序列的恒定区。
实施例11.基于ADC疏水性选择Cys位点
为了进一步优化选择Cys突变体和突变体组合用于制备具有DAR2、4、6和8的ADCs，分析利用单位点曲妥珠单抗Cys和Pcl突变体制备的MMAFADCs的性质(在专利申请55573中描述了PclADCs的制备)，并且在IgG的晶体结构中检查了缀合位点的可及性和溶剂暴露。
最具信息性的数据之一是观察到当有效载荷附着不同位点时，曲妥珠单抗Pcl-MMAFADCs的疏水性变化很大(图23)。通过疏水性相互作用层析(HIC)，使用TSKgelPhenyl-5PW柱(TosohBioscience,TSKgelPhenyl-5PW,13μm,21x150mm,不锈钢,Cat#07656；电泳缓冲液A:20mMNaPi(pH7.4)中的1.5M硫酸铵；缓冲液B:20mMNaPi(pH7.4)中的20％异丙醇；流速5ml/分钟；在90分钟内20％-80％缓冲液B的线性梯度；通过280nm处的UV吸光度监测)。令人惊讶地，尽管唯一的差异是ABA-MMAF附着的位点(图23)，但是观察到DAR2种类的滞留时间在ADCs之间变化很大。HIC在疏水性的基础上分离分子。所有的DAR2ADCs具有大于未缀合抗体(WT＝45分钟，图23)的滞留时间，这是当疏水性药物分子如ABA-MMAF附着到抗体上时所预期的。然而，在不同的位点附着有效载荷不同程度地增加了ADC的疏水性。
可以从对抗体结构上附着位点的定位的观察用理论来说明滞留时间的令人惊奇的巨大差异(图24)：如果药物有效载荷附着在抗体外的暴露位点上，例如在HC-K288Pcl、HC-N286Pcl、HC-V422Pcl、HC-L398Pcl和HC-S415Pcl处，那么滞留时间较长，其中对各ADCs测量了87和94分钟之间的滞留时间(图23)。相反地，如果有效载荷附着到内部位点上，如抗体的可变域和CH1结构域之间形成的腔(例如，HC-P153Pcl、HC-E152Pcl、HC-L174Pcl、HC-P171Pcl、LC-R142Pcl、LC-E161Pcl、LC-E165Pcl、LC-S159Pcl)或CH2和CH3结构域之间的大开口(例如，HC-K246C、HC-S375Pcl、HC-T393Pcl、HC-K334Pcl)，那么HIC滞留时间增加至仅仅47至57分钟，因为有效载荷部分地从与溶剂和HIC柱的相互作用中隔离出来。对于其他位点，例如，相对暴露的位点LC-K107Pcl和HC-K360Pcl，测量70和83分钟的中间滞留时间。
一般认为降低蛋白质药物的疏水性是有益的，因为其可能降低聚集和从循环的清除。我们提出图23中呈现的HIC数据使得能够选择优选的有效载荷附着位点。不依赖于缀合化学和有效载荷种类，在这样的位点缀合药物有效载荷应该是有益的，在所述位点有效载荷被隔离而不会与溶剂相互作用并且附着最小地增加抗体的疏水性。当每个抗体附着4、6或8种药物时，或当适用特别疏水的有效载荷时，谨慎地选择导致疏水性最小改变的附着位点可能是特别有益的。
为具有低疏水性的ADCs选择的Cys位点：
为了使ADCs的疏水性最小化，选择位点，其会指向抗体的多个蛋白质结构域的内部。适用时，选择基于抗体结构和具有DAR＝2的现有ADCs的行为的分析(行为＝HIC上的滞留时间和/或具有与SEC树脂相互作用的缀合物的AnSEC上的延迟滞留时间)。在表1和表2中鉴定的Cys位点中，表24中列出的位点满足上述标准。
通过疏水性相互作用层析(HIC)分析所有的ADCs。在暴露位点HC-K360C、LC-K107C、HC-E258C和HC-R292C处缀合的曲妥珠单抗MMAFADCs用于比较目的。结果显示于表25中。在如上所述的TSKgelButyl-NPR柱上分析曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs和未缀合的野生型抗体。为了比较，也列出了之前在TSKgelPhenyl-5PW上为Pcl-MMAFADCs获得的HIC数据(图23)。尽管是不同的仪器操作和方案，并且尽管由于两条接头不同的几何形状和结构而预期有一些变异性，但是在相同位置上但通过不同缀合方法缀合的ADC的滞留之间比保持几乎恒定。HIC数据提示滞留时间的确是有效载荷怎样独立于附着化学作用和接头结构很好地隔离在抗体内部的量度。如预期，不同附着位点的相对分级对Pcl-MMAF和Cys-MMAFADCs保持很大程度上相同。
附着到在表24中所选的位点，HC-E333C、HC-K392C和HC-K326C产生具有与暴露的位点ADCsLC-K107C-MMAF、HC-E258C-MMAF、HC-R292C-MMAF和HC-K360C-MMAF相似的HIC滞留时间的MMAFADCs(表28)。与未缀合的野生型抗体相比，附着到HC-E152C、LC-E165C、HC-P171C、LC-R142C、LC-E161C、HC-L174C和HC-S124C位点上增加所得ADC的滞留时间低于15％。这些位点均定位在CH1结构域中或轻链(LC)上并且HIC滞留时间数据提示它们是优选的附着位点。在CH3结构域位点中，HC-K334C和HC-S375C在缀合时展示疏水性的最小增加，使得它们成为优选的附着位点。
表24.Cys突变体位点
表25.曲妥珠单抗MMAFADCs的DAR2种类的疏水相互作用层析(HIC)滞留时间。
比较Cys和Pcl缀合化学作用，两组吻合地很好：隐藏通过一种化学作用缀合的药物的位点也倾向于通过另一种化学作用缀合时隐藏药物。由于两个接头系统的不同几何形状，预期有一些变异性。
a分析性HIC：TosohBioscience(KingofPrussia,PA,USA)TSKgelButyl-NPR柱(100mm×4.6mm,2.5μm)，运行缓冲液A:50mM磷酸钠，1.5M硫酸铵,pH7.0；缓冲液B:50mM磷酸钠，pH7.0；梯度由在100％A保持5分钟，随后是40分钟内20-100％B的线性梯度组成；通过在280nm的UV吸光度监测。
b半制备性HIC：TosohBioscience(KingofPrussia,PA,USA),TSKgelPhenyl-5PW,13μm,21x150mm；运行缓冲液A:20mMNaPi(pH7.4)中的1.5M硫酸铵；缓冲液B:20mMNaPi(pH7.4)中的20％异丙醇；流速5ml/分钟；90分钟内从20％-80％缓冲液B的线性梯度；通过在280nm的UV吸光度监测。
详细的分析性HIC方案：
使用在DionexUltiMate3000HPLC(Sunnyvale,CA,USA)上安装的TosohBioscience(KingofPrussia,PA,USA)TSKgelButyl-NPR柱(100mm×4.6mm,2.5μm)收集曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的分析性HIC数据。方法由缓冲液A(50mM磷酸钠，1.5M硫酸铵，pH7.0)和缓冲液B(50mM磷酸钠，pH7.0)的二元梯度组成。通过利用等体积3M硫酸铵稀释大约50μg抗体(PBS)制备样品。梯度由在100％A保持5分钟，随后是40分钟内20-100％B的线性梯度，最后在下次注射之前在初始条件下重新平衡10分钟组成。通过在280nm的UV吸光度监测分离。
DAR4、6和8CysADCs的制备和表征
可以组合Cys突变用于制备DAR4、6和8ADCs。一般而言，优选的组合是两个Cys突变的组合，产生具有DAR4的ADCs。在实施例10中为曲妥珠单抗和抗体14090显示了涉及组合重链(HC)Cys突变体与轻链(LC)Cys突变体用于制备DAR4ADCs的一些实例。在表26中提供了额外的数据。基于HIC数据和对IgG晶体结构中附着位点的检查，使用实施例2、5和6中描述的方案制备额外的Cys组合。在表26中显示了MMAFADCs的所选实例的数据。此外，组合所选的重链位点并遵循实施例2中列出的方案克隆重链的双Cys突变。遵循实施例5和6中描述的方案制备和缀合特征为两个HCCys突变的抗体。
为了制备DAR4ADCs，组合包括表24中列出的单位点突变。单位点的组合产生具有低疏水性的ADCs(表25)。在一些组合中，一个Cys突变定位在CH1结构域中或轻链(LC)上，并且第二个位点位于CH3结构域中。此类组合的实例是HC-E152C和HC-S375C，与LC-E165C和HC-S375C、与HC-E152C和HC-K334C、与LC-E165C和HC-K334C的特征性Cys突变抗体的组合。
当在一个抗体中组合三个或四个Cys突变时，也可以制备具有DAR6和8的ADCs。组合所选的重链组合用于制备DAR4、6和8ADCs。按照实施例2中列出的方案克隆重链的双Cys突变和三Cys突变。按照实施例5和6中描述的方案制备和缀合具有两个、三个和四个Cys突变特征的抗体。在表26中概述了一些DAR4、DAR6和DAR8ADC实例的特征。这些ADCs的一些具有如图25中显示的令人惊奇的良好PK性质。抗体14090是小鼠交叉反应性的，因而如预期，抗体14090ADCs比不结合任何小鼠抗原的曲妥珠单抗ADCs清除地更迅速。
组合包括具有表24中列出的三个和四个单位点突变的那些组合。组合包括产生具有低疏水性的ADCs的那些位点(表25)。组合包括一个Cys突变定位在CH1结构域中或轻链(LC)上，并且任选地额外的一个至三个位点位于CH3结构域中。此类组合的实例包括特征是HC-E152C或LC-E165C、与HC-S375C、与HC-K334C和/或HC-K392C的Cys突变组合的抗体。分别在表27和表28中显示了用于制备DAR6和DAR8ADCs的优选组合。
有一些例外，在所有研究的Cys位点上附着MMAF产生具有高热稳定性(实施例7，表19)、低聚集倾向性(实施例6，表18)和DAR2ADCs的良好药物代谢动力学性质(实施例9，表22，图18)的ADCs。当使用相对可溶的有效载荷，如MMAF时，ADC疏水性的差异明显地不翻译成生物物理学和药物代谢动力学性质的大的差异。实际上，如上文所示，甚至可以使用暴露的，“疏水的”位点，如HC-K360C与更优选的附着位点组合制备具有可接受的药物代谢动力学性质的DAR4、DAR6和DAR8MMAFADCs。然而，当不能很好地起作用时，使用更多的疏水性有效载荷，小心地选择导致疏水性最小改变的附着位点可能对允许制备具有良好药物代谢动力学性质的非聚集ADCs至关重要。对于此类疏水性有效载荷，当每个抗体附着4、6或8种药物时，使用减少疏水性增加的位点组合可能是有益的。
表26.利用Cys突变组合制备的所选DAR4、6和8MMAFADCs的表征。
*基于小鼠PK测量利用抗MMAF和抗-IgGELISA测定法的AUC计算。
n.d.；未检测，低于定量极限。
表27.用于制备DAR6ADCs的优选的Cys位点组合。
ADC组合 位点1 位点2 位点3
1 HC-E152C HC-S375C HC-K392C
2 HC-E152C HC-S375C HC-K334C
3 HC-E152C HC-K334C HC-K392C
4 LC-E165C HC-S375C HC-K392C
5 LC-E165C HC-S375C HC-K334C
6 LC-E165C HC-K334C HC-K392C
表28.用于制备DAR8ADCs的优选Cys位点组合。
ADC组合 位点1 位点2 位点3 位点4
1 HC-E152C HC-S375C HC-K334C HC-K392C
2 HC-E152C HC-S375C HC-E333C HC-K392C
3 LC-E165C HC-S375C HC-K334C HC-K392C
4 LC-E165C HC-S375C HC-E333C HC-K392C
实施例12.曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的体内效力研究。
通过将相关的且良好表征的人原发性肿瘤或肿瘤细胞系移植到免疫缺陷的裸小鼠中来观察体内异种移植物肿瘤模型模拟生物活性。利用抗癌剂治疗肿瘤异种移植物小鼠的研究已经提供了关于测试试剂的体内效力的有价值信息(Sausville和Burger,2006)。因为MDA-MB231克隆16细胞以抗原依赖性方式对曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs敏感(图15)，所以选择所述细胞系作为体内模型来评估曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs。根据GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(NIHpublication；NationalAcademyPress,8thedition,2001)进行所有的动物研究。将MDA-MB231克隆16细胞经皮下植入到nu/nu小鼠中(Morton和Houghton,2007)。肿瘤大小达到～200mm3后，以3mg/kg的单次剂量通过IV注射向小鼠施用曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs。在ADC注射后每周测量肿瘤生长。每个处理组包括9只小鼠。在图22中指明了利用三种曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs的体内效力研究的实例。利用3mg/kg曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs处理小鼠对所有三个所测的Cys-MMAFADCs引起肿瘤消退(图22)。没有观察到与ADC处理相关的体重减轻。结果证实利用3mg/kg的单次剂量处理，曲妥珠单抗Cys-MMAFADCs有效地引起MDA-MB231克隆16肿瘤的消退。

Claims (57)

1.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、334、360、375和392的位点上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
2.权利要求1的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代选自位置121、124、152、258、334、360和392。
3.权利要求1或2的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段包含选自SEQIDNOs:4、5、10、17、18、29、35、42、43、48、50、54、290、291、292、293、294和295的序列。
4.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161、和165的位点上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
5.权利要求4的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代选自位置145或165。
6.权利要求4的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段包含选自SEQIDNOs:61、62、69、71、75、76和77的序列。
7.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置143、147、159、163、和168的位点上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
8.权利要求7的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段包含选自SEQIDNOs:92、94、96、97和98的序列。
9.权利要求1、2或3的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161、和165的位点上还包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
10.权利要求1、2或3的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在其恒定区上在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置143、147、159、163、和168上还包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述轻链位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
11.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在重链恒定区上在位置152和375，或在位置327和375上包含半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述位置根据EU系统编号。
12.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段包含在恒定区上轻链的位置107和重链的位置360上半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
13.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400或422的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
14.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
15.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或抗体片段在所述抗体或抗体片段的轻链的其恒定区上包含选自位置143、145、147、156、159、163、和168的位置上半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
16.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段在其恒定区上包含半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置375和抗体轻链的位置165，或抗体重链的位置334和抗体轻链的位置165上的取代，并且其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
17.权利要求11、12和16任一项的免疫缀合物，其中所述药物抗体比是约4。
18.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对三个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含选自
a.抗体重链的位置375和392和抗体轻链的位置165，
b.抗体重链的位置334和375和抗体轻链的位置165，和
c.抗体重链的位置334和392和抗体轻链的位置165的取代，
并且其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
19.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对三个或更多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含选自
a.抗体重链的位置152、375和392，
b.抗体重链的位置152、334和375，和
c.抗体重链的位置152、334和392的取代，
并且所述位置根据EU系统编号。
20.权利要求18或19的免疫缀合物，其中所述药物抗体比是约6。
21.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对四个或多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置334、375和392和抗体轻链的位置165，或抗体重链的位置333、375和392和抗体轻链的位置165上的取代，并且其中所述轻链是κ链，并且其中所述位置根据EU系统编号。
22.包含经修饰抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述经修饰抗体或其抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对四个或多个氨基酸的取代组合，其中所述组合包含在抗体重链的位置152、334、375和392，或抗体重链的位置152、333、375和392上的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
23.权利要求21或22的免疫缀合物，其中所述药物抗体比是约8。
24.权利要求1-23任一项的免疫缀合物，其还包含药物部分。
25.权利要求24的免疫缀合物，其中药物部分通过所述半胱氨酸的硫和任选的接头附着到经修饰抗体或抗体片段上。
26.权利要求25的免疫缀合物，其中所述药物部分通过可切割的或不可切割的接头连接到所述半胱氨酸的所述硫。
27.权利要求25的免疫缀合物，其中所述药物部分通过不可切割的接头连接到所述半胱氨酸的所述硫。
28.权利要求25的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含巯基-马来酰亚胺连接。
29.权利要求25的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含S-CH2-C(＝O)-连接或二硫键。
30.权利要求25-29任一项的免疫缀合物，其中所述药物部分是细胞毒性剂。
31.权利要求30的免疫缀合物，其中所述药物部分选自紫杉烷类、DNA烷化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、tubulysin类似物、多卡米星类似物、阿里他汀E、阿里他汀F，和美坦生类化合物。
32.权利要求1-31任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
33.权利要求1-31任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体。
34.权利要求31的免疫缀合物，其中所述抗体是人源化的或完全人抗体。
35.权利要求31的免疫缀合物，其中所述抗体是双特异性的或多特异性的抗体。
36.权利要求1-32任一项的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段特异性结合肿瘤特征性的细胞表面标志物。
37.药物组合物，其包含权利要求1-36任一项的免疫缀合物。
38.经修饰抗体或其抗体片段，其在选自所述抗体或抗体片段的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400或422的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，并且其中所述位置根据EU系统编号。
39.经修饰抗体或其抗体片段，其在选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
40.经修饰抗体或其抗体片段，其在选自所述抗体或抗体片段的轻链的其恒定区上的位置143、145、147、156、159、163、168的其恒定区上包含半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
41.权利要求38的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是至少一个半胱氨酸，选自重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375，并且其中所述位置根据EU系统编号。
42.权利要求38的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是两个到六个半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在选自重链的121、124、152、171、174、258、292、333、360和375的位置上，并且其中所述位置根据EU系统编号。
43.权利要求39的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是至少一个半胱氨酸，其选自轻链的位置107、108、142、145、159、161和165，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
44.权利要求39的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是两个到六个半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在选自轻链的107、108、142、145、159、161和165的位置上，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。
45.权利要求40的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是至少一个半胱氨酸，其选自轻链的位置143、147、159、163和168，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
46.权利要求38的经修饰抗体或抗体片段，其中所述取代是两个到六个半胱氨酸，其中所述半胱氨酸在选自轻链的143、147、159、163和168的位置上，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。
47.权利要求11、12、14-22、38-47任一项的经修饰抗体或抗体片段，其进一步附着到药物部分上，并且其中所述药物部分通过所述半胱氨酸的硫和任选的接头附着到经修饰抗体或抗体片段上。
48.权利要求47的经修饰抗体或抗体片段，其中所述药物部分通过接头单元附着到所述半胱氨酸的硫上。
49.权利要求38-48任一项的经修饰抗体或抗体片段，其还包含至少一个Pcl或非天然的氨基酸取代或肽标签用于酶介导的缀合和/其组合。
50.核酸，其编码权利要求38-49任一项的经修饰抗体或抗体片段。
51.宿主细胞，其包含权利要求50的核酸。
52.产生经修饰抗体或抗体片段的方法，其包括在用于表达所述抗体或抗体片段的合适条件下温育权利要求49的宿主细胞，并分离所述抗体或抗体片段。
53.选择适合于被半胱氨酸替换的抗体的氨基酸以提供合适的缀合位点的方法，该方法包括：
(1)鉴定抗体恒定区中具有合适的表面暴露的氨基酸，以提供一组初始候选位点；
(2)对每一个初始候选位点，表达这样的抗体，其中该位点上的天然氨基酸被半胱氨酸替换；
(3)对每一种所表达的抗体，确定所述表达的蛋白质在还原和再氧化后是否基本同质，以提供在初始候选位点上具有游离半胱氨酸的功能抗体，
(4)对基本同质且有功能的每一种所表达的蛋白质，将初始候选位点上的半胱氨酸与马来酰亚胺部分缀合并确定所述巯基-马来酰亚胺连接在该位点上是否被去稳定化；
(5)从一组初始候选位点中去除那些所表达的抗体对其基本不同质并且无功能的位点，和其中巯基-马来酰亚胺连接不稳定的那些位点，以提供一组用于半胱氨酸取代的有利位点。
54.权利要求53的方法，其还包括步骤：为每个有利的半胱氨酸取代位点的缀合物确定解链温度，并从所述组中排除任何这样的位点，其中半胱氨酸取代和缀合引起解链温度与亲本抗体的解链温度相差5℃或更高。
55.权利要求53或54的方法，其还包括产生在所鉴定的一个或多个取代位点上含有半胱氨酸的抗体或抗体片段。
56.产生免疫缀合物的方法，其包括将接头单元(LU)或接头单元-有效载荷组合(-LU-X)附着到抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基上，其中所述半胱氨酸位于在选自所述抗体或抗体片段的重链的121、124、152、171、174、258、292、333、360和375以及所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161和165的半胱氨酸取代位点上，其中所述位置根据EU系统编号。
57.权利要求56的方法，其中所述免疫缀合物是式(I)的免疫缀合物：
其中Ab代表抗体或抗体片段，其在本文所述的优选半胱氨酸取代位点之一上包含至少一个半胱氨酸残基；
LU是如本文所述的接头单元；
X是有效载荷或药物部分；
并且n是从1-16的整数。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018064964A1 (zh) * 2016-10-08 2018-04-12 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法
CN109384843A (zh) * 2017-08-04 2019-02-26 希森美康株式会社 抗体及其制造方法、以及提升抗体的热稳定性的方法
CN110603060A (zh) * 2017-04-20 2019-12-20 诺华股份有限公司 包含无痕迹接头的持续释放递送系统
CN110869394A (zh) * 2017-06-16 2020-03-06 伊莱利利公司 工程改造的抗体化合物及其缀合物
CN111675762A (zh) * 2019-03-11 2020-09-18 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
CN111683963A (zh) * 2017-10-03 2020-09-18 默克专利有限公司 半胱氨酸工程化的抗原结合分子
WO2024099368A1 (en) * 2022-11-08 2024-05-16 Westlake University Peptide tags, compositions and methods for site-specific protein conjugation

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013093809A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CN105102455B (zh) 2012-12-21 2018-05-25 荷商台医(有限合伙)公司 亲水性自消耗连接子及其缀合物
EA201591465A1 (ru) 2013-02-08 2015-12-30 АйАрЭм ЭлЭлСи Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов
BR112016004242A8 (pt) 2013-08-28 2018-06-12 Stemcentrx Inc Métodos para conjugação sítio-específica de anticorpos e composições
KR20160070191A (ko) 2013-11-06 2016-06-17 스템센트알엑스 인코포레이티드 신규한 항-클라우딘 항체 및 사용 방법
BR112016013048A2 (pt) 2013-12-12 2017-09-26 Stemcentrx Inc anticorpos anti-dpep3 e métodos de uso
CN105899526A (zh) 2013-12-17 2016-08-24 诺华股份有限公司 细胞毒性肽和其缀合物
US10308721B2 (en) 2014-02-21 2019-06-04 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
BR112016020065A2 (pt) * 2014-03-12 2018-02-20 Novartis Ag sítios específicos para modificar anticorpos para fazer imunoconjugados
CN106459205B (zh) 2014-04-11 2021-04-09 免疫医疗有限责任公司 包含半胱氨酸工程化抗体的轭合化合物
KR102419766B1 (ko) 2014-05-22 2022-07-13 비온디스 비.브이. 항체에 대한 링커 약물의 부위 특이적 접합 및 그 결과로 얻어지는 adc
MX2016017117A (es) * 2014-06-20 2018-01-12 Abgenomics Int Inc Conjugados de anticuerpo her2-farmaco.
SG11201610624WA (en) * 2014-06-20 2017-01-27 Bioalliance Cv Anti-cd22 antibody-drug conjugates and methods of using thereof
US9950077B2 (en) * 2014-06-20 2018-04-24 Bioalliance C.V. Anti-folate receptor alpha (FRA) antibody-drug conjugates and methods of using thereof
TW201617368A (zh) 2014-09-05 2016-05-16 史坦森特瑞斯公司 新穎抗ｍｆｉ２抗體及使用方法
EP3191521A2 (en) * 2014-09-12 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
PL3233910T3 (pl) * 2014-12-19 2020-06-01 Ablynx N.V. Dimery nanociał połączone cysteiną
EP3878861A1 (en) * 2015-02-16 2021-09-15 Lonza Ltd. Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation
US20190194315A1 (en) 2015-06-17 2019-06-27 Novartis Ag Antibody drug conjugates
MA44334A (fr) * 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
TWI727380B (zh) * 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
CA2949033A1 (en) * 2015-11-30 2017-05-30 Pfizer Inc. Antibodies and antibody fragments for site-specific conjugation
US20180271998A1 (en) 2015-12-04 2018-09-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-stabilized fabs
EP3394096A1 (en) 2015-12-21 2018-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
BR112018013912A2 (pt) 2016-01-08 2018-12-18 Bioalliance C.V. anticorpos tetravalentes anti-psgl-1 e usos dos mesmos
WO2018009916A1 (en) 2016-07-07 2018-01-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antibody adjuvant conjugates
JP6957629B2 (ja) 2016-10-11 2021-11-02 ビョンディス・ビー．ブイ．Ｂｙｏｎｄｉｓ Ｂ．Ｖ． 非線状自壊性リンカーおよびそのコンジュゲート
AU2017344440B2 (en) * 2016-10-17 2020-07-30 Pfizer Inc. Anti-EDB antibodies and antibody-drug conjugates
WO2018106645A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 Innate Biotherapeutics, Llc β-1,6-GLUCAN THERAPEUTIC ANTIBODY CONJUGATES
JOP20190155A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-23 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
IL298414A (en) * 2017-02-28 2023-01-01 Immunogen Inc History of methanosinoids with peptide linkers and their conjugates
CA3052837A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Seattle Genetics, Inc. Cysteine mutated antibodies for conjugation
AR111651A1 (es) 2017-04-28 2019-08-07 Novartis Ag Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación
AR113224A1 (es) * 2017-04-28 2020-02-19 Novartis Ag Conjugados de anticuerpo que comprenden un agonista de sting
WO2018233572A1 (zh) * 2017-06-20 2018-12-27 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(tdc)定点偶联位点筛选
US11364303B2 (en) 2017-09-29 2022-06-21 Pfizer Inc. Cysteine engineered antibody drug conjugates
PE20210320A1 (es) 2018-06-01 2021-02-16 Novartis Ag Moleculas de union contra bcma y usos de las mismas
UY38265A (es) 2018-06-20 2020-01-31 Novartis Ag Conjugados anticuerpo droga para ablación de células madre hematopoyéticas
WO2020089815A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Novartis Ag Antibody conjugates comprising sting agonist
US20230053449A1 (en) 2018-10-31 2023-02-23 Novartis Ag Dc-sign antibody drug conjugates
EP3898697A2 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Novartis AG Antibodies to pmel17 and conjugates thereof
EP3937984A1 (en) 2019-03-15 2022-01-19 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
WO2020236841A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Novartis Ag Antibody drug conjugates having linkers comprising hydrophilic groups
EP3972651A2 (en) 2019-05-20 2022-03-30 Novartis AG Mcl-1 inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use
KR20220079590A (ko) 2019-10-04 2022-06-13 티에이이 라이프 사이언시스 Fc 돌연변이 및 부위-특이적인 접합 성질을 포함하는 항체 조성물
CA3169521A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Marie-Priscille Brun Modified binding polypeptides for optimized drug conjugation
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
EP4251209A1 (en) 2020-11-24 2023-10-04 Novartis AG Bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof
KR20230138444A (ko) 2020-11-24 2023-10-05 노파르티스 아게 Mcl-1 억제제 항체-약물 접합체 및 사용 방법
AU2021388021A1 (en) 2020-11-24 2023-06-22 Novartis Ag Anti-cd48 antibodies, antibody drug conjugates, and uses thereof
CN117255808B (zh) * 2021-01-18 2024-06-07 上海药明合联生物技术有限公司 工程化抗体和包含工程化抗体的抗体-药物偶联物
KR20230145332A (ko) 2021-02-16 2023-10-17 글리코스 핀란드 오이 링커-페이로드 및 이의 컨쥬게이트
MX2023012277A (es) 2021-04-16 2023-12-07 Novartis Ag Conjugados anticuerpo-fármaco y métodos para fabricar los mismos.
WO2023076599A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
TW202404645A (zh) 2022-05-20 2024-02-01 瑞士商諾華公司 Met bcl-xl抑制劑抗體-藥物結合物及其使用方法
WO2023225320A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Novartis Ag Epha2 bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2023225359A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Novartis Ag Antibody-drug conjugates of antineoplastic compounds and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102159248A (zh) * 2008-07-15 2011-08-17 健泰科生物技术公司 蒽环类衍生物缀合物、它们的制备方法以及它们作为抗肿瘤化合物的用途
WO2011156328A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN102369218A (zh) * 2009-04-01 2012-03-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-FcRH5抗体和免疫缀合物以及应用方法

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2429008A (en) 1945-12-01 1947-10-14 Diamond Chain & Mfg Company Sprocket or gear
US2429001A (en) 1946-12-28 1947-10-14 Axel H Stone Artificial hand
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
AU666852B2 (en) 1991-05-01 1996-02-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
EP0861893A3 (en) 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
DE4444135B4 (de) 1994-12-11 2005-06-02 Gerold Tebbe Sauerstoff-Behandlungseinrichtung
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2230494A1 (en) 1995-08-31 1997-03-06 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Composition for sustained release of an agent
PT885002E (pt) 1996-03-04 2011-07-14 Massachusetts Inst Technology Materiais e métodos para aumento da internalização celular
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
ES2301198T3 (es) 1997-06-12 2008-06-16 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Polipeptidos artificiales de anticuerpos.
RU2141483C1 (ru) 1997-07-04 1999-11-20 Небольсин Владимир Евгеньевич Производные пептидов или их фармацевтически приемлемые соли, способ их получения, применение и фармацевтическая композиция
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
WO1999066903A2 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
PT1176195E (pt) 1999-04-09 2013-07-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico
AU765588C (en) 1999-11-24 2004-12-16 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
JP2003531821A (ja) 1999-12-29 2003-10-28 イムノージェン インコーポレーテッド 改変型ドキソルビシンおよびダウノルビシンを含む細胞傷害性薬剤ならびにその治療上の使用
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
EP1636340A4 (en) 2003-06-18 2009-02-11 Scripps Research Inst COMPLEMENTS TO THE GENETIC CODE OF UNNATURATIVE REACTIVE AMINO ACIDS
EP1663306A2 (en) 2003-09-05 2006-06-07 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20060166319A1 (en) 2004-08-13 2006-07-27 Chan Michael K Charging tRNA with pyrrolysine
US20060183888A1 (en) 2004-08-13 2006-08-17 Chan Michael K Pyrrolysine synthesis and modification
WO2006023403A2 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Eph receptor fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
PL1791565T3 (pl) * 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
EP1797127B1 (en) 2004-09-24 2017-06-14 Amgen Inc. Modified fc molecules
CA2587766A1 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
WO2008020827A2 (en) 2005-08-01 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Altered polypeptides, immunoconjugates thereof, and methods related thereto
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
AU2006287416A1 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Medimmune, Llc Toxin conjugated Eph receptor antibodies
MX2008015132A (es) * 2006-05-30 2008-12-10 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados y sus usos.
EP2083017A4 (en) 2006-09-14 2011-01-12 Med & Biological Lab Co Ltd ANTIBODIES HAVING INCREASED ADCC ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
ES2636089T3 (es) 2006-10-27 2017-10-05 Genentech, Inc. Anticuerpos e inmunoconjugados y usos para los mismos
EP2609932B1 (en) * 2006-12-01 2022-02-02 Seagen Inc. Variant target binding agents and uses thereof
US20100184959A1 (en) 2007-03-19 2010-07-22 Medimmune Limited Polypeptide Variants
CA2683568A1 (en) * 2007-05-08 2008-11-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
PT2176296E (pt) * 2007-07-16 2012-05-14 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados anti-cd79b e métodos de utilização
EP2188979A2 (en) 2007-09-10 2010-05-26 Nxp B.V. Method and apparatus for motion estimation in video image data
BRPI0818780A2 (pt) 2007-10-19 2015-04-22 Genentech Inc Anticorpo anti-tenb2 planejados por cisteína e conjugados de medicamento com anticorpos
US20110033378A1 (en) * 2008-01-18 2011-02-10 Medlmmune, Llc. Cysteine Engineered Antibodies For Site-Specific Conjugation
ES2477543T3 (es) 2008-10-24 2014-07-17 Irm Llc Pirrolina-carboxi-lisina generada biosintéticamente y modificaciones de proteínas específicas de sitio mediante derivatización química de restos de pirrolina-carboxi-lisina y pirrolisina
CN101709047A (zh) 2009-05-25 2010-05-19 华东理工大学 第二十二种天然氨基酸-吡咯赖氨酸的化学全合成方法
PL2896404T3 (pl) * 2009-06-04 2017-12-29 Novartis Ag Sposoby identyfikacji miejsc koniugacji IgG
EP2445520A4 (en) * 2009-06-22 2013-03-06 Medimmune Llc MANIPULATED FC REGIONS FOR LOCAL SPECIFIC CONJUGATION
CN102471375A (zh) 2009-07-09 2012-05-23 F-斯塔生物技术研究和发展有限公司 稳定的免疫球蛋白恒定结构域
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB0920324D0 (en) * 2009-11-19 2010-01-06 Ucb Pharma Sa Antibodies
CA2781682A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods
EP2554669B1 (en) * 2010-03-26 2018-09-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment
GB201014033D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
EP2638066A4 (en) * 2010-11-09 2015-06-03 Medimmune Llc ANTIBODY EQUIPMENT FOR HOMOGENEOUS CONJUGATION
CA2816426A1 (en) * 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
LT2794905T (lt) * 2011-12-20 2020-07-10 Medimmune, Llc Modifikuoti polipeptidai, skirti bispecifinių antikūnų karkasams
WO2013093809A1 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
KR101515894B1 (ko) 2012-02-20 2015-05-19 주식회사 노리코리아 지식 유닛에 기초하여 교육 서비스를 제공하기 위한 방법, 시스템 및 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체
EP2855520B1 (en) 2012-06-04 2018-09-26 Novartis AG Site-specific labeling methods and molecules produced thereby
SG11201408161RA (en) * 2012-06-08 2015-01-29 Sutro Biopharma Inc Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
WO2014124258A2 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Irm Llc Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
EA201591465A1 (ru) 2013-02-08 2015-12-30 АйАрЭм ЭлЭлСи Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов
UY35397A (es) 2013-03-12 2014-10-31 Amgen Inc INHIBIDORES POTENTES Y SELECTIVOS DE NaV1.7
JP2016516035A (ja) 2013-03-15 2016-06-02 ノバルティス アーゲー 細胞増殖阻害剤およびそれらのコンジュゲート
CN105899526A (zh) * 2013-12-17 2016-08-24 诺华股份有限公司 细胞毒性肽和其缀合物
BR112016020065A2 (pt) 2014-03-12 2018-02-20 Novartis Ag sítios específicos para modificar anticorpos para fazer imunoconjugados
CN106573956A (zh) * 2014-06-13 2017-04-19 诺华股份有限公司 澳瑞他汀衍生物及其缀合物
EP3215519A1 (en) * 2014-11-06 2017-09-13 Novartis AG Amatoxin derivatives and conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase
MA44334A (fr) * 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
US11605302B2 (en) 2020-11-10 2023-03-14 Rockwell Collins, Inc. Time-critical obstacle avoidance path planning in uncertain environments

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102159248A (zh) * 2008-07-15 2011-08-17 健泰科生物技术公司 蒽环类衍生物缀合物、它们的制备方法以及它们作为抗肿瘤化合物的用途
CN102369218A (zh) * 2009-04-01 2012-03-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-FcRH5抗体和免疫缀合物以及应用方法
WO2011156328A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018064964A1 (zh) * 2016-10-08 2018-04-12 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法
CN110603060A (zh) * 2017-04-20 2019-12-20 诺华股份有限公司 包含无痕迹接头的持续释放递送系统
CN110869394A (zh) * 2017-06-16 2020-03-06 伊莱利利公司 工程改造的抗体化合物及其缀合物
CN109384843A (zh) * 2017-08-04 2019-02-26 希森美康株式会社 抗体及其制造方法、以及提升抗体的热稳定性的方法
CN109384843B (zh) * 2017-08-04 2023-09-01 希森美康株式会社 抗体及其制造方法、以及提升抗体的热稳定性的方法
CN111683963A (zh) * 2017-10-03 2020-09-18 默克专利有限公司 半胱氨酸工程化的抗原结合分子
CN111683963B (zh) * 2017-10-03 2024-03-29 默克专利有限公司 半胱氨酸工程化的抗原结合分子
CN111675762A (zh) * 2019-03-11 2020-09-18 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
CN111675762B (zh) * 2019-03-11 2023-12-01 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
WO2024099368A1 (en) * 2022-11-08 2024-05-16 Westlake University Peptide tags, compositions and methods for site-specific protein conjugation

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