CN104540519A - 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法 - Google Patents

抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104540519A
CN104540519A CN201380038620.8A CN201380038620A CN104540519A CN 104540519 A CN104540519 A CN 104540519A CN 201380038620 A CN201380038620 A CN 201380038620A CN 104540519 A CN104540519 A CN 104540519A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ly6e
immunoconjugates
cell
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380038620.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104540519B (zh
Inventor
P·常
阪中千惠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN104540519A publication Critical patent/CN104540519A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104540519B publication Critical patent/CN104540519B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明提供抗Ly6E抗体、免疫缀合物及使用它们的方法。

Description

抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年5月21日提交、流水号61/649,775的美国临时专利申请的权益，通过述及将其完整收入本文。
发明领域
本发明涉及抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用它们的方法。
发明背景
淋巴细胞抗原6复合物，基因座E(Ly6E)，也称作视黄酸诱导的基因E(RIG-E)和干细胞抗原2(SCA-2)。它是一种GPI连接的，长131个氨基酸，约8.4kDa的蛋白质，功能未知，无已知的结合配偶物。它最初鉴定为在小鼠中的未成熟胸腺细胞，胸腺髓质上皮细胞中表达的转录物。RIG-E,a humanhomolog of the murine Ly-6 family,is induced by retinoic acid during thedifferentiation of acute promyelocytic leukemia cell.Mao M.,Yu M.,Tong J.-H.,Ye J.,Zhu J.,Huang Q.-H.,Fu G.,Yu L.,Zhao S.-Y.,Waxman S.,Lanotte M.,Wang Z.-Y.,Tan J.-Z.,Chan S.-J.,Chen Z.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:5910-5914(1996)。
本领域需要靶向Ly6E的药剂来诊断和治疗Ly6E相关疾患，诸如癌症。本发明实现该需要且提供其它好处。
发明概述
本发明提供抗Ly6E抗体、免疫缀合物及使用它们的方法。
在一些实施方案中，提供一种结合Ly6E的分离的抗体。在其它实施方案中，该结合Ly6E的抗体结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位。在另一个实施方案中，此类抗体以≤4nM的亲和力结合Ly6E，如通过Scatchard分析测量的。在另一个实施方案中，此类抗体以≤7nM的亲和力结合Ly6E，如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。在还有另一个实施方案中，此类抗体用作药物。
在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤4nM的亲和力结合，如通过Scatchard分析测量的，或以≤7nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR测量的，其为单克隆抗体。在另一个实施方案中，此类抗体为人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。
在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤4nM的亲和力结合，如通过Scatchard分析测量的，且一结合所述SEQ IDNO：1氨基酸21-131内的表位就在表达Ly6E的细胞中内在化。在另一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤7nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR测量的，且一结合所述SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位就在表达Ly6E的细胞中内在化。
在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤4nM的亲和力结合，如通过Scatchard分析测量的，或以≤7nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR测量的，其中该抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO：12的HVR-H3、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2。在另一个实施方案中，此类抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3。在还有另一个实施方案中，上文所述抗体进一步包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。在还有另一个实施方案中，此类抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2、和(c)包含氨基酸序列SEQID NO：9的HVR-L3。
在一个实施方案中，对于包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3及(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1、(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2、和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3的抗体，它进一步包含轻链可变域框架FR2序列SEQ ID NO：20或轻链可变域框架FR3序列SEQ ID NO：21或重链可变域框架FR1序列SEQ ID NO：23或重链可变域框架FR2序列SEQ ID NO：24。
在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤4nM的亲和力结合，如通过Scatchard分析测量的，或以≤7nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR测量的，且包含(a)与氨基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与氨基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在另一个实施方案中，此类抗体包含SEQ ID NO：5的VH序列。在还有另一个实施方案中，此类抗体进一步包含SEQ ID NO：3的VL序列。
在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤4nM的亲和力结合，如通过Scatchard分析测量的，其包含SEQ ID NO：5的VH序列和SEQ ID NO：3的VL序列。在另一个实施方案中，结合SEQ IDNO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤7nM的亲和力结合，如通过SPR测量的，其包含SEQ ID NO：5的VH序列和SEQ ID NO：3的VL序列。
在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤4nM的亲和力结合，如通过Scatchard分析测量的，其为IgG1、IgG2a或IgG2b。在一个实施方案中，结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体以≤7nM的亲和力结合，如通过SPR测量的，其为IgG1、IgG2a或IgG2b。
在一个实施方案中，提供编码本文所述抗体的分离的核酸。在另一个实施方案中，还提供包含此类分离的核酸的宿主细胞。在还有另一个实施方案中，还提供生成抗体的方法，其包括培养包含本文所述分离的核酸的宿主细胞，使得该抗体生成。
在一个实施方案中，提供包含本文所述抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。在另一个实施方案中，此类免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab为本文所述抗体；(b)L为接头；(c)D为选自美登木素生物碱(maytansinoid)、奥瑞司他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)、和奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物的药物；且(d)p范围为1-8。在一些实施方案中，此类免疫缀合物具有D，其为奥瑞司他汀。在其它实施方案中，此类免疫缀合物具有D，其具有式DE：
其中R2和R6各自为甲基；R3和R4各自为异丙基；R5为H；R7为仲丁基；每一个R8独立选自CH3、O-CH3、OH、和H；R9为H；且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
在其它实施方案中，本文所述免疫缀合物具有MMAE作为其药物，MMAE具有结构：
在一个实施方案中，本文所述免疫缀合物具有D，其为式A的吡咯并苯并二氮卓：
其中虚线表示C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；R2独立选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，且任选还选自卤素或二卤素，其中RD独立选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H、和卤素；R6和R9独立选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；R7独立选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；Q独立选自O、S和NH；R11为H，或R，或在Q为O的情况下，SO3M，其中M为金属阳离子；R和R’各自独立选自任选取代的C1-8烃基、C3-8杂环基和C5-20芳基基团，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环环；R12、R16、R19和R17分别如为R2、R6、R9和R7定义的；R”为C3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子和/或任选取代的芳香环中断；且X和X’独立选自O、S和N(H)。在一些实施方案中，在本文所述免疫缀合物中，D具有结构：
其中n为0或1。
在一个实施方案中，在本文所述免疫缀合物中，D为奈莫柔比星衍生物。在另一个实施方案中，D具有选自下示的结构：
在一个实施方案中，本文所述免疫缀合物包含接头，其是蛋白酶可切割的。在其它实施方案中，该接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在还有另一个实施方案中，免疫缀合物包含接头，其是酸不稳定的。在其它实施方案中，该接头包含腙。
在一个实施方案中，免疫缀合物具有选自下示的式：
其中S为硫原子；
在一些实施方案中，p范围为2-5。
在一个实施方案中，本文所述发明的免疫缀合物包含抗体，该抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1、(b)包含氨基酸序列SEQID NO：11的HVR-H2、(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3、(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1、(e)包含氨基酸序列SEQID NO：8的HVR-L2、和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。在另一个实施方案中，本文所述发明的免疫缀合物包含SEQ ID NO：5的VH序列和SEQ ID NO：3的VL序列。
在一个实施方案中，提供包含本文所述发明的免疫缀合物和药学可接受载剂的药物配制剂。在一些实施方案中，药物配制剂进一步包含别的治疗剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为化疗剂，诸如例如铂复合物。
在一个实施方案中，提供治疗具有Ly6E阳性癌症的个体的方法。在一些实施方案中，此类方法包括施用包含本文所述发明的免疫缀合物(其包含结合Ly6E的抗体，例如本文所述的)的药物配制剂。在其它实施方案中，该Ly6E阳性癌症选自乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、结直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、或胃癌。在一些实施方案中，本发明的一种方法包括对个体施用别的治疗剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为化疗剂，诸如例如铂复合物。
在一些实施方案中，提供抑制Ly6E阳性细胞增殖的方法。在一个实施方案中，此类方法包括在允许本文所述发明的免疫缀合物(其包含结合Ly6E的抗体)结合Ly6E阳性细胞表面上的Ly6E的条件下将该细胞暴露于该免疫缀合物。在一些实施方案中，结合Ly6E的抗体为本文所述抗体。在一些实施方案中，Ly6E阳性细胞的增殖由此受到抑制。在一些实施方案中，该细胞为乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、黑素瘤细胞、卵巢癌细胞、非小细胞肺癌细胞、或胃癌细胞。
在一个实施方案中，本文所述结合Ly6E的抗体是与标记物缀合的。在一些实施方案中，此类标记物为正电子发射体。在一些实施方案中，该正电子发射体为89Zr。
在一些实施方案中，提供一种检测生物学样品中的人Ly6E的方法。在一些实施方案中，此类方法包括在允许抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将该生物学样品与该抗Ly6E抗体接触，并检测该抗Ly6E抗体和该生物学样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。在一些实施方案中，抗Ly6E抗体为本文所述抗体。在一些实施方案中，该生物学样品为乳腺癌样品、胰腺癌样品、结肠癌样品、结直肠癌样品、黑素瘤样品、卵巢癌样品、非小细胞肺癌样品、或胃癌样品。
在一个实施方案中，提供一种用于检测Ly6E阳性癌症的方法。在此类实施方案中，一种方法包括(i)将经标记的抗Ly6E抗体施用于具有或怀疑具有Ly6E阳性癌症的受试者，并(ii)检测该受试者中的该经标记的抗Ly6E抗体，其中检测到该经标记的抗Ly6E抗体指示该受试者中的Ly6E阳性癌症。在一些实施方案中，抗Ly6E抗体为本文所述抗体。在其它实施方案中，该Ly6E阳性癌症选自乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、结直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、或胃癌。在本文所述方法的一个实施方案中，本文所述结合Ly6E的抗体是与标记物缀合的。在一些实施方案中，此类标记物为正电子发射体。在一些实施方案中，该正电子发射体为89Zr。
在一些实施方案中，提供结合Ly6E的分离的抗体，其用作药物。在其它实施方案中，该结合Ly6E的抗体结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位。在另一个实施方案中，此类抗体以≤4nM的亲和力结合Ly6E，如通过Scatchard分析测量的。在另一个实施方案中，此类抗体以≤7nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR测量的。在还有另一个实施方案中，此类抗体用于治疗Ly6E阳性癌症。在一些实施方案中，此类抗体用于抑制Ly6E阳性癌细胞增殖。在一些实施方案中，该Ly6E阳性癌细胞为乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、黑素瘤细胞、卵巢癌细胞、非小细胞肺癌细胞、或胃癌细胞。在一些实施方案中，本文所述此类抗体的用途为用于制造药物。在另一个实施方案中，此类用途为用于治疗Ly6E阳性癌症的药物。在还有另一个实施方案中，此类用途为用于抑制Ly6E阳性癌细胞增殖。在一些实施方案中，该Ly6E阳性癌细胞为乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、黑素瘤细胞、卵巢癌细胞、非小细胞肺癌细胞、或胃癌细胞。
附图简述
图1显示序列比对，比较来自人(SEQ ID NO：1)、猕猴(cynomolgusmonkey)(SEQ ID NO：2)、恒河猴(rhesus monkey)(SEQ ID NO：35)、小鼠(SEQ ID NO：36)、和大鼠(SEQ ID NO：37)物种的Ly6E直向同系物的序列。这些序列之间在胞外域(ECD)中在氨基酸水平的百分比同一性显示为人与猕猴Ly6E之间的约96％及人与大鼠Ly6E之间的约52％。
图2显示Ly6E mRNA表达的Genelogic概况，如实施例1中进一步描述的。测量是在Affymetrix U133P芯片上进行的，而且表述为人组织中Ly6E表达的定标平均差异。每个点代表一份正常(绿色)、肿瘤(红色)、或患病非肿瘤(蓝色)人组织标本。矩形涵盖每种分布的25至75百分位范围。WBC＝白细胞。其中，在乳腺、胰腺、结直肠、肺、黑素瘤和卵巢癌中看到Ly6E的过表达。
图3描绘一组正常人组织和选定癌细胞系和组织中针对RPL19对照基因表达标准化的Ly6E转录物表达的QRT-PCR相对倍数变化，如实施例2中描述的。结果指示正常组织中的Ly6E转录物表达与乳腺和胰腺癌中的Ly6E表达相比较低。
图4显示人源化抗Ly6E抗体(hu9B12.v12)与嵌合抗Ly6E抗体(xLy6Emu9B12)和人卡帕I共有序列(卡帕I共有)相比的轻链可变域序列比对。与人共有框架不同的氨基酸位置以灰色阴影标示。为生成CDR嫁接物而转移的区域以框标示。位置依照Kabat编号。
图5显示人源化抗Ly6E抗体(hu9B12.v12)与嵌合抗Ly6E抗体(xLy6Emu9B12)和人VH2共有序列(VH2共有)相比的重链可变域序列比对。与人共有框架不同的氨基酸位置以灰色阴影标示。为生成CDR嫁接物而转移的区域以框标示。位置依照Kabat编号。
图6显示人源化抗Ly6E抗体(hu9B12.v12)与嵌合抗Ly6E抗体(xLy6Emu9B12)和人VH3共有序列(VH3共有)相比的重链可变域序列比对。与人共有框架不同的氨基酸位置以灰色阴影标示。为生成CDR嫁接物而转移的区域以框标示。位置依照Kabat编号。
图7显示抗Ly6E ADC在异种移植物小鼠模型中的体内功效，如实施例7中描述的。小图A显示接种HCC1569 X2乳腺癌细胞的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)。自每组9只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B显示活的HCC1569 X2细胞中的表面Ly6E蛋白质表达，如通过流式细胞术看到的，其中灰色峰指示仅用第二检测试剂处理的细胞，而黑色峰指示用3μg/mL Ly6E抗体(hu9B12v12)ADC处理，接着用作为第二检测试剂的缀合至人IgG的Alexafluor 488处理的细胞。作为几何均值，Ly6E表达显示在柱形图的右边。小图C显示hu9B12v12ADC滴定对乳腺癌细胞系HCC1569 X2的细胞杀伤。将所示浓度的hu9B12v12ADC、对照IgG-vc-MMAE、或等同量的PBS媒介对照与细胞一起温育5天，并使用CellTiter-Glo评估相对细胞存活力(y轴)。
图8显示抗Ly6E ADC在异种移植物小鼠模型中的体内功效。小图A显示接种SU.86.86胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6E ADC。自每组9只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较HCC1569 X1和SU.86.86细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总β-肌动蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示抗Ly6E ADC滴定对胰腺癌细胞系SU.86.86的细胞杀伤。将所示浓度的抗Ly6E ADC、对照IgG-vc-MMAE、或等同量的PBS媒介对照与细胞一起温育5天，并使用CellTiter-Glo评估相对细胞存活力(y轴)。小图D显示SU.86.86细胞团粒上的1+Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。
图9显示抗Ly6E ADC在于XenTech(Evry，France)建立的原代乳腺癌肿瘤异种移植物模型HBCx-9中的体内功效。小图A显示植入患者衍生乳腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6E ADC。自每组9只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种XenTech原代肿瘤模型中及HCC1569 X1和SU.86.86细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总β-肌动蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示HBCx-9肿瘤上的Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示异质染色样式。指出了Ly6E染色处于1+水平的肿瘤细胞的百分比。
图10显示抗Ly6E ADC在于XenTech(Evry，France)建立的原代乳腺癌肿瘤异种移植物模型HBCx-8中的体内功效。小图A显示植入患者衍生乳腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6E ADC。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种XenTech原代肿瘤模型中及HCC1569 X1和SU.86.86细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总β-肌动蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示HBCx-8肿瘤上的Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示处于1+或2+水平的异质染色样式。
图11显示抗Ly6E ADC在于Oncotest GmbH(Freiburg，Germany)建立的原代乳腺癌肿瘤异种移植物模型MAXF-1162中的体内功效。小图A显示植入患者衍生乳腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6E ADC。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种Oncotest原代肿瘤模型及细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总GAPDH蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示MAXF-1162肿瘤上的Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示异质染色样式。指出了Ly6E染色处于1+或2+水平的肿瘤细胞的百分比。
图12显示抗Ly6E ADC在于Oncotest GmbH(Freiburg，Germany)建立的原代胰腺癌肿瘤异种移植物模型PAXF-1657中的体内功效。小图A显示植入患者衍生胰腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6E ADC。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种Oncotest原代肿瘤模型及细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总GAPDH蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示PAXF-1657肿瘤上的Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示异质染色样式。指出了Ly6E染色处于很弱(+/-)水平的肿瘤细胞的百分比。
图13比较多种抗Ly6E ADC缀合物在小鼠异种移植物模型中的体内功效。小图A、B和C均显示用胰腺癌细胞系SU.86.86在免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，给予动物单次IV注射1mpk对照ADC或抗Ly6E ADC，如图上标示的。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图D显示SU.86.86细胞团粒上的1+Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。
本发明实施方案的详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗Ly6E抗体”和“结合Ly6E的抗体”指能够以足够的亲和力结合Ly6E，使得抗体可用作靶向Ly6E中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体对无关的、非Ly6E蛋白的结合程度小于抗体对Ly6E的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)或Scatchard分析或表面等离振子共振(诸如例如Biacore)测量的。在某些实施方案中，结合Ly6E的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Ly6E抗体结合来自不同物种的Ly6E间保守的Ly6E表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
如本文中使用的，术语“抗体药物缀合物”(ADC)等同于术语“免疫缀合物”。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤(例如何杰金(Hodgkin)氏和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体的例子包括过表达Ly6E的癌症，其可以包括例如乳腺癌和/或转移性乳腺癌，包括Her2阴性乳腺癌和/或三重阴性乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、结直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)、胃癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胶质瘤、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、白血病和其它淋巴增殖性病症、和各种类型的头和颈癌。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“表位”指抗原分子上，抗体结合的特定位点。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每一个区域。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的CDR，或a-CDR的CDR区域内。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。免疫缀合物等同于术语“抗体药物缀合物”(ADC)。
“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者指人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗Ly6E抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“Ly6E”指任何天然、成熟Ly6E，其源自细胞中对Ly6E前体蛋白的加工。该术语包括来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人和猕猴或恒河猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的Ly6E，除非另有说明。该术语还包括天然存在的Ly6E变体，例如剪接变体或等位变体。一种带信号序列(氨基酸1-20＝信号序列)的例示性人Ly6E前体蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。一种例示性成熟人Ly6E的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：38。一种例示性猕猴Ly6E的氨基酸1-131的序列显示于SEQ ID NO：2。一种例示性成熟猕猴Ly6E的氨基酸序列显示于SEQID NO：39。一种例示性大鼠Ly6E前体(带信号序列，氨基酸1-26)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQ ID NO：37和42。例示性小鼠Ly6E前体(带信号序列，氨基酸1-26)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQ ID NO：36和41。
术语“Ly6E阳性癌症”指包含在其表面上表达Ly6E的细胞的癌症。为了确定细胞是否在表面上表达Ly6E的目的，认为Ly6E mRNA表达与细胞表面上的Ly6E表达有关联。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法测定Ly6E mRNA表达。或者，可以在诸如免疫组织化学、FACS、等方法中使用例如针对Ly6E的抗体测定细胞表面上的Ly6E表达。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症表示乳腺癌、转移性乳腺癌，包括Her2阴性乳腺癌和/或三重阴性乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、结直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)、或胃癌，其每一种展现高水平的Ly6E表达。
术语“Ly6E阳性细胞”指在其表面上表达Ly6E的癌细胞。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统(包括数码UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指所处形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中与活性成分不同，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文中使用的，“铂复合物”指抗癌化疗药物，诸如例如但不限于顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、异丙铂(iproplatin)、沙铂(satraplatin)、CI-973、AZ0473、DWA2114R、奈达铂(nedaplatin)、和螺铂(sprioplatin)，它们基于它们共价结合DNA的能力发挥针对肿瘤的功效。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每一个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindtet al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007))。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合该抗原的抗体。参见例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991))。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“烃基”(alkyl)指含正、仲、叔或环碳原子的C1-C18烃(碳氢化合物)。例子有甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)。
如本文中使用的，术语“C1-C8烃基”指具有1至8个碳原子的直链的或分支的、饱和的或不饱和的烃。代表性的“C1-C8烃基”基团包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而分支的C1-C8烃基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基，不饱和的C1-C8烃基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基。C1-C8烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
如本文中使用的，术语“C1-C12烃基”指具有1至12个碳原子的直链的或分支的、饱和的或不饱和的烃。C1-C12烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
如本文中使用的，术语“C1-C6烃基”指具有1至6个碳原子的直链的或分支的、饱和的或不饱和的烃。代表性“C1-C6烃基”基团包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、和-正己基；而分支的C1-C6烃基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、和2-甲基丁基；不饱和的C1-C6烃基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、和3-己烯基。C1-C6烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个上文关于C1-C8烃基基团所述的基团取代的。
术语“C1-C4烃基”，如本文中使用的，指具有1至4个碳原子的直链的或分支的、饱和的或不饱和的烃。代表性“C1-C4烃基”基团包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、和-正丁基；而分支的C1-C4烃基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基；不饱和的C1-C4烃基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、和-异丁烯基。C1-C4烃基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个上文关于C1-C8烃基基团所述的基团取代的。
“烃氧基”指与氧形成单键的烃基基团。例示性烃氧基包括但不限于甲氧基(-OCH3)和乙氧基(-OCH2CH3)。“C1-C5烃氧基”指有1至5个碳原子的烃氧基基团。烃氧基基团可以是未取代的，或者是用一个或多个上文关于烃基基团所述的基团取代的。
“烯基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp2双键的含正、仲、叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：次乙基或乙烯基(-CH＝CH2)、丙烯基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)、和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。“C2-C8烯基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp2双键的含2至8个正、仲、叔或环碳原子的烃。
“炔基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp三键的含正、仲、叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和丙炔基(-CH2C≡CH)。“C2-C8炔基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp三键的含2至8个正、仲、叔或环碳原子的烃。
“亚烷基”(alkylene)指1-18个碳原子且具有两个单价基心(radicalcenter)(通过自亲本烷烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的饱和的、分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、等等。
“C1-C10亚烷基”指通式-(CH2)1-10-的直链、饱和烃基团。C1-C10亚烷基的例子包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
“亚烯基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)(通过自亲本烯烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不饱和的、分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烯基包括但不限于：1,2-亚乙烯基(-CH＝CH-)。
“亚炔基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)(通过自亲本炔烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不饱和的、分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚炔基包括但不限于：亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(-CH2C≡C-)、和亚4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“芳基”指碳环芳香族基团。芳基基团的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。碳环芳香族基团或杂环芳香族基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C5-C20芳基”指碳环芳香环中有5至20个碳原子的芳基基团。C5-C20芳基基团的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。C5-C20芳基基团可以是取代的或未取代的，如上文关于芳基基团所述。“C5-C14芳基”指碳环芳香环中有5至14个碳原子的芳基基团。C5-C14芳基基团的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。C5-C14芳基基团可以是取代的或未取代的，如上文关于芳基基团所述。
“亚芳基”指具有两个共价键且可以是邻位、间位、或对位构型(如下示结构所示)的芳基基团：
其中苯基基团可以是未取代的，或者是用至多四个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“芳基烃基”指与碳原子(通常是末端或sp3碳原子)成键的氢原子之一用芳基替换的无环烃基。典型的芳基烃基包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等等。芳基烃基基团包含6至20个碳原子，例如芳基烃基基团的烃基模块(包括烷基、烯基或炔基)是1至6个碳原子，芳基模块是5至14个碳原子。
“杂芳基烃基”指与碳原子(通常是末端或sp3碳原子)成键的氢原子之一用杂芳基替换的无环烃基。典型的杂芳基烃基基团包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基、等等。杂芳基烃基基团包含6至20个碳原子，例如杂芳基烃基基团的烃基模块(包括烷基、烯基或炔基)是1至6个碳原子，杂芳基模块是5至14个碳原子和1至3个选自N、O、P、和S的杂原子。杂芳基烃基基团的杂芳基模块可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P、和S的杂原子)的双环，例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]、或[6,6]体系。
“取代的烃基”、“取代的芳基”、和“取代的芳基烃基”分别指其中一个或多个氢原子各自独立用取代基替换的烃基、芳基、和芳基烃基。典型的取代基包括但不限于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2，其中每一个X独立为卤素：F、Cl、Br、或I；且每一个R独立为-H、C2-C18烃基、C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基团或前体药物模块。上文所述亚烷基、亚烯基、和亚炔基也可以被类似的取代。
“杂芳基”和“杂环”指其中一个或多个环原子是杂原子(例如氮、氧和硫)的环体系。杂环基包含3至20个碳原子和1至3个选自N、O、P、和S的杂原子。杂环可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至3个选自N、O、P、和S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P、和S的杂原子)的双环，例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]、或[6,6]体系。
例示性杂环记载于例如Paquette,Leo A.,“Principles of ModernHeterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)，特别是第1、3、4、6、7、和9章；“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series ofMonographs”(John Wiley&Sons,New York,1950至今)，特别是第13、14、16、19、和28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。
举例而言，杂环的例子包括但不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢硫苯基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氢硫苯基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基(purinyl)、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、酚嗪基、酚噻嗪基、呋咱基、酚嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、唑烷基、苯并三唑基、苯并异唑基、羟吲哚基、苯并唑啉基、和靛红酰基(isatinoyl)。
举例而言而非限制，碳键合的杂环键合于吡啶的2、3、4、5、或6位，哒嗪的3、4、5、或6位，嘧啶的2、4、5、或6位，吡嗪的2、3、5、或6位，呋喃、四氢呋喃、噻吩(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2、3、4、或5位，唑、咪唑或噻唑的2、4、或5位，异唑、吡唑或异噻唑的3、4、或5位，吖丙啶的2或3位，吖丁啶的2、3、或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7、或8位，或异喹啉的1、3、4、5、6、7、或8位。还要更典型的是，碳键合的杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基、或5-噻唑基。
举例而言而非限制，氮键合的杂环键合于吖丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啉、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，及咔唑或β-咔啉的9位。还要更典型的是，氮键合的杂环包括1-吖丙啶基(aziridyl)、1-吖丁啶基(azetedyl)、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基、和1-哌啶基。
“C3-C8杂环”指其中1至4个环碳原子独立地用选自O、S和N的杂原子替换的芳香族或非芳香族C3-C8碳环。C3-C8杂环的代表性例子包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩(benzothiophene)、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、硫苯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异唑基和四唑基。C3-C8杂环可以是未取代的，或者是用至多7个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C8杂环基/C3-C8杂环并”指其中杂环基团的氢原子之一用键替换的上文定义的C3-C8杂环基团。C3-C8杂环基可以是未取代的，或者是用至多6个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C20杂环”指其中1至4个环碳原子独立地用选自O、S和N的杂原子替换的芳香族或非芳香族C3-C20碳环。C3-C20杂环可以是未取代的，或者是用至多7个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C20杂环基/C3-C20杂环并”指其中杂环基团的氢原子之一用键替换的上文定义的C3-C20杂环基团。
“碳环”指饱和的或不饱和的环，作为单环具有3至7个碳原子，作为双环具有7至12个碳原子。单环碳环具有3至6个环原子，还要更典型的是5或6个环原子。双环碳环具有7至12个环原子，例如排列成双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系，或者具有9或10个环原子，排列成双环[5,6]或[6,6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基、和环辛基。
“C3-C8碳环”指3、4、5、6、7或8个成员的饱和的或不饱和的非芳香族碳环。代表性C3-C8碳环包括但不限于-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-环庚基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基、-环辛基、和-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可以是未取代的，或者是用一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每一个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C8碳环基/C3-C8碳环并”指其中碳环基团的氢原子之一用键替换的上文定义的C3-C8碳环基团。
“接头”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头包括二价基，诸如烃二基(alkyldiyl)、芳二基、杂芳二基，诸如-(CR2)nO(CR2)n-、烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethyleneoxy)、PEG、聚亚甲基氧基(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，JeffamineTM)等模块；及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯、和己酰胺。在各种实施方案中，接头可包含一个或多个氨基酸残基，诸如缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、和高赖氨酸。
术语“手性”指分子具有镜像对映体不可重叠的特性，而术语“非手性”指分子可重叠于其镜像对映体上。
术语“立体异构体”指具有相同的化学结构，但是在原子或基团的空间排列方面有所不同的化合物。
“非对映异构体”指具有两个或更多个手性中心且其分子彼此不为镜像对映体的空间异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性、和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率的分析规程下分开，诸如电泳和层析。
“对映异构体”指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种空间异构体。
本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill BookCompany,New York；及Eliel,E.and Wilen,S.,Stereochemistry of OrganicCompounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记，其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们互为镜像。一种特定立体异构体还可称作对映异构体，此类异构体的混合物通常称作对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或工艺中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对映异构体等摩尔混合从而没有旋光性的混合物。
“离去基团”指可以用另一官能团取代的官能团。某些离去基团是本领域公知的，例子包括但不限于卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲烷磺酰基(甲磺酰基)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(三氟甲磺酸根)、和三氟甲基磺酸根。
术语“保护基团”指常用于使化合物上的其它官能团起反应的同时封闭或保护特定官能度的取代基。例如，“氨基保护基团”指附着至化合物中的氨基基团并阻断或保护氨基官能度的取代基。合适的氨基保护基团包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(CBZ)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)。关于保护基团及其用途的一般性说明参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991或更晚的版本。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于结合Ly6E的抗体和包含此类抗体的免疫缀合物。本发明的抗体和免疫缀合物对于例如Ly6E阳性癌症的诊断或治疗是有用的。
A.例示性抗Ly6E抗体
在一些实施方案中，本发明提供结合Ly6E的分离的抗体。在某些实施方案中，抗Ly6E抗体具有至少一项或多项下述特征(任意组合)：
(a)结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位；和
(b)以≤7nM、或≤6nM、或≤5nM、或≤4nM、或≤3nM、或≤2nM、或≤1nM，且任选≥0.0001nM、或≥0.001nM、或≥0.01nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR或Scatchard分析测量的。
本发明的一种非限制性例示性抗体是鼠9B12，如图4-6所示，及其人源化变体，诸如例如hu9B12.v12，如图4-6所示。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E。在一些实施方案中，Ly6E选自人、猕猴、恒河猴、小鼠或大鼠Ly6E。
在一些实施方案中，抗Ly6E抗体结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位。在一些此类实施方案中，该抗Ly6E抗体以≤7nM、或≤6nM、或≤5nM、或≤4nM、或≤3nM、或≤2nM、或≤1nM，且任选≥0.0001nM、或≥0.001nM、或≥0.01nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR或Scatchard分析测量的。本发明的一种非限制性例示性抗体是鼠9B12，如图4-6所示，及其人源化变体，诸如例如hu9B12.v12，如图4-6所示。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E或猕猴Ly6E。
一方面，本发明提供一种抗Ly6E抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQID NO：12的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。在另一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。在又一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。在又一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3。
另一方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQID NO：9的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
另一方面，本发明的抗体包含：(a)VH结构域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2，和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
另一方面，本发明提供一种抗体，其包含：(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
在某些实施方案中，在下述HVR位置替代上文提供的抗Ly6E抗体的任何一个或多个氨基酸：
在任何上述实施方案中，抗Ly6E抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且它进一步包含轻链可变域框架FR2序列SEQ ID NO：20或轻链可变域框架FR3序列SEQ ID NO：21或重链可变域框架FR1序列SEQ ID NO：23或重链可变域框架FR2序列SEQ ID NO：24。
另一方面，抗Ly6E抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列相对于参照序列包含替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：5中替代、插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQ IDNO：5中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO：10的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3。
另一方面，提供一种抗Ly6E抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQ IDNO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VL序列相对于参照序列包含替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQID NO：3中替代、插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQ ID NO：3中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
另一方面，提供一种抗Ly6E抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：3中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含VH序列SEQ ID NO：5和VL序列SEQ ID NO：3的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供了一种抗体，其结合由SEQ ID NO：1氨基酸21-131组成的Ly6E片段内的表位。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
在又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
测定法
为了确定抗Ly6E抗体是否“结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位”，在293细胞中表达具有N和C端删除的Ly6E多肽，并通过FACS测试抗体对截短型多肽的结合，其中抗体对截短型多肽的结合相对于对在293细胞中表达的全长Ly6E的结合的实质性降低(≥70％降低)或消除指示该抗体不结合该截短型多肽。
依照如本文中实施例4所述的Scatchard分析来确定抗Ly6E抗体是否“以≤6nM、或≤5nM、或≤4nM、或≤3nM、或≤2nM、或≤1nM的亲和力结合”。或者，可以依照例如Biacore测定法来测定抗Ly6E抗体亲和力。具体而言，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用-3000(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)测量的。依照供应商的用法说明书用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。将山羊抗人Fc IgG偶联至芯片以实现每个流动室中大约10,000个响应单位(RU)。用1M乙醇胺封闭未反应的偶联基团。为了进行动力学测量，捕捉抗Ly6E抗体以实现大约300RU。于25℃以30μl/min的流速注射人Ly6E(例如杆状病毒系统中表达的与His-Fc融合的氨基酸21-131或自CHO细胞表达的与Fc融合的氨基酸21-131)在HBS-P缓冲液(0.01M HEPESpH7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)中的两倍连续稀释液(125nM至0.49nM)。使用1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreTM EvaluationSoftware version 3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计，诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅动比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
在任何上述实施方案，抗Ly6E抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人受体框架为人VL卡帕IV共有(VLKIV)框架和/或VH框架VH1。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体为基本上全长抗体，例如IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
在又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体为基本上全长抗体，例如IgG2a抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
在又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM，且任选≥10-13M(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM 125I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-)洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数仪(Packard)上对板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用Scatchard分析测量的，如实施例4中所述。依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还可参见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合抗体和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、No.7,527,791、No.6,982,321、和No.7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；Dall’Acquaet al.,Methods 36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；及Osbourn et al.,Methods36:61-68(2005)及Klimka et al.,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(记载FR改组的“引导选择”办法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；及Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(参见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk and van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeuri et al.,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerneriet al.,J.Immunol.147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Lii et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology 20(3):927-937(2005)及Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91(2005)。
也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,in Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Ly6E，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Ly6E，而另一种针对CD3。参见例如美国专利No.5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合Ly6E的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达Ly6E的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991))、和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004 A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan et al.,Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber et al.,J.Immunol.152:5368(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576 A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合Ly6E及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
a)替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”中，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboomet al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于Cunningham and Wells,Science,244:1081-1085(1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变附着于Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改良特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1,Presta,L；及WO 2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)；及WO 2003/085107)。
进一步提供具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(参见例如Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.etal.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312；及Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298、333、和/或334(EU残基编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中做出改变，其导致改变的(即改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551；WO 99/51642；及Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US 2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有替代，例如Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下述残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化，而且如果附着了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗、等。
在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，而且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供编码本文所述抗Ly6E抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成抗Ly6E抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗Ly6E抗体的重组生成，分离编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)，并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利No.5,648,237；No.5,789,199；及No.5,840,523。还可参见Charlton,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以在可溶性级分中自细菌细胞浆分离抗体，并可以进一步纯化。
在原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也是自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(其描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham et al.,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
C.测定法
可通过本领域已知的多种测定法对本文中提供的抗Ly6E抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知方法诸如ELISA、FACS、或Western印迹。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文所述任何抗体竞争对Ly6E的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文所述抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法参见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods inMolecular Biology,vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合Ly6E，例如本文所述任何抗体)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对Ly6E的结合的能力)的溶液中温育固定化Ly6E。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化Ly6E。在允许第一抗体结合Ly6E的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化Ly6E联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化Ly6E联合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对Ly6E的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual,ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含缀合有一种或多种细胞毒剂(诸如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射缀合物))的本文中抗Ly6E抗体的免疫缀合物。
免疫缀合物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，而且在一些实施方案中，在其中胞内积累，在那里系统施用未缀合的药物可对正常细胞导致不可接受水平的毒性(Polakis,P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)是靶向化疗分子，其通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞而组合抗体和细胞毒性药物二者的特性(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004)，由此通过最大化功效及最小化脱靶毒性而增强治疗指数(Carter,P.J.and Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。
本发明的ADC化合物包括那些具有抗癌活性的。在一些实施方案中，该ADC化合物包括缀合(即共价附着)至药物模块的抗体。在一些实施方案中，经由接头将抗体共价附着至药物模块。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)将有效剂量的药物选择性投递至肿瘤组织，由此在提高治疗指数(“治疗窗”)的同时可实现更大的选择性(即更低的有效剂量)。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物模块(D)可包括任何具有细胞毒性或细胞抑制性效果的化合物、模块或基团。药物模块可通过包括但不限于微管蛋白结合、DNA结合或插层、和抑制RNA聚合酶、蛋白质合成、和/或拓扑异构酶的机制来发挥它们的细胞毒性和细胞抑制性效果。例示性药物模块包括但不限于美登木素生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、奥瑞司他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine，PBD)、奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物、PNU-159682、蒽环类抗生素(anthracycline)、度卡霉素(duocarmycin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、紫杉烷(taxane)、单端孢菌素(trichothecene)、CC1065、喜树碱(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)、及其具有细胞毒性活性的立体异构体、电子等排体、类似物、和衍生物。下文更为详细地讨论了此类免疫缀合物的非限制性例子。
1.例示性抗体-药物缀合物
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的一个例示性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物模块(D)、和将Ab附着至D的接头模块(L)。在一些实施方案中，经由一个或多个氨基酸残基(诸如赖氨酸和/或半胱氨酸)将抗体附着至接头模块(L)。
一种例示性ADC具有式I：
Ab-(L-D)p  式I
其中p为1至约20。在一些实施方案中，可缀合至抗体的药物模块的数目受到游离半胱氨酸残基的数目限制。在一些实施方案中，通过本文所述方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。式I的例示性ADC包括但不限于具有1、2、3、或4个工程化改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.et al.(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，抗体中早就存在一个或多个游离半胱氨酸残基，无需使用工程化改造，在这种情况中，可利用现有的游离半胱氨酸残基将抗体缀合至药物。在一些实施方案中，在缀合抗体之前将抗体暴露于还原条件，从而生成一个或多个游离半胱氨酸残基。
a)例示性接头
“接头”(L)为双功能或多功能模块，其可用于将一个或多个药物模块(D)连接至抗体(Ab)以形成式I的抗体-药物缀合物(ADC)。在一些实施方案中，可使用具有反应性官能度(用于共价附着至药物和抗体)的接头来制备抗体-药物缀合物(ADC)。例如，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以生成ADC。
一方面，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能度。非限制性例示性此类反应性官能度包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、活化的酯诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、氯化酸、磺酰氯、异氰酸酯、和异硫氰酸酯。参见例如Klussman et al.(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773第766页上的缀合方法及本文中的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能度。例示性此类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能度的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。非限制性例示性此类反应性官能度包括但不限于酰肼(hydrazide)、肟(oxime)、氨基(amino)、肼(hydrazine)、硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)、和芳酰肼(arylhydrazide)。
接头可包含一种或多种接头构件。例示性接头构件包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“MCC”)。本领域已知多种接头构件，下文描述了其中一些。
接头可以是便于释放药物的“可切割接头”。非限制性例示性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、或含二硫化物接头(Chari et al.(1992)Cancer Research52:127-131；US 5,208,020)。
在某些实施方案中，接头具有下示式II：
-Aa-Ww-Yy-  式II，
其中A为“延伸物单元”(stretcher unit)，而a为0至1的整数；W为“氨基酸单元”，而w为0至12的整数；Y为“间隔物单元”(spacer unit)，而y是0、1、或2；且Ab、D、和p如上文关于式I定义的。此类接头的例示性实施方案记载于美国专利No.7,498,298，通过述及明确将其收入本文。
在一些实施方案中，接头构件包含将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”。非限制性例示性延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价附着至抗体、药物、或别的接头构件的位点)：
在一些实施方案中，接头构件包含“氨基酸单元”。在一些此类实施方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于一暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)就从免疫缀合物释放药物(Doronina et al.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。例示性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽、和五肽。例示性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)、苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)、苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)、和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸(minor amino acid)和/或非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可以针对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶)的酶促切割来设计和优化氨基酸单元。
在一些实施方案中，接头构件包含将抗体连接(或是直接地或是经由延伸物单元和/或氨基酸单元)至药物模块的“间隔物”单元。间隔物单元可以是“自我牺牲的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元指间隔物单元的部分或整体在ADC受到切割后保持结合至药物模块的间隔物单元。非自我牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。在一些实施方案中，肿瘤细胞相关蛋白酶对包含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块自ADC的剩余部分释放。在一些此类实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块在肿瘤细胞中进行水解步骤，如此自药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
“自我牺牲的”间隔物单元容许释放药物模块。在某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苯甲基单元。在一些此类实施方案中，将对氨基苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与药物之间生成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯、或碳酸酯(Hamann et al.(2005)Expert Opin.Ther.Patents 15:1087-1103)。在一些实施方案中，间隔物单元为对氨基苯甲基氧羰基(PAB)。在一些实施方案中，包含自我牺牲的接头的ADC具有结构：
其中Q为-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基、或-氰基；m为范围为0至4的整数；且p范围为1至约20。在一些实施方案中，p范围为1至10、1至7、1至5、或1至4。
自我牺牲的间隔物的其它例子包括但不限于在电子上与PAB基团相似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利No.7,375,078；Hayet al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻位或对位氨基苯甲基乙缩醛。在一些实施方案中，可使用在酰胺键水解后发生环化的间隔物，诸如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues et al.(1995)Chemistry Biology2:223)、恰当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm et al.(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry et al.(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基α碳的连接是在ADC中可能有用的自我牺牲的间隔物的另一个例子(Kingsbury et al.(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在一些实施方案中，接头L可以为树枝状类型接头，其用于经由分支的多官能接头模块将多于一个药物模块共价结合至抗体(Sun et al.(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun et al.(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。树枝状接头可提高药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效力相关。因此，在抗体仅带有一个反应性半胱氨酸硫醇基的情况中，可经由树枝状接头附着众多药物模块。
下文在式I的ADC的背景中显示非限制性例示性接头：
val-cit，
MC-val-cit，
MC-val-cit-PAB。
别的非限制性例示性ADC包括下示结构：
其中X为：
Y为：
每一个R独立为H或C1-C6烃基；且n为1至12。
典型地，可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽型接头。例如，可依照液相合成法来制备此类肽键(例如E.and K.Lübke(1965)“The Peptides”,volume 1,pp 76-136,Academic Press)。
在一些实施方案中，用调控溶解度和/或反应性的基团对接头进行取代。作为一个非限制性例子，带电荷的取代基诸如磺酸酯(-SO3 -)或铵可提高接头试剂的水溶性及便于接头试剂与抗体和/或药物模块的偶联反应，或便于Ab-L(抗体-接头中间体)与D或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于制备ADC所采用的合成路径。在一些实施方案中，将接头的一部分偶联至抗体并将接头的一部分偶联至药物，然后将Ab-(接头部分)a偶联至药物-(接头部分)b以形成式I的ADC。在一些此类实施方案中，抗体包含多于一个(接头部分)a取代基，使得将多于一个药物偶联至式I的ADC中的抗体。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下述接头试剂制备的ADC：二-马来酰亚胺基-三氧乙二醇(BMPEO)，N-(β-马来酰亚胺基丙基氧)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)，N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯(EMCS)，N-[γ-马来酰亚胺基丁酰基氧]琥珀酰亚胺酯(GMBS)，1,6-己烷-二-乙烯基砜(HBVS)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)，琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)，琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)，琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，琥珀酰亚胺基6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯](SMPH)，亚氨基硫烷(IT)，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，和琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，而且包括二-马来酰亚胺试剂：二硫代二马来酰亚胺基乙烷(DTME)，1,4-二马来酰亚胺基丁烷(BMB)，1,4-二马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)，二马来酰亚胺基己烷(BMH)，二马来酰亚胺基乙烷(BMOE)，BM(PEG)2(下文所示)，和BM(PEG)3(下文所示)；亚胺酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。在一些实施方案中，二-马来酰亚胺试剂容许将抗体中的半胱氨酸的硫醇基团附着至含硫醇的药物模块、接头、或接头-药物中间体。与硫醇基团反应性的其它官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯、和异硫氰酸酯。
某些有用的接头试剂可得自各种商业来源，诸如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford，IL)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO)，或者依照本领域中记载的规程合成；例如Toki et al.(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchik et al.(1997)Tetrahedron Letters 38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frisch et al.(1996)Bioconjugate Chem.7:180-186；US 6,214,345；WO 02/088172；US 2003130189；US 2003096743；WO03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。
碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的一种例示性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)例示性药物模块
(1)美登素和美登木素生物碱
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱分子的抗体。美登木素生物碱是美登素(maytansine)的衍生物，而且是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如下述美国专利公开了合成美登木素生物碱：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
美登木素生物碱药物模块在抗体-药物缀合物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于经由非二硫化物接头缀合至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适于用作美登木素生物碱药物模块的某些美登木素生物碱是本领域已知的，而且可以依照已知方法自天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见例如Yu et al.(2002)PNAS 99:7968-7973)。美登木素生物碱也可依照已知方法合成制备。
例示性美登木素生物碱药物模块包括但不限于那些具有经修饰的芳香环的，诸如：C-19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(例如通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4,361,650和No.4,307,016)(例如通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(例如通过使用酰氯的酰化来制备)，以及那些在芳香环的其它位置具有修饰的。
例示性美登木素生物碱药物模块还包括那些具有修饰的，诸如：C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(例如通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US 4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(例如自诺卡氏菌制备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4,364,866)(例如通过链霉菌对美登醇的转化来制备)；C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和No.4,315,929)(例如自Trewianudlflora分离)；C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和No.4,322,348)(例如通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备)；及4,5-脱氧(US 4,371,533)(例如通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。
美登木素生物碱化合物上的许多位置作为连接位置是有用的。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。在一些实施方案中，反应可发生于具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位、和具有羟基的C-20位。在一些实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成连接。
美登木素生物碱药物模块包括那些具有下示结构的：
其中波状线表示美登木素生物碱药物模块的硫原子附着至ADC的接头。每一个R可以独立为H或C1-C6烃基。将酰胺基团附着至硫原子的亚烃基链可以为甲烷基(methanyl)、乙烷基(ethanyl)、或丙基，即m为1、2、或3(US 633410；US 5,208,020；Chari et al.(1992)Cancer Res.52:127-131；Liu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93:8618-8623)。
本发明的ADC涵盖美登木素生物碱药物模块的所有立体异构体，即手性碳处的R和S构型的任何组合(US 7,276,497；US 6,913,748；US 6,441,163；US 633410(RE39151)；US 5,208,020；Widdison et al.(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，通过述及将其完整收录)。在一些实施方案中，美登木素生物碱药物模块具有下示立体化学：
美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括但不限于具有下示结构的DM1、DM3、和DM4：
其中波形线表示药物的硫原子对抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附着。
其它例示性美登木素生物碱抗体-药物缀合物具有如下结构和缩写(其中Ab为抗体，而p为1至约20。在一些实施方案中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4)：
Ab-SPP-DM1，
Ab-SMCC-DM1。
DM1经由BMPEO接头连接至抗体硫醇基团的例示性抗体-药物缀合物具有如下结构和缩写：
其中Ab为抗体；n为0、1、或2；而p为1至约20。在一些实施方案中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4。
包含美登木素生物碱的免疫缀合物及其制备方法和治疗用途公开于例如美国专利No.5,208,020；No.5,416,064；US 2005/0276812 A1；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，据此通过述及明确收录其公开内容。还可参见Liu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623；及Chari et al.(1992)CancerResearch 52:127-131。
在一些实施方案中，抗体-美登木素生物碱缀合物可通过在不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性的情况下将抗体化学连接至美登木素生物碱分子来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，据此通过述及明确收录其公开内容。在一些实施方案中，每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱分子的ADC在对抗体的功能或溶解多没有负面影响的情况下在增强靶细胞的细胞毒性方面显示功效。在一些情况中，甚至一个分子的毒素/抗体预期增强细胞毒性，胜过使用裸抗体。
用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物的例示性连接基团包括例如本文中描述的那些和美国专利No.5,208,020；欧洲专利0 425 235 B1；Chari et al.(1992)Cancer Research 52:127-131；US 2005/0276812 A1；及US 2005/016993A1中披露的那些，据此通过述及明确收录其公开内容。
(2)奥瑞司他汀和多拉司他汀
药物模块包括多拉司他汀、奥瑞司他汀、及其类似物和衍生物(US5,635,483；US 5,780,588；US 5,767,237；US 6,124,431)。奥瑞司他汀是海洋软体动物化合物多拉司他汀-10的衍生物。虽然并非意图限于任何特定理论，多拉司他汀和奥瑞司他汀已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al.(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al.(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。可将多拉司他汀/奥瑞司他汀药物模块经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172；Doronina et al.(2003)Nature Biotechnology 21(7):778-784；Francisco et al.(2003)Blood 102(4):1458-1465)。
例示性奥瑞司他汀实施方案包括N-末端连接的单甲基奥瑞司他汀药物模块DE和DF，披露于US 7,498,298及US 7,659,241，通过述及明确收录其完整公开内容：
其中DE和DF的波形线表示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每一个位置独立地：
R2选自H和C1-C8烃基；
R3选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4与R5一起形成碳环环且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烃基和C3-C8碳环，而n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烃基；
R7选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
每一个R8独立地选自H、OH、C1-C8烃基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烃基)；
R9选自H和C1-C8烃基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH、或NR12，其中R12为C1-C8烃基；
R11选自H、C1-C20烃基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m为范围为1-1000的整数；
R13为C2-C8烃基；
R14为H或C1-C8烃基；
R15的每一次出现独立地为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H、或-(CH2)n-SO3-C1-C8烃基；
R16的每一次出现独立地为H、C1-C8烃基、或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)、和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；且
n为范围为0至6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立地为异丙基或仲丁基，而R5为-H或甲基。在一个例示性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，而R7为仲丁基。
在还有另一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，而R9为-H。
在仍有另一个实施方案中，R8的每一次出现为-OCH3。
在一个例示性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8的每一次出现为-OCH3，而R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一个例示性实施方案中，R10为-苯基。
在一个例示性实施方案中，当Z为-O-时，R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，而R16为-C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
式DE的一种例示性奥瑞司他汀实施方案为MMAE，其中波形线表示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)：
MMAE。
式DF的一种例示性奥瑞司他汀实施方案为MMAF，其中波形线表示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)：
MMAF。
其它例示性实施方案包括在五肽奥瑞司他汀药物模块C末端处具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽奥瑞司他汀药物模块C末端处具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各种接头构件的式I的ADC的非限制性例示性实施方案具有如下结构和缩写(其中“Ab”为抗体；p为1至约8；“Val-Cit”为缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”为硫原子)：
Ab-MC-vc-PAB-MMAF，
Ab-MC-vc-PAB-MMAE，
Ab-MC-MMAE，
Ab-MC-MMAF。
包含MMAF及各种接头构件的式I的ADC的非限制性例示性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。包含通过不可蛋白水解切割的接头附着至抗体的MMAF的免疫缀合物已经显示出拥有与包含通过可蛋白水解切割的接头附着至抗体的MMAF的免疫缀合物相当的活性(Doronina et al.(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124)。在一些此类实施方案中，认为药物释放是通过细胞中的抗体降解来实现的。
典型地，可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备基于肽的药物模块。可依照例如液相合成法来制备此类肽键(参见例如E.and K.Lübke,“The Peptides”,volume 1,pp 76-136,1965,AcademicPress)。在一些实施方案中，奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块可依照下述文献中的方法来制备：US 7,498,298；US 5,635,483；US 5,780,588；Pettit et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit et al.(1998)Anti-Cancer DrugDesign 13:243-277；Pettit,G.R.et al.(1996)Synthesis 719-725；Pettit et al.(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
在一些实施方案中，式DE的奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块(诸如MMAE)、和式DF的奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块(诸如MMAF)、和药物-接头中间体及其衍生物(诸如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、和MC-vc-PAB-MMAE)可使用US 7,498,298；Doroninaet al.(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124；及Doronina et al.(2003)Nat.Biotech.21:778-784中记载的方法来制备，然后将它们缀合至感兴趣的抗体。
(3)加利车霉素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族及其类似物能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂(Hinman et al.(1993)Cancer Research 53:3336-3342；Lode et al.(1998)Cancer Research 58:2925-2928)。加利车霉素具有胞内作用位点，但在某些情况中不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取在一些实施方案中可大大增强它们的细胞毒性效果。制备带有加利车霉素药物模块的抗体-药物缀合物的非限制性例示性方法记载于例如US5,712,374；US 5,714,586；US 5,739,116；及US 5,767,285。
(4)吡咯并苯并二氮卓
在一些实施方案中，ADC包含吡咯并苯并二氮卓(PBD)。在一些实施方案中，PDB二聚体识别并结合特定DNA序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种PBD)首次报告于1965年(Leimgruber et al.(1965)J.Am.Chem.Soc.87:5793-5795；Leimgruber et al.(1965)J.Am.Chem.Soc.87:5791-5793)。自此以后，报告了一些PBD(天然发生的和类似物二者)(Thurston et al.(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三环PBD支架的二聚体(US 6,884,799；US 7,049,311；US 7,067,511；US 7,265,105；US 7,511,032；US 7,528,126；US 7,557,099)。并非意图限于任何特定理论，认为二聚体结构赋予适宜的三维形状以实现与B型DNA的小沟的同螺旋度(isohelicity)，导致在结合位点处的紧密贴合(Kohn,in Antibiotics III.Springer-Verlag,NewYork,pp.3-11(1975)；Hurley and Needham-VanDevanter(1986)Acc.Chem.Res.19:230-237)。携带C2芳基取代基的二聚PBD化合物已经显示出作为细胞毒剂是有用的(Hartley et al.(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard et al.(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22):6463-6466)。
在一些实施方案中，可采用PBD化合物作为药物前体，这通过用在体内可移除的氮保护基团在N10位置处保护它们来实现(WO 00/12507；WO2005/023814)。
已经将PBD二聚体缀合至抗体，而且所得ADC显示出具有抗癌特性(US2010/0203007)。PBD二聚体上的非限制性例示性连接位点包括五元吡咯环、PBD单元之间的系链、和N10-C11亚胺基团(WO 2009/016516；US2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO2011/130598)。
ADC的非限制性例示性PBD二聚体构件为式A：
及其盐和溶剂合物，其中：
波形线表示共价附着至接头的位点；
虚线表示C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，且任选还选自卤素或二卤素，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H、和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
Q独立地选自O、S和NH；
R11为H，或R，或在Q为O的情况下，SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立地选自任选取代的C1-8烃基、C1-12烃基、C3-8杂环基、C3-20杂环基、和C5-20芳基基团，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环环；
R12、R16、R19和R17分别如为R2、R6、R9和R7定义的；
R”为C3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子(例如O、S、N(H)、NMe)和/或芳香环(例如苯或吡啶)(该环是任选取代的)中断；
且X和X’独立地选自O、S和N(H)。
在一些实施方案中，R和R’各自独立选自任选取代的C1-12烃基、C3-20杂环、和C5-20芳基，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环环。
在一些实施方案中，R9和R19为H。
在一些实施方案中，R6和R16为H。
在一些实施方案中，R7和R17均为OR7A，其中R7A为任选取代的C1-4烃基。在一些实施方案中，R7A为Me。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，R11为H。
在一些实施方案中，每一个单体单元中的C2与C3之间存在双键。
在一些实施方案中，R2和R12独立选自H和R。在一些实施方案中，R2和R12独立为R。在一些实施方案中，R2和R12独立为任选取代的C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些实施方案中，R2和R12独立为任选取代的苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基、或异喹啉基。在一些实施方案中，R2和R12独立选自＝O、＝CH2、＝CH-RD、和＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和R12为＝CH2。在一些实施方案中，R2和R12各自为H。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝O。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CF2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立为＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立为＝CH-RD。
在一些实施方案中，当R2和/或R12为＝CH-RD时，每一个基团可独立具有下文所示任一构型：
在一些实施方案中，一个＝CH-RD处于构型(I)。
在一些实施方案中，R”为C3亚烃基基团或C5亚烃基基团。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(I)的结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(II)的结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(III)的结构：
其中RE和RE”各自独立选自H或RD，其中RD如上文定义的；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，RE和/或RE”为H。在一些实施方案中，RE和RE”为H。在一些实施方案中，RE和/或RE”为RD，其中RD为任选取代的C1-12烃基。在一些实施方案中，RE和/或RE”为RD，其中RD为甲基。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(IV)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1和Ar2可以是相同的或不同的；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A(V)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1和Ar2可以是相同的或不同的；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立选自任选取代的苯基、呋喃基、硫苯基和吡啶基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立为任选取代的苯基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立为任选取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基基团可以经由任何可利用环位置结合至PBD核。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以是异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。
ADC的别的非限制性例示性PBD二聚体构件为式B：
及其盐和溶剂合物，其中：
波形线表示共价附着至接头的位点；
连接至OH的波形线表示S或R构型；
RV1和RV2独立选自H、甲基、乙基和苯基(苯基可以是任选用氟取代的，特别是在4位)和C5-6杂环基；且
n为0或1。
在一些实施方案中，RV1和RV2独立选自H、苯基、和4-氟苯基。
在一些实施方案中，接头可附着于PBD二聚体药物模块的多个位点之一，包括B环的N10亚胺、C环的C-2内/外位、或连接A环的系链单元(见下文结构C(I)和C(II))。
ADC的非限制性例示性PBD二聚体构件包括式C(I)和C(II)：
式C(I)和C(II)以它们的N10-C11亚胺形式显示。例示性PBD药物模块还包括甲醇胺以及受到保护的甲醇胺形式，如下文框中显示的：
其中：
X为CH2(n＝1至5)、N、或O；
Z和Z’独立选自OR和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烃基链；R1、R’1、R2和R’2各自独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括取代的芳基)、C5-20杂芳基基团、-NH2、-NHMe、-OH、和-SH，
其中，在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含多至5个碳原子；
R3和R’3独立选自H、OR、NHR、和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烃基链；
R4和R’4独立选自H、Me、和OMe；
R5选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括用卤素、硝基、氰基、烃氧基、烃基、杂环基取代的芳基)和C5-20杂芳基基团，其中，在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含多至5个碳原子；
R11为H、C1-C8烃基、或保护基团(诸如乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(CBZ)、9-芴基甲基烯酰基羰基(Fmoc)、或包含自我牺牲单元的模块诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；
R12为H、C1-C8烃基、或保护基团；
其中R1、R’1、R2、R’2、R5、或R12之一的一个氢或A环之间的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-间隔物的一个氢用连接至ADC的接头的键替换。
ADC的例示性PDB二聚体部分包括但不限于(波形线表示共价附着至接头的位点)：
PBD二聚体。
包含PBD二聚体的ADC的非限制性例示性实施方案具有下示结构：
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab；
PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：
n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。在一些实施方案中，n选自4和8。
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab和PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab的接头是蛋白酶可切割的，而PBD二聚体-马来酰亚胺-乙缩醛的接头是酸不稳定的。
PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC可依照本领域已知方法来制备。参见例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598。
(5)蒽环类抗生素
在一些实施方案中，ADC包含蒽环类抗生素。蒽环类抗生素是展现细胞毒性活性的抗生化合物。并非意图限于任何特定理论，研究已经指出蒽环类抗生素可通过多种不同机制运作来杀伤细胞，包括：1)将药物分子插入细胞的DNA中，由此抑制DNA依赖性核酸合成；2)由药物生成自由基，然后自由基与细胞高分子反应以引起对细胞的损害，和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Peterson et al.,“Transport And Storage Of AnthracyclineIn Experimental Systems And Human Leukemia”in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R.Bachur,“Free Radical Damage”id.at pp.97-102)。由于它们的细胞毒性潜力，蒽环类抗生素已经用于治疗众多癌症，诸如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11)。
非限制性例示性蒽环类抗生素包括多柔比星、表柔比星、伊达比星、道诺霉素、奈莫柔比星、及其衍生物。已经制备并研究柔红霉素和多柔比星的免疫缀合物和药物前体(Kratz et al.(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey et al.(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362；Torgov et al.(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834；Dubowchik et al.(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532；King et al.(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP 0 328 147；US 6,630,579)。抗体-药物缀合物BR96-多柔比星与肿瘤相关抗原Lewis-Y特异性反应，而且已经在I和II期研究中进行评估(Saleh et al.(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292；Ajani et al.(2000)Cancer Jour.6:78-81；Tolcher et al.(1999)J.Clin.Oncology 17:478-484)。
PNU-159682是一种有力的奈莫柔比星代谢物(或衍生物)(Quintieri et al.(2005)Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是多柔比星的一种半合成类似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基团，而且已经处于临床评估(Grandi et al.(1990)Cancer Treat.Rev.17:133；Ripamontiet al.(1992)Brit.J.Cancer 65:703)，包括针对肝细胞癌瘤的II/III期试验(Sunet al.(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of CancerResearch 44:1st Ed,Abs 4649；Pacciarini et al.(2006)Jour.Clin.Oncology24:14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的一种非限制性例示性ADC如式Ia所示：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基基团且R2为C1-C5烃氧基基团，或其药学可接受盐；
L1和Z一起为本文所述接头(L)；
T为本文所述抗体(Ab)；且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10、1至7、1至5、或1至4。
在一些实施方案中，R1和R2二者为甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的又一种非限制性例示性ADC如式Ib所示：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基基团且R2为C1-C5烃氧基基团，或其药学可接受盐；
L2和Z一起为本文所述接头(L)；
T为本文所述抗体(Ab)；且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10、1至7、1至5、或1至4。
在一些实施方案中，R1和R2二者为甲氧基(-OMe)。
在一些实施方案中，含奈莫柔比星的ADC的奈莫柔比星构件为PNU-159682。在一些此类实施方案中，ADC的药物部分可具有下示结构之一：
其中波形线表示附着至接头(L)。
可以经由数个连接位点和多种接头(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)(包括本文所述接头)将蒽环类抗生素(包括PNU-159682)缀合至抗体。
包含奈莫柔比星和接头的例示性ADC包括但不限于：
PNU-159682马来酰亚胺乙缩醛-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物(R1R2)-Ab，其中：
R1和R2独立选自H和C1-C6烃基；和
PNU-159682-马来酰亚胺-Ab。
PNU-159682马来酰亚胺乙缩醛-Ab的接头是酸不稳定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab、PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物-Ab、和PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物(R1R2)-Ab的接头是蛋白酶可切割的。
(6)其它药物模块
药物模块还包括格尔德霉素(Mandler et al.(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler et al.(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028；Mandler et al.(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)；和酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如WO 93/21232。
药物模块还包括具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶)。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射缀合抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在一些实施方案中，在将免疫缀合物用于检测时，它可包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc99或I123，或是包含用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可以将锆-89与各种金属螯合剂络合及与抗体缀合，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入免疫缀合物。例如，可生物合成肽，或是化学合成肽，其中使用包含例如一个或多个氟-19原子代替一个或多个氢的合适氨基酸前体。在一些实施方案中，可以经抗体中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99、I123、Re186、Re188和In111。在一些实施方案中，可以经抗体的赖氨酸残基来附着钇-90。在一些实施方案中，IODOGEN法(Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于掺入碘-123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)记载了某些其它方法。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含缀合至药物前体活化酶的抗体。在一些此类实施方案中，药物前体活化酶将药物前体(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变成活性药物，诸如抗癌药。在一些实施方案中，此类免疫缀合物在抗体依赖性酶介导的药物前体疗法(“ADEPT”)中是有用的。可缀合至抗体的酶包括但不限于对于将含磷酸盐/酯的药物前体转变为游离药物有用的碱性磷酸酶；对于将含硫酸盐/酯的药物前体转变为游离药物有用的芳基硫酸酯酶；对于将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶有用的胞嘧啶脱氨酶；对于将含肽的药物前体转变为游离药物有用的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；对于转化含D-氨基酸替代的药物前体有用的D-丙氨酰羧肽酶；对于将糖基化药物前体转变为游离药物有用的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；对于将用β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物有用的β-内酰胺酶；及对于将在其胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基基团衍生的药物转变为游离药物有用的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。在一些实施方案中，可通过本领域共知的重组DNA技术将酶共价结合至抗体。参见例如Neuberger et al.(1984)Nature 312:604-608。
c)药物载荷
药物载荷(loading)由p表示，即式I的分子中每个抗体的平均药物模块数。药物载荷的范围可以为每个抗体1至20个药物模块(D)。式I的ADC包括缀合有一定范围(1至20个)药物模块的抗体的集合。来自缀合反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模块数可通过常规手段来表征，诸如质谱术、ELISA测定法、和HPLC。还可测定ADC在p方面的定量分布。在一些情况中，将p为某数值的同质ADC自具有其它药物载荷的ADC分离、纯化、和表征可通过诸如反相HPLC或电泳等手段来实现。
对于一些抗体-药物缀合物，p可能受到抗体上附着位点数目限制。例如，在附着为半胱氨酸硫醇的情况中，正如上文某些例示性实施方案中的那样，抗体可能只有一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基团，可附着接头。在某些实施方案中，较高的药物载荷(例如p>5)可引起某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性、或丧失细胞通透性。在某些实施方案中，ADC的平均药物载荷的范围为1至约8；约2至约6；或约3至约5。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率可以为小于8，而且可以为约2至约5(US 7,498,298)。
在某些实施方案中，在缀合反应中少于理论最大值的药物模块缀合至抗体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂反应，如下文讨论的。一般地，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，其可连接至药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的载荷(药物/抗体比率)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应的时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原性条件。
应当理解，在多于一个亲核基团与药物-接头中间体或与接头试剂反应的情况中，所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物混合物。可通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可通过质谱术来鉴定，并通过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如McDonagh et al.(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblettet al.(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.et al.,“Effect ofdrug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of ananti-CD30 antibody-drug conjugate,”Abstract No.624,American Association forCancer Research,2004 Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of theAACR,Volume 45,March 2004；Alley,S.C.et al.,“Controlling the location ofdrug attachment in antibody-drug conjugates,”Abstract No.627,AmericanAssociation for Cancer Research,2004 Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of the AACR,Volume 45,March 2004)。在某些实施方案中，可通过电泳或层析自缀合混合物分离具有单一载荷值的同质ADC。
d)某些制备免疫缀合物的方法
可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件、和试剂通过数种路径来制备式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应以形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应以形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备式I的ADC的例示性方法记载于US 7,498,298，通过述及明确将其收入本文。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基团；(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸；和(iv)在抗体糖基化的情况中糖的羟基或氨基基团。胺、硫醇、和羟基基团是亲核的，而且能够与接头模块上的亲电子基团反应以形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基、和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使得抗体完全或部分还原，从而具有与接头试剂缀合的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。或者，可经由赖氨酸残基的修饰将别的亲核基团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)反应，导致胺转变为硫醇。也可通过引入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)而将反应性硫醇基团引入抗体。
还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来生成本发明的抗体-药物缀合物。接头试剂上的有用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、硫代半卡巴腙、肼羧酸酯、和芳基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基团可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中生成羰基(醛和酮)基团，它们能与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致生成醛替换第一个氨基酸(Geoghegan&Stroh(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5,362,852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
药物模块上的例示性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基、和马来酰亚胺基团。
本文中标题为“例示性接头”的节中描述了可用于制备ADC的非限制性例示性交联剂试剂。使用此类交联剂试剂来连接两个模块(包括蛋白质性质模块和化学模块)的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。重组DNA分子可包含各自编码缀合物的抗体和细胞毒性部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
在还有另一个实施方案中，可以将抗体缀合至“受体”(诸如链霉亲合素)从而用于肿瘤预靶向，其中对患者施用抗体-受体缀合物，接着使用清除剂自循环清除未结合的缀合物，然后施用缀合至细胞毒剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如亲合素)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗Ly6E抗体对于检测生物学样品中Ly6E的存在是有用的。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物学样品”包括例如细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的结肠、结直肠、子宫内膜、胰腺、或卵巢组织)。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗Ly6E抗体。在又一方面，提供检测生物学样品中Ly6E的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗Ly6E抗体结合Ly6E的条件下使生物学样品与本文所述抗Ly6E抗体接触，并检测是否在抗Ly6E抗体与生物学样品中的Ly6E之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗Ly6E抗体来选择适合用抗Ly6E抗体治疗的受试者，例如其中Ly6E是一种用于选择患者的生物标志物。在又一个实施方案中，生物学样品为细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的结肠、结直肠、子宫内膜、胰腺、或卵巢组织)。
在又一个实施方案中，体内使用抗Ly6E抗体来检测(例如通过体内成像)受试者中的Ly6E阳性癌症，例如为了癌症诊断、预后、或分期，确定适宜的治疗过程，或监测癌症对治疗的响应的目的。本领域已知用于体内检测的一种方法是免疫-正电子发射体层摄影术(immuno-PET)，如记载于例如vanDongen et al.(2007)The Oncologist 12:1379-1389及Verel et al.(2003)J.Nucl.Med.44:1271-1281。在此类实施方案中，提供一种用于检测受试者中的Ly6E阳性癌症的方法，该方法包括将经标记的抗Ly6E抗体施用于具有或怀疑具有Ly6E阳性癌症的受试者，并检测受试者中经标记的抗Ly6E抗体，其中检测到经标记的抗Ly6E抗体指示受试者中的Ly6E阳性癌症。在某些此类实施方案中，经标记的抗Ly6E抗体包含缀合至正电子发射体(诸如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr、和124I)的抗Ly6E抗体。在一个特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。
在又一些实施方案中，诊断或检测方法包括使固定化至基片的第一抗Ly6E抗体与要测试Ly6E存在情况的生物学样品接触，使基片暴露于第二抗Ly6E抗体，并检测第二抗Ly6E抗体是否结合至第一抗Ly6E抗体和生物学样品中的Ly6E之间的复合物。基片可以是任何支持性介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合物珠、载片、芯片、和其它基片。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的结直肠、子宫内膜、胰腺或卵巢组织。在某些实施方案中，第一或第二抗Ly6E抗体是本文所述任何抗体。在此类实施方案中，第二抗Ly6E抗体可以是6D3或7C9；或者自6D3或7C9衍生的抗体，如本文中描述的。
可依照任何上述实施方案来诊断或检测的例示性病症包括Ly6E阳性癌症，诸如Ly6E阳性结直肠癌(包括腺癌)、Ly6E阳性卵巢癌(包括卵巢浆液性腺癌)、Ly6E阳性胰腺癌(包括胰管腺癌)、和Ly6E阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是在本文实施例B中所述条件下得到大于“0”的抗Ly6E免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，Ly6E阳性癌症以1+、2+或3+水平表达Ly6E，如在本文实施例B中所述条件下定义的。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是根据检测Ly6E mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法，表达Ly6E的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供经标记的抗Ly6E抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)、以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。在另一个实施方案中，标记物为正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr、和124I。在一个特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的本文所述抗Ly6E抗体或免疫缀合物与一种或多种任选的药学可接受载剂来制备此类抗体或免疫缀合物的药物配制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，处于冻干配制剂或水性溶液形式。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体或免疫缀合物配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体或免疫缀合物配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的多于一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，在一些情况中，可能期望进一步提供铂复合物，例如用于治疗Ly6E阳性癌症，诸如例如Ly6E阳性乳腺癌、或Ly6E阳性胰腺癌、或Ly6E阳性结肠癌、或Ly6E阳性结直肠癌、或Ly6E阳性黑素瘤癌、或Ly6E阳性卵巢癌、或Ly6E阳性非小细胞肺癌、或Ly6E阳性胃癌。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's PharmaceuticalSciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
可以在例如治疗性方法等方法中使用本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物。
在一方面，本文中提供的抗Ly6E抗体或免疫缀合物用于抑制Ly6E阳性细胞增殖的方法，该方法包括在允许抗Ly6E抗体或免疫缀合物结合细胞表面上的Ly6E的条件下将细胞暴露于抗Ly6E抗体或免疫缀合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，该方法是体外或体内方法。在又一些实施方案中，该细胞为乳腺癌细胞、或胰腺癌细胞、或结肠癌细胞、或结直肠癌细胞、或黑素瘤癌细胞、或卵巢癌细胞、或非小细胞肺癌细胞、或胃癌细胞。
体外细胞增殖的抑制可使用可购自Promega(Madison，WI)的CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法来测定。该测定法基于存在的ATP的量化来测定培养物中的可存活细胞的数目。参见Crouch et al.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利No.6,602,677。该测定法可以以96或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree et al.(1995)AntiCancerDrugs 6:398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(CellTiter-试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞的数目成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
在另一方面，提供作为药物使用的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在又一些方面，提供在治疗方法中使用的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供用于治疗Ly6E阳性癌症的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，本发明提供在治疗具有Ly6E阳性癌症的个体的方法中使用的抗Ly6E抗体或免疫缀合物，该方法包括对个体施用有效量的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
在又一方面，本发明提供抗Ly6E抗体或免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗Ly6E阳性癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗Ly6E阳性癌症的方法，该方法包括对具有Ly6E阳性癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
在又一方面，本发明提供用于治疗Ly6E阳性癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有此类Ly6E阳性癌症的个体施用有效量的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。
依照任何上述实施方案的Ly6E阳性癌症可以是例如Ly6E阳性乳腺癌、或Ly6E阳性胰腺癌、或Ly6E阳性结肠癌、或Ly6E阳性结直肠癌、或Ly6E阳性黑素瘤癌、或Ly6E阳性卵巢癌、或Ly6E阳性非小细胞肺癌、或Ly6E阳性胃癌。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是在本文所述条件下得到大于“0”的抗Ly6E免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，Ly6E阳性癌症以1+、2+或3+水平表达Ly6E，如在本文所述条件下定义的。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是根据检测Ly6E mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法，表达Ly6E的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物，例如供任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以单独地或与疗法中的其它药剂组合地使用本发明的抗体或免疫缀合物。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，别的治疗剂为铂复合物，例如用于治疗Ly6E阳性癌症，诸如例如Ly6E阳性乳腺癌、或Ly6E阳性胰腺癌、或Ly6E阳性结肠癌、或Ly6E阳性结直肠癌、或Ly6E阳性黑素瘤癌、或Ly6E阳性卵巢癌、或Ly6E阳性非小细胞肺癌、或Ly6E阳性胃癌。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后发生本发明的抗体或免疫缀合物的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体或免疫缀合物。
可以通过任何合适手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体或免疫缀合物(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的抗体或免疫缀合物应当以一种与较好医学实践一致的方式配制、定剂量、和施用。关于这一点考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状态、病症的起因、药剂递送部位、施用方法、施用日程表、及医学从业人员知道的其它因素。抗体或免疫缀合物无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径，或者以本文所述剂量的约1-99％，或者以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体或免疫缀合物(当单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重性和病程、施用抗体或免疫缀合物是出于预防还是治疗目的、之前的疗法、患者的临床史和对抗体或免疫缀合物的响应、及主治医师的判断。抗体或免疫缀合物恰当地以一次或一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的抗体或免疫缀合物可作为施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用或是通过连续输注。取决于上文所述因素，一个典型日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗一般会持续直至出现疾病症状的期望遏制。抗体或免疫缀合物的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。可施用一个较高的初始加载剂量，接着是一个或多个较低的剂量。然而，其它剂量摄生法可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定方法来监测。
应当理解，可使用本发明的免疫缀合物和抗Ly6E抗体二者实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供一种制品，其包含对于治疗、预防和/或诊断上文所述病症有用的材料。制品包括容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或免疫缀合物。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体或免疫缀合物；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的这个实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示可使用组合物来治疗特定状况。或者/另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液或右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
I.本发明的序列
在本发明的另一方面，提供对于上文所述病症的治疗、预防和/或诊断有用的下述序列。
III.实施例
下文是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般性描述，可实施各种其它实施方案。
实施例1-人Ly6E基因表达
GeneLogic概况：为了分析多份人肿瘤和正常活检样品中的Ly6E mRNA表达，自Gene Logic公司获得Affymetrix数据。为探针集ID 202145_at显示的分析是使用HGU133 Plus v2 GeneChip对3,879份正常人组织样品(绿色符号)、1,605份人癌症组织样品(红色符号：1,291份原代和314份转移)、和3,872份人非癌症疾病组织样品(蓝色符号)进行的。使用Affymetrix MAS(Microarray Analysis Suite)版本5.0软件将微阵列数据标准化，其中样品表达值定标至休整均值500。
这项分析显示Ly6E在乳腺、胰腺、结肠、肺和卵巢癌中特异性过表达，在正常组织中检测到低/无Ly6E(图2)。
原位杂交(ISH)：依照Methods Mol Biol.2006；326:255-64中建立的方法对卵巢癌组织微阵列(TMA)实施原位杂交以评估Ly6E的流行度。
正向引物GTG CCT GAT CTG TGC CCT TGG-SEQ ID NO：48
反向引物CCC GGA AGT GGC AGA AAC CC-SEQ ID NO：49
探针序列：
GTGCCTGATCTGTGCCCTTGGTCCCAGGTCAGGCCCACCCCCTGCACCTCCACCTGCCCCAGCCCCTGCCTCTGCCCAAGTGGGCCAGCTGCCCTCACTTCTGGGGTGGATGATGTGACCTTCCTTGGGGGACTGCGGAAGGGACGAGGGTTCCCTGGAGTCTTACGGTCCAACATCAGACCAAGTCCCATGGACATGCTGACAGGGTCCCCAGGGAGACCGTGTCAGTAGGGATGTGTGCCTGGCTGTGTACGTGGGTGTGCAGTGCACGTGAGAGCACGTGGCGGCTTCTGGGGGCCATGTTTGGGGAGGGAGGTGTGCCAGCAGCCTGGAGAGCCTCAGTCCCTGTAGCCCCCTGCCCTGGCACAGCTGCATGCACTTCAAGGGCAGCCTTTGGGGGTTGGGGTTTCTGCCACTTCCGGG-SEQ ID NO：50。
结果指示47/65份(72％)分析的卵巢肿瘤显示Ly6E表达(数据未显示)。
免疫组织化学(IHC)：对在载玻片上封固的4μm厚福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织切片实施免疫组织化学。将载玻片在二甲苯中脱石蜡，并经由分级醇至蒸馏水来再水合。将载玻片用靶物修复液(Dako，Carpinteria，CA，USA)于99℃预处理20分钟。然后分别用KPL封闭液(Kierkegaard andPerry Laboratories，Gaithersburg，MD，USA)和亲合素/生物素封闭液(VectorLaboratories，Burlingame，CA，USA)处理载玻片。用磷酸盐缓冲盐水中的3％牛血清清蛋白(Roche，Basel，Switzerland)中的10％马血清(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)封闭非特异性IgG结合。将一抗小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8(见实施例3)稀释至10μg/mL，并在载玻片上于室温温育60分钟。
漂洗载玻片，与马抗小鼠IgG生物素化二抗(Vector Labs)一起温育，接着在Vectastain ABC Elite试剂(Vector Labs)中温育。然后将载玻片在Pierce金属增强DAB(Thermo Scientific；Fremont，CA)中温育，复染色，脱水并盖上盖玻片。
根据IHC研究，Ly6E的流行度检测为乳腺癌中27-36％，胰腺癌中约40％，结肠癌中约26％，黑素瘤中17-26％，NSCLC中约29％(数据未显示)。
正常组织的免疫组织化学：对一组正常人和猕猴组织，在人和猕猴二者的胃和唾液腺中检测到低和中等Ly6E表达，在猕猴的肾上腺皮质的一个细胞亚群中检测到低至中等Ly6E表达且在人标本中程度更低，而且在膀胱的移行上皮(transitional epithelium)中检测到中等Ly6E表达(仅检查了猕猴)。下文表2将综合性的一组人和猕猴正常组织中的免疫组织化学(IHC)Ly6E表达列表。低至中等Ly6E表达限于以灰色突显的组织(肾上腺皮质、宫颈、唾液腺、胃和膀胱)。
表2：
实施例2-定量PCR(QRT PCR)
对来自Origene，Rockville，MD(HMRT 102)、含有来自一组48种正常组织的DNA第一条链的人主要组织qPCR阵列针对Ly6E RNA表达进行测定。平行测定一组选定癌细胞系和组织(乳腺和胰腺)中的Ly6E表达。使用来自Applied Biosystems(ABI，Foster City，CA)的试剂、仪器和软件建立Taqman测定法。设计引物-探针集，其中用报告染料FAM和淬灭染料TAMRA双重标记的发荧光探针侧翼为引物。
用于RPL19的引物-探针集：
正向引物-5’AGC GGA TTC TCA TGG AAC A(SEQ ID NO：51)；反向引物-5’CTG GTC AGC CAG GAG CTT(SEQ ID NO：52)；和探针-5’TCCACA AGC TGA AGG CAG ACA AGG(SEQ ID NO：53)。
用于Ly6E的引物-探针：
正向引物-5’AGA AGG CGT CAA TGT TGG T(SEQ ID NO：54)；反向引物-5’CAC TGA AAT TGC ACA GAA AGC(SEQ ID NO：55)；和探针-5’TTC CAT GGG CAT CAG CTG CTG(SEQ ID NO：56)。
结果指示正常组织中的Ly6E转录物表达与乳腺和胰腺癌中的Ly6E表达相比较低(图3)。
实施例3-抗体生成和人源化
为了生成抗Ly6E单克隆抗体克隆4D8、10G7和9B12，如下给5只雌性BALB/c小鼠免疫接种细菌(大肠杆菌)生成的带His标签的Ly6E或哺乳动物(CHO-K1S)生成的带C末端myc 6X His标签的Ly6E蛋白：
人Ly6E cDNA的生成：将来自Origene，Rockville，MD的人Ly6E和来自Open Biosystems，Lafayette，CO的猕猴Ly6E cDNA克隆入带N末端gD标签的逆转录病毒载体。分别使用这些构建体来生成稳定表达人和猕猴Ly6E的PC3细胞集合。
另外，将His标签人Ly6E克隆入CMV启动子驱动的哺乳动物表达系统和细菌表达系统以自CHO-K1悬浮细胞和自大肠杆菌生成分泌的蛋白质。
小鼠的免疫接种：以6次两周一次足垫注射给小鼠免疫接种2μg在单磷酰基脂质A/海藻糖二棒状杆菌酸酯(dicorynomycolate)佐剂(RibiImmunochemicals)中重悬浮的蛋白质。最后一次强化后3天，使用50％聚乙二醇将腘淋巴结细胞与自鼠骨髓瘤细胞系P3X63AgU.1(CRL1597；美国典型培养物保藏中心)衍生的细胞融合。在96孔板中使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基选择杂交瘤。10至14天后，收集培养物上清液，并通过直接ELISA(针对免疫原)和流式细胞术分析(针对对HT1080转染细胞系上的Ly6E的结合)进行筛选，然后通过有限稀释进行亚克隆。
hu9B16CDR嫁接物的生成：使用分开的针对每一个高变区的寡核苷酸通过Kunkel诱变生成鼠9B12(mu9B12)的数种CDR嫁接物。在瞬时IgG表达载体的背景中生成构建体。通过DNA测序来评估正确克隆。如记载的那样表达并纯化IgG(参见Liang,W.-C.et al.,Function blocking antibodies toneuropilin-1generated from a designed human synthetic antibody phage library.Journal of Molecular Biology 366,815-829(2007))。
基于细胞的Ly6E竞争性结合测定法：用含5mM EDTA的PBS收获培养的经人Ly6E转染的PC3细胞。用PBS清洗细胞，并添加到384孔高结合板(MesoScale Discovery Technology(MSD)；Gaithersburg，MD)上。如记载的那样将板于室温保持1小时以容许细胞贴壁至板(参见Lu,Y.,Wong,W.L.&Meng,Y.G.A high throughput electrochemiluminescent cell-binding assay fortherapeutic anti-CD20antibody selection.Journal of Immunological Methods314,74-79(2006))。将带细胞的板用含胎牛血清的PBS封闭1小时，然后在冰上冷却。将系列稀释的抗体变体样品与等体积的固定浓度的小鼠9B12抗体混合。将混合物添加到板上，并在温和摇动中于4℃温育1小时。
然后用冷PBS清洗板，并将作为检测试剂的用磺基-钌标签标记的抗小鼠IgG Fc特异性抗体(Jackson ImmunoReserach；West Grove，PA)添加至板。将板在温和摇动中于4℃温育1小时。温育后再次清洗板，并将MSD读数缓冲液(MSD；Gaithersburg，MD)添加到孔上。用MSD成像仪6000对板读数。使用KaleidaGraph软件(Synergy Software；Reading，PA)对数据绘图和分析以确定IC50值。
SPR亲和力测定：在BIAcoreTM-T100上使用单循环动力学通过表面等离振子共振实施亲和力测定。在CM5芯片上依照供应商的用法说明书经EDC/NHS化学固定化Hu Ly6E(约20个响应单位(RU))。为了动力学测量，于25℃以流速30μl/min注射抗Ly6E IgG在PBST中的3倍系列稀释液(5至405nM)，用于结合为200秒，用于解离为300秒。通过减去来自空白流动室和来自相同流动室上缓冲液运行的RU二者来校正结合响应。使用同时拟合kon和koff的1:1朗格缪尔模型来测量表观KD。
9B12(抗Ly6E)的人源化：为了人源化鼠9B12，将高变区(HVR)嫁接入卡帕I–VH2或卡帕I–VH3共有框架以生成数种含有潜在游标位置的不同组合的CDR嫁接物。将9B12变体的可变域序列与人共有(图4)卡帕I和(图5)VH2或(图6)VH3可变域框架比对。以灰色突显与人共有框架不同的氨基酸位置；为了生成CDR嫁接物而转移的区域以框标示。位置依照Kabat编号(参见Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.&Foeller,C.Sequences of proteins of immunological interest,Edn.5th.(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD；1991)。VL域中使用的HVR区域为：位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)(图4)。在VH域中，嫁接位置26-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(图5和6)。
将新的人框架中数个潜在影响HVR构象的位置(游标位置)恢复成小鼠序列，试图探索它们在Ly6E结合亲和力方面的作用。在卡帕I域中，包括位置43、44、和71的组合。在VH2域中，探索位置24、37、49、73和76的组合，而在VH3域中，测试位置24、48、67、71、76和78的组合。构建了总共25种变体并作为IgG表达(表3)。然后在基于细胞的Ly6E竞争性结合测定法中筛选经过纯化的IgG。大多数HVR构建体结合Ly6E，不管是使用共有VH2还是VH3可变重域。使用VH2域获得了具有最少额外变化的最好克隆hu9B12.v12，其包含卡帕I中的3个游标位置(43、44和71)和VH2中的2个位置(24和49)。表3显示构建并使用基于细胞的Ly6E竞争性结合测定法评估的人源化HVR框架修复变体的矩阵。
表3
这个克隆在基于细胞的Ly6E竞争结合测定法中具有降低约3-5倍的对人Ly6E的亲和力，但是根据SPR和Scatchard分析具有相似的亲和力(表4)，其中ch9B12表示嵌合变体，9B12.v12表示人源化变体。
表4
实施例4-抗Ly6E抗体的人和猕猴Ly6E的结合
实施Scatchard分析以对抗体测定亲和力和每个细胞的结合位点。使用Iodogen法将Hu.9B12v12抗体碘化数次。使用NAP-5柱通过凝胶过滤自游离125I-Na纯化放射性标记的Hu.9B12v12抗体，其具有11.14-16.01μCi/μg范围的比活性。将50μL含有固定浓度的碘化抗体和渐减浓度的未标记抗体的竞争反应混合物分配入96孔板。使用Sigma细胞解离液自烧瓶解离用逆转录病毒稳定转导以表达重组的带gD标签的人或猕猴Ly6E的PC3细胞，并用结合缓冲液(含2％FBS、50mM HEPES,pH 7.2、和0.1％叠氮化钠的DMEM)清洗。以适宜密度(0.2mL结合缓冲液中200,000个细胞)将经过清洗的细胞添加至装有50μL竞争结合混合物的96孔板。每一份含细胞的竞争反应中碘化抗体的终浓度为200pM，而每一份含细胞的竞争反应中未标记抗体的终浓度有变化，以500nM开始，然后通过1:2倍数稀释而降低产生10个浓度，而且包括零添加、仅缓冲液的样品。对于未标记抗体的每一个浓度，一式三份测定带细胞的竞争反应。将带细胞的竞争反应于室温温育2小时。2小时温育后，将竞争反应转移至Millipore多筛选滤板，并用结合缓冲液清洗4次以分开游离的与结合的碘化抗体。在Wallac Wizard 1470伽马计数仪(PerkinElmer Life andAnalytical Sciences；Wellesley，MA)上对滤器计数。使用New Ligand软件(Genentech)评估结合数据，该软件利用Munson and Rodbard(1980)的拟合算法来确定抗体的结合亲和力。如图6小图A和B及表5所示，Hu9B12v12对人和猕猴的结合亲和力分别评估为4.0nM和7.9nM。
表5
实施例5-抗体药物缀合物的生成
对于大规模抗体生产，在CHO细胞中生成抗体。将编码VL和VH的载体转染入CHO细胞，并通过蛋白A亲和层析自细胞培养液纯化IgG。
vcMMAE ADC的生成：通过将hu9B12.v12或对照抗gD ADC缀合至药物-接头模块MC-vc-PAB-MMAE来生成抗Ly6E抗体-药物缀合物(ADC)，这在本文中有描述。方便起见，药物-接头模块MC-vc-PAB-MMAE在这些实施例中及在附图中有时称作“vcMMAE”或“VCE”。在缀合之前，使用依照WO2004/010957A2中记载的方法学的标准方法用TCEP部分还原抗体。使用依照例如Doronina et al.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784及US 2005/0238649 A1中记载的方法学的标准方法将部分还原的抗体缀合至药物-接头模块。简言之，将部分还原的抗体与药物-接头模块组合以容许药物-接头模块缀合至抗体中还原的半胱氨酸残基。淬灭缀合反应，并纯化ADC。测定每一种ADC的药物载荷(每个抗体的平均药物模块数)，对于抗Ly6E抗体和抗gD对照抗体，在3.3和4.0之间。
实施例6-人源化抗Ly6E ADC对人和猕猴Ly6E的结合
体外杀伤测定法：为了评估Hu9B12v12-ADC对细胞存活力的影响，在96孔透明底黑色板中在50μL普通生长培养基中以每孔1,500个分配细胞。24小时后，将另外50μL含有连续稀释度的Hu9B12v12-ADC浓度的培养基添加至一式三份孔。5天后，使用CellTiter-Glo发光细胞存活力试剂(G7572；Promega Corporation)和EnVision 2101多标记物读数仪(Perkin-Elmer)测定细胞存活。对于测试的2种细胞系，体外杀伤功效表现出与细胞表面上的Ly6E表达成正比(图6，小图A和B)。
流式细胞术：为了荧光激活细胞分选(FACS)，在含有2.5mmol/L EDTA的PBS中收获细胞，并在含有1％FBS的PBS缓冲液中清洗。于40℃进行所有后续步骤。将细胞与3至5μg/mL一抗、接着是适宜的二抗一起各温育1小时。用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析细胞，并获得几何均值。使用一抗Hu.9B12v12进行Ly6E细胞表面检测，使用内部生成的抗gD单抗进行N末端gD标签检测。使用Alexa 488缀合的抗小鼠或抗人IgG荧光检测试剂(A11017，A11013；Invitrogen)。
实施例7-抗Ly6E ADC在异种移植物小鼠模型中的体内功效
乳腺癌细胞系HCC1569(CRL-2330)、胰腺癌细胞系SU.86.86(CRL-1837)、中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(CCl-61)和前列腺癌细胞系PC3(CRL-1435)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。CHO-K1S是CHO-K1的悬浮细胞系衍生物。HCC1569 X2细胞系是亲本HCC1569细胞系(ATCC，CRL-2330)为体内生长而优化的衍生物。在雌性Taconic NCr裸鼠的右体侧中皮下注射亲本HCC1569细胞，收获一个肿瘤，切碎，并在体外培养，得到HCC1569 X1细胞系。再次在雌性Taconic NCr裸鼠的右体侧中皮下注射HCC1569 X1系，试图改进细胞系的生长。自这项研究收集一个肿瘤，再次适应体外生长，生成HCC1569 X2细胞系。这种细胞系及自这种系衍生的肿瘤表达Ly6E。
异种移植物模型：在自上文所述细胞系衍生的异种移植物模型中或在原代患者衍生的肿瘤模型中评估抗Ly6E抗体药物缀合物(ADC)的功效，后一项实验是在Oncotest(Freiburg，Germany)和XenTech(Genopole，France)进行的。
所有在Genentech(South San Francisco，CA)进行的研究均依照实验动物护理和使用指南(Ref:Institute of Laboratory Animal Resources(NIHpublication no.85-23),Washington,DC:National Academies Press；1996)。所有在Oncotest进行的实验均得到地方当局批准，而且依照德国动物福利法指南(Tierschutzgesetz)进行。通过The Direction des Services Vétérinaires,Ministère de l'Agriculture et de la Pêche,France获得了在XenTech的CERFE设备中使用动物的授权(协议No.A 91-228-107)。动物护理和庇护依照欧洲公约STE 123。在XenTech进行的所有实验会依照法国关于实验室动物保护的立法并依照当前有效的、法国农业与渔业部颁给Truong-An TRAN博士的、关于用脊椎动物进行实验的许可证(No.A 91-541；日期：2010年12月21日；有效期：5年)实施。6至9周龄雌性免疫缺陷小鼠在背部右体侧中皮下接种，并自每组9-10只小鼠测定平均肿瘤体积及SD。
对于用自细胞系衍生的异种移植物进行的功效研究，在含Matrigel的HBSS中给来自Taconic的NCR裸鼠接种5x106个细胞，或者在含Matrigel的HBSS中给来自Charles River的C.B-17SCID(自交)小鼠接种2x106个细胞。将0.36mg雌激素植入物用于HCC1569 X2异种移植物模型。对于在XenTech和Oncotest用肿瘤外植体进行的功效研究，给来自Harlan或Charles River的无胸腺裸鼠或NMRI nu/nu小鼠植入来自模型HBCx-8、HBCx-9、MAXF-1162和PAXF-1657的、原代乳腺或胰腺癌患者衍生的材料。当肿瘤体积达到大约80-200mm3时(第0天)，将动物随机分组，每组9-10只，并以适宜剂量施用单次静脉内(IV)注射媒介对照或ADC。直至研究结束，每周两次测量肿瘤体积。
尽管为了清楚理解的目的已经通过例示和实施例的方式较为详细地描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过述及明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。

Claims (56)

1.一种结合Ly6E的分离的抗体，其中该抗体以通过Scatchard分析测量的≤4nM的亲和力结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位。
2.权利要求1的抗体，其为单克隆抗体。
3.权利要求1的抗体，其为人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。
4.权利要求1的抗体，其中该抗体一结合所述SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位就在表达Ly6E的细胞中内在化。
5.权利要求1的抗体，其为结合SEQ ID NO：1氨基酸21-131内的表位的抗体片段。
6.权利要求1的抗体，其中该抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2。
7.权利要求1的抗体，其中该抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的HVR-H1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的HVR-H2、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：12的HVR-H3。
8.权利要求7的抗体，其进一步包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
9.权利要求1的抗体，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HVR-L1、(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HVR-L2、和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的HVR-L3。
10.权利要求8的抗体，其进一步包含轻链可变域框架FR2序列SEQ ID NO：20或轻链可变域框架FR3序列SEQ ID NO：21或重链可变域框架FR1序列SEQ ID NO：23或重链可变域框架FR2序列SEQ ID NO：24。
11.权利要求1的抗体，其包含(a)与氨基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与氨基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
12.权利要求10的抗体，其包含SEQ ID NO：5的VH序列。
13.权利要求10的抗体，其包含SEQ ID NO：3的VL序列。
14.一种抗体，其包含SEQ ID NO：5的VH序列和SEQ ID NO：3的VL序列。
15.权利要求1的抗体，其为IgG1、IgG2a或IgG2b。
16.一种分离的核酸，其编码权利要求1至15任一项的抗体。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求16的核酸。
18.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求17的宿主细胞，使得该抗体生成。
19.一种免疫缀合物，其包含权利要求1至15任一项的抗体和细胞毒剂。
20.权利要求19的免疫缀合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：
(a)Ab为权利要求1至14任一项的抗体；
(b)L为接头；
(c)D为选自美登木素生物碱(maytansinoid)、奥瑞司他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)、和奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物的药物；且
(d)p范围为1-8。
21.权利要求20的免疫缀合物，其中D为奥瑞司他汀。
22.权利要求21的免疫缀合物，其中D具有式DE：
且其中R2和R6各自为甲基；R3和R4各自为异丙基；R5为H；R7为仲丁基；每一个R8独立选自CH3、O-CH3、OH、和H；R9为H；且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
23.权利要求20的免疫缀合物，其中该药物为MMAE。
24.权利要求21的免疫缀合物，其中D为式A的吡咯并苯并二氮卓：
其中虚线表示C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；
R2独立选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，且任选还选自卤素或二卤素，其中RD独立选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H、和卤素；
R6和R9独立选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
Q独立选自O、S和NH；
R11为H，或R，或在Q为O的情况下，SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立选自任选取代的C1-8烃基、C3-8杂环基和C5-20芳基基团，且任选涉及基团NRR’时，R和R’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环环；
R12、R16、R19和R17分别如为R2、R6、R9和R7定义的；
R”为C3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子和/或任选取代的芳香环中断；且X和X’独立选自O、S和N(H)。
25.权利要求24的免疫缀合物，其中D具有结构：
其中n为0或1。
26.权利要求20的免疫缀合物，其中D为奈莫柔比星衍生物。
27.权利要求26的免疫缀合物，其中D具有选自下示的结构：
28.权利要求20至27任一项的免疫缀合物，其中该接头是蛋白酶可切割的。
29.权利要求28的免疫缀合物，其中该接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
30.权利要求20至27任一项的免疫缀合物，其中该接头是酸不稳定的。
31.权利要求30的免疫缀合物，其中该接头包含腙。
32.权利要求22的免疫缀合物，其具有式：
其中S为硫原子。
33.权利要求25的免疫缀合物，其具有式：
34.权利要求27的免疫缀合物，其具有选自下示的式
35.权利要求20至34任一项的免疫缀合物，其中p范围为2-5。
36.权利要求20至35任一项的免疫缀合物，其包含权利要求8的抗体。
37.权利要求20至35任一项的免疫缀合物，其包含权利要求14的抗体。
38.一种药物配制剂，其包含权利要求20至37任一项的免疫缀合物和药学可接受载剂。
39.权利要求38的药物配制剂，其进一步包含别的治疗剂。
40.权利要求39的药物配制剂，其中该别的治疗剂为铂复合物。
41.一种治疗具有Ly6E阳性癌症的个体的方法，该方法包括对个体施用有效量的权利要求20至37任一项的免疫缀合物。
42.权利要求41的方法，其中该Ly6E阳性癌症选自乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、结直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、或胃癌。
43.权利要求42的方法，其进一步包括对个体施用别的治疗剂。
44.权利要求43的方法，其中该别的治疗剂为铂复合物。
45.一种抑制Ly6E阳性细胞增殖的方法，该方法包括在允许权利要求20至37任一项的免疫缀合物结合该细胞表面上的Ly6E的条件下将该细胞暴露于该免疫缀合物，由此抑制该细胞增殖。
46.权利要求45的方法，其中该细胞为乳腺、胰腺、结肠、结直肠、黑素瘤、卵巢、非小细胞肺或胃癌细胞。
47.权利要求1至15任一项的抗体，其是与标记物缀合的。
48.权利要求47的抗体，其中该标记物为正电子发射体。
49.权利要求48的抗体，其中该正电子发射体为89Zr。
50.一种检测生物学样品中的人Ly6E的方法，其包括在允许权利要求1至15任一项的抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将该生物学样品与该抗Ly6E抗体接触，并检测该抗Ly6E抗体和该生物学样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。
51.权利要求50的方法，其中该抗Ly6E抗体为权利要求8或权利要求14的抗体。
52.权利要求51的方法，其中该生物学样品为乳腺癌样品、胰腺癌样品、结肠癌样品、结直肠癌样品、黑素瘤癌样品、卵巢癌样品、非小细胞肺癌样品、或胃癌样品。
53.一种用于检测Ly6E阳性癌症的方法，其包括(i)将经标记的抗Ly6E抗体施用于具有或怀疑具有Ly6E阳性癌症的受试者，其中该经标记的抗Ly6E抗体包含权利要求1至15任一项的抗Ly6E抗体，并(ii)检测该受试者中的该经标记的抗Ly6E抗体，其中检测到该经标记的抗Ly6E抗体指示该受试者中的Ly6E阳性癌症。
54.权利要求53的方法，其中该经标记的抗Ly6E抗体为经标记的权利要求8或权利要求14的抗体。
55.权利要求53或权利要求54的方法，其中该经标记的抗Ly6E抗体包含与正电子发射体缀合的抗Ly6E抗体。
56.权利要求56的方法，其中该正电子发射体为89Zr。
CN201380038620.8A 2012-05-21 2013-05-20 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法 Active CN104540519B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261649775P 2012-05-21 2012-05-21
US61/649,775 2012-05-21
PCT/US2013/041848 WO2013177055A2 (en) 2012-05-21 2013-05-20 ANTI-Ly6E ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES AND METHODS OF USE

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104540519A true CN104540519A (zh) 2015-04-22
CN104540519B CN104540519B (zh) 2018-06-01

Family

ID=49624486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038620.8A Active CN104540519B (zh) 2012-05-21 2013-05-20 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法

Country Status (25)

Country Link
US (2) US9724427B2 (zh)
EP (1) EP2852404B1 (zh)
JP (2) JP6192022B2 (zh)
KR (1) KR101718200B1 (zh)
CN (1) CN104540519B (zh)
AR (1) AR091098A1 (zh)
AU (2) AU2013266604B2 (zh)
BR (1) BR112014028366A2 (zh)
CA (1) CA2872327A1 (zh)
CL (1) CL2014003140A1 (zh)
CO (1) CO7151531A2 (zh)
CR (1) CR20140529A (zh)
EA (1) EA201491947A1 (zh)
HK (2) HK1208167A1 (zh)
IL (1) IL235542A0 (zh)
MA (1) MA37538B1 (zh)
MX (1) MX352581B (zh)
NZ (1) NZ702195A (zh)
PE (1) PE20150025A1 (zh)
PH (1) PH12014502601A1 (zh)
SG (1) SG11201407561UA (zh)
TW (1) TWI614265B (zh)
UA (1) UA114814C2 (zh)
WO (1) WO2013177055A2 (zh)
ZA (1) ZA201408236B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107106700A (zh) * 2013-12-16 2017-08-29 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体‑药物缀合物
CN108064246A (zh) * 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9828597B2 (en) 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US8796009B2 (en) 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
JP6707445B2 (ja) 2013-10-21 2020-06-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｌｙ６Ｅ抗体及び使用方法
EP3082874A2 (en) * 2013-12-16 2016-10-26 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2015095124A1 (en) * 2013-12-16 2015-06-25 Genentech Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
CN107108724A (zh) 2014-09-12 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 半胱氨酸改造抗体和缀合物
WO2016090050A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
AU2015370918C1 (en) 2014-12-23 2021-10-14 Nbe-Therapeutics Ag Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
CN109152843A (zh) 2016-05-20 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
EP3548515A1 (en) 2016-12-01 2019-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
SG11201907208XA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
CN110997013B (zh) 2017-07-24 2022-09-20 瑞泽恩制药公司 抗cd8抗体和其用途
US20210198636A1 (en) * 2017-10-20 2021-07-01 Genethon Use of Syncytin for Targeting Drug and Gene Delivery to Lung Tissue
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
JP2022505450A (ja) 2018-10-24 2022-01-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
TW202216215A (zh) 2020-07-21 2022-05-01 美商建南德克公司 Ｂｒｍ降解之抗體結合化學誘導物及其方法
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
AR128331A1 (es) 2022-01-26 2024-04-17 Genentech Inc Inductores químicos de degradación conjugados con anticuerpos y métodos de estos
AR128330A1 (es) 2022-01-26 2024-04-17 Genentech Inc Inductores químicos de degradación conjugados con anticuerpo y métodos de estos
WO2023215737A1 (en) * 2022-05-03 2023-11-09 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies, immunoconjugates, and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016225A2 (en) * 2002-08-19 2004-02-26 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2007109347A2 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and ly6 e: targets for cancer diagnosis and therapy

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
US5856136A (en) 1996-07-03 1999-01-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human stem cell antigens
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6913756B1 (en) * 1998-04-29 2005-07-05 The Uab Research Foundation Monoclonal antibodies specific for anthrax and peptides derived from the antibodies thereof
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
EP1229934B1 (en) 1999-10-01 2014-03-05 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2366718A3 (en) * 2002-06-28 2012-05-02 Domantis Limited Ligand
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
EP2311945A1 (en) 2003-10-14 2011-04-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies substituting for functional proteins
NZ583292A (en) 2003-11-06 2012-03-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
PL1704166T3 (pl) 2004-01-07 2015-10-30 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Przeciwciała monoklonalne swoiste względem M-CSF i ich zastosowania
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
EP1736965B1 (en) * 2004-04-28 2008-07-30 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Hierarchy encoding apparatus and hierarchy encoding method
CN102973947A (zh) 2004-06-01 2013-03-20 健泰科生物技术公司 抗体-药物偶联物和方法
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
US20060094676A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Ronit Lahav Compositions and methods for treating cancer using compositions comprising an inhibitor of endothelin receptor activity
JP4993645B2 (ja) 2004-12-01 2012-08-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体薬剤結合体および方法
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
WO2007100385A2 (en) 2005-10-31 2007-09-07 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
US20070269442A1 (en) 2006-05-19 2007-11-22 Robert J. Webber Chimeric monoclonal antibody recognizing iNOS
KR101667062B1 (ko) 2008-07-15 2016-10-17 제넨테크, 인크. 안트라시클린 유도체 접합체, 그의 제조 방법 및 항-종양 화합물로서의 그의 용도
CA2752884A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
CN102985113B (zh) 2010-02-23 2015-05-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
EA024730B1 (ru) 2010-04-15 2016-10-31 Медимьюн Лимитед Пирролбензодиазепиновые соединения, их конъюгаты, фармацевтические композиции, содержащие указанные конъюгаты, и применение указанных конъюгатов
KR101839163B1 (ko) 2010-06-08 2018-03-15 제넨테크, 인크. 시스테인 조작된 항체 및 접합체
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
JP6707445B2 (ja) * 2013-10-21 2020-06-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｌｙ６Ｅ抗体及び使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016225A2 (en) * 2002-08-19 2004-02-26 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2007109347A2 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and ly6 e: targets for cancer diagnosis and therapy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T.FLEMING等: "Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6Emediate inhibition of IL-2 production.", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107106700A (zh) * 2013-12-16 2017-08-29 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体‑药物缀合物
CN107106700B (zh) * 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
CN108064246A (zh) * 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物

Also Published As

Publication number Publication date
MX2014014085A (es) 2015-02-04
US20160199508A1 (en) 2016-07-14
WO2013177055A2 (en) 2013-11-28
JP2017169572A (ja) 2017-09-28
CL2014003140A1 (es) 2015-02-27
HK1208167A1 (zh) 2016-02-26
EP2852404A4 (en) 2015-12-02
CN104540519B (zh) 2018-06-01
AU2016259286A1 (en) 2016-12-01
ZA201408236B (en) 2016-01-27
TW201406780A (zh) 2014-02-16
EP2852404A2 (en) 2015-04-01
JP2015528692A (ja) 2015-10-01
CA2872327A1 (en) 2013-11-28
TWI614265B (zh) 2018-02-11
BR112014028366A2 (pt) 2017-06-27
HK1209373A1 (zh) 2016-04-01
KR101718200B1 (ko) 2017-03-21
MA37538A2 (fr) 2016-11-30
US9724427B2 (en) 2017-08-08
MX352581B (es) 2017-11-29
AU2013266604B2 (en) 2016-09-08
AU2013266604A1 (en) 2015-01-15
EA201491947A1 (ru) 2015-05-29
IL235542A0 (en) 2015-01-29
MA37538B1 (fr) 2017-11-30
SG11201407561UA (en) 2014-12-30
WO2013177055A3 (en) 2014-03-06
US10653792B2 (en) 2020-05-19
AR091098A1 (es) 2015-01-14
CR20140529A (es) 2015-02-12
KR20150013318A (ko) 2015-02-04
NZ702195A (en) 2016-09-30
PE20150025A1 (es) 2015-02-09
EP2852404B1 (en) 2017-07-26
JP6192022B2 (ja) 2017-09-06
UA114814C2 (uk) 2017-08-10
PH12014502601A1 (en) 2015-02-02
US20180015177A1 (en) 2018-01-18
CO7151531A2 (es) 2014-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104540519B (zh) 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法
CN105814084B (zh) 抗cd33抗体和免疫缀合物
CN105189552B (zh) 抗b7-h4抗体和免疫缀合物
RU2687132C2 (ru) АНТИ-FcRH5 АНТИТЕЛА
US9562099B2 (en) Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
CN104411721A (zh) 抗lgr5抗体和免疫缀合物
CN104470544A (zh) 抗pmel17抗体和免疫缀合物
CN104039340B (zh) 治疗黑素瘤的方法及治疗剂组合
CN106413756A (zh) 使用抗steap1抗体和免疫缀合物的方法
CN105518027A (zh) 使用抗lgr5抗体的方法
CN103347897A (zh) 抗间皮素抗体和免疫偶联物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1209373

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant