EA043810B1 - Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов - Google Patents

Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов Download PDF

Info

Publication number
EA043810B1
EA043810B1 EA201591465 EA043810B1 EA 043810 B1 EA043810 B1 EA 043810B1 EA 201591465 EA201591465 EA 201591465 EA 043810 B1 EA043810 B1 EA 043810B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
fragment
light chain
heavy chain
cys
Prior art date
Application number
EA201591465
Other languages
English (en)
Inventor
Бернхард Хуберт Гайерстангер
Вэйцзя Оу
Тецуо Уно
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of EA043810B1 publication Critical patent/EA043810B1/ru

Links

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Вследствие важности антител для различных терапевтических применений, существует потребность в надежных способах для селективной модификации антител, чтобы ввести улучшенные свойства или дополнительные функции. Изобретение предоставляет специфичные участки для присоединения фрагментов к антителам для получения модифицированных антител, таких как для применения при получении конъюгатов антитело - лекарственное средство (ADC). Селективные участки конъюгации расположены в константных областях антитела и, таким образом, являются применимыми для различных антител.
Предшествующий уровень техники
Значение способов модификации антител является хорошо известным, и было разработано много способов для конъюгации антител, чтобы присоединить различные фрагменты полезной нагрузки. Многие из этих способов основаны на природной распространенности специфичных реакционноспособных аминокислотных остатков в антителе, таких как лизин и цистеин, которые могут применяться для присоединения полезной нагрузки. Однако, полагаться на нативные аминокислоты не всегда желательно, поскольку расположение и количество присоединенной полезной нагрузки зависит от числа и положения этих реакционноспособных аминокислот: слишком много или слишком мало таких остатков создают трудности для эффективного управления загрузкой полезной нагрузки на антитело. В дополнение, размещение реакционноспособных аминокислот может затруднять достижение полной конъюгации, приводя к гетерогенным продуктам во время конъюгации. Гетерогенность фармацевтического активного ингредиента, например, обычно является нежелательной, поскольку она делает непредсказуемым введение лекарственного средства гетерогенной популяции субъектов: значительно более предпочтительным является вводить гомогенный продукт, и значительно более трудно полностью охарактеризовать и предсказать поведение гетерогенного продукта. Сайт-специфичная конъюгация цитотоксического лекарственного средства с антителом через, например, сконструированные остатки цистеина приводит к гомогенным иммуноконъюгатам, которые проявляют улучшенный терапевтический индекс (Junutula et al. (2008) Nat Biotechnol. 26(8):925-932)).
Были сконструированы антитела, для добавления некоторых остатков, подобных цистеину в специфичные положения, где эти остатки могут применяться для конъюгации (Lyons et al. (1990) Protein Eng., 3:703-708), но значение специфичных замен может варьировать с некоторыми антителами, та как сконструированный цистеин может препятствовать складчатости антител и окислению надлежащих внутримолекулярных дисульфидных связей (Voynov et al. (2010) Bioconjug. Chem. 21 (2):385-392).
Поскольку сконструированные цистеины в антителах, экспрессированных в клетках млекопитающих, являются модифицированными через дисульфидные связи с глутатионом (GSH) и/или цистеином в время их биосинтеза (Chen et al. (2009) mAbs 1:6, 563-571), модифицированные цистеин(ы) в продукте конъюгата антитело-лекарственное средство, как он первоначально экспрессируется являются нереакционноспособными по отношению к тиол-реакционноспособным реагентам. Активация сконструированных цистеина (цистеинов) требует восстановления GSH и/или цистеинового аддукта (которое обычно приводит к восстановлению всех межцепочечных дисульфидных связей антитела), с последующим повторным окислением и повторным образованием нативной, межцепочечной дисульфидной связи перед конъюгацией (Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26(8):925-32). Некоторые из участков, где вводился цистеин, препятствуют процессу повторного окисления и в последующем приводят к нежелательным, негомогенным продуктам конъюгации. Следовательно, является важным идентифицировать участки в антителе, где введенный цистеин не препятствует процессу повторного окисления перед конъюгацией с тиол-реакционноспособным реагентом, таким как малеимид или бром-, хлор- или йод-ацетамидные группы.
Конъюгация остатков цистеина с бром-ацетамидом, йод-ацетамидом или хлор-ацетамидом приводит к образованию стабильной тиоэфирной связи. (Alley et al. (2008) Bioconjug Chem, 19(3):759-65). Однако, обычная химия является менее эффективной, чем химия конъюгации с малеимидом. Поскольку образование таких тиол-малеимидных связей является популярным и высокоэффективным способом применения, когда полезную нагрузку или линкер присоединяют к цистеину, существует потребность в идентификации участков в антителе для замены на цистеин, где малеимидные связи могут применяться. Более важным является то, что сайт-специфичные конъюгированные иммуноконъюгаты могут проявлять улучшенный терапевтический индекс, таким образом, остается потребность в идентификации специфичных привилегированных участков для замены на цистеин в антителах, которые обеспечивают эффективное образование конъюгации полезных нагрузок с антителами, и, которые обеспечивают конъюгаты, имеющие высокую стабильность. Настоящее изобретение предоставляет такие привилегированные участки для замены на цистеин, которые дают улучшенные антитела для целей конъюгации, и иммуноконъюгаты, содержащие такие улучшенные антитела.
- 1 043810
Сущность изобретения
Данное изобретение предоставляет специфичные участки в константной области антитела или фрагмента антитела, на которых может выполняться замена нативной аминокислоты на цистеин (Cys) в исходном антителе или фрагменте антитела, чтобы обеспечить остаток Cys для присоединения химического фрагмента (например, полезной нагрузки/фрагмента лекарственного средства) для образования иммуноконъюгата с хорошей эффективностью и стабильностью. Изобретение дополнительно предоставляет сконструированные антитела или фрагменты антител, имеющие один или более остатков Cys на одном или более из этих специфичных участков, а также иммуноконъюгаты, полученные из таких сконструированных антител или фрагментов антител.
Способы введения Cys в специфичные местоположения антител являются известными в данной области, см., например, WO 2011/005481. Однако, рассматриваемое изобретение раскрывает специфичные участки в константной области антител или фрагментов антител, где замена одного или более нативных аминокислот исходного антитела или фрагмента антитела на Cys предоставляет одно или более из следующих преимуществ: Хорошая реакционная способность для инициации эффективной иммуноконъюгации; пониженная склонность к потере полезной нагрузки, когда применяют линкер конъюгации Cysмалеимид; сниженная тенденция к образованию нежелательных дисульфидных связей, таких как сшивка между антителами или образование ненативных внутримолекулярных дисульфидных связей; и низкая гидрофобность полученного в результате ADC.
Специфичные привилегированные участки для Cys-замены нативных аминокислот в константной области исходных антител или фрагментов антител выбирают, чтобы обеспечить эффективную конъюгацию, в то же время минимизируя нежелательные эффекты. Сперва, специфичные участки для модификации выбирают так, чтобы замена нативных аминокислот исходного антитела или фрагмента антитела на Cys в одном или более из выбранных местоположений предоставляла антитела или фрагменты антител, которые легко конъюгируются с новым цистеином. Специфичные местоположения выбирают, чтобы они были достаточно поверхностно-доступными для обеспечения реакционноспособности сульфгидрила остатка цистеина по отношению к электрофилам в водных растворах. Идентификация подходящих участков для Cys-замены нативных аминокислот исходного антитела или фрагмента антитела включала в себя анализ поверхностной экспозиции нативных аминокислот на основании данных кристаллической структуры. Поскольку участки, описанные в данном документе, являются достаточно доступными и реакционноспособными, они могут применяться для образования иммуноконъюгатов посредством химических реакций, хорошо известных в данной области для модификации природных остатков цистеина. При конъюгации остатков Cys-замены, таким образом, применяют общепринятые способы.
Выбранные участки модификации могут демонстрировать низкую склонность к обратимости конъюгации, когда при конъюгации используют тиол-малеимидные фрагменты. Реакция конъюгации тиолмалеимид часто является высокоселективной и крайне эффективной, и может применяться либо для присоединения полезной нагрузки к тиолу остатка цистеина белка или в качестве линкера где-либо при связывании между белком и полезной нагрузкой. Например, малеимид может присоединяться к белку (например, антителу или фрагменту антитела), и полезная нагрузка, имеющая присоединенный тиол может добавляться к малеимиду с образование конъюгата:
Соответственно, на этой стадии конъюгации, белок (например, антитело или фрагмент антитела) может представлять собой либо одиночный круг или двойной круг; другой может представлять полезную нагрузку. Информация по стабильности иммуноконъюгата здесь специфически относится к конъюгации замененного цистеина посредством реакции с малеимидной группой. В нескольких вариантах осуществления, тиол берется от цистеина в белке (например, антителе или фрагменте антитела), так, что двойной круг представляет белок и одиночный круг представляет полезную нагрузку.
В то время, как реакцию тиол-малеимид часто применяют для получения конъюгатов, обратимость стадии конъюгации, как изображено ниже, может приводить к потере полезной нагрузки или захват полезной нагрузки другим тиол-содержащим видом молекулы:
О
о
Сообщалось, что некоторые участки для замены на цистеин обеспечивают более стабильные малеимидные конъюгаты, чем другие, предположительно вследствие того, что местное химическое окружение в некоторых местах на поверхности антитела вокруг нового цистеина может способствовать гидролизу сукцинимидного кольца и, следовательно, препятствовать обратимости связывания тиолмалеимид в иммуноконъюгате (Shen et al. (2012), Nat. Biotechnol. 30(2):184-9). Идентификация преиму
- 2 043810 щественных участков для соответствия этому критерию включала в себя введение Cys вместо многих нативных аминокислот, имеющих подходящую поверхностную экспозицию, получая иммуноконъюгаты, содержащие связь тиол-малеимид, и оценку стабильности иммуноконъюгата, чтобы исключить участки, где стабильность конъюгата была снижена местным микроокружением вокруг дестабилизирующих участков. Вследствие этого, химическая реакция, которая может применяться для присоединения линкеров и полезных нагрузок к остаткам Cys-замены, не ограничена проблемами стабильности, ассоциированными с обратимостью тиол-малеимидных конъюгатов, которая обсуждается выше. Ряд методов может применяться для образования конъюгатов по цистеину, включая малеимидную конъюгацию. Участки для замены на цистеин, описанные в данном документе, способствуют стабильности конъюгатного продукта антитела, когда применяют один из наиболее общепринятых способов конъюгации, делая эти участки преимущественными для конструирования антитела, поскольку модифицированное антитело может применяться с использованием хорошо известной и высокоэффективной методологии конъюгации с малеимидом. Выбор участков на основе данного критерия иллюстрируется данными, представленными в табл. 22 и примере 9.
Выбранные участки могут быть расположены таким образом, чтобы минимизировать нежелательное образование дисульфида, которое может препятствовать образованию гомогенного конъюгата. Когда антитела или фрагменты антител, содержащие сконструированные цистеины продуцируются в клетках млекопитающих, остатки Cys обычно присутствуют в виде дисульфидов со свободными Cys аминокислотой или с глутатионом (Chen et al. (2009) mAbs 16, 353-571). Чтобы высвободить остатки Cys для конъюгации с тиол-реакционноспособными группами, антитело или фрагмент антитела необходимо восстановить, разрушая все дисульфидные связи. Антитело или фрагмент антитела затем повторно окисляют при условиях, которые облегчают образование нативных дисульфидов, которые стабилизируют антитело или фрагмент антитела. При повторном окислении, остатки цистеина, которые слишком значительно экспонированы на поверхности антитела или фрагмента антитела, могут образовывать дисульфиды посредством реакции с Cys в еще одном антителе или фрагменте антитела (дисульфиды между антителами), или посредством образования нежелательных дисульфидов внутри антитела. Было обнаружено, что остатки цистеина, помещенные на специфичных участках, описанных в данном документе, являются подходящим образом доступными, чтобы быть способными к эффективной конъюгации, но являются достаточно экранированы или подходящим образом позиционированы, чтобы снизить или устранить образование дисульфидных связей между антителами и внутри антител, которые иначе бы возникали во время операций восстановления/повторного окисления, обычно необходимыми, при экспрессировании cys-модифицированных антител. Аналогично, было обнаружено, что после повторного окисления некоторые участки продуцируют негомогенные продукты конъюгации, которые, по-видимому, обусловлены расположением нового остатка Cys, встроенного в конструкцию белка, и специфичные участки, идентифицированные в данном документе, являются участками, где такая гетерогенность минимизирована.
Конъюгирование полезных нагрузок в виде лекарственных средств на участках, где они ограждены от взаимодействий с растворителем, и присоединение может увеличить гидрофобность антитела при присоединении лекарственного средства является предпочтительным, так как снижение гидрофобности белкового лекарственного средства обычно считается благоприятным, поскольку оно может снизить агрегацию и выведение из циркуляции. Выбор участков присоединения, которые приводят к минимальным изменениям в гидрофобности, может быть особенно благоприятным, когда присоединяют 4, 6 или 8 лекарственных средств на антитело, или, когда применяют особенно гидрофобные полезные нагрузки.
Участки для введения Cys оценивали с использованием этих и дополнительных методов, описанных в Примерах данного документа, что приводило к выбору предпочтительных участков для введения Cys для конструирования антител или фрагментов антитела для введения Cys в качестве участка для конъюгации, особенно для получения ADC. Дополнительные подробности, касающиеся выбора специфичных участков для замены природной аминокислоты антитела на Cys, предоставлены в данном документе.
Участки для замены на цистеин расположены в константной области антитела или фрагмента антитела, и их идентифицируют в данном документе с использованием стандартных соглашений по нумерации. Хорошо известно, однако, что части или фрагменты антитела могут применяться для многих целей вместо интактных непроцессированных антител, а также то, что антитела могут быть модифицированы различными путями, которые влияют на нумерацию участков в константной области даже, несмотря на то, что они не воздействуют значительно на функционирование константной области. Например, было показано, что введение метки S6 (короткого пептида) в петлевую область антитела, обеспечивает сохранение активности антитела, даже, несмотря на то, что оно изменяет нумерацию многих участков в антителе. Соответственно, в то время, как предпочтительные участки для замены на цистеин, описанные в данном документе, идентифицируют посредством стандартной системы нумерации, основанной на нумерации в интактном антителе, изобретение включает соответствующие участки во фрагментах антител или в антителах, содержащих другие модификации, такие как введение пептидной метки. Соответствующие участки в этих фрагментах или модифицированных антителах являются, таким образом, предпочтительными участками для замены на цистеин во фрагментах или модифицированных антителах, и
- 3 043810 ссылки на участки для замены на цистеин посредством номера включают соответствующие участки в модифицированных антителах или фрагментах антител, которые сохраняют функцию соответствующей части непроцессированного антитела.
Соответствующий участок во фрагменте антитела или в модифицированном антителе может легко быть идентифицирован посредством выравнивания сегмента фрагмента антитела или модифицированного антитела с непроцессированным антителом, чтобы идентифицировать участок во фрагменте антитела или в модифицированном антителе, который совпадает с одним из предпочтительных участков цистеиновой замены изобретения. Выравнивание может быть основано на сегменте, достаточно длинном, чтобы обеспечить совпадение сегмента с корректной частью непроцессированного антитела, такой как сегмент из по меньшей мере 20 аминокислотных остатков или по меньшей мере 50 остатков или по меньшей мере 100 остатков или по меньшей мере 150 остатков. При выравнивании можно также учитывать другие модификации, которые могли быть встроены во фрагмент антитела или модифицированное антитело, таким образом, различия в последовательности вследствие сконструированных точечных мутаций в сегменте, используемом для выравнивания, особенно для консервативных замен, смогут быть обеспечены. Таким образом, например, Fc домен может быть удален из антитела, и мог бы содержать аминокислотные остатки, которые соответствуют участкам для замены на цистеин, описанном в данном документе, несмотря на различия в нумерации: можно также ожидать, что участки Fc домена, соответствующие участкам для заменам на цистеин изобретения будут преимущественными участками для замены на цистеин в Fc домене, и включены в объем изобретения.
В одном варианте осуществления, изобретение предоставляет иммуноконъюгат формулы (I):
где Ab представляет антитело или фрагмент антитела, содержащие по меньшей мере один остаток цистеина на одном из предпочтительных участков замены на цистеин, выбранном из описанных в данном документе;
LU представляет собой линкерный блок, как описано в данном документе;
X представляет собой полезную нагрузку или фрагмент лекарственного средства;
и n является целым числом от 1 до 16.
Обычно в соединениях формулы (I), LU присоединен к цистеину на одном из участков для замены на цистеин, описанных в данном документе, X представляет собой фрагмент лекарственного средства, такого как лекарственное средство против злокачественных новообразований, и n равно 2-8, когда Ab является антителом, или n может быть равен 1-8, когда Ab является фрагментом антитела.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 360 и 375 тяжелой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
В аспекте по варианту осуществления, изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 143, 147, 159, 163, и 168 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, содержащие замену одной или более аминокислот на цистеин в положениях, описанных в данном документе. Участки для замены на цистеин находятся в константных областях антитела, и, таким образом, являются применимыми к разнообразным антителам, и участки выбирают для обеспечения стабильных и гомогенных конъюгатов. Модифицированное антитело или фрагмент могут иметь две или более замены на цистеин, и эти замены могут применяться в комбинации с другими модификацией антитела и способами конъюгации, как описано в данном документе.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую иммуноконъюгат, раскрытый выше, и способы применения иммуноконъюгатов.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет нуклеиновую кислоту, кодирующую моди
- 4 043810 фицированное антитело или фрагмент антитела, описанные в данном документе, имеющие по меньшей мере одну замену на цистеин на участке, описанном в данном документе. Изобретение дополнительно предоставляет клетки-хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты, и способы применения нуклеиновой кислоты или клеток-хозяев, чтобы экспрессировать и продуцировать антитела или фрагменты, описанные в данном документе.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет способ выбора аминокислоты антитела, которая является подходящей для замены на цистеин, чтобы обеспечить хороший участок для конъюгации, включающий в себя:
(1) идентификацию аминокислот в константной области антитела, которые имеют подходящую поверхностную экспозицию, чтобы обеспечить набор первоначальных кандидатных участков;
(2) для каждого первоначального кандидатного участка, экспрессию антитела, где нативную аминокислоту на данном участке заменяют на цистеин;
(3) для каждого экспрессированного антитела, определение того, является ли экпрессированный белок по существу гомогенным после восстановления и повторное окисление, чтобы обеспечить функциональное антитело, имеющее свободный цистеин на первоначальном кандидатном участке, (4) для каждого экспрессированного белка, который является по существу гомогенным и функциональным, конъюгирование цистеина на первоначальном кандидатном участке с малеимидным фрагментом и определение того, является ли связь тиол-малеимид стабильной на данном участке;
(5) удаление из набора первоначальных кандидатных участков тех участков, для которых экспрессированное антитело не является по существу гомогенным и функциональным, и тех участков, где связь тиол-малеимид является дестабилизированной, чтобы обеспечить набор преимущественных участков для замены на цистеин.
Необязательно, способ дополнительно включает в себя стадию определения температуры плавления для конъюгата каждого преимущественного участка для замены на цистеин, и исключение из набора любых участков, где замена на цистеин и конъюгация вызывают отличие температуры плавления на 5°C или более от температуры плавления нативного антитела.
В варианте осуществления, изобретение предоставляет способ получения иммуноконъюгата, который включает в себя присоединение Линкерного Блока (LU) или комбинации Линкерный Блок-Полезная нагрузка (-LU-X) к остатку цистеина в антителе или фрагменте антитела, где цистеин расположен на участке замены на цистеин, выбранном из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 360 и 375 тяжелой цепи указанного антитела или фрагмента антитела и положений 107, 108, 142, 145, 159, 161, и 165 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
Другие аспекты и варианты осуществления изобретения описаны более подробно в данном документе.
1. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области на участке, выбранном из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 334, 360, 375 и 392 тяжелой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
2. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 1, где замену одной или более аминокислот на цистеин выбирают из положений 121, 124, 152, 258, 334, 360 и 392.
3. Иммуноконъюгат вариантов осуществления 1 или 2, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 10, 17, 18, 29, 35, 42, 43, 48, 50, 54, 290, 291, 292, 293, 294, и 295.
4. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области на участке, выбранном из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
5. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 4, где замену одной или более аминокислот на цистеин выбирают из положений 145 или 165.
6. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 4, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, 62, 69, 71, 75, 76 и 77.
7. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области на участке, выбранном из положений 143, 147, 159, 163 и 168 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
- 5 043810
8. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 7, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 92, 94, 96, 97 и 98.
9. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 1, 2 или 3, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела дополнительно содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области на участке, выбранном из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
10. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 1, 2 или 3, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела дополнительно содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 143, 147, 159, 163 и 168 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения легкой цепи нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
11. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит комбинацию замен из двух или более аминокислот на цистеин в константной области тяжелой цепи в положениях 152 и 375, или в положениях 327 и 375, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
12. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит комбинацию замен из двух или более аминокислот на цистеин в его константных областях, содержащих положение 107 легкой цепи и 360 тяжелой цепи, где указанная легкая цепь представляет собой каппа цепь, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
13. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400 и 422 тяжелой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
14. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199 и 203 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
15. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин, выбранных из положений 143, 145, 147, 156, 159, 163 и 168 в его константной области легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
16. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит комбинацию замен из двух или более аминокислот на цистеин в его константных областях, где комбинации содержат замены в положениях 375 тяжелой цепи антитела и положении 165 легкой цепи антитела, или в положении 334 тяжелой цепи антитела, в положении 165 легкой цепи антитела, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа цепь, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
17. Иммуноконъюгат любых вариантов осуществления 11, 12 и 16, где отношение лекарственного средства к антителу равно приблизительно 4.
18. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит комбинацию замен из трех или более аминокислот на цистеин в его константных областях, где комбинации содержат замены, выбранные из
a) положений 375 и 392 тяжелой цепи антитела и положения 165 легкой цепи антитела,
b) положений 334 и 375 тяжелой цепи антитела и положения 165 легкой цепи антитела, и
c) положений 334 и 392 тяжелой цепи антитела и положения 165 легкой цепи антитела, и, где указанная легкая цепь представляет собой каппа цепь, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
19. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит комбинацию замен из трех или более аминокислот на цистеин в его константных областях, где комбинации содержат замены, выбранные из
a) положений 152, 375 и 392 тяжелой цепи антитела,
b) положений 152, 334 и 375 тяжелой цепи антитела, и
- 6 043810
c) положений 152, 334 и 392 тяжелой цепи антитела, и, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
20. Иммуноконъюгаты вариантов осуществления 18 или 19, где отношение лекарственного средства к антителу равно приблизительно 6.
21. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит комбинацию замен из четырех или более аминокислот на цистеин в его константных областях, где комбинации содержат замены в положениях 334, 375, и 392 тяжелой цепи антитела и положении 165 легкой цепи антитела, или в положениях 333, 375, и 392 тяжелой цепи антитела и в положении 165 легкой цепи антитела, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа цепь, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
22. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит комбинацию замен из четырех или более аминокислот на цистеин в его константных областях, где комбинации содержат замены в положениях 152, 334, 375, и 392 тяжелой цепи антитела, или в положениях 152, 333, 375 и 392 тяжелой цепи антитела, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
23. Иммуноконъюгаты по варианту осуществления 21 или 22, где отношение лекарственного средства к антителу равно приблизительно 8.
24. Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-23, дополнительно содержащий фрагмент лекарственного средства.
25. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 24, где фрагмент лекарственного средства присоединяют к модифицированному антителу или фрагменту антитела через серу указанного цистеина и необязательный линкер.
26. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 25, где указанный фрагмент лекарственного средства соединяют с указанной серой указанного цистеина через расщепляемый или нерасщепляемый линкер.
27. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 25, где указанный фрагмент лекарственного средства соединяют с указанной серой указанного цистеина через нерасщепляемый линкер.
28. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 25, где указанный иммуноконъюгат содержит связь тиол-малеимид.
29. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 25, где указанный иммуноконъюгат содержит -SCH2-C(=O)- связь или дисульфидную связь.
30. Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 25-29, где указанный фрагмент лекарственного средства представляет собой цитотоксичное средство.
31. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 30, где указанный фрагмент лекарственного средства выбирают из группы, состоящей из таксанов, ДНК-алкилирующих агентов (например, аналогов СС1065), антрациклинов, аналогов тубулизина, аналогов дуокармицина, ауристатина Е, ауристатина F и майтансиноидов.
32. Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-31, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
33. Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-31, где указанное антитело представляет собой химерное антитело.
34. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 31, где указанное антитело представляет собой гуманизированное или полностью человеческое антитело.
35. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 31, где указанное антитело представляет собой биспецифичное или мультиспецифичное антитело.
36. Иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-32, где указанное антитело или фрагмент антитела специфически связывается с маркером клеточной поверхности, характеристическим для опухоли.
37. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-36.
38. Модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, содержащие замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400 и 422 тяжелой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
39. Модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, содержащие замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199 и 203 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
40. Модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, содержащие замену одной или бо
- 7 043810 лее аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 143, 145, 147, 156, 159, 163 и 168 в его константной области легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
41. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 38, где указанная замена представляет собой по меньшей мере один цистеин, выбранный из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 360 и 375 тяжелой цепи, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
42. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 39, в которых указанная замена представляет собой два-шесть цистеинов, где указанные цистеины находятся в положениях, выбранных из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 360 и 375 тяжелой цепи, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
43. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 39, в которых указанная замена представляет собой по меньшей мере один цистеин, выбранных из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
44. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 40, в которых указанная замена представляет собой два-шесть цистеинов, где указанные цистеины находятся в положениях, выбранных из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU, и где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
45. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 40, в которых указанная замена представляет собой по меньшей мере один цистеин, выбранный из положений 143, 147, 159, 163 и 168 легкой цепи, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
46. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 40, в которых указанная замена представляет собой два-шесть цистеинов, где указанные цистеины находятся в положениях, выбранных из положений 143, 147, 159, 163 и 168 легкой цепи, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
47. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 11, 12, 14-22, 38-47, которые дополнительно присоединены к фрагменту лекарственного средства, и где указанный фрагмент лекарственного средства присоединяют к модифицированному антителу или фрагменту антитела через серу указанного цистеина и необязательный линкер.
48. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по варианту осуществления 47, где указанный фрагмент лекарственного средства присоединяют к сере указанного цистеина через Линкерный Блок.
49. Модифицированное антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 38-48, дополнительно содержащие по меньшей мере один Pcl или замену на неприродную аминокислоту или пептидную метку для фермент-опосредованной конъюгации и/или их комбинации.
50. Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированное антитело или фрагмент антитела по любому из вариантов осуществления 38-49.
51. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по варианту осуществления 50.
52. Способ получения модифицированного антитела или фрагмента антитела, включающий в себя инкубацию клетку-хозяина по варианту осуществления 49 при подходящих условиях для экспрессии антитела или фрагмента антитела, и выделение указанного антитела или фрагмента антитела.
53. Способ выбора аминокислоты антитела, которая является подходящей для замены на цистеин для обеспечения подходящего участка для конъюгации, включающий в себя (1) идентификацию аминокислот в константной области антитела, которые имеют подходящую поверхностную экспозицию, чтобы предоставить набор первоначальных кандидатных участков;
(2) для каждого первоначального кандидатного участка, экспрессию антитела, где нативную аминокислоту на данном участке заменяют на цистеин;
(3) для каждого экспрессированного антитела, определение того, является ли экпрессированный белок по существу гомогенным после восстановления, и повторное окисление, чтобы обеспечить функциональное антитело, имеющее свободный цистеин на первоначальном кандидатном участке, (4) для каждого экспрессированного белка, который является по существу гомогенным и функциональным, конъюгирование цистеина на первоначальном кандидатном участке с малеимидным фрагментом, и определение того, является ли связь тиол-малеимид дестабилизированной на данном участке;
(5) удаление из набора первоначальных кандидатных участков тех участков, для которых экспрессированное антитело не является по существу гомогенным и функциональным, и тех участков, где связь тиол-малеимид является дестабилизированной, чтобы обеспечить набор преимущественных участков для замены на цистеин.
- 8 043810
54. Способ по варианту осуществления 53, дополнительно включающий стадию определения температуры плавления для конъюгата каждого преимущественного участка для замены на цистеин, и исключение из набора любых участков, где замена на цистеин и конъюгация вызывают отличие температуры плавления на 5°C или более от температуры плавления исходного антитела.
55. Способ по варианту осуществления 53 или 54, дополнительно включающий продуцирование антитела или фрагмента антитела, содержащие цистеин на одном или более идентифицированных участков для замены.
56. Способ получения иммуноконъюгата, который включает в себя присоединение Линкерного Блока (LU) или комбинации Линкерный Блок-Полезная нагрузка (-LU-X) к остатку цистеина в антителе или фрагменте антитела, где цистеин расположен на участке замены на цистеин, выбранном из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 360 и 375 тяжелой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, и положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи указанного антитела или фрагмента антитела, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
57. Способ по варианту осуществления 56, где иммуноконъюгат имеет формулу (I):
М \
АЬЧ--LU \ Λ, где Ab представляет антитело или фрагмент антитела, содержащие по меньшей мере один остаток цистеина на одном из предпочтительных участков замены на цистеин, выбранном из описанных в данном документе;
LU представляет Линкерный Блок, как описано в данном документе;
X представляет собой полезную нагрузку или фрагмент лекарственного средства;
и n является целым числом от 1 до 16.
Определения
Термин аминокислота относится к каноническим, синтетическим и неприродным аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично каноническим аминокислотам. Канонические аминокислоты представляют собой протеиногенные аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, и включают аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин, а также селеноцистеин, пирролизин и его аналог пирролин-карбокси-лизин. Аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют одинаковую основную химическую структуру, в виде канонических аминокислот, т.е. α-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой, и R группой, например, цитруллин, гомосерин, норлейцин, сульфоксид метионина, метилсульфоний метионина. Такие аналоги имеют модифицированные R группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют одинаковую основную химическую структуру в виде канонической аминокислоты.
Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично канонической аминокислоте. Термин неприродная аминокислота, как применяют в данном документе, подразумевает представление аминокислотных структур, которые не могут генерироваться биосинтетически в любом организме, с использованием немодифицированных или модифицированных генов из любого организма, вне зависимости от того являются ли они одинаковыми или различными. В дополнение, такие неприродные аминокислоты обычно требуют модифицированную тРНК и модифицированную тРНК синтетазу (RS) для введения в белок. Эта пара тРНК/RS преимущественно включает неприродную аминокислоту по сравнению с каноническими аминокислотами. Такая ортогональна пара тРНК/RS генерируется посредством процесса селекции, как разработано Schultz et al. (см., например, Liu et al. (2010) Annu. Rev. Biochem. 79:413-444) или аналогичной методики. Термин неприродная аминокислота не включает природный 22ой протеиногенный аминокислотный пирролизин (Pyl), а также его деметилированный аналог пирролин-карбокси-лизин (Pcl), поскольку включение обоих остатков в белки опосредуется немодифицированной, природной пары пирролизил-тРНК/тРНК синтетаза, и поскольку Pyl и Pcl генерируются биосинтетически (см., например,. Ou et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:1043710442; Cellitti et al. (2011) Nat. Chem. Biol, 27; 7 (8):528-30). См. также Предварительную заявку США 61/76236, включенную посредством ссылки, в которой описаны участки специфичных аминокислотных остатков в легких и тяжелых цепях антитела, которые могут быть заменены на Pcl.
Термин антитело, как применяют в данном документе, относится к полипептиду семейства иммуноглобулинов, который способен к связыванию соответствующего антигена нековалентно, обратимо, и специфичным образом. Например, природное антитело IgG представляет собой тетрамер, содержащий по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи (также называемых тяжелая цепь антитела) и две легких (L) цепи (также называемых легкая цепь антитела), связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращаемой в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доме
- 9 043810 нов, СН1, СН2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращаемой в данном документе как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH и VL области могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, называемые определяющие комплементарность области (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 CDR3, и FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первым компонентом (Clq) of classical комплемент system.
Термин антитело включает, но не ограничено перечисленным, моноклональные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, верблюжьи антитела, химерные антитела, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включающие, например, анти-Id антитела к антителам изобретения). Антитела могут принадлежать к любому изотипу/классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), или подклассу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2).
Как легкие, так и тяжелые цепи разделяют на области структурной и функциональной гомологии. Термины константная и вариабельная применяют функционально. В данном отношении, следует учитывать, что вариабельные домены, частей как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют распознавание антигена и специфичность. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) придают важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарную подвижность, связывание Fc рецептора, связывание комплемент, и т.п. По договоренности, нумерация доменов константной области возрастает, по мере того, как они становятся более удаленными от участка связывания антигена или амино-конца антитела. N-конец является вариабельной области, а по С-концу находится константная область; CH3 и CL домены в действительности содержат карбокси-концевые домены тяжелой и легкой цепи, соответственно.
Термин фрагмент антитела, как применяют в данном документе, относится либо к антигенсвязывающему фрагменту антитела или неантиген-связывающему фрагменту (например, Fc) антитела. Термин антиген-связывающий фрагмент, как применяют в данном документе, относится к одному или более частям антитела, которые сохраняют способность специфически взаимодействовать с (например, посредством связывания, стерического несоответствия, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) эпитопа антигена. Примеры связывающих фрагментов включают, но не ограничиваются перечисленным, одноцепочечные Fvs (scFv), дисульфид-связанные Fvs (sdFv), Fab фрагменты, F(ab') фрагменты, моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов; F(ab)2 фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанные посредством дисульфидного мостика в шарнирной области; Fd фрагмент, состоящий из VH и СН1 доменов; Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одиночного плеча антитела; dAb фрагмент (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), который состоит из VH домен; и изолированная определяющая комплементарность область (CDR), или другие эпитип-связывающие фрагменты антитела.
Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены, с использованием рекомбинантных методов, посредством синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одиночной белковой цепи, в которой VL и VH области образуют пару с образованием моновалентных молекул (известных, как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:58795883, 1988). Такие одноцепочечные антитела также подразумеваются охваченными термином антигенсвязывающий фрагмент. Эти антиген-связывающие фрагменты получают с использованием общепринятых методов, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на применимость, таким же образом, как интактные антитела.
Антиген-связывающие фрагменты могут также вводиться в одиночный домен антитела, макситела, минитела, нанотела, интраантитела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Антиген-связывающие фрагменты могут быть привиты к остовам на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. Патент США № 6,703,199, который описывает фибронектиновые полипептидные монотела).
Антиген-связывающие фрагменты могут вводиться в одноцепочечные молекулы, содержащие пару тандемных Fv сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые, вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи, образуют пару антиген-связывающих областей (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; и Патент США № 5,641,870).
Термин моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела, как применяют в данном документе, относится к полипептидам, включающим антитела и фрагменты антител, которые имеют по существу идентичную аминокислотную последовательность или произведены из одинакового генетического источника. Данный термин также включает препараты молекул антител одного молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела проявляет одиночную специфичность связыва
- 10 043810 ния и аффинность для конкретного эпитопа.
Термин человеческое антитело, как применяют в данном документе, включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области являются производными последовательностей человеческого происхождения. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также является производной от таких человеческих последовательностей, например, человеческих первоначальных последовательностей, или мутированных версий человеческих первоначальных последовательностей или антитела, содержащего косенсусные каркасные последовательные, производные от анализа человеческих каркасных последовательностей, например, как описано в Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000).
Человеческие антитела изобретения могут включать аминокислотные остатки, некодируемые человеческими последовательностями (например, мутации, вводимые посредством статистического или сайтспецифичного мутагененза in vitro или посредством соматической мутации in vivo, или консервативной замены, чтобы инициировать стабильность или изготовление).
Термин гуманизированное антитело, как применяют в данном документе, относится к антителу, которое сохраняет реакционную способность нечеловеческого антитела, в то же время, являясь менее иммуногенным у людей. Это может достигаться, например, посредством сохранения нечеловеческих CDR областей и замены оставшихся частей антитела на их человеческие двойники. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994).
Термин распознает, как применяют в данном документе, относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое находит и взаимодействует (например, связывается) с его эпитопом, независимо от того является ли этот эпитоп линейным или конформационным. Термин эпитоп относится к участку на антигене, с которым антитело или антиген-связывающий фрагмент изобретения специфически связываются. Эпитопы могут быть образованы из сближенных аминокислот или несближенных аминокислот, помещаемых рядом посредством четвертичным складыванием белка. Эпитопы, образованные из сближенных аминокислот, обычно сохраняются при предоставлении воздействию денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные четвертичным складыванием, обычно теряют свои свойства при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают методы, известные в данной области, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
Термин аффинность, как применяют в данном документе, относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном на одиночном антигенном участке. В пределах каждого антигенного участка, вариабельная область плеча антитела взаимодействует посредством слабых нековалентных сил с антигеном на многочисленных участках; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.
Термин изолированное антитело относится к антителу, которое не содержит по существу других антител, имеющих отличные антигенные специфичности. Изолированное антитело, которое специфически связывается с одним антигеном, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими антигенами. Более того, изолированное антитело может не содержать по существу другого клеточного материала и/или других химикатов.
Термин консервативно модифицированный вариант применяют как к аминокислотным последовательностям, так и последовательностям нуклеиновых кислот. По отношению к конкретным последовательностям нуклеиновых кислот, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или, где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, до по существу идентичных последовательностей. Вследствие дегенерации генетического кода, большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин устанавливается кодоном, кодон может изменяться до любого из соответствующих кодонов, описанных без измененного кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой молчащие вариации которые являются одним видом консервативно модифицированной вариации. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в данном документе, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Квалифицированный специалист сможет понять, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован, чтобы на выходе дать функционально идентичную молекулу. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид подразумевается в каждой описанной последовательности.
Для полипептидных последовательностей, консервативно модифицированные варианты включа
- 11 043810 ют индивидуальные замены, делеции или присоединения к полипептидной последовательности, которые приводят в результате к замене аминокислот на химически аналогичную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, предоставляющие функционально сходные аминокислоты являются хорошо известными в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнением и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели изобретения. Следующие восемь групп содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) Аланин (А), Глицин (G); 2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е); 3) Аспарагин (N), Глутамин (Q); 4) Аргинин (R), Лизин (K); 5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); 6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонин (Т); и 8) Цистеин (С), Метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984)). В нескольких вариантах осуществления, термин консервативные модификации последовательности применяют для обозначения аминокислотных модификаций, которые не оказывают значительного воздействия или значительно не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность.
Термин оптимизированная, как его применяют в данном документе, относится к нуклеотидной последовательности, измененной для кодирования аминокислотной последовательности с использованием кодонов, которые являются предпочтительными в продуцирующей клетке или организме, обычно эукариотной клетке, например, дрожжевой клетке, клетке Pichia, грибковой клетке, клетке Trichoderma, клетке яичника китайского хомяка (СНО) или человеческой клетке. Оптимизированную нуклеотидную последовательность конструируют, чтобы сохранить полностью или максимально возможно аминокислотную последовательность, первоначально кодируемую первоначальной нуклеотидной последовательностью, которая также является известной как родительская последовательность.
Термины процент идентичный или процент идентичный, в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются по существу идентичными, если две последовательности имеют установленное процентное содержание аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е. 60% идентичности, необязательно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по сравнению с установленной областью или, когда не установлены, по сравнению с полной последовательностью), когда их сравнивают и выравнивают для максимального соответствия по сравнению с окном сравнения, или обозначенной областью, измеренной с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством ручного выравнивания и визуальной проверки. Необязательно, идентичность существует при сравнении с областью, которая имеет по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов (или 10 аминокислот) по длине, или более предпочтительно, при сравнении с областью, которая имеет от 100 до 500 или 1000 или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот) по длине.
Для сравнения последовательностей, обычно одна последовательность действует в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей, тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, обозначают координаты субпоследовательности, если необходимо, и обозначают параметры алгоритма программы сравнения последовательностей. Могут применяться параметры программы по умолчанию или могут быть обозначены альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонных последовательностей, на основании параметров программы.
А окно сравнения, как применяют в данном документе, включает обозначение сегмента из любого одного из числа близлежащих положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 200, более обычно приблизительно от 100 до приблизительно 150, в котором последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью из такого же числа близлежащих положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться, например, посредством алгоритма локальной гомологии Smith и Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970), посредством алгоритма гомологии выравнивания Needleman и Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), посредством поиска метода подобия Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), посредством компьютеризованных выполнений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или посредством выравнивания вручную и визуальной проверки (см., например, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).
Двумя примерами алгоритмов, которые являются подходящими для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., Nuc. Кислоты Res. 25:3389-3402, 1977; и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, соответственно. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST является общедоступным через National Center for Biotechnology Information. Этот алгоритм включает в себя сначала идентификацию пар последовательностей с высокой балльной оценкой (HSPs) посредством идентификации коротких слов длины W в запрашиваемой последовательности, которая либо совпадает или
- 12 043810 удовлетворяет некоторой положительно-значимой пороговой балльной оценке Т, при сравнении со словом такой же длины в последовательности базы данных. Т называют балльной оценкой порога соседнего слова (Altschul et al., выше). Эти первоначальные выборки соседнего слова действуют как затравки для инициации поисков, чтобы найти более длинные HSPs, содержащие их. Выборки слов расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько далеко, насколько кумулятивная балльная оценка выравнивания может быть увеличена. Кумулятивные балльные оценки вычисляют, используя, для нуклеотидных последовательностей параметры М (наградная балльная оценка за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей, матрицу балльных оценок применяют для вычисления кумулятивного балла. Расширение словных выборок в каждом направлении прекращают, когда: кумулятивная балльная оценка выравнивания падает на количество X от его максимально достижимого значения; кумулятивная балльная оценка приходит к нулю или ниже, вследствие накопления одной или более отрицательных балльных оценок выравниваний остатков; или когда достигают конца обеих последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве установок по умолчанию длину слова (W), равную 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей, программа BLASTP использует в качестве установок по умолчанию длину слова, равную 3, и ожидание (Е), равное 10, и матрицу балльных оценок BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), выравнивания (В), равные 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4, и сравнение обеих цепей.
Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ подобия между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Одной мерой подобия, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая предоставляет указание на вероятность, при которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями могло бы происходить случайно. Например, нуклеиновая кислота считается подобной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой является меньше приблизительно 0,2, более предпочтительно, меньше приблизительно 0,01, и наиболее предпочтительно, меньше приблизительно 0,001.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями также может быть определен с использованием алгоритма Е. Meyers и W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988), который был введен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы массы остатка РАМ120, штрафа за продление пропуска в последовательности, равного 12, и штрафа за пропуск в последовательности, равного 4. В дополнение, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Needleman и Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444453, 1970), который был введен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного на www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossom 62 или матрикса РАМ250, и штрафа за делецию, равного 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение делеции, равного 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Отличным от процентного значения идентичности последовательностей, отмеченного выше, еще одним показанием, что две последовательности нуклеиновой кислоты или два полипептида являются идентичными по существу, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой является иммунологически кросс-реактивным с антителами, вырабатываемыми против полипептида, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид обычно является по существу идентичным второму полипептиду, например, там, где два пептида отличаются только консервативными заменами. Еще одним показанием того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются по существу идентичными, является то, что две молекулы или их комплементы гибридизируются друг с другом в строгих условиях, как описано ниже. Еще одним другим показанием того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются по существу идентичными, является то, что для амплификации последовательностей могут применяться одинаковые праймеры.
Термин нуклеиновая кислота используют в данном документе взаимозаменяемо с термином полинуклеотид и он относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам либо в одно- или двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи скелета, которые являются синтетическими, природными и неприродными, которые имеют сходные свойства связывания с эталонной нуклеиновой кислотой, и, которые метаболизируются аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфотиоаты, фосфоамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA).
Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в неявном виде охватывает ее молчащие варианты (например, вырожденные замены кодонов) и комплементарные последовательности, а также последовательности, указанные явным образом. В особенности, как подробно описано ниже, вырожденные замены кодонов могут быть достигнуты посредством генерации последовательностей, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов заменяют на
- 13 043810 остатки со смешанными основаниями и/или остатки дезоксиинозина (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; и Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:9198).
Термин функционально связанные в контексте нуклеиновых кислот относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более полинуклеотидными (например, ДНК) сегментами. Обычно, он относится к функциональной взаимосвязи транскрипционной регуляторной последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторные или энхансерные последовательности являются функционально связанными с кодирующей последовательностью, если они стимулируют или модулируют транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. В общем случае, промоторные транскрипционные регуляторные последовательности, которые являются функционально связанными с транскрибируемой последовательностью, являются физически сближенными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются цисдействующими. Однако, некоторые транскрипционные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, не нуждаются в физическом сближении или расположении в тесной близости с кодирующими последовательностями, чью транскрипцию они усиливают.
Термины полипептид и белок применяют взаимозаменяемо в данном документе, для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применяют к полимерам канонических аминокислот, а также полимерам неканонических аминокислот. Если не указано иначе, конкретная полипептидная последовательность также в неявной форме охватывает ее консервативно модифицированные варианты.
Термин иммуноконъюгат или конъюгат антитела, как применяют в данном документе, относится к связыванию антитела или фрагмента этого антитела с еще одним другим средством, таким как химиотерапевтическое средство, токсин, иммунотерапевтическое средство, зонд для визуализации, спектроскопический зонд, и т.п. Связь может осуществляться через одну или множество ковалентных связей, или нековалентных взаимодействий, и может включать хелатирование. Различные линкеры, многие из которых являются известными в данной области, могут использоваться, чтобы образовать иммуноконъюгат. Дополнительно, иммуноконъюгат может быть предоставлен в форме гибридного белка, который может экспрессироваться из полинуклеотида, кодирующего иммуноконъюгат. Как применяют в данном документе, гибридный белок относится к белкам, создаваемым посредством объединения двух или более генов или фрагментов генов, которые первоначально кодировали отдельные белки (включающие пептиды и полипептиды). Гибридный белок может быть создан посредством объединения по N- или Сконцу, или посредством введения генов или фрагментов генов в разрешаемые области одного из партнерских белков. Трансляция гибридного гена приводит к единственному белку с функциональными свойствами, производимыми от каждого из исходных белков.
Термин субъект включает людей и животных, не являющихся людьми. Животные, не являющиеся людьми, включают всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, не являющиеся людьми, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии и рептилии. За исключением отмеченных случаев, термины пациент или субъект применяют в данном документе взаимозаменяемо.
Термин цитотоксин или цитотоксическое средство, как применяют в данном документе, относится к любому средству, которое является вредным для роста и пролиферации клеток и могут действовать для снижения, ингибирования или разрушения клетки или злокачественного новообразования.
Термин средство против злокачественных новообразований, как применяют в данном документе, относится к любому средству, которое может применяться для лечения пролиферативного нарушения клеток, такого как злокачественное новообразование, включающему, но не ограниченному перечисленным, цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, лучевую терапию и средства для лучевой терапии, нацеленные средства против злокачественных новообразований, и иммунотерапевтические средства.
Термин фрагмент лекарственного средства или полезная нагрузка используют взаимозаменяемо, и он относится к химическому фрагменту, который конъюгируют с антителом или фрагментом антитела изобретения, и может включать любой фрагмент, который является применимым для присоединения к антителу или фрагменту антитела. Например, фрагмент лекарственного средства или полезная нагрузка могут представлять собой средство против злокачественных новообразований, противовоспалительное средство, противогрибковое средство, антибактериальное средство, противопаразитарное средство, противовирусное средство, анестезирующее средство. В некоторых вариантах осуществления фрагмент лекарственного средства выбирают из ингибитора V-АТФазы, ингибитора HSP90, ингибитора IAP, ингибитора mTor, стабилизатора микротрубочек, дестабилизаторов микротрубочек, ауристатина, доластатина, майтансиноида, MetAP (метионинаминопептидазы), ингибитора ядерного экспорта белков CRM1, ингибитора DPPIV, ингибитора реакций переноса фосфорила в митохондриях, ингибитора синтеза белка, ингибитора киназы, ингибитора CDK2, ингибитора CDK9, ингибитора протеасом, ингибитора кинезина, ингибитора HDAC, средства, повреждающего ДНК, ДНК-алкилирующего средства, интеркалятора ДНК, связующего малой бороздки ДНК и ингибитора DHFR. Подходящие примеры включают ауристатины, такие как ММАЕ и MMAF; калихеамицины, такие как гамма-калихеамицин; и майтансиноиды, такие как DM1 и DM4. Способы присоединения каждого из перечисленных к линкеру, совмести
- 14 043810 мому с антителами и способом изобретения, являются известными в данной области. См., например, Singh et al. (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457. В дополнение, полезная нагрузка может представлять собой биофизический зонд, флуорофор, спиновую метку, инфракрасный зонд, аффинный зонд, хелатор, спектроскопический зонд, радиоактивный зонд, липидную молекулу, полиэтиленгликоль, полимер, спиновую метку, ДНК, РНК, белок, пептид, поверхность, антитело, фрагмент антитела, наночастицу, квантовую точку, липосому, частицу PLGA, сахарид или полисахарид, реакционноспособную функциональную группу, или связывающее средство, которое может соединять конъюгат с еще одним фрагментом, поверхностью и т.д.
Термин отношение лекарственного средства к антителу (также именуемое DAR), относится к числу полезных нагрузок или фрагментов лекарственного средства, связанных с антителом иммуноконъюгата. Например, отношение лекарственного средства к антителу, равное 2, означает, что в среднем два фрагмента лекарственного средства связаны с каждым антителом в образце иммуноконъюгатов. Некоторые индивидуальные иммуноконъюгаты находящиеся в образце при отношении лекарственного средства к антителу, равном двум, могут не иметь или иметь только один связанный фрагмент лекарственного средства; другие иммуноконъюгаты в этом образце будут иметь два, три, четыре или даже более фрагментов в индивидуальном антителе. Но среднее отношение в образце будет равно двум. Существуют различные методы, известные в данной области, для измерения отношений лекарственного средства к антителу иммуноконъюгатов.
В варианте осуществления данного изобретения, DAR в образце иммуноконъюгатов может являться гомогенным. Гомогенный образец конъюгации представляет собой образец с узким распределением DAR. В качестве иллюстративного варианта осуществления, гомогенный образец конъюгации, имеющий DAR, равный 2, может содержать антитела, которые не являются конъюгированными, и некоторые антитела, имеющие более двух фрагментов, конъюгированных при DAR, приблизительно равном двум. Большая часть образца означает, что по меньшей мере свыше 70%, или по меньшей мере свыше 80% или по меньшей мере свыше 90% антител в образце будут конъюгированы с двумя фрагментами.
В качестве иллюстративного варианта осуществления, гомогенный образец конъюгации, имеющий DAR, равный 4, может содержать в данном образце антитела, которые имеют больше или меньше четырех фрагментов, конъюгированных при DAR, приблизительно равном четырем. Большая часть образца означает, что по меньшей мере свыше 70%, или по меньшей мере свыше 80% или по меньшей мере свыше 90% антител в образце будут конъюгированы с четырьмя фрагментами.
В качестве иллюстративного варианта осуществления, гомогенный образец конъюгации, имеющий DAR, равный 6, может содержать в данном образце антитела, которые имеют больше или меньше шести фрагментов, конъюгированных при DAR, приблизительно равном шести. Большая часть образца означает, что по меньшей мере свыше 70%, или по меньшей мере свыше 80% или по меньшей мере свыше 90% антител в образце антител в образце будут конъюгированы с шестью фрагментами.
В качестве иллюстративного варианта осуществления, гомогенный образец конъюгации, имеющий DAR, равный 8, может содержать в данном образце антитела, которые имеют больше или меньше восьми фрагментов, конъюгированных при DAR, приблизительно равном четырем. Большая часть образца означает, что по меньшей мере свыше 70%, или по меньшей мере свыше 80% или по меньшей мере свыше 90% антител в образце антител в образце будут конъюгированы с восемью фрагментами.
Иммуноконъюгат, имеющий отношение лекарственного средства к антителу, равное приблизительно 2, относится к образцу иммуноконъюгатов, где отношение лекарственного средства к антителу может находиться в интервале от приблизительно 1,6-2,4 фрагментов/антитело, 1,8-2,3 фрагментов/антитело или 1,9-2,1 фрагментов/антитело.
Иммуноконъюгат, имеющий отношение лекарственного средства к антителу, равное приблизительно 4, относится к образцу иммуноконъюгатов, где отношение лекарственного средства к антителу может находиться в интервале от приблизительно 3,6-4,4 фрагментов/антитело, 3,8-4,3 фрагментов/антитело или 3,9-4,1 фрагментов/антитело.
Иммуноконъюгат, имеющий отношение лекарственного средства к антителу, равное приблизительно 6, относится к образцу иммуноконъюгатов, где отношение лекарственного средства к антителу может находиться в интервале от приблизительно 5,6-6,4 фрагментов/антитело, 5,8-6,3 фрагментов/антитело или 5,9-6,1 фрагментов/антитело.
Иммуноконъюгат, имеющий отношение лекарственного средства к антителу, равное приблизительно 8, относится к образцу иммуноконъюгатов, где отношение лекарственного средства к антителу может находиться в интервале от приблизительно 7,6-84 фрагментов/антитело, 7,8-8,3 фрагментов/антитело или 7,9-8,1 фрагментов/антитело.
Опухоль относится к росту и пролиферации неопластических клеток, независимо от того, являются ли они злокачественными или доброкачественными, и всем предраковым и раковым клеткам и тканям.
Термин противоопухолевая активность означает снижение скорости пролиферации, жизнеспособности или метастатической активности опухолевых клеток. Возможным путем демонстрации противоопухолевой активности является показать падение скорости роста аномальных клеток, который возникает во время терапии, или устойчивость или снижение размера опухоли. Такую активность можно оце
- 15 043810 нить, используя принятые опухолевые модели in vitro или in vivo, включающие, но не ограниченные перечисленным, ксеноирансплантантные модели, аллотрансплантантные модели, модели MMTV и другие известные модели, известные в данной области для исследования противоопухолевой активности.
Термин злокачественное образование относится к недоброкачественной опухоли или раку. Как применяют в данном документе, термин рак включает злокачественное новообразование, характеризуемое дерегулированным или неуправляемым ростом клеток. Примерные злокачественные новообразования включают: карциномы, саркомы, лейкемии и лимфомы.
Термин рак включает первичные злокачественные опухоли (например, опухоли, клетки которых не мигрировали к участкам в организме субъекта, отличным от участка исходной опухоли) и вторичные злокачественные опухоли, (например, опухоли, возникающие в результате метастазов, миграции опухолевых клеток к вторичным участкам, которые отличаются от участка исходной опухоли).
Как применяют в данном документе, термин оптический изомер или стереоизомер относится к любой из различных стереоизомерных конфигураций, которые могут существовать для данного соединения настоящего изобретения и включают геометрические изомеры. Понимают, что заместитель может присоединяться по хиральному центру атома углерода. Термин хиральный относится к молекулам, которые обладают свойством неналагаемости на их партнера зеркального изображения, в то время как термин хиральный относится к молекулам, которые могут налагаться на их партнера зеркального изображения. Следовательно, изобретение включает энантиомеры, диастереомеры или рацематы соединения. Энантиомеры представляют собой пару стереоизомеров которые представляют собой неналагающиеся зеркальные изображения друг друга. 1: 1 смесь пары энантиомеров представляет собой рацемическую смесь. Термин применяют для обозначения рацемической смеси в соответствующих случаях. Диастереоизомеры являются стереоизомерами, которые имеют по меньшей мере два асимметрических атома, но которые не являются зеркальными изображениями друг друга. Абсолютную стереохимию устанавливают в соответствии с R-S системой Кана-Ингольда-Прелога. Когда соединение представляет собой чистый энантиомер, стереохимия по каждому хиральному углероду может быть обозначена посредством либо R или S. Разделяемые соединения, абсолютная конфигурация которых является неизвестной, могут быть обозначены (+) или (-) В зависимости от направления (право- или левовращающего), в котором они вращают плоскополяризованный свет при длине волны D линии натрия. Некоторые соединения, описанные в данном документе, содержат один или более асимметрических центров или осей и могут, таким образом, приводить к энантиомерам, диастереомерам и другим стереоизомерным формам, которые могут быть определены, с точки зрения абсолютной стереохимии, как (R)- или (S)-.
В зависимости от выбора исходных веществ и методик, соединения могут быть представлены в форме одного из возможных изомеров или в виде их смесей, например, в виде чистых оптических изомером, или как смеси изомеров, такие как рацематы и диастереоизомерные смеси, в зависимости от числа асимметрических углеродных атомов. Подразумевают, что настоящее изобретение включает все такие возможные изомеры, включая рацемические смеси, диастереомерные смеси и оптически чистые формы. Оптически активные (R)- и (S)-изомеры могут быть получены с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов, или могут быть разделены с использованием общепринятых методов. Если соединение содержит двойную связь, заместитель может иметь Е или Z конфигурацию. Если соединение содержит дизамещенный циклоалкил, циклоалкильный заместитель может иметь цис- или трансконфигурацию. Подразумевают, что все таутомерные формы также являются включенными.
Как применяют в данном документе, термины соль или соли относится к кислотно-аддитивной или основно-аддитивной соли соединения изобретения. Соли включают, в частности, фармацевтические приемлемые соли. Термин фармацевтически приемлемые соли относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений данного изобретения и, которые обычно не являются биологически или иным образом нежелательными. Во многих случаях, соединения настоящего изобретения являются способными к образованию солей с кислотой и/или основанием вследствие присутствия амино и/или карбоксильных групп, или групп, аналогичных им.
Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть образованы с неорганическими кислотами и органическими кислотами, например, соли ацетата, аспартата, бензоата, бесилата, бромида/гидробромида, бикарбоната/карбоната, бисульфата/сульфата, камфорсульфоната, хлорида/гидрохлорида, хлортеофиллината, цитрата, этандисульфоната, фумарата, глюцептата, глюконата, глюкуроната, гиппурата, гидройодида/йодида, изетионата, лактата, лактобионата, лаурилсульфата, малата, малеата, малоната, манделата, мезилата, метилсульфата, нафтоата, напсилата, никотината, нитрата, октадеканоата, олеата, оксалата, пальмитата, памоата, фосфата/гидрофосфата/дигидрофосфата, полигалактуроната, пропионата, стеарата, сукцината, сульфосалицилата, тартрата, тозилата и трифтораацетата.
Неорганические кислоты, из которых соли могут быть получены, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т.п.
Органические кислоты, из которых соли могут быть получены, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную
- 16 043810 кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т.п. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут быть образованы с неорганическими и органическими основаниями.
Неорганические основания, из которых соли могут быть получены, включают, например, соли аммония и металлы из столбцов I-XII периодической таблицы. В некоторых вариантах осуществления, соли получают из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; особенно подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния.
Органические основания, из которых соли могут быть получены, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включающие природные замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и т.п. Некоторые органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглумин, пиперазин и трометамин.
Фармацевтически приемлемые соли настоящего изобретения могут быть синтезированы из основного или кислотного фрагмента, посредством общепринятых химических методов. Обычно, такие соли могут быть получены посредством взаимодействия свободных кислотных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат или т.п. Na, Ca, Mg или K), или посредством взаимодействия свободных основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующей кислоты. Такие реакции обычно проводят в воде или в органическом растворителе, или в смеси из обоих. Обычно, использование неводных сред, таких как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил является желательным там, где это практически осуществимо. Перечни дополнительных подходящей солей могут быть найдены, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); и в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002).
Любая формула, приведенная в данном документе, также предназначена для представления немеченых форм, а также меченых изотопами форм соединений. Изотопно меченые соединения имеют структуры, изображенных посредством формул, приведенных в данном документе, за исключением тех случаев, когда один или более атомов заменяют на атом, имеющий выбранную атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые могут быть введены в соединения изобретения, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как 2Н, 3Н, nC, 13С, 14С, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36Cl, 125I соответственно. Изобретение включает различные изотопно меченые соединения, определенные в настоящем документе, например те, в которых присутствуют радиоактивные изотопы, такие как 3Н и 14С или те, в которых присутствуют нерадиоактивные изотопы, такие как 2Н и 13С. Такие изотопно меченые соединения являются применимыми в метаболических исследованиях (с 14С), кинетических исследованиях реакции (с, например, 2Н или 3Н), методах обнаружения или визуализации, таких как позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), включающих аналитические тесты на распределение в тканях лекарственного средства или субстрата, или при лечении пациентов радиоактивными изотопами. В частности, 18F или меченое соединение могут быть особенно желательными для исследований методами ПЭТ или ОФЭКТ. Изотопномеченые соединения формулы (I) обычно могут быть получены посредством общепринятых методов, известных квалифицированным специалистам в данной области или посредством процессов, аналогичных способам, описанным в сопровождающих Примерах и Получениях, с использованием соответствующих изотопно-меченых реагентов вместо ранее использовавшегося немеченого реагента.
Дополнительно, замена на более тяжелые изотопы, особенно дейтерий (т.е. 2Н или D) может давать некоторые терапевтические преимущества, являющиеся результатом более высокой метаболической стабильности, например увеличенному времени полужизни in vivo или сниженным требованиям к дозировке или улучшению терапевтического индекса. Понимают, что дейтерий в данном контексте считается заместителем соединения формулы (I). Концентрация такого более тяжелого изотопа, в особенности дейтерия, может быть определена посредством фактора изотопного обогащения. Термин фактор изотопного обогащения, как применяют в данном документе, означает отношение между изотопной распространенностью и природной распространенностью установленного изотопа. Если заместитель в соединении данного изобретения обозначен как дейтерий, такое соединение имеет фактор изотопного обогащения для каждого обозначенного атома дейтерия, равный по меньшей мере 3500 (52,5% введения дейтерия по каждому обозначенному атому дейтерия), по меньшей мере 4000 (60% введения дейтерия), по меньшей мере 4500 (67,5% введения дейтерия), по меньшей мере 5000 (75% введения дейтерия), по меньшей мере 5500 (82,5% введения дейтерия), по меньшей мере 6000 (90% введения дейтерия), по меньшей мере 6333,3 (95% введения дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (97% введения дейтерия), по меньшей мере 6600 (99% введения дейтерия), или по меньшей мере 6633,3 (99,5% введения дейтерия).
Как применяют в данном документе, термин фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические средства, средства замедляющие всасывание, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственных средств, связующие, эксципиенты, дезинтеграторы, смазки, подсластители, ароматизаторы, красители и
- 17 043810
т.п. и их комбинации, как может быть известно специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Кроме случаев, когда какой-либо общепринятый носитель является несовместимым с активным ингредиентом, предполагается его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.
Термин терапевтически эффективное количество соединения настоящего изобретения относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ субъекта, например, снижение или ингибирование активности фермента или белка, или смягчение симптомов, облегчение состояний, замедление или задержка прогрессирования заболевания, или предотвращение заболевания и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления, термин терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое, когда его вводят субъекту, является эффективным, чтобы по меньшей мере частично облегчить, ингибировать, предотвратить и/или смягчить состояние или нарушение или заболевание, или по меньшей мере частично ингибировать активность целевого фермента или рецептора.
Как применяют в данном документе, термин ингибировать, ингибирование или ингибирующий относится к снижению или подавлению данного состояния, симптома, или нарушения, или заболевания, или существенному снижению исходной активности биологической активности или процесса.
Как применяют в данном документе, термин лечить, излечивание или лечение какого-либо заболевания или нарушения относится в одном варианте осуществления, к облегчению заболевания или расстройства (т.е. замедлению или отмены или снижению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В еще одном варианте осуществления лечить, излечивание или лечение относится к облегчению или снижению по меньшей мере одного физического параметра, включая те параметры, которые могут быть неразличимыми пациентом. В еще одном другом варианте осуществления, лечить, излечивание или лечение относится к модуляции заболевания или расстройства, либо физически, (например, стабилизации различимого симптома), физиологически, (например, стабилизации физического параметра), или обоим. В еще одном другом варианте осуществления, лечить, излечивание или лечение относится к профилактике или задержке наступления или развития или прогрессирования заболевания или расстройства.
Как применяют в данном документе, субъект является нуждающимся в лечении, если такой субъект смог бы получить благоприятный эффект биологически, медицински или в качестве жизни от такого лечения.
Как применяют в данном документе, термин единственного и множественного числа и аналогичные термины, используемые в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), следует рассматривать, как охватывающие как единственную, так и множественную форму, если в данном документе не указано иначе, или явно не противоречит по контексту.
Термин тиол-малеимид, как применяют в данном документе, описывает группу, образованную посредством реакции тиола с малеимидом, имеющим данную общую формулу
где Y и Z являются группами, подлежащими соединению через связь тиол-малеимид, и могут представлять собой линкерные блоки, и могут быть присоединены к антителам или полезным нагрузкам. В некоторых случаях, Y представляет собой сконструированное антитело согласно изобретению, и атом серы, показанный в формуле, берется от цистеина на одном из участков замены, описанных в данном документе; в то время как Z представляет линкерный блок, соединенный с полезной нагрузкой.
Линкерный Блок (LU), как применяют в данном документе, относится к ковалентному химическому связыванию между двумя фрагментами, такими как антитело и полезная нагрузка. Каждый LU может состоять из одного или более компонентов, описанных в данном документе как L1, L2, L3, L4, L5 и L6. Линкерный блок может быть выбран, чтобы предоставить подходящее расстояние между соединяемыми фрагментами, или обеспечить некоторые физико-химические свойства, или обеспечить расщепление линкерного блока при определенных условиях.
Расщепляемый, как применяют в данном документе, относится к линкеру или линкерному блоку (LU), который соединяет два фрагмента посредством ковалентных соединений, но разрушается с разрывом ковалентного соединения между фрагментами при физиологических условиях. Расщепление может быть ферментативным или неферментативным, но обычно высвобождает полезную нагрузку из антитела, без разрушения антитела.
Нерасщепляемый, как применяют в данном документе, относится к линкеру или линкерному блоку (LU), который не является подверженным к разрушению при физиологических условиях. В то время, как линкер может быть модифицирован физиологически, он сохраняет полезную нагрузку, соединенную с антителом, пока антитело не будет существенно разрушено, т.е. разрушение антитела предшествует расщеплению линкера in vivo.
Циклооктин, как применяют в данном документе, относится к 8-членному кольцу, содержащему
- 18 043810 углерод-углеродную тройную связь (ацетилен). Кольцо необязательно является конденсированным с одним или двумя фенильными кольцами, которые могут быть замещены 1-4 C1-4алкилом, C1-4алкокси, галогеном, гидроксилом, СООН, COOL1, -C(O)NH-L1, O-L1 или аналогичными группами, и, которые могут содержать N, О или S в качестве члена кольца. В предпочтительных вариантах осуществления, циклооктин может представлять собой С8 углеводородное кольцо, в частности изолированное кольцо, которое является насыщенным помимо тройной связи, и может быть замещенным F или Гидрокси, и может быть связано с линкером или LU через -O-, -С(О), C(O)NH или С(О)О.
Циклооктен, как применяют в данном документе, относится к 8-членному кольцу, содержащему по меньшей мере одну двойную связь, особенно транс-двойную связь. Кольцо необязательно является конденсированным с одним или двумя фенильными кольцами, которые могут быть замещены 1-4 C14алкилом, С1_4алкокси, галогеном, гидроксилом, СООН, COOL1, -C(O)NH-L1, O-L1 или аналогичными группами, и, которые могут содержать N, О или S в качестве члена кольца. В предпочтительных вариантах осуществления, циклооктен может представлять собой изолированное C8 углеводородное кольцо, которое является насыщенным помимо транс-двойной связи и необязательно является замещенным F или Гидрокси, и может быть связано с линкером или LU через -O-, -С(О), C(O)NH или С(О)О.
Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иначе, или явным образом не противоречит контексту. Применение любых и всех примеров, или иллюстративной лексики (например, такие как), предоставленных в данном документе, предназначено просто для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничение на объем притязаний изобретения, заявленного иным образом.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. График поверхностной доступности аминокислотных остатков в тяжелой цепи человеческих IgG1 (А) и каппа легкой цепи (В). Поверхностную доступность рассчитывают, используя Surface Racer 5.0 и выражают в квадратных Ангстремах [А2].
Фиг. 2. Расположение выбранных 92 TAG мутаций в структуре человеческого IgG1 с каппа легкой цепью. Выбранные остатки для TAG мутаций показаны черным цветом на только одной из двух тяжелых цепей и для одной из двух каппа легких цепей (IHZH.pdb). Структуры показаны с использованием PyMOL, пакета программ молекулярного моделирования из открытых источников (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0. Schrodinger. LLC).
Фиг. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей константных областей тяжелой цепи трастузумаб и антитела 14090. Остатки, прошедшие мутацию в Cys в антителе трастузумаб и в антителе 14090, подчеркнуты. Аминокислотные остатки в тяжелой цепи нумеруют посредством системы нумерации Eu (Edelman et al., 1969).
Фиг. 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей константных областей трастузумаб, человеческих IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Фиг. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей константных областей человеческих каппа и лямбда легких цепей. А. Остатки, прошедшие мутацию в Cys в каппа легкой цепи трастузумаб и лямбда легкой цепи антитела 14090 подчеркнуты. В. Остатки, выбранные для Cys мутаций, показаны на структурной модели PyMOL человеческой лямбда легкой цепи (Protein Structure Databank вход 3G6D.pdb).
Фиг. 6. Анализ трастузумаб Cys антител посредством невосстанавливающего SDS-PAGE.
Фиг. 7. Гель-фильтрация трастузумаб LC-S156C мутантного антитела (пунктирная линия) и дикого типа трастузумаб (сплошная линия).
Фиг. 8. Анализ дикого типа трастузумаб (А) и трастузумаб LC-E158C мутантного антитела (В) посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. (ОФ-ВЭЖХ).
Фиг. 9. МС анализ трастузумаб LC-R108C мутантного антитела после очистки от Белка А (интактная МС).
Фиг. 10. Структура MC-MMAF.
Фиг. 11. Анализ конъюгационных смесей трастузумаб Cys антител с MC-MMAF посредством ОФВЭЖХ. ОФ-ВЭЖХ следы конъюгационных смесей показаны пунктирными линиями. ОФ-ВЭЖХ следы немодифицированных антител показаны сплошными линиями. А. LC-R108C-MMAF, В. HC-360CMMAF, С. LC-S156C-MMAF и D. HC-S275C-MMAF ADC.
Фиг. 12. Анализ конъюгационных смесей трастузумаб Cys антител с MC-MMAF посредством ОФВЭЖХ. ОФ-ВЭЖХ следы конъюгационных смесей показаны пунктирными линиями. ОФ-ВЭЖХ следы немодифицированных антител показаны сплошными линиями. А. HC-S134C-MMAF и В. HC-S136CMMAF ADC.
Фиг. 13. Анализ трастузумаб Cys-MMAF ADC посредством аналитической гель-фильтрации (AnSEC). Трастузумаб НС-K290С-MMAF ADC (короткая пунктирная линия), трастузумаб LC-R142C-MMAF ADC (пунктирная линия), и трастузумаб LC-L154C-MMAF ADC (штриховая линия) сравнивают с немодифицированным дикого типа трастузумаб (сплошная линия).
Фиг. 14. Температурная кривая плавления немодифицированного дикого типа трастузумаб и трастузумаб НС-T335C-MMAF, трастузумаб HC-S337C-MMAF и трастузумаб НС-КЗбОС-MMAF ADC.
- 19 043810
Фиг. 15. Аналитические тесты на пролиферацию клеток для трастузумаб LC-S159C-MMAF с клетками А. НСС1954, В. MDA-MB231 клона 16 и С. MDA-MB231 клона 40.
Фиг. 16. IC50 трастузумаб Cys-MMAF ADC в аналитическом тесте на пролиферацию клеток MDAMB231 клона 16.
Фиг. 17. Аналитические тесты на пролиферацию клеток для Антитело 14090 HC-S375C-MMAF ADC с клетками А. CMK11-5 и В. лейкемическими Т-лимфоцитами человека.
Фиг. 18. Фармакокинетическое исследование трастузумаб LC-Cys-MMAF ADC, не проявляющего существенной потери лекарственного средства. А. Дикого типа неконъюгированное трастузумаб, В. LCK107C-MMAF, С. LC-R108C-MMAF, D. LC-L154C-MMAF, и Е. LC-S159C-MMAF ADC.
Фиг. 19. Фармакокинетическое исследование трастузумаб НС-Cys-MMAF ADC, не проявляющего существенной потери лекарственного средства. A. HC-K121C-MMAD, В. HC-L174C-MMAF, С. HCE258C-MMAF, и D. HC-R292C-MMAF ADC.
Фиг. 20. Фармакокинетическое исследование трастузумаб Cys-MMAF ADC, проявляющего существенную потерю лекарственного средства. A. LC-T129C-MMAF, В. LC-E143C-MMAF, С. НС-К246СMMAF, и D. HC-R344C-MMAF ADC.
Фиг. 21. Фармакокинетическое исследование двух трастузумаб Cys-MMAF ADC, проявляющих быстрое выведение in vivo. A. HC-T335C-MMAF и В. HC-S337C-MMAF ADC.
Фиг. 22. Исследования эффективности действия in vivo трастузумаб Cys-MMAF ADC на модели мышиного ксенотрансплантанта MDA-MB231 клона 16.
Фиг. 23: Значения времени удерживания трастузумаб Pcl MMAF DAR 2 ADC, измеренного посредством Хроматографии с гидрофобным взаимодействием. ABA-MMAF присоединяется по Pcl остатку, замененному на указанный НС или LC остаток. А) НС конъюгированный ADC. В) LC конъюгированный ADC. Указано время удерживания неконъюгированного антитела дикого типа (WT).
Фиг. 24. Расположение выбранных участков полезной нагрузки в структуре человеческого IgG1 с каппа легкой цепью. Выбранные остатки показаны черным цветом на только одной из двух тяжелых цепей и для одной из двух каппа легких цепей (1HZH.pdb). Три вращения структуры показаны с использованием PyMOL, программного пакета для молекулярного моделирования из открытых источников (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0. Schrodinger, LLC).
Фиг. 25. Фармакокинетическое исследование трастузумаб и антитела 14090 Cys-MMAF ADC с DAR 4, 6 и 8, полученного с антителами с 2, 3 или 4 Cys мутациями. DAR 4 трастузумаб ADC: HC-E258C-LCS159C-MMAF (А), HC-S375C-LC-S159C-MMAF (В), НС-E258C-LC-E165C-MMAF (С), HC-S375C-LCE165C-MMAF (D), НС-Е152С-LC-R142C-MMAF (Е), HC-P171C-LC-R142C-MMAF, и HC-E152C-LCS159C-MMAF (G); DAR 4 антитело 14090 ADC:HC-S375C-LC-A143C-MMAF (Н), HC-K360C-LC-V159CMMAF (I), и HC-S375C-LC-V159C-MMAF (J); K. DAR 6 трастузумаб ADC HC-K334C-S375C-LC-E165CMMAF и НС-K334С-K392C-LC-E165C-MMAF; L. DAR 8 трастузумаб ADC HC-K334C-K360C-S375CLC-E165C-MMAF, HC-K334C-K360C-K392C-LC-E165C-MMAF и НС-K334C-S375C-K392C-LC-E165CMMAF. Антитело 14090 является мышиным кросс-реактивным, и следовательно, выводится более быстро, чем трастузумаб ADC, которое не связывается с какими-либо мышиными антигенами.
Подробное описание
Настоящее изобретение предоставляет способы сайт-специфичного мечения антител или фрагментов антител посредством замены одной или более аминокислот исходных антитела или фрагмента антитела в специфичных положениях на цистеиновые аминокислоты (Cys), таким образом, что сконструированные антитела или фрагменты антител способны к конъюгации с различными средствами (например, цитотоксическими средствами). Настоящее изобретение также предоставляет иммуноконъюгаты, которые получают посредством применения способов, описанных в данном документе.
Когда цистеин встраивают в конструкцию исходных антитела или фрагмента антитела, модифицированное антитело или фрагмент антитела извлекают первыми из среды экспрессии с цистеином или глутатионом (GSH), присоединенными на сконструированных цистеиновых участке (участках) через дисульфидную связь (Chen et al. (2009) mAbs 16, 353-571). Присоединенные цистеин или GSH затем удаляют на стадии восстановления, на которой также восстанавливаются все нативные межцепочечные дисульфидные связи исходных антитела или фрагмента антитела. На второй стадии эти дисульфидные связи повторно окисляются перед тем, как происходит конъюгация. Настоящее раскрытие показывает, что, когда цистеин встраивают на определенных участках, стадия повторного окисления не протекает надлежащим образом, предположительно вследствие образования некорректных дисульфидных связей. Соответствующим образом, настоящее изобретение предоставляет уникальные наборы участков в константной области тяжелой цепи антитела и константной области легкой цепи антитела, соответственно, где Cys-замена, как описано в данном документе, производит модифицированные антитела или фрагменты антител, которые участвуют надлежащим образом в процессе повторного окисления, а также приводит к получению стабильных и нормально функционирующих иммуноконъюгатов.
Сайт-специфичное мечение антитела, в соответствии с настоящим изобретением может достигаться с использованием разнообразных химически доступных реагентов для мечения, таких как средства против злокачественных новообразований, флуорофоры, пептиды, сахара, детергенты, полиэтиленгликоли,
- 20 043810 средства, потенцирующие иммунную систему, зонды для визуализации с использованием радиоактивных изотопов, пролекарства и другие молекулы.
Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способы получения гомогенных иммуноконъюгатов с определенным отношением лекарственное средство-к-антителу для применения в терапии злокачественных новообразований и других показаний, а также в качестве реагентов для визуализации. Настоящее изобретение также предоставляет иммуноконъюгаты, полученные таким образом, а также фармацевтические композиции, содержащие эти иммуноконъюгаты. Способы настоящего изобретения могут применяться в комбинации с другими способами конъюгации, известными в данной области.
Следующие нумерованные варианты осуществления представляют некоторые аспекты и вариации изобретения:
где Ab представляет антитело или фрагмент антитела, содержащие по меньшей мере один остаток цистеина на одном из предпочтительных участков замены на цистеин, выбранном из описанных в данном документе;
LU представляет собой Линкерный Блок, как описано в данном документе;
X представляет собой полезную нагрузку или фрагмент лекарственного средства; и n является целым числом от 1 до 16.
В этих вариантах осуществления, n предпочтительно представляет собой приблизительно 2, приблизительно 4, приблизительно 6, или приблизительно 8. LU представляет собой обычно группу формулы -L1-L2-L3-L4-L5-L6-, где L1, L2, L3, L4, L5 и L6 независимо выбирают из -A1-, -А1Х2- и -X2-; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(СН2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)m-, -(O(C(R4)2)n)m-, -((CH2)nO)ra-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-> -NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-,
- C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-> -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-,
- (C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-,
- (CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8,
- 21 043810
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, €1-4алкила, фенила или С1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1-4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и €1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, €1-4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
- 22 043810
R8 независимо выбирают из
R9 независимо выбирают из Н и С1-6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В нескольких из этих вариантов осуществления, иммуноконъюгат содержит группу формулы О L2-L3-L4-L5-L6-X
. S о 1-сн2
L2-L3-L4-L5-L6-X или
-^-СН2 Q
НА НВ ' где атом серы представляет собой серу остатка цистеина в модифицированном антителе или фрагменте антитела и расположен на одном из участков замены идентифицированных в данном документе.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления, участок замены на цистеин может занимать положение, которое соответствует одному из участков, идентифицированных посредством номера положения, даже несмотря на то, что положение участка в последовательности было изменено посредством модификации или усечения непроцессированного антитела. Соответствующие участки могут быть легко идентифицированы посредством выравнивания антитела или фрагмента с непроцессированным антителом.
1. Сайт-специфичные антитела со встроенным цистеином.
Сайт-специфичное мечение.
Антитела (например, исходное антитело, необязательно содержащее одну или более неканонических аминокислот) настоящего изобретение нумеруют в соответствии с системой нумерации EU, как приведено в Edelman et al. (1969) Proc. Natl. Acad. USA 63:78-85, за исключением того, что лямбда легкую цепь нумеруют в соответствии с системой нумерации Кабат, как приведено в Kabat et al. (1991) Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242. Константную область человеческого IgG1 применяют в качестве представительной на протяжении всей заявки. Однако, изобретение не ограничено человеческим IgG1;
соответствующие положения аминокислот могут быть легко выведены посредством выравнивания последовательностей. Например, фиг. 4 показывает выравнивание последовательностей константных областей тяжелой цепи человеческих IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, таким образом, что идентифицированный участок для встраивания Cys в константной области IgG1 может быть легко идентифицирован для IgG2, IgG3, и IgG4 как показано на фиг. 4. Для константной области легкой цепи, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 являются одинаковыми. В табл. 1 ниже приведены положения аминокислот в константной области тяжелой цепи антитела, которые могут быть заменены на цистеин. В табл. 2 приведены положения аминокислот в константной области каппа легкой цепи антитела, которые могут быть заменены на цистеин. В табл. 3 приведены положения аминокислот в константной области лямбда легкой цепи антитела, которые могут быть заменены на цистеин.
- 23 043810
Таблица 1
Идентифицированные участки для замены на цистеин в константной области тяжелой цепи человеческого IgG1 (Участки пронумерованы в соответствии с системой нумерации EU)
EU номер Остаток Поверхностная доступность [A2 ] Выбранный НС Cys SEQ ID NO.
117 SER 128,0 HC-S117C 2
119 SER 79, 1 HC-S119C 3
121 LYS 135, 9 HC-K121C 4
124 SER 40,2 HC-S124C 5
132 SER 34,4 HC-S132C 6
134 SER 123,3 HC-S134C 7
136 SER 182,9 HC-S136C 8
139 THR 32,9 HC-T139C 9
152 GLU 52,1 HC-E152C 10
153 PRO 89, 1 HC-P153C 11
155 THR 69, 0 HC-T155C 12
157 SER 39, 0 HC-S157C 13
164 THR 125, 4 HC-T164C 14
165 SER 183,2 HC-S165C 15
169 THR 60, 0 HC-T169C 16
171 PRO 33,3 HC-P171C 17
174 LEU 68,1 HC-L174C 18
176 SER 161,9 HC-S176C 19
177 SER 68,1 HC-S177C 20
189 PRO 86, 4 HC-P189C 21
191 SER 126, 8 HC-S191C 22
195 THR 111,3 HC-T195C 23
197 THR 89, 8 HC-T197C 24
205 LYS 217,1 HC-K205C 25
207 SER 50, 0 HC-S207C 26
212 ASP 97,0 HC-D212C 27
246 LYS 55, 1 HC-K246C 28
258 GLU 42,1 HC-E258C 29
269 GLU 189, 2 HC-E269C 30
274 LYS 137,8 HC-K274C 31
286 ASN 119, 4 HC-N286C 32
288 LYS 181,8 HC-K288C 33
290 LYS 177,0 HC-K290C 34
292 ARG 251,5 HC-R292C 35
293 GLU 83,3 HC-E293C 36
294 GLN 73,5 HC-E294C 37
320 LYS 55, 0 HC-K320C 38
322 LYS 78,3 HC-K322C 39
326 LYS 212,7 HC-K326C 40
330 ALA 96, 3 HC-A330C 41
333 GLU 84,7 НС-ЕЗЗЗС 42
334 LYS 49, 6 НС-К334С 43
335 THR 70, 1 НС-Т335С 44
337 SER 15, 1 HC-S337C 45
344 ARG 98,2 HC-R344C 46
355 ARG 249, 4 HC-R355C 47
360 LYS 113, 9 НС-К360С 48
- 24 043810
362 GLN 40, 8 HC-Q362C 49
375 SER 28,9 HC-S375C 50
382 GLU 21,8 НС-Е382С 51
389 ASN 189, 5 HC-N389C 52
390 ASN 36, 4 HC-N390C 53
392 LYS 81,8 НС-К392С 54
393 THR 35, 8 НС-Т393С 55
398 LEU 110, 9 HC-L398C 56
400 SER 81,3 HC-S400C 57
413 ASP 79, 6 HC-D413C 58
415 SER 69, 0 HC-S415C 59
422 VAL 80, 8 HC-V422C 60
Таблица 2
Идентифицированные участки для замены на цистеин в каппа легкой цепи константной области человеческого IgG1 (Участки пронумерованы в соответствии с системой нумерации EU)
EU номер Остаток Поверхностная доступность [A2] Выбранный НС Cys SEQ ID NO.
107 LYS 90 LC-K107C 61
108 ARG 49 LC-R108C 62
109 THR 148 LC-T109C 63
112 ALA 50 LC-A112C 64
114 SER 39 LC-S114C 65
122 ASP 90 LC-D122C 66
123 GLU 51 LC-E123C 67
129 THR 41 LC-T129C 68
142 ARG 55 LC-R142C 69
143 GLU 117 LC-E143C 70
145 LYS 160 LC-K145C 71
152 ASN 157 LC-N152C 72
154 LEU 117 LC-L154C 73
156 SER 122 LC-S156C 74
159 SER 22 LC-S159C 75
161 GLU 66 LC-E161C 76
165 GLU 74 LC-E165C 77
168 SER 170 LC-S168C 78
169 LYS 241 LC-K169C 79
170 ASP 48 LC-D170C 80
182 SER 59 LC-S182C 81
183 LYS 131 LC-K183C 82
188 LYS 201 LC-K188C 83
190 LYS 167 LC-K190C 84
191 VAL 58 LC-V191C 85
197 THR 38 LC-T197C 86
199 GLN 127 LC-Q199C 87
203 SER 110 LC-S203C 88
206 THR 70 LC-T206C 89
- 25 043810
Таблица 3
Идентифицированные участки для замены на цистеин в лямбда легкой цепи человеческого IgG1
Кабат номер Остаток Поверхностная доступность [A2] Выбранный НС Cys SEQ ID NO.
143 ALA 82 LC-A143C 92
145 THR 106 LC-T145C 93
147 ALA 14 LC-A147C 94
156 LYS 233 LC-K156C 95
159 VAL 28 LC-V159C 96
163 THR 157 LC-T163C 97
168 SER 166 LC-S168C 98
Вследствие высокой гомологии последовательности константных областей антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, открытия изобретения не ограничиваются какими-либо конкретными антителами или фрагментами антител.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгаты, содержащие модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит замену одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) аминокислот в их константной области тяжелой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 1. В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 334, 360, 375 и 392 тяжелой цепи. Например, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену двух аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 121 и 124, 121 и 152, 121 и 171, 121 и 174, 121 и 258, 121 и 292, 121 и 333, 121 и 334, 121 и 360, 121 и 375, 121 и 392, 124 и 152, 124 и 171, 124 и 174, 124 и 258, 124 и 292, 124 и 333, 124 и 334,124 и 360,124 и 375, 124 и 392,152 и 171, 152 и 174, 152 и 258, 152 и 292, 152 и 333, 152 и 334, 152 и 360, 152 и 375, 152 и 392, 171 и 174, 171 и 258, 171 и 292, 171 и 333, 171 и 360,171 и 375,174 и 258, 174 и 292,174 и 333,174 и 334, 174 и 360, 174 и 375, 174 и 392, 258 и 292, 258 и 333, 258 и 334,258 и 360, 258 и 375,258 и 392,292 и 333, 292 и 334, 292 и 360, 292 и 375, 292 и 392, 333 и 334, 333 и 360, 333 и 375, 333 и 392;334 и 360,334 и 375, 334 и 392, 360 и 375, 360 и 392 или 375 и 392 тяжелой цепи.
В еще одном варианте осуществления, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену трех аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 121, 124 и 152; 121, 124 и 171; 121, 124 и 174; 121, 124 и 258; 121, 124 и 292; 121, 124 и 333; 121, 124 и 334; 121, 124 и 360; 121, 124 и 375; 121, 124 и 392; 121, 152 и 171; 121, 152 и 174; 121, 152 и 258; 121, 152 и 292; 121, 152 и 333; 121, 152 и 334; 121, 152 и 360; 121, 152 и 375; 121, 152 и 392; 121, 171 и 174; 121, 171 и 258; 121, 171 и 292; 121, 171 и 333; 121, 171 и 334;121, 171 и 360; 121, 171 и 375; 121, 171 и 392; 121, 174 и 258, 121, 174 и 292; 121, 174 и 333; 121, 174 и 334;121, 174 и 360; 121, 174 и 375; 121, 174 и 392; 121, 258 и 292; 121, 258 и 333; 121, 258 и 334; 121, 258 и 360; 121, 258 и 375;121, 258 и 392;121, 292 и 333;121, 292 и 334;121, 292 и 360;121, 292 и 375;121, 292 и 392; 121, 333 и 334;121, 333 и 360;121, 333 и 375; 121, 333 и 392;121, 334 и 360;121, 334 и 375;121, 334 и 392;121, 360 и 375;121, 360 и 392; 121, 375 и 392;124, 152 и 171;124, 152 и 174;124, 152 и 258;124,152 и 292; 124, 152 и 333; 124, 152 и 334; 124, 152 и 360; 124, 152 и 375; 124, 152 и 392; 124, 171 и 174; 124, 171 и 258; 124, 171 и 292; 124, 171 и 333; 124, 171 и 334; 124, 171 и 360; 124, 171 и 375; 124, 171 и 392; 124, 174 и 258; 124, 174 и 292; 124, 174 и 333; 124, 174 и 334; 124, 174 и 360; 124, 174 и 375; 124, 174 и 392; 124, 258 и 292; 124, 258 и 333; 124, 258 и 334; 124, 258 и 360; 124, 258 и 375; 124, 258 и 392;124, 292 и 333; 124, 292 и 334;124, 292 и 360;124, 292 и 375;124, 292 и 392;124, 333 и 360;124, 333 и 334; 124, 333 и 375;124, 333 и 392;124, 334 и 360;124, 334 и 375;124, 334 и 392;124, 360 и 375;124, 360 и 392; 124, 375 и 392; 152, 171 и 174; 152, 171 и 258; 152, 171 и 292; 152, 171 и 333; 152, 171 и 334; 152, 171 и 360;152, 171 и 375;152, 171 и 392; 152, 174 и 258; 152, 174 и 292; 152, 174 и 333; 152, 174 и 334; 152, 174 и 360; 152, 174 и 375; 152, 174 и 392; 152, 258 и 292; 152, 258 и 333; 152, 258 и 334; 152, 258 и 360; 152, 258 и 375;152, 258 и 392;152, 292 и 333;152, 292 и 334;152, 292 и 360;152, 292 и 375;152, 292 и 392; 152, 333 и 334;152, 333 и 360;152, 333 и 375;152, 333 и 392;152, 334 и 360;152, 334 и 375;152, 334 и 392; 152, 360 и 375; 152, 360 и 392; 152, 375 и 392; 171, 174 и 258; 171, 174 и 292;171, 174 и 333;171,174 и 334; 171, 174 и 360; 171, 174 и 375; 171, 174 и 392; 171, 258 и 292; 171, 258 и 292; 171, 258 и 333; 171, 258 и 334;171, 258 и 360;171, 258 и 375;171, 258 и 392;171, 292 и 333;171, 292 и 334;171, 292 и 360;
- 26 043810
171, 292 и 375; 171, 292 и 392; 171, 333 и 334; 171, 333 и 360; 171, 333 и 375; 171, 333 и 392; 171, 334 и 360; 171, 334 и 392; 171, 360 и 375; 171, 360 и 392; 171, 375 и 392; 174, 258 и 292; 174, 258 и 333; 174, 258 и 334; 174, 258 и 360; 174, 258 и 375; 174, 258 и 392; 174, 292 и 333; 174, 292 и 334; 174, 292 и 360; 174, 292 и 375; 174, 292 и 392; 174, 333 и 334; 174, 333 и 360; 174, 333 и 375; 174, 333 и 392; 174, 334 и 360; 174, 334 и 375; 174, 334 и 392; 174, 360 и 375; 174, 360 и 392; 174, 375 и 392; 258, 292 и 333; 258, 292 и 334; 258, 292 и 360; 258, 292 и 375; 258, 292 и 392; 258, 333 и 360; 258, 333 и 375; 258, 333 и 392; 258, 334 и 360; 258, 334 и 375; 258, 334 и 392; 258, 360 и 375; 258, 360 и 392; 258, 375 и 392; 292, 333 и 334; 292, 333 и 360; 292, 333 и 375; 292, 333 и 392; 292, 334 и 360; 292, 334 и 375; 292, 334 и 392; 292, 360 и 375; 292, 360 и 392; 292, 375 и 392; 333, 334 и 360; 333, 334 и 375; 333, 334 и 392; 333, 360 и 375, 333, 360 и 392; 333, 375 и 392; 334, 360 и 375; 334, 360 и 392; или 360, 375 и 392 тяжелой цепи.
В варианте осуществления, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену четырех аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 152, 333, 375 и 392; или 152, 334, 375 и 392 тяжелой цепи.
В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит SEQ ID NO: 2, 3, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 25, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 38, 39, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 51, 53, 54, 56, 57 или 60. В еще одном конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит SEQ ID NO: 6, 7, 8, 15, 19, 20, 22, 23, 24, 27, 36, 37, 41, 49, 52, 55, 58 или 59.
В еще одном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгаты, содержащие модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит замену одной или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) в их константной области легкой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 2. В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165 легкой цепи, где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека. Например, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену двух аминокислот на цистеин в его константной области, выбранных из положений 107 и 108; 107 и 142; 107 и 145; 107 и 159; 107 и 161; 107 и 165; 108 и 142; 108 и 145; 108 и 159; 108 и 161; 108 и 165; 142 и 145; 142 и 159; 142 и 161; 142 и 165; 145 и 159; 145 и 161; 145 и 165; 159 и 161; 159 и 165; 161 и 165 легкой цепи, где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека. В еще одном варианте осуществления, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену трех аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 107, 108 и 142; 107, 108 и 145; 107, 108 и 159; 107, 108 и 161; 107, 108 и 165; 107, 142 и 145; 107, 142 и 159;
107, 142 и 161; 107, 142 и 165; 107, 145 и 159; 107, 145 и 161; 107, 145 и 165; 107, 159 и 161; 107, 159 и
165; 107, 161 и 165; 108, 142 и 145; 108, 142 и 159; 108, 142 и 161; 108, 142 и 165; 108, 145 и 159; 108, 145 и 161; 108, 145 и 165; 108, 159 и 161; 108, 159 и 165; 108, 161 и 165; 142, 145 и 159; 142, 145 и 161; 142,
145 и 165; 142, 159 и 161; 142, 159 и 165; 142, 161 и 165; 145, 159 и 161; 145, 159 и 165; 145, 161 и 165;
или 159, 161 и 165 легкой цепи, где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека.
В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит SEQ ID NO: 63, 65, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 86, 87 или 88. В еще одном конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит SEQ ID NO: 64, 66, 67, 84, 85 или 89, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 или 89.
В еще одном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгаты, содержащие модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит замену одной или более аминокислот в их константной области легкой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 3. В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент ле
- 27 043810 карственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену одной или более аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 143, 147, 159, 163 и 168 легкой цепи, где указанные положения легкой цепи нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека. Например, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену двух аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 143 и 147; 143 и 159; 143 и 163; 143 и 168; 147 и 159; 147 и 163; 147 и 168; 159 и 163; 159 и 168; или 163 и 168 легкой цепи, где указанные положения легкой цепи нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека. В еще одном варианте осуществления, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированное антитело или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену трех аминокислот на цистеин в их константной области, выбранных из положений 143, 147 и 159; 143, 147 и 163; 143, 147 и 168; 143, 159 и 163; 143, 159 и 168; 143, 163 и 168; 147, 159 и 163; 147, 159 и 168; 147, 163 и 168; или 159, 163 и 168 легкой цепи, где указанные положения легкой цепи нумеруют в соответствии с системой Кабат, и где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека.
В варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит SEQ ID NO: 92, 94, 96, 97 или 98. В еще одном конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит SEQ ID NO: 93 или 95.
В варианте осуществления, иммуноконъюгат может иметь DAR, равный приблизительно 2 или приблизительно 4. В варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгаты, содержащие модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит Cys-замену одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) аминокислот в их константной области тяжелой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 1, и Cys-замену одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) аминокислот в их константной области легкой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 2 или табл. 3. В одном варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгаты, содержащие модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит Cys-замену одной или более аминокислот в их константной области тяжелой цепи, выбранных из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 334, 360, 375 и 392; и Cys-замену одной или более аминокислот в их константной области легкой цепи, выбранных из положений 107, 108, 142, 145, 159, 161 и 165, где указанная легкая цепь представляет собой каппа легкую цепь человека. В варианте осуществления, модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении
- 28 043810
165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cysзамену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи;
- 29 043810 или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 107 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 108 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 142 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 145 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 161 человеческой каппа легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи. В варианте осуществления, модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержит Cysзамену в положении 375 и в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи. В варианте осуществления модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать Cys-замену в положении 334 и в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи. В еще одном примере, модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать Cys-замену в положении 334 и в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи. В варианте осуществления, иммуноконъюгаты этих комбинаций могут иметь DAR, равный приблизительно 4 или приблизительно 6.
В варианте осуществления, модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать Cys-замену в положении 334, в положении 375 и в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи. В варианте осуществления, модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать Cys-замену в положении 333, в положении 375 и в положении 392 тяжелой цепи, и Cysзамену в положении 165 человеческой каппа легкой цепи. В варианте осуществления, эти комбинации могут иметь DAR, равный приблизительно 4, 6 или 8.
В варианте осуществления, настоящее изобретение предоставляет иммуноконъюгаты, содержащие модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит Cys-замену одной или более аминокислот в их константной области тяжелой цепи, выбранных из положений 121, 124, 152, 171, 174, 258, 292, 333, 334, 360, 375 и 392; и Cys-замену одной или более аминокислот в их константной области легкой цепи, выбранных из положений 143, 147, 159, 163, и 168, где указанная легкая цепь представляет собой лямбда легкую цепь человека. Например, модифицированное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cysзамену в положении 121 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 124 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cysзамену в положении 152 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 171 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cysзамену в положении 174 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 че
- 30 043810 ловеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 258 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cysзамену в положении 292 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 333 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cysзамену в положении 334 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 360 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cysзамену в положении 375 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 143 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 147 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 159 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 163 человеческой лямбда легкой цепи; или Cys-замену в положении 392 тяжелой цепи, и Cys-замену в положении 168 человеческой лямбда легкой цепи.
В варианте осуществления изобретения, аминокислотная замена, описанная в данном документе, представляет собой цистеин, содержащий тиольную группу. В нескольких аспектах изобретения, тиольную группу используют для химической конъюгации, и ее присоединяют к линкерному блоку (LU) и/или фрагменту лекарственного средства. В нескольких вариантах осуществления, иммуноконъюгаты изобретения содержат фрагмент лекарственного средства, выбранный из группы, состоящей из ингибитора VАТФазы, ингибитора HSP90, ингибитора IAP, ингибитора mTor, стабилизатора микротрубочек, дестабилизаторов микротрубочек, ауристатина, доластатина, майтансиноида, MetAP (метионинаминопептидазы), ингибитора ядерного экспорта белков CRM1, ингибитора DPPIV, ингибиторов протеасом, ингибиторов реакций переноса фосфорила в митохондриях, ингибитора синтеза белка, ингибитора киназы, ингибитора CDK2, ингибитора CDK9, ингибитора кинезин, ингибитора HDAC, средства, повреждающего ДНК, ДНК-алкилирующего средства, интеркалятора ДНК, связующего малой бороздки ДНК и ингибитора DHFR. В нескольких вариантах осуществления, иммуноконъюгаты изобретения содержат фрагмент лекарственного средства, который представляет собой средство против злокачественных новообразований. Модифицированное антитело или фрагменты антитела настоящего изобретения могут иметь любые форматы, известные в данной области, такие как моноклональное, химерное, гуманизированное, полностью человеческое, биспецифичное или мультиспецифичное антитело или фрагмент этого антитела.
В соответствии с настоящим изобретением, тяжелая цепь и/или легкая цепь модифицированного антитела (или фрагмента этого антитела) может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более замены на цистеин в их константных областях. В одном варианте осуществления, модифицированные антитела или фрагменты антител содержат 2, 4, 6, 8 или более замен на цистеин в их константных областях. В нескольких вариантах осуществления, модифицированное антитело, фрагмент антитела или их иммуноконъюгат содержит 2 или 4 Cys-замены.
В одном варианте осуществления, исходное антитело (антитело без замены на цистеин) представляет собой антитело IgG, IgM, IgE или IgA. В конкретном варианте осуществления, исходное антитело антитело IgG1. В еще одном конкретном варианте осуществления, исходное антитело представляет собой антитело IgG2, IgG3 или IgG4.
- 31 043810
Настоящее изобретение также предоставляет модифицированные антитела или фрагменты этих антител, содержащие замену одной или более аминокислот в их константной области тяжелой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 1. В нескольких вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет модифицированные антитела или фрагменты этих антител, содержащие замену одной или более аминокислот в их константной области легкой цепи, выбранных из положений, идентифицированных в табл. 2 или табл. 3.
В некоторых вариантах осуществления, модифицированные антитела или фрагменты антител, предоставленные в данном документе, метят, применяя способы изобретения в комбинации с другими способами конъюгации, известными в данной области, включающими, но не ограниченные перечисленным, химиоселективную конъюгацию через лизин, гистидин, тирозин, формил-глицин, пирролизин, пирролин-карбокси-лизин, неприродные аминокислоты, и белковые метки для фермент-опосредованной конъюгации (например, метки S6).
2. Химия конъюгации
Конъюгированное антитело или фрагмент этого антитела, предоставленные в данном документе, получают посредством посттрансляционной модификации по меньшей мере одного остатка цистеина, который был включен в антитело или фрагмент этого антитела, как описано выше, посредством сайтспецифичных способов введения метки. Конъюгированное антитело или фрагмент антитела могут быть получены посредством способов, известных в данной области для конъюгации полезной нагрузки, представляющей интерес с остатками цистеина, которые встречаются в белках в природе, и посредством способов, описанных для конъюгации с белками, сконструированными, чтобы содержать дополнительный остаток цистеина, заменяющий еще одну аминокислоту природной последовательности белка.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитела или фрагмент этих антител, предоставленные в данном документе, конъюгируют, применяя известные способы, где введенный цистеин (cys) конъюгируют с малеимидным производным, как на Схеме Ia ниже. Модифицированные антитела изобретения, которые проходят через данный тип конъюгации, содержат связь тиол-малеимид.
Схема Ia
Конъюгация через образование тиол-малеимидного аддукта где LU представляет собой Линкерный Блок (LU), и X представляет собой полезную нагрузку или фрагмент лекарственного средства.
В других вариантах осуществления, Cys введенный в модифицированные антитела или фрагмент антитела конъюгируют посредством реакции с альфа-галогенкарбонильным соединением, таким как хлор-, бром- или йод-ацетамид, как показано на Схеме Ib ниже. Понимают, что другие уходящие группы, помимо галогена, такие как тозилат, трифлат и другие алкил- или арилсульфонаты, могут применяться в качестве уходящей группы Y. В то время как Схема Ib отображает реакцию Cys тиола с альфагалогенацетамидом, способ включает любое алкилирование серы введенного Cys с группой Формулы YCHR-C(=O)-, где R представляет собой Н или C1-4алкил, Y представляет собой уходящую группу (обычно Cl, Br или I, и необязательно алкилсульфонат или арилсульфонат); она не ограничена амидами.
Схема Ib
Конъюгация посредством реакции с альфа-галогенкарбонильным соединением
Y представляет собой уходящую группу (Cl, Br, I, OTs, OTf и т.п.); LU представляет собой линкерный блок;
X представляет собой полезную нагрузку или фрагмент лекарственного средства.
Альтернативно, Cys, введенный в модифицированные антитела или фрагмент антитела, может быть конъюгирован посредством реакции с внешним тиолом при условиях, которые индуцируют образование дисульфидной связи между внешним тиолом и атомом серы введенного остатка цистеина, как показано на Схеме Ic ниже. В этих примерах, R может представлять собой Н; однако, было обнаружено, что соединения, где одна или обе R группы представляют алкильную группу, например, Метил, увеличивают стабильность дисульфида.
- 32 043810
Схема Ic
Конъюгация посредством образования дисульфида
каждый R представляет независимо Н или С-|_4алкил;
LU представляет собой линкерный блок;
X представляет собой полезную нагрузку или фрагмент лекарственного средства.
Посредством лишь примера, такие пост-трансляционные модификации иллюстрируются на Схемах (Ia)-(Ic) выше, где исходная структура представляет цистеин, введенный в легкую цепь или тяжелую цепь антитела на одном из специфичных участков, идентифицированных в данном документе. Способы выполнения каждого из этих способов конъюгации являются хорошо известными в данной области. Антитело может быть модифицировано посредством этих методов в его легких цепях, или его тяжелых цепях или как в легких, так и тяжелых цепях. Антитело, в котором каждая легкая цепь или каждая тяжелая цепь были модифицированы, чтобы содержать одиночный введенный цистеин, будут обычно содержать два участка конъюгации, так как антитело обычно содержит две легких и две тяжелых цепи.
При конъюгации, модифицированные антитела изобретения обычно содержат 1-12, часто 2-8, и предпочтительно 2, 4 или 6 фрагментов -LU-X (Линкерный Блок-Полезная нагрузка). В нескольких вариантах осуществления, легкую или тяжелую цепь антитела модифицируют, чтобы ввести два новых остатка Cys на двух из специфичных участков, идентифицированных в данном документе для Cys-замен (или альтернативно один Cys вводят в легкую цепь и одну в тяжелую цепь), так, что тетрамерное антитело в конечном счете содержит четыре участка конъюгации.
Аналогично, антитело может быть модифицировано посредством замены 3 или 4 из его нативных аминокислот на Cys на специфичных участках, идентифицированных в данном документе, в легкой цепи или тяжелой цепи или их комбинации, что приводит в результате к 6 или 8 участкам конъюгации в тетрамерном антителе.
X в этих конъюгатах представляет полезную нагрузку, которая может представлять собой любой химический фрагмент, который является применимым для присоединения антитела. В нескольких вариантах осуществления, X представляет собой фрагмент лекарственного средства, выбранный из цитотоксина, средства против злокачественных новообразований, противовоспалительного средства, противогрибкового средства, антибактериального средства, противопаразитарного средства, противовирусного средства, потенциатора иммунной системы, и анестезирующего средства или любого другого терапевтического или биологически активного фрагмента или фрагмента лекарственного средства. В других вариантах осуществления, X представляет собой метку, такую как биофизический зонд, флуорофор, аффинный зонд, спектроскопический зонд, радиоактивный зонд, спиновую метку или квантовую точку. В других вариантах осуществления, X представляет собой химический фрагмент, который модифицирует физико-химические свойства антитела такую как липидную молекулу, полиэтиленгликоль, полимер, полисахарид, липосому или хелатор. В других вариантах осуществления, X представляет собой функциональную или обнаруживаемую биомолекулу, такую как нуклеиновая кислота, рибонуклеиновая кислота, белок, пептид (например, фермент или рецептор), сахар или полисахарид, антитело или фрагмент антитела. В других вариантах осуществления, X представляет собой фиксирующий фрагмент, такой как наночастица, частица PLGA, или поверхность, или любой связывающий фрагмент для специфичного связывания конъюгата с еще одним фрагментом, таким как гистидиновая метка, поли-G, биотин, авидин, стрептавидин, и т.п. В других вариантах осуществления, X представляет собой реакционноспособную функциональную группу, которая может применяться для присоединения конъюгата антитела к еще одному химическому фрагменту, такому как фрагмент лекарственного средства, метка, еще одно антитело, еще один химический фрагмент, или поверхность.
Линкерный Блок (LU) может представлять собой любой подходящий химический фрагмент, который ковалентно присоединяет тиол-реакционноспособную группу (например, малеимид, альфа-галоген карбонил, винилкарбонил (например, акрилат или акриламид), винилсульфон, винилпиридина или тиол) к полезной нагрузке. Многие подходящие LU являются известными в данной области. Например, LU может состоять из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или более шести линкеров, называемых в данном документе Lb L2, L3, L4, L5 и L6. В некоторых вариантах осуществления LU содержит линкер, выбранный из неферментативно расщепляемого линкера, нерасщепляемого линкера, ферментативно расщепляемого линкера, фото-стабильного линкера, фото-расщепляемого линкера или их любой комбинации, и LU необязательно содержит саморазрушающийся спэйсер.
В нескольких вариантах осуществления, LU представляет собой группу формулы -L1-L2-L3-L4- или -L1-L2-L3-L4-L5-L6-. Связывающие группы L1, L2, L3, L4, L5 и L6 для применения в LU включают алкиле
- 33 043810 новые группы -(СН2)П- (где n равно 1-20, обычно 1-10 или 1-6), блоки этиленгликоля (-СН2СН2О-)П (где n равно 1-20, обычно 1-10 или 1-6), амиды -C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-, сложные эфиры -C(=O)-O- или -OC(=O)-, кольца, имеющие две доступные точки присоединения, такие как дивалентный фенила, С3-8 циклоалкильные или С4-8 гетероциклильные группы, аминокислоты -NH-CHR*-C=O- или -C(=O)-CHR*-NH-, где R* представляет собой боковую цепь известной аминокислоты (часто одной из канонических аминокислот, но также включающей например, норвалин, норлейцин, гомосерин, гомоцистеин, фенилглицин, цитруллин, и другие названные альфа-аминокислоты), полипептиды из известных аминокислот (например, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды, и т.д.), связи тиол-малеимид (от добавления -SH к малеимиду), -S-CR2- и другие простые эфиры тиола, такие как -S-CR2-C (=O) - или -С (=O)-CR2-S-, где R такой, как определено выше для Схемы Ic, -CH2-C(=O)-, и дисульфиды (-S-S-), а также комбинации любых из перечисленных с другими линкерами, описанными ниже, например, связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер, фото-расщепляемый линкер или линкер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В нескольких вариантах осуществления, когда LU представляет собой -L1-L-L3-L4-L5-L6-, L1, L2, L3, L4, L5 и L6 могут быть выбраны из:
-Ai-, -А1Х2- и -X2—; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)„)m-, -(O(C(R4)2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-, -NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-,
-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -((/(RUJOiCJl'uJmNH^ -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-,
-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8,
- 34 043810
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, -С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила или C1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1.4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и C1.4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
- 35 043810
R9 независимо выбирают из Н и С1-6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В нескольких вариантах осуществления, по меньшей мере один из L1, L2, L3, L4, L5 и L6 представляет собой стабильный или нерасщепляемый, линкер. В нескольких вариантах осуществления, по меньшей мере один из L1, L2, L3, L4, L5 и L6 представляет собой расщепляемый линкер, который может быть химически расщепляемым (гидразоны, дисульфиды) или ферментативно расщепляемым. В нескольких вариантах осуществления, ферментативно расщепляемый линкер представляет собой линкер, легко расщепляемый пептидазой: Val-Cit линкер (валин-цитруллин), дипептид из двух известных аминокислот, является одним таким линкером. В других вариантах осуществления, ферментативно расщепляемый линкер представляет собой линкер, который приводится в действие активностью глюкуронидазы:
является примером такого линкера, который также содержит саморазрушающийся спэйсер, который разрушается самопроизвольно при физиологических условиях, как только глюкуронидаза расщепляет гликозидную связь.
В нескольких вариантах осуществления, иммуноконъюгат изобретения содержит модифицированный остаток цистеина Формулы IIA или IIB:
о zl2-l3-l4-l5-l6-x /N __ L2-L3-L4-L5-L6-X или / fl . / 4-сн2 Я
Гсн2 * 2 о
IIA IIB , где -CH2-S- представляет боковую цепь Cys, введенного на одном из выбранных участков Cysзамены, описанных в данном документе, и L2-L6 и X представляют связывающие группы и полезные нагрузки, соответственно, как дополнительно описано в данном документе. В нескольких вариантах осуществления IIA, L2 представляет собой связь. В нескольких вариантах осуществления IIB, L2 является NH или О. В нескольких вариантах осуществления обоих IIA и IIB, L3 выбирают из (CH2)1-10 и (СН2СН2О)1-6. L4, L5 и L6 представляют собой дополнительные необязательные линкеры, выбранные из линкеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления, L6 может представлять собой карбонил (С=О) или линкер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где:
L1 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L2 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L3 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер, и
L4 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер, фото-расщепляемый линкер или линкер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фотостабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
- 36 043810
L2 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L3 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер, и
L4 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер, фото-расщепляемый линкер или лин кер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В нескольких из вариантов осуществления LU по меньшей мере один из L1, L2, L3, L4, L5 и L6 представляет собой расщепляемый линкер, и LU считают расщепляемым. Аналогично, в нескольких из вариантов осуществления LU по меньшей мере один из L1, L2, L3, L4, L5 и L6 представляет собой нерасщепляемый линкер. В некоторых из этих вариантов осуществления, каждый линкер из LU является нерасщепляемым, и LU считается нерасщепляемым.
В нескольких из вышеприведенных вариантов осуществления, где LU представляет собой -L1-L2-L3L4-, по меньшей мере один из L1, L2, L3 и L4 представляет собой линкер, выбранный из
-A1-, -А1Х2- и -X2-; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(СН2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)m-, -(O(C(R4),)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH,)n-, -(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-,
- (CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-,
- NHC(=O)(C(R4)2)„-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)„S-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)„C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-,
- (C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8,
Ν Ν
- 37 043810
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, -С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, C1-4алкила, фенила или C1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, заме
- 38 043810 щенного -С(=О)ОН, C1.4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и С1.4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
R9 независимо выбирают из Н и C1-6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В этих вариантах осуществления, другие линкеры из LU независимо выбирают из связи, -A1-, -A1X2-, -X2-, неферментативно расщепляемого линкера, нерасщепляемого линкера, ферментативно расщепляемого линкера, фото-стабильного линкера, фото-расщепляемого линкера и линкера, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -A1X2- или -X2-; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(СН2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)m-, -(O(C(R4)2)„)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-,
-(CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-, -NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-,
-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8
- 39 043810
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, -С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, C1-4алкила, фенила или C1_4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
- 40 043810 каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1.4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и C1.4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, С1.4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9;
L2 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L3 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер, и
L4 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер, фото-расщепляемый линкер или линкер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления, L1 представляет собой C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-CH2CH2S-, так, что LU представляет собой -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-CH2CH2-S-L2-L3-L4-.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -А1Х2- или -X2-; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(СН2)n-, -(O(CH2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(О(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8
- 41 043810
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот,
-С(=О)ОН и -ОН,
- 42 043810 каждый R5 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила или С1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=С)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1-4алкокси, замещенного -С(=С)ОН и C1-4алкила, замещенного -С(=С)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, C1_4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
R9 независимо выбирают из Н и C1_6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9;
L2 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L3 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L4 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер, фото-расщепляемый линкер или линкер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -A1X2- или -X2-; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(СН2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -(O(CH2)n)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -NHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8
- 43 043810
- 44 043810
S-, -Si(OH)2O-
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, -С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила или С1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1-4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и О1-4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, C1-4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
R9 независимо выбирают из Н и C1-6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9;
L2 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер;
L3 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер или фото-расщепляемый линкер, и
L4 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер, нерасщепляемый линкер, ферментативно расщепляемый линкер, фото-стабильный линкер, фото-расщепляемый линкер или лин
- 45 043810 кер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -A1X2- или -X2-; где:
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(СН2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -(O(CH2)n)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -NHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
каждый Х2 независимо выбирают из связи, R8
- 46 043810
-S-, -Si(OH)2O-,
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- and -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, -С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, C1-4алкила, фенила или О1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1.4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и О1.4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, C1.4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
R9 независимо выбирают из Н и C1.6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9;
L2 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер;
L3 представляет собой связь, неферментативно расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер;
L4 представляет собой связь, ферментативно расщепляемый линкер или линкер, который содержит саморазрушающийся спэйсер.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -A1X2- или -X2-;
L2 представляет собой связь, -A2- или -A2X2-;
L3 представляет собой связь, -А3- или -А3Х2-;
- 47 043810
L4 представляет собой связь, -A4-, -А4Х2-,
Ai представляет собой -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)„-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)„)m-, -(O(C(R4)2)„)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-,
- (CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-,
- NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-,
- (C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-,
- (CH2)nNH( (CH2)nO)m(CH2)n-, -(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n—, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;
A2 представляет собой -C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)„-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)m-, -(O(C(R4)2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NR4-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-, -NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nS-, -(C(R4)2)nS, -S(CH2)n-, -S(C(R4)2)n-, -(CH2)nNH-, -(C(R4)2)nNH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,
- C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-,
- (CH2)n(O(CH2)n)mOC(=O)NH(CH2)n-, -(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(=O)NH(C(R4)2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-,
- (O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-,
A3 представляет собой -C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)„-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)m-, -(O(C(R4)2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-,
- 48 043810
- (CH2)„C(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-, -NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nS-, -(C(R4)2)nS-, -S(CH2)n-, -S(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,
- C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)„NHC(=O)(C(R4)2)n-,
- (CH2)n(O(CH2)n)mOC(=O)NH(CH2)n-, -(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(=O)NH(C(R4)2)n-, -(CH2)n(O(CH2)n)mOC(=O)-, (C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mC(=O)-, Д ( K'/llOI ( RVu.f ( O)-,
- (CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-,
- (O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-,
A4 представляет собой -C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)n-, -(O(CH,)n)m-, -(O(C(R4)2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((C(R4)2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -(C(R4)2)nC(=O)NH-, -(CH2)nNHC(=O)-, -(C(R4)2)nNHC(=O)-, -NHC(=O)(CH2)n-, -NHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -C(=O)NH(C(R4)2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -S(C(R4)2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)NH(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(C(R4)2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-,
- (C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(C(R4)2)nNHC(=O)(C(R4)2)n-,
-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- ИЛИ -(O(C(R4)2)n)mNHC(=O)(C(R4)2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8
- 49 043810
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, C1.4алкила, боковых цепей известных аминокислот, -С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, О1-4алкила, фенила или C1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1_4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и C1_4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
- 50 043810
R9 независимо выбирают из Н и С1-6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -A1X2- или -X2-;
L2 представляет собой связь, -А2- или -А2Х2-;
L3 представляет собой связь, -А3- или -А3Х2-;
L4 представляет собой связь, -А4-, -А4Х2-,
° или
A1 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(CH2)n-, -(O(CH2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -(CH)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
A2 представляет собой -C(=O)NH-, -(=O)NH(CH2)n-, -(O(CH2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-, -NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или
Аз представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(CH2)n-, -(O(CH2)n)m-, -((CHXOU -((CHXOUCHX-, -(CH2)nC(=O)NH-, -NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или
A4 -C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)n-, -(O(CH2)n)m-, -((CH2)nO)m-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)NH-,
-NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)nS-, -S(CH2)nC(=O)NH-,
-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)(CH2)n-, -(CH2)nC(=O)-, -(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи,
- 51 043810
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, S-, -Si(OH)2O-,
C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из
-С(=О)ОН и -ОН,
Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот, каждый R5 независимо выбирают из Н, C1_4алкила, фенила или C1_4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В некоторых вариантах осуществления Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где
L1 представляет собой связь, -A1-, -A1X2- или -X2-;
L2 представляет собой связь, -А2- или -А2Х2-;
L3 представляет собой связь, -А3- или -А3Х -;
L4 представляет собой связь, -А4-, -А4Х2-,
-C(=O)NH-,
A1 представляет собой
-C(=O)NH(CH2)n-,
-(CH2)nNHC(=O)-,
-((CH2)nO)m(CH2)n-, -NHC(=O)(CH2)n-,
-C(=O)NH(CH2)nS-, -(O(CH2)n)m-,
-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,
- (CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
A2 представляет собой -C(=O)NH-, -C(=O)NH(CH2)n-,
- ((CH2)nO)m(CH2)n-, -NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-,
- (CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или
-C(=O)NH(CH2)nS-, -(O(CH2)n)m-,
-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,
- 52 043810
A3 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(CH2)n-,
-((CH2)nO)m(CH2)n-, -NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-,
-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-, -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n- или
-C(=O)NH(CH2)nS-, -(O(CH2)n)m-,
-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,
A4 представляет собой -C(=O)NH-, -С(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)m(CH2)n-, -NHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)-,
-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n- или -(O(CH2)n)mNHC(=O)(CH2)n-;
каждый X2 независимо выбирают из связи, R8
-C(=O)NH(CH2)nS-, -(O(CH2)n)m-,
-C(=O)NH(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,
- 53 043810
, -CHR4(CH2)nC(=O)NH-, -CHR4(CH2)nNHC(=O)-, C(=O)NH- и -NHC(=O)-;
каждый R4 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, боковых цепей известных аминокислот,
-С(=О)ОН и -ОН, каждый R5 независимо выбирают из Н, C1-4алкила, фенила или C1-4алкила, замещенного 1-3 -ОН группами;
каждый R6 независимо выбирают из Н, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, C1-4алкокси, замещенного -С(=О)ОН и C1-4алкила, замещенного -С(=О)ОН;
R7 независимо выбирают из Н, С1-4алкила, фенила, пиримидина и пиридина;
R8 независимо выбирают из
R9 независимо выбирают из Н и C1-6галогеналкила;
каждое n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и каждое m независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В одном варианте осуществления, L1 представляет собой -(СН2)1-10-С(=О)-, например, -(СН2)5С(=О)-; и каждый из L2, L3 и L4 представляет связь.
В некоторых вариантах осуществления LU содержит val-cit линкер данной формулы, в которой X представляет полезную нагрузку, обычно фрагмент лекарственного средства, такой как фрагмент, имеющий активность против злокачественных новообразований:
- 54 043810
Когда L4-L5-L6 представляет собой val-cit линкер, как показано выше, L3 предпочтительно представляет собой -(СН2)2.6-С(=О)-.
В некоторых вариантах осуществления X группа представляет собой майтансиноид, такой как DM1 или DM4, или аналог или производное доластатина, такое как доластатин 10 или 15, и ауристатины MMAF или ММАЕ, или калихеамицин, такой как N-ацетил-γ-калихеамицин, или метка или краситель, такой как родамин или тетраметилродамин.
Как применяют в данном документе, линкер представляет собой любой химический фрагмент, который способен к соединению антитела или его фрагмента с X группой (полезной нагрузкой) для образования иммуноконъюгата. Линкеры могут быть подвержены расщеплению, такому как расщепление, индуцируемое кислотой, расщепление, индуцируемое светом, расщепление, индуцируемое пептидазой, расщепление индуцируемое эстеразой, и расщепление дисульфидной связи, при условиях, в которых соединение или антитело остается активным. Альтернативно, линкеры могут быть по существу резистентными к расщеплению. Линкер может включать или может не включать саморазрушающийся спэйсер.
Неограничивающие примеры неферментативно расщепляемых линкеров, как применяют в данном документе, чтобы конъюгировать X1 группу с модифицированными антителами или фрагментом этих антител, предоставленными в данном документе, включают кислотолабильные линкеры, линкеры, содержащие дисульфидный фрагмент, линкеры, содержащие триазольный фрагмент, линкеры, содержащие гидразоновый фрагмент, линкеры, содержащие тиоэфирный фрагмент, линкеры, содержащие диазо фрагмент, линкеры, содержащие оксимный фрагмент, линкеры, содержащие амидный фрагмент, и линкеры, содержащие ацетамидный фрагмент.
Неограничивающие примеры ферментативно расщепляемых линкеров, как применяют в данном документе, чтобы конъюгировать X группу с модифицированными антителами или фрагментами этих антител, предоставленными в данном документе, включают, но не ограничиваются перечисленным, линкеры, которые расщепляются протеазой, линкеры, которые расщепляются амидазой, и линкеры, которые расщепляются -глюкуронидазой или еще одной глюкозидазой.
В некоторых вариантах осуществления, такие расщепляемые ферментами линкеры представляют собой линкеры, которые расщепляются катепсином, включающим катепсин Z, катепсин В, катепсин Н и катепсин С. В некоторых вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер представляет собой дипептид, расщепляемый катепсином, включающий дипептиды, расщепляемые катепсином Z, катепсином В, катепсином Н или катепсином С. В некоторых вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер является катепсин В-расщепляемым пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер является катепсин В-расщепляемым дипептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления ферментативно расщепляемый дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин или фенилаланин-лизин. Другие неограничивающие примеры ферментативно расщепляемых линкеров, как применяют в данном документе, для конъюгации X группы с модифицированными антителами или фрагментами этих антител, предоставленными в данном документе, включают, но не ограничиваются перечисленным, линкеры, которые расщепляются глюкуронидазой, например,
См. Ducry et al, Bioconjugate Chem, (2010) vol. 21(1), 5-13.
Саморазрушающиеся спэйсеры представляют собой бифункциональные химические фрагменты, ковалентно связанные по одному концу с первым химическим фрагментом и по другому концу со вторым химическим фрагментом, образуя посредством этого стабильную молекулу из трех частей. Линкер может содержать саморазрушающийся спэйсер, связанный с третьим химическим фрагментом, который является отщепляемым от спэйсера либо химически или ферментативно. При расщеплении связи между саморазрушающимся спэйсером и первым химическим фрагментом или третьим химическим фрагмен
- 55 043810 том, саморазрушающиеся спэйсеры претерпевают быстрые и самопроизвольные внутримолекулярные реакции и, таким образом, отделяются от второго химического фрагмента. Эти внутримолекулярные реакции обычно включают в себя электронные перегруппировки, такие как реакции 1,4, или 1,6, или 1,8 элиминирования или циклизации с образованием в высокой степени преимущественных пяти- или шестичленных колец. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, первый или третий фрагмент представляет собой группу, расщепляемую ферментом, и это расщепление является результатом ферментативной реакции, в то время как в других вариантах осуществления первый или третий фрагмент является кислотолабильной группой, и это расщепление происходит вследствие изменения рН. В применении к настоящему изобретению, второй фрагмент представляет собой группу Полезной нагрузки, определенную в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления, отщепление первого или третьего фрагмента от саморазрушающегося спэйсера является результатом расщепления под действием протеолитического фермента, в то время как в других вариантах осуществления оно является результатом расщепления гидролазой. В некоторых вариантах осуществления, отщепление первого или третьего фрагмента от саморазрушающегося спэйсера является результатом расщепления катепсиновым ферментом или глюкуронидазой.
В некоторых вариантах осуществления, расщепляемый ферментом линкер представляет собой пептидный линкер, а спэйсер ковалентно связан по одному из его концов с пептидным линкером и ковалентно связан по его другому концу с фрагментом лекарственного средства. Эта молекула из трех частей является стабильной и фармакологически неактивной в отсутствие фермента, но является ферментативно расщепляемой посредством фермента по связи, ковалентно связывающей спэйсерный фрагмент и пептидный фрагмент. Пептидный фрагмент отщепляется от молекулы из трех частей, что инициирует саморазрушающуюся природу спэйсерного фрагмента, приводя к самопроизвольному расщеплению связи, ковалентно связывающей спэйсерный фрагмент с фрагментом лекарственного средства, чтобы, таким образом, воздействовать на высвобождение лекарственного средства в фармакологически активной форме.
В других вариантах осуществления, линкер содержит саморазрушающийся спэйсер, который соединяется с пептидом, либо непосредственно или опосредованно по одному концу, и с полезной нагрузкой по другому концу; и спэйсер присоединяется к третьему фрагменту, который может отщепляться от спэйсера ферментативно, таким образом, как под действием глюкуронидазы. При отщеплении третьего фрагмента, спэйсер разрушается или перегруппировывается таким путем, который вызывает высвобождение полезной нагрузки. Примером линкера с данным типом саморазрушающегося спэйсера является этот расщепляемый глюкуронидазой линкер, где гидролиз ацеталя, катализируемый глюкуронидазой, высвобождает фенольное соединение, которое самопроизвольно разлагается при физиологических условиях:
Неограничивающие примеры саморазрушающегося спэйсера, необязательно применяемого при конъюгации группы X1 с модифицированными антителами или фрагментами этих антител, предоставленными в данном документе, включают, но не ограничиваются перечисленным, фрагменты, которые включают бензилкарбонильный фрагмент, бензилэфирный фрагмент, 4-аминобутиратный фрагмент, гемитиоаминальный фрагмент или N-ацилгемитиоаминальный фрагмент.
Другие примеры саморазрушающихся спэйсеров включают, но не ограничиваются перечисленным, п-аминобензилоксикарбонильные группы, ароматические соединения, которые являются электронно сходными с п-аминобензилоксикарбонильной группой, такие как производные 2-аминоимидазол-5метанола и орто или пара-аминобензилацетали. В некоторых вариантах осуществления, саморазрушающиеся спэйсеры, применяемые в данном документе, которые претерпевают циклизацию при гидролизе амидной связи, включают замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты и амиды 2аминофенилпропионовой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления, спэйсер представляет собой ryY ггА н или н , в то время как в других вариантах осуществления спэйсер представляет собой
- 56 043810
где n равно 1 или 2.
В других вариантах осуществления спэйсер представляет собой
где n равно 1 или 2.
В других вариантах осуществления спэйсер представляет собой
где n равно 1 или 2.
В других вариантах осуществления спэйсер представляет собой
где n равно 1 или 2.
В других вариантах осуществления спэйсер представляет собой
где n равно 1 или 2.
Схемы (2а-2с) иллюстрируют пост-трансляционную модификацию модифицированных антител или фрагментов этих антител, предоставленных в данном документе, где Линкерный Блок (LU) представляет собой -L1-L2-L3-L4-, и L1 в каждом случае представляет собой группу, которая взаимодействует с новым Cys.
Схема 2а
Схема 2b
- 57 043810
Схема 3c
R R
На каждой из схем 2а-2с, исходным веществом является замененный Cys остаток в антителе или фрагменте антитела, модифицированных, как описано в данном документе, где пунктирные связи показывают соединение с присоединяемыми остатками антитела или фрагмента антитела; каждый R представляет собой Н или €1-4алкил, обычно Н или метил; L2, L3 и L4 являются компонентами связывающего блока LU, такими, как описанные выше; X представляет собой полезную нагрузку; и группой, соединяющей L2 с серой замененного Cys изобретения, является L1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, X представляет собой реакционноспособную функциональную группу, которая может применяться, чтобы соединить конъюгированное антитело с еще одним химическим фрагментом, посредством взаимодействия с подходящей комплементарной функциональной группой. Табл. 4 отображает несколько примеров реакционноспособных функциональных групп, которые X может представлять, наряду с комплементарной функциональной группой, которая может применяться для соединения конъюгата, содержащего X с еще одним соединением. Способы применения X для соединения с соответствующей комплементарной функциональной группой являются хорошо известными в данной области. Соединения с использованием азида обычно делают, используя Клик или не содержащую меди клик-химию; реакции, включающие гидразины, алкоксиамины или ацилгидразины обычно протекают через образование основания Шиффа с одной из карбонильных функциональных групп.
Таблица 4
X Комплементарная реакционноспособная функциональная группа для X
тиол тиол, малеимид, галогенацетамид, винилсульфон или винилпиридин
азид алкен, алкин, фосфин-(тио)сложный эфир, циклооктин, циклооктен или оксаноборнадиен
фосфин-(тио)сложный эфир) азид
оксаноборнадиен азид или тетразин
алкин азид или тетразин
алкен тетразин
циклооктин азид или тетразин
циклооктен тетразин
норборнен тетразин
тетразин норборнен, алкен, алкин, циклооктин или оксаноборнадиен
альдегид гидроксиламин, гидразин или NH2-NH- С (=0)-
кетон гидроксиламин, гидразин или NH2-NH- С (=0)-
гидроксиламин альдегид или кетон
гидразин альдегид или кетон
nh2-nh-c (=0) - альдегид или кетон
галогенацетамид тиол
тиол тиол
малеимид Тиол
винилсульфон Тиол
винилпиридин Тиол
Примерные продукты соединений, сделанных с использованием этих компонентов, отображены в табл. 5, где Y1 представляет антитело изобретения, A1 представляет связывающий блок (LU), соединяющий антитело с полезной нагрузкой Ха, -L2-L3-L4- в Формуле II-а представляет линкерный блок, который
- 58 043810 может быть представлен в молекуле, подлежащей соединению с конъюгированным антителом через Ха, и X1 представляет полезную нагрузку. Полезная нагрузка Ха представляет собой реакционноспособную функциональную группу, и Xb в Формуле П-а является соответствующей комплементарной функциональной группой, а сама Формула II-а представляет молекулу, подлежащую соединению с конъюгированным антителом. Третий столбец в табл. 5 отображает продукт реакции Ха с Xb.
Таблица 5
Y1-A—Ха Xb-L2-L3-L4-X1 Формула (ll-a) y1-a1-x2-l2-l3-l4-x1
Y1—A-,—N3 HC^C—L2—L3-L4-X1 n=n n^^l2-l3-l4-x1 Y1—A<
Y1—A-,—N3 НС^С—L2—L3-L4-X1 γ1-Αι L2-L3-L4-X1
Υ^Α^ΟΞΟΗ N3-L2-L3-L4-X1 ^-Ц-Ц-Х1 Y1—A'f'N
Y1—A-|—CzECH N3-L2-L3-L4-X1 О И / N Y —Al l2-l3-l4-x1
Υ1—α/^Υ) NH2-O-L2-L3-L4- N^/^-U-X1 y1—a^A
Η Υ1—Α<^Ο NH2-O-L2-L3-L4X1 .. ,L2-L3-L4-X1 H
ό-νη2 Υ1—Α< CH3C(=O)-L2-L3L4-X1 ,^l2-l3-l4-x1 Y1- 1
ό-νη2 Υ1—Α< HC(=O)-L2-L3-L4X1 h^l2-l3-l4-x1 H Y1^
0 HS-L2-L3-L4-X1 OfO-LrU-X1 .О 0
SH Υ1—Α< 0 О-l2-l3-l4-x1 0 0 Y1-A1 0
S Η Υ1—Αι 0 / HN—-L2-L3-L4-X1 H A/S 7-7 42-l3-l4-x1 y1 1 0
- 59 043810
к ./АЧ As Y1 й ° HS-—L2-L3-L4-X1 L2-L3-L4-X1 A ,XA1 As. Y1 ΧΝ^Ο H
SH Y1—Ai / q/ ΗΝ—L2-L3-L4-X1 H /S 42-l3-l4-x1 II Y1 0
Br^ Ак As. Y1 Ν ΧΟ Η HS—L2-L3-L4-X1 L-2-L3-L4-X1 A xA1. Jk. Y XN«O H
Υ1—A^^O NH2-NH-C(=O)L2-L3-L4-X' 0 hn/^l2-l3-l4-x1 Y1
Η Υ1—αΎ^Ο NH2-NH-C(=O)L2-L3-L4-X1 0 HN/^'L2-L3-L4-X1 y.'aYn H
νηνη2 Υ1—Α<^0 R5C(=O)-L2-L3L4-X1 r5 l2-l3-l4-x1 A YA1^NHN о
νηνη2 γ1—αΥ^Ο HC(=O)-L2-L3-L4X1 H l2-l3-l4-x1 . Y γΑι^ΝΗΝ О
SH Υ1—Α< HS-L2-L3-L4-X1 ,s—s-l2l3l4-x1 i^Ai Y
Υ1—Α·|—Ν3 1 -7-(R6)n Ψ . L2—L3-L4—X1 nA Y1-A-f ^^(R 6)n L2-L3-L4-X1
- 60 043810
y1-Ai^^-(R6) N3-L2-L3-L4-X1 (Rg)n L2-L3-L4-X1 y1-aY В ,'n
y1-A!-n3 / 0 Ph2P\Y° p L2-L3-L4-X1 Ph О l/Ph u ,γ° υ^Αί-ν^ ηη H l2-l3-l4-x1
P-Ph =( 0 y1-a4y% / N3-L2-L3-L4-X1 Ph,/? P<-Ph /Ύ /° HN—L2-L3-L4-X1
Y1-Ar-N3 Ph zPh p 0 О Λ Y1-A1-N/XL2-L3-L4-X1
0 JI p Y1-Ai P N3-L2-L3-L4-X1 0 Y1-AT\ HN—L2-L3-L4-X1
y1-a( r7 N^N 11 1 N^N r8-l2-l3-l4-x1 r7 YN / \ NH и Г=< l2-l3-l4-x1
A Л “Az /А M π ^Xl2-l3-L4-x1 .n^R? HN Y’-< vA L2-L3-L4-X1
- 61 043810
лумм y1-a( Ry iAn II I N^N r8-l2-l3-l4-x1 < к> /X. CO / \ \ J b 00
q? Qi С >- (+ V )-2~1-з_Ц-Х1 I—0 ,nM HN κΓγΛ γ1-Αι Mb L2-L3-L4-X1-Cr
r 9 9ч Mb Y1-ArNH V N3-L2-L3-L4-X1 L2-L3-L4-X1
Y1-Al-N3 P Rg ΖΒγ0 47 NH L2-L3-L4-x1 L2-L3-L4-^1 ,N NH , b-Y Y1-A< \9
, °мЬ Y-A-|—NH 47 r7 N^N II I N^N R8 L2-L3-L4-X1 L2-L3-L4-X1 8 y^-nh/jjh Z==N/ R7
n-nyr’ Y’-A,-r7n'N N H y -Ai HN / NH 'nA / /1 r7 l2 l3-l4
Y1—A^ N3 О θΡ X 4 Ύ) г О I X rV-O γ1—A) Ί ) l2-l3-l4-x1
< Г > М-р рмГ N3-L2-L3-L4-X1 7 \ 0
В некоторых вариантах осуществления, модифицированное антитело или фрагмент этого антитела, предоставленные в данном документе, конъюгируют при отношении X группа-к-антителу (полезной нагрузки к антитело) между приблизительно 1 и 16, таком как 1-12, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, или 8, где модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 остатков цистеина, введенных на специфичных участках, раскрытых в данном документе. Например, отношение X группак-антителу, равное 4, может достигаться посредством введения двух остатков Cys в тяжелую цепь анти
- 62 043810 тела, которая будет содержать 4 участка конъюгация, по два от каждой тяжелой цепи. Иммуноконъюгаты таки антител будут содержать до 4 групп полезной нагрузки, которые могут быть подобными или различными, и предпочтительно все являются одинаковыми. В еще одном примере, отношение X группа-кантителу, равное 4, может достигаться посредством введения одного остатка Cys в тяжелую цепь, а второго остатка Cys в легкую цепь антитела, приводя в результате к 4 участкам конъюгации, двум в двух тяжелых цепях и двум в двух легких цепях. Отношение 6, 8 или выше может достигаться посредством комбинаций из 3, 4 или более замен на цистеин изобретения в тяжелой и легкой цепи антитела. Замена на множество цистеиновых групп в антителе может приводить к неуместному образованию дисульфида и другим проблемам. Таким образом, для загрузки более 4 групп полезной нагрузки на одну молекулу антитела, способы изобретения могут альтернативно комбинироваться со способами, которые не основаны на реакциях по цистеину серы, такими как ацилирования по лизину или конъюгация через метки S6 или Pcl методология.
В то время, как отношение полезной нагрузки к антителу имеет точное значение для конкретной молекулы конъюгата, понимают, что значение будет часто представлять собой среднее значение, когда его используют для описания образца, содержащего много молекул, вследствие некоторой степени негомогенности, обычно на стадии конъюгации. Средняя загрузка для образца иммуноконъюгата именуется в данном документе как отношение лекарственного средства к антителу или DAR. В нескольких вариантах осуществления, DAR находится между приблизительно 1 и приблизительно 16, и обычно равно приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В нескольких вариантах осуществления, по меньшей мере 50% массы образца является соединением, имеющим среднее отношение плюс или минус 2, и предпочтительно по меньшей мере 50% образца составляет конъюгат, который содержит среднее отношение плюс или минус 1. Предпочтительные варианты осуществления включают иммуноконъюгаты, где DAR равно приблизительно 2 или приблизительно 8, например, приблизительно 2, приблизительно 4, приблизительно 6 или приблизительно 8. В нескольких вариантах осуществления, DAR, равное 'приблизительно n' означает, что измеренное значение для DAR находится в пределах 10% от n (в Формуле (I)).
3. Дополнительное изменение каркаса области Fc
Настоящее изобретение предоставляет сайт-специфичные меченые иммуноконъюгаты. Иммуноконъюгаты изобретения могут содержать модифицированные антитела или фрагменты этих антител, которые дополнительно содержат модификации каркасных остатков в VH и/или VL, например, для улучшения свойств антитела. Обычно такие каркасные модификации получают, чтобы уменьшить иммуногенность антитела. Например, одним подходом является обратно-мутировать один или более каркасных остатков в соответствующую первоначальную последовательность. Более конкретно, антитело, которое прошло через соматическую мутацию, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от первоначальной последовательности, из которого получают антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы посредством сравнения каркасных последовательностей антитела с первоначальными последовательностями, из которых получают антитело. Для возврата последовательностей каркасной области к их первоначальной конфигурации, соматические мутации могут быть обратно-мутированы в первоначальную последовательность посредством, например, сайт-направленного мутагенеза. Такие обратномутированные антитела также подразумеваются охваченными изобретением.
Еще один тип модификации каркаса включает в себя мутацию одного или более остатков в каркасной области, или даже в одной или более областей CDR, чтобы удалить Т-клеточные эпитопы, чтобы, таким образом, снизить потенциальную иммуногенность антитела. Данный подход также называется деиммунизацией, и описан в дополнительных подробностях в патентной публикации США № 20030153043 Carr et al.
В дополнение или как альтернатива к модификациям, сделанным в каркасных областях или областях CDR, антитела изобретения могут быть сконструированы, чтобы включать модификации внутри Fc области, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с Fc рецептором и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело изобретения могут быть химически модифицировано (например, один или более химических фрагментов могут быть присоединены к антителу) или быть модифицированы для изменения его гликозилирования, снова для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов осуществления описан в дополнительных подробностях ниже.
В одном варианте осуществления, шарнирная область СН1 модифицируют таким образом, что число остатков цистеина в шарнирной области изменяется, например, увеличивается или уменьшается. Этот подход описан дополнительно в патенте США № 5,677,425 Bodmer et al. Число остатков цистеина в шарнирной области СН1 изменяется для, например, облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела.
В еще одном варианте осуществления, Fc шарнирную область антитела подвергают мутации, чтобы снизить биологическое время полужизни антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в межфазную область СН2-СНЗ домена Fc-шарнирного фрагмента, таким образом, что антитело имеет нарушенное связывание Стафиллококкового белка A (SpA) относительно связывания
- 63 043810
SpA нативным Fc-шарнирным доменом. Этот подход описан с дополнительными подробностями в патенте США № 6,165,745 by Ward et al.
В еще других вариантах осуществления, Fc область изменяют посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на отличный от него аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например, одна или более аминокислот могут быть заменены на отличный от них аминокислотный остаток таким образом, что антитело имеет измененную аффинность для эффекторного лиганда но сохраняет антиген-связывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, по отношению к которому аффинность изменяют, может представлять собой, например, Fc рецептор или С1 компонент комплемента. Данный подход описан, например, в патентах США № 5,624,821 и 5,648,260, оба Winter et al.
В еще одном варианте осуществления, одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков, может быть заменена на отличный от них аминокислотный остаток таким образом, что антитело имеет измененной связывание C1q и/или пониженную или отмененную комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Данный подход описан, например, в патентах США № 6,194,551 Idusogie et al.
В еще одном варианте осуществления, один или более аминокислотных остатков изменяют, чтобы, таким образом, изменить способность антитела фиксировать комплемент. Данный подход описан, например, в Публикации РСТ WO 94/29351 Bodmer et al. В конкретном варианте осуществления, одна или более аминокислот антитела или фрагмента этого антитела настоящего изобретения заменяют одним или более аллотипичными аминокислотными остатками, такими, как показанные на фиг. 4 для подкласса IgG1 и каппа изотипа. Аллотипичные аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются перечисленным, константную область тяжелой цепи подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, а также константную область легкой цепи каппа изотипа, как описано Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009).
В еще одном другом варианте осуществления, Fc область модифицируют, чтобы увеличить способность антитела опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или чтобы увеличить аффинность антитела для Fcy рецептора посредством модификации одной или более аминокислот. Данный подход описан, например, в Публикации РСТ WO 00/42072 Presta. Более того, участки связывания в человеческом IgG1 для FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn были картированы и варианты с улучшенным связыванием были описаны (см. Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001).
В еще одном другом варианте осуществления, модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено агликозилированное антитело (т.е. у антитела отсутствует гликозилирование). Гликозилирование может быть изменено, чтобы, например, увеличить аффинность антитела для антигена. Такие углеводные модификации могут осуществляться посредством, например, изменения одного или более участков гликозилирования в последовательности антитела. Например, могут быть сделаны одна или более аминокислотных замен, которые приводят к элиминированию одного или более участков гликозилирования вариабельной области каркаса, чтобы, таким образом, элиминировать гликозилирование на данном участке. Такое агликозилирование может увеличивать аффинность антитела для антигена. Такой подход описан, например, в патентах США № 5,714,350 и 6,350,861 Со et al.
Дополнительно или альтернативно, может быть получено антитело, которое имеет измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее пониженные количества фукозильных остатков, или антитело, имеющее увеличенные раздвоенные структуры GlcNac. Было продемонстрировано, что такие измененные гликозилирование матрицы увеличивают ADCC способность антитела. Такие углеродные модификации могут выполняться, например, посредством экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в данной области и могут применяться в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела изобретения, чтобы, таким образом, продуцировать антитело с измененным гликозилированием. Например, ЕР 1,176,195 от Hang et al. описывает клеточную линию с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, таким образом, что антитела, экспрессированные в такой клеточной линии проявляют гипофукозилирование. Публикация РСТ WO 03/035835 от Presta описывает вариантную клеточную линию СНО, клетки Lecl3, с пониженной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, также приводящей в результате к гипофукозилированию антитела, экспрессированного в такой клетке-хозяине (см. также Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Публикация РСТ WO 99/54342 от Umana et al. описывает клеточные линии, сконструированные, чтобы экспрессировать гликопротеин-модифицирующие гликозилтрансферазы (например, бета(1,4)-N ацетилглюкозоаминилтрансферазы III (GnTIII)) таким образом, что антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях, проявляют увеличенные раздвоенные структуры GlcNac, что приводит в результате к увеличенной ADCC активности антитела (см. также Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999).
В еще одном варианте осуществления, антитело модифицируют, чтобы увеличить его время биологической полужизни. Возможными являются различные подходы. Например, могут вводиться одна или более из следующих мутаций: T252L, T254S или T256F, как описано в патенте США № 6,277,375 на имя Ward. Альтернативно, чтобы увеличить время биологической полужизни, антитело может быть изменено
- 64 043810 в области СН1 или CL, чтобы содержать эпитоп связывания с рецептором реутилизации, взятом из двух петлей СН2 домена области Fc из IgG, как описано в патентах США 5,869,046 и 6,121,022 by Presta et al.
4. Конгьюгаты антитела.
Настоящее изобретение предоставляет сайт-специфичные способы введения метки, модифицированные антитела и фрагменты этих антител, и иммуноконъюгаты, полученные соответственно. С использованием способов изобретения, модифицированные антитело или фрагменты этого антитела могут быть конъюгированы с меткой, такой как фрагмент лекарственного средства, например, средство против злокачественных новообразований, средство лечения аутоиммунных расстройств, противовоспалительное средство, противогрибковое средство, антибактериальное средство, противопаразитарное средство, противовирусное средство, или анестезирующее средство, или реагент для визуализации, такой как хелатор для ПЭТ-визуализации, или флуоресцентная метка или контрастный реагент для МРТ. Антитело или фрагменты антитела могут также быть конъюгированы с использованием некоторых идентичных или различных метящих фрагментов при комбинировании способов изобретения с другими способами конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгаты настоящего изобретения содержат фрагмент лекарственного средства, выбранный из ингибитора V-АТФазы, ингибитора HSP90, ингибитора IAP, ингибитора mTor, стабилизатора микротрубочек, дестабилизатора микротрубочек, ауристатина, доластатина, майтансиноида, MetAP (метионинаминопептидазы), ингибитора ядерного экспорта белков CRM1, ингибитора DPPIV, ингибиторов протеасом, ингибитора реакций переноса фосфорила в митохондриях, ингибитора синтеза белка, ингибитора киназы, ингибитора CDK2, ингибитора CDK9, ингибитора HDAC, средства, повреждающего ДНК, ДНК-алкилирующего средства, интеркалятора ДНК, связующего малой бороздки ДНК, ингибиторов топоизомеразы, ингибиторов синтеза РНК, ингибиторов кинезина, ингибиторов белок-белковых взаимодействий и ингибитора DHFR.
Дополнительно, модифицированные антитела или фрагменты антител настоящего изобретения могут быть конъюгированы с фрагментом лекарственного средства, который модифицирует данный биологический ответ. Фрагменты лекарственных средств не должны быть истолкованы, как ограниченные классическими химическими терапевтическими средствами. Например, фрагмент лекарственного средства может представлять собой иммуномодулятор, такой как потенциатор иммунной системы, низкомолекулярный потенциатор иммунной системы, агонист TLR, олигомер CpG, TLR2 агонист, агонист TLR4, агонист TLR7, агонист TLR9, агонист TLR8, пептид эпитопа Т-клеток или т.п. Фрагмент лекарственного средства может также представлять собой олигонуклеотид, миРНК, shPHK, кДНК или т.п. Альтернативно, фрагмент лекарственного средства может представлять собой белок, пептид, или полипептид, обладающей желательной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такие как абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонас, холерный токсин или дифтерийный токсин, белок, такой как фактор некроза опухолей, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста, тканевой активатор плазминогена, цитокин, апоптотическое средство, анти-ангиогенное средство, или модификатор биологического ответа, такой как, например, лимфокин.
В одном варианте осуществления, модифицированные антитела или фрагменты антител настоящего изобретения конъюгируют с фрагментом лекарственного средства, таким как цитотоксин, лекарственным средством (например, иммуносупрессором) или радиотоксином. Примеры цитотоксина включают, но не ограничиваются перечисленным, таксаны (см., например, Международные (РСТ) Патентные заявки № WO 01/38318 и PCT/US03/02675), ДНК-алкилирующие средства (например, аналоги СС-1065), антрациклины, аналоги тубулизина, аналоги дуокармицина, ауристатин Е, ауристатин F, майтансиноиды, и цитотоксические средства, содержащие реакционноспособный фрагмент полиэтиленгликоля (см., например, Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000), Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000), Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991), Francisco et al., Blood (2003) (электронная публикация перед печатной публикацией), Патенты США № 5,475,092, 6,340,701, 6,372,738, и 6,436,931, Публикацию Патентной заявки США № 2001/0036923 А1, рассматриваемые патентные заявки США Сер. № 10/024,290 и 10/116,053, и Международную (РСТ) Патентную Заявку № WO 01/49698), таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1дегидротестостерон, глюкокортикоиды и пуромицин и его аналоги или гомологи. Терапевтические средства также включают, например, анти-метаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацила декарбазин), абляционные средства (например, мехлорэтамин, тиотепа хлорамбуцил, мейфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусулфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С, и цис-дихлордиамин платины (II) (DDP), цисплатин, антрациклины (например, даунорубицин (прежде дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежде актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин). (См. например, Seattle Genetics US 20090304721).
Другие примеры терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с модифицированными антителами или фрагментами антител изобретения, включают дуокармицины, калихеамицины, майтансины и ауристатины и их производные. Пример конъюгата калихеамицина с антителом явля
- 65 043810 ется доступным для приобретения (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
Для дополнительного обсуждения типов цитотоксинов, линкеров и способов для конъюгирования терапевтических средств с антителами, см. также Saito et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
В соответствии с настоящим изобретением, модифицированные антитела или фрагменты этих антител могут также быть конъюгированы с радиоактивным изотопом для генерации цитотоксических радиофармпрепаратов, называемых радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами для применения диагностически или терапевтически включают, но не ограничиваются перечисленным, иод131, индии111, иттрии90, и лютеций. Способы получения радиоиммуноконъюгатов являются установленными в данной области. Примеры радиоиммуноконъюгатов являются доступными для приобретения, включающие Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) и Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), и аналогичные способы могут применяться для получения радиоиммуноконъюгатов с использованием антител изобретения. В некоторых вариантах осуществления, макроциклический хелатор представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N,N'-тетрауксусную кислота (DOTA), которая может быть присоединена к антителу через линкерную молекулу. Такие линкерные молекулы являются общеизвестными в данной области и описаны в Denardo et al. (1998) Clin. Cancer Res. 4(10): 2483-90; Peterson et al. (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; и Zimmerman et al. (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, каждая полностью включается посредством ссылки.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет модифицированные антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с антигеном. Модифицированные антитела или фрагменты могут быть конъюгированы или гибридизированы с гетерологичным белком или полипептидом (или их фрагментом, предпочтительно с полипептидом из по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аминокислот) для генерации гибридных белков. В частности, изобретение предоставляет гибридные белки, содержащие фрагмент антитела, описанный в данном документе (например, Fab фрагмент, Fd фрагмент, Fv фрагмент, F(ab)2 фрагмент, VH домен, VH CDR, VLдомен или VL CDR) и гетерологичный белок, полипептид или пептид.
В нескольких вариантах осуществления, модифицированные фрагменты антитела без антигенсвязывающей специфичности, такие как, но не ограниченные перечисленным, модифицированные Fc домены со сконструированными остатком (остатками) цистеина в соответствии с настоящим изобретением, применяют для генерации гибридных белков, содержащих такой фрагмент антитела (например, сконструированные Fc) и гетерологичный белок, полипептид или пептид.
Дополнительные гибридные белки могут генерироваться посредством методов перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов, и/или перетасовки кодонов (обобщенно называемых перетасовками ДНК). Перетасовки ДНК могут использоваться для изменения активностей антител изобретения или их фрагментов (например, антитела или их фрагменты с более высокими аффинностями и более низкими скоростями диссоциации). См., в целом, Патенты США № 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, и 5,837,458; Patten et al. (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al. (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; и Lorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313 (каждая из этих патентов и публикации полностью включены посредством ссылки). Антитела или их фрагменты, или кодируемые антитела или их фрагменты, могут быть изменены посредством подвергания статистическому мутагенезу посредством подверженного ошибкам ПЦР, статистического введения нуклеотидов или других методов перед рекомбинацией. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с антигеном, могут быть рекомбинированы с одним или более компонентами, мотивами, секциями, частями, доменами, фрагментами и т.д. одной или более гетерологичных молекул.
Более того, модифицированные антитела или фрагменты этих антител настоящего изобретения могут быть конъюгированы с маркерными последовательностями, таким как пептид для облегчения очистки. В предпочтительных вариантах осуществления, маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гекса-гистидиновый пептид, такой как метка, предоставленная в векторе pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), среди других, многие из которых являются доступными для приобретения. Как описано в Gentz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, например, геса-гистидин обеспечивает удобную очистку гибридного белка. Другие пептидные метки, применимые для очистки, включают, но не ограничиваются перечисленным, гемагглютининовую (НА) метку, которая соответствует эпитопу, полученному из гемагглютининового белка вируса гриппа (Wilson et al. (1984) Cell 37:767), и FLAG мета (A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001). В соответствии с настоящим изобретением, антитела или фрагменты антител могут также быть конъюгированы с проникающими в опухоль пептидами, чтобы усилить их эффективность действия.
В других вариантах осуществления, модифицированные антитела или фрагменты антител настоя
- 66 043810 щего изобретения являются конъюгированными с диагностическим или обнаруживаемым средством. Такие иммуноконъюгаты могут быть применимыми для мониторинга или прогнозирования наступления, развития, прогрессирования и/или тяжести заболевания или расстройства как части методики клинического тестирования, такой как определение эффективности действия конкретной терапии. Такой диагноз и обнаружение могут осуществляться посредством сочетания антитела с обнаруживаемыми веществами, включающими, но не ограниченными перечисленным, различные ферменты, такие как, но не ограниченные перечисленным, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза;
простетические группы, такие как, но не ограниченные перечисленным, стрептавидин/биотин и авидин/биотин;
флуоресцентные материалы, такие как, но не ограниченные перечисленным, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламина флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные материалы, такие как, но не ограниченные перечисленным, люминол;
биолюминесцентные материалы, такие как, но не ограниченные перечисленным, люцифераза, люциферин, и аэкворин; радиоактивные материалы, такие как, но не ограниченные перечисленным, йод (131I, 125I, 123I, и 121I), углерод (14С), сера (35S), тритий (3Н), индий (115In, 113In, 112In, и n1In), технеций (99Тс), таллий (201Ti), галлий (68Ga, 67Ga), палладий (103Pd), молибден (99Мо), ксенон (133Хе), фтор (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 64Cu, n3Sn, и 117Sn; и позитрон-испускающие металлы с использованием различных позитронно-эмиссионных томографий и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов.
Модифицированные антитела или фрагменты антител изобретения могут также присоединяться к твердым подложкам, которые являются особенно применимыми для иммунологических анализов или очистки целевого антигена. Такие твердые подложки включают, но не ограничиваются перечисленным, стекло, целлюлозу, полиакриламид, найлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.
5. Фармацевтическая композиция.
Чтобы получить фармацевтические или стерильные композиции, включающие иммуноконъюгаты, иммуноконъюгаты изобретения смешивают с фармацевтически приемлемым носителе или эксципиентом. Композиции могут дополнительно содержать один или более других терапевтических средств, которые являются подходящими для лечения или профилактики злокачественного новообразования (рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, множественной миеломы, рака яичника, рака печени, рака желудка, рака поджелудочной железы, острой миелоидной лейкемии, хронической миелоидной лейкемии, остеосаркомы, карциномы сквамозных клеток, леммоцитарных опухолей периферических нервов (например, шванномы), рака шеи и головы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, рака пищевода Барретса, глиобластомы, чистоклеточной саркомы мягких тканей, злокачественной мезотелиомы, нейрофиброматоза, рака почки, меланомы, рака простаты, доброкачественной гиперплазии простаты (ВРН), гинекомастии и эндометриоза).
Лекарственные формы терапевтических и диагностических средств могут быть получены посредством смешивания с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме, например, лиофилизированных порошков, взвесей, водных растворов, лосьонов или суспензий (см., например, Hardman et al., Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of Therapeuticals, McGrawHill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner и Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000).
Выбор режима введения для терапевтического средства зависит от нескольких факторов, включающих интенсивность обмена объекта в сыворотке или ткани, уровень симптомов, иммуногенность объекта, и доступность целевых клеток в биологическом матриксе. В некоторых вариантах осуществления, режим введения максимизирует количество терапевтического средства, доставляемого пациенту совместимый с приемлемым уровнем побочных эффектов. Соответственно, количество доставленного биологического средства зависит частично от конкретного объекта и тяжести состояния, подвергаемого лечению. Руководство по выбору соответствующих доз антител, цитокинов и малых молекул является доступным (см, например, Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniamonovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000).
- 67 043810
Определение соответствующей дозы делается клиницистом, например, с использованием параметров или факторов, известных или предполагаемых в данной области, чтобы воздействовать на лечение или предсказанных для воздействия на лечение. Обычно, дозу начинают с количества до некоторой степени меньшего, чем оптимальная доза, и ее затем увеличивают небольшими приращениями, пока не достигают желательного или оптимального эффекта относительно любого из негативных побочных эффектов. Важные диагностические измерения включают измерения симптомов, например, воспаления или уровня продуцируемых воспалительных цитокинов.
Действительные уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут варьироваться таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным, чтобы достигнуть желательного терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции, и способа введения, не являясь токсичным для пациентом. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включающих активность конкретных используемых композиций настоящего изобретения, или их сложного эфира, соли или амида, путь введения, время введения, скорость выведения конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возрастом, полом, массой тела, состоянием, общим состоянием здоровья и предшествующей медицинской историей пациента, подвергаемого лечению, и т.п. факторов известных в медицинских областях.
Композиции, содержащие антитела или их фрагменты изобретения могут быть обеспечены, посредством непрерывной инфузии, или посредством доз при интервалах, равных например, одному дню, одной неделе или 1-7 раз в неделю. Дозы могут обеспечиваться внутривенно, подкожно, местно, перорально, назально, ректально, внутримышечно, интрацеребрально или посредством ингаляции. Конкретный протокол доз представляет собой протокол, включающий максимальную дозу или частоту доз, который позволяет избежать значительных нежелательных побочных эффектов.
Для иммуноконъюгатов изобретения, дозировка, вводимая пациенту, может составлять от 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента. Дозировка может составлять между 0,0001 мг/кг и 20 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 10 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 5 мг/кг, 0,0001 и 2 мг/кг, 0,0001 и 1 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 0,75 мг/кг, 0,0001 мг/кг и 0,5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,25 мг/кг, от 0,0001 до 0,15 мг/кг, от 0,0001 до 0,10 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,25 мг/кг или от 0,01 до 0,10 мг/кг массы тела пациента. Дозировка антител или их фрагментов изобретения может быть рассчитана с использованием массы пациента в килограммах (кг), умноженной на дозу, подлежащую введению в мг/кг.
Дозы иммуноконъюгатов изобретения могут повторяться и введения могут быть разделены на по меньшей мере 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней, 45 дней, 2 месяца, 75 дней, 3 месяца или по меньшей мере 6 месяцев. В конкретном варианте осуществления, дозы иммуноконъюгатов изобретения повторяют каждые 3 дня.
Эффективное количество для конкретного пациента может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подвергаемое лечению, общее состояние здоровья пациента, способ введения и доза введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory и Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001).
Способ введения может проводиться посредством, например, местного или кожного применения, инъекции или инфузии посредством внутривенного, внутрибрюшинного, интрацеребрального, внутримышечного, внутриглазного, внутриартериального, интрацереброспинального, внутрь повреждения введения, или посредством систем с продолжительным высвобождения или имплантата (см., например, Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; Патенты США № 6,350,466 и 6,316,024). Там, где необходимо, композиция может также включать солюбилизирующее средство и местное анестезирующее средство, такое как лидокаин, чтобы снизить боль на участке инъекции. В дополнение, может также использоваться легочное введение, например, посредством применения ингалятора или распылителя, и лекарственной формы с аэрозолизирующим средством. См., например, Патенты США № 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, и 4,880,078; и Публикации РСТ № WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, и WO 99/66903, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки.
Композиция настоящего изобретения может также вводиться через один или более путей введения с использованием одного или более из разнообразных способов, известных в данной области. Как будет понятно квалифицированному специалисту в области, путь и/или способ введения будут видоизменяться в зависимости от желательных результатов. Выбранные пути введения для иммуноконъюгатов изобретения включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение может представлять способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышеч
- 68 043810 ную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, инраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспиральную, эпидуральную и интастернальную инъекцию и инфузию. Альтернативно, композиция изобретения может вводиться через непарентеральный путь, такой как местный, эпидермальный или чрезслизистый путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, подъязычно или местно. В одном варианте осуществления, иммуноконъюгаты изобретения вводят посредством инфузии. В еще одном варианте осуществления, иммуноконъюгаты изобретения вводят подкожно.
Если иммуноконъюгаты изобретения вводят в системе с контролируемым высвобождением или системе с продолжительным высвобождением, может применяться насос для достижения контролируемого или продолжительного высвобождения (см. Langer, выше; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989). Полимерные материалы могут применяться для достижения контролируемого или продолжительного высвобождения терапий изобретения (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer и Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen и Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983; см. также Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 71:105, 1989; Патент США № 5,679,377; Патент США № 5,916,597; Патент США № 5,912,015; Патент США № 5,989,463; Патент США № 5,128,326; Публикация РСТ № WO 99/15154; и Публикация РСТ № WO 99/20253. Примеры полимеров, применяемых в лекарственных формах с продолжительным высвобождением включают, но не ограничиваются перечисленным, поли (2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловую кислоту), поли(этилен-со-винилацетат), поли(метакриловую кислоту), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), поли(лактид-со-гликолиды) (PLGA), и полиортосложные эфиры. В одном варианте осуществления, полимер, применяемый в лекарственной форме с продолжительным высвобождением является инертным, не содержащим способных к утечке примесей, стабильным при хранении, стерильным, и биодеградируемым. Система с контролируемым или продолжительным высвобождением может помещаться в близости от профилактической или терапевтической мишени, таким образом, требуя только фракцию системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984).
Системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, Science 249:1527-1533, 1990). Любой метод, известный специалисту в данной области, может применяться для получения лекарственных форм с продолжительным высвобождением, содержащих один или более иммуноконъюгатов изобретения. См., например, Патент США № 4,526,938, Публикацию РСТ WO 91/05548, Публикацию РСТ WO 96/20698, Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996; Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997; и Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки.
Если иммуноконъюгаты изобретения вводят местно, они могут быть составлены в форме мази, крема, трансдермального пластыря, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы хорошо известной специалисту в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Для неразбрызгиваемых местных дозированных форм обычно используют от вязких до полутвердых или твердых форм, содержащих носитель или один или более эксципиентов, совместимых с местным применением, и имеющих динамическую вязкость, в некоторых случаях, большую, чем у воды. Подходящие лекарственные формы включают, без ограничения, растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, бальзамы и т.п., которые, если желательно, стерилизуют или смешивают со вспомогательными средствами (например, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими средствами, буферами или солями) для оказания влияния на различные свойства, такие как, например, осмотическое давление. Другие подходящие местные дозированные формы включают распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент, в некоторых случаях, в комбинации с твердым или жидким инертным носителем, упаковывают в смеси с находящимся под давлением летучим веществом (например, газообразным пропеллентом, таким как Freon™) или в сжимаемой бутыли. Смачивающие вещества или увлажнители могут также добавляться к фармацевтическим композициям и дозированным формам, если желательно. Примеры таких дополнительных ингредиентов являются хорошо известными в данной области.
Если композиции, содержащие иммуноконъюгаты, вводят интраназально, они могут быть составлены в форме аэрозоля, спрея, тумана или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства для применения в соответствии с настоящим изобретением могут удобным образом доставляться в форме презентации аэрозольного спрея из находящихся под давлением упаковок или распылителя, с подходящим пропеллентом (например, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторэтаном, диоксидом углерода или другим подходящим газом). В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозировки может быть определена посредством обеспечения клапана для
- 69 043810 доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи (составленные из, например, желатина) для применения в ингаляторе или инсуфляторе могут быть составлены содержащими порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Способы совместного введения или лечения вместе со вторым терапевтическим средством, например, цитокином, стероидом, химиотерапевтическим средством, антибиотиком или излучением, являются известными в данной области (см., например, Hardman et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of Therapeuticals, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeuticals for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner и Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy и Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Эффективное количество терапевтического средства может снижать симптомы на по меньшей мере 10%; на по меньшей мере 20%; по меньшей мере приблизительно 30%; по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50%.
Дополнительные терапии (например, профилактические или терапевтические средства), которые могут вводиться в комбинации с иммуноконъюгатами изобретения, могут вводиться с интервалом, с интервалом меньше 5 мин, с интервалом меньше 30 мин, с интервалом 1 ч, с интервалом приблизительно 1 ч, с интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 ч, с интервалом от приблизительно 2 до приблизительно 3 ч, с интервалом от приблизительно 3 до приблизительно 4 ч, с интервалом от приблизительно 4 до приблизительно 5 ч, с интервалом от приблизительно 5 до приблизительно 6 ч, с интервалом от приблизительно 6 до приблизительно 7 ч, с интервалом от приблизительно 7 до приблизительно 8 ч, с интервалом от приблизительно 8 до приблизительно 9 ч, с интервалом от приблизительно 9 до приблизительно 10 ч, с интервалом от приблизительно 10 до приблизительно 11 ч, с интервалом от приблизительно 11 до приблизительно 12 ч, с интервалом от приблизительно 12 до 18 ч, с интервалом от 18 до 24 ч, с интервалом от 24 до 36 ч, с интервалом от 36 до 48 ч, с интервалом от 48 до 52 ч, с интервалом от 52 до 60 ч, с интервалом от 60 до 72 ч, с интервалом от 72 до 84 ч, с интервалом от 84 до 96 ч, или с интервалом от 96 до 120 ч от иммуноконъюгатов изобретения. Две или более терапий могут вводиться в течение одного и того же посещения пациента.
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгаты изобретения могут быть составлены для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Для обеспечения того, что терапевтические соединения изобретения пересекают ВВВ (если желательно), они могут быть составлены, например, в виде липосом. По методам производства липосом, см., например, Патенты США № 4,522,811; 5,374,548; и 5,399,331. Липосомы могут содержать один или более фрагментов, которые селективно транспортируются в специфичные клетки или органы, и, таким образом, усиливают нацеленную доставку лекарственного средства (см., например, Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Примерные нацеливающие фрагменты включают фолат или биотин (см., например, Патент США № 5,416,016 на имя Low et al.); маннозиды (Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитела (Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); поверхностно-активный рецептор белка A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); см. также K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Изобретение предоставляет протоколы для введения фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгаты изобретения по отдельности или в комбинации с другими терапиями субъекту, нуждающемуся в этом. Терапии (например, профилактические или терапевтические средства) комбинированных терапий настоящего изобретения могут вводиться сопутствующим образом или последовательно субъекту. Терапия (например, профилактические или терапевтические средства) комбинированных терапий настоящего изобретения могут также вводиться циклически. Циклическая терапия включает введение первой терапии (например, первого профилактического или терапевтического средства) в течение периода времени, с последующим введением второй терапии (например, второго профилактического или терапевтического средства) в течение периода времени и повтор данного последовательного введения, т.е. цикла, чтобы уменьшить развитие резистентности к одной из терапий (например, средства), чтобы избежать или снизить побочные эффекты одной из терапий (например, средств), и/или чтобы улучшить эффективность действия терапий.
Терапии (например, профилактические или терапевтические средства) комбинированных терапий изобретения могут вводиться субъекту одновременно.
Термин одновременно не ограничен введением терапий (например, профилактических или терапевтических средств) точно в одно и то же время, но скорее означает то, что фармацевтическая композиция, содержащая антитела или их фрагменты изобретения вводится субъекту в последовательности и в пределах временного интервала таким образом, что антитела изобретения могут действовать вместе с другими терапией или терапиями для обеспечения увеличенного благоприятного эффекта, чем если бы они вводились иным образом. Например, каждая терапия может вводиться субъекту в одно время или последовательно в любом порядке в различные временные отметки; однако, если ее не вводят в одно и то же время, они должны вводиться достаточно близко по времени, так, чтобы обеспечить желательный
- 70 043810 терапевтический или профилактический эффект. Каждая терапия может вводиться субъекту отдельно, в любой подходящей форме и посредством любого подходящего пути. В различных вариантах осуществления, терапии (например, профилактические или терапевтические средства) вводят субъекту с интервалом меньше 15 мин, меньше 30 мин, меньше 1 ч, с интервалом приблизительно 1 ч, с интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 ч, с интервалом от приблизительно 2 до приблизительно 3 ч, с интервалом от приблизительно 3 до приблизительно 4 ч, с интервалом от приблизительно 4 до приблизительно 5 ч, с интервалом от приблизительно 5 до приблизительно 6 ч, с интервалом от приблизительно 6 до приблизительно 7 ч, с интервалом от приблизительно 7 до приблизительно 8 ч, с интервалом от приблизительно 8 до приблизительно 9 ч, с интервалом от приблизительно 9 до приблизительно 10 ч, с интервалом от приблизительно 10 до приблизительно 11 ч, с интервалом от приблизительно 11 до приблизительно 12 ч, с интервалом 24 ч, с интервалом 48 ч, с интервалом 72 ч, или с интервалом 1 неделя. В других вариантах осуществления, две или более терапий (например, профилактических или терапевтических средств) вводят в течение одного и того же посещения пациента.
Профилактические или терапевтические средства комбинированных терапий могут вводиться субъекту в одной и той же фармацевтической композиции. Альтернативно, профилактические или терапевтические средства комбинированных терапий могут вводиться одновременно субъекту в отдельных фармацевтических композициях. Профилактические или терапевтические средства могут вводиться субъекту посредством одного и того же или различных путей введения.
Данное изобретение, будучи полностью описанным, дополнительно иллюстрируется следующими примерами и формулой изобретения, которые являются иллюстративными и не означают дополнительное ограничение.
Примеры
Пример 1. Выбор поверхностных доступных участков для Cys мутации в тяжелой цепи IgG1 и каппа легкой цепи человека.
Экспонированные на поверхности остатки в константной области тяжелой цепи IgG1 человека и каппа легких цепей человека были идентифицированы в кристаллической структуре антитела hIgG1/каппа (структура Банка данных Белков вход 1HZH.pdb, табл. 6, 7, фиг. 1) с использованием компьютерной программы Surface Racer 5.0, как описано в Tsodikov et al, A novel computer program for fast exact calculation of accessible and molecular surface areas and average surface curvature, J. Comput. Chem., 23, 600-609 (2002). 88 остатков были выбраны для Cys-замены, 59 участков в hIgG тяжелой цепи и 29 в человеческой каппа легкой цепи, на основании следующих критериев: 1) выбор остатков в CH1, CH2 и CH3 доменах константных областей тяжелой цепи и константных областей легкой цепи; 2) выбор экспонированных на поверхности остатков, но обход полностью экспонированных остатков и С-концевой области, чтобы избежать образования димера между антителами; 3) сосредоточение внимания на полярных или заряженных остатках, таких как Ser, Thr, Lys, Arg, Glu, и Asp; и 4) исключение остатков в домене связывания FcRn, домене связывания Белка А, и шарнирной области тяжелой цепи.
Критерий 1) именно выбор участков Cys-замены в константной области антитела, подтверждения переносимости участков конъюгации к многим различным антителам. Критерий 2) основан на наблюдении образования димера между антителами для Cys-замен выступающим образом экспонированных остатков (остатки, исключенные на основании данного критерия, приведены в табл. 6). На основании кристаллической структуры IgG учитывали предполагаемую ориентацию боковой цепи Cys: остатки, для которых боковая цепь Cys может быть частично экранирована от взаимодействий с еще одним антителом, но все еще могут быть реакционноспособными по отношению к низкомолекулярной полезной нагрузке, обладали преимуществом над остатками с более крупной поверхностной доступностью, но с ориентацией, которая может обеспечить взаимодействия с крупной макромолекулой, такие как образование димера. Критерий 3) выполняли, чтобы дать преимущество консервативным мутациям, чтобы минимизировать дестабилизирующие эффекты мутаций на антитело. Аналогично, критерий 4) применяли, чтобы избежать функциональных изменений антитела, таких как эффекты на связывание FcRn и Белка А, которое может воздействовать на фармакокинетические свойства антитела или приводить к потере при манипуляции очистки, соответственно. Остатки, исключенные на основании критерия, 4 перечислены в табл. 6. Расположение 88 выбранных участков мутации в структурной модели hIgG1/каппа указывает на то, что выбранные участки являются поверхностно доступными (фиг. 2).
- 71 043810
Таблица 6
Поверхностная доступность аминокислотных остатков в тяжелой цепи IgG1 человека. Поверхностная доступность была рассчитана с использованием программы Surface Racer 5.0 и выражена в виде квадратных Ангстремов [А2]. Исключенные участки указывают на участки, которые исключают из выбора вследствие причин, указанных в примере 1. Выбранные участки представляют собой участки, которые _________ выбирают для замены на Cys в изобретении .___________
Ей номер Остаток Поверхностная доступность [A21 Причина для исключения (если применима) Выбранные участки
117 SER 128 HC-S117C
118 ALA 2
119 SER 79 HC-S119C
120 THR 71
121 LYS 136 НС-К121С
122 GLY 21
123 PRO 2
124 SER 40 HC-S124C
125 VAL 0
126 PHE 1
127 PRO 0
128 LEU 0
129 ALA 0
130 PRO 0
131 SER 0
132 SER 34 HC-S132C
133 LYS 87
134 SER 123 HC-S134C
135 THR 1
136 SER 183 HC-S136C
137 GLY 84
138 GLY 40
- 72 043810
139 THR 33 HC-T139C
140 ALA 0
141 ALA 0
142 LEU 0
143 GLY 0
144 CYS 0
145 LEU 0
146 VAL 0
147 LYS 0
148 ASP 1
149 TYR 0
150 PHE 0
151 PRO 0
152 GLU 52 HC-E152C
153 PRO 89 HC-P153C
154 VAL 10
155 THR 69 HC-T155C
156 VAL 0
157 SER 39 HC-S157C
158 TRP 0
159 ASN 4
160 SER 164 Димер
161 GLY 35 Димер
162 ALA 115 Димер
163 LEU 17
164 THR 125 HC-T164C
165 SER 183 HC-S165C
166 GLY 20
167 VAL 12
168 HIS 5
169 THR 60 HC-T169C
170 PHE 0
171 PRO 33 HC-P171C
172 ALA 9
-73 043810
173 VAL 0
174 LEU 68 HC-L174C
175 GLN 0
176 SER 162 HC-S176C
177 SER 68 HC-S177C
178 GLY 8
179 LEU 0
180 TYR 6
181 SER 0
182 LEU 2
183 SER 0
184 SER 0
185 VAL 0
186 VAL 0
187 THR 30
188 VAL 0
189 PRO 86 HC-P189C
190 SER 21
191 SER 127 HC-S191C
192 SER 17
193 LEU 0
194 GLY 18
195 THR 111 HC-T195C
196 GLN 79
197 THR 90 HC-T197C
198 TYR 0
199 ILE 25
200 CYS 0
201 ASN 8
202 VAL 0
203 ASN 22
204 HIS 0
205 LYS 217 HC-K205C
206 PRO 66
-74043810
207 SER 50 HC-S207C
208 ASN 91
209 THR 24
210 LYS 234 Димер
211 VAL 30
212 ASP 97 HC-D212C
213 LYS 70
214 LYS 146
215 ALA 0
216 GLU 79
217 PRO 0
218 LYS 4
219 SER 149
220 CYS 7
221 ASP 0 Шарнир
222 LYS 208 Шарнир
223 THR 112 Шарнир
224 HIS 1 Шарнир
225 THR 22 Шарнир
226 CYS 12 Шарнир
227 PRO 22 Шарнир
228 PRO 133 Шарнир
229 CYS 7 Шарнир
230 PRO 84 Шарнир
231 ALA 114 Шарнир
232 PRO 49 Шарнир
233 GLU 114 Шарнир
234 LEU 90
235 LEU 88
236 GLY 9
237 GLY 46
238 PRO 14
239 SER 9
240 VAL 0
-75 043810
241 РНЕ 0
242 LEU 0
243 РНЕ 1
244 PRO 34
245 PRO 0
246 LYS 55 HC-K246C
247 PRO 18
248 LYS 47
249 ASP 1
250 THR 0 Связывание FcRn
251 LEU 0
252 MET 53 Связывание Белка A, FcRn
253 ILE 155 Связывание Белка A
254 SER 157 Связывание Белка A, FcRn
255 ARG 103
256 THR 86 Связывание FcRn
257 PRO 0 Связывание FcRn
258 GLU 42 HC-E258C
259 VAL 0 Связывание FcRn
260 THR 0
261 CYS 0
262 VAL 0
263 VAL 0
264 VAL 0
265 ASP 11 Связывание FcRn
266 VAL 0
267 SER 10
-76043810
268 HIS 79
269 GLU 189 HC-E269C
270 ASP 23
271 PRO 20
272 GLU 152
273 VAL 19
274 LYS 138 HC-K274C
275 PHE 2
276 ASN 1
277 TRP 0
278 TYR 14
279 VAL 0
280 ASP 66
281 GLY 72
282 VAL 141
283 GLU 80
284 VAL 25
285 HIS 133
286 ASN 119 HC-N286C
287 ALA 67
288 LYS 182 HC-K288C
289 THR 5
290 LYS 177 HC-K290C
291 PRO 51
292 ARG 252 HC-R292C
293 GLU 83 HC-E293C
294 GLU 73 HC-E294C
295 GLN 170
296 TYR 29
297 ASN 61 Гликозилиро- вание
298 SER 125 Гликозилиро- вание
- 77 043810
299 THR 2 Гликозилиро- вание
300 TYR 28
301 ARG 18
302 VAL 0
303 VAL 10
304 SER 0
305 VAL 17
306 LEU 0
307 THR 27 Связывание FcRn
308 VAL 0 Связывание FcRn
309 LEU 122
310 HIS 4 Связывание Белка A
311 GLN 145 Связывание Белка A, FcRn
312 ASP 14
313 TRP 0
314 LEU 6 Связывание Белка А
315 ASN 151 Связывание Белка А
316 GLY 12
317 LYS 81
318 GLU 49
319 TYR 0
320 LYS 55 НС-К320С
321 CYS 0
322 LYS 78 НС-К322С
323 VAL 0
324 SER 0
325 ASN 0
326 LYS 213 НС-К326С
- 78 043810
327 ALA 10
328 LEU 9
329 PRO 158
330 ALA 96 HC-A330C
331 PRO 44
332 ILE 32
333 GLU 85 НС-ЕЗЗЗС
334 LYS 50 НС-К334С
335 THR 70 НС-Т335С
336 ILE 13
337 SER 15 HC-S337C
338 LYS 0
339 ALA 37
340 LYS 217 Связывание Белка A
341 GLY 37
342 GLN 235
343 PRO 42
344 ARG 98 HC-R344C
345 GLU 105
346 PRO 0
347 GLN 24
348 VAL 3
349 TYR 3
350 THR 0
351 LEU 0
352 PRO 38
353 PRO 0
354 SER 0
355 ARG 249 HC-R355C
356 ASP 53
357 GLU 0
358 LEU 36
359 THR 144 Димер
- 79 043810
360 LYS 114 HC-K360C
361 ASN 155
362 GLN 41 HC-Q362C
363 VAL 0
364 SER 0
365 LEU 0
366 THR 0
367 CYS 0
368 LEU 0
369 VAL 0
370 LYS 1
371 GLY 0
372 RHE 0
373 TYR 23
374 PRO 0
375 SER 29 HC-S375C
376 ASP 9
377 ILE 11
378 ALA 11
379 VAL 4
380 GLU 18 Связывание FcRn
381 TRP 0
382 GLU 22 HC-E382C
383 SER 1
384 ASN 147
385 GLY 102 Димер
386 GLN 161
387 PRO 99
388 GLU 4
389 ASN 189 HC-N389C
390 ASN 36 HC-N390C
391 TYR 44
392 LYS 82 HC-K392C
- 80 043810
393 THR 36 HC-T393C
394 THR 0
395 PRO 72
396 PRO 47
397 VAL 9
398 LEU 111 HC-L398C
399 ASP 0
400 SER 81 HC-S400C
401 ASP 68
402 GLY 29
403 SER 0
404 PHE 22
405 PHE 0
406 LEU 0
407 TYR 0
408 SER 0
409 LYS 0
410 LEU 0
411 THR 0
412 VAL 0
413 ASP 80 HC-D413C
414 LYS 83
415 SER 69 HC-S415C
416 ARG 53
417 TRP 0
418 GLN 108
419 GLN 177
420 GLY 39
421 ASN 35
422 VAL 81 HC-V422C
423 PHE 0
424 SER 2
425 CYS 0
426 SER 0
-81 043810
427 VAL 0
428 MET 0 Связывание FcRn
429 HIS 0
430 GLU 14
431 ALA 22
432 LEU 1
433 HIS 227 Связывание Белка A
434 ASN 126 Связывание Белка A, FcRn
435 HIS 28
436 TYR 54
437 THR 36
438 GLN 82
439 LYS 12
440 SER 62
441 LEU 2
442 SER 34
443 LEU 101
444 SER 70 Димер
- 82 043810
Таблица 7
Поверхностная доступность аминокислотных остатков в каппа легкой цепи человека. Поверхностную доступность рассчитывали, используя Surface Racer 5.0 и выражали в квадратных Ангстремах [А2]. Вы-
бра г ные уч Ей номер 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 асткиу Оста- ток LYS ARG THR VAL ALA ALA PRO SER VAL РНЕ ILE РНЕ PRO PRO SER ASP GLU GLN LEU LYS SER GLY THR ALA SER VAL VAL CYS LEU LEU ASN ASN PHE TYR PRO ARG GLU ALA казывают i Поверхностная доступность [A2] 90 49 148 77 16 50 2 39 0 0 0 0 0 0 0 90 51 0 21 230 101 12 41 0 0 0 0 0 0 0 5 18 0 0 3 55 117 7 а участки, Выбранные участки LC-K107C LC-R108C LC-T109C LC-A112C LC-S114C LC-D122C LC-E123C LC-T129C LC-R142C LC-E143C выбранн Ей номер 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 ые для з Оста- ток GLU SER VAL THR GLU GLN ASP SER LYS ASP SER THR TYR SER LEU SER SER THR LEU THR LEU SER LYS ALA ASP TYR GLU LYS HIS LYS VAL TYR ALA CYS GLU VAL THR HIS амены на Поверх- ностная доступ- ность [А2] 66 8 14 5 74 8 13 170 241 48 1 0 0 0 0 0 0 0 0 13 21 59 131 32 52 0 77 201 42 167 58 0 0 0 12 0 38 4 Cys в изобрете Выбранные участки LC-E161C LC-E165C LC-S168C LC-K169C LC-D170C LC-S182C LC-K183C LC-K188C LC-K190C LC-V191C LC-T197C нии
145 LYS 160 LC-K145C 199 GLN 127 LC-Q199C
146 VAL 11 200 GLY 11
147 GLN 22 201 LEU 17
148 TRP 0 202 ARG 343
149 LYS 48 203 SER 110 LC-S203C
150 VAL 0 204 PRO 69
- 83 043810
151 ASP 59 205 VAL 30
152 ASN 157 LC-N152C 206 THR 70 LC-T206C
153 ALA 51 207 LYS 44
154 LEU 117 LC-L154C 208 SER 47
155 GLN 26 209 PHE 5
156 SER 122 LC-S156C 210 ASN 44
157 GLY 114 211 ARG 89
158 ASN 19 212 GLY 15
159 SER 22 LC-S159C 213 GLU 107
160 GLN 36 214 CYS 58
Пример 2. Получение мутантных антител трастузумаб Cys.
ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей трастузумаб, были химически синтезированы и клонированы в два вектора экспрессии млекопитающих, pOG-HC и pOG-LC, которые содержат константные области человеческого IgGl и человеческой каппа легкой цепи, что приводило в результате к двум конструкциям дикого типа, pOG-трастузумаб НС и pOG-трастузумаб LC, соответственно. В векторах экспрессия конструкций тяжелой и легкой цепей антитела в клетках млекопитающих направляется CMV промотором. Векторы содержат синтетическую сигнальную последовательность из 24 аминокислот: MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA (SEQ ID NO: 99), в N-конце тяжелой цепи или легкой цепи для проведения их секреции из клеток млекопитающих. Сигнальную последовательность утверждали как эффективную при направлении секреции белка для сотен белков млекопитающих в 293 Freestyle™ клетках. Олигонуклеотид-направленный мутагенез использовали для получения Cysмутантных конструкций в трастузумаб. Были химически синтезированы 88 пар праймеров мутации (табл. 8), которые соответствуют 88 участкам Cys мутации, выбранным в константных областях тяжелой цепи и каппа легкой цепи человеческого IgGl, как описано в Примере 1. Смысловые и антисмысловые пары праймеров мутации смешивали перед ПЦР амплификацией. ПЦР реакции выполняли, применяя PfuUltra II Fusion HS ДНК Полимеразу (Stratagene) с pOG-трастузумаб НС и pOG-трастузумаб LC в качестве матриц. После ПЦР реакций, ПЦР продукты подтверждали на агарозных гелях, и обрабатывали DPN I с последующей трансформацией в клетках DH5a (Klocket al. (2009) Methods Mol Biol. 498:91-103).
Последовательности 88 Cys-мутантных конструкций подтверждали секвенированием ДНК. Аминокислотная последовательность непроцессированной тяжелой цепи трастузумаб дикого типа показана как SEQ ID NO: 1, а такая последовательность легкой цепи - как SEQ ID NO: 90. Кодируемые последовательности белка константной области 59 трастузумаб HCCys-мутантных конструкций (SEQ ID NO: 2 через SEQ ID NO: 60) и 29 трастузумаб LCCys-мутантных конструкций (SEQ ID NO: 61 - SEQ ID NO: 89) показаны в табл. 9 и табл. 10, соответственно. Аминокислотные остатки в тяжелой цепи человеческого IgGl и человеческой каппа легкой цепи нумеруют посредством Ен системы нумерации (Edelman et al, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63:78-85).
Таблица 8
Последовательности ДНК праймеров мутации, используемых для получения 88 Cys мутаций тяжелой и легкой цепей человеческого IgGl
Участки мутации Наименование праймера Последовательность SEQ ID NO.
LC-K107C LC-CYS-S1 GTGGAGATCTGTCGAACGGTGG CCGCTCCCAGCGTGTTCA 100
LC-CYS-A1 ACCGTTCGACAGATCTCCACCT TGGTACCCTGTCCGAAC 101
LC-R108C LC-CYS-S2 GGAGATCAAATGCACGGTGGCC GCTCCCAGCGTGTTCATCT 102
LC-CYS-A2 GCCACCGTGCATTTGATCTCCA CCTTGGTACCCTGTCCGA 103
LC-T109C LC-CYS-S3 GATCAAACGATGTGTGGCCGCT CCCAGCGTGTTCATCTTCC 104
LC-CYS-A3 GCGGCCACACATCGTTTGATCT CCACCTTGGTACCCTGTC 105
LC-A112C LC-CYS-S4 ACGGTGGCCTGTCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGA 106
-84043810
LC-CYS-A4 CACGCTGGGACAGGCCACCGTT CGTTTGATCTCCACCTTG 107
LC-S114C LC-CYS-S5 GCCGCTCCCTGCGTGTTCATCT TCCCCCCCAGCGACGAGCA 108
LC-CYS-A5 ATGAACACGCAGGGAGCGGCCA CCGTTCGTTTGATCTCCA 109
LC-D122C LC-CYS-S6 CCCCCAGCTGTGAGCAGCTGAA GAGCGGCACCGCCAGCGT 110
LC-CYS-A6 CAGCTGCTCACAGCTGGGGGGG AAGATGAACACGCTGGGA 111
LC-E123C LC-CYS-S7 С C GAG C GAG T G T GAG С T GAAGA GCGGCACCGCCAGCGTG 112
LC-CYS-A7 TTCAGCTGACAGTCGCTGGGGG GGAAGATGAACACGCTG 113
LC-T129C LC-CYS-S10 AGAGCGGCTGTGCCAGCGTGGT GTGCCTGCTGAACAACTT 114
LC-CYS-A10 CACGCTGGCACAGCCGCTCTTC AGCTGCTCGTCGCTGGGG 115
LC-R142C LC-CYS-S11 TCTACCCCTGTGAGGCCAAGGT GCAGTGGAAGGTGGACAA 116
LC-CYS-A11 TTGGCCTCACAGGGGTAGAAGT TGTTCAGCAGGCACACCA 117
LC-E143C LC-CYS-S12 TACCCCCGGTGTGCCAAGGTGC AGTGGAAGGTGGACAAC 118
LC-CYS-A12 ACCTTGGCACACCGGGGGTAGA AGTTGTTCAGCAGGCACA 119
LC-K145C LC-CYS-S13 CGGGAGGCCTGCGTGCAGTGGA AGGTGGACAACGCCCTGC 120
LC-CYS-A13 CACTGCACGCAGGCCTCCCGGG GGTAGAAGTTGTTCAGCA 121
LC-N152C LC-CYS-S14 AAGGTGGACTGTGCCCTGCAGA GCGGCAACAGCCAGGAGA 122
LC-CYS-A14 TGCAGGGCACAGTCCACCTTCC ACTGCACCTTGGCCTCCC 123
- 85 043810
LC-L154C LC-CYS-S15 GACAACGCCTGTCAGAGCGGCA ACAGCCAGGAGAGCGTCA 124
LC-CYS-A15 TGCCGCTCTGACAGGCGTTGTC CACCTTCCACTGCACCTTG 125
LC-S156C LC-CYS-S16 GCCCTGCAGTGTGGCAACAGCC AGGAGAGCGTCACCGAGCA 126
LC-CYS-A16 GCTGTTGCCACACTGCAGGGCG TTGTCCACCTTCCACTGCA 127
LC-S159C LC-CYS-S18 AGCGGCAACTGTCAGGAGAGCG TCACCGAGCAGGACAGCAA 128
LC-CYS-A18 CTCTCCTGACAGTTGCCGCTCT GCAGGGCGTTGTCCACCT 129
LC-E161C LC-CYS-S19 AACAGCCAGTGCAGCGTCACCG AGCAGGACAGCAAGGACT 130
LC-CYS-A19 GTGACGCTGCACTGGCTGTTGC CGCTCTGCAGGGCGTTGT 131
LC-E165C LC-CYS-S20 GAGCGTCACCTGTCAGGACAGC AAGGACTCCACCTACAGC 132
LC-CYS-A20 CTGTCCTGACAGGTGACGCTCT CCTGGCTGTTGCCGCTCT 133
LC-S168C LC-CYS-S21 GAGCAGGACTGCAAGGACTCCA CCTACAGCCTGAGCAGCA 134
LC-CYS-A21 GAGTCCTTGCAGTCCTGCTCGG TGACGCTCTCCTGGCTGT 135
LC-K169C LC-CYS-S22 GAG GAGAG С T G T GAG T С СAC С T ACAGCCTGAGCAGCACC 136
LC-CYS-A22 GTGGAGTCACAGCTGTCCTGCT CGGTGACGCTCTCCTGG 137
LC-D170C LC-CYS-S23 ACAG CAAG TAG T С СAC C TAGAG CCTGAGCAGCACCCTGAC 138
LC-CYS-A23 TAGGTGGACTACTTGCTGTCCT GCTCGGTGACGCTCTCCT 139
LC-S182C LC-CYS-S24 TGACCCTGTGCAAGGCCGACTA CGAGAAGCATAAGGTGTA 140
- 86 043810
LC-CYS-A24 GTCGGCCTTGCACAGGGTCAGG GTGCTGCTCAGGCTGTAG 141
LC-K183C LC-CYS-S25 GACCCTGAGCTGTGCCGACTAC GAGAAGCATAAGGTGTAC 142
LC-CYS-A25 TAGTCGGCACAGCTCAGGGTCA GGGTGCTGCTCAGGCTGT 143
LC-K188C LC-CYS-S26 GACTACGAGTGCCATAAGGTGT ACGCCTGCGAGGTGAC 144
LC-CYS-A26 ACCTTATGGCACTCGTAGTCGG CCTTGCTCAGGGTCAGG 145
LC-K190C LC-CYS-S27 GAGAAGCATTGCGTGTACGCCT GCGAGGTGACCCACCAG 146
LC-CYS-A27 GGCGTACACGCAATGCTTCTCG TAGTCGGCCTTGCTCAGG 147
LC-V191C LC-CYS-S28 AGCATAAGTAGTACGCCTGCGA GGTGACCCACCAGGGCCT 148
LC-CYS-A28 CAGGCGTACTACTTATGCTTCT CGTAGTCGGCCTTGCTCA 149
LC-T197C LC-CYS-S29 GCGAGGTGTGTCACCAGGGCCT GTCCAGCCCCGTGACCAA 150
LC-CYS-A29 CCCTGGTGACACACCTCGCAGG CGTACACCTTATGCTTCT 151
LC-Q199C LC-CYS-S30 GTGACCCACTGTGGCCTGTCCA GCCCCGTGACCAAGAGCT 152
LC-CYS-A30 GACAGGCCACAGTGGGTCACCT CGCAGGCGTACACCTTAT 153
LC-S203C LC-CYS-S31 GGCCTGTCCTGTCCCGTGACCA AGAGCTTCAACAGGGGCGA 154
LC-CYS-A31 GTCACGGGACAGGACAGGCCCT GGTGGGTCACCTCGCAGG 155
LC-T206C LC-CYS-S32 CAGCCCCGTGTGCAAGAGCTTC AACAGGGGCGAGTGCTAA 156
LC-CYS-A32 AAGCTCTTGCACACGGGGCTGG ACAGGCCCTGGTGGGTC 157
- 87 043810
HC-S117C HC-CYS-S1 CCGTCTCCTGCGCTAGCACCAA GGGCCCCAGCGTGTTC 158
HC-CYS-A1 GGTGCTAGCGCAGGAGACGGTG ACCAGGGTTCCTTGAC 159
HC-S119C HC-CYS-S2 TCCTCGGCTTGTACCAAGGGCC CCAGCGTGTTCCCCCTGG 160
HC-CYS-A2 CCCTTGGTACAAGCCGAGGAGA CGGTGACCAGGGTTCCTT 161
HC-K121C HC-CYS-S3 CTAGCACCTGTGGCCCCAGCGT GTTCCCCCTGGCCCCCA 162
HC-CYS-A3 GCTGGGGCCACAGGTGCTAGCC GAGGAGACGGTGACCAG 163
HC-S124C HC-CYS-S4 AGGGCCCCTGTGTGTTCCCCCT GGCCCCCAGCAGCAAGA 164
HC-CYS-A4 GGGGAACACACAGGGGCCCTTG GTGCTAGCCGAGGAGACG 165
HC-S132C HC-CYS-S5 CCCCCAGCTGCAAGAGCACCAG CGGCGGCACAGCCGCCCT 166
HC-CYS-A5 GGTGCTCTTGCAGCTGGGGGCC AGGGGGAACACGCTGGGG 167
HC-S134C HC-CYS-S6 AGCAGCAAGTGTACCAGCGGCG GCACAGCCGCCCTGGGCT 168
HC-CYS-A6 CCGCTGGTACACTTGCTGCTGG GGGCCAGGGGGAACACG 169
HC-S136C HC-CYS-S7 AGAGCACCTGTGGCGGCACAGC CGCCCTGGGCTGCCTGGT 170
HC-CYS-A7 GTGCCGCCACAGGTGCTCTTGC TGCTGGGGGCCAGGGGGA 171
HC-T139C HC-CYS-S8 AGCGGCGGCTGTGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTGAAGGACT 172
HC-CYS-A8 CAGGGCGGCACAGCCGCCGCTG GTGCTCTTGCTGCTGGGG 173
HC-E152C HC-CYS-S9 TACTTCCCCTGTCCCGTGACCG TGTCCTGGAACAGCGGA 174
- 88 043810
HC-CYS-A9 GGTCACGGGACAGGGGAAGTAG TCCTTCACCAGGCAGC 175
HC-P153C HC-CYS-S10 TCCCCGAGTGCGTGACCGTGTC CTGGAACAGCGGAGCCCT 176
HC-CYS-A10 CACGGTCACGCACTCGGGGAAG TAGTCCTTCACCAGGCAG 177
HC-T155C HC-CYS-S11 GAGCCCGTGTGCGTGTCCTGGA ACAGCGGAGCCCTGACCT 178
HC-CYS-A11 CAGGACACGCACACGGGCTCGG GGAAGTAGTCCTTCACCA 179
HC-S157C HC-CYS-S12 TGACCGTGTGCTGGAACAGCGG AGCCCTGACCTCCGGCGT 180
HC-CYS-A12 CTGTTCCAGCACACGGTCACGG GCTCGGGGAAGTAGTCCT 181
HC-T164C HC-CYS-S13 GGAGCCCTGTGCTCCGGCGTGC ACACCTTCCCCGCCGTGCT 182
HC-CYS-A13 ACGCCGGAGCACAGGGCTCCGC TGTTCCAGGACACGGTCA 183
HC-S165C HC-CYS-S14 CCCTGACCTGTGGCGTGCACAC CTTCCCCGCCGTGCTGCA 184
HC-CYS-A14 TGTGCACGCCACAGGTCAGGGC TCCGCTGTTCCAGGACAC 185
HC-T169C HC-CYS-S15 GCGTGCACTGCTTCCCCGCCGT GCTGCAGAGCAGCGGCCT 186
HC-CYS-A15 GGCGGGGAAGCAGTGCACGCCG GAGGTCAGGGCTCCGCTG 187
HC-P171C HC-CYS-S16 CACACCTTCTGTGCCGTGCTGC AGAGCAGCGGCCTGTACA 188
HC-CYS-A16 CAGCACGGCACAGAAGGTGTGC ACGCCGGAGGTCAGGGCT 189
HC-L174C HC-CYS-S17 CCGCCGTGTGTCAGAGCAGCGG CCTGTACAGCCTGTCCA 190
HC-CYS-A17 GCTGCTCTGACACACGGCGGGG AAGGTGTGCACGCCGGAG 191
- 89 043810
HC-S176C HC-CYS-S18 TGCTGCAGTGCAGCGGCCTGTA CAGCCTGTCCAGCGTGGT 192
HC-CYS-A18 ACAGGCCGCTGCACTGCAGCAC GGCGGGGAAGGTGTGCACG 193
HC-S177C HC-CYS-S19 CTGCAGAGCTGTGGCCTGTACA GCCTGTCCAGCGTGGTGA 194
HC-CYS-A19 TACAGGCCACAGCTCTGCAGCA CGGCGGGGAAGGTGTGCA 195
HC-P189C HC-CYS-S21 TGACAGTGTGCAGCAGCAGCCT GGGCACCCAGACCTACAT 196
HC-CYS-A21 CTGCTGCTGCACACTGTCACCA CGCTGGACAGGCTGTACA 197
HC-S191C HC-CYS-S22 TGCCCAGCTGCAGCCTGGGCAC С CAGAC C TAGAT С T G СAA 198
HC-CYS-A22 CCCAGGCTGCAGCTGGGCACTG TCACCACGCTGGACAGGCT 199
HC-T195C HC-CYS-S23 GCCTGGGCTGTCAGACCTACAT СTGСAACGTGAACСACAA 200
HC-CYS-A23 GTAGGTCTGACAGCCCAGGCTG CTGCTGGGCACTGTCACCA 201
HC-T197C HC-CYS-S24 G СAC С CAG TGC TAGAT С T G CAA CGTGAACCACAAGССCA 202
HC-CYS-A24 GCAGATGTAGCACTGGGTGCCC AGGCTGCTGCTGGGCACT 203
HC-K205C HC-CYS-S25 T GAAC СAC T G T С С CAG CAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGT 204
HC-CYS-A25 TGTTGCTGGGACAGTGGTTCAC GTTGCAGATGTAGGTCTGG 205
HC-S207C HC-CYS-S26 ACAAGCCCTGCAACACCAAGGT GGACAAGAGAGTGGAGC 206
HC-CYS-A26 CTTGGTGTTGCAGGGCTTGTGG T T CAC G T T G CAGAT G TAG 207
HC-D212C HC-CYS-S27 ACCAAGGTGTGCAAGAGAGTGG AGCCCAAGAGCTGCGACA 208
- 90 043810
HC-CYS-A27 CACTCTCTTGCACACCTTGGTG TTGCTGGGCTTGTGGTTCA 209
HC-K246C HC-CYS-S28 TCCCCCCCTGTCCCAAGGACAC CC T GAT GAT CAGCAGGA 210
HC-CYS-A28 GTCCTTGGGACAGGGGGGGAAC AGGAACACGGAGGGTCCG 211
HC-E258C HC-CYS-S29 AGGACCCCCTGCGTGACCTGCG TGGTGGTGGACGTGAG 212
HC-CYS-A29 CAGGTCACGCAGGGGGTCCTGC TGATCATCAGGGTGTCCT 213
HC-E269C HC-CYS-S30 T GAG С САС T G T GAG С CAGAG G T GAAGTTСAACTGGTACG 214
HC-CYS-A30 CTCTGGGTCACAGTGGCTCACG TCCACCACCACGCAGGTC 215
HC-K274C HC-CYS-S32 CCAGAGGTGTGCTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGG 216
HC-CYS-A32 CCAGTTGAAGCACACCTCTGGG TCCTCGTGGCTCACGTCCA 217
HC-N286C HC-CYS-S35 GAGGTGCACTGTGCCAAGACCA AGCCCAGAGAGGAGCAGT 218
HC-CYS-A35 GGTCTTGGCACAGTGCACCTCC ACGCCGTCCACGTACCAGT 219
HC-K288C HC-CYS-S36 СACAACGССTGTACGAAGССCA GAGAGGAGCAGTACAACA 220
HC-CYS-A36 GGCTTGGTACAGGCGTTGTGCA CCTCCACGCCGTCCACGT 221
HC-K290C HC-CYS-S37 G С CAAGAC С T G T С С CAGAGAG G AGCAGTACAACAGCACCT 222
HC-CYS-A37 CTCTCTGGGACAGGTCTTGGCG TTGTGCACCTCCACGCCGT 223
HC-R292C HC-CYS-S38 ACCAAGCCCTGTGAGGAGCAGT ACAACAGCACCTACAGGGT 224
HC-CYS-A38 CTGCTCCTCACAGGGCTTGGTC TTGGCGTTGTGCACCTCCA 225
- 91 043810
HC-E293C HC-CYS-S39 CAAGCCCAGATGCGAGCAGTAC AACAGCACCTACAGGGTG 226
HC-CYS-A39 GTACTGCTCGCATCTGGGCTTG GTCTTGGCGTTGTGCACCT 227
HC-E294C HC-CYS-S40 G С С СAGAGAG Т G Т СAG ТАСААС AGCACCTACAGGGTGGT 228
HC-CYS-A40 TTGTACTGACACTCTCTGGGCT TGGTCTTGGCGTTGTGCA 229
HC-K320C HC-CYS-S41 CAAGGAATACTGCTGCAAGGTC TCCAACAAGGCCCTGCCA 230
HC-CYS-A41 GACCTTGCAGCAGTATTCCTTG CCGTTCAGCCAGTCCTGGT 231
HC-K322C HC-CYS-S42 TACAAGTGCTGCGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCCA 232
HC-CYS-A42 GTTGGAGACGCAGCACTTGTAT TCCTTGCCGTTCAGCCAGT 233
HC-K326C HC-CYS-S43 GGTCTCCAACTGTGCCCTGCCA GСССССАТСGAAAAGACС 234
HC-CYS-A43 GGCAGGGCACAGTTGGAGACCT TGCACTTGTATTCCTTGC 235
НС-АЗЗОС HC-CYS-S44 GCCCTGCCATGTCCCATCGAAA AGACCATCAGCAAGGCCA 236
HC-CYS-A44 TTCGATGGGACATGGCAGGGCC TTGTTGGAGACCTTGCACT 237
НС-ЕЗЗЗС HC-CYS-S45 GCCCCCATCTGCAAGACCATCA GCAAGGCCAAGGGCCAGC 238
HC-CYS-A45 GATGGTCTTGCAGATGGGGGCT GGCAGGGCCTTGTTGGAGA 239
НС-К334С HC-CYS-S46 CCCATCGAATGCACCATCAGCA AGGCCAAGGGCCAGCCA 240
HC-CYS-A46 GCTGATGGTGCATTCGATGGGG GCTGGCAGGGCCTTGTTG 241
НС-Т335С HC-CYS-S47 TCGAAAAGTGCATCAGCAAGGC CAAGGGCCAGCCACGGGA 242
- 92 043810
HC-CYS-A47 CTTGCTGATGCACTTTTCGATG GGGGCTGGCAGGGCCTTGT 243
HC-S337C HC-CYS-S48 AGACCATCTGCAAGGCCAAGGG CCAGCCACGGGAGCCCCA 244
HC-CYS-A48 CCTTGGCCTTGCAGATGGTCTT TTCGATGGGGGCTGGCAGG 245
HC-R344C HC-CYS-S50 GGCCAGCCATGCGAGCCCCAGG TGTACACCCTGCCTCCAT 246
HC-CYS-A50 CTGGGGCTCGCATGGCTGGCCC TTGGCCTTGCTGATGGTCT 247
HC-R355C HC-CYS-S51 CTCCATCCTGCGACGAGCTGAC CAAGAACCAGGTGTСССT 248
HC-CYS-A51 CAGCTCGTCGCAGGATGGAGGC AGGGTGTACACCTGGGGCT 249
HC-K360C HC-CYS-S52 AGCTGACCTGCAACCAGGTGTC CCTGACCTGTCTGGTGA 250
HC-CYS-A52 CACCTGGTTGCAGGTCAGCTCG TCCCGGGATGGAGGCAGG 251
HC-Q362C HC-CYS-S53 CCAAGAACTGCGTGTCCCTGAC CTGTCTGGTGAAGGGCTT 252
HC-CYS-A53 TCAGGGACACGCAGTTCTTGGT CAGCTCGTCCCGGGATGGA 253
HC-S375C HC-CYS-S54 TTCTACCCCTGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACG 254
HC-CYS-A54 GGCGATGTCGCAGGGGTAGAAG С С С T T САС CAGACAG G T CA 255
HC-E382C HC-CYS-S55 TGGAGTGGTGCAGCAACGGCCA GССCGAGAACAACTACA 256
HC-CYS-A55 GGCCGTTGCTGCACCACTCCAC GGCGATGTCGCTGGGGTAG 257
HC-N389C HC-CYS-S56 AGCCCGAGTGCAACTACAAGAC CACCCCCCCAGTGCTGGA 258
HC-CYS-A56 CTTGTAGTTGCACTCGGGCTGG CCGTTGCTCTCCCACTCCA 259
- 93 043810
HC-N390C HC-CYS-S57 С С C GAGAAC Т G С ТACAAGAC СА CCCCCCCAGTGCTGGACA 260
HC-CYS-A57 GGTCTTGTAGCAGTTCTCGGGC TGGCCGTTGCTCTCCCACT 261
HC-K392C HC-CYS-S58 GAACААС ТАС Т G САС САС С С С С CCAGTGCTGGACAGCGAC 262
HC-CYS-A58 GGGGTGGTGCAGTAGTTGTTCT CGGGCTGGCCGTTGCTCT 263
HC-T393C HC-CYS-S59 ААСТАСAAGТGТАСССССССAG TGCTGGACAGCGACGGCA 264
HC-CYS-A59 TGGGGGGGTACACTTGTAGTTG TTCTCGGGCTGGCCGTTG 265
HC-L398C HC-CYS-S60 CCCCAGTGTGTGACAGCGACGG CAGCTTCTTCCTGTACA 266
HC-CYS-A60 GTCGCTGTCACACACTGGGGGG GTGGTCTTGTAGTTGTTCT 267
HC-S400C HC-CYS-S61 TGCTGGACTGCGACGGCAGCTT CTTCCTGTACAGCAAGCT 268
HC-CYS-A61 GCTGCCGTCGCAGTCCAGCACT GGGGGGGTGGTCTTGTAGT 269
HC-D413C HC-CYS-S62 TGACCGTGTGCAAGTCCAGGTG GCAGCAGGGCAACGTGTT 270
HC-CYS-A62 ACCTGGACTTGCACACGGTCAG С Τ Т GC Т GTACAGGAAGAAG 271
HC-S415C HC-CYS-S63 TGGACAAGTGCAGGTGGCAGCA GGGCAACGTGTTCAGCT 272
HC-CYS-A63 CTGCCACCTGCACTTGTCCACG GTCAGCTTGCTGTACAGG 273
HC-V422C HC-CYS-S64 AGGGCAACTGCTTCAGCTGCAG CGTGATGCACGAGGCCCT 274
HC-CYS-A64 GCAGCTGAAGCAGTTGCCCTGC TGCCACCTGGACTTGTCCA 275
- 94 043810
Таблица 9 Аминокислотные последовательности константных областей Cys-мутантных конструкций в тяжелой цепи человеческого IgG1. SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность непроцессированного трастузумаб (человеческий IgG1). SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 60 показывают последовательность ID номеров для 59 Cys-мутантных конструкций в тяжелой цепи человеческого IgG1, показывая только последовательности константной области.
SEQ ID NO:1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYA
DSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:2
CASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:3
SACTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 95 043810
SEQ ID NO:4
SASTCGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:5
SASTKGPCVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:6
SASTKGPSVFPLAPSCKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:7
SASTKGPSVFPLAPSSKCTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:8
SASTKGPSVFPLAPSSKSTCGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 96 043810
SEQ ID NO:9
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGCAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:11
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPECVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:12
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVCVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:13
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVCWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 97 043810
SEQ ID NO:14
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALCSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:15
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTCGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:16
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHCFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFCAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:18
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVCQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 98 043810
SEQ ID NO:19
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQCS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:20
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSC GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:21
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVCSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:22
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSCSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:23
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGCQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 99 043810
SEQ ID NO:24
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQCYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:25
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHCPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:26
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPCNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:27
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVCKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:28
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPCPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 100 043810
SEQ ID NO:29
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPCVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:30
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHCDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:31
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVCFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:32
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHCAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:33
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNACTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 101 043810
SEQ ID NO:34
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTCPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:35
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:36
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRCEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:37
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRECQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:38
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYCCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 102 043810
SEQ ID NO:39
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCCVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:40
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNCALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:41
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPCPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:42
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPICKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:43
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 103 043810
SEQ ID NO:44
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKCISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:45
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTICKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:46
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPCEPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:47
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSCEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:48
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTC NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 104 043810
SEQ ID NO:49
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NCVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:50
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:51
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWCSNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:52
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPECNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:53
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 105 043810
SEQ ID NO:54
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:55
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKCTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:56
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVCDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:57
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:58
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVCKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 106 043810
SEQ ID NO:59
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKCRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:60
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN CFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 290:
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:
291SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 292
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTC NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 293
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTC NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 294
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 295
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 107 043810
Таблица 10 Аминокислотные последовательности константной области 29 Cys-мутантных конструкций человеческой каппа легкой цепи. SEQ ID NO: 61 представляет собой последовательность константной области человеческой каппа легкой цепи дикого типа. SEQ ID NO: 62 - SEQ ID NO: 90 показывает последовательность ID номера для 29 Cys-мутантных конструкций в константной области человеческой каппа легкой цепи
SEQ ID NO:61
CRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:62
KCTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:63
KRCVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
I SEQ ID NO:64
KRTVACPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:65
KRTVAAPCVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:66
KRTVAAPSVFIFPPSCEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:67
KRTVAAPSVFIFPPSDCQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:68
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGCASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:69
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPCEAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:70
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPRCAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:71
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREACVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:72
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDCALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
- 108 043810
SEQ ID NO:73
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNACQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:74
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQCGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:75
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNCQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:76
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQCSVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:77
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTCQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:78
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
CKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:79
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SCDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:80
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKCSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:81
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLCKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:82
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSCADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:83
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYECHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
- 109 043810
SEQ ID NO:84
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHCVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:85 KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKCYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
I SEQ ID NO:86
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVCHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:87 KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHCGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:88 KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSCPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:89 KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVCKSFNRGEC SEQ ID NO:90 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSR FSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Пример 3. Перенос Cys мутаций тяжелой цепи и легкой цепи трастузумаб в различные антитела.
Для трастузумаб, все Cys мутации для присоединения полезных нагрузок лекарственного средства выбирали в константной области его тяжелой цепи человеческого IgG1 и человеческой каппа легкой цепи. Поскольку константные области антител являются высоко консервативными в первичной последовательности и структуре, Cys мутантные остатки, которые идентифицируют в качестве хороших участков присоединения полезной нагрузки в контексте трастузумаб, будут также служить в качестве предпочтительных остатков для присоединения в других антителах. Для демонстрации переносимости этих родовых участков конъюгации в другие антитела, авторы клонировали набор Cys мутаций в антитело 14090. Антитело 14090 представляет собой антитело с тяжелой цепью человеческого IgG1 и человеческой лямбда легкой цепью, которое связывается с целевым белком, отличным от трастузумаб. ДНК, кодирующую вариабельную область антитела 14090, клонировали в семь выбранных Cys мутантных плазмидных конструкций pOG трастузумаб НС (SEQ ID NO приведены в табл. 11) для замены вариабельных областей конструкций трастузумаб в плазмидах, как описано в Примере 2. В результате, аминокислотные последовательностей константных областей тяжелой цепи в соответствующих семи Cys конструкциях антитела 14090 и трастузумаб являются идентичными (фиг. 3). Последующие примеры показывают, что эти участки могут быть легко конъюгированы. Напротив, вследствие высокой степени подобия в первичных последовательностях и в третичных структурах для различных человеческих изотипов IgG (фиг. 4), Cys мутации в каппа легкой цепи трастузумаб могут легко переноситься в эквивалентные легкие цепи в человеческих антителах, содержащих тяжелые цепи различного изотипа. Таким же образом, участки, идентифицированные в константной области IgG1, могут переноситься в IgG2, IgG3 и IgG4.
Пример 4. Цистеиновые мутации в человеческих лямбда легких цепях.
Человеческие лямбда и каппа легкие цепи имеют небольшое подобие аминокислотных последовательностей (фиг. 5А). Мутации в лямбда легкой цепь антитела 14090 были выбраны на основе приблизительного сходства местоположений остатков в модели кристаллической структуры (Protein Databank structure вход 3G6D.pdb) Fab, содержащего человеческую лямбда легкая цепь в сравнении с желательными остатками в каппа легкой цепи трастузумаб (фиг. 5А и В). Семь дополнительных Cys-мутантных конструкций генерировали в плазмиду антитела 14090-лямбда легкой цепи, используя олигонуклеотиднаправленный мутагенез (Higuchi et al. 1988) в комбинации со стратегией клонирования PIPE (Klock и Lesley, 2009). Праймеры мутации, применяемые для генерации Cys точечных мутаций в лямбда легкой цепи, приведены в табл. 12. Секреция антитела 14090 также направляется синтетической сигнальной последовательностью из 24 аминокислот: MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA (SEQ ID NO: 99). Последовательности конструкций антитела 14090 Cys подтверждали секвенированием ДНК. Последовательность для константной области человеческой лямбда легкой цепи дикого типа показана как SEQ ID NO: 91. Последовательности кодируемого белка семи Cys-мутантных конструкций в легкой цепи (SEQ ID NO: 92 - SEQ ID NO: 98) показаны в табл. 13. Последующие примеры покажут, что эти Cys мутанты эффективно конъюгируются с полезной нагрузкой ADC. Поскольку все из этих мутантов находятся в константной
- 110 043810 области человеческой лямбда легкой цепи, эти участки конъюгации могут легко переноситься в другие антитела с лямбда легкими цепями.
Таблица 11
ID номера последовательностей Cys конструкций тяжелой цепи трастузумаб, применяемых для клонирования вариабельной области антитела 14090.
ID NO последовательности Cys конструкции трастузумаб НС
SEQ ID NO:5 iSEQ ID NO:8
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:18
SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:50
Таблица 12
Нуклеотидные последовательности праймеров, применяемых при мутагенезе семи Cys-мутантных конструкций в . лямбда легкой цепи человеческого IgG1
Участки мутации Наименование праймера Последовательность SEQ ID NO.
LC-A143C Seq-0017 CCGGGATGCGTGACAGTGGCCTGG AAGGCAGATAGC 276
Seq-0018 TGTCACGCATCCCGGGTAGAAGTC ACTTATGAGACA 277
LC-T145C Seq-0019 GCCGTGTGTGTGGCCTGGAAGGCA GATAGCAGCCCC 278
Seq-0020 GGCCACACACACGGCTCCCGGGTA GAAGTCACTTAT 279
LC-A147C Seq-0021 ACAGTGTGTTGGAAGGCAGATAGC AGCCCCGTCAAG 280
Seq-0022 CTTCCAACACACTGTCACGGCTCC CGGGTAGAAGTC 281
LC-K156C Seq-0023 CCCGTCTGTGCGGGAGTGGAGACC ACCACACCCTCC 282
Seq-0024 TCCCGCACAGACGGGGCTGCTATC TGCCTTCCAGGC 283
LC-V159C Seq-0025 GCGGGATGT GAGAC СAC СACAC С C TCCAAACAAAGC 284
Seq-0026 GGTCTCACATCCCGCCTTGACGGG GCTGCTATCTGC 285
LC-T163C Seq-0027 ACСАССTGTСССTCCAAACAAAGC AACAACAAGTAC 286
Seq-0028 GGAGGGACAGGTGGTCTCCACTCC CGCCTTGACGGG 287
LC-S168C Seq-0029 AAAC AAT G CAACAACAAG T AC G C G GCCAGCAGCTAT 288
Seq-0030 GTTGTTGCATTGTTTGGAGGGTGT GGTGGTCTCCAC 289
- 111 043810
Таблица 13 Аминокислотная последовательность константной области Cys-мутантных конструкций в лямбда легкой цепи антитела 14090
SEQ ID NO: 91 представляет собой последовательность для константной области человеческой лямбда легкой цепи дикого типа. SEQ ID NO: 91 - SEQ ID NO: 98 показывают последовательности 7 Cysмутантов в константной области лямбда легкой цепи человеческого антитела 14090 SEQ ID NO:91
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:92 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGCVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS I SEQ ID NO:93
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVCVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:94 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVCWKADSSPVKAGVETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:95 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVCAGVETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:96 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGCETTTPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:97 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTCPSKQS NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:98 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQC NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Пример 5. Экспрессия и очистка Cys мутантных антител в клетках 293 Freestyle™.
Cys мутанты антитела трастузумаб экспрессировали в клетках 293 Freestyle™ посредством совместной трансфекции плазмид тяжелой цепи и легкой цепи с использованием метода преходящей трансфекции, как описано ранее (Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 (2001)). ДНК плазмиды, применяемые при совместной трансфекции, получали, используя набор препаратов плазмид Qiagen в соответствии с протоколом изготовителя. Клетки 293 Freestyle™ культивировали в суспензии в средах для экспрессии Freestyle™ (Invitrogen) при 37°C под 5% CO2. В день перед трансфекцией, клетки разделяли на 0,7х106 клеток/мл в свежих средах. В день трансфекции, плотность клеток обычно достигала 1,5 х106 клеток/мл. Клетки трансфицировали смесью плазмид тяжелой цепи и легкой цепи при отношении 1:1, используя метод PEI (Meissner et al., 2001). Трансфицированные клетки дополнительно культивировали в течение пяти дней. Среду из культуры собирали центрифугированием культуральной жидкости при 2000xg в течение 20 мин и фильтровали через 0,2 микрометрические фильтры. Экспрессированные антитела очищали от профильтрованной среды, применяя Белок А-Сефарозу™ (GE Healthcare Life Sciences). Антитела типа IgG элюировали с колонки Белок А-Сефароза™ с использованием элюирущего буфера (рН 3,0) и немедленно нейтрализовали 1 М Tris-HCl (pH 8,0), с последующей заменой буфера на PBS.
Уровни экспрессии 88 мутантных антител Cys трастузумаб в преходящим образом трансфицированных 293 Freestyle™ являются сходными с уровнями экспрессии трастузумаб дикого типа, со средним выходом при 18,6 мг/л +/- 9,5 мг/л (табл. 14), позволяя предположить, что одиночные точечные мутации на выбранных участках не изменяют значительно удерживание экспрессированного антитела механизмом секреции клеток. Анализ очищенных Cys мутантных антител трастузумаб с использованием невосстанавливающего SDS PAGE показывает, что Cys мутантные антитела не образуют олигомеров дисульфидно-связанных сконструированными цистеинами (фиг. 6). Гель-фильтрация (фиг. 7) дополнительно подтверждает вывод, что все Cys мутантные антитела трастузумаб являются мономерными. Анализ мутантных антител с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ также позволяет предположить, что большинство Cys мутантных антител являются неотличимыми от трастузумаб дикого типа с точки зрения времени удерживания и гомогенности (фиг. 8). Анализ невосстановленного дегликозилированного непроцессированного трастузумаб LC-R108C посредством масс-спектрометрии (интактной ЖХ-МС) показал, что большинство антител было модифицировано двумя цистеинами (фиг. 9 и табл. 15). Эти наблюдения со
- 112 043810 гласуются с предшествующей публикацией, указывающей на то, что тиольную группу сконструированного цистеина в Cys мутантных антителах трастузумаб модифицируют цистеином, когда экспрессию проводят в клетках 293 freestyle™, и, что модификацию необходимо удалять восстановителями перед конъюгацией с любыми тиол-реакционноспособными реагентами (Chen, et al., mAbs 1:6, 563-571, 2009).
Cys мутантные антитела 14090 также экспрессировали в клетках 293 Freestyle™ посредством совместной трансфекции плазмид НС и LC, с использованием метода PEI, описанного (Meissner et al., 2001). Уровни экспрессии Cys мутантных антител 14090 являются аналогичными уровням экспрессии антитела 14090 дикого типа (табл. 16).
Таблица 14
Выход Cys мутантных антител трастузумаб, преходящим образом экспрессированных в клетках 293 Freestyle™. Выходы измеряли по УФ-поглощению при 280 нм после очистки с белком А
Cys мутант трастузумаб Очищенный АЬ (мг/л) Cys мутант трастузумаб Очищенный АЬ (мг/л)
HC-S117C 46, 9 HC-R355C 30, 1
HC-S119C 22,5 НС-К360С 32,0
НС-К121С 22,1 HC-Q362C 20,7
HC-S124C 17,8 HC-S375C 33,3
HC-S132C 30, 9 НС-Е382С 35, 3
HC-S134C 18, 6 HC-N389C 28,7
HC-S136C 21,2 HC-N390C 34,5
НС-Т139С 25, 9 НС-К392С 28,2
НС-Е152С 13, 0 НС-Т393С 6, 6
НС-Р153С 10, 8 HC-L398C 5, 1
НС-Т155С 18,4 HC-S400C 4,1
HC-S157C 16, 9 HC-D413C 27, 6
НС-Т164С 20,2 HC-S415C 10, 6
HC-S165C 20, 6 HC-V422C 5, 0
НС-Т169С 8,2 LC-K107C 11,0
НС-Р171С 24, 6 LC-R108C 27,0
HC-L174C 15, 2 LC-T109C 13, 1
HC-S176C 13,4 LC-A112C 10,5
HC-S177C 30, 0 LC-S114C 21,2
НС-Р189С 11,7 LC-D122C 25, 5
НС-К205С 13,3 LC-E123C 20, 1
HC-S207C 2,5 LC-T129C 7,1
HC-D212C 26, 5 LC-R142C 14, 6
НС-К246С 12,0 LC-E143C 10, 0
НС-Е258С 18,7 LC-K145C 13, 0
НС-Е269С 6, 3 LC-N152C 12,0
НС-К273С 20,7 LC-L154C 13, 1
HC-N286C 15, 0 LC-S156C 12,0
НС-К288С 20, 9 LC-S159C 26, 6
НС-К290С 20, 0 LC-E161C 20, 0
- 113 043810
Пример 6. Восстановление, повторное окисление и конъюгация Cys мутантных антител с MCMMAF.
Поскольку встроенные Cys в антителах, экспрессированных в клетках млекопитающих, модифицируют посредством аддуктов (дисульфидов), таких как глутатион (GSH) и/или Цистеин во время их биосинтеза (Chen et al. 2009), модифицированный Cys в продукте, первоначально экспрессированном, является нереакционноспособным по отношению к тиол-реакционноспособным средствам, таким как малеимидо или бром- или йод-ацетамидные группы. Чтобы конъюгировать встроенный цистеин после экспрессии, глутатионовые или цистеиновые аддукты необходимо удалить посредством восстановления этих дисульфидов, которое обычно влечет за собой восстановление всех дисульфидов в экспрессируемом белке. Это может выполняться посредством первоначального предоставления антитела воздействию восстановителя, такого как дитиотреитол (DTT), с последующей операцией, которая обеспечивает повтор
- 114 043810 ное окисление всех нативных дисульфидных связей антитела для восстановления и/или стабилизации структуры функционального антитела.
Соответственно, чтобы восстановить все нативные дисульфидные связи и дисульфидное связывание между цистеином или GSH аддуктами встроенного остатка цистеина, свежеприготовленный DTT добавляли к ранее очищенным Cys мутантам трастузумаб и антителу 14090, до конечной концентрации, равной 20 мМ. После инкубации антитела с DTT при 37°C в течение 1 ч, смеси диализовали при 4°C против PBS в течение трех дней с ежедневной заменой буфера для удаления DTT и повторно окислить нативные дисульфидные связи. Альтернативным методом является удаление восстановителя через обессоливающую колонку, Sephadex G-25. Как только белок полностью восстанавливают, 1 мМ окисленный аскорбат (дегидро-аскорбиновую кислоту) добавляют к обессоленным образцам и инкубации для повторного окисления выполняют в течение 20 ч. Оба метода приводили к аналогичным результатам. Однако, попытки следовать методикам переокисления, ранее описанным в литературе, с использованием CuSO4 приводили к осаждению белка. Во всех примерах в данном описании применяли методику диализа, описанную выше. Повторное окисление восстанавливает внутрицепочечные дисульфиды, в то время как диализ позволяет цистеинам и глутатионам, соединенным с вновь введенными цистеином (цистеинами), отдиализоваться.
После повторного окисления антитела являются готовыми для конъюгации. Малеимид-MMAF (MC-MMAF, 10 эквивалентов относительно антитела, фиг. 10) добавляли к повторно окисленным антителам в PBS буфере (рН 7,2). Инкубации проводили в течение от 1 до 24 ч. Процесс конъюгации регистрировали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ, которая может отделять конъюгированные антитела от неконъюгированных. Реакционные смеси конъюгации анализировали на колонке PRLP-S 4000A (50 мм х 2,1 мм, Agilent), нагретой при 80°C и элюирование колонки выполняли посредством линейного градиента из 30-60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% ТФУ при скорости потока, равной 1,5 мл/мин. Элюирование белков с колонки регистрировали при 280 нм, 254 нм и 215 нм. Хроматограмма обращенно-фазовой ВЭЖХ типовой конъюгационной смеси показана на фиг. 11.
Когда конъюгационные смеси анализировали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ, многие Cys участки генерировали гомогенные продукты конъюгации, как можно предположить по однородным профилям элюирования с одиночным пиком (фиг. 11), в то время как некоторые Cys участки генерировали гетерогенные продукты конъюгации (фиг. 12). Операции, описанные выше, включают в себя восстановление и повторное окисление нативных дисульфидных связей, а также восстановление связей между цистеином и GSH аддуктами сконструированных остатков цистеина. Во время процесса повторного окисления, сконструированный остаток цистеина может препятствовать повторному образованию надлежащих нативных дисульфидных связей посредством процесса дисульфидной перетасовки. Это может приводить к образованию несогласованных дисульфидных связей, либо между сконструированным цистеином и нативным остатком цистеина или между некорректно согласованных нативных дисульфидных связей. Такие несогласованные дисульфидные связи могут воздействовать на удерживание антитела на колонке обращенно-фазовой ВЭЖХ. Процессы рассогласования могут также приводить к неспаренным остаткам цистеина, отличным от желательного сконструированного цистеина. Присоединение малеимидMMAF к различным положениям в антителе воздействует на время удерживания различным образом (см. обсуждение гомогенно конъюгированных ADC ниже). В дополнение, неполное повторное окисление будет оставлять антитело с нативными остатками цистеина, которые будут взаимодействовать с малеимид-MMAF в дополнение к желательной конъюгации со сконструированным остатком цистеина. Любой процесс, который затрудняет надлежащее и полное образование нативных дисульфидных связей будет приводить к сложному профилю ВЭЖХ (фиг. 11) при конъюгации с Малеимид-MMAF. Выход однородного ADC, измеренный посредством УФ-поглощения неочищенных реакционных смесей, варьировал в зависимости от Cys мутаций (табл. 17). С использованием методики восстановления/повторного окисления и операций конъюгации, описанных выше, 65 из 88 Cys мутантных антител трастузумаб давали в результате гомогенные продукты конъюгации, и эти участки являются преимущественными участками для Cys замен, которые нужно сделать, при получении цистеин-сконструированные антител для конъюгации.
Эти 65 Cys-MMAF ADC анализировали подробно в различных аналитических тестах: Дифференциальную сканирующую флуориметрию (ДСФ) применяли для измерения термической стабильности. Аналитическую гель-фильтрацию (AnSEC) применяли для измерения агрегации. Антигензависимую активность по уничтожению клеток in vitro измеряли посредством анализов на жизнеспособность клеток, а фармакокинетические характеристики измеряли у мышей. Эти аналитические тесты и соответствующие результаты описаны более подробно ниже.
Чтобы оценить состояние агрегации трастузумаб Cys-MMAF ADC, ADC анализировали на колонке для гель-фильтрации (GE, Superdex 200, 3.2/30) при скорости потока, равной 0,1 мл/мин в PBS. Все 65 Cys-MMAF ADC были мономерными. Большинство ADC содержит меньше 10% олигомера (фиг. 13, табл. 18), указывая на то, что конъюгация MC-MMAF с Cys-мутантными конструкциями трастузумаб на выбранных участках не вызывала агрегацию антитела.
- 115 043810
Таблица 17
Выход MMAF ADC, генерируемых с Cys-мутантными конструкциями трастузумаб. Гетеро указывает на гетерогенную смесь образцов, показанную на обращенно-фазовой ВЭЖХ с различными значениями времени удерживания
трастузумаб Суз-ММАЕ ADC Выход (мг/л) Суз конструкция Выход (мг/л)
HC-S117C 6, 9 HC-R344C 33, 4
HC-S119C 15, 3 HC-R355C 24,3
НС-К121С 4,4 НС-К360С 26, 5
HC-S124C 13,2 HC-Q362C гетеро
HC-S132C Гетеро HC-S375C 34,3
HC-S134C Гетеро НС-Е382С 34, 9
HC-S136C Гетеро HC-N389C гетеро
НС-Т139С 11,1 HC-N390C 33, 1
НС-Е152С 7,8 НС-К392С 20, 8
НС-Р153С 8,2 НС-Т393С гетеро
НС-Т155С 12,9 HC-L398C 3,4
HC-S157C 13,5 HC-S400C 1,7
НС-Т164С 13,7 HC-D413C гетеро
HC-S165C Гетеро HC-S415C гетеро
НС-Т169С 4,7 HC-V422C 3, 6
НС-Р171С 14,7 LC-K107C 1, 6
HC-L174C 9, 1 LC-R108C 12,2
HC-S176C Гетеро LC-T109C 8,4
HC-S177C Гетеро LC-A112C гетеро
НС-Р189С 7,7 LC-S114C 16, 9
HC-S191C Гетеро LC-D122C Гетеро
НС-Т195С Гетеро LC-E123C Гетеро
НС-Т197С Гетеро LC-T129C 4,0
НС-К205С 11,3 LC-R142C 11,3
HC-S207C 1,0 LC-E143C 4,0
HC-D212C Гетеро LC-K145C 8,7
НС-К246С 9, 0 LC-N152C 7,2
- 116 043810
НС-Е258С 10, 1 LC-L154C 1,3
НС-Е269С 5, 6 LC-S156C 7,2
НС-К274С 15, 3 LC-S159C 12,3
HC-N286C 12, 9 LC-E161C 12, 0
НС-К288С 14,4 LC-E165C 2,0
НС-К290С 8,0 LC-S168C 3, 1
HC-R292C 10,3 LC-K169C 2,5
НС-Е293С 15, 0 LC-D170C 2,2
НС-Е294С Гетеро LC-S182C 7,9
НС-К320С 18,9 LC-K183C 3, 8
НС-К322С 29, 1 LC-K188C 7,2
НС-К326С 22,8 LC-K190C Гетеро
НС-АЗЗОС Гетеро LC-V191C Гетеро
НС-ЕЗЗЗС 7,4 LC-T197C 16, 4
НС-К334С 11,2 LC-Q199C 10, 3
НС-Т335С 5, 2 LC-S203C 13, 5
HC-S337C 1,4 LC-T206C Гетеро
Таблица 18
Процентное содержание олигомера в препаратах трастузумаб Cys-MMAF ADC, ______определенное посредством аналитической гель-фильтрации______
трастузумаб Cys-MMAF ADC Олигомер (%) Участок конъюгации Олигомер (%)
HC-S117C н. о. HC-R344C 9, 5
HC-S119C 3,2 HC-R355C н. о.
НС-К121С н. о. НС-К360С н. о.
HC-S124C н. о. HC-S375C н. о.
НС-Т139С 4,8 НС-Е382С н. о.
НС-Е152С н. о. HC-N390C н. о.
НС-Р153С н. о. НС-К392С н. о.
НС-Т155С н. о. HC-L398C н. о.
HC-S157C н. о. HC-S400C 9, 2
НС-Т164С н. о. HC-V422C н. о.
- 117043810
НС-Т169С н.о. LC-K107C н.о.
НС-Р171С н.о. LC-R108C н.о.
HC-L174C н.о. LC-T109C н.о.
НС-Р189С н.о. LC-S114C н.о.
НС-К205С н.о. LC-T129C н.о.
HC-S207C н.о. LC-R142C н.о.
НС-К246С н.о. LC-E143C 13, 1
НС-Е258С н.о. LC-K145C н.о.
НС-Е269С н.о. LC-N152C н.о.
НС-К274С 11,7 LC-L154C 7,3
HC-N286C 9, 2 LC-S156C 6, 1
НС-К288С н.о. LC-S159C 2,8
НС-К290С н.о. LC-E161C н.о.
HC-R292C н.о. LC-E165C н.о.
НС-Е293С н.о. LC-S168C н.о.
НС-К320С н.о. LC-K169C н.о.
НС-К322С н.о. LC-D170C н.о.
НС-К326С н.о. LC-S182C 6, 9
НС-ЕЗЗЗС н.о. LC-K183C н.о.
НС-К334С н.о. LC-K188C н.о.
НС-Т335С н.о. LC-T197C н.о.
HC-S337C н.о. LC-Q199C 6, 3
LC-S203C н.о.
н.о.: Ниже предела обнаружения.
Пример 7. Анализ термической стабильности трастузумаб Cys-MMAF ADC in vitro.
Конъюгация полезной нагрузки с трастузумаб может стабилизировать или дестабилизировать антитело, приводя к изменениям в температуре антитела, которые могут быть определены посредством дифференциальной сканирующей флуориметрии (ДСФ), которая основана на температурно-индуцированной денатурации, регистрируемой красителем, чувствительным к окружению, таким как сипро оранжевый. Образцы ADC отбирали аликвотами при трех повторностях в 384-луночные планшеты в PBS (6,7 мМ фосфата натрия рН 7,2; 150 мМ NaCl). В каждой лунке, 8 мкл 0,25 мг/мл антитела смешивали с 2 мкл 25х красителя сипро оранжевого (Invitrogen). Планшеты герметически закрывали и анализировали в системе Roche LightCycler 480 при линейном изменении температуры от 30 до 85°C с 20 сканированиями флуоресценции, регистрируемыми на градус С. Температуры плавления определяли по первой производной интенсивности флуоресцентности на температурных кривых.
Типовой анализ термического сдвига для трастузумаб дикого типа показал два перехода плавления (Tm), Tm1 при 69,7°C и Tm2 при 81,2°C, соответственно (табл. 19). Когда трастузумаб Cys-MMAF ADC подвергали аналитическим тестам на термическую стабильность белка, стало очевидным, что конъюгация MC-MMAF с антителами индуцировала различные изменения Tm в зависимости от участков конъюгации (табл. 19). Когда MC-MMAF конъюгировали с большинством Cys участков либо в СН1 или CH3 доменах, полученный в результате ADC, например HC-K356C-MMAF, показывал картину распределения, аналогичную картине дикого типа анти-Her с небольшими изменениями по Tm1 и Tm2. Однако, когда МС-MMAF конъюгировали с Cys участками, расположенными в СН2 домене, снижение Tm1 наблюдали для большинства участков, в то время, как Tm2 оставался в основном неизменным. Снижение Tm1, наблюдаемое для большинства СН2 доменов Cys-MMAF конъюгатов, находилось в интервале от 5°C до 26°C. Два ADC с наибольшим снижением Tm1 представляли собой HC-T335C-MMAF и HCS337C-MMAF, с Tm1 при 42°C и 45°C, соответственно (фиг. 14). Результаты показывают, что местоположение конъюгации MC-MMAF может иметь значительное воздействие на стабильность ADC.
- 118 043810
Таблица 19
Температуры плавления Tm1 и Tm2 трастузумаб Cys-MMAF ADC, наблюдаемые посредством дифференциальной сканирующей флуориметрии (ДСФ)
Трастузумаб Cys- MMAF ADC НС домен Tml [°C] Tm2 [°C]
дикого типа антитело н.п. 69,71 81,18
HC-S117C СН1 69, 09 79, 85
HC-S119C СН1 69,28 78,58
НС-К121С СН1 69, 63 78,52
HC-S124C СН1 69, 27 80,56
НС-Т139С СН1 69, 09 80,74
НС-Е152С СН1 69, 63 80, 83
НС-Р153С СН1 69,71 78,52
НС-Т155С СН1 69, 27 80, 83
HC-S157C СН1 69, 72 80, 81
НС-Т164С СН1 69, 17 80,7
НС-Т169С СН1 68,74 80,47
НС-Р171С СН1 69, 27 77, 18
HC-L174C СН1 69, 89 80, 03
НС-Р189С СН1 69, 09 81,27
НС-К205С СН1 69, 54 80, 65
HC-S207C СН1 69, 00 80, 65
НС-К246С СН2 64, 65 80,74
НС-Е258С СН2 65, 32 81,03
НС-Е269С СН2 65,36 81,01
НС-К274С СН2 67,14 81,09
HC-N286C СН2 67,22 81,09
НС-К288С СН2 65, 54 80, 83
НС-К290С СН2 69, 00 80, 65
HC-R292C СН2 67,49 80,56
НС-Е293С СН2 64,34 81,03
НС-К320С СН2 60, 60 80,59
НС-К322С СН2 62,41 80,70
НС-К326С СН2 63, 05 80,74
НС-ЕЗЗЗС СН2 63, 67 80, 92
НС-К334С СН2 64, 65 80,47
НС-Т335С СН2 42,93 80, 04
HC-S337C СН2 45, 56 80,48
HC-R344C СНЗ 69, 50 80, 92
HC-R355C СНЗ 68,18 81,25
- 119 043810
HC-K360C CH3 69,28 80, 92
HC-S375C CH3 68,20 81,36
HC-E382C CH3 69, 36 80,74
HC-N390C CH3 68,73 80, 92
HC-K392C CH3 67,05 80, 92
HC-L398C CH3 68,47 81,36
HC-S400C CH3 68, 65 81,27
HC-V422C CH3 69, 98 81,45
LC-K107C H . π . 69, 45 80,29
LC-R108C H . π . 70, 10 h . о, 1
LC-T109C H . π . 68,47 80,21
LC-T129C H . π . 68,47 80, 12
LC-R142C H . π . 69, 00 78, 61
LC-E143C H . π . 69, 83 80,59
LC-K145C H . π . 69, 00 80, 65
LC-N152C H . π. 67,49 81,09
LC-L154C H . π. 68,47 80, 65
LC-S156C H . π. 68,83 80,47
LC-S159C H . π. 69, 50 79, 93
LC-E161C H . π. 68, 65 80, 12
LC-E165C H . π. 69, 27 79,76
LC-S168C H . π. 69, 54 79, 67
LC-K169C H . П . 69, 09 80,29
LC-D170C H . П . 68,83 80, 12
LC-S182C H . П . 69, 18 80,29
LC-K183C H . П . 69, 09 80,47
LC-K188C H . П . 68,74 80, 65
LC-T197C H . П . 69, 63 80,74
LC-Q199C H . П . 69, 54 80,21
LC-S203C H . П . 68,84 80, 92
н.о. - не определено вследствие того, что широкий переход Tm2 препятствовал точному определению Tm, н.п. - не применимо.
Пример 8. Аналитические тесты на пролиферацию клеток для измерения активности по уничтожению клеток in vitro для Cys ADC.
Клетки, которые естественно экспрессируют целевые антигены, или клеточные линии, сконструированные для экспрессии целевых антигенов, часто применяют для анализа активности ADC. Для оценки активности по уничтожению клеток трастузумаб ADC in vitro, использовали две сконструированные клеточные линии, клон 16 и клон 40 MDA-MB231, и клетки НСС1954 (Clinchy В, Gazdar A, Rabinovsky R, Yefenof E, Gordon В, Vitetta ES. Breast Cancer Res Treat. (2000) 61:217-228). Клетки клона 16 MDAMB231 стабильно экспрессируют высокое число копий (~5х105 копий/клетку) рекомбинантных человеческих Her2, в то время, как клон 40 экспрессирует низкое число копий (~5х103 копий/клетку) человеческих Her2. Клетки НСС1954 эндогенно экспрессируют высокий уровень (~5х105 копий/клетку) человеческих Нег2 на поверхности. Для определения активности по уничтожению клеток антитела 14090 ADC, применяли клетки CMK11-5 и клетки линии лейкемических Т-лимфоцитов человека. В то время как CMK11-5 клетки экспрессируют высокий уровень антигена для антитела 14090 на клеточной поверхности, в клетках линии лейкемических Т-лимфоцитов человека нет никакой обнаруживаемой экспрессии антиген. Антигензависимый цитотоксический эффект должен уничтожать только клетки, которые экспрессируют достаточно антигена на клеточной поверхности, а не клетки, в которых отсутствует антиген. Аналитические тесты на пролиферацию клеток проводили с Cell-Titer-Glo™ (Promega) через пять дней после того, как клетки инкубировали с различными концентрациями ADC (Riss et al. (2004) Assay Drug Dev Technol. 2:51-62). В некоторых исследованиях, аналитические тесты на клеточной основе являются высокопроизводительными и проводятся в автоматизированной системе (Melnick et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA. 103:3153-3158).
- 120 043810
Трастузумаб Cys-MMAF ADC специфически уничтожал клон 16 клеток MDA-MB231 и НСС1954, но не клон 40 клеток MDA-MB231 (фиг. 15). IC50 трастузумаб Cys-MMAF ADC в аналитических тестах на клетках клона 16 MDA-MB231 находится в интервале от 30 пМ до 200 пМ (табл. 20, фиг. 16). Аналогично, антитело 14090 Cys-MMAF ADC проявлял антигензависимое уничтожение клеток в аналитических тестах на пролиферацию клеток. Антитело 14090 Cys-MMAF ADC уничтожал антигенэкспрессирующие клетки CMK11-5, но не антиген-отрицательные лейкемические Т-лимфоциты человека (фиг. 17). IC50 антитело 14090-MMAF ADC в аналитическом тесте на пролиферацию CMK11-5 находится в интервале от 400 пМ до 1 нМ (табл. 21).
Таблица 20
IC50 трастузумаб Cys-MMAF ADC в MDA-MB231 аналитическом тесте на пролиферацию клеток клона 16 Her2+
трастузумаб Cys- MMAF ADC 1С50 (мкМ) трастузумаб Cys-MMAF ADC ic50 (мкМ)
HC-S117C 1,55Е-04 HC-R344C 2,75Е-04
HC-S119C 1,18Е-04 HC-R355C 1,21Е-04
НС-К121С 1,06Е-04 НС-К360С 1,92Е-04
HC-S124C 9,78Е-05 HC-S375C 1,42Е-04
НС-Т139С 1,48Е-04 НС-Е382С 2,53Е-04
НС-Е152С 7,62Е-05 HC-N390C 1,58Е-04
НС-Р153С 9,27Е-05 НС-К392С 1,43Е-04
НС-Т155С 1,ЗЗЕ-04 HC-L398C 1,08Е-04
HC-S157C 1,47Е-04 HC-S400C 1,43Е-04
НС-Т164С 1,34Е-04 HC-V422C 1,72Е-04
НС-Т169С 1,98Е-04 LC-K107C 2,59Е-05
НС-Р171С 1,ЗЗЕ-04 LC-R108C 2,96Е-05
HC-L174C 1,19Е-04 LC-T109C 8,12Е-05
НС-Р189С 1,82Е-04 LC-S114C 3,37Е-05
НС-К205С 1,02Е-04 LC-T129C 2,73Е-05
HC-S207C 2,16Е-04 LC-R142C 2,64Е-05
НС-К246С 9,54Е-05 LC-E143C 3,76Е-05
НС-Е258С 9,40Е-05 LC-K145C 3,87Е-05
НС-Е269С 8,98Е-05 LC-N152C 2,14Е-05
НС-К274С 9,99Е-05 LC-L154C 3,52Е-05
HC-N286C 9,94Е-05 LC-S156C 4,28Е-05
НС-К288С 7,47Е-05 LC-S159C 4,34Е-05
НС-К290С 3,55Е-04 LC-E161C 3,62Е-05
HC-R292C 9,69Е-05 LC-E165C 4,68Е-05
НС-Е293С 1,10Е-04 LC-S168C 2,50Е-04
НС-К320С 9,79Е-05 LC-K169C 7,74Е-05
НС-К322С 1,16Е-04 LC-D170C 1,64Е-04
НС-К326С 1,73Е-04 LC-S182C 9,07Е-05
НС-ЕЗЗЗС 1,28Е-04 LC-K183C 8,39Е-05
НС-К334С 1,43Е-04 LC-K188C 9,71Е-05
НС-Т335С 8,69Е-05 LC-T197C 1,07Е-04
HC-S337C 7,79Е-05 LC-Q199C 1,31Е-04
LC-S203C 1,18Е-04
- 121 043810
Таблица 21
IC5o антитело 14090 Cys-MMAF ADC в аналитическом тесте на пролиферацию клеток CMK11-5
Антитело 14090 Cys-MMAF ADC 1С5о (мкМ)
HC-S124C 9,26Е-04
НС-Т139С 1,22Е-03
НС-Е152С 4,60Е-04
HC-L174C 6,02Е-04
НС-К360С 8,56Е-04
HC-S375C 4,38Е-04
LC-A143C 7,09Е-04
LC-A147C 1,14Е-03
LC-V159C 5,41Е-04
LC-T163C 6,38Е-04
LC-S168C 1,06Е-03
Пример 9. Фармакокинетическое исследование трастузумаб Cys-MMAF ADC.
Было продемонстрировано, что длительное время полужизни в сыворотке является решающим для высокой in vivo эффективности действия ADC (Hamblett, et al., Effects of drug loading on antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate Clin Cancer Res., 10:7063-7070 (2004); Alley et al., Bioconjug Chem. 19:759-765 (2008)). Обычно присоединение гидрофобной полезной нагрузки лекарственного средства к антителу может оказывать значительное воздействие на свойства антитела, и это может приводить к быстрому выведению ADC in vivo (Hamblettet al., 2004) и плохой эффективности действия in vivo. Чтобы оценить эффекты различных участков конъюгации на выведение MMAF ADC in vivo, фармакокинетические исследования на мышах, не имеющих опухоли, проводили с 65 трастузумаб Cys-MMAF ADC. Чтобы обнаружить MMAF, содержащие ADC в мышиной плазме, генерировали анти-MMAF. Были разработаны аналитические тесты ELISA для обнаружения ADC с использование внеклеточного домена человеческих HER2 для захвата трастузумаб IgG молекул из плазмы и антитела против человеческого IgG (анти-hIgG) и антитела против MMAF для генерации сигналов в двух раздельных аналитических тестах. В двух аналитических тестах ELISA измеряют сывороточную концентрацию антитела трастузумаб и интактного ADC соответственно, как более подробно обсуждается ниже.
Трем мышам на группу вводили однократную дозу трастузумаб Cys-MMAF ADC при 1 мг/кг. Десять образцов плазмы собирали в течение двух недель и анализировали посредством ELISA, используя внеклеточный домен человеческого HER2 для захвата всех молекул трастузумаб IgG, включающих трастузумаб Cys-MMAF ADC и трастузумаб без MMAF. Антитела против MMAF и против hIgG затем применяли для обнаружения в двух раздельных аналитических тестах. В ELISA с антитело против MMAF измеряли концентрацию только конъюгатов трастузумаб MMAF, а в ELISA с анти-hIgG количественно определяли как конъюгаты трастузумаб Cys-MMAF, так и антитела трастузумаб, в которых отсутствует MMAF. Стандартные кривые получали для каждого ADC, отдельно использую такой же материал, как инфицировали мышам. Аналитические тесты с анти-MMAF и анти-hIgG должны, следовательно, давать на выходе идентичные считывания концентраций, если никаких изменений по нагрузке лекарственным средством трастузумаб Cys-MMAF ADC не происходит после инъекции в мышей. Для трастузумаб CysMMAF ADC, который терял некоторое количество полезной нагрузки MMAF, в аналитическом тесте ELISA с анти-MMAF антителом будут измерять более низкую концентрацию, чем в ELISA с анти-hIgG. Сравнение двух считываний концентрации, следовательно, позволяет измерить высвобождение лекарственного средства из трастузумаб Cys-MMAF ADC во время инкубации in vivo в мышах.
Как было измерено посредством анти-hIgG ELISA, 63 из 65 ADC проявляли фармакокинетический профиль, аналогичный неконъюгированному антителу трастузумаб дикого типа (фиг. 18, 19, 20), указывая на то, что конъюгация полезной нагрузки МС-MMAF с этими участками не оказывает существенного воздействия на выведение антитела. Двумя исключениями являются НС-Т335С и HC-S337C. Конъюгация MC-MMAF с этими двумя участками приводит к быстрому выведению ADC, измеренному посредством ELISA с анти-MMAF и анти-hIgG (фиг. 21). Анализ термического сдвига белка показал, что Tm1 для трастузумаб HC-T335C-MMAF и трастузумаб HC-S337C-MMAF снижался от 69°C для антитела трастузумаб дикого типа до 42°C и 45°C, соответственно (фиг. 14). Конъюгация MC-MMAF с двумя участками резко снижает термическую стабильность ADC (на 27°C и 24°C, соответственно). Для 63 ADC, которые показывают фармакокинетический профиль, сходный с неконъюгированным антителом, изменения Tml составляли менее 8°C, позволяя предположить, что быстрое выведение может возможно коррелировать с низкой термической стабильностью ADC.
Чтобы определить химическую стабильность связывания между полезной нагрузкой MMAF и антителом на различных Cys участках, концентрации трастузумаб Cys-MMAF ADC, измеренные посредством
- 122 043810
ELISA с анти-MMAF и всех молекул трастузумаб, измеренные посредством ELISA с анти-hIgG, сравнивали друг с другом для каждого образца. Многие трастузумаб Cys-MMAF ADC, в пределах ошибки измерений, проявляли хорошее перекрывание между двумя концентрациями в течение двух недель, позволяя предположить, что связь между MC-MMAF и цистеином, введенным на этих участках была стабильной во время циркуляции у мышей в течение данного периода (фиг. 18, 19). Напротив, некоторые трастузумаб Cys-MMAF ADC проявляли существенную потерю лекарственного средства, на что указывает более высокое считывание анти-hIgG, чем считывание анти-MMAF (фиг. 20). Для некоторых трастузумаб Cys-MMAF ADC, концентрация ADC была равна приблизительно 50% от концентрации для hIgG. Эти результаты позволяют предположить, что существуют значительные различия по стабильности тиолмалеимидной связи полезных нагрузок лекарственного средства, конъюгированных с различными участками, как предполагалось ранее (Shen et al. Nat. Biotechnol. 2012, 30 (2):184-9). Участки, имеющие хорошую стабильность, являются предпочтительными участками для применения при получении ADC, как описано в данном документе.
При фармакокинетических исследованиях, площадь под кривой зависимости плазменной концентрации от времени (AUC) является важным параметром при оценке общего выведения и биодоступности вводимого лекарственного средства. В фармакокинетических исследованиях авторов, для каждого трастузумаб Cys-MMAF ADC два значения AUC, AUC-MMAF и AUC-hIgG, рассчитывали отдельно для измерений ELISA с анти-MMAF и анти-hIgG. Отношения AUC-MMAF к AUC-hIgG для всех трастузумаб Cys-MMAF ADC варьировали от 0,4 до 1,2 (табл. 20). Фиг 18, 19 и 20 включают ФК кривые для ADC на протяжении полного интервала наблюдаемых отношений AUC-MMAF/AUC-hIgG и иллюстрируют изменчивость и неопределенность измерений. Отношения AUC-MMAF к AUC-hIgG >1 (табл. 20) предполагают неопределенности >25%, поскольку отношение должно оставаться около 1, если не происходит никакой потери лекарственного средства. Как показано в табл. 20, из 63 трастузумаб Cys-MMAF ADC с измеряемыми AUC от обоих ELISA, 40 ADC показывают отношение AUC-MMAF/AUC-hIgG >0,7, указывая на то, что в пределах точности измерений, небольшую потерю лекарственного средства MMAF наблюдали у них после введения мышам. Однако, 23 ADC проявляли отношение AUC-MMAF/AUC-hIgG <0,7, позволяя предположить, что количество полезной нагрузки MMAF конъюгата на этих 23 участках значительно снизилось во время in vivo инкубации у мышей.
О различиях в стабильности малеимидной связи на различных участках конъюгации сообщалось ранее для Cys сконструированных ADC (см. Shen et al. (2012) Nat Biotechnol. 22;30(2):184-9 для обсуждения и ссылок). Для предпочтительных участков, которые проявляют увеличенную стабильность в сыворотке, окружение антитела вероятно катализирует гидролиз сукцинимидного кольца, образованного посредством реакции малеимида с цистеином. Гидролизованная форма не может вернуться назад и не может высвободить малеимидное лекарственное средство. Сама по себе, способность окружения антитела катализировать гидролиз кольца не может быть предсказана и является неожиданным свойством некоторых сконструированных Cys участков. Участки в табл. 22, имеющие отношение AUC(MMAF)/AUC(hIgG) более чем 0,7, являются, следовательно, особенно подходящими участками для замены на цистеин на основе данного критерия, а участки, имеющие отношение, равное приблизительно 0,9 или выше, являются особенно предпочтительными участками для замены на цистеин для целей изобретения, когда их применяют. Эти участки включают участки тяжелой цепи 322, 334, 121, 288, 171, 139, 360, 117, 392, 375, 292, 333, 174, 258, 337, 422, 320, 390 и 335; и участки легкой цепи 107, 203, 108 и 114.
Таблица 22
AUC-MMAF и AUC-hIgG трастузумаб Cys-MMAF ADC у мышей
Трастузумаб Cys- MMAF ADC AUC-MMAF (час*мкг/мл) AUC-hIgG (час*мкг/мл) AUC (MMAF) / AUC(hlgG)
HC-K246C-MMAF 1515 3587 0,4
HC-K205C-MMAF 2109 4893 0,4
LC-S168C-MMAF 1688 3619 0,5
LC-E143C-MMAF 1589 3254 0,5
HC-E382C-MMAF 1364 2541 0,5
HC-T155C-MMAF 2930 5308 0, 6
HC-S119C-MMAF 2230 4045 0, 6
LC-T129C-MMAF 2375 4332 0, 6
LC-T109C-MMAF 1588 2716 0, 6
LC-K169C-MMAF 2858 4855 0, 6
HC-S400C-MMAF 2363 3922 0, 6
HC-R355C-MMAF 2344 3777 0, 6
- 123 043810
HC-R344C-MMAF 1994 3215 0, 6
LC-Q199C-MMAF 2042 3261 0, 6
LC-S182C-MMAF 2434 3722 0,7
НС-Pl53C-MMAF 2201 3402 0,7
HC-N286C-MMAF 2286 3535 0,7
HC-T169C-MMAF 2113 3190 0,7
LC-K183C-MMAF 2014 3053 0,7
LC-T197C-MMAF 2126 3177 0,7
LC-K145C-MMAF 2339 3454 0,7
HC-L398C-MMAF 2063 2979 0,7
НС-Pl 89C-MMAF 2042 2968 0,7
HC-S157C-MMAF 2625 3640 0,7
HC-E269C-MMAF 2373 3293 0,7
LC-S159C-MMAF 2063 2809 0,7
LC-E161C-MMAF 1974 2632 0, 8
LC-E165C-MMAF 2481 3244 0, 8
HC-T164C-MMAF 2514 3290 0, 8
LC-R142C-MMAF 2903 3786 0, 8
LC-S156C-MMAF 2217 2847 0, 8
HC-S207C-MMAF 2378 3001 0, 8
LC-N152C-MMAF 2303 2862 0, 8
HC-E152C-MMAF 3403 4202 0, 8
LC-L154C-MMAF 1959 2387 0, 8
LC-K188C-MMAF 2230 2680 0, 8
HC-K326C-MMAF 2621 3157 0, 8
LC-D17OC-MMAF 2048 2420 0, 9
HC-K290C-MMAF 2668 3090 0, 9
HC-E293C-MMAF 2167 2523 0, 9
HC-S124C-MMAF 2107 2463 0, 9
HC-K274C-MMAF 3080 3554 0, 9
HC-K322C-MMAF 3108 3437 0, 9
HC-K334C-MMAF 4527 5048 0, 9
HC-K121C-MMAF 2647 2952 0, 9
HC-K288C-MMAF 2681 2902 0, 9
- 124 043810
НС-Pl71C-MMAF 2312 2481 0, 9
LC-K107C-MMAF 2621 2817 0, 9
HC-T139C-MMAF 2951 3186 0, 9
НС-КЗ60C-MMAF 3791 4014 0, 9
HC-S117C-MMAF 2661 2828 0, 9
LC-S203C-MMAF 2730 2919 0, 9
HC-K392C-MMAF 3148 3302 1,0
HC-S375C-MMAF 2593 2644 1, 0
HC-R292C-MMAF 2816 2806 1,0
HC-E333C-MMAF 3850 3796 1,0
НС-Ll74C-MMAF 2604 2541 1, 0
HC-E258C-MMAF 3941 3732 1, 1
HC-S337C-MMAF 34,38 32,14 1,1
HC-V422C-MMAF 2662 2424 1,1
НС-К320C-MMAF 3181 2776 1,2
HC-N390C-MMAF 3627 3105 1,2
LC-R108C-MMAF 3711 2992 1,2
LC-S114C-MMAF н.п. 2567 н.п.
HC-T335C-MMAF 6,71 н.п. н.п.
н.п.: не применимо.
Пример 10. Комбинация Cys участков для получения конгьюгатов антитела с лекарственным средством при отношениях лекарственного средства к антителу больших 2.
Конъюгаты антител, получаемые посредством конъюгации с остатками лизина или частично восстановленными нативными дисульфидными связями часто характеризуются отношениями лекарственного средства к антителу (DAR) между 3 и 4. Cys сконструированные антитела более обычно имеют DAR, равный 2. Для некоторых показаний, может быть желательным получать ADC с более высоким DAR, которое может в принципе достигаться посредством введения множества Cys мутаций в антитело. По мере роста числа Cys мутаций, вероятность того, что такие мутации препятствуют требуемому процессу повторного окисления во время получения ADC, и, следовательно, приводят к гетерогенным продуктам, также увеличивается. В данном исследовании, идентифицировали большое число Cys мутантов по одиночному участку тяжелой и легкой цепи с хорошим поведением при повторном окислении.
Чтобы продемонстрировать, что некоторые участки конъюгации могут объединяться для получения ADC с DAR, большим двух, несколько предпочтительных одиночных участков Cys конструкций легкой и тяжелой цепи трастузумаб и антитела 14090 (табл. 23) совместно экспрессировали в клетках 293 Freestyle™, как описано в Примере 5. Очищенные антитела, все из которых содержат одну Cys мутацию в тяжелой цепи и одну Cys мутацию в легкой цепи восстанавливали, повторно окисляли и конъюгировали с MC-MMAF, как описано в Примере 6. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография продемонстрировала единичный определенный пик элюирования, предполагая эффективное повторное окисления нативных дисульфидных связей. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография после конъюгации MC-MMAF также показала преобладающий единичный пик элюирования для видов ADC с DAR 4. DAR всех ADC в табл. 23 был подтвержден, как равный 4, посредством масс-спектрометрии. Выходы при получении варьировали от 16 до 24 мг/л преходящей культуры клеток. ADC, в-основном, являлись мономерными, как было определено посредством аналитической гель-фильтрации; только для 2 из 8 антител могли быть обнаружены агрегаты (табл. 23). Трастузумаб и 14090 ADC проявляли антиген-зависимое уничтожение клеток в аналитических тестах на пролиферацию клеток клона 16 MDA-MB231 и CMK1105, соответственно (табл. 23).
Таблица 23 ______Свойств Cys сконструированных MMAF ADC с DAR, равным 4______
Cys-MMAF ADC (DAR=4) LC SEQ ID NO HC SEQ ID NO Выход (мг/л) An SEC ЗМономер AnSEC %Мультимер IC50 MDA- MB231-16 клетки (мкМ) IC50 CMK11-5 клетки (мкМ)
трастузумаб LC-S159C- НС-Е258С 75 29 17,3 100 He обнаружено 4,91e-4 Нет активности
- 125 043810
трастузумаб LC-S159C- HC-S375C 75 50 17,8 100 Не обнаружено 2,44е-4 Нет активное ти
трастузумаб LC-E165C- НС-Е258С 77 29 16, 5 100 Не обнаружено 3,24е-4 Нет активности
трастузумаб LC-E165C- HC-S375C 77 50 16, 9 100 Не обнаружено 2,15е-4 Нет активности
Антитело 14090 LC- А143С-НС- К360С 92 48 16, 1 94,8 5,2 Нет активности 4,92е-4
Антитело 14090 LC- А143С-НС- S375C 92 50 21,8 100 Не обнаружено Нет активности 4,76е-4
Антитело 14090 LC- V159C-HC- К360С 96 48 24,0 100 Не обнаружено Нет активности 4,55е-4
Антитело 14090 LC- V159C-HC- S375C 96 50 21,7 97,1 2,9 Нет активности 3,99е-4
н.о.: не обнаруживаемо, нет активности: отсутствие признаков уничтожения клеток при наивысшей оцениваемой концентрации (66 нМ) SEQ ID NO только устанавливают константные области последовательностей антител.
Пример 11. Выбор Cys участков на основании гидрофобности ADC.
Для дополнительной оптимизации выбора Cys мутантов и комбинаций мутантов для получения ADC с DAR 2, 4, 6 и 8, анализировали свойства MMAF ADC, полученных с единственным участком у мутантов трастузумаб Cys и Pcl (Получение Pcl ADC описано в патентной заявке 55573), и доступность и воздействие растворителей на участки конъюгации проверяли на кристаллических структурах IgG.
Одним из наиболее информативных было наблюдение того, что гидрофобность трастузумаб PclMMAF ADC сильно варьировала, когда полезную нагрузку присоединяли на различных участках (фиг. 23). Гидрофобность этих ADC измеряли посредством хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ГВХ), используя колонку TSKgel Phenyl-5PW (Tosoh Bioscience, TSKgel Фенил-5PW, 13 мкм, 21x150 мм, нержавеющая сталь, Cat# 07656; промывочный буфер А: 1,5 М сульфат аммония в 20 мМ NaPi (pH7,4); буфер В: 20% изопропанол в 20 мМ NaPi (рН7,4); скорость потока 5 мл/мин; линейный градиент от 20 до 80% буфера В в течение 90 мин; регистрация посредством УФ-поглощения при 280 нм). Удивительно то, что наблюдали, что значения времени удерживания образцов с DAR 2 сильно варьировали между ADC, несмотря на то, что единственным различием являлся участок присоединения ABA-MMAF (фиг. 23). ГВХ разделяет молекулы на основе гидрофобности. Все ADC с DAR 2 имеют время удерживания при ГВХ больше, чем время удерживания неконъюгированного антитела (WT=45 мин, фиг. 23), что может быть ожидаемым, когда гидрофобная молекула лекарственного средства, такая как ABA-MMAF присоединяется к антителу. Однако, присоединение полезной нагрузки на различных участках увеличивает гидрофобность ADC в различной степени.
Удивительно большие различия в значениях времени удерживания могут быть рационально объяснены в результате проверки местоположения присоединения участков в структуре антитела (фиг. 24): значения времени удерживания являются более высокими, если полезная нагрузка лекарственного средства присоединяется на экспонированном участке с наружной стороны антитела, например на HCK288Pcl, HC-N286Pcl, HC-V422Pcl, HC-L398Pc1 и HC-S415Pcl, где значения времени удерживания между 87 и 94 мин измеряли для соответствующих ADC (фиг. 23). Напротив, если полезная нагрузка присоединяется на внутреннем участке, таком как полость, образованная между вариабельной областью и СН1 доменами (например, HC-P153Pcl, HC-E152Pcl, HC-L174Pcl, НС-Р171Рс1, LC-R142Pcl, LC-E161Pcl, LCE165Pcl, LC-S159Pcl) или большое отверстие между СН2 и CH3 доменами антитела (например, НСK246C, HC-S375Pcl, HC-T393Pcl, HC-K334Pcl), время удерживания при ГВХ увеличивалось до только 47-57 мин поскольку полезная нагрузка является частично ограниченной от взаимодействия с раствори
- 126 043810 телем и колонки ГВХ. Для других участков, например, относительно экспонированных участков, LCК107Рс1 и НС-К360Рс1, измеряли промежуточные значения времени удерживания, равные 70 и 83 мин.
Снижение гидрофобности белкового лекарственного средства обычно считают благоприятным, поскольку оно может понизить агрегацию и выведение из циркуляции. Авторы предполагают, что данные ГВХ, представленные на фиг. 23, обеспечивают выбор предпочтительных участков присоединения полезной нагрузки. Конъюгирование полезных нагрузок лекарственных средств на участках, где они ограничены от взаимодействий с растворителем и присоединения, минимально увеличивает гидрофобность антитела, что при присоединении лекарственного средства должно быть благоприятным независимо от химизма конъюгации и класса полезной нагрузки. Осторожный выбор участков присоединения, который приводит к минимальным изменениям гидрофобности, может быть особенно благоприятным, когда присоединяют 4, 6 или 8 лекарственных средств на антитело, или когда применяют особенно гидрофобные полезные нагрузки.
Cys участки, выбранные для ADC с низкой гидрофобностью.
Чтобы минимизировать гидрофобность ADC, выбирали участки, которые могли бы быть направлены в сторону внутренней части различных белковых доменов антитела. Выбор был основан на анализе структуры антитела и поведения существующих ADC с DAR=2, где это применимо (поведение = время удерживания на ГВХ и/или задержанное время удерживания на AnSEC с конъюгатами, которые взаимодействуют со смолами SEC). Из Cys участков, идентифицированных в табл. 1 и табл. 2, участки, приведенные в таблице 24 удовлетворяют приведенным выше критериям.
Все ADC анализировали посредством хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ГВХ). Трастузумаб MMAF ADC, конъюгированный на экспонированных участках НС-К36ОС, LC-K107C, HCЕ258С и HC-R292C, применяли для целей сравнения. Результаты показаны в табл. 25. трастузумаб CysMMAF ADC и неконъюгированное антитело дикого типа анализировали на колонке TSKgel Butyl-NPR, как описано ниже. Для сравнения, также приведены данные ГВХ, полученные ранее для Pcl-MMAF ADC на TSKgel Phenyl-5PW (фиг. 23). Несмотря на различные приборное оснащение и методики, и хотя ожидается некоторая изменчивость вследствие различных геометрии и структур двух линкеров, отношение значений времени удерживания для ADC, конъюгированных по одинаковому положению, но посредством различных методов конъюгации, остается почти постоянным. Данные ГВХ позволяют предположить, что значения времени удерживания несомненно являются мерой измерения того, насколько хорошо полезная нагрузка ограничена во внутренней части антитела независимо от химизма присоединения и структуры линкера. Как ожидалось, относительное ранжирование различных участков присоединения остается, в-основном, идентичным для Pcl-MMAF и Cys-MMAF ADC.
Присоединение к участку, выбранному в табл. 24, НС-Е333С, НС-К392С и НС-К326С приводит к MMAF ADC, которые имеют значения времени удерживания при ГВХ, которые являются сходными с такими значениями для ADC с экспонированными участками LC-K107C-MMAF, HC-E258C-MMAF, HCR292C-MMAF и HC-K360C-MMAF (табл. 28). Присоединение к участкам НС-Е152С, LC-E165C, HCР171С, LC-R142C, LC-E161C, HC-L174C и HC-S124C увеличивает время удерживания полученного в результате ADC на менее 15% в сравнении с неконъюгированным антителом дикого типа. Все эти участки расположены в СН1 домене или в легкой цепи (ЛЦ) и данные по времени удерживания при ГВХ позволяют предложить их в качестве предпочтительных участков присоединения. Из участков CH3 домена, HC-K334C и HC-S375C проявляют самое низкое увеличение гидрофобности при конъюгации, что делает их предпочтительными участками присоединения.
- 127 043810
Таблица 25 Значение времени удерживания при хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ГВХ) образцов трастузумаб MMAF ADC с DAR 2. При сравнении химизма конъюгации Cys и Pcl, два набора хорошо согласуются: участки, которые скрывают лекарственное средство, конъюгированное посредством одного химизма, также имеют тенденцию к скрытию лекарственного средства, когда их конъюгируют посредством другого химизма. Некоторая изменчивость является ожидаемой вследствие различной геометрии двух линкерных систем _____________________
Трастузумаб ADC DAR2 ГВХ удерживание3 (мин) Трастузумаб ADC DAR2 ГВХ удерживание13 (мин) Отношение
ДТ 19, 5 ДТ 45 0,43
НС-Е152С- MMAF 20,4 НС-Е152Рс1- MMAF 50 0,41
LC-E165C- MMAF 20, 8 LC-E165Pcl- MMAF 55 0,38
НС-Р171С- MMAF 21,0 НС-Р171Рс1- MMAF 51 0,41
НС-К334С- MMAF 21,5 НС-К334Рс1- MMAF 56 0,38
HC-S375C- MMAF 21, 6 HC-S375Pcl- MMAF 52 0,42
LC-R142C- MMAF 21,7 LC-R142Pcl- MMAF 51 0,42
LC-E161C- MMAF 22,0 LC-E161Pcl- MMAF 55 0,40
HC-L174C- MMAF 22,0 HC-L174Pcl- MMAF 50 0,44
HC-S124C- MMAF 22,4 HC-S124Pcl- MMAF 59 0,38
НС-ЕЗЗЗС- MMAF 23, 1 HC-E333Pcl- MMAF 63 0,37
НС-К392С- MMAF 23, 1 HC-K392Pcl- MMAF 60 0,38
HC-R292C- MMAF 23, 8 HC-R292Pcl- MMAF 69 0,35
НС-К326С- MMAF 24,5 HC-K326Pcl- MMAF 72 0,34
LC-K107C- MMAF 24,8 LC-K107Pcl- MMAF 70 0,35
НС-Е258С- MMAF 24,9 HC-E258Pcl- MMAF 69 0,36
НС-К360С- MMAF 26, 8 HC-K360Pcl- MMAF 83 0,32
a Аналитическая ГВХ: Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA, USA) колонка TSKgel Butyl-NPR (100 мм x 4,6 мм, 2,5 мкм), промывочый буфер А: 50 мМ фосфата натрия, 1,5 М сульфата аммония, рН 7,0; буфер В: 50 мМ фосфата натрия, рН 7,0; градиент состоял из 5 мин поддерживания 100% А, с последующим линейным градиентом от 20 до 100% В в течение 40 мин; регистрация посредством УФ-поглощения при 280 нм.
b Полу-преп ГВХ: Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA, USA), TSKgel Phenyl-5PW, 13 мкм, 21x150 мм; промывочный буфер А: 1,5 М сульфата аммония в 20 мМ NaPi (pH 7,4); буфер В: 20% изопропанола в 20 мМ NaPi (pH 7,4); скорость потока 5 мл/мин; линейный градиент от 20 до 80% буфера В в течение 90 мин; регистрация посредством УФпоглощения при 280 нм.
- 128 043810
Подробная методика аналитической ГВХ.
Данные аналитической ГВХ для трастузумаб Cys-MMAF ADC получали, используя Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA, USA) колонку TSKgel Butyl-NPR (100 мм x 4,6 мм, 2,5 мкм), установленную на Dionex UltiMate 3000 ВЭЖХ (Sunnyvale, CA, USA). Метод состоял из бинарного градиента буфера А (50 мМ фосфата натрия, 1,5 М сульфата аммония, рН 7,0) и буфера В (50 мМ фосфата натрия, рН 7,0). Образцы получали разбавлением приблизительно 50 мкг антитела (PBS) равным объемом 3 М сульфата аммония. Градиент состоял из 5 мин выдерживания при 100% А, с последующим линейным градиентом от 20 до 100% В в течение 40 мин и окончательного повторного уравновешивания при первоначальных условиях в течение 10 мин перед следующим инжектированием. Разделение регистрировали посредством УФ-поглощения при 280 нм.
Получение и характеризация Cys ADC с DAR 4, 6 и 8.
Cys мутации могут комбинироваться для получения ADC с DAR 4, 6 и 8. Как правило, предпочтительная комбинация представляет собой комбинацию из двух Cys мутаций, приводящих к ADC с DAR 4. Некоторые примеры, которые включают комбинирование Cys мутантной тяжелой цепи (НС) с Cys мутантной легкой цепью (LC) для получения ADC с DAR 4, показаны в примере 10 для трастузумаб и для антитела 14090. Дополнительные данные представлены в табл. 26. На основании данных ГВХ и проверки участков присоединения в кристаллических структурах IgG, были получены дополнительные Cys комбинации с использованием методик, описанных в примерах 2, 5 и 6. Данные для выбранных примеров MMAF ADC показаны в табл. 26. В дополнение, выбранные участки тяжелой цепи комбинировали и двойные Cys мутации тяжелой цепи клонировали, следуя методикам, приведенным в примере 2. Получали антитела, представляющие две НС Cys мутации и конъюгировали, следуя методикам, описанным в примере 5 и 6.
Для получения ADC с DAR 4, комбинации включают мутации по одиночному участку, приведенные в табл. 24. Комбинации одиночных участков приводили к ADC с низкой гидрофобностью (табл. 25). В некоторых комбинациях, одна Cys мутация расположена в СН1 домене или в легкой цепи, а второй участок расположен в CH3 домене. Примерами таких комбинаций являются антитела, представляющие комбинации Cys мутантов из НС-Е152С и HC-S375C и LC-E165C и HC-S375C и НС-Е152С и НС-К334С и LC-E165C и НС-К334С.
ADC с DAR 6 и 8 также могут быть получены, когда три или четыре Cys мутации комбинируют в одном антителе. Выбранные комбинации тяжелой цепи комбинировали для получения ADC с DAR 4, 6 и 8. Двойные и тройные Cys мутации тяжелой цепи клонировали, следуя протоколам, приведенным в примере 2. Антитела, представляющие две, три и четыре Cys мутации получали и конъюгировали, следуя методикам, описанным в примере 5 и 6. Характеристики некоторых примеров ADC с DAR 4, DAR 6 и DAR 8 обобщены в табл. 26. Некоторые из этих ADC имели удивительно хорошие ФК свойства, как показано на фиг. 25. Антитело 14090 является мышиным кросс-реакционноспособным и, следовательно, антитело 14090 ADC, как ожидают, выводятся более быстро, чем трастузумаб ADC, который не связывается с какими-либо мышиными антигенами.
Комбинации включают комбинации с тремя и четырьмя мутациями по единственному участку, приведенными в табл. 24. Комбинации включают те участки, которые приводят к ADC с низкой гидрофобностью (табл. 25). Комбинации включают одну Cys мутацию, расположенную в СН1 домене или в легкой цепи (LC), и необязательно дополнительные один-три участка находятся в CH3 домене. Примеры таких комбинаций включают антитела, представляющие комбинации Cys мутантов из НС-Е152С или LC-E165C, с HC-S375C, с НС-К334С и/или НС-К392С. Предпочтительные комбинации для получения ADC с DAR б и DAR 8 показаны в табл. 27 и табл. 28 соответственно.
С некоторыми исключениями, присоединение MMAF на всех исследованных Cys участках приводит к ADC с высокой термической стабильностью (Пример 7, табл. 19), низкой склонностью к агрегации (Пример 6, табл. 18) и хорошими фармакокинетическими свойствами ADC DAR 2 (Пример 9, табл. 22, фиг. 18). Различия ADC по гидрофобности, очевидно, не переводятся в большие различия в биофизических и фармакокинетических свойствах, когда применяют относительно растворимую полезную нагрузку, такую как MMAF. В действительности, как показано выше, MMAF ADC с DAR 4, DAR 6 и DAR 8 с приемлемыми фармакокинетическими свойствами могут быть получены даже с использованием экспонированных, гидрофобных участков, таких как НС-К36ОС в комбинации с более предпочтительными участками присоединения. Однако, при менее хороших характеристиках, когда применяют больше гидрофобных полезных нагрузок, осторожный выбор участков присоединения, которые приводят к минимальным изменениям в гидрофобности, может быть незаменимым, чтобы обеспечить получение неагрегирующих ADC с хорошими фармакокинетическими свойствами. Для таких гидрофобных полезных нагрузок, использование комбинации участков, которые снижают гидрофобность, увеличения могут быть благоприятными, когда присоединяют 4, 6 или 8 лекарственных средств на антитело.
- 129 043810
Таблица 26
Характеризация выбранных MMAF ADC с DAR 4, 6 и 8, полученных с комбинациями Cys мутаций
Наименование Cys-MMAF ADC DAR Мультимера AnSEC AUC MMAF/AUC hlgG
трастузумаб-НС-Е258С-ЪС-3159С-ММАГ 4, 0 н.о. 0, 9
трастузумаб-НС-3375С-ЬС-3159С-ММАЕ 4,0 н.о. 0, 8
трастузумаб-НС-Е258С-ЬС-Е165C-MMAF 4,0 н.о. 0, 9
трастузумаб-НС-3375С-ЬС-Е165C-MMAF 4, 0 н.о. 0, 8
трастузумаб-НС-Е152С-НС-Н142С-ММАЕ 3, 8 н.о. 0, 9
трастузумаб-НС-Р171С-ЬС-Н142С-ММАГ 3, 8 0, 1 1,1
трастузумаб-НС-Е152С-НС-3159С-ММАЕ 3, 8 н/а 0,7
Антитело 14090-HC-S375C-LC-A143C- MMAF 4, 0 н.о. 0, 9
Антитело 14090-HC-K360C-LC-V159C- MMAF 4, 0 н.о. 1,0
Антитело 14090-HC-S375C-LC-V159C- MMAF 4, 0 2,9 1, 0
трастузумаб-НС-К334С-3375C-LC- E165C-MMAF 6, 0 н.о. 0, 8
трастузумаб-НС-К334С-КЗ 92C-LC- E165C-MMAF 5, 8 11 0,4
трастузумаб-НС-К334С-КЗ 60C-S37 5C- LC-E165C-MMAF 8, 0 5 0, 6
трастузумаб-НС-К334С-КЗ60С-К392С- LC-E165C-MMAF 7, 8 н.о. 0, 8
трастузумаб-НС-К334С-3375С-К392С- LC-E165C-MMAF 8, 0 н.о. 0,7
* Расчеты AUC основаны ФК измерениях у мышей с использованием аналитических тестов ELISA с анти-MMAF и анти-IgG. н.о.; не обнаружено, ниже предела количественного определения.
Таблица 27
Предпочтительные комбинации Cys-участков для получения ADC с DAR 6
ADC комбинация Участок 1 Участок 2 Участок 3
1 НС-Е152С HC-S375C НС-К392С
2 НС-Е152С HC-S375C НС-К334С
3 НС-Е152С НС-К334С НС-К392С
4 LC-E165C HC-S375C НС-К392С
5 LC-E165C HC-S375C НС-К334С
6 LC-E165C НС-К334С НС-К392С
- 130 -

Claims (7)

  1. Таблица 28
    Предпочтительные комбинации Cys-участков для получения ADC с DAR 8
    ADC комбинация Участок 1 Участок 2 Участок 3 Участок 4
    1 НС-Е152С HC-S375C НС-К334С НС-К392С
    2 НС-Е152С HC-S375C НС-ЕЗЗЗС НС-К392С
    3 LC-E165C HC-S375C НС-К334С НС-К392С
    4 LC-E165C HC-S375C НС-ЕЗЗЗС НС-К392С
    Пример 12. Исследования эффективности действия трастузумаб Cys-MMAF ADC in vivo.
    Ксенотрансплантантные модели опухоли in vivo имитируют наблюдаемую биологическую активность посредством трансплантации соответствующих и хорошо охарактеризованных человеческих первичных опухолей или клеточных линий опухолей иммунодефицитным голым мышам. Исследования по обработке мышей с ксенотрансплантантами опухоли противораковыми реагентами позволили получить ценную информацию, касающуюся эффективности действия in vivo тестируемых реагентов (Sausville and Burger, 2006). Поскольку клетки MDA-MB231 клона 16 являлись чувствительными к трастузумаб CysMMAF ADC антигензависимым образом (фиг. 15), данную клеточную линию выбрали в качестве модели in vivo для оценки трастузумаб Cys-MMAF ADC. Все исследования на животных проводили в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (публикация NIH; National Academy Press, 8th edition, 2001). Клетки клона 16MDA-MB231 имплантировали nu/nu мышам подкожно (Morton and Houghton, 2007). После того, как размер опухоли достигал ~200 мм3, трастузумаб CysMMAF ADC вводили мышам посредством ВВ инъекции одной дозой при 3 мг/кг. Рост опухоли измеряли ежедневно после инъекции ADC. Каждая группа обработки включала 9 мышей. Пример исследования эффективности действия in vivo указан на фиг. 22 с тремя трастузумаб Cys-MMAF ADC. Обработка мышей 3 мг/кг трастузумаб Cys-MMAF ADC вызывала регресс опухоли для всех трех тестируемых CysMMAF ADC (фиг. 22). Не наблюдали никакой потери массы, ассоциированной с обработкой ADC. Результаты подтверждали, что при обработке однократной дозой при 3 мг/кг, трастузумаб Cys-MMAF ADC эффективно вызывали регресс опухолей MDA-MB231 клона 16.
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело IgG или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замену аминокислоты на цистеин в константной области тяжелой цепи в положении, соответствующему положению 152 тяжелой цепи IgG1, и где указанное положение нумеруют в соответствии с системой EU.
  2. 2. Иммуноконъюгат по п.1, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательность SEQ ID NO: 10.
  3. 3. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело IgG или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент антитела содержит замены двух аминокислот на цистеин в константной области тяжелой цепи в положениях, соответствующих положениям 152 и 375 тяжелой цепи IgG1, где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
  4. 4. Иммуноконъюгат по п.3, в котором указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит последовательность SEQ ID NO: 295.
  5. 5. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело IgG или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит комбинацию из замен трех аминокислот на цистеин в константной области тяжелой цепи, где комбинация содержит замены, выбранные из:
    a) положений, соответствующих положениям 152, 375 и 392 тяжелой цепи антитела IgG1,
    b) положений, соответствующих положениям 152, 334 и 375 тяжелой цепи антитела IgG1, и где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
  6. 6. Иммуноконъюгат, содержащий модифицированное антитело IgG или фрагмент этого антитела и фрагмент лекарственного средства, где указанное модифицированное антитело или фрагмент этого антитела содержит комбинацию из замен четырех аминокислот на цистеин:
    a) в константной области в положениях, соответствующих положениям 152, 334, 375 и 392 тяжелой цепи IgG1; или
    b) в константной области в положениях, соответствующих положениям 152, 333, 375 и 392 тяжелой цепи IgG1;
    где указанные положения нумеруют в соответствии с системой EU.
  7. 7. Иммуноконъюгаты по любому из предшествующих пунктов, имеющие отношение лекарственно
    - 131 -
EA201591465 2013-02-08 2014-02-07 Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов EA043810B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61/762,563 2013-02-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043810B1 true EA043810B1 (ru) 2023-06-26

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11596695B2 (en) Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
EP3960767A2 (en) Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
EP2855520B1 (en) Site-specific labeling methods and molecules produced thereby
WO2014124258A2 (en) Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
TW201406780A (zh) 抗－Ｌｙ６Ｅ抗體及免疫結合物及其使用方法
ES2930255T3 (es) Anticuerpos anti-Ror2, fragmentos de anticuerpos, sus inmunoconjugados y usos de los mismos
US20240189439A1 (en) Antibodies to pmel17 and conjugates thereof
CA3118542A1 (en) Cdcp1-targeted therapies
EA043810B1 (ru) Специфичные участки для модификации антител для получения иммуноконъюгатов
CA3227515A1 (en) Biopharmaceutical compositions and stable isotope labeling peptide mapping method