TW201406780A - 抗－Ｌｙ６Ｅ抗體及免疫結合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗-Ly6E抗體、免疫結合物及其使用方法。

Description

抗-Ly6E抗體及免疫結合物及其使用方法 相關申請案交叉參考
本申請案主張於2012年5月21日提出申請之美國臨時專利申請案第61/649,775號之權益，該案件以引用方式完全併入本文中。
本發明係關於抗-Ly6E抗體及免疫結合物及其使用方法。
淋巴細胞抗原6複合體基因座E(Ly6E)(亦稱作視黃酸)誘導基因E(RIG-E)及幹細胞抗原2(SCA-2)。其係GPI連接、131個胺基酸長度、無已知結合配偶體之未知功能的約8.4kDa蛋白質。其最初鑒定為在小鼠未成熟胸腺細胞、胸腺髓質上皮細胞中表現之轉錄本。在急性前髓細胞性白血病細胞分化期間視黃酸誘導RIG-E(鼠類Ly-6家族之人類同源物)。Mao M.、Yu M.、Tong J.-H.、Ye J.、Zhu J.、Huang Q.-H.、Fu G.、Yu L.、Zhao S.-Y.、Waxman S.、Lanotte M.、Wang Z.-Y.、Tan J.-Z.、Chan S.-J.、Chen Z.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：5910-5914(1996)。
業內需要靶向Ly6E用於診斷及治療Ly6E相關性病況(例如癌症)之藥劑。本發明滿足該需要且提供其他益處。
本發明提供抗-Ly6E抗體、免疫結合物及其使用方法。
在一些實施例中，提供與Ly6E結合之分離抗體。在其他實施例中，與Ly6E結合之抗體結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內的表位。在另一實施例中，該抗體以如藉由斯卡查德分析(scatchard analysis)量測之4nM之親和力結合Ly6E。在另一實施例中，該抗體以如藉由表面電漿共振(SPR)量測之7nM之親和力結合Ly6E。在又一實施例中，該抗體用作藥劑。
在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位、以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合、或以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合Ly6E的抗體係單株抗體。在另一實施例中，該抗體係人類、人類化或嵌合抗體。
在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位的抗體以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合，且在結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之該表位後於表現Ly6E之細胞中內化。在另一實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位之抗體以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合Ly6E且在結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之該表位後於表現Ly6E之細胞中內化。
在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位之抗體以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合或以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合Ly6E，其中該抗體包含(a)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，(b)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9，及(c)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11。在另一實施例中，該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。在又一實施例中，上述抗體進一步包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。在又一實施例中，該抗體包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。
在一個實施例中，對於包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12及(d)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(e)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11及(f)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，其進一步包含輕鏈可變結構域框架FR2序列SEQ ID NO：20或輕鏈可變結構域框架FR3 SEQ ID NO：21或重鏈可變結構域框架FR1 SEQ ID NO：23或重鏈可變結構域框架FR2 SEQ ID NO：24。
在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位之抗體以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合或以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合Ly6E，且包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在另一實施例中，該抗體包含VH序列SEQ ID NO：5。在又一實施例中，該抗體進一步包含VL序列SEQ ID NO：3。
在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位的抗體以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合，包含VH序列SEQ ID NO：5及VL序列SEQ ID NO：3。在另一實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位的抗體以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合，包含VH序列SEQ ID NO：5及VL序列SEQ ID NO：3。
在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位的抗體以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合，該抗體係IgG1、IgG2a或IgG2b。在一個實施例中，結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位的抗體以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合，該抗體係IgG1、IgG2a或IgG2b。
在一個實施例中，提供編碼如本文所述抗體之分離核酸。在另一實施例中，亦提供包含該分離核酸之宿主細胞。在又一實施例中，亦提供產生抗體之方法，該方法包含培養包含如本文所述分離核酸之宿主細胞以便產生抗體。
在一個實施例中，提供包含如本文所述抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。在另一實施例中，該免疫結合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab係如本文所述抗體；(b)L係連接體；(c)D係選自類美坦生(maytansinoid)、奧裏斯他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯二氮呯及奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物之藥物；及(d)p在1至8範圍內。在一些實施例中，該免疫結合物具有呈奧裏斯他汀形式之D。在其他實施例中，該免疫結合物具有具有式DE之D：
其中R2及R6各自係甲基，R3及R4各自係異丙基，R5係H，R7係第二丁基，每一R8獨立地選自CH3、O-CH3、OH及H；R9係H；且R18係-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
在其他實施例中，本文所述免疫結合物具有具有以下結構之MMAE作為其藥物：
在一個實施例中，本文所述免疫結合物具有呈式A之吡咯并苯二氮呯形式之D： 其中虛線指示在C1與C2之間或C2與C3之間可視需要存在之雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11係H或R，或其中Q係O、SO3M，其中M係金屬陽離子；R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況在與基團NRR’之關係中，R及R’與其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4-、5-、6-或7員雜環；R12、R16、R19及R17分別係如針對R2、R6、R9及R7所定義；R”係C3-12伸烷基，該鏈可穿插一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳香族環；且X及X’獨立地選自O、S及N(H)。在一些實施例中，如本文所述免疫結合物D具有結構：
其中n係0或1。
在一個實施例中，如本文所述免疫結合物D係奈莫柔比星衍生物。在另一實施例中，D具有選自以下之結構：
在一個實施例中，如本文所述免疫結合物包含可由蛋白酶裂解之連接體。在其他實施例中，連接體包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在又一實施例中，免疫結合物包含酸不穩定之連接體。在其他實施例中，連接體包含腙。
在一個實施例中，免疫結合物具有選自以下之式：
其中S係硫原子；
在一些實施例中，p在2至5範圍內。
在一個實施例中，如本文所述之本發明免疫結合物包含含有以 下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11，(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(f)HVR-I3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。在另一實施例中，如本文所述之本發明免疫結合物包含VH序列SEQ ID NO：5及VL序列SEQ ID NO：3。
在一個實施例中，提供包含如本文所述之本發明免疫結合物及醫藥上可接受之載劑的醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含額外治療劑。在一些實施例中，額外治療劑係化學治療劑，例如鉑複合體。
在一個實施例中，提供治療患有Ly6E-陽性癌症之個體之方法。在一些實施例中，該等方法包含投與包含如本文所述之本發明免疫結合物的醫藥調配物，該免疫結合物包含結合(例如)如本文所述之Ly6E的抗體。在其他實施例中，Ly6E-陽性癌症係選自乳癌、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌或胃癌。在一些實施例中，本發明方法包含向個體投與額外治療劑。在一些實施例中，額外治療劑係化學治療劑，例如鉑複合體。
在一些實施例中，提供抑制Ly6E-陽性細胞增殖之方法。在一個實施例中，該等方法包含在容許將免疫結合物結合至細胞表面上之Ly6E的條件下將Ly6E-陽性細胞暴露於如本文所述之包含結合Ly6E之抗體之本發明免疫結合物。在一些實施例中，結合Ly6E之抗體係如本文所述抗體。在一些實施例中，藉此抑制Ly6E-陽性細胞之增殖。在一些實施例中，細胞系乳癌細胞、胰臟癌細胞、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、黑色素瘤細胞、卵巢癌細胞、非小細胞肺癌細胞或胃癌細胞。
在一個實施例中，結合如本文所述Ly6E之抗體係與標記物結 合。在一些實施例中，該標記物係正電子發射體。在一些實施例中，正電子發射體係89Zr。
在一些實施例中，提供檢測生物試樣中之人類Ly6E之方法。在一些實施例中，該方法包含使生物試樣與抗-Ly6E抗體在容許抗-Ly6E抗體結合至天然存在之人類Ly6E的條件下接觸及檢測生物試樣中是否在抗-Ly6E抗體與天然存在之人類Ly6E之間形成複合體。在一些實施例中，抗-Ly6E抗體係本文所述抗體。在一些實施例中，生物試樣係乳癌試樣、胰臟癌試樣、結腸癌試樣、結腸直腸癌試樣、黑色素瘤試樣、卵巢癌試樣、非小細胞肺癌試樣或胃癌試樣。
在一個實施例中，提供檢測Ly6E-陽性癌症之方法。在該等實施例中，方法包含(i)向患有或懷疑患有Ly6E-陽性癌症之個體投與經標記抗-Ly6E抗體，及(ii)檢測個體中之經標記抗-Ly6E抗體，其中經標記抗-Ly6E抗體之檢測指示個體中之Ly6E-陽性癌症。在一些實施例中，抗-Ly6E抗體係本文所述抗體。在其他實施例中，Ly6E-陽性癌症係選自乳癌、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌或胃癌。在本文所述方法之一個實施例中，結合如本文所述Ly6E之抗體係與標記物結合。在一些實施例中，該標記物係正電子發射體。在一些實施例中，正電子發射體係89Zr。
在一些實施例中，提供與Ly6E結合之分離抗體，其用作藥劑。在其他實施例中，與Ly6E結合之抗體結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位。在另一實施例中，該抗體以如藉由斯卡查德分析量測之4nM之親和力結合Ly6E。在另一實施例中，該抗體以如藉由SPR量測之7nM之親和力結合Ly6E。在又一實施例中，該抗體用於治療Ly6E-陽性癌症。在一些實施例中，該抗體用於抑制Ly6E-陽性癌症細胞增殖。在一些實施例中，Ly6E-陽性癌症細胞系乳癌細胞、胰臟癌細胞、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、黑色素瘤細胞、卵巢癌細 胞、非小細胞肺癌細胞或胃癌細胞。在一些實施例中，如本文所述該抗體之用途係用於製造藥劑。在另一實施例中，該用於係用於用以治療Ly6E-陽性癌症之藥劑。在又一實施例中，該用途係用於抑制Ly6E-陽性癌症細胞增殖。在一些實施例中，Ly6E-陽性癌症細胞系乳癌細胞、胰臟癌細胞、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、黑色素瘤細胞、卵巢癌細胞、非小細胞肺癌細胞或胃癌細胞。
圖1顯示來自人類(SEQ ID NO：1)、食蟹猴(SEQ ID NO：2)、恒河猴(SEQ ID NO：35)、小鼠(SEQ ID NO：36)及大鼠(SEQ ID NO：37)之Ly6E直向同源物的序列之序列比對。細胞外結構域(ECD)中該等序列之間在胺基酸層面之一致性百分比在人類與食蟹猴Ly6E之間顯示為約96%且在人類與大鼠Ly6E之間顯示為約52%。
圖2顯示如實例1中進一步闡述之Ly6E mRNA表現之Genelogic概況。在Affymetrix U133P晶片上實施量測且表示為人類組織中之Ly6E表現之比例標化平均差。每一點代表正常(綠色)、腫瘤(紅色)或病變非腫瘤(藍色)人類組織樣品。長方形涵蓋每一分佈之25%至75%範圍。WBC=白血球。尤其在乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤及卵巢癌中觀察到Ly6E過表現。
圖3繪示在如實例2中所述之一組正常人類組織及所選癌細胞系及組織中正規化為RPL19對照基因之表現之Ly6E轉錄本之表現之QRT-PCR相對倍數變化。結果指示正常組織中之Ly6E轉錄本表現與乳癌及胰臟癌中之Ly6E表現相比較低。
圖4顯示人類化抗-Ly6E抗體(hu9B12.v12)與嵌合抗-Ly6E抗體(xLy6E mu9B12)及人類κ I共有序列(κ I共有)相比之輕鏈可變結構域序列比對。不同於人類共有框架之胺基酸位置加灰色陰影。經轉移以產生CDR移植物之區域加框。根據Kabat對位置進行編號。
圖5顯示人類化抗-Ly6E抗體(hu9B12.v12)與嵌合抗-Ly6E抗體(xLy6E mu9B12)及人類VH2共有序列(VH2共有)相比之重鏈可變結構域序列比對。不同於人類共有框架之胺基酸位置加灰色陰影。經轉移以產生CDR移植物之區域加框。根據Kabat對位置進行編號。
圖6顯示人類化抗-Ly6E抗體(hu9B12.v12)與嵌合抗-Ly6E抗體(xLy6E mu9B12)及人類VH3共有序列(VH3共有)相比之重鏈可變結構域序列比對。不同於人類共有框架之胺基酸位置加灰色陰影。經轉移以產生CDR移植物之區域加框。根據Kabat對位置進行編號。
圖7 如實例7中所述異種移植物小鼠模型中抗-Ly6E ADC之活體內功效。圖A顯示在經HCC1569 X2乳癌細胞接種之免疫缺陷小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，以指示劑量給予動物單次IV注射對照ADC(對照-vc-MMAE)或人類化抗-Ly6E(hu9B12 v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)。自每組9隻動物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖B顯示如藉由流式細胞術觀察之活的HCC1569 X2細胞中之表面Ly6E蛋白質表現，其中灰色峰指示經單獨的第二檢測試劑處理之細胞且黑色峰指示經3μg/mL Ly6E抗體(hu9B12 v12)ADC處理、之後經作為第二檢測試劑之結合至人類IgG之Alexafluor 488處理的細胞。直方圖之右側顯示呈幾何平均值(GeoMean)形式之Ly6E之表現。圖C顯示劑量遞增之hu9B12 v12 ADC針對乳癌細胞系HCC1569 X2之細胞殺死。將指示濃度之hu9B12 v12 ADC、對照IgG-vc-MMAE或等效量之PBS媒劑對照與細胞一起培育5天且使用CellTiter-Glo評定相對細胞存活力(y軸)。
圖8顯示異種移植物小鼠模型中抗-Ly6E ADC之活體內功效。圖A顯示在接種SU.86.86胰臟癌細胞之免疫缺陷小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，以指示劑量給予動物單次IV注射對照ADC(對照-vc-MMAE)或抗-Ly6E ADC。自每組9隻動 物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖B藉由免疫印跡比較HCC1569 X1及SU.86.86細胞溶胞物中之總Ly6E蛋白質表現。平行量測總β-肌動蛋白含量以用作載荷對照。圖C顯示劑量遞增之抗-Ly6E ADC針對胰臟癌細胞系SU.86.86之細胞殺死。將指示濃度之抗-Ly6E ADC、對照IgG-vc-MMAE或等效量之PBS媒劑對照與細胞一起培育5天且使用CellTiter-Glo評定相對細胞存活力(y軸)。圖D顯示藉由免疫組織化學對SU.86.86細胞沈澱之1+Ly6E染色。
圖9顯示在XenTech(Evry,France)處建立之原發性乳癌腫瘤異種移植物模型HBCx-9中之抗-Ly6E ADC的活體內功效。圖A顯示在植入患者源乳癌腫瘤物質之免疫缺陷小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，以指示劑量給予動物單次IV注射對照ADC(對照-vc-MMAE)或抗-Ly6E ADC。自每組9隻動物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖B藉由免疫印跡比較各種XenTech原發性腫瘤模型及HCC1569 X1及SU.86.86細胞溶胞物中之總Ly6E蛋白質表現。平行量測總β-肌動蛋白含量以用作載荷對照。圖C顯示藉由免疫組織化學對HBCx-9腫瘤之Ly6E染色。多種腫瘤試樣之獨立性染色顯示異質性染色型式。指示在1+等級Ly6E下之腫瘤細胞染色之百分比。
圖10顯示在XenTech(Evry,France)處建立之原發性乳癌腫瘤異種移植物模型HBCx-8中之抗-Ly6E ADC的活體內功效。圖A顯示在植入患者源乳癌腫瘤物質之免疫缺陷小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，以指示劑量給予動物單次IV注射對照ADC(對照-vc-MMAE)或抗-Ly6E ADC。自每組10隻動物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖B藉由免疫印跡比較各種XenTech原發性腫瘤模型及HCC1569 X1及SU.86.86細胞溶胞物中之總Ly6E蛋白質表現。平行量測總β-肌動蛋白含量以用作載荷對照。圖C顯示藉 由免疫組織化學對HBCx-8腫瘤之Ly6E染色。多種腫瘤試樣之獨立性染色顯示1+或2+等級下之異質性染色型式。
圖11顯示在Oncotest GmbH(Freiburg,Germany)處建立之原發性乳癌腫瘤異種移植物模型MAXF-1162中之抗-Ly6E ADC的活體內功效。圖A顯示在植入患者源乳癌腫瘤物質之免疫缺陷小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，以指示劑量給予動物單次IV注射對照ADC(對照-vc-MMAE)或抗-Ly6E ADC。自每組10隻動物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖B藉由免疫印跡比較各種Oncotest原發性腫瘤模型及細胞溶胞物中之總Ly6E蛋白質表現。平行量測總GAPDH蛋白含量以用作載荷對照。圖C顯示藉由免疫組織化學對MAXF-1162腫瘤之Ly6E染色。多種腫瘤試樣之獨立性染色顯示異質性染色型式。指示在1+或2+等級Ly6E下之腫瘤細胞染色之百分比。
圖12顯示在Oncotest GmbH(Freiburg,Germany)處建立之原發性胰臟癌腫瘤異種移植物模型PAXF-1657中之抗-Ly6E ADC的活體內功效。圖A顯示在具有患者源胰臟癌腫瘤外植體之免疫缺陷小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，以指示劑量給予動物單次IV注射對照ADC(對照-vc-MMAE)或抗-Ly6E ADC。自每組10隻動物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖B藉由免疫印跡比較各種Oncotest原發性腫瘤模型及細胞溶胞物中之總Ly6E蛋白質表現。平行量測總GAPDH蛋白含量以用作載荷對照。圖C顯示藉由免疫組織化學對PAXF-1657腫瘤之Ly6E染色。多種腫瘤試樣之獨立性染色顯示異質性染色型式。指示在極弱(+/-)等級Ly6E下之腫瘤細胞染色之百分比。
圖13比較小鼠異種移植物模型中各種抗-Ly6E ADC結合物之活體內功效。圖A、B及C均顯示在具有胰臟癌細胞系SU.86.86之免疫缺陷 小鼠中建立之皮下腫瘤。在腫瘤體積達到約100-250mm3(第0天)時，給予動物單次IV注射1mpk對照ADC或抗-Ly6E ADC，如圖上所指示。自每組10隻動物測定平均腫瘤體積及標準偏差(在圖上指示)。圖D顯示藉由免疫組織化學對SU.86.86細胞沈澱之1+Ly6E染色。
I.定義
出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)間之非共價相互作用之總和強度。除非另有說明，否則本文所用「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。可藉由業內已知之常用方法(包括彼等本文所述者)來量測親和力。用於量測結合親和力之具體闡釋性及實例性實施例闡述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指與不具有一或多個超變區(HVR)中之一或多個改變之親代抗體相比具有該等改變之抗體，該等改變改良抗體對抗原之親和力。
術語「抗-Ly6E抗體」及「結合Ly6E之抗體」係指能以足夠親和力結合Ly6E從而使得該抗體可用作靶向Ly6E之診斷劑及/或治療劑之 抗體。在一個實施例中，抗-Ly6E抗體與無關非Ly6E蛋白結合之程度低於該抗體與Ly6E結合之約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)或藉由斯卡查德分析或藉由表面電漿共振(例如Biacore)所量測。在某些實施例中，與Ly6E結合之抗體之解離常數(Kd)係1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-Ly6E抗體結合Ly6E中在來自不同物種之Ly6E之間保守之表位。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現期望抗原結合活性即可。
本文所用術語「抗體藥物結合物」(ADC)等效於術語「免疫結合物」。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙鏈抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合至相同表位之抗體」(作為參考抗體)係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。實例性競爭分析提供於本文中。
術語「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物之通常特徵在於細胞生長/增殖失調之生理學病況。癌症之實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤(例如，何傑金氏(Hodgkin’s)及非何傑金氏淋巴瘤)、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更具體實例包括過表現Ly6E之癌症，其可包括(例如)乳癌及/或轉移性乳癌(包括Her2陰性乳癌及/或三重陰性 乳癌)、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(鱗狀及/或非鱗狀)、胃癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膠質瘤、子宮頸癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細胞瘤、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其他淋巴增殖性病症及各種類型之頭頸癌。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同源或物種的抗體。
本文所用術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、瘤克寧錠(chlorambucil)、唐黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應子功能」係指彼等可歸因於抗體之Fc區之生物學活性，其可隨抗體同種型而有所變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「表位」係指抗體結合之抗原分子上之特定位點。
術語「Fc區」在本文中係用於界定免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號符合EU編號系統(亦稱為EU索引)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及源自其之子代(不考慮傳代次數)。子代與親代細胞之核酸含量可不完全相同，且可含有突變。本文包括經篩選或選擇與原始轉化細胞具有相同功能或生物活性之突變體子代。
「人類抗體「係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係代表在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變結構域序列亞組。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人所述之亞組κ I(見上文)。在一個實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人所述之III亞組(見上文)。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區域的至少一部分。抗體之「人類化形式」(例如，非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
本文所用術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域區中序列高度可變及/或形成結構上界定之環(「超變環」)之區域中的每一者。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自超變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。實例性超變環出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處。(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。)實例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成超變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處。(參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人所述編號(見上文)。
「免疫結合物」係結合至一或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之抗體。免疫結合物等效於術語「抗體藥物結合物」(ADC)。
「個體」(「individual」或「subject」)係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體係人類。
「經分離」抗體係自其天然環境組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至具有大於95%或99%之純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述，例如，參見Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「經分離」核酸係指已與其天然環境之組份分離之核酸分子。經分離核酸包括含於通常含有核酸分子之細胞中之該核酸分子，但該核酸分子存於染色體外或存於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
「編碼抗-Ly6E抗體之經分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括單一載體或多個單獨載體中之該(等)核酸分子及存於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。
本文所用術語「Ly6E」係指任何自處理細胞中之Ly6E前體蛋白產生之天然成熟Ly6E。除非另外指明，否則該術語包括來自任何脊椎動物源(包括哺乳動物(例如靈長類動物(例如人類及食蟹猴或恒河猴)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠))的Ly6E。該術語亦包括Ly6E之天然變體，例如剪接變體或對偶基因變體。具有信號序列(胺基酸1-20=信號序列)之實例性人類Ly6E前體蛋白之胺基酸序列示於SEQ ID NO：1中。實例性成熟人類Ly6E之胺基酸序列示於SEQ ID NO：38中。實例性食蟹猴Ly6E之胺基酸1-131之序列示於SEQ ID NO：2中。實例性成熟食蟹猴Ly6E之胺基酸序列示於SEQ ID NO：39中。實例性大鼠Ly6E前體(具有信號序列，胺基酸1-26)及成熟序列之胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：37及42中。實例性小鼠Ly6E前體(具有信號序列，胺基酸1-26)及成熟序列之胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：36及41中。
術語「Ly6E-陽性癌症」係指包含在細胞表面上表現Ly6E之細胞的癌症。出於測定細胞是否在表面上表現Ly6E之目的，認為Ly6E mRNA表現與細胞表面上之Ly6E表現相關。在一些實施例中，藉由選自原位雜交及RT-PCR(包括定量RT-PCR)之方法測定Ly6E mRNA之表現。或者，可使用(例如)針對Ly6E之抗體以諸如免疫組織化學、FACS等方法測定Ly6E於細胞表面上之表現。在一些實施例中，Ly6E-陽性癌症意指乳癌、轉移性乳癌(包括Her2陰性乳癌及/或三重陰性乳癌)、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(鱗狀及/或非鱗狀)或胃癌，其各自呈現高程度之Ly6E表現。
術語「Ly6E-陽性細胞」係指在表面上表現Ly6E之癌症細胞。
本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群體獲得的抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生之變體，此等變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單個決定簇。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵在於得自實質上同源之抗體群體，且不應視為需要藉由任一特定方法產生該抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體顯示法及利用含有所有或部分之人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。
「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道耳頓(dalton)之異源四聚體糖蛋白，其由雙硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈組成。自N-至C-末端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N-至C-末端，每一輕鏈依次具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)及恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕型(κ)及拉姆達(λ)。
術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有有關適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告的資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在 比對序列並引入間隔(若需要)以達到最大序列一致性百分比後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比，且任何保守取代皆不視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以熟習此項技術者所熟知之多種方式來達成比對，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之適宜參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，胺基酸序列一致性%之值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2來獲得。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司設計，且原始碼已與用戶文件一起歸檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)Washington D.C.,20559中，其中其係以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司(South San Francisco,California)公開獲得，或可自原始碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。藉由ALIGN-2程式設定所有序列比較參數且不加以改變。在採用ALIGN-2比較胺基酸序列之情形中，給定胺基酸序列A相對於(to、with或against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者其可表述為具有或包含相對於給定胺基酸序列B之一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下來計算：100乘以分數X/Y
其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2在該程式對A與B之比對中評定為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%之值皆係如前一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈容許所含活性成份之生物活性有效之形式且不含對投與該調配物之個體具有不可接受之毒性之其他組份之製劑。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份以外之對個體無毒性之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用「鉑複合體」係指抗癌化學療法藥物，例如(但不限於)順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、異丙鉑(iproplatin)、沙鉑(satraplatin)、CI-973、AZ0473、DWA2114R、奈達鉑(nedaplatin)及螺鉑(sprioplatin)，其基於其共價結合DNA之能力發揮抵抗腫瘤之功效。
本文所用「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「treat」或「treating」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床幹預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之合意效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中每一結構域皆包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見，Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域文庫。例如，參見Portolano等人，J.Immunol. 150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
本文所用術語「載體」係指能傳送與其連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入已引入該載體之宿主細胞之基因組中之載體。某些載體能引導與其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
「烷基」係含有正、二級、三級或環狀碳原子之C1-C18烴。實例係甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、i-丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、s-丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、第三丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
本文所用術語「C1-C8烷基」係指具有1至8個碳原子之直鏈或具支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C8烷基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基及-正癸基；而具支鏈C1-C8烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基、2-甲基丁基、不飽 和C1-C8烷基，包括(但不限於)、-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁基烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1丁炔基。C1-C8烷基可未經取代或經一或多個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
本文所用術語「C1-C12烷基」係指具有1至12個碳原子之直鏈或具支鏈、飽和或不飽和烴。C1-C12烷基可未經取代或經一或多個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN，其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
本文所用術語「C1-C6烷基」係指具有1至6個碳原子之直鏈或具支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C6烷基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基及正己基；而具支鏈C1-C6烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基及2-甲基丁基；不飽和C1-C6烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁基烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基及3-己基。C1-C6烷基可未經取代或經一或多個如上文針對C1-C8烷基所述之基團取代。
本文所用術語「C1-C4烷基」係指具有1至4個碳原子之直鏈或具支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C4烷基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而具支鏈C1-C4烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基；不飽和C1-C4烷基包括(但不限於)、-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁基烯基。C1-C4烷基可未經取代或經一或多個如上文針對C1-C8烷基所述之基團取代。
「烷氧基」係單一鍵結至氧之烷基。實例性烷氧基包括(但不限於)甲氧基(-OCH3)及乙氧基(-OCH2CH3)。「C1-C5烷氧基」係具有1至5個碳原子之烷氧基。烷氧基可未經取代或經一或多個如上文針對烷基所述之基團取代。
「烯基」係含有具有至少一個不飽和位點(即碳-碳、sp 2 雙鍵)之正、二級、三級或環狀碳原子之C2-C18烴。實例包括(但不限於)：伸乙基或乙烯基(-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH=CH2)、環戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2)。「C2-C8烯基」係含有2至8個具有至少一個不飽和位點(即碳-碳、sp 2 雙鍵)之正、二級、三級或環狀碳原子之烴。
「炔基」係含有具有至少一個不飽和位點(即碳-碳、sp三鍵)之正、二級、三級或環狀碳原子之C2-C18烴。實例包括(但不限於)乙炔系(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。「C2-C8炔基」係含有2至8個具有至少一個不飽和位點(即碳-碳、sp三鍵)之正、二級、三級或環狀碳原子之烴。
「伸烷基」係指具有1至18個碳原子且具有兩個藉由自母體烷烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生之單價基團中心的飽和、具支鏈或單鏈或環狀烴基團。典型伸烷基包括(但不限於)：亞甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(- CH2CH2CH2CH2-)及諸如此類。
「C1-C10伸烷基」係式-(CH2)1-10-之直鏈、飽和烴基團。C1-C10伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。
「伸烯基」係指具有2至18個碳原子且具有兩個藉由自母體烯烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生之單價基團中心的不飽和、具支鏈或單鏈或環狀烴基團。典型伸烯基包括(但不限於)：1,2-伸乙基(-CH=CH-)。
「伸炔基」係指具有2至18個碳原子且具有兩個藉由自母體炔烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生之單價基團中心的不飽和、具支鏈或單鏈或環狀烴基團。典型伸炔基包括(但不限於)：乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
「芳基」係指碳環芳香族基團。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。碳環芳香族基團或雜環芳香族基團可未經取代或經一或多個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C5-C20芳基」係碳環芳香族環中具有5至20個碳原子之芳基。C5-C20芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C20芳基可如上文針對芳基所述經取代或未經取代。「C5-C14芳基」係碳環芳香族環中具有5至14個碳原子之芳基。C5-C14芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C14芳基可如上文針對芳基所述經取代或未經取代。
「伸芳基」係具有兩個共價鍵且可呈如以下結構中所示之鄰、 間或對構型之芳基： 其中苯基可未經取代或經至多四個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「芳基烷基」係指鍵結至碳原子(通常末端或sp3碳原子)之氫原子中之一者經芳基替代的非環狀烷基。典型芳基烷基包括(但不限於)苄基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙-1-基及諸如此類。芳基烷基包含6至20個碳原子，例如芳基烷基之烷基部分(包括烷烴基、烯基或炔基)係1至6個碳原子且芳基部分係5至14個碳原子。
「雜芳基烷基」係指鍵結至碳原子(通常末端或sp3碳原子)之氫原子中之一者經雜芳基替代的非環狀烷基。典型雜芳基烷基包括(但不限於)2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及諸如此類。雜芳基烷基包含6至20個碳原子，例如，雜芳基烷基之烷基部分(包括烷烴基、烯基或炔基)係1至6個碳原子且雜芳基部分係5至14碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜芳基烷基之雜芳基部分可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之二環，例如：二環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
「經取代烷基」、「經取代芳基」及「經取代芳基烷基」分別意指烷基、芳基及芳基烷基，其中一或多個氫原子各自獨立地經取代 基替代。典型取代基包括(但不限於)-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2、-C(=S)NR2、-C(=NR)NR2，其中每一X獨立地係鹵素：F、Cl、Br或I；且每一R獨立地係-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14雜環、保護基團或前藥部分。如上文所述之伸烷基、伸烯基及伸炔基亦可類似地經取代。
「雜芳基」及「雜環」係指一或多個環原子係雜原子(例如氮、氧及硫)之環系統。雜環基團包含3至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之二環，例如：二環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
實例性雜環闡述於(例如)Paquette,Leo A.,「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其第1、3、4、6、7及9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs」(John Wiley & Sons,New York,1950年呈遞)、尤其第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中。
雜環之實例包括(例如且不加以限制)吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(六氫吡啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、萘硫基(thianaphthalenyl)、吲哚基、假吲哚基、喹啉基、異喹 啉基、苯并咪唑基、六氫吡啶基、4-六氫吡啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙-四氫呋喃基、四氫吡喃基、雙-四氫吡喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、氮基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、異苯并呋喃基、苯并吡喃基、呫噸基、啡噁噻基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、嗒嗪基、中氮茚基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、呔嗪基、萘啶基、喹喏啉基、喹唑啉基、啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-哢啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋呫基、啡噁嗪基、異苯并二氫吡喃基、苯并二氫吡喃基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、六氫吡嗪基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基及靛紅基(isatinoyl)。
例如且不加以限制，碳鍵結之雜環係在以下位置鍵結：吡啶之2、3、4、5或6位、嗒嗪之3、4、5或6位、嘧啶之2、4、5或6位、吡嗪之2、3、5或6位、呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之2、3、4或5位、噁唑、咪唑或噻唑之2、4或5位、異噁唑、吡唑或異噻唑之3、4或5位、氮丙啶之2或3位、氮雜環丁烷之2、3或4位、喹啉之2、3、4、5、6、7或8位或異喹啉之1、3、4、5、6、7或8位。仍更通常地，碳鍵結之雜環包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-嗒嗪基、4-嗒嗪基、5-嗒嗪基、6-嗒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
例如且不加以限制，氮鍵結之雜環係在以下位置鍵結：氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑 啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、六氫吡啶、六氫吡嗪、吲哚、二氫吲哚、1H-吲唑之1位、異吲哚或異二氫吲哚之2位、嗎啉之4位及咔唑或β-哢啉之9位。仍更通常地，氮鍵結之雜環包括1-氮丙啶基、1-氮雜環丁基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-六氫吡啶基。
「C3-C8雜環」係指芳香族或非芳香族C3-C8碳環，其中1至4個環碳原子獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子替代。C3-C8雜環之代表性實例包括(但不限於)苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基(coumarinyl)、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、嗒嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。C3-C8雜環可未經取代或經至多七個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C8雜環基」係指上文定義之C3-C8雜環基團，其中雜環基團之氫原子中之一者經鍵替代。C3-C8雜環基可未經取代或經至多六個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C20雜環」係指芳香族或非芳香族C3-C8碳環，其中1至4個環碳原子獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子替代。C3-C20雜環可未經取代或經至多七個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷 基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C20雜環基」係指上文定義之C3-C20雜環基團，其中雜環基團之氫原子中之一者經鍵替代。
「碳環」意指具有3至7個碳原子作為單環或7至12碳原子作為二環之飽和或不飽和環。單環狀碳環具有3至6個環原子，仍更通常5或6個環原子。二環狀碳環具有7至12個環原子，例如，以二環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統佈置；或具有9或10個環原子，以二環[5,6]或[6,6]系統佈置。單環狀碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環庚基及環辛基。
「C3-C8碳環」係3-、4-、5-、6-、7-或8員飽和或不飽和非芳香族碳環。代表性C3-C8碳環包括(但不限於)-環丙基、-環丁基、-環戊基、-環戊二烯基、-環己基、-環己烯基、-1,3-環己二烯基、-1,4-環己二烯基、-環庚基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚四烯基、-環辛基及-環辛二烯基。C3-C8碳環可未經取代或經一或多個包括但不限於以下之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN；其中每一R’獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C8碳環基」係指上文定義之C3-C8碳環基團，其中碳環基團之氫原子中之一者經鍵替代。
「連接體」係指包含共價鍵或將抗體共價附接至藥物部分之原 子鏈的化學部分。在各個實施例中，連接體包括二價基團，例如烷基二基、芳基二基、雜芳基二基，諸如以下等部分：-(CR2)nO(CR2)n-，烷基氧基(例如聚乙烯氧基、PEG、聚亞甲基氧基)及烷基胺基(例如聚伸乙基胺基，JeffamineTM)之重複單元；及二酸酯及醯胺，包括琥珀酸酯、琥珀酸醯胺、二羥乙酸酯、丙二酸酯及己醯胺。在各個實施例中，連接體可包含一或多個胺基酸殘基，例如纈胺酸、苯基丙胺酸、離胺酸及高離胺酸。
術語「對掌性」係指具有鏡像配偶體之不可疊合之性質之分子，而術語「非對掌性」係指可與其鏡像配偶體重疊之分子。
術語「立體異構體」係指具有相同化學構成、但關於原子或基團之空間佈置不同的化合物。
「非對映異構體」係指具有兩個或更多個對掌性中心且分子並非彼此之鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非對映異構體之混合物可在高解析度分析程序(例如電泳級層析)下分開。
「對映異構體」係兩個彼此為不可疊合鏡像之立體異構體對。
本文所用立體化學定義及慣例通常遵循S.P.Parker編輯，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley & Sons公司，New York。許多有機化合物以光學活性形式存在，即其具有使平面偏振光旋轉之能力。在闡述光學活性化合物中，前綴D及L或R及S用於表示分子在其對掌性中心附近之絕對構型。採用前綴d及l或(+)及(-)表示化合物之平面偏振光之旋轉符號，其中(-)或l意指化合物係左旋。有(+)或d前綴之化合物係右旋。對於給定化學結構而言，該等立體異構體相同，只是其係彼此之鏡像。特定立體異構體亦可稱作對映異構體，且該等 異構體之混合物經常稱作對映異構體混合物。對映異構體之50：50混合物稱作外消旋混合物或外消旋物，若在化學反應或過程中無立體選擇或立體特異性，則此可出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指兩種對映異構物質之等莫耳混合物，不含光學活性。
「離去基團」係指可由另一官能基取代之官能基。某些離去基團已為業內所熟知，且實例包括(但不限於)鹵離子(例如，氯離子、溴離子、碘離子)、甲烷磺醯基(甲磺醯基)、對甲苯磺醯基(甲苯磺醯基)、三氟甲基磺醯基(三氟甲磺酸酯)及三氟甲基磺酸酯。
術語「保護基團」係指通常用於封阻或保護特定官能基而使化合物上之其他官能基反應的取代基。例如，「胺基保護基團」係附接至胺基且封阻或保護化合物中之胺基官能基之取代基。適宜胺基保護基團包括(但不限於)乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苄基氧基羰基(CBZ)及9-茀基甲基氧基羰基(Fmoc)。關於保護基團及其用途之一般說明，參見T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991或更新版本。
II.組合物及方法
在一個態樣中，本發明部分係基於結合LY6E之抗體及包含該等抗體之免疫結合物。本發明之抗體及免疫結合物可用於(例如)診斷或治療LY6E-陽性癌症。
A.實例性抗-Ly6E抗體
在一些實施例中，本發明提供結合LY6E之經分離抗體。在某些實施例中，抗-Ly6E抗體具有以任何組合之以下特性中之至少一或多者：(a)結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位；及(b)以如下親和力結合Ly6E：7nM、或6nM、或5nM、或4nM、或3nM、或2nM、或1nM，且視情況 0.0001nM、或0.001nM、或0.01nM，如藉由SPR或斯卡查德分析所量測。
本發明之非限制性實例性抗體係如圖4至6中所示之鼠類9B12及其人類化變體，例如hu9B12.v12，如圖4至6中所示。在一些實施例中，Ly6E係人類Ly6E。在一些實施例中，Ly6E選自人類、食蟹猴、恒河猴、小鼠或大鼠Ly6E。
在一些實施例中，抗-Ly6E抗體結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位。在一些該等實施例中，抗-Ly6E抗體以如下親和力結合Ly6E：7nM、或6nM、或5nM、或4nM、或3nM、或2nM、或1nM，且視情況0.0001nM、或0.001nM、或0.01nM，如藉由SPR或斯卡查德分析所量測。本發明之非限制性實例性抗體係如圖4至6中所示之鼠類9B12及其人類化變體，例如hu9B12.v12，如圖4至6中所示。在一些實施例中，Ly6E係人類Ly6E。在一些實施例中，Ly6E係人類Ly6E或食蟹猴Ly6E。
在一態樣中，本發明提供抗-Ly6E抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。
在一個態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。在一個實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：12之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：12之HVR-H3及包含胺基 酸序列SEQ ID NO：9之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：12之HVR-H3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：9之HVR-L3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：11之HVR-H2。在又一實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。在一個實施例中，抗體包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。
在另一態樣中，本發明抗體包含(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR：(i)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(ii)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：12之胺基酸序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7，(ii)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。
在某些實施例中，如上文提供之抗-Ly6E抗體之任何一或多個胺基酸係在以下HVR位置處經取代：在上文任一實施例中，抗-Ly6E抗體經人類化。在一個實施例中，抗-Ly6E抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在另一實施例中，抗-Ly6E抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且其進一步包含輕鏈可變結構域框架FR2序列SEQ ID NO：20或輕鏈可變結構域框架FR3 SEQ ID NO：21或重鏈可變結構域框架FR1 SEQ ID NO：23或重鏈可變結構域框架FR2 SEQ ID NO：24。
在另一態樣中，抗-Ly6E抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-Ly6E抗體保留結合Ly6E之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：5中已有總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-Ly6E抗體包含SEQ ID NO：5之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。
在另一態樣中，提供抗-Ly6E抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-Ly6E抗體保留結合Ly6E之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：3中已有總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-Ly6E抗體包含SEQ ID NO：3之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。
在另一態樣中，提供抗-Ly6E抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一個實施例中，抗體包含分別SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：3之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在又一態樣中，本發明提供與本文所提供抗-Ly6E抗體結合至相同表位之抗體。例如，在某些實施例中，提供與包含VH序列SEQ ID NO：5及VL序列SEQ ID NO：3之抗-Ly6E抗體結合至相同表位的抗體。在某些實施例中，提供與Ly6E中由SEQ ID NO：1之胺基酸21至131組成之片段內之表位結合的抗體。
在本發明之又一態樣中，上文任一實施例之抗-Ly6E抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一個實施例中，抗-Ly6E抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙鏈抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同種型。
在又一態樣中，上文任一實施例之抗-Ly6E抗體可單獨或組合納入下文章節1-7中所述特徵中之任一者：
分析
為測定抗-Ly6E抗體是否「結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位」，使具有N-及C-末端缺失之Ly6E多肽在293個細胞中表現且藉由FACS測試抗體與經截短多肽之結合，其中抗體與經截短多肽之結合相對於與在293個細胞中表現之全長Ly6E之結合大量減少(70%減少)或消除，此指示抗體不會結合至該經截短多肽。
如實例4中本文所述根據斯卡查德分析測定抗-Ly6E抗體是否「以6nM、或5nM、或4nM、或3nM、或2nM、或1nM之親和力結合」。或者，可根據(例如)BIAcore分析測定抗-Ly6E抗體親和力。具體而言，使用表面電漿共振分析使用BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)量測Kd。根據供應商之說明書用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)試劑活化BIAcoreTM研究級CM5晶片。將山羊抗人類Fc IgG偶合至晶片以在每一流動室中達成約10,000個反應單元(RU)。用1M乙醇胺封阻未反應偶合基團。對於動力學量測，捕捉抗-Ly6E抗體以達成約300RU。於25℃下以30μl/min之流速將人類Ly6E之兩倍連續稀釋物(例如，融合至桿狀病毒系統中表現之His-Fc的胺基酸21至131或融合至自CHO細胞表現之Fc的胺基酸21至131；125nM至0.49nM)注射於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005%表面活性劑P20)。締合速率(kon)及解離速率(koff)係使用1：1 Langmuir結合模型(BIAcoreTM評估軟體3.2版)來計算。以比率koff/kon來計算平衡解離常數(Kd)。若藉由上文表面電漿共振分析獲得之締合速率(on-rate)超過106M-1 s-1，則該締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術在25℃下在濃度遞增之抗原存在下量測存於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之升高或降低，如在使用攪拌比色管之光譜儀(例如配備有停流設備之光譜儀(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco® 分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
在上文任一實施例中，抗-Ly6E抗體經人類化。在一個實施例中，抗-Ly6E抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含人類受體框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在某些實施例中，人類受體框架係人類VL κ IV共有(VLKIV)框架及/或VH框架VH1。
在本發明之又一態樣中，上文任一實施例之抗-Ly6E抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一個實施例中，抗-Ly6E抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙鏈抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，抗體係實質上全長抗體，例如IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同種型。
在又一態樣中，上文任一實施例之抗-Ly6E抗體可單獨或組合納入下文章節1-7中所述特徵中之任一者：在本發明之又一態樣中，上文任一實施例之抗-Ly6E抗體係單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-Ly6E抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙鏈抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，抗體係實質上全長抗體，例如IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同種型。
在又一態樣中，上文任一實施例之抗-Ly6E抗體可單獨或組合納入下文章節1-7中所述特徵中之任一者：
1.抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體之解離常數(Kd)係1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM，且視情況10-13M(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中，Kd係如以下分析法所述，利用所關注抗體之 Fab形式及其抗原進行放射性標記抗原結合分析法(RIA)來量測。Fab對抗原之溶液結合親和力之量測法為：由Fab在連續滴定濃度之未標記抗原之存在下，與最低濃度之(125I)標記抗原達成平衡，然後用塗覆抗-Fab抗體之分析板捕捉所結合抗原(例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析法之條件，使用含於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml之捕捉用抗-Fab抗體(Cappel Labs)塗佈MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)過夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白封阻2至5小時。在非吸附性分析板(Nunc 269620號)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合(例如，依據Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中針對抗-VEGF抗體(Fab-12)之評估法)。然後將所關注Fab培育過夜；然而，可繼續培育更長時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。之後，將混合物轉移至捕捉分析板上，在室溫下培育(例如，1小時)。然後移除溶液，並用含於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)洗滌分析板8次。當分析板乾燥時，添加150μl/孔之閃爍劑(MICROSCINT-20 TM；Packard)，且將分析板在TOPCOUNT TM γ計數器(Packard)上計數10分鐘。選出每一Fab達到低於或等於20%最大結合度時之濃度，用於競爭性結合分析。
根據另一實施例，如實例4中所述，使用斯卡查德分析法量測Kd。根據另一實施例，於25℃下使用表面電漿共振分析法，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)，利用固定抗原CM5晶片在約10個反應單元(RU)下量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，之後以5μl/分鐘之流速注射，獲得約10 個反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗原後，注射1M乙醇胺以封阻未反應基團。量測動力學時，在25℃下以約25μl/min之流速注射含Fab之含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑之PBS(PBST)溶液之兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。締合速率(kon)及解離速率(koff)係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)，藉由同時擬合結合及解離感測圖來計算。以比率koff/kon來計算平衡解離常數(Kd)。例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上文表面電漿共振分析法獲得之締合速率超過106M-1 s-1，則可使用螢光淬滅技術來測定該締合速率，該技術在25℃下，在濃度遞增之抗原存在下量測存於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之升高或降低，如在附有攪拌比色管之光譜儀(例如配備有停流設備之光譜儀(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見(例如)Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且活體內半衰期延長之Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙鏈抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人， Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術來製備抗體片段，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)來產生，如本文所述。
3.嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴)之可變區)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係類別或亞類已自親代抗體發生變化之「類別轉換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，而保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(闡述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見，Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(經體突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見，Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及自篩選FR文庫獲得之框架區(例如，參見，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改質以產生完整人類抗體或具有響應抗原性激發之人類可變區 的完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座代替內源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由此等動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法製得。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述來自雜交瘤細胞系之單株人類IgM抗體之產生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域 序列來產生人類抗體。然後，此等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5.源自文庫之抗體
可藉由在組合文庫中篩選具有期望活性之抗體來分離本發明抗體。例如，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自該等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。此等方法可參見(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人，編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且進一步闡述於(例如)以下中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜且在噬菌體文庫中將其隨機重組，然後可在該等文庫中篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自免疫化源之文庫向免疫原提供高親和力抗體而無需構築雜交瘤。或者，可選殖天然譜(例如，自人類)以向各種無任何免疫之非自體抗原亦及自體抗原提供單一抗體源，如由Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因片段，且使用含有隨機序列之PCR引物編碼高度可變CDR3區並在活體外達成重排，如 由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段可視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。
6.多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對LY6E且另一種系針對任何另一抗原。在某些實施例中，一種結合特異性係針對LY6E且另一種係針對CD3。例如，參見美國專利第5,821,337號。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合Ly6E之兩個不同表位。亦可使用雙特異性抗體將細胞毒性劑集中至表現Ly6E之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製得。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例 如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體(例如，如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述)。
本文亦包括經改造以具有三個或更多個功能抗原結合位點之抗體(包括「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括「雙重作用性FAb」或「DAF」，其包含結合Ly6E以及另一不同抗原之抗原結合位點(例如，參見US 2008/0069820)。
7.抗體變體
在某些實施例中，涵蓋本文所提供抗體之胺基酸序列變體。例如，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體係藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以達成最終構築體，前提為最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。
a)取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。保守取代顯示於表1之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表1之「實例性取代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步所述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)經保留/改良抗原結合、經降低免疫原性或經改良ADCC或CDC。
可根據常見側鏈性質對胺基酸進行分組：(1)疏水性殘基：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性殘基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性殘基：Asp、Glu；(4)鹼性殘基：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將該等類別之一的成員交換為另一類別。
一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之 一或多個超變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物學性質(例如，增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上保留親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生物學活性(例如結合親和力)。
可對HVR作出變化(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。此等改變可在HVR「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間經受高頻率突變之密碼子編碼的殘基)(例如，參見Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由自二級文庫構築及重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，人類Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入所選用於成熟之可變基因中。然後建立二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可特異性地鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要該等改變不顯著降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可對HVR作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)。此等改變可在HVR「熱點」或SDR外部。在上文所提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不 超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085中所述。在此方法中，已鑑別殘基或目標殘基組(例如，帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並由中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)代替以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，使用抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向此等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽與抗體N末端或C末端之融合物。
b)糖基化變體
在某些實施例中，改變本文所提供抗體以提高或降低抗體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列從而產生或移除一或多個糖基化位點來便利地達成抗體糖基化位點的添加或缺失。
倘若抗體包含Fc區，則其所附接之碳水化合物可有所改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二分枝寡糖，其通常藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域的Asn297。例如，參見Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包含各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二分枝寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一個實施例中，提供碳水化合物結構中缺少附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之抗體變體。例如，此抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量係藉由計算糖鏈內Asn297處之岩藻糖相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來測定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中大約297位處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體中具有微小序列變化，故Asn297亦可位於297位上游或下游之大約±3個胺基酸處，亦即，介於294位與300位之間。此等岩藻糖基化變體可具有經改良ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖-缺乏」抗體變體有關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及 WO2003/085107)。
進一步提供二等分寡糖之抗體變體，例如，其中附接至抗體Fc區之二分枝寡糖由GlcNAc二等分。此等抗體變體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變體之實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此等抗體變體可具有經改良CDC功能。此等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非全部效應子功能之抗體變體，此使其成為抗體之活體內半衰期較為重要、但某些效應子功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害之應用之期望候選者。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺少FcγR結合能力(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞中之表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)之第464頁表3中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci. USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可使用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於此等分析之有用效應子細胞包含周邊血單核球(PBMC)及天然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如，在諸如揭示於Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中之動物模型等動物模型中)評價所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來確認抗體不能與C1q結合且因此缺少CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低之效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297處經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有改良或降低之與FcR之結合的某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基 酸取代(例如，在Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代)之Fc區。
在一些實施例中，Fc區有所改變，從而改變(亦即，改良或減小)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
具有延長之半衰期及增強之與新生兒Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中，Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之結合之抗體闡述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。此等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及與Fc區變體有關之其他實例之WO 94/29351。
d)半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基於抗體之可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體結合至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫結合物，如本文進一步所述。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編 號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文所提供抗體可經進一步修飾以含有業內已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物之數目可變，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。通常，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可根據包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之結合物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長之輻射：其不會危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺滅的溫度。
B.重組方法及組合物
抗體可使用重組方法及組合物來產生，如(例如)美國專利第4,816,567號中所闡述。在一個實施例中，提供編碼本文所述抗-LY6E 抗體之經分離核酸。此核酸可編碼抗體中包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供一或多個包含此核酸之載體(例如，表現載體)。在又一實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個該實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)包含如下核酸之載體：其編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗-LY6E抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供包含編碼該抗體之核酸之宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於抗-LY6E抗體之重組產生，分離(例如)如上文所述之編碼抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此核酸可使用習用程序容易地分離出來並定序(例如，藉由使用能與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特定而言在無需糖基化及Fc效應子功能時。對於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見(例如)美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，可以可溶部分自細菌細胞膏糊分離抗體且可將其進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)亦係編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「經人類化」從而產生部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用之諸多桿狀病毒菌株，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可使用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，可使用適於懸浮液生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚腎系(293或293細胞，如(例如)Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠支持細胞(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於 抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，例如，參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C.分析
可藉由業內已知之多種分析來鑑別本文所提供之抗-LY6E抗體，針對其物理/化學性質及/或生物活性進行篩選或表徵。
在一個態樣中，藉由已知方法(例如ELISA、BIACore®、FACS或西方墨點法)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與本文所述任何抗體競爭結合LY6E之抗體。在某些實施例中，此一競爭性抗體結合由本文所述抗體結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在實例性競爭分析中，在溶液中培育固定化LY6E，該溶液包含結合LY6E之第一經標記抗體(例如，本文所述任何抗體)及正在測試與第一抗體競爭結合LY6E之能力之第二未標記抗體。第二抗體可存於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定化LY6E。在容許第一抗體結合LY6E之條件下培育後，移除過量未結合抗體，且量測與固定化LY6E結合之標記之量。若在測試試樣中與固定化LY6E結合之標記之量相對於對照試樣顯著降低，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合LY6E。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含與一或多種細胞毒性劑(化學 治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性結合物))結合之本文之抗-LY6E抗體。
免疫結合物允許將藥物部分靶向遞送至腫瘤，且在一些實施例中於其中細胞內累積，其中未結合藥物之全身投與可對正常細胞產生不可接受程度之毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5：382-387)。
抗體-藥物結合物(ADC)係靶向化學治療分子，其藉由將細胞毒性藥物靶向抗原表現腫瘤細胞組合抗體與細胞毒性藥物之性質(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9：982-1004)，藉此藉由使功效最大化並使脫靶毒性最小化增強治療指數(Carter,P.J.及Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3)：154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41：98-107。
本發明之ADC化合物包括彼等具有抗癌活性者。在一些實施例中，ADC化合物包括結合(即共價附接)至藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接體共價附接至藥物部分。本發明之抗體-藥物結合物(ADC)選擇性遞送有效劑量之藥物至腫瘤組織，藉此可達成更大選擇性(即更低有效劑量)，同時增加治療指數(「治療窗」)。
抗體-藥物結合物(ADC)之藥物部分(D)可包括任何具有細胞毒性或細胞生長抑制效應之化合物、部分或基團。藥物部分可藉由包括(但不限於)微管蛋白結合、DNA結合或相互作用、及抑制RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓撲異構酶之機制賦予其細胞毒性及細胞生長抑制效應。實例性藥物部分包括(但不限於)類美坦生、多拉斯他汀(dolastatin)、奧裏斯他汀、卡奇黴素、吡咯并苯二氮呯(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽環、多卡米星(duocarmycin)、長春花生物鹼、紫杉烷(taxane)、單端孢黴烯(trichothecene)、 CC1065、喜樹鹼(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及其具有細胞毒性活性之立體異構體、等排物、類似物及衍生物。下文進一步詳細論述該等免疫結合物之非限制性實例。
1.實例性抗體-藥物結合物
抗體-藥物結合物(ADC)化合物之實例性實施例包含靶向腫瘤細胞之抗體(Ab)、藥物部分(D)及將Ab附接至D之連接體部分(L)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基(例如離胺酸及/或半胱胺酸)附接至連接體部分(L)。
實例性ADC具有式I：Ab-(L-D)p 式I
其中p係1至約20。在一些實施例中，可結合至抗體之藥物部分之數目受限於游離半胱胺酸殘基之數目。在一些實施例中，藉由本文所述方法將游離半胱胺酸殘基引入抗體胺基酸序列中。式I之實例性ADC包括(但不限於)具有1、2、3或4個經改造半胱胺酸胺基酸之抗體(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502：123-138)。在一些實施例中，在未使用改造情況下，抗體中已經存在一或多個游離半胱胺酸殘基，在該情形下可使用現存游離半胱胺酸殘基將抗體結合至藥物。在一些實施例中，在抗體結合之前使抗體暴露於還原條件下，以產生一或多個游離半胱胺酸殘基。
a)實例性連接體
「連接體」(L)係可用於將一或多個藥物部分(D)連接至抗體(Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物(ADC)之雙功能或多功能部分。在一些實施例中，抗體-藥物結合物(ADC)可使用具有反應性官能基以共價附接至藥物及抗體之連接體來製備。例如，在一些實施例中，抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇可與連接體之反應性官能基或藥物-連接體中間體形成鍵以製造ADC。
在一個態樣中，連接體具有能夠與抗體上存在之游離半胱胺酸反應以形成共價鍵之官能基。該等非限制性實例性反應官能基包括琥珀醯亞胺、鹵代乙醯胺、α-鹵代乙醯基、活化酯，例如琥珀醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、醯氯、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。例如，參見Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773之第766頁及本文之實例之結合方法。
在一些實施例中，連接體具有能夠與抗體上存在之親電基團反應之官能基。該等實例性親電基團包括(但不限於)醛及酮羰基。在一些實施例中，連接體之反應性官能基之雜原子可與抗體上之親電基團反應且與抗體單元形成共價鍵。該等非限制性實例性反應性官能基包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼。
連接體可包含一或多個連接體組份。實例性連接體組份包括6-馬來醯亞胺基己醯基(「MC」)、馬來醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯基丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苄基氧基羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(「SPP」)及環己烷-1甲酸4-(N-馬來醯亞胺基甲基)酯(「MCC」)。業內已知各種連接體組份，下文闡述其中之一些。
連接體可為「可裂解連接體」，其有利於藥物釋放。非限制性實例性可裂解連接體包括酸不穩定連接體(例如，包含腙)、蛋白酶敏感性(例如，肽酶敏感性)連接體、光不穩定性連接體或含二硫化物之連接體(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；US 5208020)。
在某些實施例中，連接體具有以下式II：-Aa-Ww-Yy- 式II
其中A係「延伸體單元」，且a係0至1之整數；W係「胺基酸單元」，且w係0至12之整數；Y係「間隔體單元」，且y係0、1或2；且Ab、D及p係如上文針對式I所定義。該等連接體之實例性實施例闡述於美國專利第7,498,298號中，該案件以引用方式明確併入本文中。
在一些實施例中，連接體組份包含將抗體連接至另一連接體組份或藥物部分之「延伸體單元」。下文顯示非限制性實例性延伸體單元(其中波形線指示與抗體、藥物或額外連接體組份之共價附接位點)：
在一些實施例中，連接體組份包含「胺基酸單元」。在一些該等實施例中，胺基酸單元允許連接體由蛋白酶裂解，藉此在暴露於細胞內蛋白酶(例如溶酶體酶)時有利於藥物自免疫結合物釋放(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784)。實例性胺基酸單元包括(但不限於)二肽、三肽、四肽及五肽。實例性二肽包括(但不限於)纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯基丙胺酸(af或ala-phe)；苯基丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯基丙胺酸-高離胺酸(phe-homolys)；及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。實例性三肽包括(但不限於)甘胺酸- 纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包含天然胺基酸殘基及/或微量胺基酸及/或非天然胺基酸類似物，例如瓜胺酸。胺基酸單元可針對由特定酶(例如腫瘤相關之蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶酶蛋白酶)之酶裂解設計並優化。
在一些實施例中，連接體組份包含將抗體直接或經由延伸體單元及/或胺基酸單元連接至藥物部分之「間隔體」單元。間隔體單元可為「自分解」或「非自分解」單元。「非自分解」間隔體單元係在ADC裂解後，部分或全部間隔體單元仍結合至藥物部分者。非自分解間隔體單元之實例包括(但不限於)甘胺酸間隔體單元及甘胺酸-甘胺酸間隔體單元。在一些實施例中，含有甘胺酸-甘胺酸間隔體單元之ADC由腫瘤細胞相關之蛋白酶進行酶裂解可自ADC之剩餘部分釋放甘胺酸-甘胺酸-藥物部分。在一些該等實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中經受水解步驟，由此自藥物部分裂解甘胺酸-甘胺酸間隔體單元。
「自分解」間隔體單元允許釋放藥物部分。在某些實施例中，連接體之間隔體單元包含對胺基苄基單元。在一些該等實施例中，對胺基苄醇經由醯胺鍵附接至胺基酸單元，且在苄醇與藥物之間製得胺基甲酸酯、胺基甲酸甲基酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103)。在一些實施例中，間隔體單元係對胺基苄基氧基羰基(PAB)。在一些實施例中，包含自分解連接體之ADC具有結構：
其中Q係-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m 係0至4範圍內之整數；且p在1至約20範圍內。在一些實施例中，p在1至10、1至7、1至5或1至4範圍內。
自分解間隔體之其他實例包括(但不限於)電子上類似於PAB基團之芳香族化合物，例如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(美國專利第7,375,078號；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰-或對-胺基苄基縮醛。在一些實施例中，在醯胺鍵水解後可使用經歷環化之間隔體，例如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2：223)、大約經取代二環[2.2.1]及二環[2.2.2]環系統(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55：5867)。藥物與甘胺酸殘基之α-碳之連接係可用於ADC中之自分解間隔體之另一實例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27：1447)。
在一些實施例中，連接體L可為用於經由分枝、多功能連接體部分將一個以上藥物部分共價附接至抗體的樹突型連接體(Sun等人(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。樹突連接體可增加藥物對抗體之比率，即載荷，其與ADC之效能有關。因此，倘若抗體僅具有一個反應性半胱胺酸硫醇基團，則可經由樹突連接體附接多個藥物部分。
非限制性實例性連接體示於下文式I之ADC上下文中：
其他非限制性實例性ADC包括以下結構： 其中X係： ,-(CH2)n-,-(CH2CH2O)n-, Y係： 每一R獨立地係H或C1-C6烷基；且n係1至12。
通常，肽型連接體可藉由在兩個或更多個胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵可(例如)根據液相合成方法(例如，E.Schröder及K.Lübke(1965)「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，Academic Press)製備。
在一些實施例中，連接體經調節溶解性及/或反應性之基團取代。作為非限制性實例，帶電荷取代基(例如磺酸根(-SO3 -)或銨)可增加連接體試劑之水溶解性且有利於連接體試劑與抗體及/或藥物部分之偶合反應，或有利於Ab-L(抗體-連接體中間體)與D、或D-L(藥物-連接體中間體)與Ab之偶合反應，此取決於用於製備ADC之合成途徑。在一些實施例中，一部分連接體偶合至抗體且一部分連接體偶合至藥物，且隨後Ab-(連接體部分)a偶合至藥物-(連接體部分)b以形成式I之ADC。在一些該等實施例中，抗體包含一個以上(連接體部分)a取代基，從而使得一種以上藥物偶合至式I之ADC中之抗體。
本發明化合物明確涵蓋(但不限於)利用以下連接體試劑製備之ADC：雙-馬來醯亞胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-馬來醯亞胺基丙基氧基)-N-羥基琥珀醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-馬來醯亞胺基己醯基氧基)琥珀醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基碸(HBVS)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸)琥珀醯亞胺基酯(LC-SMCC)、間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸琥珀醯亞胺基酯(SBAP)、碘乙酸琥珀醯亞胺基酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、丙酸N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯 (SPDP)、戊酸N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)酯(SPP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)、6-[(β-馬來醯亞胺基丙醯胺基)己酸]琥珀醯亞胺基酯(SMPH)、亞胺基硫烷(IT)、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB、及苯甲酸琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)酯(SVSB)，且包括雙-馬來醯亞胺試劑：二硫基雙馬來醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4雙馬來醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙馬來醯亞胺基己烷(BMH)、雙馬來醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(下文所示)及BM(PEG)3(下文所示)；亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些實施例中，雙-馬來醯亞胺試劑允許抗體中之半胱胺酸之硫醇基團附接至含硫醇之藥物部分、連接體或連接體-藥物中間體。與硫醇基團具有反應性之其他官能基包括(但不限於)碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯及異硫氰酸酯。
某些有用之連接體試劑可自各種市售來源(例如Pierce Biotechnology公司，(Rockford,IL)，Molecular Biosciences公司(Boulder,CO))獲得，或根據業內所述程序合成；例如，Toki等人 (2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Dubowchik，等人，(1997)Tetrahedron Letters,38：5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355；Frisch等人(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。
經碳-14標記之1-異硫氰酸苯甲醯基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於放射性核苷酸與抗體結合的實例性螯合劑。例如，參見WO94/11026。
b)實例性藥物部分 (1)美坦生(Maytansine)及類美坦生
在一些實施例中，免疫結合物包含結合至一或多個類美坦生分子之抗體。類美坦生係美坦生之衍生物，且係藉由抑制微管蛋白聚合起作用之有絲分裂抑制劑。美坦生首先係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離出(美國專利第3896111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美坦生，例如美登醇(maytansinol)及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成類美坦生揭示於(例如)美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號中。
類美坦生藥物部分係抗體-藥物結合物中有吸引力之藥物部分，此乃因其係：(i)相對易於藉由發酵或發酵產物之化學改質或衍生化製備，(ii)易於利用適於經由非二硫化物連接體結合至抗體之官能基衍生化，(iii)在血漿中穩定，(iv)有效抵抗多種腫瘤細胞系。
適用作類美坦生藥物部分之某些類美坦生已為業內已知且可根據已知方法分離自天然源或使用遺傳改造技術產生(例如，參見Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)。類美坦生亦可根據已知方法以合成方式製備。
實例性類美坦生藥物部分包括(但不限於)彼等具有經修飾芳香族環者，例如：C-19-去氯(美國專利第4256746號)(例如，藉由安絲菌素(ansamytocin)P2之氫化鋁鋰還原製備)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4361650號及第4307016號)(例如，藉由使用鏈黴菌(Streptomyces)或放線菌之去甲基化或使用LAH之去氯化製備)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(例如，藉由使用醯氯之醯基化製備)及彼等在芳香族環之其他位置處具有修飾者。
實例性類美坦生藥物部分亦包括彼等具有修飾者：例如：C-9-SH(美國專利第4424219號)(例如，藉由美登醇與H2S或P2S5反應製備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2 OR)(US 4331598)；C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4450254號)(例如，自Nocardia製備)；C-15-羥基/醯氧基(US 4364866)(例如，藉由用鏈黴菌轉化美登醇製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號)(例如，分離自Trewia nudlflora)；C-18-N-去甲基(美國專利第4362663號及第4322348號)(例如，藉由用鏈黴菌使美登醇去甲基化製備)；及4,5-去氧基(US 4371533)(例如，藉由美登醇之三氯化鈦/LAH還原製備)。
類美坦生化合物上之許多位置用作連接位置。舉例而言，酯連接可藉由使用習用偶合技術與羥基反應形成。在一些實施例中，反應可發生在具有羥基之C-3位、經羥基甲基修飾之C-14位、經羥基修飾之C-15位及具有羥基之C-20位處。在一些實施例中，連接係在美登醇 或美登醇類似物之C-3位處。
類美坦生藥物部分包括彼等具有以下結構者：
其中波形線指示類美坦生藥物部分之硫原子與ADC之連接體之共價附接。每一R可獨立地為H或C1-C6烷基。將醯胺基團附接至硫原子之伸烷基鏈可為甲烷基、乙烷基或丙基，即m係1、2或3(US 633410；US 5208020；Chari等人(1992)Cancer Res.52：127-131；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：8618-8623)。
類美坦生藥物部分之所有立體異構體預期用於本發明之ADC，即對掌性碳處之R及S構型之任何組合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison等人(2006)J.Med.Chem.49：4392-4408，其全文以引用方式併入)。在一些實施例中，類美坦生藥物部分具有以下立體化學：
類美坦生藥物部分之實例性實施例包括(但不限於)DM1、DM3 及DM4，其具有以下結構：
其中波形線指示藥物之硫原子與抗體-藥物結合物之連接體(L)之共價附接。
其他實例性類美坦生抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫(其中Ab係抗體且p係1至約20。在一些實施例中，p係1至10，p係1至7，p 係1至5，或p係1至4)：
實例性抗體-藥物結合物(其中DM1經由BMPEO連接體連接至抗體之硫醇基團)具有以下結構及縮寫：
其中Ab係抗體；n係0、1或2；且p係1至約20。在一些實施例中，p係1至10，p係1至7，p係1至5，或p係1至4
含有類美坦生之免疫結合物及其製造方法及其治療用途揭示於(例如)美國專利第5,208,020號及第5,416,064號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等案件之揭示內容以引用方式明確併入本文中。亦參見Liu等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)；及Chari等人.Cancer Research 52：127-131(1992)。
在一些實施例中，抗體-類美坦生結合物可藉由使抗體化學連接至類美坦生分子而不顯著減少抗體或類美坦生分子之生物活性來製備。例如，參見美國專利第5,208,020號(其揭示內容以引用方式明確併入本文中)。在一些實施例中，每抗體分子結合平均3至4個類美坦生分子之ADC在增強靶細胞之細胞毒性中顯示功效，而不會負面地影響抗體之功能或溶解性。在一些情況下，甚至預計相對於使用裸抗體，一個毒素/抗體分子亦會增強細胞毒性。
用於製造抗體-類美坦生結合物之實例性連接基團包括(例如)彼等本文所述者及彼等揭示於美國專利第5208020號、歐洲專利0 425 235 B1、Chari等人.Cancer Research 52：127-131(1992)、US 2005/0276812 A1及US 2005/016993 A1中者，該等案件之揭示內容以引用方式明確併入本文中。
(2)奧裏斯他汀及多拉斯他汀
藥物部分包括多拉斯他汀、奧裏斯他汀及其類似物及衍生物(US 5635483、US 5780588、US 5767237、US 6124431)。奧裏斯他汀係海洋軟體動物化合物多拉斯他汀-10之衍生物。儘管並不意欲受限於任何具體理論，但已顯示多拉斯他汀及奧裏斯他汀會干擾微管動力學、GTP水解及核與細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉斯他汀/奧裏斯他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)末端或C (羧基)末端附接至抗體(WO 02/088172；Doronina等人(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784；Francisco等人(2003)Blood 102(4)：1458-1465)。
實例性奧裏斯他汀實施例包括N-末端連接之單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及DF，其揭示於US 7498298及US 7659241中，該等案件之揭示內容之全文以引用方式明確併入本文中：
其中DE及DF之波形線指示與抗體或抗體-連接體組份之共價附接位點，且在每一位置處獨立地：R2係選自H及C1-C8烷基；R3係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；R4係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；R5係選自H及甲基；或R4與R5一起形成碳環且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra及Rb獨立地選自H、C1-C8烷基及C3-C8碳環且n係選自2、3、4、5及6；R6係選自H及C1-C8烷基；R7係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；每一R8獨立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環及O-(C1-C8烷 基)；R9係選自H及C1-C8烷基；R10係選自芳基或C3-C8雜環；Z係O、S、NH或NR12，其中R12係C1-C8烷基；R11係選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m係1至1000範圍內之整數；R13係C2-C8烷基；R14係H或C1-C8烷基；R15在每次出現時獨立地係H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；R16在每次出現時獨立地係H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18係選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環)及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環)；且n係0至6範圍內之整數。
在一個實施例中，R3、R4及R7獨立地係異丙基或第二丁基且R5係-H或甲基。在實例性實施例中，R3及R4各自係異丙基，R5係-H，且R7係第二丁基。
在又一實施例中，R2及R6各自係甲基，且R9係-H。
在再一實施例中，R8在每次出現時係-OCH3。
在實例性實施例中，R3及R4各自係異丙基，R2及R6各自係甲基，R5係-H，R7係第二丁基，R8在每次出現時係-OCH3，且R9係-H。
在一個實施例中，Z係-O-或-NH-。
在一個實施例中，R10係芳基。
在實例性實施例中，R10係-苯基。
在實例性實施例中，在Z係-O-時，R11係-H、甲基或第三丁基。
在一個實施例中，在Z係-NH時，R11係-CH(R15)2，其中R15係-(CH2)n-N(R16)2，且R16係-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一實施例中，在Z係-NH時，R11係-CH(R15)2，其中R15係-(CH2)n-SO3H。
式DE之實例性奧裏斯他汀實施例係MMAE，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接體(L)之共價附接：
式DF之實例性奧裏斯他汀實施例係MMAF，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接體(L)之共價附接：
其他實例性實施例包括在五肽奧裏斯他汀藥物部分之C-末端具有苯基丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽奧裏斯他汀藥物部分之C-末端具有苯基丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各種連接體組份之式I之ADC的非限制性實例性實施例具有以下結構及縮寫(其中「Ab」係抗體；p係1至約8，「Val-Cit」係纈胺酸-瓜胺酸二肽；且「S」係硫原子：
包含MMAF及各種連接體組份之式I之ADC的非限制性實例性實施例進一步包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。已顯示包含藉由不可蛋白水解裂解之連接體附接至抗體之MMAF的免疫結合物具有與包含藉由可蛋白水解裂解之連接體附接至抗體之MMAF的免疫結合物相當的活性(Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)。在一些該等實施例中，據信藥物釋放可藉由細胞中之抗體降解實現。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或更多個胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵可(例如)根據液相合成方法(例如，參見E.Schröder及K.Lübke，「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，1965，Academic Press)製備。在一些實施例中，奧裏斯他汀/多拉斯他汀藥物部分可根據以下之方法製備：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.,等人Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
在一些實施例中，式DE(例如MMAE)及DF(例如MMAF)之奧裏斯他汀/多拉斯他汀藥物部分及藥物-連接體中間體及其衍生物(例如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE)可使用US 7498298、Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124及Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21：778-784中所述製備且隨後結合至所關注抗體。
(3)卡奇黴素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合至一或多個卡奇黴素分子之抗體。亞皮莫耳濃度之卡奇黴素家族抗生素及其類似物能夠產生雙鏈DNA斷裂(Hinman等人，(1993)Cancer Research 53：3336-3342；Lode等人，(1998)Cancer Research 58：2925-2928)。卡奇黴素具有細胞內作用位點，但在一些情況下，不容易穿過質膜。因此，在一些實施例中，該等藥劑經由抗體介導之內在化之細胞攝入可顯著增強其細胞毒性效應。製備具有卡奇黴素藥物部分之抗體-藥物結合物之非限制性實例性方法闡述於(例如)US 5712374、US 5714586、US 5739116及US 5767285中。
(4)吡咯并苯二氮呯
在一些實施例中，ADC包含吡咯并苯二氮呯(PBD)。在一些實施例中，PDB二聚體識別並結合特異性DNA序列。天然產物安麯黴素(anthramycin)(一種PBD)首先報導於1965年(Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5793-5795；Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5791-5793)。其後，已報導大量天然PBD及其類似物(Thurston等人，(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三環狀PBD架構之二聚體(US 6884799、US 7049311、US 7067511、US 7265105、US 7511032、US 7528126、US 7557099)。並不意欲受限於任何具體理論，據信二聚體結構賦予適當三維形狀與B型DNA之小溝 之等螺旋性，從而在結合位點處產生適貼配合(Kohn,In Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19：230-237)。已顯示具有C2芳基取代基之二聚體PBD化合物可用作細胞毒性劑(Hartley等人(2010)Cancer Res.70(17)：6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7)：2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22)：6463-6466)。
在一些實施例中，PBD化合物可藉由在N10位置處用可活體內移除之氮保護基團對其進行保護用作前藥(WO 00/12507、WO 2005/023814)。
PBD二聚體結合至抗體且顯示所得ADC具有抗癌性質(US 2010/0203007)。PBD二聚體上之非限制性實例性連接位點包括五員吡咯基環、PBD單元之間之系鏈及N10-C11亞胺基團(WO 2009/016516、US 2009/304710、US 2010/047257、US 2009/036431、US 2011/0256157、WO 2011/130598)。
ADC之非限制性實例性PBD二聚體組份具有式A：
及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示與連接體之共價附接位點；虛線指示在C1與C2或C2與C3之間可視需要存在之雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基； R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11係H或R，或其中Q係O、SO3M，其中M係金屬陽離子；R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8雜環基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況在與基團NRR’之關係中，R及R’與其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4-、5-、6-或7員雜環；R12、R16、R19及R17分別係如針對R2、R6、R9及R7所定義；R”係C3-12伸烷基，該鏈可穿插一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶，該等環視情況經取代)；且X及X’獨立地選自O、S及N(H)。
在一些實施例中，R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況在與基團NRR’之關係中，R及R’與其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4-、5-、6-或7員雜環。
在一些實施例中，R9及R19係H。
在一些實施例中，R6及R16係H。
在一些實施例中，R7及R17二者均係OR7A，其中R7A係視情況經取代之C1-4烷基。在一些實施例中，R7A係Me。
在一些實施例中，X係O。
在一些實施例中，R11係H。
在一些實施例中，每一單體單元中C2與C3之間存在雙鍵。
在一些實施例中，R2及R12獨立地選自H及R。在一些實施例中， R2及R12獨立地係R。在一些實施例中，R2及R12獨立地係視情況經取代之C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些實施例中，R2及R12獨立地係視情況經取代之苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或異喹啉基。在一些實施例中，R2及R12獨立地選自=O、=CH2、=CH-RD及=C(RD)2。在一些實施例中，R2及R12係=CH2。在一些實施例中，R2及R12各自係H。在一些實施例中，R2及R12各自係=O。在一些實施例中，R2及R12各自係=CF2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地係=C(RD)2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地係=CH-RD。
在一些實施例中，在R2及/或R12係=CH-RD時，每一基團可獨立地具有下文所示構型：
在一些實施例中，=CH-RD係呈構型(I)。
在一些實施例中，R”係C3伸烷基或C5伸烷基。
在一些實施例中，ADC之實例性PBD二聚體組份具有式A(I)之結構： 其中n係0或1。
在一些實施例中，ADC之實例性PBD二聚體組份具有式A(II)之結構： 其中n係0或1。
在一些實施例中，ADC之實例性PBD二聚體組份具有式A(III)之結構： 其中RE及RE”各自獨立地選自H或RD，其中RD係如上文所定義；且其中n係0或1。
在一些實施例中，n係0。在一些實施例中，n係1。在一些實施例中，RE及/或RE”係H。在一些實施例中，RE及RE”係H。在一些實施例中，RE及/或RE”係RD，其中RD係視情況經取代之C1-12烷基。在一些實施例中，RE及/或RE”係RD，其中RD係甲基。
在一些實施例中，ADC之實例性PBD二聚體組份具有式A(IV)之結構： 其中Ar1及Ar2各自獨立地係視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且其中n係0或1。
在一些實施例中，ADC之實例性PBD二聚體組份具有式A(V)之 結構： 其中Ar1及Ar2各自獨立地係視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且其中n係0或1。
在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地選自視情況經取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地係視情況經取代之苯基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地係視情況經取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地係視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何有用環位置結合至PBD中心。例如，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。在一些實施例中，喹啉基係選自喹啉-3-基及喹啉-6-基。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。在一些實施例中，異喹啉基係選自異喹啉-3-基及異喹啉-6-基。
ADC之其他非限制性實例性PBD二聚體組份具有式B：
及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示與連接體之共價附接位點；連接至OH之波形線指示S或R構型； RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位處)及C5-6雜環基；且n係0或1。
在一些實施例中，RV1及RV2獨立地選自H、苯基及4-氟苯基。
在一些實施例中，連接體可在PBD二聚體藥物部分之不同位點(包括B環之N10亞胺、C環之C-2內/外位置或連接A環之系鏈單元)之一處附接(參見下文結構C(I)及C(II))。
ADC之非限制性實例性PBD二聚體組份包括式C(I)及C(II)：
式C(I)及C(II)以其N10-C11亞胺形式顯示。實例性PBD藥物部分亦包括甲醇胺及經保護甲醇胺形式，如下框中所示：
其中：X係CH2(n=1至5)、N或O；Z及Z’獨立地選自OR及NR2，其中R係含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烷基鏈；R1、R’1、R2及R’2各自獨立地選自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經取代芳基)、C5-20雜芳基、-NH2、-NHMe、-OH及-SH，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子； R3及R’3獨立地選自H、OR、NHR及NR2，其中R係含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烷基鏈；R4及R’4獨立地選自H、Me及OMe；R5係選自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括由鹵基、硝基、氰基、烷氧基、烷基、雜環基取代之芳基)及C5-20雜芳基，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R11係H、C1-C8烷基或保護基團(例如乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苄基氧基羰基(CBZ)、9-茀基甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自分解單元之部分，例如纈胺酸-瓜胺酸-PAB)；R12係H、C1-C8烷基或保護基團；其中R1、R’1、R2、R’2、R5或R12中之一者之氫或A環之間之-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-間隔體之氫經連接至ADC之連接體之鍵替代。
ADC之實例性PDB二聚體部分包括(但不限於)(波形線指示與連接體之共價附接位點)： 包含PBD二聚體之ADC之非限制性實例性實施例具有以下結構： n係0至12。在一些實施例中，n係2至10。在一些實施例中，n係4至8。在一些實施例中，n係選自4及8。
PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab與PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab之連接體係可蛋白酶裂解的，而PBD二聚體-馬來醯亞胺-縮醛之連接體係對酸不穩定。
PBD二聚體及包含PBD二聚體之ADC可根據業內已知方法製備。例如，參見WO 2009/016516、US 2009/304710、US 2010/047257、US 2009/036431、US 2011/0256157、WO 2011/130598。
(5)蒽環
在一些實施例中，ADC包含蒽環。蒽環係具有細胞毒性活性之抗生素化合物。儘管無意受限於任何具體理論，但研究已指示蒽環可藉由多種不同機制操作以殺滅細胞，該等機制包括：1)將藥物分子嵌入細胞之DNA中，藉此抑制DNA依賴性核酸合成；2)由藥物產生游離基團，該等基團隨後與細胞大分子反應，以對細胞造成損害，及/或3)藥物分子與細胞膜相互作用(例如，參見C.Peterson等人，「Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia」，Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R.Bachur,「Free Radical Damage」id，第97-102頁)。蒽環由於其細胞毒性潛能而已用於治療多種癌症，例如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(例如，參見P.H-Wiernik，Anthracycline：Current Status And New Developments第11頁)。
非限制性實例性蒽環包括多柔比星、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、道諾黴素(daunomycin)、奈莫柔比星及其衍生物。已製備並研究唐黴素及多柔比星之免疫結合物及前藥(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13：477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362；Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16：717-721；Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532；King等人(2002)J.Med.Chem.45：4336-4343；EP 0328147；US 6630579)。抗體-藥物結合物BR96-多柔比星會與腫瘤相關性抗原Lewis-Y發生特異性反應，且已在I期及II期研究中進行評估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18：2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour.6：78-81；Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology 17：478-484)。
PNU-159682係奈莫柔比星之有效代謝物(或衍生物)(Quintieri等人，(2005)Clinical Cancer Research 11(4)：1608-1617)。奈莫柔比星 係多柔比星之半合成類似物(其中多柔比星之葡糖苷胺基上具有2-甲氧基嗎啉基)且已進行臨床評估(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rev.17：133；Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65：703；)，包括針對肝細胞癌之II/III期試驗(Sun等人(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research,44：第1版，Abs 4649；Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology 24：14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之非限制性實例性ADC示於式Ia中：
其中R1係氫原子、羥基或甲氧基且R2係C1-C5烷氧基，或其醫藥上可接受之鹽；L1及Z一起係如本文所述連接體(L)；T係如本文所述抗體(Ab)；且m係1至約20。在一些實施例中，m係1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2二者均係甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之其他非限制性實例性ADC示於式Ib中：
其中R1係氫原子、羥基或甲氧基且R2係C1-C5烷氧基，或其醫藥上可接受之鹽；L2及Z一起係如本文所述連接體(L)；T係如本文所述抗體(Ab)；且m係1至約20。在一些實施例中，m係1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2二者均係甲氧基(-OMe)。
在一些實施例中，含有奈莫柔比星之ADC之奈莫柔比星組份係PNU-159682。在一些該等實施例中，ADC之藥物部分可具有以下結構中之一者： 其中波形線指示與連接體(L)之附接。
蒽環(包括PNU-159682)可經由若干連接位點及多個連接體連接至抗體(US 2011/0076287、WO2009/099741、US 2010/0034837、WO 2010/009124)，包括本文所述連接體。
包含奈莫柔比星及連接體之實例性ADC包括(但不限於)：
PNU-159682-val-cit-PAB-間隔體(R1R2)-Ab，其中：R1及R2獨立地選自H及C1-C6烷基；且
PNU-159682馬來醯亞胺縮醛-Ab之連接體係對酸不穩定，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab、PNU-159682-val-cit-PAB-間隔體-Ab及PNU-159682-val-cit-PAB-間隔體(R1R2)-Ab之連接體係可蛋白酶裂解的。
(6)其他藥物部分
藥物部分亦包括格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000) J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)；及酶促活性毒素及其片段，包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石鹼草(Sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、線菌毒素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及新月毒素(tricothecenes)。例如，參見WO 93/21232。
藥物部分亦包括具有溶核活性之化合物(例如，核糖核酸酶或DNA內切核酸酶)。
在某些實施例中，免疫結合物可包含高放射活性原子。多種放射性同位素可用於產生放射性結合抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，當免疫結合物用於檢測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子，例如Tc99或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記物，例如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合試劑複合且結合至抗體(例如)用於PET成像(WO 2011/056983)。
可以已知方式向免疫結合物中納入放射標記物或其他標記物。例如，肽可使用包含(例如)一或多個氟-19原子替代一或多個氫之適宜胺基酸前體生物合成或化學合成。在一些實施例中，可經由抗體中之 半胱胺酸殘基附接諸如Tc99、I123、Re186、Re188及In111等標記物。在一些實施例中，可經由抗體之離胺酸殘基附接釔-90。在一些實施例中，ODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57可用於納入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)闡述某些其他方法。
在某些實施例中，免疫結合物可包含結合至前藥活化酶之抗體。在一些該等實施例中，前藥活化酶將前藥(例如，肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化為藥物，例如抗癌藥物。在一些實施例中，該等免疫結合物可用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)中。可結合至抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶，其可用於將含磷酸酯之前藥轉化成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其可用於將含有硫酸酯之前藥轉化成游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其可用於將非毒性5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶及組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B及L)，其可用於將含肽之前藥轉化為游離藥物；D-丙胺醯基羧基肽酶，其可用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶及神經胺酸酶，其可用於將糖基化前藥轉化成藥物；β-內醯胺酶，其可用於將經β-內醯胺衍生化之藥物轉化成游離藥物；及青黴素(penicillin)醯胺酶，例如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其可用於將在胺氮處分別經苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生化之藥物轉化為游離藥物。在一些實施例中，酶可藉由業內熟知之重組DNA技術共價結合至抗體。例如，參見Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)。
c)藥物載荷
藥物載荷由p表示，即式I分子中每抗體之藥物部分之平均數目。藥物載荷可在1至20個藥物部分(D)/抗體範圍內。式I之ADC包括與多 個(1至20個)藥物部分結合之抗體之集合。來自結合反應之ADC製劑中每抗體之藥物部分之平均數目可藉由習用方式(例如質譜、ELISA分析及HPLC)表徵。亦可測定ADC之定量分佈(以p表示)。在一些情況下，均質ADC之分離、純化及表徵(其中p係具有其他藥物載荷之ADC之特定值)可藉由諸如反相HPLC或電泳等方式達成。
對於一些抗體-藥物結合物而言，p可受限於抗體上之附接位點之數目。例如，若附接係半胱胺酸硫醇，如在上文某些實例性實施例中，則抗體可具有僅一個或若干半胱胺酸硫醇基團，或可具有僅一個或若干足夠反應性硫醇基團，經由其可附接連接體。在某些實施例中，較高藥物載荷(例如p>5)可引起某些抗體-藥物結合物聚集、不溶解、毒性或喪失細胞滲透性。在某些實施例中，ADC之平均藥物載荷在1至約8、約2至約6或約3至約5範圍內。實際上，已顯示對於某些ADC而言，藥物部分/抗體之最佳比例可小於8，且可為約2至約5(US 7498298)。
在某些實施例中，在結合反應期間，少於理論最大值之藥物部分結合至抗體。抗體可含有(例如)不與如下文論述之藥物-連接體中間體或連接體試劑反應之離胺酸殘基。通常，抗體不含許多游離及反應性半胱胺酸硫醇基團，其可連接至藥物部分；實際上抗體中之大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫化物橋形式存在。在某些實施例中，抗體可在部分或完全還原條件下經還原試劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP))還原，以產生反應性半胱胺酸硫醇基團。在某些實施例中，抗體經受變性條件以實現反應性親核基團(例如離胺酸或半胱胺酸)。
ADC之載荷(藥物/抗體比率)可以不同方式加以控制，且例如，藉由：(i)限制藥物-連接體中間體或連接體試劑相對於抗體之莫耳過量，(ii)限制結合反應時間或溫度，及(iii)半胱胺酸硫醇修飾之部分 或限制還原條件。
應瞭解，若一個以上親核基團與藥物-連接體中間體或連接體試劑反應，則所得產物係ADC化合物的混合物，且具有一或多個藥物部分附接至抗體之分佈。每抗體之藥物之平均數目可自混合物藉由雙重ELISA抗體分析計算，該分析對抗體具有特異性且對藥物具有特異性。個別ADC分子可於混合物中藉由質譜鑑別且藉由HPLC(例如疏水相互作用層析)分離(例如，參見McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design & Selection 19(7)：299-307；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Hamblett,K.J.等人「Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」，摘要號624，American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting，2004年3月27至31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」，摘要號627，American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting，2004年3月27至31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些實施例中，具有單一載荷值之均質ADC可藉由電泳或層析自結合混合物分離。
d)某種製備免疫結合物之方法
式I之ADC可藉由採用彼等熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑之若干途徑製備，包括：(1)抗體之親核基團與二價連接體試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，之後與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核基團與二價連接體試劑反應以經由共價鍵形成D-L，之後與抗體之親核基團反應。經由後一途徑製備式I之ADC之實例性方法闡述於US 7498298中，該案件以引用方式明確併入本文中。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基團，(ii)側鏈 胺基團，例如離胺酸，(iii)側鏈硫醇基團，例如半胱胺酸，及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基具有親核性且能夠與連接體部分上之親電基團反應以形成共價鍵且連接體試劑包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及醯鹵；(ii)烷基鹵及苄基鹵，例如鹵基乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基團。某些抗體具有可還原鏈間二硫化物，即半胱胺酸橋。抗體可藉由用還原試劑(例如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP))處理從而完全或部分還原抗體而對與連接體試劑之結合具有反應性。因此，每一半胱胺酸橋將在理論上形成兩個反應性硫醇親核劑。可經由修飾離胺酸殘基(例如，藉由使離胺酸殘基與2-亞胺基硫烷(Traut試劑)反應，從而將胺轉化成硫醇)向抗體中引入額外親核基團。亦可藉由引入1個、2個、3個、4個或更多個半胱胺酸殘基(例如，藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變體抗體)向抗體中引入反應性硫醇基團。
本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由使抗體上之親電基團(例如醛或酮羰基)與連接體試劑或藥物上之親核基團反應來產生。連接體試劑上之有用之親核基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼。在一個實施例中，抗體經修飾以引入能夠與連接體試劑或藥物上之親核取代基反應之親電部分。在另一實施例中，糖基化抗體之糖可經(例如)高碘酸鹽氧化試劑氧化，以形成醛或酮基團，其可與連接體試劑或藥物部分之胺基團反應。所得亞胺席夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定連接，或可由(例如)硼氫化物試劑還原以形成穩定胺連接。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可在抗體中產生羰基(醛及酮)基團，其可與藥物上之適當基團反應(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗 體可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛替代第一胺基酸(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。該醛可與藥物部分或連接體親核劑反應。
藥物部分上之實例性親核基團包括(但不限於)：能夠與連接體部分上之親電基團反應以形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，且連接體試劑包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及醯鹵；(ii)烷基鹵及苄基鹵，例如鹵基乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基團。
可用於製備ADC之非限制性實例性交聯劑試劑在本文中闡述於標題為「實例性連接體」之部分中。業內已知使用該等交聯劑試劑以連接兩個部分(包括蛋白質性部分及化學部分)之方法。在一些實施例中，可藉由(例如)重組技術或肽合成製造包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。重組DNA分子可包含編碼抗體之區域及彼此毗鄰或由編碼連接體肽之區域隔開之結合物之細胞毒性部分，該連接體肽不會破壞結合物之期望性質。
在又一實施例中，抗體可結合至「受體」(例如鏈菌素)以用於腫瘤預靶向中，其中向患者投與抗體-受體結合物，之後使用清潔劑自循環移除未結合結合物且隨後投與結合至細胞毒性劑(例如，藥物或放射性核苷酸)之「配體」(例如，抗生物素蛋白)。
E.用於診斷及檢測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供抗-LY6E抗體中之任一者可用於在生物試樣中檢測LY6E之存在。本文所用術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。「生物試樣」包含(例如)細胞或組織(例如，活檢材料，包括癌性或潛在癌性結腸、結腸直腸、子宮內膜、胰臟或卵巢組織)。
在一個實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗-LY6E抗體。在又一態樣中，提供在生物試樣中檢測LY6E之存在之方法。在某些 實施例中，該方法包含在容許抗-LY6E抗體結合LY6E之條件下使生物試樣與本文所述抗-LY6E抗體接觸，及檢測生物試樣中在抗-LY6E抗體與LY6E之間是否形成複合體。該方法可係活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗-LY6E抗體來選擇使用抗-LY6E抗體之療法之合格個體，例如，其中LY6E係用於選擇患者之生物標記物。在又一實施例中，生物試樣係細胞或組織(例如，活檢材料，包括癌性或潛在癌性結腸、結腸直腸、子宮內膜、胰臟或卵巢組織)。
在又一實施例中，例如出於診斷、預後或分期癌症、測定適當療法過程或監測癌症對療法之反應之目的，藉由(例如)活體內成像在活體內使用抗-Ly6E抗體以檢測個體之LY6E-陽性癌症。業內已知之一種活體內檢測方法係免疫-正電子發射斷層攝影術(免疫-PET)，如(例如)van Dongen等人，The Oncologist 12：1379-1389(2007)及Verel等人，J.Nucl.Med.44：1271-1281(2003)中所述。在該等實施例中，提供檢測個體之LY6E-陽性癌症之方法，該方法包含向患有或懷疑患有LY6E-陽性癌症之個體投與經標記抗-Ly6E抗體，及檢測個體之經標記抗-Ly6E抗體，其中經標記抗-Ly6E抗體之檢測指示個體之LY6E-陽性癌症。在某些該等實施例中，經標記抗-Ly6E抗體包含結合至正電子發射體(例如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I)之抗-Ly6E抗體。在特定實施例中，正電子發射體係89Zr。
在其他實施例中，診斷或檢測方法包含使固定至基材之第一抗-Ly6E抗體與欲測試LY6E之存在之生物試樣接觸，將基材暴露於第二抗-Ly6E抗體，及檢測第二抗-Ly6E是否結合至生物試樣中第一抗-Ly6E抗體與LY6E之間之複合體。基材可為任何支撐性介質，例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合物珠粒、載玻片、晶片及其他基材。在某些實施例中，生物試樣包含細胞或組織(例如，活檢材料，包括癌性或潛在癌性結腸直腸、子宮內膜、胰臟或卵巢組織)。在某些實施例中， 第一或第二抗-Ly6E抗體係本文所述之任何抗體。在該等實施例中，第二抗-Ly6E抗體可為6D3或7C9；或源自如本文所述6D3或7C9之抗體。
可根據上文任一實施例診斷或檢測之實例性病症包括LY6E-陽性癌症，例如LY6E-陽性結腸直腸癌(包括腺癌)、LY6E-陽性卵巢癌(包括卵巢血清腺癌)、LY6E-陽性胰臟癌(包括胰臟導管腺癌)及LY6E-陽性子宮內膜癌。在一些實施例中，LY6E-陽性癌症係在實例B中本文所述條件下抗-Ly6E免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)評分大於「0」之癌症，「0」對應於在>90%腫瘤細胞中染色極弱或無染色。在另一實施例中，LY6E-陽性癌症在實例B中本文所述條件下以1+、2+或3+等級表現LY6E，如所定義。在一些實施例中，LY6E-陽性癌症係根據檢測LY6E mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析表現LY6E之癌症。在一些實施例中，RT-PCR係定量RT-PCR。
在某些實施例中，提供經標記抗-LY6E抗體。標記物包括(但不限於)直接檢測之標記物或部分(例如螢光標記物、發色標記物、電子緻密標記物、化學發光標記物及放射性標記物)以及經由(例如)酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記物包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃(fluorescein)及其衍生物)、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯(dansyl)、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶，美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶合)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記 物、噬菌體標記物、穩定自由基及諸如此類。在另一實施例中，標記物係正電子發射體。正電子發射體包括(但不限於)68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在特定實施例中，正電子發射體係89Zr。
F.醫藥調配物
本文所述抗LY6E抗體或免疫結合物之醫藥調配物係藉由將具有期望純度之該抗體或免疫結合物與一或多種醫藥上可接受之可選載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；氯化苄烷銨；氯化苄甲乙氧銨；酚類、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬複合體(例如Zn-蛋白質複合體)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺聚糖酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體或免疫結合物調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體或免疫結合物調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成份，較佳係彼等具有不會相互不良影響之互補活性者。例如，在一些情況下，可期望進一步提供鉑複合體，例如，用於治療LY6E-陽性癌症，例如，LY6E-陽性乳癌、或LY6E-陽性胰臟癌、或LY6E-陽性結腸癌、或LY6E-陽性結腸直腸癌、或LY6E-陽性黑色素瘤癌症、或LY6E-陽性卵巢癌、或LY6E-陽性非小細胞肺癌或LY6E-陽性胃癌。
可將活性成份裝入藉由(例如)凝聚技術或介面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體或免疫結合物之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常無菌。無菌性可藉由(例如)經由無菌濾膜過濾來容易地實現。
G.治療方法及組合物
本文所提供任何抗-Ly6E抗體或免疫結合物可用於諸如治療方法等方法中。
在一個態樣中，本文所提供抗-Ly6E抗體或免疫結合物用於抑制LY6E-陽性細胞增殖之方法中，該方法包含在容許抗-Ly6E抗體或免 疫結合物結合至細胞表面上之LY6E條件下使細胞暴露於抗-Ly6E抗體或免疫結合物，藉此抑制細胞增殖。在某些實施例中，該方法係活體外或活體內方法。在其他實施例中，細胞係乳癌細胞或胰臟癌細胞或結腸癌細胞、或結腸直腸癌細胞、或黑色素瘤癌細胞、或卵巢癌細胞、或非小細胞肺癌細胞或胃癌細胞。
可使用可自Promega(Madison,WI)購得之CellTiter-GloTM發光細胞存活力分析來分析活體外細胞增殖之抑制。該分析基於存在之ATP之定量測定培養物中之活細胞之數目，該ATP指示代謝活性細胞。參見Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88、美國專利第6602677號。該分析可以96孔或384孔模型事實，使得適於自動化高通量篩選(HTS)。參見Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404。該分析程序涉及直接向培育細胞中添加單一試劑(CellTiter-Glo®試劑)。此引起細胞裂解並產生藉由螢光素酶反應產生之發光信號。發光信號與所存在ATP之量成比例，該ATP之量與培養物中存在之活細胞之數目成正比。可藉由發光儀或或CCD相機成像裝置記錄數據。發光輸出以相對光單位(RLU)表示。
在另一態樣中，提供用作藥劑之抗-LY6E抗體或免疫結合物。在其他態樣中，提供用於治療方法之抗-LY6E抗體或免疫結合物。在某些實施例中，提供用於治療LY6E-陽性癌症之抗-Ly6E抗體或免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有LY6E-陽性癌症之個體之方法中之抗-LY6E抗體或免疫結合物，該方法包含向該個體投與有效量之抗-LY6E抗體或免疫結合物。在一個該實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
在又一態樣中，本發明提供抗-LY6E抗體或免疫結合物在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，該藥劑係用於治療LY6E-陽性 癌症。在又一實施例中，該藥劑係用於治療LY6E-陽性癌症之方法，該方法包含向患有LY6E-陽性癌症之個體投與有效量之該藥劑。在一個該實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
在另一態樣中，本發明提供用於治療LY6E-陽性癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有該LY6E-陽性癌症之個體投與有效量之抗-LY6E抗體或免疫結合物。在一個該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。
上文任一實施例之LY6E-陽性癌症可為(例如)LY6E-陽性乳癌、或LY6E-陽性胰臟癌、或LY6E-陽性結腸癌、或LY6E-陽性結腸直腸癌、或LY6E-陽性黑色素瘤癌症、或LY6E-陽性卵巢癌、或LY6E-陽性非小細胞肺癌或LY6E-陽性胃癌。在一些實施例中，LY6E-陽性癌症係在本文所述條件下抗-Ly6E免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)評分大於「0」之癌症，「0」對應於在>90%腫瘤細胞中染色極弱或無染色。在另一實施例中，LY6E-陽性癌症在本文所述條件下以1+、2+或3+等級表現LY6E，如所定義。在一些實施例中，LY6E-陽性癌症係根據檢測LY6E mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析表現LY6E之癌症。在一些實施例中，RT-PCR係定量RT-PCR。
上文任一實施例之「個體」可係人類。
在又一態樣中，本發明提供包含本文所提供用於(例如)上文任一治療方法之任一抗-LY6E抗體或免疫結合物之醫藥調配物。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供任一抗-LY6E抗體或免疫結合物及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供任一抗-LY6E抗體或免疫結合物及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
本發明抗體或免疫結合物可單獨或與其他藥劑組合用於療法 中。例如，本發明抗體或免疫結合物可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，額外治療劑係鉑複合體，例如用於治療LY6E-陽性癌症，例如LY6E-陽性乳癌、或LY6E-陽性胰臟癌、或LY6E-陽性結腸癌、或LY6E-陽性結腸直腸癌、或LY6E-陽性黑色素瘤癌症、或LY6E-陽性卵巢癌、或LY6E-陽性非小細胞肺癌或LY6E-陽性胃癌。
上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或分開調配物中)及分開投與(在此情形中，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明抗體或免疫結合物)。本發明抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
本發明抗體或免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分地端視投與時間長短而定。本文涵蓋多種投藥方案，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本發明抗體或免疫結合物可以符合良好醫療實踐之方式進行調配、給藥及投與。在此背景下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時間安排及醫療從業者已知之其他因素。抗體或免疫結合物不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於抗體或免疫結合物存於調配物中之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素。該等藥劑通常以相同劑量且以本文所述之投與途徑，或本文所述劑量之約1%至99%，或以經驗/臨床上確定為適宜之任一劑量及任一途徑使用。
對於疾病之預防或治療，本發明抗體或免疫結合物之適宜劑量(在單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、抗體或免疫結合物類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體或免疫結合物係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床史及對抗體或免疫結合物之反應以及主治醫師之判斷。該抗體或免疫結合物適於一次性或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，不論(例如)係藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注來投與，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)抗體或免疫結合物可係投與患者之初始候選劑量。端視上述因素，一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更高之範圍內。在經若干天或更長時間重複投與時，端視病況而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體或免疫結合物之一實例性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任一組合)中之一或多個劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如，以使患者接受約2個至約20個或例如約6個劑量之抗體)。可在開始時投與較高載荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。
應瞭解，可使用本發明免疫結合物及抗-Ly6E抗體實施上文任一調配或治療方法。
H.製品
在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料之製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標籤或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器容納組合物自身或該組合物與另一有效治療、預防及/或診斷病症之組 合物之組合，且可具有無菌存取埠(例如，容器可為靜脈內溶液袋或小瓶，其具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子)。組合物中之至少一種活性劑係本發明抗體或免疫結合物。標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療所選病況。此外，製品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體或免疫結合物；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例之製品可另外包含包裝插頁，其指示組合物可用於治療特定病況。或者或另外，製品可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受之緩衝液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及用戶角度考慮所期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
I.本發明之序列
在本發明之另一態樣中，提供可用於治療、預防及/或診斷上述病症之以下序列。
III.實例
以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，根據上文所提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。
實例1-人類Ly6E基因表現
GeneLogic概況：對於多種人類腫瘤及正常活檢試樣中之Ly6E mRNA表現之分析，自Gene Logic公司獲得Affymetrix數據。使用HGU133加上v2 GeneChip在3,879個正常人類組織試樣(綠色符號)、1,605個人類癌症組織試樣(紅色符號：1,291個原發性及314個轉移性)及3,872個人類非癌症疾病組織試樣(藍色符號)上實施針對探針組ID 202145_at所示之分析。使用Affymetrix MAS(微陣列分析套件)5.0版軟體正規化微陣列數據，且將試樣表現值比例標化為500之截尾均值。
此分析顯示，Ly6E在乳癌、胰臟癌、結腸癌、肺癌及卵巢癌中特異性過表現，正常組織中檢測到低Ly6E或未檢測到(圖2)。
原位雜交(ISH)：在用於評估Ly6E之流行率之卵巢癌組織微陣列(TMA)上根據Methods Mol Biol.2006；326：255-64中建立之方法實施原位雜交。
正向引物GTG CCT GAT CTG TGC CCT TGG-SEQ ID NO：48
反向引物CCC GGA AGT GGC AGA AAC CC-SEQ ID NO：49
探針序列： -SEQ ID NO：50.
結果指示47/65(72%)之所分析卵巢腫瘤顯示Ly6E表現(數據未顯示)。
免疫組織化學(IHC)：在安裝於載玻片上之福爾馬林(formalin)固定之4μm厚石蠟嵌入(FFPE)組織切片上實施免疫組織化學。使載玻片在二甲苯中去石蠟化並經由分級醇再水合成蒸餾水。於99℃下將載玻片用Target Retrieval溶液(Dako,Carpinteria,CA,USA)預處理20分鐘。隨後將載玻片分別用KPL封阻溶液(Kierkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)及抗生物素蛋白/生物素封阻劑(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)處理。用磷酸鹽緩衝鹽水 中之存於3%牛血清白蛋白(Roche,Basel,Switzerland)中之10%馬血清(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)封阻非特異性IgG結合。將一級抗體小鼠抗-Ly6E純系10G7.7.8(參見實例3)稀釋為10μg/mL且於室溫下在載玻片上培育60分鐘。
將載玻片沖洗、與生物素化二級馬抗小鼠IgG(Vector Labs)一起培育，之後在Vectastain ABC Elite試劑(Vector Labs)中培育。隨後將載玻片在Pierce金屬增強之DAB(Thermo Scientific；Fremont,CA)中培育，對比染色，脫水並蓋上蓋玻片。
根據IHC研究，Ly6E之流行率於乳癌中檢測為27%至36%、於胰臟癌中為約40%、於結腸癌中為約26%、於黑色素瘤中為17%至26%、於NSCLC中為約29%(數據未顯示)。
正常組織上之免疫組織化學：在一組正常人類及食蟹猴組織上，檢測到在人類及食蟹猴之胃及唾液腺中低及中度Ly6E表現，在食蟹猴中之腎上腺皮質中之細胞亞群中檢測到低至中度Ly6E表現且在人類樣品中程度較低，且在膀胱之移形上皮中檢測到中度Ly6E表現(僅檢驗食蟹猴)。下表2匯總全面人類及食蟹猴正常組織組中之Ly6E之免疫組織化學(IHC)表現。低(LOW)至中度(MOD)Ly6E表現限於以灰色突出顯示之組織(腎上腺皮質、子宮頸、唾液腺、胃及膀胱)。ND=未實施。NO=無表現。
實例2-定量PCR(QRT PCR)
分析來自Origene,Rockville,MD(HMRT 102)之一組48個正常組織之含有第一DNA鏈之人類主要組織qPCR陣列的Ly6E RNA表現。平行比較一組選擇癌細胞系及組織(乳房及胰臟)中之Ly6E表現。使用來自Applied Biosystems(ABI,Foster City,CA)之試劑、儀器及軟體設定Taqman分析。引物-探針組設計有側接經報告染料FAM及淬滅染料TAMRA雙重標記之螢光探針的引物。
RPL19之引物-探針組：正向引物-5’AGC GGA TTC TCA TGG AAC A(SEQ ID NO：51)；反向引物-5’CTG GTC AGC CAG GAG CTT(SEQ ID NO：52)及探針-5’TCC ACA AGC TGA AGG CAG ACA AGG(SEQ ID NO：53)。
Ly6E之引物-探針組：正向引物-5’AGA AGG CGT CAA TGT TGG T(SEQ ID NO：54)；反向引物-5’CAC TGA AAT TGC ACA GAA AGC(SEQ ID NO：55)及探針-5’TTC CAT GGG CAT CAG CTG CTG(SEQ ID NO：56)。
結果指示與乳癌及胰臟癌中之Ly6E表現相比，正常組織中之Ly6E轉錄本表現較低(圖3)。
實例3-抗體產生及人類化
對於抗-Ly6E單株抗體、純系4D8、10G7及9B12之產生，如下用細菌(埃希氏大腸桿菌)產生之His標記之Ly6E或哺乳動物(CHO-K1S)產生之C-Term myc 6X His標記之Ly6E蛋白質對5隻雌性BALB/c小鼠進行免疫：人類Ly6E cDNA之產生：將來自Origene,Rockville,MD之人類Ly6E及來自Open Biosystems,Lafayette,CO之食蟹猴Ly6E cDNA選殖至逆轉錄病毒N末端gD標記之載體中。使用該等構築體以產生分別穩定表現人類及食蟹猴Ly6E之PC3細胞彙集。
另外，將His標籤人類Ly6E選殖至CMV啟動子驅動之哺乳動物表現系統及細菌表現系統中，以產生自CHO-K1懸浮細胞及埃希氏大腸桿菌分泌之蛋白質。
小鼠之免疫：將小鼠用6個每兩週足墊注射2μg重新懸浮於單磷醯脂質A/海藻糖二棒狀黴菌酸酯佐劑(Ribi Immunochemicals)中之蛋白質免疫。最後加強3天後，使用50%聚乙二醇使膕淋巴結細胞與源自鼠類骨髓瘤細胞系P3X63AgU.1之細胞(CRL1597；American Type Culture Collection)融合。在96孔板中使用次黃嘌呤胺基蝶呤-胸苷(HAT)培養基選擇雜交瘤。10至14天後，收集培養上清液並藉由直接ELISA針對免疫原並藉由流式細胞術以分析結合HT1080轉染細胞系上之Ly6E進行篩選且隨後藉由限制稀釋亞選殖。
hu9B16 CDR移植物之產生-藉由Kunkel誘變使用每一超變區之單獨寡核苷酸產生鼠類9B12(mu9B12)之若干CDR移植物。在瞬時IgG表現載體之背景下製造構築體。藉由DNA測定評價正確純系。如所述使IgG表現並純化(參見Liang,W.-C.等人.Function blocking antibodies to neuropilin-1 generated from a designed human synthetic antibody phage library.Journal of Molecular Biology 366,815-829(2007))。
基於細胞之Ly6E競爭性結合分析-利用含有5mM EDTA之PBS收穫經培養人類Ly6E轉染之PC3細胞。將細胞用PBS洗滌並添加至384孔高結合板(Meso Scale Discovery Technology(MSD)；Gaithersburg,MD)上。將板於室溫下保持1hr以使細胞黏附至板，如所述(參見Lu,Y.,Wong,W.L.及Meng,Y.G.A high throughput electrochemiluminescent cell-binding assay for therapeutic anti-CD20 antibody selection.Journal of Immunological Methods 314,74-79(2006))。將具有細胞之板用含有PBS之胎牛血清封阻1hr且隨後在冰上冷卻。將連續稀釋之抗體變體試樣與相等體積之固定濃度之小鼠9B12 Ab混合。將混合物添加至板上並於4℃下在輕柔振盪下培育1hr。
隨後將板用冷PBS洗滌並向板中添加經硫代-釕標籤標記之抗小鼠IgG Fc特異性Ab(Jackson ImmunoReserach；West Grove,PA)作為檢測試劑。將板於4℃下在輕柔振盪下培育1hr。在培育後，再次洗滌板，並將MSD讀取緩衝液(MSD；Gaithersburg,MD)添加至孔上。利用MSD SectorÒ成像儀6000對板進行讀數。使用KaleidaGraph軟體(Synergy Software；Reading,PA)對數據繪圖並分析儀測定IC50值。
SPR親和力測定-藉由表面電漿共振使用單一循環動力學在BIAcoreTM-T100上實施親和力測定。經由EDC/NHS化學根據供應商說明書(約20個反應單元(RU))在CM5晶片上固定Hu Ly6E。對於動力學量測，於25℃下以30μl/min之流速注射抗-Ly6E IgG(5nM至405nM)於PBST中之三倍連續稀釋物，締合200s且解離300s。藉由自空白流動室及自相同流動室上運行之緩衝液減去RU校正結合反應。使用同時擬合kon及koff之1：1 Languir模型量測表觀KD。
9B12(抗-Ly6E)之人類化
為人類化鼠類9B12，將超變區(HVR)移植至κ I-VH2或κ I-VH3共 有框架中，以產生含有潛在游標位之不同組合的若干CDR移植物。9B12變體之可變結構域序列與人類共有(圖4)κ I及(圖5)VH2或(圖6)VH3可變結構域框架對準。將不同於人類共有框架之胺基酸位置以灰色突出顯示；將經轉移以產生CDR移植物之區域加框。根據Kabat對位置進行編號(參見Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.及Foeller,C.Sequences of proteins of immunological interest，第5版，(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD；1991)。VL結構域中所用之HVR區係：位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)(圖4)。在VH結構域中，移植位置26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)(圖5及6)。
試圖將新人類框架中潛在影響HVR構象(游標位)之若干位置恢復成小鼠序列以探索其對Ly6E結合親和力之作用。在κ I結構域中，包括位置43、44及71之組合。在VH2結構域中，探索位置24、37、49、73及76之組合，而在VH3結構域中，測試位置24、48、67、71、76及78之組合。所有一起25個變體經構築且表示為IgG(表3)。隨後在基於細胞之Ly6E競爭性結合分析中篩選純化IgG。不管是否使用共有VH2或VH3可變重結構域，大多數HVR構築體皆與Ly6E結合。使用VH2結構域獲得具有最少額外變化之最佳純系hu9B12.v12且其在κ I中含有3個游標位(43、44及71)且在VH2中含有2個游標位(24及49)。表3顯示使用基於細胞之Ly6E競爭性結合分析構築並評價之人類化HVR框架-修復變體的矩陣。
表3 輕鏈
此純系在基於細胞之Ly6E競爭性結合分析中針對人類Ly6E具有約3至5倍減少親和力，但藉由SPR及斯卡查德分析量測之親和力類似(表4)，其中ch9B12表示嵌合變體且9B12.v12表示人類化變體。
實例4-抗-Ly6E抗體與人類及食蟹猴Ly6E之結合
針對抗體實施斯卡查德分析以測定每細胞之親和力及結合位點。使用Iodogen方法將Hu.9B12v12抗體碘化若干次。經放射標記之Hu.9B12v12抗體係藉由凝膠過濾使用NAP-5管柱自游離125I-Na純化且具有11.14-16.01μCi/μg之一系列特異性活性。將50μL含有固定濃度之碘化抗體及減少濃度之未經標記之抗體之競爭反應混合物放置於96孔板中。使用Sigma細胞解離溶液使經逆轉錄病毒穩定轉導以表現重組人類或食蟹猴gD標記之Ly6E的PC3細胞自燒瓶脫離且將其用結合緩衝液(DMEM，具有2% FBS、50mM HEPES(pH 7.2)及0.1%疊氮化鈉)洗滌。將經洗滌細胞以於0.2mL結合緩衝液中200,000個細胞之近似密度添加至含有50-μL競爭反應混合物之96孔板中。具有細胞之每一 競爭反應物中之碘化抗體之最終濃度係200pM且具有細胞之競爭反應物中之未經標記抗體之最終濃度變化，以500nM開始且隨後藉由1：2倍稀釋10個濃度而降低，且包括零添加之僅緩衝液試樣。一式三份地分析對於每一濃度之未經標記抗體之具有細胞之競爭反應物。將具有細胞之競爭反應物於室溫下培育2小時。2小時培育後，將競爭反應物轉移至Millipore Multiscreen過濾板並用結合緩衝液洗滌四次以分離游離與結合碘化抗體。在Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences；Wellesley,MA)上對過濾器進行計數。使用New Ligand軟體(Genentech)評估結合數據，該軟體使用Munson及Rodbard(1980)之擬合算法測定抗體之結合親和力。如圖6之A及圖B及表5中所示，人類及食蟹猴上之Hu9B12v12之結合親和力分別估計為4.0nM及7.9nM。
實例5-抗體藥物結合物之產生
對於較大規模抗體產生，在CHO細胞中產生抗體。將編碼VL及VH之載體轉染至CHO細胞中並藉由蛋白A親和力層析自細胞培養基純化IgG。
vcMMAE ADC之產生：藉由結合hu9B12.v12產生抗-Ly6E抗體-藥物結合物(ADC)或將對照抗gD ADC結合至藥物-連接體部分MC-vc-PAB-MMAE，其繪示於本文中。為方便起見，藥物-連接體部分MC-vc-PAB-MMAE在該等實例及圖中有時稱作「vcMMAE」或「VCE」。在結合之前，使用標準方法根據WO 2004/010957 A2中所述方法利用TCEP部分還原抗體。使用標準方法根據(例如)Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784及US 2005/0238649 A1中所述之方法將部分還原抗體結合至藥物-連接體部分。簡言之，將部分還原抗體與藥物-連接體部分組合以使藥物-連接體部分與抗體之還原半胱胺酸殘基結合。驟冷結合反應並純化ADC。測定每一ADC之藥物載荷(每抗體之藥物部分之平均數目)且對於抗-Ly6E抗體及抗-gD對照抗體介於3.3與4.0之間。
實例6：人類化抗-Ly6E ADC與人類及食蟹猴Ly6E之結合
活體外殺死分析：為評價Hu9B12v12-ADC對細胞存活力之效應，在96孔透明底部黑色黑色板中將細胞以1,500個/孔平鋪於50μL正常生長培養基中。24小時後，向一式三份孔中添加具有Hu9B12v12-ADC濃度之連續稀釋物之額外50μL培養基。5天後，使用CellTiter-Glo發光細胞存活力試劑(G7572；Promega Corporation)且利用EnVision 2101多標記讀數器(Perkin-Elmer)測定細胞存活。對於所測試兩個細胞系，活體外殺死功效似乎與Ly6E於細胞表面上之表現成正比(圖6之圖A及B)。
流式細胞術：對於螢光活化細胞分選(FACS)，在具有2.5mmol/L EDTA之PBS中收穫細胞並在含有1% FBS之PBS緩衝液中進行洗滌。所有隨後步驟均係於4℃下實施。將細胞各自與3μg/mL至5μg/mL一級抗體、之後適當二級抗體一起培育1小時。隨後利用FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences)分析細胞並獲得幾何平均值。使用用於 Ly6E細胞表面檢測之一級抗體Hu.9B12v12、用於N-Term gD標籤檢測之內部產生之抗-gD mAb。使用Alexa 488結合之抗小鼠或抗人類IgG螢光檢測試劑(A11017,A11013；Invitrogen)。
實例7：異種移植物小鼠模型中之抗-Ly6E ADC之活體內功效
乳癌細胞系HCC1569(CRL-2330)、胰臟癌細胞系SU.86.86(CRL-1837)、中國倉鼠卵巢細胞系CHO-K1(CC1-61)及前列腺癌細胞系PC3(CRL-1435)係自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC,Manassas,VA)獲得。CHO-K1S係CHO-K1之懸浮細胞系衍生物。HCC1569 X2細胞系係針對活體內生長最佳化之親代HCC1569細胞系之衍生物(ATCC,CRL-2330)。在雌性Taconic NCr裸小鼠之右側腹皮下注射親代HCC1569細胞，收穫一個腫瘤，切碎並使其在活體外生長，從而產生HCC1569 X1細胞系。試圖在雌性Taconic NCr裸小鼠之右側腹再次皮下注射HCC1569 X1系以改良細胞系之生長。收集此研究之腫瘤並使其再次適於活體外生長以產生HCC1569 X2細胞系。此細胞系及源自此系之腫瘤表現Ly6E。
異種移植物模型：在源自上述細胞系之異種移植物模型中或在原發性患者源之腫瘤模型中評估抗-Ly6E抗體藥物結合物(ADC)之功效，後一實驗係於Oncotest,Freiburg,Germany及XenTech,Genopole,France處實施。
於Genentech,South San Francisco,CA處實施之所有研究均係根據實驗室動物護理及使用導則(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(參照：Institute of Laboratory Animal Resources(NIH公開案第85-23號),Washington,DC：National Academies Press；1996)。於Oncotest處實施之所有實驗均由當地機構批准，且係根據German Animal Welfare Act指南(Tierschutzgesetz)實施。由The Direction des Services Vétérinaires,Ministère de l'Agriculture et de la Pêche,France(協定編號A 91-228-107)獲得在XenTech之CERFE設備中使用動物之授權。動物護理及圈養係根據歐洲公約STE 123。XenTech之所有實驗均將根據關於實驗室動物之保護之法國立法且根據關於脊椎動物動物之實驗之目前有效許可證，由French Ministry for Agriculture and Fisheries頒予Truong-An TRAN博士(編號A 91-541，日期為2010年12月21日；有效期：5年)。將6至9週齡雌性免疫缺陷小鼠在右背側皮下接種並自每組9至10隻小鼠測定平均腫瘤體積及SD。
對於利用源自細胞系之異種移植物之功效研究，將來自Taconic之NCR裸小鼠用具有基質膠之HBSS中之500萬個細胞接種或將來自Charles River之C.B-17 SCID(近親交配)小鼠用具有基質膠之HBSS中之200萬個細胞接種。對於HCC1569 X2異種移植物模型使用0.36mg雌激素植入體。對於利用XenTech及Oncotest之腫瘤植入體之功效研究，對來自Harlan或Charles River之胸腺裸或NMRI nu/nu小鼠植入來自模型HBCx-8、HBCx-9、MAXF-1162及PAXF-1657之原發性乳癌或胰臟癌患者源物質。在腫瘤體積達到約80mm3至200mm3(第0天)時，將動物隨機化成各自9-10名之組且以適當劑量投與媒劑對照或ADC之單一靜脈內(IV)注射。每週兩次量測腫瘤體積直至研究結束。
儘管出於清晰理解之目的藉助闡釋及實例在某些細節上闡述了上述發明，但該等說明及實例不應解釋為限制本發明範圍。本文所引用所有專利及科學文獻之揭示內容的全部內容皆以引用方式明確地併入本文中。
<110> 美商建南德克公司
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<130> P4922R1
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<150> US 61/649,775
<151> 2012-05-21
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<213> 恒河獼猴
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Claims (56)

  1. 一種與Ly6E結合之分離抗體，其中如藉由斯卡查德分析法(scatchard analysis)所量測，該抗體係以之4nM之親和力結合SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位。
  2. 如請求項1之抗體，其係單株抗體。
  3. 如請求項1之抗體，其係人類、人類化或嵌合抗體。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體在結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之該表位時，於表現Ly6E之細胞中內化。
  5. 如請求項1之抗體，其係結合至SEQ ID NO：1之胺基酸21至131內之表位之抗體片段。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，(b)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：9，及(c)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(c)HVR-H3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：12。
  8. 如請求項7之抗體，其進一步包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：9。
  9. 如請求項1之抗體，其包含(a)HVR-L1，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：8；及(c)HVR-L3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：9。
  10. 如請求項8之抗體，其進一步包含輕鏈可變結構域框架FR2序列SEQ ID NO：20或輕鏈可變結構域框架FR3 SEQ ID NO：21或重鏈可變結構域框架FR1 SEQ ID NO：23或重鏈可變結構域框架FR2 SEQ ID NO：24。
  11. 如請求項1之抗體，其包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
  12. 如請求項10之抗體，其包含SEQ ID NO：5之VH序列。
  13. 如請求項10之抗體，其包含SEQ ID NO：3之VL序列。
  14. 一種抗體，其包含SEQ ID NO：5之VH序列及SEQ ID NO：3之VL序列。
  15. 如請求項1之抗體，其係IgG1、IgG2a或IgG2b。
  16. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至15中任一項之抗體。
  17. 一種宿主細胞，其包含如請求項16之核酸。
  18. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項17之宿主細胞，以產生該抗體。
  19. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  20. 如請求項19之免疫結合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab係如請求項1至14中任一項之抗體；(b)L係連接體；(c)D係選自類美坦生(maytansinoid)、奧裏斯他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯二氮呯及奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物之藥物；且(d)p在1至8範圍內。
  21. 如請求項20之免疫結合物，其中D係奧裏斯他汀。
  22. 如請求項21之免疫結合物，其中D具有式DE 且其中R2及R6各自係甲基，R3及R4各自係異丙基，R5係H，R7係第二丁基，每一R8獨立地選自CH3、O-CH3、OH及H；R9係H；且R18係-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
  23. 如請求項20之免疫結合物，其中該藥物係MMAE。
  24. 如請求項21之免疫結合物，其中D係式A之吡咯并苯二氮呯： 其中虛線指示在C1與C2或C2與C3之間可視需要存在之雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11係H或R，或其中Q係O、SO3M，其中M係金屬陽離子；R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況在與基團NRR’之關係中，R及R’與其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4-、5-、6-或7員雜環； R12、R16、R19及R17分別係如針對R2、R6、R9及R7所定義；R”係C3-12伸烷基，該鏈可穿插一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳香族環；且X及X’獨立地選自O、S及N(H)。
  25. 如請求項24之免疫結合物，其中D具有以下結構： 其中n係0或1。
  26. 如請求項20之免疫結合物，其中D係奈莫柔比星衍生物。
  27. 如請求項26之免疫結合物，其中D具有選自以下之結構：
  28. 如請求項20至27中任一項之免疫結合物，其中該連接體可被蛋 白酶裂解。
  29. 如請求項28之免疫結合物，其中該連接體包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
  30. 如請求項20至27中任一項之免疫結合物，其中該連接體係對酸不穩定。
  31. 如請求項30之免疫結合物，其中該連接體包含腙。
  32. 如請求項22之免疫結合物，其具有下式： 其中S係硫原子。
  33. 如請求項25之免疫結合物，其具有下式：
  34. 如請求項27之免疫結合物，其具有選自以下之式：
  35. 如請求項20至27及32至34中任一項之免疫結合物，其中p在2至5範圍內。
  36. 如請求項20至27及32至34中任一項之免疫結合物，其包含如請求項8之抗體。
  37. 如請求項20至27及32至34中任一項之免疫結合物，其包含如請求項14之抗體。
  38. 一種醫藥調配物，其包含如請求項20至37中任一項之免疫結合物及醫藥上可接受之載劑。
  39. 如請求項38之醫藥調配物，其進一步包含額外治療劑。
  40. 如請求項39之醫藥調配物，其中該額外治療劑係鉑複合體。
  41. 一種如請求項20至37中任一項之免疫結合物之用途，其用於製造用以治療患有Ly6E-陽性癌症之個體之藥劑。
  42. 如請求項41之用途，其中該Ly6E-陽性癌症係選自乳癌、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌或胃癌。
  43. 如請求項42之用途，其中該藥劑欲與額外治療劑一起投與或進一步包含該額外治療劑。
  44. 如請求項43之用途，其中該額外治療劑係鉑複合體。
  45. 一種如請求項20至37中任一項之免疫結合物之用途，其用於製造用以抑制Ly6E-陽性細胞增殖之藥劑。
  46. 如請求項45之用途，其中該細胞係乳癌、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌或胃癌細胞。
  47. 如請求項1至15中任一項之抗體，其係與標記物結合。
  48. 如請求項47之抗體，其中該標記物係正電子發射體。
  49. 如請求項48之抗體，其中該正電子發射體係89Zr。
  50. 一種檢測生物試樣中之人類Ly6E之方法，該方法包含使該生物試樣與如請求項1至15中任一項之抗-Ly6E抗體在容許該抗-Ly6E抗體與天然人類Ly6E結合之條件下接觸，及檢測該生物試樣中該抗-Ly6E抗體與天然人類Ly6E之間是否形成複合體。
  51. 如請求項50之方法，其中該抗-Ly6E抗體係如請求項8或請求項14之抗體。
  52. 如請求項51之方法，其中該生物試樣係乳癌試樣、胰臟癌試樣、結腸癌試樣、結腸直腸癌試樣、黑色素瘤癌症試樣、卵巢癌試樣、非小細胞肺癌試樣或胃癌試樣。
  53. 一種經標記抗-Ly6E抗體之用途，其用於製造用於檢測Ly6E-陽性癌症之方法中之藥劑，該方法包含(i)向患有或懷疑患有Ly6E-陽性癌症之個體投與經標記之抗-Ly6E抗體，其中該經標記之抗-Ly6E抗體包含如請求項1至15中任一項之抗-Ly6E抗體，及(ii)檢測該個體中之該經標記之抗-Ly6E抗體，其中檢測到該經標記之抗-Ly6E抗體時表示該個體中之Ly6E-陽性癌症。
  54. 如請求項53之用途，其中該經標記之抗-Ly6E抗體係經標記之如請求項8或請求項14之抗體。
  55. 如請求項53或請求項54之用途，其中該經標記之抗-Ly6E抗體包含結合至正電子發射體之抗-Ly6E抗體。
  56. 如請求項55之用途，其中該正電子發射體係89Zr。
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